KR100855357B1 - 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기제조방법으로 제조된 사료 첨가제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하여 상기 균주내에 셀레늄을 축적시키는 단계; 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 배양하여 상기 균주내에 게르마늄을 축적시키는 단계; 상기 배양한 사카로마아세스 세레비지애 균주 및 캔디다 유틸리스 균주를 건조, 세척한 후 파쇄시켜 균체를 얻는 단계; 및 상기 균체를 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 함유한 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 사료 첨가제는 양식어류의 성장촉진, 어병예방 및 면역기능 증강, 항산화 효과를 나타내므로 양식어류 배양에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사료 첨가제{Production Method of Functional Feed Additives for Fish Culturing and Feed Additives from This Method}

도 1은 셀레늄 첨가배지에서 배양한 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) BH-59의 생육 곡선을 나타낸 그래프이고,

-*-*- ; 대조군, -●-●- ; 셀레늄 50 ppm 첨가,

-×-×- ; 셀레늄 100 ppm 첨가, -▲-▲- : 셀레늄 250 ppm 첨가,

-◆-◆- ; 셀레늄 500 ppm 첨가, -■-■- ; 셀레늄 1000 ppm 첨가,

도 2는 사육장치로 이용한 양식 수조관의 구조를 나타낸 도식도이고,

A : 지하수 출구, B1 : 어항내 PVC파이프,

B2 : 어항외 PVC 파이프, C : 지하수 배출구,

D : 산소, E : 시판 산소기,

도 3은 각 처리군별 치어의 생존율을 비교한 그래프이고,

-*-*- ; 대조군, -◆-◆- ; Se, Ge 투여군,

-■-■- ; 키토산 투여군, -▲-▲- : 한약 + 맥반석 투여군,

도 4는 각 처리군별 치어 비장의 무게를 나타낸 그래프이고,

도 5는 각종 처리군의 치어중의 항산화 활성을 비교한 그래프이다.

본 발명은 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 및 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 배양한 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 함유한 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사료 첨가제에 관한 것이다.

WTO 체제가 출범하고 200 해리 경제수요역의 선포에 따른 인접국간의 어업협정체결에 의한 어장축소, 과도이용에 위한 연안어업 자원감소와 생태계의 환경오염 등 국내외의 여건변화에 따라 기르는 어업육성의 필요성이 대두되고 있으며, 자원부족과 연안 수산자원의 획기적인 증대를 위한 새로운 미래 지향적 생산 및 관리 방식이 요구된다. 정부가 추진중인 배합사료 직접 지불제도가 도입된 지 3년이 경과하고 있으나 전체 공급량 중 생사료에 대한 의존 비율이 아직도 90% 수준으로 매우 높은 실정이다. 생사료의 사용에 따른 양식어장의 오염이 가중되고 있으며, 양식어 1 ㎏을 키우기 위해서 소요되는 사료계수가 생사료의 경우 약 4~5이므로 양식어 1 ㎏을 상품으로 키우기 위해서는 4~5 ㎏의 생사료가 필요하여 많은 양을 급이 하므로 사료 효율성이 낮다. 어류양식에서 사료비가 차지하는 비율은 약 60%로 예상되는 생사료의 수급 및 가격 불안정성은 어류 양식업의 경영의 성패 요인뿐만 아니라 대단한 위험요소이다.

생사료 급여시 양어장의 오염이 심각하여 자연 폐사율이 30~40% 정도이지만 배합사료를 급이하면 20%이하로 조절 될 것으로 보고되고 있다. 생사료의 경우 일정기간 동안 양식장에 지속적으로 투입되면 어장 바닥에 누적되어 어장을 부패시켜 양식 환경을 악화시키고 해양오염으로 인한 연안자원의 고갈, 양식 어류의 질병까지 초래한다. 국내에서도 양식 축산사료 제조회사 중 32개 회사가 HACCP 인증제도 도입 등을 통해 품질이 향상될 것으로 기대를 모으고 있는 가운데, 양식어류용 배합사료도 품질 개선을 위해 성분 고시 및 품질인증제도의 도입이 될 것으로 예상된다. 또한, 앞으로 정부에서 강력히 추진하고 있는 환경친화형 직불제로 전환되면서 배합사료만 사용하도록 규제가 불가피할 것으로 판단된다.

