KR101231652B1 - 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체 - Google Patents

개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체 Download PDF

Info

Publication number
KR101231652B1
KR101231652B1 KR1020100139385A KR20100139385A KR101231652B1 KR 101231652 B1 KR101231652 B1 KR 101231652B1 KR 1020100139385 A KR1020100139385 A KR 1020100139385A KR 20100139385 A KR20100139385 A KR 20100139385A KR 101231652 B1 KR101231652 B1 KR 101231652B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
selenium
cerevisiae
ppm
mutant
dry cell
Prior art date
Application number
KR1020100139385A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120089949A (ko
Inventor
이상락
남효윤
김수기
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020100139385A priority Critical patent/KR101231652B1/ko
Publication of KR20120089949A publication Critical patent/KR20120089949A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101231652B1 publication Critical patent/KR101231652B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 신규 돌연변이체에 관한 발명이다.

Description

개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체{S. cerevisiae 6M with improving organic selenium production rate}
본 발명은 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 신규 돌연변이체에 관한 발명이다.
농업이 집약적으로 전개됨에 따라 토양내 이용 가능한 양질의 미량 광물질들이 해를 거듭할수록 감소되고 있는 실정이다. 그에 따라 토양에서 생산된 농작물에 있어서도 미량광물질들이 부족한 형편이다. 따라서 일반적으로 사료용 곡물 및 조사료 등에서 미량광물질의 결핍을 보충하기 위하여 사료 배합시에 무기태 미량광물질의 첨가가 필요하다.
가축에게 중요한 미량광물질 중의 하나인 selenium은 원자번호 34, 분자량이 78.96인 6b족 원소로 황(S)과 화학적 특성이 매우 비슷한 준금속(semi-metal)이며, 환원되면 selenide (Se-2), 산화되면 selenite (Se+4) 또는 selenate (Se+6)로 존재할 수 있다. 일반적인 토양에는 selenium의 함량이 매우 낮지만(1 ppm), 지역에 따라 토양 중 함량이 매우 높아서 토양 중 selenium이 식물에 전이되고 그 식물을 먹은 동물이나 인체에서 selenosis를 유발하기도 한다(Kim Y. Y. 2000. J. Anim. Sci. & Technol. (Kor.) 42(6):835-848).
Selenium은 1817년 스웨덴의 화학자 J. J. Berzelius가 금속 제련과정 중에 생긴 황산의 잔류물에서 발견하여 붙인 이름으로 50여년 전까지는 중독광물질로 여겨져 왔었다. 그러나 Schwarz와 Foltz에 의해 selenium은 쥐의 간 손상을 예방할 수 있는 물질로 알려지면서, 생리적으로 세포질에서 항산화 역할을 하는 glutathione peroxidase (GSH-Px)의 구성 성분이라는 것이 뒤늦게 밝혀진 후부터(Rotruck J. T., 등. 1973. Science. 179:588-590) selenium은 필수 미량광물질로 인식되고 있다. Selenium 결핍은 GSH-Px의 활성을 떨어뜨려 대사과정 중에 생기는 과산화물(H2O2)를 효과적으로 제거하지 못하므로 세포의 기능장애 또는 세포의 파괴를 유발한다(Eklow L., 등. 1981. FEBS Lett. 127:125-128).
동물이나 사람에게서 selenium의 결핍은 여러 가지 대사성 질병을 유발하는데, 생리적인 주요 변화에는 성장지연, 피부병, 탈모, 시각장애, 번식장애, 간이나 근육의 괴사가 일어난다(Kohrl J., 등. 2000. Biol Chem 381(9-10):849-864). 면양과 축우에서 발생하는 백근증(white muscle disease)은 근육조직의 괴사로 인하여 유발되는데, selenium의 결핍으로 체내에서 형성된 H2O2와 같은 산화물질들에 의해 근육내 myogloblin이 파괴되어 근육 특유의 홍적색을 띄지 못하고 전체적으로 근육의 색깔이 엷어져서 흰색에 가까워 도살된 가축의 selenium 결핍 여부를 쉽게 판단할 수 있는 좋은 수단이 될 수 있다(Schwarz K. 1976. Essentiality and metabolic functions of selenium. Med. Clin. North America. 60:745-757).
전 세계적으로 selenium의 결핍증은 방목을 위주로 하는 반추 동물들에서 자주 일어나며 특히 selenium 결핍상태인 어미로부터 태어난 어린 동물에서는 자주 발생하고 있으나, 비육후기의 동물들에서는 외관상으로 결핍증을 판별하기는 어렵다(Ammerman C. B. and S. M. Miller. 1975. Selenium in ruminant nutrition : A review. J. Dairy Sci. 58:1561-1577).
닭에서 selenium 결핍은 간괴사, 근육위축, 삼출성질병, 췌장 섬유증, 빈약한 깃털, 면역결핍, 생식능력의 감소, 그밖에도 많은 증상들이 있다(Shamberger R. J. 1983. Selenium deficiency diseases in animals. Pages 31-58. In: Biochemistry of Selenium. Plenum press, New York, NY 10013). 한편, selenium 함량이 낮은 사료를 급여한 산란계에서의 산란율은 54~58%였으나, selenium을 첨가하면 산란율이 75~80%로 유의하게 산란 성적이 개선되었다(Latshaw J. D. and Osman. 1974. A selenium and vitamin E responsive condition in the laying hen. Poultry Sci. 53:1704-1708).
Selenium이 동물 체내에서 항산화작용을 하는 GSH-Px의 구성성분이라는 것이 밝혀지면서 1974년 미국 FDA에서 모든 돼지사료에 0.1 ppm의 무기태 selenium첨가를 허용하기에 이르렀다. 또한 1987년 FDA는 모든 돼지사료에 무기태 selenium 0.3 ppm 수준으로 첨가할 수 있도록 개정하였다. 한편 2000년 6월 6일부터 미국 FDA는 selenium yeast형태의 유기태 selenium의 사용을 가금 사료에 처음으로 허가하였다. 현재 우리나라 사료관리법 시행령에 따르면 배합사료에 첨가할 수 있는 selenium의 허용범위를 돼지와 가금류는 4 ppm, 비육우와 축우를 비롯한 다른 가축들의 경우는 2 ppm으로 제시하고 있다.
무기태 selenium (selenite 또는 selenate)은 단순 확산에 의해 흡수되므로 일반적으로 외관상 소화율이 80% 정도로 능동수송에 의해 운송되는 유기태 selenium보다 높다(Kim Y. Y. and D. C Mahan. 2001. Asian-Aus. J. Animal. Sci. 14(2):243-249). 그러나 흡수된 무기태 selenium의 대부분은 뇨를 통해서 체외로 다시 배출되고, 실제적으로 체내에 축적되는 selenium의 양은 체외로 배설되는 양이 상대적으로 적은 유기태 selenium 첨가시에 더 높게 나타난다(Kim Y. Y. and D. C. mahan. 2001. J. Anim. Sci).
흡수된 selenium은 혈액을 통하여 체내 여러 조직으로 운송되어 축적되는데 간과 신장에서 가장 높은 농도를 보인다. 동물의 혈액 중 selenium은 짧은 기간 동안의 영양상태를 나타내지만, selenium이 조직 중에 축적되는 데는 상당한 시간이 소요되므로 조직중의 selenium 농도는 장기간의 selenium 영양상태를 나타낸다고 할 수 있다. 동물조직 중 간에서의 selenium 농도는 동물에서 selenium 결핍 여부를 결정하는 좋은 지표로 사용될 수 있다(Ammerman C. B. and S. M. Miller. 1975. A review. J. Dairy Sci. 58:1561-1577). 체내조직에 따라서도 축적되는 양이 달라지는데, 일반적으로 유기태가 무기태 selenium보다 체내축적이 더 많이 된다(Kim Y. Y. and D. C Mahan. 2001. Asian-Aus. J. Animal. Sci. 14(2):243-249).
사람이나 동물과는 달리 식물은 sodium selenite를 selenomethionine으로 전환할 수 있는 능력이 있다. 대두박, 밀, 그리고 옥수수에 함유되어 있는 총 selenium의 80% 이상은 이와 같은 유기태 형태이다. 이것을 가축에게 급여하면 근육과 간 등의 조직에 축적되어 이용된다. 따라서 selenomethionine은 번식과 질병 예방 등에 있어서 필요한 양을 체내 단백질에 축적 시킴으로써 그 역할이 매우 중요하다.
한편, Saccharomyces cerevisiae의 자가소화(autolysis)에 의해 생산된 yeast extract는 미생물 발효 배지, 조미료, 건강식품 등의 원료로서 많이 이용되고 있다(Choi S. J. and Chung B. H. 1998. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 13:308-311). 금속 흡수를 위해 생물적 흡수체(biosorbent)로서 S. cerevisiae의 잇점으로는 S. cerevisiae는 복잡하지 않는 발효 기술을 이용하여 쉽게 대량 생산할 수 있고 성장 배지가 비싸지 않으며 균체량 또한 높다. S. cerevisiae는 다양한 식품과 산업적 음료로부터 얻을 수 있으며, waste residuals에 S. cerevisiae의 공급은 기본적으로 안전하다고 평가되었다. 일반적으로 S. cerevisiae는 실제 적용했을 때 대중적으로 받아들이기 쉬울 뿐만아니라 금속이온 제거에 있어, 특히 분자수준에 있어 금속과 미생물의 상호작용의 흡수 메카니즘을 규명하기 위한 이상적 model organism이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 유기태 selenium 생산효율이 높은 효모 돌연변이체 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유기태 selenium의 생산성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 개량된 유기태 셀레늄 생산 활성을 가지는 S. cerevisiae 6M(KACC93114P) 돌연변이체 균주를 제공한다.
이하 본 발명을 서술한다.
본 발명에서는 wild type 균주 중 유기태 selenium 생산효율이 우수한 균주를 탐색하고, UV 돌연변이를 실시하여 생산성이 더욱 증진된 균주를 개발한 후, 유기태 selenium 생산성 향상을 위하여 배양성분 및 배양조건을 최적화하였다.
먼저 본 발명에서는 유기태 selenium 생산성이 우수한 wild type S. cerevisiae와 S. cerevisiae의 UV mutant를 선별하였다.
S. cerevisiae wild type 균주 13종 중 S. cerevisiae KCCM 12635이 selenium uptake 효율이 가장 높아 UV mutagenesis를 위한 wild type strain으로 선별하였다. 이 S. cerevisiae KCCM 12635에 5 분간의 UV 조사를 통하여 UV mutagenesis를 실시하였으며, selenium 농도 2000 ppm에서 생존하는 돌연변이균주를 선발하여 selenium uptake 효율을 비교하였다. 돌연변이에 의해 생성된 균주 중 S. cerevisiae 6M 균주에서 가장 높은 selenium uptake를 나타내었다. UV 돌연변이 S. cerevisiae 6M은 wild type S. cerevisiae KCCM 12635보다 selenium 생산효율이 1.23 배 증가하였다.
