WO2018002520A1 - Utilisation d'au moins un compose selenie pour augmenter la teneur en ethanol d'une composition et procede de fermentation alcoolique utilisant un compose selenie particulier - Google Patents

Utilisation d'au moins un compose selenie pour augmenter la teneur en ethanol d'une composition et procede de fermentation alcoolique utilisant un compose selenie particulier Download PDF

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WO2018002520A1
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alcoholic fermentation
selenium
concentration
saccharomyces
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PCT/FR2017/051727
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Khadidja Romari
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Metabolium
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the general field of the production of ethanol by microorganic ferments, in particular by yeasts, particularly species belonging to the genus Saccharomyces, as well as by any microorganism genetically modified to produce ethanol.
  • ethanol 80% of the ethanol on the market is produced by anaerobic fermentation (called alcoholic fermentation) from various fermentable sugars used with the yeast Saccharomyces cerevisiae (Antonius et al., Antonie van Leeuwenhoek, 90: 391-418, 2006 Lin and Tanaka, Appl Microbiol Biotechnol, 69: 627-642, 2006).
  • Fermentable sugars are sugars that can be converted into alcohol by yeasts. It is mainly glucose, fructose and sucrose, glucose and sucrose being the most used sugars in an industrial environment. Thanks to technological improvements, ethanol yields have improved considerably over the last decade.
  • Ethanol is used in many sectors, including the agri-food industry (mainly for the manufacture of alcoholic beverages) and the biofuel industry (as an alternative to fossil fuels). According to the Renewable Global Status Report 2015, a global production of 94 trillion liters was achieved in 2014. However, this production is generally not very profitable. Therefore, the development of improved technology, allowing better yields, is essential.
  • selenium yeast in alcoholic fermentation processes such as the manufacture of beer (see, for example, documents RU2423417 and RU2086645).
  • selenium which is provided by the yeasts, is present in the final alcoholic beverage. This makes it possible to make selenium intake for the consumer.
  • One of the objects of the invention is to increase the production of ethanol of a composition during an alcoholic fermentation with at least one microorganic ferment.
  • the invention thus provides, in a first aspect, a use of at least one selenium compound for increasing the ethanol content of a composition, said process comprising at least one alcoholic fermentation step of said composition, said step of alcoholic fermentation being carried out:
  • the selenium compound is present in the composition in such a way that the concentration of selenium provided by this selenium compound in this composition is between 0.5 and 10 mg / L (by weight of selenium relative to to the volume of the composition).
  • increasing the ethanol content of a composition is meant according to the invention that the composition (operating in culture medium) naturally produces ethanol by an alcoholic fermentation step out of the presence of the selenium compound, and that the presence of the selenium compound during an alcoholic fermentation step, under identical conditions except for the presence of the selenium compound, increases appreciably, for example from minus 5% (in ratio in g / l of ethanol produced) the ethanol content of the composition.
  • the alcoholic fermentation step produces at least 5% more ethanol in the culture medium in the presence of selenium compound than it produces in the same composition, with identical conditions except the absence of selenium compound. This represents a significant technical advantage over currently known processes, for which the selenium used in alcoholic fermentation is used primarily for human nutrition or even to increase the polyphenol content of a wine.
  • the selenium compound is any selenium compound accessible to those skilled in the art.
  • a selenium compound is an organic or inorganic molecule comprising a selenium atom.
  • Organic selenium compounds are generally obtained by replacing at least one sulfur with at least one selenium atom in a molecule.
  • the organic selenium compound may for example be chosen from those described in patent application WO 2015/155453 from Tetrahedron.
  • the selenium compound is selected from the group consisting of 2-hydroxy-4-methylselenobutyric acid (or 2-hydroxy-4-methylselenobutanoic acid) or a salt thereof, selenite, selenic acid, selenate , selenocysteine, selenomethionine, selenocystathionine, selenohomocysteine and seleno-adenosylselenomethionine.
  • the selenium compound is selected from the group consisting of 2-hydroxy-4-methylselenobutyric acid or a salt thereof, selenocysteine and selenomethionine.
  • 2-Hydroxy-4-methylselenobutyric acid is generally in L, D, or D, L form.
  • the salt of 2-hydroxy-4-methylselenobutyric acid is preferably a salt of calcium, zinc or magnesium.
  • microorganic ferment is intended to mean any eukaryotic capable of producing only ethanol, as well as any microorganism genetically modified to produce ethanol, that is to say not naturally producing only ethanol. ethanol and having received genetic material to produce it. This excludes any acetogenic microorganism.
  • eukaryotic refers to all unicellular or multicellular organisms whose cells, “eukaryotes”, have a nucleus and organelles delimited by membranes. Eukaryotes are distinguished from prokaryotes (such as bacteria and archaea) which, for their part, are devoid of these structures.
  • microorganism ferment is the Rhodotorula mushroom.
  • microorganism genetically modified to produce ethanol is a cyanobacterium described in US Pat. No. 6,699,696 to Enol Energy Inc.
  • the microorganic ferment is a yeast selected from the species Kloeckera apiculata, species of the genus Candida and species of the genus Saccharomyces, preferably of the genus Saccharomyces. Even more preferably, the microorganic ferment is a yeast selected from the species Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces exiguus and Saccharomyces uvarum.
