KR20050108103A - 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법 - Google Patents

Abstract

게르마늄, 셀레늄 등의 무기 금속이온을 효모 균체 내로 동시에 유입시켜, 이들 무기 금속이온을 유기화하는, 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법이 개시된다. 상기 효모의 제조방법은 효모 생장용 기본 배지에 효모 균주를 접종하고, 25 내지 35℃의 온도로 24 내지 30시간 동안, 질소원과 탄소원을 추가하면서 유가배양하여 효모 균체를 다량 배양하는 과정; 및 상기 배양된 효모 균주에 무기셀레늄 및 무기게르마늄을 첨가하고, 4 내지 8시간 동안 추가 배양하는 과정을 포함한다.

Description

유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법 {Method for producing yeast including organically bound germanium and selenium}

본 발명은 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 게르마늄, 셀레늄 등의 무기 금속이온을 효모 균체 내로 동시에 유입시켜, 이들 무기 금속이온을 유기화하는, 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법에 관한 것이다.

자연계의 게르마늄은 무기게르마늄과 유기게르마늄의 두 가지 형태로 존재하며, 유기게르마늄은 무기게르마늄이 존재하는 환경에서 서식하는 미생물 및 식물체 내에 주로 존재한다. 게르마늄의 생리적 작용에 대해서는 오래 전부터 연구되어 왔다. 게르마늄은 생체 내에서 주로 세포내 산소공급 증진, 자유라디칼 제거, 중금속의 독성제거, NK세포와 마크로파지(macrophage)의 활성화, T-임파구의 생산조절 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 또한 관절염, 노인성 골다공증 뿐 만 아니라, 암에도 효과가 있음이 입증되었다(Med. Hypothesis. 26:207-215 1998). 이러한 생리활성에도 불구하고, 게르마늄을 무기게르마늄의 형태로 섭취하면, 일정농도 이상에서 인체에 강한 독성을 나타내기도 하고, 지속적으로 섭취 시 체내에 축적되어, 신장장애, 근질환, 심근증, 신경장애, 콩팥이나 간의 기능장애, 체중감소, 빈혈 등을 일으킬 수 있다((Regulatory toxicology and pharmacology 25,211-219 1997). 따라서 천연물 내에 존재하는 유기게르마늄의 형태로 게르마늄을 섭취하는 것이 일반적이며, 이와 같은 천연물로는 난치성 질병치료에 이용되는 산삼, 영지, 홍삼, 신선초, 땅두릅, 운지 등의 생약들을 예시할 수 있다.

셀레늄은 원자번호 34, 분자량이 78.96인 6b족 물질로서, 황(S)과 화학적 특성이 유사한 준금속(semi-metal)이며, 환원되면 셀레나이드(selenide, Se²⁺), 산화되면 셀레나이트(selenite, Se⁴⁺) 또는 셀레네이트(selenate, Se⁶⁺)로 존재한다. 무기태 셀레늄은 일반적으로 셀레늄과 나트륨, 칼슘 등이 결합한 염의 형태로 존재하며, 동물에서의 이용성은 별로 차이가 없으나, 나트륨과 결합한 셀레늄(sodium selenite, sodium selenate)은 물에 잘 용해되므로 피부나 점막세포와 직접 접촉하면 중독현상까지 나타날 정도로 위험하다(J.Anim.Sci.& Technol.(Kor.) 42(6) 835-848 2000). 무기태의 셀레늄은 생체 내에서 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase)의 구성 성분이 된다. 유기태 셀레늄은 Se-메티오닌(methionine), Se-시스틴(Cystine) 등, 다양한 아미노산과 셀레늄이 결합한 형태로 존재하며, 강력한 항산화력을 가진다(Carcinogenesis 20(9) 1657-1666 1999). 셀레늄은 체내에서 항산화, 항암, 면역기능과 생식기능 유지, 노화방지 등의 작용을 하는데, 특히 브로컬리나 마늘 속에는 암세포의 성장을 강력히 저해할 수 있는 셀레늄이 다량 들어있어 암을 예방하는데 도움이 되는 것으로 알려져 있다(Biomedicine & Pharmacotherapy 57 134-144 2003). 최근에는 셀레늄 강화 효모를 이용한 유기태 셀레늄의 생산방법이 보편화되고 있는데, 황과 화학적 성질이 비슷한 셀레늄을 배지에 첨가하여 효모를 배양한 후, 효모 세포 단백질을 수거하면, 효모의 체단백질을 구성하는 황 함유 아미노산들의 황이 셀레늄으로 치환되므로, 황 대신 셀레늄을 함유한 유기태 셀레늄을 얻을 수 있다.(J.Anim.Sci.& Technol.(Kor.) 42(6) 835-848 2000). 식물을 이용한 예로는 게르마늄과 셀레늄을 동시에 채소류에 처리하여 실제 섭취 시 건강에 이상이 없었고, 항산화제 함량이 증가되는 것이 보고된 바 있다(KOR.J.HORT.SCI.TECHNOL.17(5),OCTOBER 1999).