본 발명의 S. cerevisiae 6M 균주는 2010년 12월21일 대한민국 수원시 서둔동 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 KACC93114P로 기탁하였다.
다음으로, 본 발명에서는 UV 돌연변이에 의해 selenium uptake 효율이 증진된 S. cerevisiae 6M의 배양조건 최적화를 실시하였다.
S. cerevisiae 6M의 fed-batch culture시 selenium 농도를 0, 31, 63, 125, 250, 500 및 1000 ppm의 수준으로 다양하게 배치하고, 배양 0 시간에 selenium을 농도별로 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 24 시간동안 배양하였다. 배양액 내 selenium 농도가 125 ppm일 때 selenium uptake가 가장 높게 나타났다. Selenium 첨가시간을 0, 3 및 9 시간으로 하였을 때, selenium을 0 시간에 첨가시 유기태 selenium 생산량이 가장 높았다. Selenium을 0 시간에 첨가 후 24 시간까지 배양하며 selenium 생산량을 조사한 결과, 배양 9 시간때에 가장 높은 selenium 생산량을 나타내었다. 또한 초기 pH를 3에서 7까지 조사하였을때 초기 pH 6으로 조정시 selenium 생산량은 10.87 mg/L로 가장 높게 나타났다.
다음으로 본 발명에서는 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 fed-batch 배양시 유기태 selenium 생산 효율을 높이기 위한 배지의 최적화를 실시하였다.
탄소원으로 glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose 및 lactose를 첨가하여 실험한 결과, galactose 첨가시 selenium uptake가 가장 높게 나타났으며, 질소원으로 yeast extract, malt extract, peptone, urea, ammonium sulfate 및 ammonium phosphate를 첨가하여 조사한 결과 peptone 첨가시 selenium uptake가 가장 높게 나타났다. 탄소원으로 glucose와 galactose, 질소원으로 peptone을 이용하여 C/N 비율을 1, 3, 5, 7 및 9 의 다섯 수준으로 하여 배양하였을 때 glucose와 peptone의 C/N 비율이 7일 때 selenium uptake가 가장 많았다. 미네랄 첨가가 selenium uptake에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 미네랄 총 12 종(MgSO4, KCl, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCl2, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, MgCl2, CuSO4, FeCl3)을 각각 0.05%씩 첨가하여 조사한 결과 MgSO4와 KCl 첨가시 selenium uptake가 가장 높았다. 반응표면모델(Response surface model)에 의해 배지를 최적화하기 위하여 glucose와 peptone 그리고 MgSO4와 KCl의 최적 농도를 탐색하였다. 각각의 배지 성분들을 3가지 수준으로 하여 Box-Behnken design으로 실험을 설계하였고 총 27개의 실험을 수행하였다. 그 결과 glucose, peptone, MgSO4 및 KCl의 최적 농도는 27.73, 11.40, 0.30, 0.81 g/L으로 나타났으며, 이때 총 selenium 생산량의 반응 기대치는 31.57 mg/L으로 나타났다.
본 발명에서 유기태 selenium의 생산효율을 증진시키기 위하여 다양한 wild type S. cerevisiae로부터 선별한 균주를 UV조사를 통하여 분리한 돌연변이주 6M은 fed-batch에서의 최적 배양조건은 배양 0 시간에 selenium을 첨가하고, 9 시간에 배양을 완료하며, 배양액 내 selenium농도를 125 ppm으로 하고, 배양 초기 pH를 6으로 하는 것으로 조사되었다.
또한 탄소원으로는 galactose, 질소원으로는 peptone이 가장 효율이 좋았으며, glucose와 peptone의 C/N 비율은 7로 하며, 미네랄 공급원으로 magnesium sulfate와 potassium chloride를 첨가하였을 때 유기태 selenium의 생산 효율을 가장 높일 수 있을 것이라 사료되었다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 selenium yeast 생산을 위한 최적 배양 조건을 맞추는 실험을 실시하였다. 배양액 내 selenium농도 125 ppm일 때 selenium uptake가 가장 높게 나타났으며, 배양 0 시간에 selenium을 첨가한 후, 9 시간 배양 시 selenium uptake가 가장 높게 나타났다. 또한 배양 초기 pH가 6일 때 selenium uptake가 가장 높게 나타났다.
또한 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 selenium yeast 생산 효율을 높이기 위한 배지의 최적화를 실시하였다. 탄소원 중 galactose 첨가 시 selenium uptake가 가장 높게 나타났으며, 질소원으로는 peptone 첨가 시 selenium uptake가 가장 높게 나타났다. 또한 탄소공급원에 따른 C/N의 비율은 glucose와 peptone에 있어 C/N 비율이 7일 때 가장 높게 나타났다. 미네랄 공급원 중 MgSO4과 KCl을 각각 첨가시 selenium uptake가 가장 높았다. 반응표면모델(Response surface model)에 의해 glucose, peptone, MgSO4 및 KCl의 농도를 27.73, 11.40, 0.30 그리고 0.81 g/L로 하였을 때 총 selenium 생산량의 반응 기대치는 31.57 mg/L로 높게 나타났다.
상기의 결과로부터, S. cerevisiae 6M의 fed-batch 배양시 배양 0 시간에 selenium을 첨가한 후, 9 시간에 배양을 완료하고, 배양액 내 selenium농도를 125 ppm으로 하며, 배양 초기 pH는 6으로 조절하였을 때 생산효율이 가장 높게 나타는 것을 알 수 있으며, 탄소원으로는 galactose, 질소원으로는 peptone 가장 효율이 좋았으며, glucose와 peptone의 비율을 7로 하고 미네랄 공급원으로 magnesium sulfate와 potassium chloride를 첨가하였을 때, 유기태 selenium 생산 효율을 가장 높일 수 있는 효과를 나타내었다.
도 1은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 여러 야생형 S. cerevisiae 균주의 건조 세포 중량을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 2는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 여러 야생형 S. cerevisiae 균주의 셀레늄 농도를 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 여러 야생형 S. cerevisiae 균주의 전체 셀레늄 생성을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이형 S. cerevisiae 균주의 건조 세포 중량을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이형 S. cerevisiae 균주의 셀레늄 농도를 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이형 S. cerevisiae 균주의 전체 셀레늄 생성을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 S. cerevisiae 야생형(KCCM 12635) 및 돌연변이 균주(6M)의 건조 세포 중량을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 S. cerevisiae 야생형(KCCM 12635) 및 돌연변이 균주(6M)의 셀레늄 농도를 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 S. cerevisiae 야생형(KCCM 12635) 및 돌연변이 균주(6M)의 전체 셀레늄 생성을 나타낸 그래프이다. 에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 여러 셀레늄 농도를 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M에서 건조 세포 중량을 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 11은 여러 셀레늄 농도를 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M에서 셀레늄 농도를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 여러 셀레늄 농도를 포함하는 YM배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M에서 총 셀레늄 생산을 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포 중량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 흡광도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 건조 세포중량에 대한 셀레늄 급여의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 16은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 셀레늄 농도에 대한 셀레늄 급여 시간의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 17은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 전체 셀레늄 생성률에 대한 셀레늄 급여의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 18은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 건조 세포중량에 대한 수집 시간의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 19는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 수집 시간의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 20은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생산에 대한 수집 시간의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 21은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 S. cerevisiae KCCM 12635(a) 및 돌연변이 S. cerevisiae 6M(b)의 건조 세포중량에 대한 초기 pH의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 S. cerevisiae KCCM 12635(a) 및 돌연변이 S. cerevisiae 6M(b)의 셀레늄 농도에 대한 초기 pH의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 23은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 S. cerevisiae KCCM 12635(a) 및 돌연변이 S. cerevisiae 6M(b)의 총 셀레늄 생성에 대한 초기 pH의 효과를 나타낸 그래프이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 24는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량에 대한 여러 탄소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 25는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 여러 탄소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 26은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생성에 대한 여러 탄소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 27은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량에 대한 여러 질소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 28은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 여러 질소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 29는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생성에 대한 여러 질소원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 30은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포 중량에 대한 탄소원 및 C/N 비율의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.(a) Glucose/peptone, (b) Galactose/peptone.
도 31은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 탄소원 및 C/N 비율의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.(a) Glucose/peptone, (b) Galactose/peptone.
도 32는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생산에 대한 탄소원 및 C/N 비율의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.(a) Glucose/peptone, (b) Galactose/peptone.
도 33은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포 중량에 대한 여러 광물원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 34는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 여러 광물원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 35는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생산에 대한 여러 광물원의 효과를 나타낸 그림이다.에러바는 3회 반복의 표준 편차를 나타낸다.
도 36은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량의 반응에 대한 이차 다중 회귀 모델을 나타낸다.Y는 건조 세포 중량(g/l)의 예측된 반응을 의미하고, X1, X2, X3 및 X4는 각각 포도당, 펩톤, MgSO4 및 KCl에 대한 변수의 비코드된 값(g/l)이다.
도 37은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량의 관찰 값과 예측값을 나타낸 그림이다.
도 38은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량에 대한 영양분의 효과를 나타내는 3차원 플롯. (A) MgSO4 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 펩톤의 효과; (B) 펩톤 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 MgSO4 의 효과; (C) 펩톤 및 MgSO4의 중앙 지점에서 포도당 및 KCl의 효과; (D) 포도당 및 KCl의 중앙 지점에서 펩톤 및 MgSO4의 효과; (E) 포도당 및 MgSO4의 중앙 지점에서 펩톤 및 KCl의 효과;(F) 포도당 및 펩톤의 중앙 지점에서 MgSO4 및 KCl의 효과.
도 39는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 세포 셀레늄에 대한 이차 다중 회귀 모델을 나타낸다.Y는 세포 셀레늄의 예측된 반응(ug/g)의 예측된 반응을 의미하고, X1, X2, X3 및 X4는 각각 포도당, 펩톤, MgSO4 및 KCl에 대한 변수의 비코드된 값(g/l)이다.
도 40은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도의 관찰 값과 예측값을 나타낸 그림이다.
도 41은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 영양분의 효과를 나타내는 3차원 플롯. (A) MgSO4 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 펩톤의 효과; (B) 펩톤 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 MgSO4의 효과; (C) 펩톤 및 MgSO4의 중앙 지점에서 포도당 및 KCl의 효과; (D) 포도당 및 KCl의 중앙 지점에서 펩톤 및 MgSO4의 효과; (E) 포도당 및 MgSO4의 중앙 지점에서 펩톤 및 KCl의 효과;(F) 포도당 및 펩톤의 중앙 지점에서 MgSO4 및 KCl의 효과.
도 42는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 총 셀레늄 생산의 반응에 대한 이차 다중 회귀 모델을 나타낸다.Y는 총 셀레늄 생산률의 예측된 반응(mg/l)의 예측된 반응을 의미하고, X1, X2, X3 및 X4는 각각 포도당, 펩톤, MgSO4 및 KCl에 대한 변수의 비코드된 값(g/l)이다.