  • This yeast is different from a yeast extract which itself contains yeast cells "dead” that is to say whose content has been removed.
  • An embodiment according to the invention is such that the selenium compound is present in the composition at a concentration such that the concentration of selenium in this composition is between 1 and 8 mg / L, for example equal to about 2 mg / L. .
  • concentration such that the concentration of selenium in this composition is between 1 and 8 mg / L, for example equal to about 2 mg / L. .
  • this applies to the total selenium content of the composition, taking into consideration the total concentration of each of them.
  • the composition is such that known to those skilled in the art to ensure the production of ethanol for the microorganism ferment concerned, that is to say that is, the composition includes the chemical elements necessary for the alcoholic fermentation.
  • the alcoholic fermentation step is generally carried out in the presence of at least one carbohydrate chosen from the group formed by glucose, fructose, sucrose, maltose, sucrose and mixtures thereof, preferably selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, and mixtures thereof, more preferably selected from the group consisting of glucose, sucrose, and mixtures thereof.
  • carbohydrate chosen from the group formed by glucose, fructose, sucrose, maltose, sucrose and mixtures thereof, preferably selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, and mixtures thereof, more preferably selected from the group consisting of glucose, sucrose, and mixtures thereof.
  • the alcoholic fermentation step is carried out in the presence of at least one carbohydrate selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, maltose and sucrose, preferably selected from the group formed by glucose, fructose and sucrose, more preferably selected from the group consisting of glucose and sucrose.
  • the alcoholic fermentation step is carried out:
  • the composition is preferably chosen from compositions derived from at least one element selected from the group consisting of wheat, barley, oats, maize, rice, rye, beet, sugar cane, palm waste, grapes and apples.
  • composition can be subjected, as is known to those skilled in the art, to at least one pretreatment such as hydrolysis.
  • strain Saccharomyces cerevisiae has the enzyme invertase for hydrolyzing the fermentable sugar sucrose, present for example in beet molasses, glucose and fructose.
  • glucose is generally used as fermentable sugar and as the sole source of carbon.
  • the invention also relates to a process for alcoholic fermentation of a composition, said process comprising at least one alcoholic fermentation step of said composition, said alcoholic fermentation step being carried out:
  • selenium compound chosen from the group formed by 2-hydroxy-4-methylselenobutyric acid or one of its salts and selenocysteine, and present in the composition at a concentration such that the concentration of selenium in this composition is between 0.5 and 10 mg / L;
  • the alcoholic fermentation step is generally as described above with regard to the use according to the invention. In particular, it meets the preferred conditions, simultaneously or alternatively, explained below.
  • the alcoholic fermentation step is preferably carried out in the presence of at least one carbohydrate selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, maltose, sucrose and their mixtures, preferably chosen in the group formed by glucose, fructose, sucrose, and mixtures thereof, even more preferably selected from the group consisting of glucose, sucrose, and mixtures thereof.
  • at least one carbohydrate selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, maltose, sucrose and their mixtures, preferably chosen in the group formed by glucose, fructose, sucrose, and mixtures thereof, even more preferably selected from the group consisting of glucose, sucrose, and mixtures thereof.
  • the alcoholic fermentation step is carried out in the presence of at least one carbohydrate selected from the group consisting of glucose, fructose, sucrose, maltose and sucrose, preferably selected from the group formed by glucose, fructose and sucrose, more preferably selected from the group consisting of glucose and sucrose.
  • the microorganic ferment is a yeast selected from the species Kloeckera apiculata, species of the genus Candida and species of the genus Saccharomyces, preferably selected from the species Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces pastorianus and Saccharomyces uvarum.
  • the microorganic ferment may finally be a Rhodotorula fungus or a microorganism genetically modified to produce ethanol, for example a cyanobacterium described in US Pat. No. 6,699,696.
  • the concentration of the selenium compound is such that the concentration of selenium in this composition is between 1 and 8 mg / l.
  • composition is generally chosen from compositions derived from at least one element selected from the group consisting of wheat, barley, oats, corn, rice, rye, beetroot, sugar cane, palm waste, grapes and apples.
  • the glucose-containing industrial culture medium detailed in Table 1 was used for all experiments on the Saccharomyces strains described hereinafter. This medium has been described by Bafrncova et al., Biotechnology Letters, 21: 337341, 1999.
  • the cultures in the presence of selenium compound were made from the fermentation medium from an inoculum prepared in the following manner: A cryotube containing 1.8 ml of the strain to be used (YPD medium [10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone, 20 g / L glucose, pH 6.0], sterile 30% glycerol, cryopreserved in exponential phase and stored at -80 ° C until use) was transferred to a 2L Erlenmeyer flask containing 500 mL of sterile YG medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L glucose, natural pH 6.0). The pre-culture was then incubated at 120 rpm ("rpm" for "rpm”), 30 ° C for 18-24h.
  • YPD medium 10 g / L yeast extract, 20 g / L peptone, 20 g / L glucose, pH 6.0
  • sterile 30% glycerol cryopreserved in exponential phase and stored
  • Ethanol and Residual Glucose The production of ethanol was determined by enzymatic kit (Sigma Aldrich Ref MAK076-1 KT) throughout the fermentations. The residual glucose in the fermentation must has also been determined by enzymatic kit (Roche Ref 10716251035). All The sample from the fermentation must was frozen at -20 ° C until dosed when necessary.
