KR20060002212A

KR20060002212A - 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양방법과 이를 이용한 조성물

Info

Publication number: KR20060002212A
Application number: KR1020040051155A
Authority: KR
Inventors: 이정복; 장창순
Original assignee: 이정복; 장창순
Priority date: 2004-07-01
Filing date: 2004-07-01
Publication date: 2006-01-09
Also published as: KR100581343B1

Abstract

본 발명은 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양 방법과 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH ₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하되 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양하며, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하여 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 얻은 다음, 균체를 수세하고 용도별로 주정박, 탈지강, 당류 등과 혼합하여 건조하므로서 용도에 맞는 조성물을 제조하고 이를 적용하므로서 셀레늄이 축적된 제품을 용이하게 얻을 수 있었다.

셀레늄, 유기 셀레늄, 효모, 캔디다 유틸리스, 사료, 농업용유기질 비료, 농업용관주제, 엽면살포제, 퇴비, 화장품

Description

유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양 방법과 이를 이용한 조성물{Yeast containing a large percentage of organic-selenium and its cultivation method and the composition utilizing thereof}

도 1은 균체 배양시간에 따른 탄소원의 농도, 건조균체량, 에탄올 농도를 나타낸 그래프로서, 도 1a는 탄소원으로서 슈크로스를 사용한 것이고, 도 1b는 글루코오스를 사용한것이며,

도 2은 회분 배양(batch culture)시 균체 배양시간에 따른 말토오스의 농도, 건조균체량, 셀레늄 함유량을 나타낸 그래프이고,

도 3은 간헐적으로 배지를 보충하면서 배양시 배양시간에 따른 말토오스의 농도, 건조균체량, 배지 보충량, 셀레늄 함유량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양 방법과 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO ₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하되 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양하며, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하여 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 얻은 다음, 균체를 수세하고 용도별로 주정박, 탈지강, 당류 등과 혼합하여 건조하므로서 용도에 맞는 조성물을 제조하고 이를 적용하므로서 셀레늄이 축적된 제품을 용이하게 얻을 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 및 이의 배양 방법과 이를 이용한 조성물에 관한 것이다.

셀레늄은 원소 주기율표상 VI B족에 속하는 산소족 원소로서, 맥주효모, 돼지나 소의 콩팥, 버터, 소맥배아, 굴, 새우, 우유, 현미나 마늘 등에 상당량 함유되어 있으며, 사람이나 동물체내에서는 셀레노아미노산으로도 존재하고, 세포막의 손상을 야기하는 활성산소를 제어하는 작용을 가진 글루타치온퍼옥시다제를 활성화함으로써 세포막의 손상을 방지하여 노화를 지연시킬 분만 아니라 종양성 질환을 예방하는 작용을 가진 것으로 알려져 있다. 많은 연구에서 셀레늄은 종양질환을 억제하는 효과가 있는 것으로 발표되고 있는데, 이는 많은 암환자에서 혈청내 셀레늄 농도가 비정상적으로 낮게 나타나는 것으로도 확인할 수 있다.

또한, 납중독에 의한 빈현현상은 납이 적혈구의 용혈작용과 헤모글로빈 합성에 관여하는 S-아미노레불린산데하이드라제(ALAD) 효소의 활성을 저해하여 아미노레불린산의 뇨배설을 증가시킴으로써 조혈작용을 저해할 뿐 아니라, 납이 ALAD의 SH기를 불활성화시켜 조혈기능이 악화됨으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 납중독은 생체내 항산화제로 알려진 셀레늄에 의해 해독될 수 있다는 보고가 있는데, 이는 납에 의해 활성이 약화된 셀레늄-의존성 항산화계 효소인 글루타치온퍼옥시다제가 셀레늄 보충으로 그 활성이 현저하게 증가되기 때문이다. 이는 흰쥐의 납중독시에 식이내 셀레늄을 0.5ppm의 농도로 첨가하면 비첨가군에 비하여 간장조직의 과산화적 손상이 감소되는 것으로부터 입증되고 있다. 셀레늄의 이러한 납중독 해독작용은 ALAD의 SH기가 Se로 치환되므로써 납에 의한 SH기의 불활성화가 방지되기 때문인 것으로 설명되고 있다.