한편, 인체에 요구되는 여러 미량 원소들 중, 철은 골수에서 적혈구를 생성하는 조혈 작용에 관여하는 성분으로서, 체내에 산소와 영양분을 전해주고 노폐물과 이산화탄소를 운반하는데 중요한 기능을 한다. 또한 철은 여러 효소의 보조인자로 작용하고 충분한 양이 공급되지 못하면 결핍증이 생긴다. 이와 같은 철의 성인 일일 권장량은 10 내지 15mg이다. 또 다른 미량 원소인 아연은 생체의 성장과 건강에 필수적인 요소로, 일반적으로 식이 중에 충분히 존재하나, 어떤 원인으로 섭취가 제한되면 결핍증이 발생한다. 아연 효소는 우리 몸의 여러 대사에 관여하고 DNA나 RNA합성에 필요하며, 플라즈마 멤브레인(plasma membrane)을 안정화시킬 뿐 만 아니라, 산화과정에서 슈퍼옥시드 디스뮤타제(superoxide dismutase) 효소의 조효소로 작용하기도 한다. 성인의 아연 일일 권장량은 12 내지 15mg이다(The Science of the Total Environment 308 2003).

이와 같은 미량 원소의 공급과 관련하여, 대한민국 특허공개 제2001-99114호에는 미네랄이 첨가된 버섯사료를 닭에게 먹인 결과, 닭사육의 성장속도가 증가되고, 닭의 영양소 공급이 최대치에 달하며, 질 좋은 닭고기의 생산 및 알의 노른자 부위 응집력이 강하고 알껍질이 두터운 양질의 알을 얻었다는 것이 개시되어 있다. 또한, 게르마늄이나 셀레늄을 인체에 공급하기 위한 방법으로서, 예를 들면, 미국특허 4,530,846호에는 식용효모의 배양배지에 셀레늄을 첨가하고 배양하여 유기셀레늄을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 일본특허 소53-130483호는 게르마늄을 함유하는 효모류 및 그의 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제117,638호에는 유기게르마늄을 함유하는 효모 및 그의 제조방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법들은 특정한 성분 만을 공급하는 것으로서, 인체에서 필요로 하는 다양한 미네랄을 동시에 공급할 수 없다는 단점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 다종의 무기 이온을 동시에 효모 균체 내로 유입시킬 수 있는 효모의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 무기게르마늄 및 무기셀레늄 뿐 만 아니라, 철, 아연 등 미량 금속 이온을 용이하게 흡수하도록 효모를 처리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 생장용 기본 배지에 효모 균주를 접종하고, 25 내지 35℃의 온도로 24 내지 30시간 동안, 질소원과 탄소원을 추가하면서 유가배양하여 효모 균체를 다량 배양하는 과정; 및 상기 배양된 효모 균주에 무기셀레늄 및 무기게르마늄을 첨가하고, 4 내지 8시간 동안 추가 배양하는 과정을 포함하는 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법을 제공한다. 여기서, 상기 무기셀레늄 및 무기게르마늄과 함께, 철, 아연 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속이온을 더욱 첨가하는 것이 바람직하며, 이때 상기 무기게르마늄 및 무기셀레늄의 금속이온농도는 배양액량 기준으로 각각 1 내지 5000ppm이고, 상기 금속 이온의 농도는 500 내지 2000ppm이면 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 효모의 제조방법은 무기금속 이온이 효모의 세포 내로 원활하게 유입되도록 식용 효모를 변이 배양하여, 효모 균체 내에 유기게르마늄 및 유기셀레늄 뿐 만 아니라, 철분과 아연을 동시에 함유시킨다. 즉, 본 발명은 효모 균체를 대량으로 생산해, 여기에 무기금속 이온을 유입시킴으로서, 종래에 단일 금속이온이 들어있는 효모와 비교하여, 다수의 유용한 금속이온이 첨가된 효모의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 효모를 제조하기 위해서는, 먼저 무기게르마늄, 무기셀레늄 등 다양한 무기금속 이온에 대한 식용 효모의 내성을 증가시켜야 한다. 효모는 제빵, 술 등에 흔히 이용되어 인체에 대한 안정성이 입증된 미생물로서, 효모 체내에는 비타민류, 아미노산류, 무기질류 등이 풍부하여 자체가 여러 영양소의 공급원이고, 생체 내 대사활동에 필요한 효소를 다량 포함하고 있다. 이와 같이 영양학적으로 유용한 효모에 바람직한 생리 효과를 가지는 게르마늄, 셀레늄, 철, 아연 등을 유입시켜, 유기화된 형태로 공급한다면, 생체 내 독성이 없고 생체 이용률 및 효과면에서 우수하며 모자라기 쉬운 영양소를 동시에 공급할 수 있다.