  • a 200 ml mini-reactor was filled with 180 ml of sterile fermentation medium (see Table 1) supplemented with different sources of selenium compounds at a concentration of 2 mg Se / L.
  • a mini-control reactor (without selenium but all other conditions being equal) was also prepared for each fermentation.
  • the mini-reactor was sterilely seeded with biomass recovered by centrifugation (Juan centrifuge 5 min, 4000 rpm, 4 ° C). Stirring was maintained at 140 rpm and the temperature was maintained at 30 ° C throughout the crop while no air supply was made to maintain anaerobic conditions necessary for the alcoholic fermentation.
  • the addition of selenium made it possible to obtain a gain in ethanol production at 24 hours ranging from 1% to more than 50% relative to the control culture comprising no selenium compound.
  • a 5L reactor (Labfors Infors HT) containing 4 L of fermentation medium (see Table 1) was sterilized at 121 ° C for 15 min and the source of selenium compound (i.e. HMSeBA) at 2 mg was added to it. Salt.
  • a control reactor (without selenium but all other conditions being equal) was also prepared for each fermentation. The reactors were regulated at 30 ° C by a double jacket, and the pH was followed by a pH sensor directly linked to the fermentation monitoring software (Iris V5). Stirring was maintained at 300 rpm throughout the crop while no air supply was made to set anaerobic conditions necessary for the alcoholic fermentation. No cover pressure was imposed during the fermentation. The culture was started by sterile transfer of 500 mL of pre-culture to the reactor to obtain a working volume of 4.5L. Three to four samples of fermentation must were taken per 24 hours, which allowed monitoring of cell growth and consumption of fermentable sugars.
  • Characterization of ethanol production was continued in 5L fed-batch in order to validate the effect of selenium on the increase of ethanol production.
  • a single source of selenium compound was tested (the HMSeBA) to validate the fed-batch mode in 5 L.
  • the culture was started as previously indicated for the batch culture reactor in a 5L reactor. Unlike the batch culture, the start-up workload was set at 3L.
  • the concentration of fermentable sugars reached about 40 g / L
  • a 700 g / L syrup of fermentable sugars was added sterile in order to obtain a concentration of 120 g / L of fermentable sugars in the fermentation must.
  • the culture was continued to the maximum usable volume (5L) of the reactor.
  • Ethanol Red ® strain has also been characterized in fed-batch of 5L using HMSeBA as a source of selenium compound.

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Abstract

Utilisation de composé sélénié pour augmenter la teneur en éthanol d'une composition, ledit procédé comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique de ladite composition réalisée en présence dudit composé sélénié en concentration comprise entre 0,5 et 10 mg/L de sélénium dans la composition; pendant une durée de 6h à 96h; et en présence d'un ferment microorganique. Procédé de fermentation alcoolique d'une composition, ledit procédé comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique réalisée : en présence d'au moins un composé sélénié choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique ou un de ses sels et la sélénocystéine, et présent en concentration telle que la concentration de sélénium dans cette composition est comprise entre 0,5 et 10 mg/L; pendant une durée de 6h à 96h; et en présence d'un ferment microorganique.

Description

UTILISATION D'AU MOINS UN COMPOSE SELENIE POUR AUGMENTER LA TENEUR EN ETHANOL D'UNE COMPOSITION ET PROCEDE DE FERMENTATION ALCOOLIQUE UTILISANT UN COMPOSE SELENIE
PARTICULIER
La présente invention a trait au domaine général de la production d'éthanol par des ferments microorganiques, en particulier par des levures, tout particulièrement d'espèces appartenant au genre Saccharomyces, ainsi que par tout microorganisme génétiquement modifié pour produire de l'éthanol.
Actuellement, 80% de l'éthanol sur le marché est produit par fermentation anaérobique (dite fermentation alcoolique) à partir de divers sucres fermentescibles utilisés avec la levure Saccharomyces cerevisiae (Antonius et al., Antonie van Leeuwenhoek, 90 : 391-418, 2006 ; Lin et Tanaka, Appl Microbiol Biotechnol, 69 : 627-642, 2006). Les sucres fermentescibles sont les sucres pouvant être transformés en alcool par les levures. Ce sont principalement le glucose, le fructose et le saccharose, le glucose et le saccharose étant les sucres les plus utilisés en milieu industriel. Grâce aux améliorations technologiques, les rendements en éthanol se sont considérablement améliorés pendant la dernière décennie.
Cependant, les profits ont diminué. Les principales limitations de la fermentation alcoolique sont les contaminations récurrentes, ainsi que le type de procédé appliqué, qui affectent directement les rendements de production et la qualité du produit.
L'éthanol est utilisé dans de nombreux secteurs, dont l'industrie agroalimentaire (principalement pour la fabrication de boissons alcoolisées) et l'industrie des biocarburants (en temps qu'alternative aux carburants fossiles). D'après le Rapport Global des Energies Renouvelables {«Renewable Global Status Report 2015 »), une production mondiale de 94 billions de litres a été réalisée en 2014. Cependant, cette production est, généralement, peu voire pas rentable. Par conséquent, le développement d'une technologie améliorée, permettant de meilleurs rendements, s'avère essentielle.