기타 유사한 기전에 의해 셀레늄은 납 이외에도 카드뮴, 수은 등의 중금속 해독작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 특히, 이들 셀레늄은 암을 비롯한 여러가지 종양성 질환을 예방하는 성질을 갖고 있으며, 동물실험에 의하여 쥐에 셀레늄을 식이로 섭취시켰을 경우, 암발생을 40 ∼ 60% 감소시켰다는 결과와 유방암 환자의 경우 혈액 내 셀레늄 농도와 암발생 빈도가 반비례한다는 결과가 보고되어 있다.

셀레늄의 우수한 작용효과를 살펴보면, 셀레늄의 항산화력은 비타민 E의 1970배에 달하며 비타민 E와 셀레늄을 병용하면 항산화력은 상승효과가 나타나고, 비듬과 건선을 치료하는 효과가 있으며, 비타민 C 및 E와 같이 불포화 지방산의 산화를 억제하여 과산화 지질의 생성을 억제할 뿐만 아니라 과산화 지질과 단백질의 결합물인 노폐물질을 분해하여 인체의 노화를 억제시키고, 수은, 카드뮴, 납 등의 중금속과 결합하여 이들을 불활성화시키고 간세포의 괴사를 방지하여 간경화증을 예방하며, 암을 예방하며 면역기능을 향상시키고 상당량(약 25 내지 40%)이 고환, 정낭, 전립선 등 성기관에 집중되어 성적기능을 향상시키고, 백내장과 류마티즘을 예방하여 비타민 E와 함께 근이양중을 치료한다.

우리 나라 토양은 셀레늄 함량이 극도로 희박한 나라로서 셀레늄 함량이 높은 나라의 30% 정도에 그치고 있어, 재배되는 농작물에 축적되는 셀레늄의 양도 극히 미약하므로 각종 작물에 셀레늄 공급원이 필요한 실정이다.

특히, 셀레늄은 은, 구리, 납, 니켈 등과 같은 미네랄과 결합된 것, 소듐 셀레나이트, 소듐 셀레네이트 등과 같이 산소와 결합된 것, 하이드로겐 셀레나이드 등과 같은 무기 셀레늄과 효모, 유산균 등의 미생물을 배양시 무기 셀레늄을 공급하여 세포내 생체반응을 통하여 아미노산과 황과 셀레늄이 치환된 아미노산 결합형인 유기 셀레늄으로 구분되는 데, 무기 셀레늄은 흡수성이 좋지 않을 뿐만 아니라 독성이 있고 부작용이 있어 사람은 물론 동물에 직접 적용할 수 없어 농작물에 함유되어 있거나 미생물에 의하여 생성된 유기 셀레늄을 제공하여야 한다.

상기와 같이 셀레늄의 우수한 효능 및 필수 요구성에 의하여 유기 셀레늄을 제공하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다.

특히, 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 애시도필러스 (actobacillus acidphilous), 스트렙토코카스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 등의 미생물을 사용하여 셀레늄을 축적시킨 미생물 균체를 얻고, 이를 사람이나 동물에 적용하여 사람에게 필요한 셀레늄을 제공하는 방법들이 주로 이용되고 있다.

그러나, 상기와 같은 미생물을 사용하는 방법은 배양시 부산물인 에탄올이 생성되어 생산물 저해(Product inhibition)를 일으키며, 탄소원으로서 단당류를 사용하므로 생산물 저해를 일으키고, 산소요구량이 많고 균체생산량 및 성장율이 낮으며, 경제성 및 배양 용이성이 좋지 못하고, 고농도로 셀레늄을 축적시키기 어려운 문제점 등이 있었으며, 이 방법으로 얻은 균체를 여러 가지 용도로 적용시 얻어진 균체량 및 균체내 축적된 셀레늄의 양이 적어 경제적이지 못한 단점이 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 배양시 부산물인 에탄올이 생성되지 않아 생산물 저해(Product inhibition)를 일으키지 않으며, 탄소원으로서 이당류를 사용하므로 생산물 저해를 일으키지 않고, 산소요구량이 적고 성장율은 낮으나 균체생산량이 높으며, 경제성 및 배양 용이성이 좋고, 고농도로 셀레늄을 축적시킬 수 있는 효모를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 의 배양 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모를 얻고, 이를 여러 가지 용도로 적용하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출될 수 있는 또 다른 목적들을 달성하기 위하여 본 발명에서는 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하되 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양하며, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하여 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 얻은 다음, 균체를 수세하고 용도별로 주정박, 탈지강, 당류 등과 혼합하여 건조하므로서 용도에 맞는 조성물을 제조하고 이를 적용하므로서 셀레늄이 축적된 제품을 용이하게 얻을 수 있었다.