도 43은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생산의 관찰 값과 예측값을 나타낸 그림이다.
도 44는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생산에 대한 영양분의 효과를 나타내는 3차원 플롯. (A) MgSO4 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 펩톤의 효과; (B) 펩톤 및 KCl의 중앙 지점에서 포도당 및 MgSO4의 효과; (C) 펩톤 및 MgSO4의 중앙 지점에서 포도당 및 KCl의 효과; (D) 포도당 및 KCl의 중앙 지점에서 펩톤 및 MgSO4의 효과; (E) 포도당 및 MgSO4의 중앙 지점에서 펩톤 및 KCl의 효과;(F) 포도당 및 펩톤의 중앙 지점에서 MgSO4 및 KCl의 효과.
도 45는 이차 모델을 사용한 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포 중량에 대한 반응 결과 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 46은 이차 모델을 사용한 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 셀레늄 농도에 대한 반응 결과 프로파일을 나타낸 그림이다.
도 47은 이차 모델을 사용한 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 총 셀레늄 생산에 대한 반응 결과 프로파일을 나타낸 그림이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 서술한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1-1: S. cerevisiae wild type 균주 중 selenium 저항력과 selenium uptake 효율이 우수한 균주의 선별
1)균주
본 발명에서 사용된 13종의 S. cerevisiae 균주는 표 1과 같다. 한국 생명공학연구소 유전자은행(Korea Collection for Type Culture; KCTC)에서 제공하는 S. cerevisiae 8종의 균주(KCTC 7928, 7108, 7906, 7112, 7964, 7107, 7106, 7905)와 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganism; KCCM)에서 제공하는 S. cerevisiae 5종의 균주(KCCM 50559, 12635, 50151, 12648, 11520)를 분양받아 사용하였다.
Figure 112010087785426-pat00001
표 1은 본 발명에 사용된 Saccharomyces cerevisiae 균주를 나타낸 표이다.
2) 배지 및 배양
S. cerevisiae를 배양하기 위한 기본배지로서는 YM broth (glucose 10 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L, peptone 5 g/L)를 사용하였으며. YM agar 조제를 위하여 agar를 1.5%로 첨가하였다. 모든 배지는 121℃, 1 kg/cm2으로 15 분간 멸균 후 사용하였다. 본 실험에 사용한 균주는 DMSO (dimethylsulphoxide) 10%를 첨가하여 -70℃ deep freezer에 보관하여 사용하였다. S. cerevisiae를 revive 하기위하여 YM agar에 도말한 후, 30℃에서 48 시간 배양하였다.
고농도 selenium의 저항성을 보기 위한 배지는 YM agar에 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가하여 selenium농도를 50, 125, 250, 500, 1000, 1500, 2000 및 2500 ppm이 되도록 제조하여 멸균 후 사용하였다.
S. cerevisiae의 fed-batch 실험을 위한 배양액은 1000 mL 삼각 flask에 YM broth 500 mL를 제조 멸균 후, S. cerevisiae의 균액 3 mL를 접종하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm) (VS-8480SF, VISION Scientific co., Korea)에서 24 시간 배양한다. 멸균된 250 mL 삼각 flask에 S. cerevisiae 배양액을 60 mL씩 분주하였으며, feeding medium으로는 배양액 내 selenium 농도가 125 ppm으로 조절되도록 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가한 YM broth 30 mL씩 첨가 하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm)에서 24 시간 배양하였다.
실시예 1-2:S. cerevisiae KCCM 12635의 UV 돌연변이 균주의 선별
1) 균주
상기 실시예 1-1에서 유기태 selenium 생산효율이 가장 높은 S. cerevisiae KCCM 12635를 사용하였다.
2) 배지 및 배양
UV 조사 후 저항성이 향상된 균주를 선발하기 위한 고농도 selenium배지는 YM agar에 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가하여 배지내 selenium 농도를 2,000 ppm으로 조정하였다. UV 조사 후 균액을 고동도 selenium 배지에서 2일 동안 30℃에서 배양 한 후 생존하는 colony를 취하여 여러 번의 계대배양 후, selenium uptake 효율을 조사하였다.
S. cerevisiae의 fed-batch 실험을 위한 배양액은 1000 mL 삼각 flask에 YM broth 500 mL를 제조 멸균 후, S. cerevisiae의 균액 3 mL를 접종하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm) (VS-8480SF, VISION Scientific co., Korea)에서 24 시간 배양한다. 멸균된 250 mL 삼각 flask에 S. cerevisiae 배양액을 60 mL씩 분주하였으며, feeding medium으로는 배양액 내 selenium 농도가 125 ppm으로 조절되도록 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가한 YM broth 30 mL씩 첨가 하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm)에서 24 시간 배양하였다.
실시예 1-3:Wild type과 UV 돌연변이 균주의 yeast selenium 생산 능력 비교
1) 균주
실시예 1-1에서 유기태 selenium 생산효율이 가장 좋았던 S. cerevisiae KCCM 12635와 실시예 1-2에서 돌연변이를 실시하여 생산효율이 증진된 S. cerevisiae 6M을 사용하였다.
2) 배지 및 배양
S. cerevisiae의 fed-batch 실험을 위한 배양액은 1000 mL 삼각 flask에 YM broth 500 mL를 제조 멸균 후, S. cerevisiae의 균액 3 mL를 접종하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm) (VS-8480SF, VISION Scientific co., Korea)에서 24 시간 배양한다. 멸균된 250 mL 삼각 flask에 S. cerevisiae 배양액을 60 mL씩 분주하였으며, feeding medium으로는 배양액 내 selenium 농도가 125 ppm으로 조절되도록 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가한 YM broth 30 mL씩 첨가 하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm)에서 24 시간 배양하였다.
4) 돌연변이
실시예1-1에서 유기태 selenium 생산 효율이 가장 우수한 균주를 선별하여 돌연변이 균주로 사용하였다. Colony를 YM broth에 접종하여 shaking incubator (VS-8480SF, VISION Scientific co., Korea) (30℃, 180 rpm)에서 24 시간 배양한 후, 균액과 YM broth를 1:1로 혼합 희석 하였다. 이 희석된 균액에 UV Lamp(6 W, 254 nm, Sankyo denki, Japan)를 30 cm의 높이에서 생존율이 약 20%인 5 분 동안 조사하여 돌연변이를 유발하였다.
5) 분석 방법
건조 균체량 측정
배양액을 원심분리 tube에 담아 원심분리(3000 gx 10 min, 4℃) (SUPRA 21K, Hanil co., Korea)한 후, 상등액을 버린 균체에 증류수를 가하여 세 번에 걸쳐 씻은 후 모은 균체량은 70℃로 설정된 건조기(NDO-500, EYELA, Japan)에서 24 시간 동안 건조시킨 후 균체 무게를 측정하였다.
Selenium 정량
배양액 10 mL를 원심분리 tube에 담아 원심분리(3000 g x10 min, 4℃) (SUPRA 21K, Hanil co., Korea)한 후, 상등액을 버린 균체에 증류수 10 mL를 가하여 두 번에 걸쳐 씻은 후 모은 균체량에 HNO3 10 mL와 H3PO4 1 mL를 넣고 Microwave (MARS, CEM corperation, USA)를 이용하여 190℃에서 15 분간 분해 후, 증류수로 희석하여 ICP-OES(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometers, Varian VISTA-PRO, USA)를 이용하여 측정하였다.
6) 통계분석
본 발명에서 얻어진 실시예 1-1과 1-2의 결과는 SAS package program (2002, release 9.1 version)의 GLM (general linear model) procedure를 이용하여 처리구간 분산분석을 실시하였고, 유의성은 Duncan's multiple range test에 의해 probability 값 5% 수준에서 검정을 하였다(Steel과 Torrie, 1980). 그리고 실험 1-3에서 얻어진 결과는 두 처리구(wild type 균주 vs mutamt 균주)간의 평균값의 비교는 T-test procedure를 이용하여 분석하였다.
상기 실시예 1의 결과는 다음과 같다.
S. cerevisiae wild type 균주 중에서 selenium에 대한 저항 능력이 높은 균주를 선별하기 위하여, KCTC에서 분양받은 8종(S. cerevisiae KCTC 7928, KCTC 7108, KCTC 7906, KCTC 7112, KCTC 7964, KCTC 7107, KCTC 7106, KCTC 7905)과 KCCM에서 분양받은 5종(S. cerevisiae KCCM 50559, KCCM 12635, KCCM 50151, KCCM 12648, KCCM 11520)의 균주에 대해 YM agar에 selenium을 농도별로 첨가하여 생존능력을 조사한 결과는 표 2에 나타내었다.
Selenium을 첨가 시 S. cerevisiae의 생존능력은 감소하는 경향을 보였다. Selenium 50 ppm 배지에서 KCCM 12648과 KCTC 7107 두 균주는 생존이 억제되어 selenium에 대한 저항 능력이 전혀 없는 것으로 사료되며, 나머지 11 균주는 125 ppm의 selenium 농도까지 생존하였다. 그러나 selenium 250 ppm의 농도에서는 KCTC 7964와 KCTC 7905 두 균주 또한 생존이 억제되었으며, 다른 9종의 균주의 CFU/mL은 다소 감소하는 경향을 보였다. Selenium 농도 500 ppm에서는 KCTC 7928, KCTC 7108, KCCM 12635 및 KCTC 7106 총 4개의 균주만 생존했으며, KCCM 12635에서 7.4x106 CFU/mL로 가장 높은 저항능력을 보였다. 또한 KCTC 7106는 4.8x103 CFU/mL으로 낮은 생존능력을 나타냈지만 selenium의 2500 ppm의 농도에서도 1.1x104 CFU/mL 생존하여 selenium에 대한 높은 저항 능력을 보였다.
S. cerevisiae KCCM 12635는 배지내 selenium 500 ppm 농도에서 7.4x106 CFU/mL로 가장 높은 생존하는 능력을 보였다. 반면 S. cerevisiae KCTC 7106 1.8 x103 CFU/mL로 낮은 생존능력을 보였지만 2500 ppm의 고농도에서도 생존하는 높은 저항 능력이 나타났다.
Figure 112010087785426-pat00002
표 2는 여러 농도의 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 야생형 S. cerevisiae 균주의 생존성을 나타낸 표이다.
S. cerevisiae wild type의 균주에 대한 selenium uptake 능력을 비교한 결과, KCTC 7107의 건조균체량은 1.83 g/L으로 유의적으로 가장 높게(P<0.05) 나타났으나(표 3), 건조균체량내 selenium 함량은 2.25 mg/g으로 낮게 나타났다. S. cerevisiae KCCM 50559와 S. cerevisiae KCCM 12635 균주에서는 건조균체량내 selenium 함량은 각각 3.77과 3.98 mg/g으로 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05).