이와 같은 효모의 무기금속 이온 내성을 향상시키기 위하여, 먼저, 효모 생장용 기본 배지로서 펩톤 2%, 효모추출물 1%, 글루코스 2% 및 물로 이루어진 YEPD (Yeast extract/peptone/dextrose) 기본배지에서 효모 균주를 25 내지 35℃ 에서 24 내지 30시간 배양하여 균체를 생산한다. 이와 같은 YEPD 기본배지에서의 균주생장을 조사한 결과를 도 1에 도시하였으며, 도 1에 도시한 바와 같이, 30시간 효모를 배양시 OD₆₀₀이 45수준에 도달함을 확인하였다. 이와 같은 기본 배지에 고농도의 무기게르마늄을 첨가하고, 효모를 생육시켜 무기게르마늄에 대한 효모의 적응(adaptation)을 유도한다. 구체적으로 예를 들면, 초기 게르마늄 농도 200ppm을 첨가한 YEPD 배지에 효모를 접종하고 증식시킨 후, O.D. 값이 일정 수치에 도달하면 높은 농도의 게르마늄이 함유된 새로운 배지로 옮겨서 배양하는 방법으로 배지 중 무기게르마늄의 농도를 5000ppm까지 점차적으로 높이면서, 28℃, 200rpm으로 24시간 동안 생육시켜 무기게르마늄에 대한 내성을 증가시킨다. 또한 초기 셀레늄을 100ppm 포함하는 YEPD 기본배지에 효모를 접종 배양하고, 게르마늄에서의 훈양 방법과 동일한 방법으로 적응된 균주들에 대해 셀레늄의 농도를 높여가면서 훈양을 실시하여, 무기셀레늄에 대한 내성을 증가시킨다. 무기게르마늄 및 무기셀레늄에 대한 효모의 내성을 증가시키는 다른 방법으로는 효모를 UV에 일정시간 노출시켜, 효모를 돌연변이 시킨 후 무기금속 이온에 대한 내성이 증가한 균주를 선별하는 방법을 사용할 수 있으며, 이와 같은 방법은 단시간에 금속이온에 대한 내성이 증가하고 균체의 성장력이 우수한 균주를 선별할 수 있으므로 바람직하다.