본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모의 배양 방법은 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하되 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양하며, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하는 것으로 특징지워진다.

또한, 본 발명에 따른 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모는 상기의 방법으로 배양된 것으로, 부산물인 에탄올이 생성되지 않아 생산물 저해(Product inhibition)를 일으키지 않으며, 탄소원으로서 이당류를 사용하므로 생산물 저해를 일으키지 않고, 산소요구량이 적고 성장율은 낮으나 균체생산량이 높으며, 경제성 및 배양 용이성이 좋고, 고농도로 셀레늄을 축적시킬 수 있는 것으로 특징지워진다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모를 축적하는 조성물은 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 수세하고 용도별로 주정박, 탈지강, 당류 등과 혼합하여 건조하는 것으로 특징지워진다.

본 발명에서 사용되는 효모인 캔디다 유틸리스(Candida utilis)는 톨루라 유틸리스(Tolura utilis), 톨루롭시스 유틸리스(Toluropsis utilis), 사이토코커스 유틸리스(Cytococcus utilis) 등으로 명명되기도 하며, ATCC No. 9226을 특별히 사용하였다.

캔디다 유틸리스는 2차 대전 전, 후에 독일에서 단백질 공급원으로 연구한 것이 시초이고, 자연계에 널리 존재하며, 펜토스(pentose) 자화력이 강하여 아황상 펄프 제조시 발생되는 폐수를 이용하여 사료용 효모 제조에 응용되므로서 폐수를 정화하면서 단백질 공급원을 생산할 수 있는 장점이 있고, 이노신산(inosisnic acid) 및 구아닐산(guanylic acid) 제조에도 사용되고 있다.

특히, 일본식품공전에는 식품에 직접 첨가가 허가된 식품첨가물 중 건조효모로서 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 프라질리스(Saccharomyces fragilis)와 캔디다 유틸리스를 기재하고 있어, 캔디다 유틸리스는 식품에 안전하게 사용 가능할 정도로 인체에 무해한 것이다.

뿐만 아니라, 캔디다 유틸리스는 탄소원으로서 슈크로오스와 같은 이당류를 이용 가능하고, 탄소원으로서 글루코오스를 사용할 때 보다는 성장율(Specific growth rate : U_max)는 낮으나 균체생산율(Biomass yield : Y_x/s)는 높으며, 산소한계조건(Oxygen limitation condition)에서 탄소원으로서 글루코오스를 사용시에는 에탄올을 생성(생산물 저해(Product inhibition))하는 반면에 말토오스, 슈크로오스 와 같은 이당류를 사용시에는 에탄올을 생성하지 않는 특징을 나타내는 생산물 저해가 생기지 않는다.

본 발명에서는 상기와 같은 특성을 갖는 캔디다 유틸리스 중에서 캔디다 유틸리스 ATTC 9226 균주를 분양받아 기본 배양(stock culture)을 행하였다.

즉, 증류수 1ℓ에 당밀 용액 8g, (NH₄)₂HPO₄ 0.1g, 효모 추출물 0.1g, 아가 20g을 첨가한 배지(Solide molasses agar)에 균주를 접종하고 pH 5.5 ∼ 6.0, 배양온도 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

당밀은 시그마사의 시판품을 구입하여 사용하였다.