현재, 생사료를 기준으로 할 경우 약 40-80 만톤의 원료가 필요하고, 자연 폐사율을 약 40%로 계산하면 56~110 만톤이 필요하게 되는데 이러한 생사료의 수요를 예상하면 우리나라의 어업생산 추세로는 앞으로 생사료의 원료 공급이 불가능하다. 생사료는 유통과정 중 변질이 용이하기 때문에 선도유지를 위해 냉동창고와 같은 보관 장치가 필요하며, 제조 급이시 인력소모가 높아 상대적 제반 비용이 높다. 따라서, 어류양식 시스템을 선진국형 배합사료 자동급이형 대량 생산 시스템으로 전환하고, 원가를 절감하면 그 수요는 훨씬 늘어날 것으로 전망하며 국제 경 쟁력이 있는 것으로 판단된다.

유기 게르마늄(Germanium, Ge)이란 무기물 상태의 게르마늄 이온이 아미노산 또는 유기산 등의 유기 화합물과 화학적으로 결합된 상태를 일컫는다. 상기 유기 게르마늄은 인삼, 영지, 명일엽 등에 다향 함유되어 있으며, 암, 고혈압, 당뇨병, 심장질환, 토행성 질환, 류마티스 관절염 등의 성인병 치료와 완화 및 예방에 탁월한 효과가 있으며 면역증강 작용도 있는 것으로 알려져 있어서, 미국, 일본 등의 선진국에서는 유기 게르마늄을 이용해 암, 심장질환 등의 난치병을 치료 하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Int J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med., 42(6), 653-9(1982); Antic ancer Res., 5(5), 479-483(1985)).

이러한 유기 게르마늄을 얻는 방법으로는 천연물인 인삼, 영지 등으로부터 추출하는 방법과 촉매에 의해 유기산과 이산화게르마늄의 반응을 유도해 화학적으로 합성하는 방법이 있으나, 전자는 비용이 과다하게 소모되고 후자는 안전성이 확립되지 않아 식품 또는 약품으로의 사용이 제한되어져 왔다. 게르마늄은 항종양, 노인성 골다공증, 만성 피로 증후군, 중금속 해독작용, 혈행개선, 면역기능 강화, 피부미용에 좋다(WTO, 1일권장량, 5~100 ㎎).

게르마늄(Ge)은 체내에 잔류하지 않고 생리활성이 뛰어나며 게르마늄이 들어있는 인삼, 영지, 마늘, 명일엽 등 식품은 보양 및 강장의 작용이 있다고 알려져 있으며, 유기 게르마늄이 함유된 식품이 인기리에 팔리고 있다. 유기 게르마늄의 효능은 세포 내 산소 공급 증진, 혈액의 정화, 채내 중금속이 체외 배출 촉진, 면 역 세포의 활성화 및 중금속 해독작용 등이 알려지고 있다.

한편, 셀레늄(Selenium, Se)은 1957년 미생물과 동물의 영양에 필수적이란 것이 밝혀지면서 연구가 지속되었고, 여러 동물의 결핍증이 셀레늄의 부족에 때문이라는 것과 사람에 있어서도 동물과 마찬가지로 체내대사에 필수원소라는 것이 알려지기 시작했다. 셀레늄의 결핍은 주로 동물에서 많이 찾아볼 수 있는데, 성장장애, 임신장애, 간경변증, 근육장애, 만성 간 기능장애, 닭과 칠면조의 삼출성 질병, 혹은 셀레늄과 비타민 E의 부족이 병행되었을 때 나타난다. 셀레늄은 기적의 원소로서, 노화방지, 면역기능 증진, 암 예방과 치료, 간 보호, 퇴행성 관절염, 피부질환 치료, 중금속 배설을 촉진하는 기능에 효과가 있으며 맥주효모, 소나 돼지의 신장, 버터, 소맥배아, 굴, 새우, 우유, 현미, 마늘 등에 일정량 함유되어 있다(WTO, 1일 권장량, 50~200 ㎍). 셀레늄은 세계 대다수의 인구가 식품을 통한 충분한 량의 셀레늄을 섭취하지 못하는 것으로 알려져 있으며, 세계 약 5~10억 인구가 1일 셀레늄 권장량(50~200 ㎍)을 섭취하지 못하는 것으로 추정되며 우리나라의 경우는 43 ㎍으로 부족한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 배합사료 제조시 신기능성 물질을 첨가하여 신기능성 양식어류를 생산하고자 노력하던 중, 본 발명자들인 순수분리 보관중인 유산균 Lactobacillus brevis와 효모균주인 Saccharomyces Cerevisiae 및 Candida utilis에서 유기물 형태의 셀레늄과 게르마늄을 비교적 다량 축적하고 있음을 확인하고, 상기 미생물에서 얻은 유기 셀레늄과 유기 게르마늄을 배합사료 첨가제로 개발하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제는 양식어류에 급이시 양식장의 수질오염에 따른 양식어의 질병과 세균에 대한 저항력을 강화시키고 면역기능을 증강시켜 폐사율을 줄일 수 있다.