Il est connu d'utiliser la levure séléniée dans les procédés de fermentation alcoolique telle que la fabrication de bière (voir par exemple les documents RU2423417 et RU2086645). Cependant, dans ce cas, le sélénium, qui est apporté par les levures, est présent dans la boisson alcoolisée finale. Cela permet de réaliser un apport en sélénium pour le consommateur.
Il est également connu d'utiliser du sélénium pour la fabrication de vin, non seulement pour que le sélénium soit présent sous forme organique dans le produit final, mais aussi pour augmenter la production des polyphénols qui ont leur utilité dans le produit final en particulier en tant qu'antioxydants (voir par exemple la publication de Barbulescu et al., Romanian Biotechnologial Letters, Vol. 17, No. 5, 2012, pp. 7646-7655).
Un des objets de l'invention est d'augmenter la production de l'éthanol d'une composition au cours d'une fermentation alcoolique par au moins un ferment microorganique.
L'invention a ainsi pour objet, sous un premier aspect, une utilisation d'au moins un composé sélénié pour augmenter la teneur en éthanol d'une composition, ledit procédé comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique de ladite composition, ladite étape de fermentation alcoolique étant réalisée :
- en présence dudit composé sélénié présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 0,5 et 10 mg/L;
- pendant une durée comprise dans un intervalle de 6h à 96h, de préférence de 12h à 96h ; et
- en présence d'au moins un ferment microorganique.
En d'autres termes, le composé sélénié est présent dans la composition de telle façon que la concentration du sélénium, apporté par ce composé sélénié, dans cette composition est comprise entre 0,5 et 10 mg/L (en poids de sélénium par rapport au volume de la composition).
Par « augmenter la teneur en éthanol » d'une composition, on entend selon l'invention que la composition (fonctionnant en milieu de culture) produit naturellement de l'éthanol par une étape de fermentation alcoolique hors présence du composé sélénié, et que la présence du composé sélénié au cours d'une étape de fermentation alcoolique, à conditions identiques hormis la présence du composé sélénié, augmente de façon notable, par exemple d'au moins 5% (en rapport en g/L d'éthanol produit) la teneur en éthanol de la composition. En d'autres termes, cela signifie que l'étape de fermentation alcoolique produit au moins 5% de plus d'éthanol dans le milieu de culture en présence de composé sélénié que ce qu'elle produit dans la même composition, à conditions identiques hormis l'absence de composé sélénié. Cela représente un avantage technique important par rapport aux procédés actuellement connus, pour lesquels le sélénium utilisé en fermentation alcoolique sert principalement à la nutrition humaine voire pour augmenter la teneur en polyphénols d'un vin.
Selon l'invention, le composé sélénié est tout composé sélénié accessible à l'homme du métier. Selon l'invention, un composé sélénié est une molécule, organique ou inorganique, comprenant un atome de sélénium. Les composés séléniés organiques sont généralement obtenus par remplacement d'au moins un soufre par au moins un atome de sélénium dans une molécule.
Ainsi, le composé sélénié organique peut être par exemple choisi parmi ceux décrits dans la demande de brevet WO 2015/155453 de la société Tetrahedron. De préférence, le composé sélénié est choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique (ou acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque) ou un de ses sels, le sélénite, l'acide sélénique, le sélénate, la sélénocystéine, la sélénométhionine, la sélénocystathionine, la sélénohomocystéine et la séléno-adénosylsélénométhionine.
De façon encore plus préférée, le composé sélénié est choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique ou un de ses sels, la sélénocystéine et la sélénométhionine.
L'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique est généralement sous forme L, D, ou D, L.
Le sel de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique est de préférence un sel de calcium, de zinc ou de magnésium.
Dans le cas particulier de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique, on peut se référer quant aux conditions d'utilisation de cet acide au brevet US 9017985 de la demanderesse, qui concerne l'utilisation de cet acide pour l'enrichissement en sélénium d'un microorganisme photosynthétique. Par « fermentation alcoolique », on entend un processus biochimique par lequel des sucres, qui sont des glucides, sont transformés en éthanol, généralement dans un milieu liquide, privé d'air. C'est donc un processus purement éthanologénique. En d'autres termes, cela exclut l'acétogénèse qui est un processus biochimique permettant la production à la fois d'éthanol et d'acétone. Par « ferment microorganique », on entend selon l'invention tout eucaryote apte à produire uniquement de l'éthanol, ainsi que tout microorganisme génétiquement modifié pour produire de l'éthanol, c'est-à-dire ne produisant pas naturellement uniquement de l'éthanol et ayant reçu du matériel génétique pour en produire. Cela exclut tout microorganisme acétogénique.
Le terme « eucaryote » désigne l'ensemble des organismes unicellulaires ou multicellulaires dont les cellules, « eucaryotes », possèdent un noyau et des organites délimités par des membranes. Les eucaryotes se distinguent des procaryotes (comme les bactéries et les archées) qui sont pour leur part dépourvus de ces structures.
