JP4901372B2 - デフェリフェリクリシン高生産変異株、シデロフォア生産用の液体培地、シデロフォアの製造方法 - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
(i) アスペルギルス・オリゼO−1013株(FERM P−16528)にN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンによる変異処理を施すことにより得た変異株3129−7株は、デフェリフェリクリシン生産量が親株の3倍以上になっていた。
(ii) 一般に、真菌類の培養には炭素源としてグルコースを含む培地が使用されるが、アスペルギルス属微生物を培養してシデロフォアを生産するに当たり、炭素源としてグリセロールを含む培地を用いることにより生産量が向上する。
(iii) アスペルギルス属微生物を培養してシデロフォアを生産するに当たり、増粘多糖類を含む液体培地を用いることにより、生産量が向上する。
(I)デフェリフェリクリシン高生産変異株
本発明の第1のデフェリフェリクリシン高生産変異株は、アスペルギルス・オリゼの変異処理により得られ、親株に比べてデフェリフェリクリシン生産量が3倍以上になった変異株である。
(II)アスペルギルス属微生物の培養によりシデロフォアを生産するための液体培地
本発明のアスペルギルス属微生物の培養によりシデロフォアを生産するための第1の液体培地は、グリセロールを含む液体培地である。炭素源としてグリセロールを含むことにより、その他の汎用の低分子炭素源であるグルコースなどを含む培地に比べて、シデロフォアの生産量が高くなる。
(III)シデロフォアの製造方法
本発明のシデロフォアの製造方法は、上記説明した本発明の液体培地を用いて、アスペルギルス属微生物を培養する工程と、培養物からシデロフォアを回収する工程とを含む方法である。アスペルギルス属微生物は、シデロフォアを生産する菌種であればよく、特に限定されないが、病原性を有さず、培養に使用し易い菌種として、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ソヤ、アスペルギルス・ウサミなどが挙げられる。中でも、安全性や性質が良く知られている点でアスペルギルス・オリゼが好ましい。アスペルギルス・オリゼの生産する主なシデロフォアはデフェリフェリクリシンである。中でも、アスペルギルス・オリゼのデフェリフェリクリシン高生産変異株3129―7株(FERM P-20961)を用いることが好ましい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
親株として、麹菌アスペルギルス・オリゼO−1013株(FERM P−16528)を用いた。アスペルギルス・オリゼO−1013株の胞子懸濁液(108個/ml)と飽和N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)溶液を等量混合し、30℃で30分間反応させた。遠心分離後の胞子を水で2回洗浄しNTGを除去した後、変異処理した胞子群を回収した。変異処理した胞子をCz―dox,2%(w/v)Glucose,0.25%(v/v)TritonX―100, 2%(w/v) Agarプレートに塗布した後30℃で3日間培養した。
<培養方法>
親株、及び変異処理した各株を保存スラントからポテトデキストロースアガープレート(ニッスイ社製)に塗布し、胞子を形成させた。各株の胞子を回収し、鉄制限ツァペックドックス培地 (0.2%(w/v)NaNO3,0.1%(w/v)K2HPO4,0.05%(w/v)KCl,0.05%(w/v)MgSO4・7H2O,pH6.0)に2%(w/v)グルコースを添加した液体培地40mlに、それぞれ106個/ml植菌し、30℃で7日間振盪培養した。
<Dfcy生産量の測定方法>
培養上清100μlに10μlの0.2Mクエン酸バッファー(pH4.0)、10μlの3000ppm FeCl3溶液を添加し、デフェリフェリクリシン(Dfcy)に鉄をキレートしフェリクリシン(Fcy)とした。
アスペルギルス・オリゼを実施例1と同じ条件で培養して、デフェリフェリクリシンを生産した。但し、培地としては、以下の4種類の液体培地を用いた。
培地1:
鉄制限ツァペックドックス培地に2.5%(w/v)グルコース(ナカライテスク社)を添加したもの
培地2:
鉄制限ツァペックドックス培地に2.5%(v/v)グリセロール(ナカライテスク社)を添加したもの
培地3:
鉄制限ツァペックドックス培地に2.5%(v/v)グリセロール(ナカライテスク社)、0.3%(w/v)CMC(ナカライテスク社)を添加したもの
培地4:
鉄制限ツァペックドックス培地に2.5%(v/v)グリセロール(ナカライテスク社)、0.3%(w/v)CMC(ナカライテスク社)、1.5%(w/v)カザミノ酸(Difco社)を添加したもの
培地5:
鉄制限ツァペックドックス培地に2.5%(v/v)グリセロール(ナカライテスク社)、0.3%(w/v)CMC(ナカライテスク社)、0.5%(w/v)液化粕プロテアーゼ分解物を添加したもの
培地3〜5の粘度を東機産業株式会社製 TVB-10粘度計を用いて測定したところ、9.0〜9.5mPa・sの範囲であった。
<液化粕分解物作成方法>
液化粕の凍結乾燥品10gに蒸留水50mlを加え均一にし、市販のプロテアーゼであるプロテアーゼSアマノ(アマノエンザイム社製)を0.2g加え50℃で3時間攪拌しながら反応させた。100℃で10分加熱し酵素を失活させた後遠心分離により不溶性の残渣を除去し、上清液を凍結乾燥し液化粕分解物の粉末を得た。
<鉄濃度測定方法>
カザミノ酸、及び液化粕のプロテアーゼ分解物の、それぞれ0.1%(w/v)水溶液を調製し、原子吸光分析装置(Perkin Elmer社製、AAnalyst800)にてFe含量を測定したところ、それぞれ1.4ppb、及び96.4ppbであった。
2.5%(v/v)グリセロール、1.5%(w/v)カザミノ酸、50ppmクロラムフェニコール、及び増粘多糖類からなる液体培地に、アスペルギルス・オリゼ3129−7株の胞子を106個/ml植菌して、30℃で7日間振盪培養した。
Claims (9)
- グリセロールを含む液体培地を用いて、アスペルギルス属微生物を培養する工程と、培養物からシデロフォアを回収する工程とを含むシデロフォアの製造方法。
- 前記培地のグリセロール濃度が3%(v/v)以下である請求項1に記載の方法。
- 前記培地が増粘多糖類を含む請求項1又は2に記載の方法。
- 培地の粘度が3〜30mPa・sである請求項3に記載の方法。
- 増粘多糖類を含む液体培地を用いて、アスペルギルス属微生物を培養する工程と、培養物からシデロフォアを回収する工程とを含むシデロフォアの製造方法。
- 前記培地の粘度が3〜30mPa・sである請求項5に記載の方法。
- 前記培地がタンパク質分解物を含むものである請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記培地が穀類の醸造により得られるもろみまたは粕のプロテアーゼ分解物を含むものである請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- アスペルギルス属微生物が、アスペルギルス・オリゼであり、シデロフォアがデフェリフェリクリシンである請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
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