본 발명의 목적은 양식어류의 질병을 예방하고 면역기능증강 등 생리활성이 강화된 단위 면적당 생산성이 높은 양식어류를 생산하며, 양식된 어류는 웰빙(well-being)시대의 건강지향성 생선 횟감 및 수산가공식품으로 활용하는 미생물 이용한 신기능성 유기 셀레늄과 게르마늄 함유 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도당, 효모 추출물, 펩톤 및 물을 포함하는 기본 배지에서 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하고, 셀레늄이 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 셀레늄을 축적시키는 단계; 탈지대두단백, 효모 추출물, 포도당 및 물을 포함하는 기본 배지에서 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 배양하고, 게르마늄이 다량 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 게르마늄을 축적시키는 단계; 상기 배양한 사카로마아세스 세레비지애 균주 및 캔디다 유틸리스 균주를 건조, 세척한 후 파쇄시켜 균체를 얻는 단계; 및 상기 균체를 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 함유한 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 기능성 양식어류용 사료 첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ⅰ) 포도당, 효모 추출물, 펩톤 및 물을 포함하는 기본 배지에서 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하고, 셀레늄이 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 셀레늄을 축적시키는 단계; ⅱ) 탈지대두단백, 효모 추출물, 포도당 및 물을 포함하는 기본 배지에서 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 배양하고, 게르마늄이 다량 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 게르마늄을 축적시키는 단계; ⅲ) 상기 배양한 사카로마아세스 세레비지애 균주 및 캔디다 유틸리스 균주를 건조, 세척한 후 파쇄시켜 균체를 얻는 단계; 및 ⅵ) 상기 균체를 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 함유한 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 있어서, 상기 효모 균주는 사카로마아세스 BH-59인 것이 바람직하고, 상기 사카로마아세스 균주의 배양은 포도당, 효모추출물, 펩톤, KH₂PO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, EDTA, ZnSO₄, MnCl₂, CoCl₂, CuSO₄, Na₂MoO₄, CaCl₂ , FeSO₄, Na₂SeO₃ 및 증류수를 첨가한 배지에서 pH 5.5~6.0, 배양온도 25~35℃에서 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 사카로마아세스 세레비지애 균주의 보충용 배지는 포도당, Na₂SeO₃ 또는 SeO₂ 및 효모추출물로 구성되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 있어서, 상기 캔디다 유틸리스 균주는 캔디다 유틸리스 KS-2604인 것이 바람직하고, 상기 캔디다 유틸리스 균주의 보충용 배지는 포도당, GeO₂ 및 효모추출물로 구성되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 있어서, 상기 보충용 배지는 각 균주가 대수증식기로 증식하였을 때 주입되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법에 있어서, 상기 보충용 배지의 무기 셀레늄 및 무기 게르마늄의 농도는 전체 배지의 100 내지 5000 ppm인 것이 바람직하고, 1000 내지 3000 ppm인 것이 바람직하다.

일반적으로 고농도의 미네랄이 존재하는 환경에서는 미생물의 생장이 제한을 받는다. 따라서, 본 발명에서는 다량의 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 함유하는 균주로의 이용가능성을 검토하고, 다수의 필수원소를 포함한 항종양제로써 그 세포 내 성분을 이용할 수 있는 효모를 선택하였다.

선택된 효모 균주에 대하여 셀레늄 및 게르마늄 이온의 배지 내 농도가 효모의 생장에 미치는 영향을 알기 위해 다양한 농도에서 배양하여 본 결과, 통상의 효모는 효모 균체에 대하여 셀레늄은 3 중량%, 배지에 대해서는 대략 40 ppm이 함유된 배지에서, 게르마늄은 9중량%, 배지에 대해서는 대략 100 ppm 정도의 게르마늄이 함유된 배지에서는 그 운동성이 저하되고 생장도 저해된다.

본 발명에서는 이를 극복하기 위하여, 생물학적인 증식 및 활동이 활발한 고농도 셀레늄 및 게르마늄 첨가조건 하에서도 생장이 가능하도록 활성화된 생육가능한 효모를 선별하여 이를 종균으로 사용하였다. 활성화에 사용된 균주는 셀레늄의 경우는 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)였고, 게르마늄은 캔디다 유틸리스(Candida utilis)였다.

상기 효모를 활성화시키기 위해서 배지상이 셀레늄 및 게르마늄 함량을 점차 높이는 교대 배양방법을 사용하였다. 기본 배지에 활성화된 효모를 첨가하고 활성화된 효모의 생장대수기에 전체 배지 조성물에 대하여 셀레늄은 0.001 내지 0.05 중량%, 게르마늄은 0.01 내지 0.1 중량%를 첨가하여, 각각 활성화된 효모 균주내로 다량의 유기 셀레늄 및 게르마늄이 유입되도록 하였다.