Un exemple de ferment microorganique est le champignon Rhodotorula.
Un exemple de microorganisme génétiquement modifié pour produire de l'éthanol est une cyanobactérie décrite dans le brevet US 6699696 de la société Enol Energy Inc.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le ferment microorganique est une levure choisie parmi l'espèce Kloeckera apiculata, les espèces du genre Candida et les espèces du genre Saccharomyces, de préférence du genre Saccharomyces. De façon encore plus préférée, le ferment microorganique est une levure choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces exiguus et Saccharomyces uvarum.
Cette levure est différente d'un extrait de levure qui, lui, contient des cellules de levure « mortes » c'est-à-dire dont on a retiré le contenu.
Un mode de réalisation selon l'invention est tel que le composé sélénié est présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 1 et 8 mg/L, par exemple égale à environ 2 mg/L. Lorsque plusieurs composés séléniés sont présents, cela vaut pour la teneur totale en sélénium de la composition, en prenant en considération le total de la concentration de chacun d'entre eux.
En dehors de la présence du ou des composé(s) sélénié(s) selon l'invention, la composition est telle que connue de l'homme du métier pour assurer la production d'éthanol pour le ferment microorganique concerné, c'est-à-dire que la composition comprend les éléments chimiques nécessaires à la fermentation alcoolique.
Ainsi, comme il est connu de l'homme du métier, l'étape de fermentation alcoolique est généralement réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose, le sucrose et leurs mélanges, de préférence choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, et leurs mélanges, de façon encore plus préférée choisi dans le groupe formé par le glucose, le saccharose, et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de fermentation alcoolique est réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose et le sucrose, de préférence choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose et le saccharose, de façon encore plus préférée choisi dans le groupe formé par le glucose et le saccharose.
Plus préférentiellement, l'étape de fermentation alcoolique est réalisée :
- à température comprise dans un intervalle de 10 à 35 °C ;
- en milieu essentiellement anaérobique ; et
- en présence d'azote assimilable.
Un milieu de culture industriel contenant du glucose et utilisable pour l'étape de fermentation alcoolique utilisant une souche Saccharomyces est par exemple décrit dans Bafrncova et al., Biotechnology Letters, 21 : 337341, 1999.
Un milieu de culture industriel contenant du glucose et utilisable pour l'étape de fermentation alcoolique utilisant une souche Zymomonas ainsi que le procédé de fermentation alcoolique sont par exemple décrit dans Rogers et al, Biotechnology Letters, 1(4) : 165- 170, 1979 et dans Rogers et al, Microbial Reactions, 37-84, 1982. Selon l'invention, la composition est de préférence choisie parmi les compositions issues d'au moins un élément choisi dans le groupe formé par le blé, l'orge, l'avoine, le maïs, le riz, le seigle, la betterave, la canne à sucre, les déchets de palme, le raisin et la pomme.
Bien évidemment, cette composition peut être soumise, ainsi qu'il est connu de l'homme du métier, à au moins un prétraitement telle une hydrolyse.
Cependant, pour les fermentations réalisées avec le glucose et le saccharose comme sources de carbone, aucun prétraitement n'est généralement nécessaire. En effet, la souche Saccharomyces cerevisiae possède l'enzyme invertase permettant d'hydrolyser le sucre fermentescible qu'est le saccharose, présent par exemple dans la mélasse de betterave, en glucose et fructose.
Pour les autres souches étudiées, le glucose est généralement utilisé comme sucre fermentescible et comme seule source de carbone.
L'invention concerne également un procédé de fermentation alcoolique d'une composition, ledit procédé comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique de ladite composition, ladite étape de fermentation alcoolique étant réalisée :
- en présence d'au moins un composé sélénié choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique ou un de ses sels et la sélénocystéine, et présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 0,5 et 10 mg/L ;
- pendant une durée comprise dans un intervalle de 6h à 96h, de préférence de 12h à 96h ; et
- en présence d'au moins un ferment microorganique.
L'étape de fermentation alcoolique est généralement telle qu'il est décrit précédemment en ce qui concerne l'utilisation selon l'invention. En particulier, elle répond aux conditions préférées, simultanément ou alternativement, explicitées ci-après.
Ainsi, l'étape de fermentation alcoolique est de préférence réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose, le sucrose et leurs mélanges, de préférence choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, et leurs mélanges, de façon encore plus préférée choisie dans le groupe formé par le glucose, le saccharose, et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de fermentation alcoolique est réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose et le sucrose, de préférence choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose et le saccharose, de façon encore plus préférée choisi dans le groupe formé par le glucose et le saccharose.
De préférence, le ferment microorganique est une levure choisie parmi l'espèce Kloeckera apiculata, les espèces du genre Candida et les espèces du genre Saccharomyces, de préférence choisie parmi les espèces Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces pastorianus et Saccharomyces uvarum. Le ferment microorganique peut enfin être un champignon Rhodotorula ou bien un microorganisme modifié génétiquement pour produire de l'éthanol tel par exemple une cyanobactérie décrite dans le brevet US 6699696.
Selon un mode de réalisation préféré, la concentration du composé sélénié est telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 1 et 8 mg/L.