본 발명에 있어서 효모의 건조균체량 및 셀레늄의 정량은 다음과 같은 방법으로 행하였다. 먼저, 효모 배양액 10㎖를 3,000g×10분으로 원심분리하여 상등액과 균체를 분리한 후, 균체를 0.85% NaCl 용액으로 3회 세척한 다음, 85℃에서 24시간 동안 건조하여 균체량을 측정하였다. 또한, 상기에서 얻은 원심분리후의 상등액으로부터 당을 분석하고 세포외의 셀레늄을 정량하였으며, 건조균체량을 측정한 후에 세포내의 셀레늄을 정량하였다.

셀레늄의 분석은 셀레늄 100mg을 칭량하고 50㎖의 질산을 첨가한 다음, 서서히 가온하면서 용해한 후에 0 ∼ 100㎍/㎖가 되도록 증류수로 희석하여 농도별 표준용액을 제조하고, 적정농도의 표준용액 1㎖에 증류수 10㎖를 첨가하여 희석시킨 다음, 암모니아수로 pH를 2.0으로 조정하고 염산하이드록실아민 200㎎을 첨가하여 가온 용해한 후, 2,3-디아미노나프탈렌 시약(2,3-디아미노나프탈렌 100mg과 하이드 록실아민 하이드로클로릭산 500mg을 0.1N HCl에 용해하여 100㎖로 한 것)10㎖를 첨가하고 상온에서 100분간 정치반응시킨 다음, 분리깔대기(Separating Funnel)에서 싸이클로핵산 10㎖를 첨가하여 추출하고, 핵산층을 취하여 무수황산나트륨으로 탈수한 후, 378nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한다.

그 다음에 검액 시료를 50㎖의 에테르를 이용하여 2회 추출하고 원심분리한 후, 잔사에 질산 5㎖, 염산 2.5㎖ 및 70% 과염소산 5㎖를 가하여 가온하면서 용해하고 분해장치에 모은 후 저온에서 용액이 무색 내지는 미황색이 되고, 과염소산이 흰연기가 날때까지 가열분해한 다음, 분해액과 추출액을 모두 모아서 암모니아를 이용하여 pH를 2.0으로 조정하고 표준용액과 동일한 방법으로 흡광도를 측정한 후, 표준용액의 흡광도와 비교하여 셀레늄을 정량하였다.

또한, 환원당의 정량은 환원당에 의해 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid : DNS)가 환원되어 생성된 3-아미노-5-니트로살리실산의 흡광도를 측정하여 행하였다.

각각의 농도에 따른 환원당 용액(0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4g/ℓ)을 만든 다음, 0.5㎖ DNS 시약(1% 3,5-디니트로살리실산 + 0.2% 페놀 + 0.05% 소듐 설파이트 + 1% 소듐 하이드록사이드)과 0.5㎖ 환원당 용액을 혼합하고, 끓는 물에서 5분간 가열한 후 실온으로 급속히 냉각하여 575nm에서 흡광도(OD)를 측정하며, 측정된 흡광도와 환원당의 농도에 대한 표준곡선을 그린 다음, 주어진 미지시료를 이용하여 환원당의 농도를 결정한다. 즉, 검량선에서 함수식을 구하고, OD값으로 당의 농도를 결정한다. 표준곡선의 좌표는 표 1과 같다.

표 1

농도(mg/㎖)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1
OD	0	0.238	0.419	0.595	0.700	0.856

캔디다 유틸리스 ATTC 9226 균주를 기본 배양(stock culture)한 후, 500㎖ 플라스크에 증류수 1ℓ에 당밀 용액 8g, (NH₄)₂HPO₄ 0.1g, 효모 추출물 0.1g을 첨가한 배지 150㎖를 투입하고 기본 배양액 5㎖를 접종하여 pH 5.5에서 30℃의 온도로 200rpm의 교반속도로 교반하면서 12 ∼ 24시간 동안 종배양(Seed Culture)한다.

한편, 탄소원을 결정하고, 산소 제한 및 교반율을 조절하여 배양용이성을 확보하고 생성물 저해 배제로 고농도 배양이 가능한지를 확인하기 위하여 즉, 클루이버 효과를 검증하기 위하여 다음과 같이 배양을 행하였다.