효모에 유입된 셀레늄 및 게르마늄을 정량하기 위하여, 페닐플루오론을 게르마늄과 반응시켜 착물을 형성하고 이를 505 ㎚에서 흡광도를 측정하는 분광분석법을 이용하였다.

이하, 본 발명의 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조는 다음과 같은 단계를 거친다.

제 1단계: 균체의 생산

효모균주를 25 내지 35℃에서 24 내지 48시간 배양하여 균체를 생산한다. 이때, 상기 효모균주로 셀레늄 축적을 위해서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 BH-59를, 게르마늄 축적을 위해서는 캔디다 유틸리스(Candida utilis) KS-2604 균주를 배양하는 하는 것이 특히 바람직하다.

제 2단계: 균체내로 셀레늄 및 게르마늄 이온의 유입

상기 단계에서 얻어진 배양액을 원심분리하여 효모균체만을 모아, 셀레늄의 을 250 내지 1000 ppm으로, 게르마늄은 100 내지 5000 ppm의 농도로 함유하는 용액을 1:0.5 내지 2의 비율(부피비)로 혼합하고, 상기 셀레늄 및 게르마늄 함유배양액을 pH 5 내지 7 및 30 내지 40℃의 조건을 유지하는 반응조에 넣어 15 내지 25시간 배양하면, 고함량 유기 셀레늄 및 게르마늄 효모를 생산할 수 있다.

제 3단계: 유기 셀레늄 및 게르마늄의 획득

상기 배양된 균체를 원심분리하여 회수하고, 수회 세척하여 균체 표면에 묻어 있는 무기 셀레늄 및 게르마늄을 제거하고 건조시키면, 고함량 유기 셀레늄 및 게르마늄 건조 유기성분을 얻을 수 있다. 아울러, 제 2단계 배양액을 0.2 ㎛ 멤브 레인필터로 여과시켜 사용할 수 있다.

제 4단계 : 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조

상기 유기 셀레늄 및 게르마늄의 유기성분을 일반 배합사료와 혼합하여 제조한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 기능성 양식어류용 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 BH-59를 셀레늄에 적응시키고, 상기 균주가 대수 증식기에 셀레늄이 다량 함유된 보충용 배지에서 성장시켰다. 그 결과, 셀레늄 농축이 성장에 큰 영향은 미치지 않는다(도 1 참조). 셀레늄에 대한 저항성이 증가된 효모 균주를 획득하기 위하여, 무기 게르마늄이 첨가된 배지에서 일정수준으로 성장된 효모균주를 점차적으로 셀레늄의 농도를 증가시킨 배지로 옮겨 배양하면서 고농도의 게르마늄에 대한 효모의 적응성을 증가시키거나 UV조사에 의해 효모균주의 돌연변이를 유도하여 저항성을 증가시키는 방법을 병행하여 무기 셀레늄에 대한 내성이 증가된 효모 균주를 획득하였다. 다양한 셀레늄 농도에서 배양하여 ICP/AES법에 의해 정량한 결과, 배지 중에 첨가된 셀레늄의 농도가 높을수록 효모 균체내의 셀레늄 함량이 높다(표 1 참조).

본 발명자들은 캔디다 유틸리스(Candida utilis) KS-2604 균주를 배양하고, 게르마늄 함유 배지 적응 효모 균주를 선별하기 위하여 게르마늄 함량을 증가시키는 방법으로 활성화하거나 UV조사에 의해 효모균주의 돌연변이를 유도하여 저항성을 증가시키는 방법을 병행하여 무기 게르마늄 이온에 대한 내성이 증가된 효모균주를 획득하였다. 그 결과, 활성화된 효모는 매끄러운 타원형의 정상 상태를 유지하는 반면, 비활성화된 효모는 모양이 일정하지 않았으며 균체 표면이 거친 비정상상태를 나타내었다(표 2 참조). 상기 방법에 의해 얻어진 균주의 효모세포 내로 유입된 게르마늄을 정량한 결과, 게르마늄 농도가 높을수록 효모 세포 내로 게르마늄이온이 많이 유입된다(표 3 참조).

본 발명의 유기 셀레늄 및 게르마늄을 유효성분으로 함유하는 기능성 사료 첨가제를 개발하고, 이를 일반 배합사료와 혼합하여 원형수조내의 치어의 먹이로 이용하였다(도 2 참조). 치어의 사료는 필수 지방산의 공급이 충분하도록 하였다(표 4 및 표 5 참조).