La composition est généralement choisie parmi les compositions issues d'au moins un élément choisi dans le groupe formé par le blé, l'orge, l'avoine, le maïs, le riz, le seigle, la betterave, la canne à sucre, les déchets de palme, le raisin et la pomme.
EXEMPLES
Souches du genre Saccharomyces et milieu utilisé
Deux souches industrielles ont été étudiées pour l'évaluation de la production d'éthanol sous la présence du Sélénium. Ce sont les souches Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red®) et Saccharomyces cerevisiae (Saflager S-23), toutes deux fournies commercialement par la société Fermentis (Marcq en Baroeul, France). Ces souches sont couramment utilisées dans l'industrie en particulier pour la production industrielle de bioéthanol et pour la vinification, en utilisant le glucose ou le saccharose comme source de carbone. Une autre souche de Saccharomyces pastorianus (Diamond Lager) a également été étudiée, fournie commercialement par la société Lallemand (Blagnac, France).
Le milieu de culture industriel contenant du glucose et détaillé dans le Tableau 1 a été utilisé pour toutes les expérimentations concernant les souches Saccharomyces décrites ci-après. Ce milieu a été décrit par Bafrncova et al., Biotechnology Letters, 21 : 337341, 1999.
Tableau 1 : Milieu de fermentation pour les souches du genre Saccharomyces (Bafrncova et al. 1999)
Figure imgf000009_0001
Les cultures en présence de composé sélénié ont été effectuées à partir du milieu de fermentation à partir d'un inoculum préparé de la manière suivante : Un cryotube contenant 1 ,8 mL de la souche à utiliser (milieu YPD [10g/L yeast extract, 20 g/L peptone, 20 g/L glucose ; pH de 6,0], 30% glycérol stérile, cryoconservé en phase exponentielle et stocké à -80 °C jusqu'à utilisation) a été transféré dans un récipient Erlenmeyer de 2L contenant 500 mL de milieu YG stérile (10 g/L yeast extract, 20 g/L glucose, pH naturel de 6,0). La pré-culture a ensuite été incubée à 120 rpm ( « rpm » pour « tours par minute »), 30 °C pendant 18-24h.
Le résultat en termes de production d'éthanol pour une culture donnée a été comparé à chaque fois à une culture dans des conditions strictement identiques à l'exception de l'absence du composé sélénié.
La différence de production d'éthanol en présence et en absence de composé sélénié a permis de mesurer l'augmentation de la production d'éthanol, qualifiée de « gain », dans chaque cas.
Les différentes sources de composés séléniés mises dans la solution de culture au temps t=0 étaient, pour une teneur en Se dans le milieu de culture de 2 mg/L :
- soit une solution d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyique vendue par la société Tetrahedron à 0,005 g/L, référencée « HMSeBA »,
- soit une solution de sélénite de sodium à 0,004 g/L référencé « Selenite », - soit une solution d'acide sélénique à 0,00328 g/L référencée « Ac Selenique »,
- soit une solution de sélénométhionine à 0,00496 g/L référencée « Se Meth »,
- soit une solution de sélénate à 0,0048 g/L référencée « Selenate ».
Méthodes
Ces méthodes sont utilisables que la souche soit de genre Saccharomyces ou de genre Zymomonas.
- Croissance : L'évolution de la concentration cellulaire du ferment microorganique a été suivie par spectrophotométrie à 600 nm (spectrophotomètre Shimadzu UVmini-1240) dans une cuve de 1 cm de trajet optique (Starstedt Réf. 67.742). La suspension cellulaire a été diluée par une dilution manuelle afin d'obtenir une densité optique (ou DO) entre 0,08 et 0,7 unité d'absorbance, ce qui correspond à la zone de linéarité de l'appareil.
- Dosage de l'éthanol et du glucose résiduel : La production d'éthanol a été déterminée par kit enzymatique (Sigma Aldrich Réf. MAK076-1 KT) tout au long des fermentations. Le glucose résiduel dans le moût de fermentation a également été déterminé par kit enzymatique (Roche Réf. 10716251035). Tout échantillon provenant du moût de fermentation a été congelé à -20°C jusqu'à son dosage quand cela était nécessaire.
1. Caractérisation de la production d'éthanol par différentes souches sur différentes sources de composés séléniés en mini-réacteur de 200 ml_
Un mini-réacteur de 200 ml_ a été rempli avec 180 ml_ de milieu de fermentation stérile (Cf. Tableau 1 ) complémenté avec différentes sources de composés séléniés à une concentration de 2 mg Se/L. Un mini-réacteur témoin (sans sélénium mais toutes conditions égales par ailleurs) a également été préparé pour chaque fermentation.
Le mini-réacteur a été ensemencé stérilement avec de la biomasse récupérée par centrifugation (centrifugeuse Juan 5 min, 4000 rpm, 4°C). L'agitation a été maintenue à 140 rpm et la température a été maintenue à 30 °C tout au long de la culture tandis qu'aucun approvisionnement en air n'a été réalisé afin de maintenir des conditions anaérobiques nécessaires à la fermentation alcoolique.