앞서 진행한 selenium 농도에 대한 저항 실험에서 낮은 생존율로 고농도에서까지 생존하는 selenium에 대한 저항 능력을 보였던 S. cerevisiae KCCM 7106의 건조균체량, 균체내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량은 각각 1.30 g/L, 1.29 mg/g 및 1.68 mg/L로 모든 항목에서 가장 낮게 나타났다(P<0.05). 따라서 S. cerevisiae KCTC 7106은 selenium uptake를 하지 않음으로써 고농도에서 생존할 수 있었다고 사료된다. 배지내 selenium 농도 500 ppm에서 높은 생존율을 보이며 저항 능력이 높았던 S. cerevisiae KCCM 12635는 건조균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량이 각각 3.98 mg/g 과 6.69 mg/L로 가장 높게(P<0.05) 나타났다( 도 1, 2, 및 3).
Wild type 균주 13종의 건조균체내 selenium 함량은 1.29 mg/g부터 3.98 mg/g으로 다양하게 나타내었다.
결론적으로 S. cerevisiae wild type의 13종 균주 중 KCCM 12635에서 selenium 저항 능력이 가장 높으며, 건조균체내 selenium 함량 및 총 생산량이 가장 높은 균주로 판단되어 다음의 실험에서 wild type 균주로 생산성이 가장높은 S. cerevisiae KCCM 12635를 사용하였다.
Figure 112010087785426-pat00003
표 3은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 여러 야생형 S. cerevisiae 균주의 건조 세포중량 및 셀레늄 섭취를 나타낸 표이다. 표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내고, a,b,c,d,e,f ;동일 컬럼에서 다른 윗첨자를 가지는 평균들이 유의적으로 다르다(P<0.05).
실시예 1-1에서 유기태 selenium 생산량이 가장 높은 균주로 선별된 S. cerevisiae KCCM 12635에 UV 돌연변이를 유발하였다. Selenium에 대한 저항 능력이 높은 mutation 균주를 선발하여, selenium 첨가 배지에서 fed-batch 배양시 건조 균체량, 건조균체내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량의 비교는 Table 1-4에 나타내었다.
건조균체량은 UV 돌연변이 균주 S. cerevisiae 3, 4, 5, 6, 7 및 8M (각각 1.82, 1.71, 1.77, 1.77, 1.75 및 1.78 g/L)에서 모균주인 S. cerevisiae KCCM 12635 (1.61 g/L)보다 높게 나타났다. S. cerevisiae 3M에서 건조균체량은 1.82 g/L으로 가장 높게(P<0.05) 나타났으나(도 4), 건조균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량은 각각 3.61 mg/L과 6.56 mg/L로 가장 낮게 나타났다(P<0.05). S. cerevisiae 6M에서 건조균체량은 1.77 g/L로 높게 나타났으며, 건조균체량내 selenium 함량과 총 selenium 생산량은 각각 4.55 mg/L와 7.94 mg/L로 가장 높게(P<0.05) 나타났다(도 5). 총 selenium 생산량은 모든 돌연변이 균주에서 모균주(S. cerevisiae KCCM 12635)보다 높게(P<0.05) 나타났다(도 6).
이와 같은 결과에서 UV 돌연변이를 통해 wild type에서 selenium 생산성이 가장 높았던 S. cerevisiae KCCM 12635보다 건조균체량, 건조균체량 내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량 모두 증진 시키는 효과를 얻을 수 있었으며, 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M에서 가장 높은 생산량을 얻을 수 있었다.
Figure 112010087785426-pat00004
표 4는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 여러 돌연변이형 S. cerevisiae 균주의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생산을 나타낸 표이다. 표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내고, a,b,c,d,;동일 컬럼에서 다른 윗첨자를 가지는 평균들이 유의적으로 다르다(P<0.05).
실시예 1-1에서 wild type 균주 중 selenium uptake 및 유기태 selenium 생산효율이 가장 좋은 균주 S. cerevisiae KCCM 12635와 실시예 1- 2에서 UV 돌연변이 균주 중 유기태 selenium 생산 효율이 가장 높은 S. cerevisiae 6M의 상대적 우수성을 비교한 결과는 표 5와 같다.
UV 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M에서 건조균체량, 건조균체량내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량이 각각 1.77 g/L, 4.94 mg/g 및 8.76 mg/L으로 S. cerevisiae KCCM 12635의 건조균체량, 건조균체량내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량 1.63 g/L, 4.36 mg/g 및 7.11 mg/L 보다 유의하게 높게 나타났다(P<0.05) (도 7, 8, 및 9). 따라서 S. cerevisiae 6M과 S. cerevisiae KCCM 12635를 비교하였을 때 건조균체량, 건조균체량 내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량은 각각 1.09, 1.13 및 1.23의 비율로 증가하였다.
본 발명에서는 UV 돌연변이를 실시하여 생성된 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M은 wild type 균주 중 높은 유기태 selenium 생산효율을 가진 균주로 선별된 S. cerevisiae KCCM 12635보다 유기태 selenium 생산 효율이 더욱 증진되었음을 확인할 수 있었다.
Figure 112010087785426-pat00005
표 5는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM배지에서 배양된 S. cerevisiae 야생형(KCCM 12635) 및 돌연변이 균주(6M)의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생산을 나타낸 표이다.표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내고,* ; P<0.05을 나타낸다.
상기 본 발명의 실시예에서는 S. cerevisiae wild type 균주 13종(KCTC 7928, 7108, 7906, 7112, 7964, 7107, 7106, 7905; KCCM 50559, 12635, 50151, 12648, 11520)중 selenium에 대한 저항성이 높고, 유기태 selenium생산성이 높은 균주를 선별하고, UV 돌연변이를 실시하여 유기태 selenium 생산을 증진시키는 균주를 개발하였다.
S. cerevisiae KCCM 12635는 배지 내 selenium 500 ppm의 농도에서 7.4◎06 CFU/mL로 가장 높은 저항능력을 보였다. 반면 S. cerevisiae KCTC 7106은 4.8◎03 CFU/mL으로 낮은 생존능력을 나타냈지만, selenium의 2500 ppm의 농도에서도 1.1◎04 CFU/mL 생존하는 높은 저항 능력을 보였다. Fed batch 배양시 배지내 selenium 농도 125 ppm에서 24시간 배양시(180 rpm, 30℃) S. cerevisiae KCCM 12635에서 건조균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량이 각각 3.98 mg/g 과 6.69 mg/L로 가장 높게 나타났다(P<0.05).
Wild type에서 선별된 균주 KCCM 12635에 UV 돌연변이를 실시한 결과 돌연변이 균주 S. cerevisiae 3, 4, 5, 6, 7 및 8M(각각 1.82, 1.71, 1.77, 1.77, 1.75 및 1.78 g/L)은 모균주(parent strain)인 S. cerevisiae KCCM 12635(1.61 g/L)보다 높게 나타났다. 돌연변이 균주 중 S. cerevisiae 6M 에서 건조균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량이 각각 4.55 mg/g 과 7.94 mg/L로 가장 높게나타났다.
UV 돌연변이에 의해 선별된 균주 S. cerevisiae 6M은 wild type 균주 S. cerevisiae KCCM 12635보다 건조균체량, 건조균체내 selenium 함량 및 총 selenium 생산율이 각각 1.09, 1.13 및 1.23 배 증가하였다.
결론적으로 본 발명의 상기 실시예 1에서는 wild type에서 selenium uptake 효율이 가장 좋은 S. cerevisiae KCCM 12635를 선별할 수 있었으며, UV 돌연변이를 실시하여 selenium 생산효율을 증진된 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M을 개발하였다.
실시예 2:
실시예 1에서 유기태 selenium의 생산효율을 증진시키기 위하여 UV 돌연 변이를 실시하여 선발한 S. cerevisiae 6M에 대하여 배양조건을 최적화하기 위한 일련의 실험을 실시하였고, 배양방법은 실시예 1와 동일하게 fed-batch culture를 실시하였다.
실시예 2-1: 배양액 내 selenium 농도가 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
배양액 내 selenium의 첨가농도를 결정하기 위한 배지는 YM broth에 sodium selenite (Na2SeO3)를 첨가하여 농도를 조절하였다. 배양액의 selenium 농도를 0, 31, 63, 125, 250, 500 및 1000 ppm 7개의 수준으로 다양하게 배치하여 실험하였으며, selenium을 배양 0 시간에 첨가하여 24 시간에 수확하였다.
실시예 2-2:배양 시간에 따른 S. cerevisiae 6M의 균체량의 변화
배양 시간에 따른 균체 성장율을 알아보기 위하여 selenium을 첨가하지 않고, YM 배지를 사용하여 shaking incubator (30℃, 180 rpm) (VS-8480SF, VISION Scientific co., Korea)에서 배양시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12 시간의 균 성장을 조사하였다.
실시예 2-3:Selenium 첨가 시기가 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium의 uptake효과 높은 selenium의 첨가 시간과 배양 시간을 결정하기 위하여 첨가시간을 0, 3 및 9 시간으로 다양하게 설정하고 배양시간은 10과 24 시간에서 조사하였으며, 배지내 selenium농도는 125 ppm으로 배양하였다.
실시예 2-4: 배양 시간이 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium의 uptake효과 높은 selenium의 배양 시간을 결정하기 위하여 실시예 2-3에서 selenium uptake 효율이 가장 높았던 selenium 첨가 시간은 0 시간으로 고정하였으며, 1, 3, 6, 9, 10, 12 및 24 시간으로 다양한 시간으로 배양 하였을 때 selenium uptake가 높은 배양 시간을 결정하였다. 배지내 selenium농도 125 ppm으로 배양하였다.
실시예 2-5:초기 pH가 S. cerevisiae KCCM 12635와 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
초기 pH가 selenium uptake에 미치는 영향을 조사하기 위하여 0.1 N HCl 과 0.1 N NaOH를 이용하여 배양초기 pH를 3부터 7까지 다섯 수준으로(pH 3, 4, 5, 6 및 7) 조절한 후 selenium uptake가 가장 높은 초기 pH를 결정하였다. 배지내 selenium 농도 125 ppm으로 배양하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하고 9 시간에 배양을 완료하였다.
실시예 2-6: 분석 방법
1)건조 균체량 및 pH 측정
건조 균체량은 실시예 1-3의 해당 방법과 동일하게 측정하였으며, 배양액의 pH는 pH meter (METTLER TOLEDO 320)를 이용하여 측정하였다.
2)Selenium 정량
실시예 1-3의 해당 방법과 동일하다.
상기 실시예 2의 결과는 아래와 같다.
Fed-batch culture시 배양액 내 selenium 농도에 따른 건조균체량, 건조균체량 내 selenium 함량 및 selenium 생산량에 미치는 영향은 표 6과 같다.