상기 제조한 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제가 치어의 생존율에 비치는 영향을 조사한 결과, 대조군은 물론 키토산 투여군이나 한약 및 맥반석 투여군에 비하여 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 치어의 생존율이 보다 우수하여 양식 60일 경과 후에도 거의 100%의 생존율을 유지한다(도 3 참조). 또한, 다양한 실험군으로 처리한 치어의 비장의 무게를 관찰한 결과, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 치어 비장의 무게가 가장 무거웠다(도 4 참조). 아울러, 다양한 실험군으로 처리한 치어의 항산화 활 성을 비교한 결과, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 경우의 치어의 항산화 활성이 가장 낮았다(도 5 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들은 유기 셀레늄과 게르마늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 생산하기 위하여, 본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 BH-59 및 캔디다 유틸리스(Candida utilis) KS-2604 균주를 이용하였다.

< 실시예 1 > 사카로마이세스 효모 균주에 의한 셀레늄 축적

< 1-1 > 사카로마이세스 세레비지애 균주의 배양

본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 BH-59를 중류수에 포도당 80.0 g, 효모추출물 0.5 g, 펩톤, KH₂PO₄ 8.0 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6 g, (NH₄)₂SO₄ 6.0 g, EDTA 0.3 g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1 g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01 g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05 g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001 g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1 g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5 g을 첨가한 배지에서 pH 5.5~6.0, 배양온도 25~35℃ 에서 40~70시간 동안 배양하며 12시간까지는 0.5 vvm으로 통기하면서 200~400 rpm으로 진탕배양하고, 12시간 이후에는 0.05 vvm으로 통기하면서 500~700 rpm으로 진탕배양 하였다. 상기 배양한 균주를 포도당 200 g/ℓ, Na₂SeO₃ 또는 SeO₂ 0.5~1.0 g/ℓ와 효모추출물 0.1 g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하였다. 그 결과, 셀레늄 첨가배지에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) BH-59의 생육은 셀레늄 농도가 증가함에 따라 성장이 둔화되기는 하지만, 셀레늄 1000 ppm 까지는 성장에 큰 지장은 없었다(도 1).

< 1-2 > 사카로마이세스 세레비지애 균주내 유기 셀레늄의 함량 변화

셀레늄에 대한 저항성이 증가된 효모 균주를 획득하기 위하여, 무기 셀레늄이 200 ppm이 첨가된 배지에서 일정수준으로 성장된 효모 균주를 점차적으로 셀레늄의 농도를 증가시킨 배지로 옮겨 배양하면서 고농도의 게르마늄에 대한 효모의 적응성을 증가시켰다. 또 다른 방법으로, UV조사에 의해 효모균주의 돌연변이를 유도하여 저항성을 증가시키는 방법을 병행하여 무기 셀레늄 이온에 대한 내성이 증가된 효모 균주를 획득하였다. 상기 방법에 의해 얻어진 효모 균주를 실시예 1-1에 기재된 배지에서 배양하고, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 배양액량을 기준으로 0 내지 5000ppm을 첨가하고, 동일 배양조건에서 6시간을 추가로 배양하였다. 효모 세포 내로 유입된 셀레늄을 정량하기 위하여 배양된 효모를 원심분리하고, 식염수 3회, 3차 증류수로 3회 세척 후, 건조기에서 건조한 후, 건조효모 1 g에 질산 10 ㎖을 넣어 진탕하였다. 다음으로, 효모를 16시간 상온에서 방치한 후, 원심분리하여 상등액을 취해 0.2 마이크론 막여과기로 여과한 다음 ICP/AES법에 의해 정량하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 정량 결과, 배지 중에 첨가된 셀레늄의 농도가 높을수록 효모 균체내의 셀레늄 함량이 높게 나왔으며, 5000 ppm농도에서 균체 내 함량이 2405 ppm으로 가장 높은 셀레늄 함량을 나타내었다.

셀레늄 농도(ppm)	균체내 셀레늄 함량(ppm)
0	0
100	95
500	324
1000	678
3000	2200
5000	2405

< 1-3 > 셀레늄 정량

총 셀레늄의 농도는 시료 1 g을 비이커에 넣고 질산(HNO₃) 20 ㎖와 인산(H₃PO₄) 1 ㎖를 주입하여 하룻밤 동안 방치한 후, 뜨거운 평판(Hot plate) 위에서 시료액이 반으로 줄어들 때까지 가열 증발 후, No.6 여과지로 여과하여 100 ㎖ 부피의 플라스크에 정용한 후, ICP 방출 스펙트로메터(ICP Emission Spectrometer, Jobin Yvon사, France)를 이용하여 측정하였다.