이와 같이 무기금속 이온에 대한 내성이 증가되고, 균체 성장력이 우수한 효모를 선별한 후, 선별된 효모 균주를 펩톤, 효모추출물, 포도당이 함유된 YEPD 배양 배지에서 25 내지 35℃의 온도로 24 내지 30시간 동안, 질소원과 탄소원을 추가하면서 유가배양하여 효모 균체를 대량 배양한다. 여기서 상기 효모의 배양 온도가 25℃ 미만이거나, 배양시간이 24시간 미만이면, 효모가 충분히 배양되지 않아, 추후 무기금속 이온의 첨가에 의하여 효모의 배양이 억제될 수 있고, 상기 효모의 배양 온도가 35℃ 를 초과하거나, 배양시간이 30시간을 초과하면, 무기금속 이온이 효모 내로 충분히 유입되지 않을 우려가 있다.

이와 같이 대량 배양된 효모 균주에 무기셀레늄 및 무기게르마늄, 필요에 따라 철, 아연, 이들의 혼합물 등 금속이온을 첨가하고, 4 내지 8시간 배양을 지속함으로서, 효모 균체 내로 무기금속 이온을 유입시켜 유기게르마늄, 유기셀레늄 및 철과 아연을 동시에 함유하는 효모 균체를 제조한다. 일반적으로 효모 등 미생물은 고농도의 금속이온이 존재하는 환경에서는 성장에 제한을 받으므로, 효모의 배양 초기에 금속이온을 다량으로 첨가하면 효모 균체의 대량생산이 곤란하다. 따라서, 본 발명에서는 배양이 완료될 시점에 금속이온을 균체내로 유입시켜, 높은 수율의 유기금속 이온 함유 효모를 제조한다. 상기 무기금속 이온을 첨가한 후, 효모의 배양시간이 4시간 미만이면, 무기금속 이온이 효모 내로 충분히 유입되지 못할 우려가 있고, 상기 효모의 배양시간이 8시간을 초과하여도 특별한 이익이 없이 생산성이 저하될 뿐이다. 상기 균체에 첨가되는 무기게르마늄으로는 GeO₂을 사용할 수 있고, 상기 무기 셀레늄으로는 Na₂SeO₃, Na₂SeO₄ 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 균체에 첨가되는 게르마늄 및 셀레늄의 금속이온농도는 배양액량기준으로 각각 1 내지 5000ppm, 바람직하게는 각각 100 내지 5000 ppm이고, 더욱 바람직하게는 게르마늄의 농도가 500 내지 3000ppm이고, 셀레늄의 농도가 500 내지 3000ppm이다. 또한, 철, 아연 등의 금속이온을 더욱 첨가할 경우, 철 또는 아연의 농도는 1 내지 2000ppm, 바람직하게는 500 내지 2000ppm이다. 여기서 상기 게르마늄, 셀레늄, 철 아연 등의 농도가 상기 범위 미만이면 충분한 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모를 얻을 수 없고, 상기 범위를 초과하여도 특별한 이익이 없이 경제적으로 불리할 뿐이다. 이와 같은 배양 과정 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 정제수로 수회 세척하여 균체 표면에 묻어 있는 무기 금속이온을 제거한 다음, 균체를 건조기에서 건조시켜 유기금속 이온이 함유된 효모를 얻을 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따라 게르마늄과 셀레늄을 동시에 효모에 유입시키면, 게르마늄과 셀레늄을 단독으로 유입시키는 경우보다, 다량의 셀레늄을 효모에 유입시킬 수 있고, 또한 철, 아연 등의 금속 이온도 원활히 효모로 유입되는 상승효과가 있다.