Selenium을 첨가하지 않았을 때 건조균체량은 3.15 g/L으로 가장 높게 나타났으며, selenium 첨가농도가 높아질수록 건조균체량이 낮아지는 경향을 보였다. 배지내 selenium 첨가농도 31 ppm에서 배양시 건조균체량이 1.69 g/L이며, 125 ppm까지는 건조균체량이 1.64 g/L으로 다소 감소하는 경향을 보였다. 반면 selenium 농도 1000 ppm에서는 1.21 g/L로 가장 낮게 나타났다(도 10). 또한 실시예 1에서의 wild type S. cerevisiae의 저항성 실험 결과와 비슷한 경향을 보였다. Selenium을 농도별로 첨가한 YM agar plate에서의 wild type S. cerevisiae 균주에서, selenium 250 ppm로 배양시 몇몇 균주에서 colony수가 감소했으며, 또한 몇몇 균주는 생존이 억제되었다. 반면 selenium 125 ppm까지의 농도 에서 S. cerevisiae 생존의 억제 현상이 나타나지 않은 결과와 같은 경향을 보였다. 따라서 125 ppm의 selenium 농도는 균체 생산량에 저항을 주지 않는 가장 높은 selenium 농도라고 판단되었다.
배지 내 selenium의 농도 31 ppm에서 건조 균체내 selenium 함량은 1.39 mg/g이었으며, 배지내 selenium 농도 125 ppm으로 증가함에 따라 건조균체 내 selenium 함량은 5.03 mg/g으로 증가하였다. 그러나 배지내 배지내 selenium 농도가 250, 500및 1000 ppm으로 높아질수록 4.51, 1.38 및 0.61 mg/g으로 점차 낮아지는 경향을 보였다.
총 selenium 생산량에서도 같은 경향을 보였다. 배지내 selenium 농도가 31, 63, 125 ppm으로 높아질수록 생산량이 높아졌으며, 배지 내 selenium의 농도 125 ppm에서 8.24 mg/L로 가장 높았으나, 배지내 selenium의 농도가 250, 500 및 1000 ppm으로 점차 높아질수록 6.45, 1.72 및 0.67으로 낮아졌다(도 11).
따라서 배지 내 selenium 농도는 125 ppm에서 건조균체량 내 selenium 함량과 총 selenium 생산량 각각 5.03 mg/g 과 8.24 mg/L 가장 높게 나타났기 때문에 배지 내 최적의 selenium농도는 125 ppm으로 사료된다.
Figure 112010087785426-pat00006
표 6은 YM배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M에서 건조 세포 중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생산에 대한 여러 다른 셀레늄 농도의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내고,1 ;검출 안됨을 나타낸다.
Selenium의 첨가시간과 배양시간을 알아보기 위한 기초실험으로 selenium을 첨가하지 않았을 경우 배양시간에 따른 S. cerevisiae 6M의 성장율을 조사한 결과는 표 7과 같다.
건조균체량은 배양시간에 따라 점차적으로 증가하며, 배양 9시간에 건조균체량이 2.44 g/L로 가장 높게 나타났으며, 그 이후로는 감소하는 경향을 나타내었다( 도 13). 흡광도 측정시에도 같은 경향을 보였으며 배양 시간에 따라 점차 증가하여 배양 9시간과 10시간에서 O.D.는 1.16으로 가장 높게 나타났다(도 14).
이와 같은 결과는 배양 9시간까지는 증식기, 9시간에서 10시간 정지기, 배양 10시간 이후는 사멸기에 들어가는 것으로 사료된다. 다음의 실험에서 유도기, 증식기 및 정지기에 selenium을 첨가하여 유기태 selenium 생산율에 미치는 효과에 대한 연구가 필요하다고 사료되었다.
Figure 112010087785426-pat00007
표 7은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포 중량 및 성장에 대한 배양시간의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타냄.
선별 균주 S. cerevisiae 6M에 대하여 selenium uptake효과 높은 selenium의 첨가 시기와 배양 시기를 결정하기 위하여, selenium 첨가 시간을 S. cerevisiae 6M의 성장곡선 중 유도기, 증식기 및 정지기인 0, 3 및 9 시간으로 하고, 배양시간을 10과 24 시간으로 다르게 하여 비교 실험한 결과는 표 8과 같다.
Fed-batch culture시 selenium의 첨가 시기가 0, 3 그리고 9 시간 일 때, 각각 10과 24 시간 배양시 1.72와 1.60, 2.05 와 1.82 및 2.58 과 2.34 g/L으로 selenium 첨가 시기가 늦어질수록 건조균체량은 증가하였다(도 15). 배지내 selenium 첨가시 S. cerevisiae의 성장 억제효과가 있으므로 최대 성장을 한 배양 9 시간에 selenium을 첨가하였을 때 가장 높은 건조균체량이 나타났다고 사료된다. 또한 모든 selenium 첨가 시기에서 10 시간 배양시 24 시간 배양보다 건조균체량이 높게 나타나는 경향을 보였는데, 이와 같은 결과는 배양시간이 길어짐에따라 selenium에 대한 저항능력이 약해져 건조균체량이 감소한다고 사료된다. 배양 9 시간에 selenium을 첨가하여 10 시간에 배양완료시 건조균체량은 2.58 g/L로 가장 높게 나타났는데 대수기에서 selenium을 첨가하고 배양시간을 가장 짧게한 처리구에서 selenium에 대한 저항능력이 가장 높았다고 사료된다.
배양 초기(0 시간)에 slenium 첨가시 건조균체내 selenium 함량은 배양 10 과 24 시간에서 각각 5.73와 5.13 mg/g으로 가장 높았으며, selenium 첨가시간이 0, 3 및 9 시간으로 늦어짐에 따라, 10 시간 배양시, 각각 5.73, 2.41 및 1.25 mg/g으로 감소하는 경향이 나타났다(도 16).
또한 총 selenium 생산량도 배양 초기(0 시간)에 selenium 첨가시, 배양 10과 24 시간에서 각각 9.83 과 8.20 mg/L으로 높았다. 배양 시간이 10 시간일 때 selenium 첨가시간이 0, 3 및 9로 늦어질수록 총 selenium 생산량은 9.83, 4.94 및 3.21 mg/L으로 감소하는 경향이 나타났다(도 17).
이와 같은 결과로 볼 때, 배양초기 0 시간에 selenium을 첨가시 유기태 selenium 생산 효율이 가장 높았다. 그리고 배양 24 시간보다 배양 10 시간에서 유기태 selenium생산 효율이 높았지만, 더욱 다양한 배양시간에 따른 유기태 selenium 생산효율에 대한 연구를 진행하여 최적화 할 필요가 있다.
Figure 112010087785426-pat00008
표 8은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성률에 대한 셀레늄 급여 및 배양시간의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타냄.
금속의 흡수 시간은 흡수와 탈착과정에서 중요한 역할을 하므로 최적화할 필요가 있다. 실시예 2-3에서 유기태 selenium 생산효율이 가장 높은 0 시간에 selenium을 첨가하였다. 배양시기를 1, 3, 6, 9, 10, 12 및 24 시간으로 다양하게 조사 하였을 때 selenium uptake에 미치는 영향은 표 9에 나타내었다.
배양 시간에 따른 건조균체량은 배양 1 시간에서 1.85 g/L으로 가장 높았으며, 배양 시간이 길어질수록 점차 감소하여 배양 12 시간과 24 시간 에서는 1.63 g/L로 낮게 나타났다(도 18).
건조균체량내 selenium 함량은 배양 1 시간에서 2.01 mg/g으로 가장 낮게 나타났으며, 배양 시간이 증가함에 따라 점차적으로 증가하는 경향을 보이며 배양 9 시간 에서 6.07 mg/g으로 가장 높게 나타났다. 배양 24 시간 시간에서 4.95 mg/g으로 selenium의 함량이 낮아지는 경향을 보였다(도 19).
총 selenium 생산량도 건조균체내 selenium 함량과 같은 경향을 보였다(도 20). 배양 1 시간에서 3.72 mg/L으로 가장 낮게 나타났으며, 배양시간이 증가함에 따라 총 selenium 생산량이 증가하는 경향을 보였으며, 배양 9 시간에서 10.32 mg/L으로 가장 높게 나타났다. 24 시간 배양에서는 8.07 mg/L으로 감소하는 경향을 나타냈다. 배양 시간이 길어짐에 따라 건조균체량이 감소함에도 불구하고 균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량이 증가하는 경향을 보였다. 배양 9 시간에서 가장 높은 selenium uptake효율을 보였으며, 그 이상의 배양 시간에서 점차 감소하는 경향을 보였다. 따라서 본 연구에서의 배양 9 시간의 흡수는 표면 흡착이 아닌 생체 내 축적에 의한 것이라 사료되며 selenium uptake를 위한 최적의 배양 시간으로 판단되었다.
Figure 112010087785426-pat00009
표 9는 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M 의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성률에 대한 수집 시간의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타냄.
초기 pH가 S. cerevisiae wild type KCCM 12635와 mutant 균주 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향을 조사하기 위하여 초기 pH를 3, 4, 5, 6 및 7 다섯 수준으로 조절하여, 배양 0 시간에 배지내 slenium을 125 ppm으로 첨가하여 9 시간 배양한 후, 건조균체량, 건조균체량내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량에 미치는 영향은 표 10에 나타내었다.
건조균체량은 wild type과 mutant 균주의 배지내 초기 pH 6과 7에서 각각 1.48과 1.49, 1.70과 1.66 g/L으로 높게 나타났으며, wild type과 mutant 균주 모두 배지내 pH가 낮아질수록 건조균체량이 감소하는 경향을 보여 pH 3에서 각각 1.12와 1.31 g/L으로 가장 낮게 나타났다(도 21).
Wild type과 mutant 균주 배양시, 건조균체량 내 selenium 함량의 최적 초기 pH 조건이 다르게 나타났다. Wild type의 경우 pH가 높아질수록 selenium 함량이 증가하는 경향을 보였으며, pH 5에서 5.80 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, pH가 5보다 높아질수록 selenium 함량이 낮아지는 경향이 나타났다. Mutant 균주에서도 초기 pH가 높아질수록 selenium 함량이 증가하는 경향을 보였으며, pH 6에서 6.40 mg/g로 가장 높은 selenium 함량을 보였으며, pH 6보다 높아질수록 selenium 함량이 유의적으로 낮아지는 경향을 보였다(도 22).
총 selenium 생산량에 있어서도 pH가 높아짐에 따라 증가하는 경향을 보였으며, wild type과 mutant 균주 배양시 각각 초기 pH를 5와 6으로 조절하였을 때, 총 selenium 생산량은 각각 7.91와 10.87 mg/L으로 가장 우수하게 나타났으며, 초기 pH가 6 이상으로 높아질수록 selenium 생산량이 낮아지는 경향을 확인하였다(도 23).
따라서 selenium 생산효율을 높이기 위해서는 wild type S. cerevisiae KCCM 12635는 초기 pH를 5로 조절하고, mutant S. cerevisiae 6M은 초기 pH 6으로 조절하는 것이 가장 효과적이라 사료되며 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M에서 총 selenium 생산량을 10.87 mg/L으로 높일 수 있었다.