< 실시예 2 > 캔디다 효모 균주에 의한 게르마늄 축적

< 2-1 > 캔디다 유틸리스 균주의 배양

본 발명자들은 캔디다 유틸리스(Candida utilis) KS-2604 균주를 배양하기 위하여, 전체 배지 조성물에 대하여 결정단백질원으로 탈지대두단백을 0.8 중량%, 탄수화물원으로 포도당 1 중량%, 효모 추출물 0.1 중량% 및 물을 함유하는 배지 100 ㎖에 캔디다 효모 1 v/v%를 첨가하여 28℃에서 170 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 게르마늄 함유 배지에 적응한 효모 균주의 선별을 위하여, 게르마늄 100 ppm을 첨가한 상기 배지에서 효모를 증식시킨 후 100 ppm씩 게르마늄의 양을 점진적으로 증가시키는 방법으로 활성화하였다. 그 결과 5,000 ppm의 게르마늄이 함유된 배지에서 생물학적인 증식 및 활동이 활발한 활성화된 효모 균주를 선별하였다.

< 2-2 > 캔디다 유틸리스 균주내 유기 게르마늄의 함량 변화

게르마늄에 대한 저항성이 증가된 효모 균주를 획득하기 위하여, 무기 게르마늄이 200 ppm 첨가된 배지에서 일정수준으로 성장된 효모 균주를 점차적으로 게르마늄의 농도를 증가시킨 배지로 옮겨 배양하면서 고농도의 게르마늄에 대한 효모의 적응성을 증가시켰다. 또 다른 방법으로 UV조사에 의해 효모균주의 돌연변이를 유도하여 저항성을 증가시키는 방법을 병행하여 무기 게르마늄 이온에 대한 내성이 증가된 효모 균주를 획득하였다. 그 결과, 활성화된 효모와 비활성화된 효모를 5,000 ppm의 게르마늄 첨가 배지에서 배양하여 비교한 실험에서 활성화된 효모가 매끄러운 타원형의 정상 상태를 유지하는 반면, 비활성화된 효모는 모양이 일정하지 않았으며 균체 표면이 거친 비정상상태를 나타내었다(표 2).

Candida utilis KS-2604에 의한 게르마늄의 축적

GeO2 적응	주입 방법	생산된 효모의 양(g/ℓ)1)	축적, 세포내에 축적된 GeO2(㎍/g)
적응된 효모	미 주입	60.4	1.03
	시작시에 주입	54.8	1,247
	대수 증식기에 주입	74.0	8,420
비적응된 효모	미 주입	64.6	0
	시작시에 주입	51.0	416
	대수 증식기에 주입2)	45.8	742

¹⁾ 건조 무게,

²⁾ 8시간 발효 후

상기 방법에 의해 얻어진 균주를 상기 실시예 2-1의 배지 조건에서 28℃에서 150 rpm으로 24시간 배양한 후, 동일한 배지조성을 갖는 3ℓ 배양배지에 10%(v/v)농도로 종배양액을 접종하여 28℃에서 500 rpm으로 24시간 동안 탄소원과 질소원을 첨가하면서 유가배양하였다. 그후 무기게르마늄(GeO₂)을, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 배양액량을 기준으로 0 내지 5000 ppm을 첨가하고, 동일 배양조건에서 6시간 추가로 배양하였다. 효모세포 내로 유입된 게르마늄을 정량하기 위해 배양된 효모를 원심분리하여 식염수 3회, 3차 증류수로 3회 세척 후 건조기에서 건조한 후, 건조효모 1 g에 질산 10 ㎖를 넣어 진탕하여 상온에서 16시간 방치한 후, 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이 시료 1 ㎖에 페닐플루오론 용액 1 ㎖(32 ㎎ Phenylfluorone, 1 ㎖ 6N HCl / 99 ㎖ ethanol)을 넣고 강하게 진탕 후 20분간 상온에서 방치하였다. 여기에 클로로포름 : 에탄올 = 3:2(v/v) 용액을 1 ㎖ 넣고 5분간 강하게 진탕한 후, 분리된 유기용매층을 취하여 525 ㎚에서 흡광도를 측정한 후, 게르마늄농도(1 ~ 10 ppm) 표준곡선에서의 값을 찾아 희석배수를 곱하여 게르마늄 농도를 환산하였다. 이와 같이 분석한 결과 배지 중에 첨가한 게르마늄 농도가 높을수록 효모 세포 내로 게르마늄이온이 많이 유입되며, 5000 ppm에서 균체 내 함량이 7908 ppm으로 가장 높은 유기 게르마늄 함량을 나타내었다(표 3).