즉, 10ℓ 용량의 발효기에 증류수 1ℓ에 슈크로오즈 또는 글루코오즈 30g, (NH₄)₂HPO₄ 0.1g, 효모 추출물 0.5g을 첨가한 배지 5ℓ를 투입하고 배지 중량에 대하여 10%의 종배양액을 접종하여 pH 5.5 ∼ 6.0에서 30℃의 온도로 300rpm의 교반속도로 교반하면서 0.5vvm의 통기조건(배양 12시간 후부터는 0.05vvm, 500rpm으로 조정)하에서 48시간 동안 배양한다.

슈크로오즈와 글루코오즈를 각각 탄소원으로 하는 배지에서 배양시 배양시간에 따른 슈크로오즈 또는 글루코오즈의 농도, 건조균체량, 에탄올 생성량을 측정한 결과, 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이 슈크로오스를 탄소원으로 사용시에는 에탄올 생성이 거의 없었으나 글루코오스를 탄소원으로 사용시에는 에탄올의 생성이 있음을 확인할 수 있는 바, 본 발명에서 사용되는 캔디다 유틸리스는 클루이버 효과 가 있음이 입증되었다.

따라서, 본 발명에서는 이당류인 말토스 또는 슈크로스를 사용하여 본 배양을 실시하였다.

먼저, 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지 5ℓ를 10ℓ 용량의 발효기에 투입하고 배지 중량에 대하여 10%의 종배양액을 접종하여 pH 5.0 ∼ 5.5(5M NH₄OH와 2M HCl을 이용)에서 필요에 따라 소량의 소포제(10배로 희석된 SAG471)를 투입하면서 30℃의 온도로 300rpm의 교반속도로 교반하면서 0.5vvm의 통기조건하에서 12시간 동안 배양한 다음, 배양 12시간 후부터는 0.05vvm의 통기조건하에서, 500rpm의 교반속도로 교반하면서 50 ∼ 60시간 동안 배양한다.

배양시 배양시간에 따른 말토오스의 농도, 건조균체량, 셀레늄 함량을 측정한 결과, 도 2와 같았다.

그러나, 상기와 같은 회분 배양에 있어서 발생할 수 있는 생산물 저해나 기질 저해를 배제하고 효모의 균체량을 향상시킬 뿐만 아니라 성장율을 향상시켜 고농도로 배양이 되도록 하며, 셀레늄 함량이 높도록 하고 경제성이 우수하도록 하기 위하여 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하는 것을 고려하여 본 발명에 따른 배양 방법을 완성하였다.

즉, 탄소원으로서 슈크로오스와 말토오스를 사용하여 배양시 각종 결과치를 측정한 결과, 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이 말토오스를 사용하는 것이 효과적이었다.

표 2

구분	슈크로오스	말토오스	비고
U_max	0.15 ∼ 0.2	0.19 ∼ 2.4	Hr^-
Y_X/S	0.25 ∼ 0.35	0.33 ∼ 0.42	g/g
P_SE/X	0.008 ∼ 0.02	0.015 ∼ 0.028	g/g
S_opt	50 ∼ 80	50 ∼ 80	g/ℓ

한편, 보충용 배지의 보충율(Feeding Rate : ㎖/Hr)은 하기의 식에 의하여 구하였고, 배양 시간에 따른 보충용 배지의 보충율은 도 4에 도시된 바와 같다.

F = {(X_o× V_o ×U)/Y_X/S ×(S_in - S_o)}× e^ut

상기 식에서, F는 보충용 배지의 보충율(Feeding Rate : ㎖/Hr), X_o는 초기 건조균체량(Initial Dry-Cell Weight : g/ℓ), V_o는 초기 배양 부피(Initial Culture Vol. : ℓ), U는 비성장속도(Specific Growth Rate : Hr^-), Y_X/S는 수율(균체량(Biomass(g))/ 기질(Substrate 1g)), S_in은 보충용 배지의 농도(Feeding Substrate Concentration : g/ℓ), S_o는 초기 기질 농도(Initial Substrate Concentration : g/ℓ), T는 배양시간(Hr)이다.

상기와 같은 배지 보충 조건 하에서 즉, 도 4에 도시된 양으로 배지를 보충 하면서 배양하되 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하여 표 3 및 도 3에 기재 및 도시된 바와 같이 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 얻었다.