이하, 실시예 및 비교예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[비교예 1] 게르마늄 농도에 따른 효모 균체 내 유기게르마늄의 함량변화

게르마늄에 대한 저항성이 증가된 효모균주를 획득하기 위하여, 무기게르마늄이 200ppm 첨가된 배지에서 일정수준으로 성장된 효모균주를 점차적으로 게르마늄의 농도를 증가시킨 배지로 옮겨 배양하면서 고농도의 게르마늄에 대한 효모의 적응성을 증가시겼다. 또 다른 방법으로 UV조사에 의해 효모균주의 돌연변이를 유도하여 저항성을 증가시키는 방법을 병행하여 무기금속이온에 대한 내성이 증가된 효모균주를 획득하였다. 상기 방법에 의해 얻어진 효모균주를 펩톤 2%, 효모추출물 1%, 포도당 2%로 구성된 기본배지에 접종하고, 28℃에서 150rpm으로 24시간 배양한 후, 동일한 배지조성을 갖는 3L 배양배지에 10%(v/v)농도로 종배양액을 접종하여 28℃에서 500rpm으로 24시간 동안 탄소원과 질소원을 첨가하면서 유가배양하였다. 그 후 무기게르마늄(GeO₂)을, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 배양액량을 기준으로 0 내지 5000ppm을 첨가하고, 동일 배양조건에서 6시간 추가로 배양하였다.

효모세포 내로 유입된 게르마늄을 정량하기 위해 배양된 효모를 원심분리하여 식염수 3회, 3차 증류수로 3회 세척 후 건조기에서 건조한 후, 건조효모 1그램에 질산 10ml를 넣어 진탕하여 상온에서 16시간 방치한 후, 원심분리하여 상등액을 취하였다. 이 시료 1ml에 페닐플루오론 용액 1ml(32mg Phenylfluorone, 1ml 6N HCl / 99ml ethanol)을 넣고 강하게 진탕 후 20분간 상온에서 방치하였다. 여기에 클로로포름 : 에탄올 = 3:2(v/v) 용액을 1ml 넣고 5분간 강하게 진탕한 후, 분리된 유기용매층을 취하여 525nm에서 흡광도를 측정한 후, 게르마늄농도(1 ~ 10ppm) 표준곡선에서의 값을 찾아 희석배수를 곱하여 게르마늄 농도를 환산하였으며, 그 결과를 표 1에 함께 나타내었다. 이와 같이 분석한 결과 배지 중에 첨가한 게르마늄 농도가 높을수록 효모 세포 내로 게르마늄이온이 많이 유입되며, 5000ppm에서 균체 내 함량이 15970ppm으로 가장 높은 유기게르마늄 함량을 나타내었다.

게르마늄 농도(ppm)	균체내 게르마늄 함량(ppm)
0	0
1000	4796
2000	9760
3000	11623
4000	12905
5000	15970

[비교예 2] 셀레늄 농도에 따른 효모 균체 내 유기 셀레늄의 함량변화

무기게르마늄(GeO₂) 대신 하기 표 2의 무기셀레늄(Na₂SeO₃, Na₂SeO ₄)을 첨가한 것을 제외하고는 비교예 1과 동일한 방법으로 효모를 배양하였다. 효모 세포 내로 유입된 셀레늄을 정량하기 위해 배양된 효모를 원심분리하고, 식염수 3회, 3차 증류수로 3회 세척 후, 건조기에서 건조한 후, 건조효모 1g에 질산 10ml을 넣어 진탕하였다. 다음으로, 효모를 16시간 상온에서 방치한 후, 원심분리하여 상등액을 취해 0.2마이크론 막여과기로 여과한 다음 ICP/AES법에 의해 정량하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 정량 결과, 게르마늄에서와 마찬가지로 배지 중에 첨가된 셀레늄의 농도가 높을수록 효모 균체 내의 셀레늄 함량이 높게 나왔으며, 5000ppm농도에서 균체 내 함량이 3061ppm으로 가장 높은 셀레늄 함량을 나타내었다.

셀레늄 농도(ppm)	균체내 셀레늄함량(ppm)
0	0
1000	982
2000	1232
3000	1574
4000	2012
5000	3061

[실시예] 게르마늄, 셀레늄 및 금속이온의 혼합처리에 의한 균체 내 유기금속이온의 함량 변화

펩톤 2%, 효모추출물 1% 및 포도당 2%로 구성된 기본배지에 상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 무기금속에 대한 내성균주를 접종하고 28℃에서 150rpm으로 24시간 동안 배양한 후, 동일한 배지조성을 갖는 3L 배양배지에 10%(v/v)농도로 종배양액을 접종하고, 28℃에서 500rpm으로 24시간 동안 탄소원과 질소원을 첨가하면서 유가배양하였다. 다음으로, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 배양액에 게르마늄 1,000 내지 5,000ppm, 셀레늄 1,000 내지 5,000ppm, 철 및 아연 각각 1000 ppm을 넣어 6시간 더 배양하였다. 배양된 효모를 원심분리하여 식염수 3회, 3차 증류수로 3회 세척 후, 건조기에서 건조한 후, 균체 내의 게르마늄, 셀레늄의 함량을 비교예 1과 2에 기재된 방법으로 분석하였으며, 또한 철과 아연의 함량을 원자흡광광도계를 사용하여 분석하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

무기이온농도(ppm)	균체내 축적량(ppm)
	Ge	Se	Fe	Zn
Ge(1000) / Se(1000) / 금속이온(1000)	5034	812	796	756
Ge(2000) / Se(2000) / 금속이온(1000)	8795	1520	820	760
Ge(3000) / Se(3000) / 금속이온(1000)	11879	2634	815	779
Ge(4000) / Se(4000) / 금속이온(1000)	13257	3045	836	726
Ge(5000) / Se(5000) / 금속이온(1000)	15879	3827	830	784

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 유기게르마늄은 단독처리 시와 비슷한 경향을 보였으나, 셀레늄은 단독처리 시보다 혼합처리 시 효모 내로의 유입 함량이 증가함을 알 수 있으며, 철과 아연 역시 게르마늄 및 셀레늄과 함께 효모 내로 원활하게 유입됨을 알 수 있다. 또한 상기 실시예로부터, 효모 균체 내로 유입되는 무기금속 이온의 양은 첨가된 금속이온의 농도에 비례하여 증가하므로, 효모 배양 중 첨가하는 무기금속이온의 농도를 다양하게 조절함으로써 유기화된 금속이온의 함량을 자유롭게 조절할 수 있다.

이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법에 의하여 유기게르마늄, 유기셀레늄, 철분, 아연 등을 고농도로 동시에 함유하는 효모를 제조할 수 있다. 현재까지 알려진 방법에 의하면 유기화된 게르마늄과 셀레늄을 얻기 위해서는, 단독공정에 의해서 단일성분만을 함유하는 효모균체를 얻을 수 있었지만, 본 발명에 의해 개발된 방법을 사용할 경우 게르마늄과 셀레늄 성분 이외에 철분과 아연을 다양한 농도로 동시에 함유할 뿐만 아니라, 특히 고농도의 유기 셀레늄을 함유하는 효모를 효과적이고 경제적으로 얻을 수 있다.

도 1은 효모 생장용 기본 배지에서 효모의 생장도를 나타낸 그래프.

Claims (5)

1. 효모 생장용 기본 배지에 효모 균주를 접종하고, 25 내지 35℃의 온도로 24 내지 30시간 동안, 질소원과 탄소원을 추가하면서 유가배양하여 효모 균체를 다량 배양하는 과정; 및

   상기 배양된 효모 균주에 무기셀레늄 및 무기게르마늄을 첨가하고, 4 내지 8시간 동안 추가 배양하는 과정을 포함하는 유기게르마늄 및 유기셀레늄을 포함하는 효모의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 무기셀레늄 및 무기게르마늄과 함께, 철, 아연 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속이온을 더욱 첨가하는 것인 효모의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 무기게르마늄은 GeO₂이고, 상기 무기 셀레늄은 Na₂SeO₃, Na₂SeO₄ 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 효모의 제조방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 무기게르마늄 및 무기셀레늄의 금속이온농도는 배양액량 기준으로 각각 1 내지 5000ppm이고, 상기 금속 이온의 농도는 1 내지 2000ppm인 것인 효모의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 배양된 효모는 효모를 UV에 노출시켜 돌연변이 시킨 후, 무기금속 이온에 대한 내성이 증가한 균주를 선별하여 얻어진 것인 효모의 제조방법.