게르마늄 농도(ppm)	균체내 게르마늄 함량(ppm)
0	0
100	395
500	1384
1000	2674
3000	5203
5000	7908

< 2-3 > 게르마늄 정량

게르마늄의 정량을 위한 표준화게르마늄 표준용액(Aldrich, 10,000㎍/ℓ)을 0 내지 10,000 ㎍/ℓ의 용액으로 희석하였다. 각 용액 1 ㎖씩을 취하여 6 N 염산 0.43 ㎖를 함유하는 에탄올 100 ㎖에 용해된 페닐플루오론 0.04% 용액과 착물을 형성시켰다. 이 용액에 안정제로 아라비아 고무 2×10^-30%를, 흡광도 증폭을 위해 암모늄 브로마이드 2×10^-4%를 첨가하고 20분간 방치한 후, 클로로포름과 에탄올의 3 : 2 혼합용매를 첨가하였다. 상기 용액을 5분간 강하게 진탕한 후 분리된 유기용매층을 석영 셀에 옮기고 505 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 3 > 기능성 사료 첨가제에 의한 양식어류의 배양

< 3-1 > 배양 방법

양어장에서 사육 중인 평균 체중 6.9 g되는 각종 치어를 각 실험구마다 30마리씩 수용하였으며, 각 실험구는 3회 반복하였다.

어류양식은 실험실내에 설치된 원형수조(길이 1.2 m × 높이 1.0 m, ploypropylene)를 사용하여 사육장치로 이용하였다(도 2). 상기 사육장치는 유수식을 겸한 순환 여과식 사육 장치로서 보충수의 첨가에 의해서 배설물이 즉시 사육 수조 밖으로 배출 될 수 있도록 사이펀 장치를 부착하며, 이때 사육수량은 1.0톤으로 하고 1일 10-15회 환수시키며 충분한 산소공급을 위하여 air-stone 장치를 설치하였다. 전 사육기간 중 용존 산소량은 5 ㎖/ℓ 전후, 수온은 23.0~27.2℃ 범위로서 평균 26.7℃로 하였다.

< 3-2 > 실험사료

실험 사료의 기본조성은 표 4 및 표 5에 기재된 바와 같으며, 상기 실험사료와 상기 실시예에서 제조된 사료 첨가제를 99:1의 배율로 혼합하였다.

지질은 각종 치어의 필수 지방산 요구가 밝혀져 있지 않기 때문에 n-3와 n-6가 함유되도록 대두유와 어유를 3:2 비율로 섞어서 필수 지방산의 공급이 충분하도록 하였다. 탄수화물원은 덱스트린과 α-전분이며, 셀룰로스로써 칼로리를 조절하였다. 단백질 원료는 멸치분으로 하며 25~55%(diet 1~7)의 조단백질을 함유한 사료로서 체중의 3%에 해당하는 양을 하루 2회로 나누어 공급하여 8주간 사육하였다.

최적 단백질 양을 테스트를 위한 먹이 조성(%)

성분	Diet No.
	1	2	3	4	5	6	7
어류 먹이	38	46	54	62	70	78	86
덱스트린	48	40	32	24	16	8	0
α-녹말	5	5	5	5	5	5	5
비타민 혼합물	2	2	2	2	2	2	2
미네랄 혼합물	1	1	1	1	1	1	1
효모 추출물	1	1	1	1	1	1	1
셀룰로스	0	1	2	3	4	5	5
식용유	5	4	3	2	1	0	0
식품 첨가제	0.1	0.25	0.5	0.75	1.0	0	0
조단백질	25	30	35	40	45	50	55
DE(㎉/100 g 먹이)	339	340	342	355	344	346	355

배출된 펠렛-먹이 조성분석

분석 사항	먹이
수분	3.36 %
조 단백질	52.00 %
조 지질	12.62 %
조 섬유질	1.86 %
crude ash	12.00 %
Ca	2.56 %
P	1.90 %
비타민 C	61.05 ppm
비타민 E(α-토코페롤)	617.69 ppm

< 3-3 > 치어의 생존율

상기 실시예에서 제조한 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제가 치어의 생존율에 비치는 영향을 조사하였다. 대조군, 키토산 투여군, 한약 및 맥반석 투여군, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 실험군으로 나누어 치어의 생존율 조사하였다. 그 결과, 통상 치어의 생존율을 증가시킨다고 알려진 키토산 투여군이나 한약 및 맥반석 투여군에 비하여 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 치어의 생존율이 보다 우수하여 양식 60일 경과 후에도 거의 100%의 생존율을 유지하였다(도 3).