표 3

구분	배양결과	비고
U_max	0.23	Hr^-
Y_X/S	0.4	g/g
P_SE/X	0.031	g/g
DCW	81.9	g/ℓ

상기와 같은 방법으로 배양된 균체를 3,000g로 10분간 원심분리하여 균체를 얻은 다음, 2 ∼ 3회 수세하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 열풍건조하여 건조 효모기준으로 셀레늄 함량이 2.91%인 건조 효모 제품을 얻었다.

또한, 수득된 효모를 주정박, 탈지강 등과 같은 부형제와 셀레늄 함량이 300 ∼ 1,000ppm이 되도록 혼합 건조한 것을 사료 조성물 중량에 대하여 0.01 ∼ 0.1% 첨가하여 사료를 제조하거나, ALC, 탈지강 등과 같은 부형제와 셀레늄 함량이 0.5 ∼ 5ppm이 되도록 혼합 건조하여 농업용 유기질 비료 조성물 중량에 대하여 0.05 ∼ 1% 첨가하므로서 농업용 유기질 비료를 제조할 수도 있다.

뿐만 아니라, 비료성분(미량요소로서 Fe, Mg, B 등) 0.1 ∼ 15%과 셀레늄 함량이 5,000 ∼ 12,000ppm이 되도록 혼합하여 수용성제제인 관주제를 제조하거나 비료성분(미량요소로서 Fe, Mg, B 등) 0.1 ∼ 15%, 동물성 아미노산 2%와 셀레늄 함량이 5,000 ∼ 12,000ppm이 되도록 혼합하여 수용성제제인 엽면살포제를 제조할 수 도 있으며, 공지의 화장료 조성물에 셀레늄 함량이 0.01 ∼ 5ppm이 되도록 혼합하여 화장료 조성물을 얻을 수도 있다.

즉, 사료용 생균제로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 10⁸cfu/g, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidopilus) 10⁶cfu/g, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae) 10⁷cfu/g와 셀레늄 함량이 500ppm이 되도록 주정박에 혼합하여 건조하고, 공지의 돼지 사료에 0.1% 첨가하여 돼지 생체 중량이 50 ∼ 60㎏인 돼지에 급여하여 사육한 결과, 돈육 내의 셀레늄 함량이 0.23ppm이었으나 대조구(무첨가)는 0.07ppm이었다.

또한, 비료성분(미량요소로서 Fe, Mg, B 등) 0.05%와 셀레늄 함량이 4,000ppm이 되도록 혼합하여 수용성제제인 관주제를 제조하거나 비료성분(미량요소로서 Fe, Mg, B 등) 0.05%, 동물성 아미노산 2%와 셀레늄 함량이 4,000ppm이 되도록 혼합하여 수용성제제인 엽면살포제를 제조하고 관주제 1ℓ를 물 1000ℓ에 희석하여 5 ∼ 7일 간격으로 관주처리하거나 엽면살포제 1ℓ를 물 500ℓ에 희석하여 7 ∼ 10일 간격으로 엽면살포하였다. 특히, 상추, 배추, 깻잎 등은 생육초기에 2 ∼ 3회 처리하되 관주처리는 200 ∼ 250평에, 엽면살포는 700 ∼ 800배로 병행 처리하였으며, 양파, 무우, 감자 등은 생육 중기 이후에 3 ∼ 4회 처리하되 관주처리는 150 ∼ 250평에, 엽면살포는 500 ∼ 600배로 병행 처리하였고, 토마토, 딸기, 참외, 수박, 고추, 메론 등은 과비대기에 3 ∼ 4회 처리하되 관주처리는 150 ∼ 250평에, 엽면살포는 500 ∼ 600배로 병행 처리하였으며, 복숭아, 포도 등은 과비대기 에 3 ∼ 4회 처리하되 엽면살포를 500 ∼ 600배로 처리하였고, 벼는 등숙기에 3 ∼ 4회 처리하되 관주처리는 200 ∼ 250평에, 엽면살포는 500 ∼ 600배로 병행 처리하였으며, 인삼, 약초 등은 생육기에 2 ∼ 4회 처리하되 관주처리는 200 ∼ 250평에, 엽면살포는 800 ∼ 1000배로 병행 처리하였으며, 버섯류는 생육기 후반에 엽면살포를 800 ∼ 1000배로 처리하였다.