Chaque test a été dupliqué dans un intervalle de temps maximal de 96h entre le test et sa duplication. C'est la moyenne des résultats des deux tests qui a été indiquée à chaque fois.
1 .1 Souche Ethanol Red® de Saccharomyces cerevisiae
Une première caractérisation de la production d'éthanol a été réalisée en mini-réacteur de 200 mL dans le milieu de fermentation complété avec un composé sélénié. Différentes sources de composés séléniés ont été testées. Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau 2 suivant. Tableau 2 : Production d'éthanol (EtOH, en g/L) par la souche Ethanol Red mini-réacteur de 200 ml_ sur différentes sources de composés séléniés
Figure imgf000012_0001
Pour la souche Ethanol Red , l'ajout de sélénium a permis une augmentation de la production d'éthanol à 24h ou à 48h allant de 2,7% à 15,2% par rapport à la culture témoin ne comprenant pas de composé sélénié.
1 .2 Souche Saflager S-23 de Saccharomyces cerevisiae
Concernant la souche Saccharomyces cerevisiae Saflager S-23, les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau 3 suivant.
Tableau 3 : Production d'éthanol (EtOH, en g/L) de la souche Saflager S-23 en mini-réacteur de 200 ml_ sur différentes sources de composés séléniés
Figure imgf000012_0002
Pour la souche Saflager S-23 l'ajout de sélénium a permis d'obtenir un gain de production d'éthanol à 24h allant de 1 % à plus de 50% par rapport à la culture témoin ne comprenant pas de composé sélénié.
1 .3 Souche Diamond Laqer de Saccharomyces pastorianus Concernant la souche Saccharomyces pastorianus Diamond Lager, les résultats obtenus sont montrés dans le Tableau 4 suivant. Tableau 4 : Production d'éthanol (EtOH, g/L) de la souche Diamond Lager en mini-réacteur de 200 ml_ sur différentes sources de composés séléniés
Figure imgf000013_0001
Pour la souche Diamond Lager, l'ajout de sélénium a permis d'obtenir un gain de production d'éthanol à 72h ou à 96h allant de 5% à 16% par rapport à la 5 culture témoin ne comprenant pas de composé sélénié.
A la suite de ces tests en mini-réacteur de 200 ml_, la meilleure source de composé sélénié, c'est-à-dire celle permettant d'obtenir la plus forte augmentation de production d'éthanol (à savoir le HMSeBA), a été sélectionnée. Cette source a été étudiée en réacteurs de 5L avec différents o modes opératoires, tels que le batch et le fed-batch.
2. Caractérisation de la production d'éthanol en batch de 5L
La caractérisation de la production d'éthanol s'est poursuivie en batch de 5L afin de valider l'effet du sélénium sur l'augmentation de la production d'éthanol à plus grande échelle. Une seule source de composé sélénié a été testée 5 (à savoir le HMSeBA) pour valider le mode batch en 5 L.
Un réacteur de 5L (Labfors Infors HT) contenant 4L de milieu de fermentation (Cf. Tableau 1 ) a été stérilisé à 121 °C pendant 15 min et il lui a été ajouté la source de composé sélénié (à savoir HMSeBA) à 2 mg Se/L. Un réacteur témoin (sans sélénium mais toutes conditions égales par ailleurs) a également 0 été préparé pour chaque fermentation. Les réacteurs ont été régulés à 30 °C grâce à une double enveloppe, et le pH a été suivi par un capteur de pH lié directement au logiciel de suivi de fermentation (Iris V5). L'agitation a été maintenue à 300 rpm tout au long de la culture tandis qu'aucun approvisionnement en air n'a été réalisé afin de fixer des conditions 5 anaérobiques nécessaires à la fermentation alcoolique. Aucune pression de couverture n'a été imposée pendant la fermentation. La culture a été démarrée par un transfert stérile de 500 mL de pré-culture vers le réacteur afin d'obtenir un volume de travail de 4,5L. 3 à 4 échantillons de moût de fermentation ont été prélevés par durée de 24 heures, ce qui a permis de réaliser un suivi de la croissance cellulaire et de la consommation en sucres fermentescibles.
2.1 Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red )
Les résultats obtenus sont montrés dans le Tableau 5 suivant :
Tableau 5 : Production d'éthanol (EtOH, en g/L) par la souche Ethanol Red® en batch de 5L sur HMSeBA à 2 mgSe/L de composition
Figure imgf000014_0001
Pour la souche Ethanol Red , l'ajout de Sélénium a permis une augmentation de la production d'éthanol de 16,53% à 24h, ce qui est très important.
2.2 Saccharomyces cerevisiae (Saqflaqer S-23) Les résultats obtenus sont montrés dans le Tableau 6 suivant :
Tableau 6 : Production d'éthanol par la souche Sagflager S-23 (EtOH, en g/L) en batch de 5L sur HMSeBA à 2 mgSe/L de composition
Figure imgf000014_0002
Pour la souche Sagflager S-23, l'ajout de Sélénium a permis une augmentation de la production d'éthanol de 42,5% à 30h, ce qui est considérable.