Figure 112010087785426-pat00010
표 10은 125ppm 셀레늄을 포함하는 YM 배지에서 배양된 S. cerevisiae KCCM 12635 및 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 최종 pH, 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 초기 pH의 효과를 나타낸 표이다.
실시예 2는 UV 돌연변이에 의해 selenium uptake 능력이 우수한 균주로 선별된 S. cerevisiae 6M의 배양조건 최적화를 위해 실시하였다. S. cerevisiae 6M의 fed-batch culture시 selenium 농도를 0, 31, 63, 125, 250, 500 및 1000 ppm의 수준으로 다양하게 배치하고, 0 시간에 selenium을 첨가하여 30℃, 180 rpm으로 24 시간동안 배양하였다. 배양액 내 selenium 농도가 125 ppm일 때 건조균체내 selenium 함량은 5.30 mg/g이고 총 selenium 생산량은 8.24 mg/L으로 가장 높은 생산효율을 나타냈다.
Selenium 첨가시간을 0, 3 및 9 시간으로 하였을 때 0 시간에서 selenium uptake가 가장 높았으며, selenium을 0 시간에 첨가 후 배양시간을 24 시간까지 다양하게 하였을 때 배양 9 시간에서 건조균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량은 각각 6.07 mg/g과 10.32 mg/L으로 가장 높은 효율을 보였다.
초기 pH가 selenium uptake에 미치는 영향을 pH를 3에서 7까지 조사하였으며, wild type S. cerevisiae KCCM 12635에서는 pH 5일 때 가장 높은 효율을 보였다. 반면 S. cerevisiae 6M는 초기 pH가 6일 때 건조균체내 selenium 함량은 6.40 mg/g이고, 총 selenium 생산량은 10.87 mg/L로 가장 높은 생산 효율을 보였다.
이상의 결과로부터, S. cerevisiae 6M의 배양시 배양액 내 selenium 농도와 초기 pH를 각각 125 ppm과 pH 6으로 하고, 배양 0 시간에 selenium을 첨가한 후 9 시간에 배양을 완료하였을 때 유기태 selenium 생산량이 가장 높은 것으로 판단된다.
실시예 3:
실시예 3에서는 유기태 selenium 생산 효율이 높은 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 최적 배지조건을 도출하였다. 또한 유기태 selenium의 생산을 최대화할 수 있는 탄소원, 질소원 및 미네랄원을 탐색하였고, 각 배지성분들의 최적 조건을 도출하기 위하여 Box-Behnken design과 Response suface methodology를 이용하였다.
실시예 1에서 유기태 selenium의 생산효율을 증진시키기 위하여 UV 돌연 변이를 실시하여 선발한 S. cerevisiae 6M에 대하여 배지조건을 최적화하기 위한 일련의 실험을 실시하였고, 배양방법은 실시예 1과 동일하게 fed-batch culture를 실시하였다.
실시예 3-1:탄소원의 첨가가 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium uptake에 미치는 배양액 내 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 탄소원으로 glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose 및 lactose 총 6종을 각각 10 g/L씩 첨가였으며, 질소원으로 동일하게 yeast extract, 3 g/L, malt extract, 3 g/L 및 peptone, 5 g/L을 첨가하였다. 배지내 selenium의 농도와 pH는 125 ppm과 pH 6으로 하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하여 9 시간에 배양을 완료하였다.
실시예 3-2:질소원의 첨가가 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium uptake에 미치는 배양액 내 질소원의 영향을 조사하기 위하여 질소원 yeast extract, malt extract, peptone, urea, ammonium sulfate 및 ammonium phosphate 총 6종을 각각 10 g/L씩 첨가였으며, 탄소원으로 동일하게 glucose 10 g/L를 첨가하였다. 배지내 selenium의 농도와 pH는 125 ppm과 pH 6으로 하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하여 9 시간에 배양을 완료하였다.
실시예 3-3:탄소와 질소의 비율이 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium uptake에 미치는 배양액 내 탄소와 질소의 비율의 영향을 조사하기 위하여 탄소원 glucose와 galactose 각각 20 g/L씩 첨가였으며, 질소원으로 동일하게 peptone을 사용하여 탄소와 질소의 비율은 1, 3, 5, 7 및 9의 다섯 수준으로 조절하여 실험을 실시하였다. 배지내 selenium의 농도와 초기 pH는 125 ppm과 pH 6으로 하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하여 9 시간에 배양을 완료하였다.
실시예 3-4:미네랄의 공급원의 첨가가 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향
Selenium uptake에 미치는 배양액 내 미네랄의 영향을 조사하기 위하여 미네랄 총 12 종(MgSO4, KCl, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCl2, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, MgCl2, CuSO4 및 FeCl3)을 배양액 내에 각각 0.05%씩 첨가하여 실험을 실시하였다. 탄소원과 질소원으로 각각 glucose와 peptone을 이용하였으며 탄소와 질소 비율을 7로 하고, 배지내 selenium의 농도와 pH는 125 ppm과 pH 6으로 하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하여 9 시간에 배양을 완료하였다.
실시예 3-5:반응표면모델(Response surface model)을 이용한 배지조건 최적화
배지내 selenium의 농도와 pH는 125 ppm과 pH 6으로 하였으며, 0 시간에 selenium을 첨가하여 9 시간에 배양을 완료하였다.
Glucose, peptone, MgSO4 그리고 KCl을 최적 배지 성분으로 선발하였고, 각 성분들의 최적 농도 조건을 탐색하기 위하여 Box Behnken design과 Response surface methodology를 사용하였다. Box Behnken design (BBD)은 균형 불완비 블록계획법(balanced incomplete block design)으로서 2k 요인 배치계획을 결합하여 기본계획을 수립하고 중심점에서 실험수 nc를 추가시켜서 2차 반응표면식을 추정할 수 있는 실험계획법이다(Box and Behnken, 1960) 각각의 성분들을 독립변수로 하였고, 각 변수들은 3가지의 농도수준으로 배치하였고 성분들의 농도수준과 Box behnken design 배열은 Table 3-5와 같다. 실험결과는 아래와 같은 2차 다항식을 이용하여 분석하였다.
Figure 112010087785426-pat00011
Y는 실험 결과를 통하여 얻어지는 반응으로 건조균체량, 균체내 selenium 함량, 총 selenium 생산량이다. β0는 상수값, βi, βj는 회귀계수이며, Xi와 Xj는 독립변수의 코드화되지 않은 수치이다. 반응표면모델의 분석은 MINITAB○R (version 14, Minitab Inc., USA)을 사용하였다.
2.6. 분석 방법
실시예 2의 방법과 동일하다.
상기 실시예 3의 결과는 아래와 같다.
돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M 배양시 탄소원의 첨가에 따른 균주의 성장과 selenium uptake 효율을 자세히 알아보기 위하여 S. cerevisiae 균주가 대사할 수 있다고 일반적으로 알려진 여러 탄소원들을 배지내 공급하여 조사하였다. 표 11은 탄소원으로서 glucose, fructose, sucrose, galactose, maltose 그리고 lactose를 첨가시 건조균체량, 균체내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량의 결과이다.
Galactose를 탄소원으로 사용하였을 때에 1.82 g/L으로 다른 탄소원에 비하여 높게 나타났으며, 다음은 glucose, fructose 및 sucrose에서 각각 1.50, 1.59 및 1.46 g/L으로 비교적 높게 나타났으며, maltose와 lactose에서는 0.63과 0.56 g/L으로 낮게 나타났다(도 24).
건조균체량내 selenium 함량은 galactose에서 4.62 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, glucose와 sucrose에서 각각 4.23과 4.27 mg/g으로 비교적 높게 나타났으며, maltose와 Lactose에서 각각 0.79와 0.69 mg/g로 낮게 나타났다(도 25).
총 selenium 생산량 역시 탄소원으로 galactose를 사용하였을 때 8.38 mg/L로 가장 높게 나타났으며, glucose와 sucrose에서 각각 6.34과 6.24 mg/L으로 비교적 높게 나타났으며, maltose와 Lactose에서 각각 0.50와 0.38 mg/L로 낮게 나타났다(도 26).
따라서 selenium uptake 효율을 가장 높일 수 있는 탄소원은 galactose라고 판단되었다.
Figure 112010087785426-pat00012
표 11은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 여러 탄소원의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 평균±표준편차로 나타냄.
돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M 배양시 질소원의 첨가에 따른 균주의 성장과 selenium uptake 효율을 자세히 알아보기 위하여 배지내의 질소 공급원을 다양하게 조사하였다. Table 3-2는 질소원으로서 yeast extract, malt extract, peptone, urea, ammonium sulfate 및 ammonium phosphate 첨가시 건조균체량, 균체내 selenium 함량 및 총 selenium 생산량의 결과이다.
건조균체량에 있어서는 질소원으로 yeast extract를 첨가하였을 때 1.88 g/L로 가장 높게 나타났으며, 다음으로는 peptone이 0.90 g/L으로 다소 높게 나타났으며, 무기태 질소원인 urea, ammonium sulfate 및 ammonium phosphate를 질소원으로 첨가시 건조균체량이 0 g/L으로 나타났다(도 27).
Peptone을 질소원으로 첨가 시, 건조균체량내 selenium의 함량은 10.84 mg/g으로 가장 높게 나타났으며(도 28), 총 selenium 생산량 또한 9.78 mg/L로 가장 높게 나타났다(도 29). 반면 건조균체량이 가장 높았던 질소원 중 yeast extract의 균체내 selenium 함량과 총 selenium 생산량은 각각 0.65와 1.21 mg/L로 낮게 나타났다.
이와 같은 결과에서 질소원으로 peptone을 사용하였을 때 가장 높은 selenium uptake 효율을 얻을 수 있었으며, 이후의 실험에서 질소원으로 peptone을 사용하였다.
Figure 112010087785426-pat00013
표 12는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 여러 질소원의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 평균±표준편차로 나타냄.
탄소와 질소의 비율이 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 탄소원으로 glucose와 galactose를 질소원으로 peptone을 이용하여 C/N의 비율을 1, 3, 5, 7 및 9의 다섯 수준으로 하여 실험한 결과는 표 13과 같다.
건조균체량은 질소원으로 peptone을 사용하고 탄소원으로 glucose 과 galactose를 첨가시 C/N 비율이 1 일 때 각각 2.14와 1.76 g/L으로 높게 나타났으며(도 30), 비율이 높아짐에따라 건조균체량이 낮아지는 경향이 나타났다. 이는 질소의 함량이 낮아질수록 건체량이 낮아지는 결과이므로 selenium 첨가시에도 균체량을 높이기 위해서는 질소의 공급이 중요하다고 사료된다.