농작물의 재배 결과, 방울토마토는 셀레늄 함유량이 7.51ppb이었으며, 완숙토마토는 4.99ppb이었고, 미나리는 70.0ppb, 딸기는 10.81ppb, 참외는 28.11ppb, 수박은 7.33ppb이었다.

상술한 바와 같이 본 발명에서는 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 말토스 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl ₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO ₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하되 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양하며, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ 로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양하여 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모 균체를 얻은 다음, 균체를 수세하고 용도별로 주정박, 탈지강, 당류 등과 혼합하여 건조하므로서 용도에 맞는 조성물을 제조하고 이를 적용하므로서 셀레늄이 축적된 제품을 용이하게 얻을 수 있었다.

Claims

캔디다 유틸리스(Candida utilis ATTC 9226) 균주를 음용 가능한 수돗물 1ℓ에 이당류 80.0g, (NH₄)₂SO₄ 6.0g, 효모추출물 0.5g, KH₂PO ₄ 8.0g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.6g, EDTA 0.3g, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.1g, MnCl₂ㆍ2H₂O 0.01g, CoCl₂ㆍ6H₂O 0.05g, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.001g, Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 0.1g, CaCl₂ㆍ7H₂O 0.1g, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.05g, Na₂SeO₃ 0.5g을 첨가한 배지에서 pH 5.0 ∼ 5.5, 배양온도 25 ∼ 35℃에서 40 ∼ 70시간 동안 배양하고, 말토스 200g/ℓ, Na₂SeO₃ 0.5 ∼ 1.0g/ℓ와 효모추출물 0.1g/ℓ로 구성되는 보충용 배지를 간헐적으로 투입하면서 배양함을 특징으로 하는 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모의 배양 방법.
제 1 항에 있어서, 배양 12시간까지는 0.5vvm으로 통기하면서 200 ∼ 400rpm으로 진탕배양하고 12시간 이후에는 0.05vvm으로 통기하면서 500 ∼ 700rpm으로 진탕배양함을 특징으로 하는 유기 셀레늄을 고농도로 축적하는 효모의 배양 방법.
공지의 농업용 유기질 비료 조성물에 있어서, 제1항 또는 제2항의 방법으로 배양된 캔디다 유틸리스 균체를 원심분리하고 수세한 후 부형제와 셀레늄 함량이 0.5 ∼ 5ppm이 되도록 혼합 건조한 것을 농업용 유기질 비료 조성물 중량에 대하여 0.05 ∼ 1% 첨가한 것을 특징으로 하는 농업용 유기질 비료 조성물.
공지의 사료용 조성물에 있어서, 제1항 또는 제2항의 방법으로 배양된 캔디다 유틸리스 균체를 원심분리하고 수세한 후 부형제와 셀레늄 함량이 300 ∼ 1,000ppm이 되도록 혼합 건조한 것을 사료 조성물 중량에 대하여 0.01 ∼ 0.1% 첨가한 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.
제1항 또는 제2항의 방법으로 배양된 캔디다 유틸리스 균체를 원심분리하고 수세한 후 비료성분 0.1 ∼ 15%과 셀레늄 함량이 5,000 ∼ 12,000ppm이 되도록 혼합한 것을 특징으로 하는 관주제 조성물.
제1항 또는 제2항의 방법으로 배양된 캔디다 유틸리스 균체를 원심분리하고 수세한 후 비료성분 0.1 ∼ 15%와 셀레늄 함량이 5,000 ∼ 12,000ppm이 되도록 혼합한 것을 특징으로 하는 엽면살포제 조성물.
제1항 또는 제2항의 방법으로 배양된 캔디다 유틸리스 균체를 원심분리하고 수세하여 열풍 건조하고, 공지의 화장료 조성물에 셀레늄 함량이 0.01 ∼ 5ppm이 되도록 혼합한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.