< 3-4 > 치어 비장의 무게

상기 실시예 3-3의 그룹으로 처리한 치어의 비장의 무게를 관찰한 결과, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 치어 비장의 무게가 가장 무거웠다. 이것은 상기 치어 생존율과 유사하게 상기 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제는 치어의 건강을 유지시킴을 알 수 있다(도 4).

< 3-5 > 항산화 활성의 비교

상기 실시예 3-3의 그룹으로 처리한 치어의 항산화 활성을 비교한 결과, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 경우의 치어의 항산화 활성이 가장 낮았다(도 5).

< 3-8 > 콜레스테롤 및 지방산 분석

근육의 콜레스테롤 분석을 위한 지질의 추출은 Folch 등(1957)의 방법에 준하고 추출된 지질내에 함유된 총 콜레스테롤 함량은 Sale 등(1984)의 효소방법에 의하여 정량하였다. 이때, 효소 표준액(AM 202-K, 아산제약주식회사)을 사용하였는데, 유기 셀레늄 및 게르마늄을 함유한 사료 첨가제를 섭취한 치어의 콜레스테롤 수치가 매우 낮았다.

지방산 분석을 위한 지질 추출은 Folch와 Lee(1957)의 방법에 준하여 분석하였다. 20 g의 시료를 Folch 용액(Chloroform과 Methanol = 2:1) 150 ㎖에 넣고 5분간 균질한 후 No.2 여과지로 여과하고 원심분리(771 g, 10분)를 한 후 상층액은 버리고 하층액에 NaSO₄를 첨가하여 여과하고 농축기로 클로로포름을 날려버린 후 지질을 회수하였다. 추출된 지질은 Morrison과 Smith(1964)의 방법에 준하여 전처리한 다음 지방산을 분석하는데, 추출한 지질 5 ㎎ 정도를 채취하여 Methylation tube에 넣어 0.5 N NaOH 1 ㎖를 첨가한 후 100℃에 15분간 가열하여 냉각시켰다. Boron trifluoride methanol 14% solution(BF3 methanol; Sigma, Co., USA) 3 ㎖를 넣어 다시 15분간 가열한 후 냉각하여 시험관에 옮겨 1 ㎖ 헵탄 및 5 ㎖ NaCl 포화용액을 첨가한 후 혼합하여 층이 분리될 때까지 정치하고 상등액을 채취하여 바이알에 넣어 냉동(-80℃)보관하면서 auto-sampler가 장착된 gas chromatography(Varian 3600, Varian, USA)를 이용하여 분석하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 사료 첨가제는 양식어류의 성장촉진, 어병예방 및 면역기능 증강, 항산화 효과를 나타내므로 양식어류 배양에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

1. ⅰ) 포도당, 효모 추출물, 펩톤 및 물을 포함하는 기본 배지에서 사카로마아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하고, 셀레늄이 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 셀레늄을 축적시키는 단계;

   ⅱ) 탈지대두단백, 효모 추출물, 포도당 및 물을 포함하는 기본 배지에서 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 배양하고, 게르마늄이 다량 함유된 보충용 배지에서 상기 균주를 배양하여 상기 균주내에 게르마늄을 축적시키는 단계;

   ⅲ) 상기 배양한 사카로마아세스 세레비지애 균주 및 캔디다 유틸리스 균주를 건조, 세척한 후 파쇄시켜 균체를 얻는 단계; 및

   ⅵ) 상기 균체를 배합사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 유기 셀레늄 및 유기 게르마늄을 유효성분으로 함유한 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 사카로마아세스 균주의 배양은 포도당, 효모추출물, 펩톤, KH₂PO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, EDTA, ZnSO₄, MnCl₂, CoCl₂, CuSO₄, Na₂MoO₄, CaCl₂ , FeSO₄, Na₂SeO₃ 및 증류수를 첨가한 배지에서 pH 5.5~6.0, 배양온도 25~35℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 캔디다 유틸리스 균주는 캔디다 유틸리스 KS-2604인 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 사카로마아세스 세레비지애 균주의 보충용 배지는 포도당, Na₂SeO₃ 또는 SeO₂ 및 효모추출물로 구성되는 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 캔디다 유틸리스 균주의 보충용 배지는 포도당, GeO₂ 및 효모추출물로 구성되는 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 보충용 배지는 각 균주가 대수증식기로 증식하였을 때 주입되는 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 보충용 배지의 무기 셀레늄 및 무기 게르마늄의 농도는 전체 배지의 100 내지 5000 ppm인 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 보충용 배지의 무기 셀레늄 및 무기 게르마늄의 농도는 전체 배지의 1000 내지 3000 ppm인 것을 특징으로 하는 기능성 양식어류용 사료 첨가제의 제조방법.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 기능성 양식어류용 사료 첨가제.

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