3. Caractérisation de la production d'éthanol en fed-batch de 5L
La caractérisation de la production d'éthanol a été poursuivie en fed-batch de 5L afin de valider l'effet du sélénium sur l'augmentation de la production d'éthanol. Une seule source de composé sélénié a été testée (le HMSeBA) pour valider le mode fed-batch en 5 L. La culture a été démarrée comme indiqué précédemment pour le réacteur de culture en batch, dans un réacteur de 5L. A la différence de la culture en batch, le volume de travail au démarrage a été fixé à 3L. Lorsque la concentration en sucres fermentescibles a atteint environ 40 g/L, un sirop à 700 g/L de sucres fermentescibles a été ajouté de façon stérile afin d'obtenir une concentration de 120 g/L de sucres fermentescibles dans le moût de fermentation.
La culture a été poursuivie jusqu'au volume maximal utilisable (5L) du réacteur.
3.1 Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red®)
La souche Ethanol Red® a également été caractérisée en fed-batch de 5L en utilisant le HMSeBA comme source de composé sélénié.
Les résultats obtenus sont montrés dans le Tableau 7 suivant :
Tableau 7 : Production d'éthanol par la souche Ethanol Red®en batch de 5L sur HMSeBA à 2 mgSe/L de composition
Figure imgf000015_0001
Cette mesure a confirmé les résultats obtenus à petite échelle (mini-réacteur de 200 mL) et à plus grande échelle (réacteur de 5L en culture batch), puisque l'ajout de sélénium a permis une augmentation de la production d'éthanol de 10,9 % à 23 heures et de 34,2 % à 30 heures, ce qui est considérable.

Claims
REVENDICATIONS
Utilisation d'au moins un composé sélénié pour augmenter la teneur en éthanol d'une composition, ladite utilisation comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique de ladite composition, ladite étape de fermentation alcoolique étant réalisée :
- en présence dudit composé sélénié présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 0,
5 et 10 mg/L;
- pendant une durée comprise dans un intervalle de 6h à 96h ; et
- en présence d'au moins un ferment microorganique.
Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle le composé sélénié est choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique ou un de ses sels, le sélénite, l'acide sélénique, le sélénate, la sélénocystéine, la sélénométhionine la sélénocystathionine, la sélénohomocystéine et la séléno-adénosylsélénométhionine.
Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle le composé sélénié est choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutyrique ou un de ses sels, la sélénocystéine et la sélénométhionine.
Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le ferment microorganique est une levure choisie parmi l'espèce Kloeckera apiculata, les espèces du genre Candida et les espèces du genre Saccharomyces.
Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle le ferment microorganique est une levure choisie parmi les espèces Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces exiguus et Saccharomyces uvarum.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le ferment microorganique est un microorganisme modifié génétiquement pour produire de l'éthanol.
Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le composé sélénié est présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 1 et 8 mg/L.
Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle l'étape de fermentation alcoolique est réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose, le sucrose et leurs mélanges.
Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'étape de fermentation alcoolique est réalisée :
- à température comprise dans un intervalle de 10 à 35 °C ;
- en milieu essentiellement anaérobique ; et
- en présence d'azote assimilable.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle la composition est choisie parmi les compositions issues d'au moins un élément choisi dans le groupe formé par le blé, l'orge, l'avoine, le maïs, le riz, le seigle, la betterave, la canne à sucre, les déchets de palme, le raisin, la pomme.
1 1 . Procédé de fermentation alcoolique d'une composition, ledit procédé comprenant au moins une étape de fermentation alcoolique de ladite composition, ladite étape de fermentation alcoolique étant réalisée :
- en présence d'au moins un composé sélénié choisi dans le groupe formé par l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique ou un de ses sels et la sélénocystéine, et présent dans la composition à une concentration telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 0,5 et 10 mg/L ;
- pendant une durée comprise dans un intervalle de 6h à 96h ; et
- en présence d'au moins un ferment microorganique.
12. Procédé de fermentation alcoolique selon la revendication 1 1 , dans laquelle l'étape de fermentation alcoolique est réalisée en présence d'au moins un glucide choisi dans le groupe formé par le glucose, le fructose, le saccharose, le maltose, le sucrose et leurs mélanges.
13. Procédé de fermentation alcoolique l'une des revendications 1 1 ou 12, tel que le ferment microorganique est une levure choisie parmi l'espèce Kloeckera apiculata, les espèces du genre Candida et les espèces du genre Saccharomyces, de préférence choisie parmi les espèces Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces pastorianus et Saccharomyces uvarum.
14. Procédé de fermentation alcoolique selon l'une des revendications 1 1 à 13, tel que la concentration du composé sélénié est telle que la concentration du sélénium dans cette composition est comprise entre 1 et 8 mg/L.
15. Procédé de fermentation alcoolique selon l'une des revendications 1 1 à 14, tel que la composition est choisie parmi les compositions issues d'au moins un élément choisi dans le groupe formé par le blé, l'orge, l'avoine, le maïs, le riz, le seigle, la betterave, la canne à sucre, les déchets de palme, le raisin et la pomme.
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VALERIA MAPELLI ET AL: "The interplay between sulphur and selenium metabolism influences the intracellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae", FEMS YEAST RESEARCH, vol. 12, no. 1, 21 October 2011 (2011-10-21), GB, NL, pages 20 - 32, XP055348696, ISSN: 1567-1356, DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00757.x *

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