건조균체량내 selenium 함량은 탄소와 질소 공급원으로 각각 glucose와 peptone을 첨가시 C/N의 비율이 높아짐에 따라 selenium 함량이 증가하는 경향을 보였으며, 비율이 7일 때 18.66 mg/g으로 가장 높게 나타났으나, 비율이 더 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 탄소와 질소 공급원으로 각각 galactose와 peptone을 첨가시에도 C/N의 비율이 높아짐에 따라 selenium 함량이 증가하는 경향을 보였으며, 비율이 5일 때 13.67 mg/g으로 가장 높게 나타났으며(도 31), 그 이상 비율이 높아짐에 따라 감소하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과에서 selenium uptake에 있어서 C/N의 비율은 매우 중요하며, 탄소 공급원에 따라 의 적정 비율이 다르게 나타난다고 사료된다.
Glucose와 peptone 첨가시 총 selenium 생산량은 C/N 비율이 증가함에 따라 높아지는 경향을 보였다. C/N 비율을 7로 했을 때 생산량은 22.42 mg/L으로 가장 높게 나타났으며, C/N 비율이 8로 더욱 증가하였을때는 18.75 mg/L으로 낮아졌다(도 32). 탄소원으로 galactose를 사용시에도 비슷한 경향을 보였는데 galactose와 peptone 첨가시 C/N 비율이 증가함에 따라 총 selenium 생산량이 높아지는 경향을 보였다. C/N 비율을 5로 했을 때 생산량은 17.17 mg/L으로 가장 높게 나타났으며. C/N 비율이 5 이상 증가함에 따라 생산효율이 감소하는 경향을 보였다.
결론적으로 S. cerevisiae 6M의 탄소공급원에 따른 질소원과의 비율이 selenium uptake에 있어서 질소원으로 peptone을 사용하고, 탄소원으로 glucose와 galactose를 사용시 C/N의 비율이 각각 7과 5에서 가장 높은 효율을 보였으며, glucose/peptone의 C/N 비율 7로 했을 때 selenium uptake 효율이 가장 높다고 판단되었다.
Figure 112010087785426-pat00014
표 13은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 탄소원 및 C/N 비율의 효과를 나타낸 표이다.표에서 데이터는 평균±표준편차로 나타냄.
미네랄 첨가시 돌연변이 균주 S. cerevisiae 6M의 selenium uptake에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MgSO4, KCl, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCl2, FeSO4, ZnSO4, MnSO4, MgCl2, CuSO4 그리고 FeCl3 총 미네랄 12 종을 첨가한 결과는 표 14에 나타내었다.
탄소원과 질소원을 같은 조건으로 배양해였을 경우 미네랄 첨가에 따른 균체 생산량에 현격한 차이가 났다. 건조균체량은 MgSO4, KCl 및 CaCl2 첨가 시 각각 1.70, 1.56 및 1.57 g/L로 높게 나타났다. 그러나 FeSO4, MnSO4 및 CuSO4 첨가 시 각각 0.40, 0.56 및 0.70 g/L으로 낮게 나타났다(도 33).
건조균체량 내 selenium 함량은 MgSO4, KCl 및 MgCl2 첨가 시 각각 16.38, 16.31 및 16.31 mg/g으로 높게 나타났으며, 미네랄 공급원으로 K2HPO4, KH2PO4, ZnSO4, MnSO4 및 CuSO4을 첨가하였을 때는 0.5 mg/g 이하의 아주 낮은 효율을 보였다(도 34). 따라서 Mg와 K을 첨가하여 배양시 selenium uptake 능력을 향상시킬 수 있다고 사료되었다.
총 selenium 생산량은 MgSO4 첨가 시 27.87 mg/L으로 가장 높게 나타났다(도 35). 그러나 K2HPO4, KH2PO4, FeSO4, ZnSO4, MnSO4 및 CuSO4을 첨가시 0.1 mg/L이하의 낮은 생산율을 보였다.
이와 같은 결과에서 미네랄 첨가에 따른 selenium 생산율의 효과는 미네랄 종류에 따라 현격한 차이가 났으며, 미네랄 중 MgSO4의 첨가시 가장 높은 유기태 selenium 생산 효율을 나타낸다고 판단되었다.
Figure 112010087785426-pat00015
표 14는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 여러 광물원의 효과를 나타낸 표이다. 표에서 데이터는 평균±표준편차로 나타냄.
Selenium uptake를 최대화 하기위하여 탄소원으로 선발된 glucose와 질소원으로 선발된 peptone 그리고 미네랄원인 MgSO4와 KCl들의 최적 농도를 탐색하였다. 선발된 각각의 배지 성분들을 3가지 수준으로 하여 Box-Behnken design으로 실험을 설계하였다(표 15). 실험설계표에서 각 성분들의 최저 수준은 -1, 중앙점에 해당하는 수준은 0 그리고 최고 수준은 +1로 code화 하였고, 총 27개의 실행을 얻었다. 각 실행별 성분들의 농도 조합과 그에 따른 건조균체량, 균체량내 selenium 함량 그리고 총 selenium 생산량은 표 15와 같다.
Figure 112010087785426-pat00016
Figure 112010087785426-pat00017
표 15는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량, 셀레늄 농도 및 총 셀레늄 생성에 대한 코드 값과 실제값을 가지는 Box-Behnken 디자인 배열(configuration)을 나타낸 표이다.표에서 1; 실제값, 2; 코드 값, 3; 예측 값
표 16은 건조균체량에 대한 4개의 변수 glucose, peptone, MgSO4 및 KCl의 코드화된 단위를 사용하여 분산분석표(ANOVA)를 제시하였다. 반응 변수에 대한 전체 2차 다항식 모델은 매우 유의하였으며(P<0.001), 선형항(linear term)과 제곱근(quadratic term)에도 유의하게 나타났다(P<0.001, P<0.05). 하지만 상호작용(interaction term)은 유의하지 않았으며, 적합성 결여는 0.710이 나왔다. 건조균체량에 대한 관측점들의 변동을 표본회귀선이 얼마나 잘 설명해 주는가를 상대적으로 나타내는 결정계수(coefficient of determination; R2)를 산출한 결과 R2=95.6%으로 반응모델에 높은 설명력을 제시하였다.
Figure 112010087785426-pat00018
표 16은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 건조 세포중량에 대한 코드값을 가지는 이차 모델에 대한 Analysis of variance (ANOVA) 분석을 나타낸 표이다.
건조균체량을 종속변수 Y로 설정하여 코드화된 단위를 사용해 분석을 수행하여 건조균체량에 대해 추정된 회귀 계수를 이용하여 model식을 얻었다(도 36). 그리고 설정된 모델을 이용하여 관측된 실험치와 모델을 통하여 얻어진 예측치를 비교한 결과 우수한 직선성을 나타내었다(도 37).
3.5.3 반응표면모델을 이용한 건조균체량에 대한 배지성분들의 작용
일련의 실험을 통하여 얻어진 반응표면모델에 각 성분들의 코드화되지 않은 농도수치를 대입하여 건조균체량에 미치는 배지성분들의 효과를 3차원 그래프를 이용하여 분석하였다. 분석시 고려되지 않는 나머지 배지성분들을 중앙점으로 고정하여 수행하였다. 건조균체량에 대한 배지성분들의 반응은 Figure 3-15에서 보는 것과 같다. 독립변수 MgSO4와 KCl을 고정하고 Peptone와 Glucose를 농도별로 분석한결과 Glucose와 Peptone의 농도가 각각 30 g/L와 12 g/L의 부근에서 건조균체량이 2.7 g/L로 최고 반응값을 나타내었고, 각각의 농도가 높아질수록 건조균체량이 높아지는 경향을 보였다. Glucose와 peptone의 농도를 고정하고 MgSO4와 KCl을 농도별로 분석한 결과에서 MgSO4와 KCl의 농도 1.0 g/L 부근에서 건조균체량 2.15 g/L로 가장 높은 반응값을 나타내었고 농도가 낮아짐에따라 반은값도 낮아지는경향을 보였다. 따라서 건조균체량에 있어서는 glucose, peptone, MgSO4와 KCl의 농도가 높아질수록 반응값이 높아진다고 판단된다.
3.5.4 건조균체량내 selenium 함량에 대한 Box-Behnken design 결과의 분산분석
Table 17은 건조균체량내 selenium 함량에 대한 4개의 변수 glucose, peptone, MgSO4, KCl의 코드화된 단위를 사용하여 분산분석표(ANOVA)를 제시하였다. 건조균체내 selenium 함량에 대한 분산분석에서는 제곱근 (Quadratic term)에 유의하게 나타났다(P<0.05). 적합성 결여는 0.591로 나타났다. 건조균체내 selenium 함량 관측점들의 변동을 표본회귀선이 얼마나 잘 설명해 주는가를 상대적으로 나타내는 결정계수(coefficient of determination; R2)를 산출한 결과 R2=74.4%으로 나타났다.
Figure 112010087785426-pat00019
표 17은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 세포 셀레늄에 대한 코드값을 가지는 이차 모델에 대한 Analysis of variance (ANOVA) 분석을 나타낸 표이다.
건조균체량내 selenium 함량을 종속변수 Y로 설정하여 코드화된 단위를 사용해 분석을 수행하여 건조균체량내 selenium 함량에 대해 추정된 회귀 계수를 이용하여 model식을 얻었다(도 39). 그리고 설정된 모델을 이용하여 관측된 실험치와 모델을 통하여 얻어진 예측치를 비교한 결과 우수한 직선성을 나타내었다(도 40).
일련의 실험을 통하여 얻어진 반응표면모델에 각 성분들의 코드화되지 않은 농도 수치를 대입하여 건조균체량내 selenium 함량에 미치는 배지성분들의 효과를 3차원 그래프를 이용하여 분석하였다. 분석시 고려되지 않는 나머지 배지 성분들을 중앙점으로 고정하여 수행하였다. 건조균체량내 selenium 함량에 있어 얻어진 model 식(도 39)에 대한 반응표면분석법을 수행하여 Figure 3-18과 같은 결과를 얻었다. MgSO4와 KCl의 농도를 중앙값으로 고정하고, glucose와 Peptone을 농도별로 분석한 결과 각각 21 g/L와 14.2 g/L부근에서 건조균체량내 selenium 함량이 14.2 mg/g로 가장 높은 반응값을 나타내었고 각각의 농도가 높거나 낮아질수록 반응값이 낮아지는 경향을 보였다. Peptone과 KCl을 중앙값으로 고정했을 경우에는 glucose와 MgSO4의 농도가 각각 19.0 g/L와 0.6 g/L 부근에서 반응값이 14.2 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, peptone과 MgSO4를 고정했을 때 glucose 18.0 g/L와 KCl 0.5 g/L 부근에서 14.2 mg/g으로 가장높은 반응값을 보였다. Glucose와 KCl을 고정하였을 경우 peptone과 MgSO4의 농도 7 g/L와 0.5 g/L 부근에서 반응값이 14.7 mg/g으로 가장 높았으며, Glucose와 MgSO4을 고정하였을 경우 peptone과 KCl의 농도 7 g/L와 0.5 g/L 부근에서 반응값이 14.7 mg/g으로 가장 높았다. Glucose와 peptone의 농도를 고정하고, MgSO4와 KCl농도를 각각 0.6 g/L와 0.4 g/L로 하였을 경우 반응값이 14.8 mg/g로 가장 높은 반응값을 보였다. 따라서 glucoe와 peptone의 적정농도에서 건조균체내 selenium의 함량이 높아짐을 알 수 있으며 미네랄의 적정농도의 첨가는 반응값을 더 높일 수 있을 것이라 사료된다.
표 18은 총 selenium 생산에 대한 4개의 변수 glucose, peptone, MgSO4, KCl의 코드화된 단위를 사용하여 분산분석표(ANOVA)를 제시하였다. 총 selenium 생산성에 대해서는 2차 다항식 모델은 매우 유의하였으며 (P<0.001), 선형항(linear term)과 제곱근(quadratic term) 모두에서 유의하게 나타났으며(P<0.001). 적합성 결여는 0.150으로 나타났다. 총 selenium 생산량에 대한 관측점들의 변동을 표본회귀선이 얼마나 잘 설명해 주는가를 상대적으로 나타내는 결정계수(coefficient of determination; R2)를 산출한 결과 R2=93.9%으로 반응모델에 높은 설명력을 제시하였다.
Figure 112010087785426-pat00020
표 18은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 전체 셀레늄 생성에 대한 코드값을 가지는 이차 모델에 대한 Analysis of variance (ANOVA) 분석을 나타낸 표이다.
selenium 생산을 종속변수 Y로 설정하여 코드화된 단위를 사용해 분석을 수행하여 총 selenium 생산에 대해 추정된 회귀 계수를 이용하여 model식을 얻었다(도 42). 그리고 설정된 모델을 이용하여 관측된 실험치와 모델을 통하여 얻어진 예측치를 비교한 결과 우수한 직선성을 나타내었다(도 43).
일련의 실험을 통하여 얻어진 반응표면모델에 각 성분들의 코드화되지 않은 농도수치를 대입하여 총 selenium 생산에 미치는 배지성분들의 효과를 3차원 그래프를 이용하여 분석하였다. 분석시 고려되지 않는 나머지 배지성분들을 중앙점으로 고정하여 수행하였다. 총 selenium 생산량에 있어 얻어진 model 식(도 42)에 대한 반응표면분석법을 수행한 결과를 도 44에 나타내었다. MgSO4와 KCl의 농도를 중앙값으로 고정하고, glucose와 peptone을 농도별로 분석한 결과 각각 30 g/L와 12 g/L부근에서 건조균체량내 selenium함량이 31 mg/L로 가장 높은 반응값을 나타내었고, Peptone과 KCl을 중앙값으로 고정했을 경우에는 glucose와 MgSO4의 농도가 각각 20.0 g/L와 0.6 g/L 부근에서 반응값이 28 mg/L으로 가장 높게 나타났으며, peptone과 MgSO4를 고정했을 때 glucose 23.0 g/L와 KCl 0.6 g/L 부근에서 29 mg/L으로 가장높은 반응값을 보였다. Glucose와 KCl을 고정하였을 경우 peptone과 MgSO4의 농도 10 g/L와 0.5 g/L에서 반응값이 29.07 mg/L으로 가장 높았으며, glucose와 MgSO4을 고정하였을 경우 peptone과 KCl의 농도 10 g/L와 0.6 g/L 부근에서 반응값이 30.0 mg/L으로 가장 높았다. 또한 glucose와 peptone을 중앙값으로 고정했을 경우 MgSO4와 KCl농도를 각각 0.55 g/L와 0.6 g/L의 부근에서 반응값이 14.8 mg/g로 가장 높은 반응값을 보였다.
최적 조건의 계산
최대 건조균체량을 위한 최적화 결론은 표 19, 및 도 45와 같으며, 최적 배지 조건으로는 glucoe, peptone, MgSO4 및 KCl농도를 각각 30, 12, 0.5, 0.1 g/L로 하였을 때 기대 반응값으로 2.7496 g/L이 예상되며 만족치는 0.96967으로 매우 높게 나타났다(표 19 및 도 45).
건조균체량내 selenium 함량은에 있어 최적 배지 조건 glucoe, peptone, MgSO4와 KCl농도를 각각 11.75, 5.30, 1.00 및 0.10 g/L로 하였을 때 기대치는 15.62 mg/L로 만족치는 0.82850으로 나타났다(표 20 및 도 46).
총 selenium 생산량은 최적배지 조건으로 glucoe, peptone, MgSO4와 KCl농도를 각각 27.73, 11.40, 0.30 및 0.80 g/L로 하였을 때 반응기대치는 31.57이며 만족치 1.00으로 매우 높았다(표 21 및 도 47).
Figure 112010087785426-pat00021
표 19는 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 최대 건조 세포 수율에 대한 최적 배지 조성 및 모델로부터 예측값을 나타낸 표이다.
Figure 112010087785426-pat00022
표 20은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 최대 셀레늄 농도에 대한 최적 배지 조성 및 모델로부터 예측값을 나타낸 표이다.
Figure 112010087785426-pat00023
표 21은 125ppm 셀레늄을 포함하는 실험 배지에서 배양된 돌연변이 S. cerevisiae 6M의 최대 전체 셀레늄 생산에 대한 최적 배지 조성 및 모델로부터 예측값을 나타낸 표이다.
농업생명공학연구원 KACC93114P 20101221

Claims (1)

  1. 개량된 유기태 셀레늄 생산 활성을 가지는 S. cerevisiae 6M(KACC93114P) 돌연변이체 균주를 배양하는 방법에 있어서, 탄소원으로 갈락토스를 사용하고, 질소원으로 펩톤을 사용하며, 미네랄로 마그네슘을 포함한 배양 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 개량된 유기태 셀레늄 생산 활성을 가지는 S. cerevisiae 6M(KACC93114P) 돌연변이체 균주를 배양하는 방법.
KR1020100139385A 2010-12-30 2010-12-30 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체 KR101231652B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100139385A KR101231652B1 (ko) 2010-12-30 2010-12-30 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100139385A KR101231652B1 (ko) 2010-12-30 2010-12-30 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120089949A KR20120089949A (ko) 2012-08-16
KR101231652B1 true KR101231652B1 (ko) 2013-02-08

Family

ID=46883188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100139385A KR101231652B1 (ko) 2010-12-30 2010-12-30 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101231652B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030088774A (ko) * 2002-05-15 2003-11-20 문기혁 셀레늄함유 효모의 대량 제조 방법
KR100434949B1 (ko) * 2003-07-07 2004-06-16 주식회사 엔바이오테크놀러지 유기태 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 효모의제조방법
KR20050005858A (ko) * 2003-07-07 2005-01-15 김진만 고농도 셀레늄 함유 효모 가수분해물, 이의 제조방법 및이를 함유하는 가축용 기능성 첨가제
KR20060002212A (ko) * 2004-07-01 2006-01-09 이정복 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양방법과 이를 이용한 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030088774A (ko) * 2002-05-15 2003-11-20 문기혁 셀레늄함유 효모의 대량 제조 방법
KR100434949B1 (ko) * 2003-07-07 2004-06-16 주식회사 엔바이오테크놀러지 유기태 셀레늄과 요오드 복합체를 함유하는 효모의제조방법
KR20050005858A (ko) * 2003-07-07 2005-01-15 김진만 고농도 셀레늄 함유 효모 가수분해물, 이의 제조방법 및이를 함유하는 가축용 기능성 첨가제
KR20060002212A (ko) * 2004-07-01 2006-01-09 이정복 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양방법과 이를 이용한 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120089949A (ko) 2012-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20070077238A1 (en) Production of organic and inorganic selenium compounds by lactic acid bacteria
Xu et al. Effects of two commercial feeds for semi-intensive and hyper-intensive culture and four C/N ratios on water quality and performance of Litopenaeus vannamei juveniles at high density in biofloc-based, zero-exchange outdoor tanks
Khanian et al. Alleviation of aflatoxin-related oxidative damage to liver and improvement of growth performance in broiler chickens consumed Lactobacillus plantarum 299v for entire growth period
KR20020023886A (ko) 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 그 용도
Nourmohammadi et al. Plasma thyroid hormone concentrations and pH values of some GI-tract segments of broilers fed on different dietary citric acid and microbial phytase levels
KR100514165B1 (ko) 셀레늄과 칼슘 함량이 높은 엽과류의 재배방법
Xi et al. Effect of chromium picolinate on growth performance, carcass characteristics, serum metabolites and metabolism of lipid in pigs
CN106665489A (zh) 一种肉鸡两阶段饲养方法、阶段颗粒饲料及其制备方法
CN104872384A (zh) 金针菇菇脚饲料添加剂
Jang et al. Comparison of bioavailability of organic selenium sources in finishing pigs
CN103740780A (zh) 一种通过乳酸菌发酵合成吡咯喹啉醌的方法
Bityutskii et al. Eco-friendly biotechnology for biogenic nanoselenium production and its use in combination with probiotics in poultry feeding: innovative feeding concepts
KR101231652B1 (ko) 개량된 유기태 셀레늄 생산성을 가지는 사카로마이세스 셀레비지애 돌연변이체
KR101198882B1 (ko) 유기태 셀레늄 생산성 향상을 위한 방법
Wang et al. Efficient preparation of selenium/glutathione-enriched Candida utilis and its biological effects on rats
Choi et al. Heme derived from Corynebacterium glutamicum: a potential iron additive for swine and an electron carrier additive for lactic acid bacterial culture
Yuanita et al. A combination of Dayak onion (Eleutherine palmifolia) extract and Lactobacillus acidophilus on antioxidant capacity and intestinal bacteria in broiler chickens
KR20200006430A (ko) 고함량의 셀레늄이 함유된 동식물 또는 이의 부산물 및 이의 제조방법
KR102166789B1 (ko) 내산성, 내열성의 유산균 돌연변이 균주 및 상기 균주를 유효 성분으로 포함하는 배양 조성물
KR20160099830A (ko) 축산악취의 감소 및 면역활성 효과를 가지는 로도박터 스페로이데스 cb 8521 및 이를 이용한 미생물제
CN103555625A (zh) 一种高产赖氨酸的枯草芽孢杆菌pl83及制备方法和应用
KR101837160B1 (ko) 신균주 bt-sjp kctc12726bp 및 이의 용도
KR20060065753A (ko) 알코올 분해능이 있는 유산균 및 그를 함유하는 유제품, 건강 기능성 식품 및 식품 첨가제
Mutlag et al. Assessment of the addition of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) on the weights sectors ratios and giblets weight of broiler chicken and microbial contents
Ahmed et al. Effects of fermented bamboo vinegar liquid on growth performance, nutrient digestibility, faecal Escherichia coli concentration and ammonia emissions in growing pigs

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160202

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170206

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee