KR970002248B1 - 유기 게르마늄을 함유하는 효모 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Description

유기 게르마늄을 함유하는 효모 및 그의 제조방법

제1도는 본 발명에 따른 배양배지들에서의 효모의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.

제2도는 효모 균체 내로 유입된 무기 게르마늄의 유기태 전환을 확인하기 위하여 본 발명에 따른 효모 용액과 무기 게르마늄의 투석결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 유기 게르마늄을 함유하는 효모 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 게르마늄 첨가 조건 하에서 활성화시킨 효모를 배양하는 과정에서 게르마늄을 첨가하므로써 효모 세포 내로 게르마늄 이온의 대량 유입을 유도하여 효모 세포 내 구성성분과 결합된 형태의 유기 게르마늄을 다량 함유하는 효모 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

유기 게르마늄(Germanium, Ge)이란 무기물 상태의 게르마늄 이온이 아미노산 또는 유기산 등의 유기 화합물과 화학적으로 결합된 상태를 일컫는다. 이 유기 게르마늄은 인삼, 영지, 명일엽 등에 다향 함유되어 있으며, 암, 고혈압, 당뇨병, 심장질환, 토행성 질환, 류마티스 관절염 등의 성인병 치료와 완화 및 예방에 탁월한 효과가 있으며 면역증강 작용도 있는 것으로 알려져 있어서, 미국, 일본 등의 선진국에서는 유기 게르마늄을 이용해 암, 심장질환 등의 난치병을 치료 하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.(Int J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med., 42(6), 653-9(1982); Antic ancer Res., 5(5), 479-483(1985)).

이러한 유기 게르마늄을 얻는 방법으로는 천연물인 인삼, 영지 등으로부터 추출하는 방법과 촉매에 의해 유기산과 이산화게르마늄의 반응을 유도해 화학적으로 합성하는 방법이 있으나, 전자는 비용이 과다하게 소모되고 후자는 안전성이 확립되지 않아 식품 또는 약품으로의 사용이 제한되어져 왔다.

효모는 예로부터 양조, 제빵 등에 중요하게 이용되어 온 미생물로 수천년 동안 인류의 식생활에 영향을 미쳐왔을 뿐만 아니라, 그 자체로도 훌륭한 영양공급원으로, 단백질, 비타민, 미네랄 등이 이상적으로 고루 함유된 저지방, 고단백을 특징으로 하는 차세대 단백질 공급원인 단일세포 단백질로 각광받고 있으며 단일식품으로는 최고의 비타민 B군 공급원이고 생체 내의 대사활동에 중요한 역할을 담당하는 효소를 다량 함유하고 있어 건강보조식품으로 애용되고 있다.

미국 특허 제4,530,846호는 식용효모의 배양배지에 셀레늄을 첨가, 배양하여 유기 셀레늄을 제조하는 방법을 기재하였고, 일본 공개특허 소53-130483호는 게르마늄을 함유하는 효모류 및 그의 제조방법을 기재하고 있으나, 이 방법은 효모의 활성화 과정이 없이 단순히 무기 게르마늄을 첨가한 배지에서 효모를 배양하는 방법이므로 일반적으로 만족할 만한 양의 유기 게르마늄을 얻을 수 없다.

이에, 본 발명자들은 저렴한 비용으로 안전한 유기 게르마늄을 대량으로 제조할 수 있는 방법을 얻기 위해 연구한 결과, 양질의 영양공급원인 식용효모를 이용한 유기 게르마늄의 대량 제조방법을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에서는 게르마늄공급에 의한 갑작스러운 게르마늄의 농도 변화에 따른 효모 생옥 상의 피해를 최소화하여 효모 균체 내로 다량의 게르마늄을 유입시키기 위해 효모를 고농도의 게르마늄 첨가 조건 하에 활성화시키고, 활성화된 효모의 생장대수기에 게르마늄 및 영양원인 글루코스를 함께 공급하므로써 균체내로 다량의 게르마늄 유입을 유도하였다. 또한, 균체 생산량을 극대화하기 위해 배지조성을 새로 결정하므로써 종래의 방법보다 훨씬 개선된 효율로 효모로부터 유기 게르마늄을 생산할 수 있는 방법을 제공하게 된 것이다.

본 발명의 목적은 다량의 유기 게르마늄을 함유하는 효모 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 고농도의 게르마늄 첨가 조건 하에서도 생유가능한 활성화된 효모화 활성화된 효모의 배양배지를 제공하는 것이다.

본 발명은 유기 게르마늄이 수요에 비하여 그 공급량이 태부족이어서 상대적으로 희소하고 고가인 현실때문에 유기 게르마늄으로부터 얻고자 하는 효과를 충분히 얻지 못하였던 종래의 문제점들을 본 발명의 방법에 의하여 다량의 유기 게르마늄을 저렴한 비용으로 공급하여 해결하므로써 국민의 건강생활에 크게 이바지하게 될 것으로 기대된다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은,

(1) 탈지대두단백, 효모 추출물, 글루코스 및 물로 이루어진 기본 배지에 효모균주에 대하여 게르마늄 6 내지 10중량%를 첨가한 후, 효모를 배양하는 단계;

(2) 기본 배지에 상기 단계 (1)에서 보다 증가된 양의 게르마늄을 첨가시킨 후, 이 배지에서 상기 단계(1)에서 배양된 효모 균주를 배양하는 단계;

(3) 상기 단계 (1)과 (2)를 수회 반복 실시한 후 효모를 선별하는 단계;

(4) 상기 단계 (3)에서 선별된 효모를 기본 배지에서 증식시킨 후, 효모의 생장대수기에 게르마늄 및 글루코스를 첨가하여 배양하는 것으로 이루어진 다량의 유기 게르마늄을 함유하는 효모의 제조방법인 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

일반적으로 고농도의 미네랄이 존재하는 환경에서는 미생물의 생장이 제한을 받는다. 본 발명에서는 다양한 미생물에 대하여 유기 게르마늄을 함유하는 균주로의 이용가능성을 검토하고, 여러가지의 필수 원소를 포함하여 항종양제로써 그 세포 내 성분을 이용할 수 있는 효모를 선택하게 되었다.

선택된 효모 균주에 대하여 게르마늄 이온의 배지 내 농도가 효모의 생장에 미치는 영향을 알기 위해 다양한 농도에서 배양하여 본 결과, 통상의 효모는 효모 균체에 대하여 8중량%, 예를들면 100ppm의 게르마늄이 함유된 배지에서는 그 운동성이 저하되고 생장도 저해되는 것이 관찰되었다.

본 발명에서는 이를 극복하기 위해 효모를 게르마늄이 효모 균체에 대하여 300 내지 500중량%가 함유된 배지에서도 생장이 가능하도록 활성화하여 생물학적인 증식 및 활동이 활발한 고농도 게르마늄 첨가 조건 하에서도 생육가능한 효로를 선별하고, 이를 종균으로 사용하였다. 활성화에 사용된 쥰주는 Saccharomyces cerevisiae였고, 이효모를 활성화시키기 위해서 배지 상이 게르마늄 함량을 점차 높이는 교대 배양방법이 사용되었다. 높은 수율의 제조를 위해서는 대량의 균체가 생산되어야 하고 균체당 유입되는 게르마늄의 양이 많아야 한다. 따라서, 균체가 가장 많이 생산되는 배지조성이 요구되어 이를 실험하여 전체 배지 조성물의 중량에 대하여 탈지대두단백 4.2 내지 5.2%, 효모 추출물 0.5 내지 0.7%, 글루코스 6.5 내지 7.5%를 함유하는 배지를 고농도의 유기 게르마늄을 효모로 유입하기 위한 기본배지로 사용하였다.

상기한 기본 배지에 활성화된 효모를 첨가하고 활성화된 효모의 생장대수기에 전체 배지 조성물에 대하여 게르마늄 0.01 내지 0.1 중량 % 및 양양원으로써 글루코스 5 내지 7중량%를 첨가하므로 활성화된 효모 균주내로 다량의 유기 게르마늄이 유입되도록 하였다.

효모에 유입된 게르마늄을 정량하기 위하여는 페닐플루오론을 게르마늄과 반응시켜 착물을 형성하고 이를 505mm에서 흡광도를 측정하는 분광분석법을 이용하였다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 효모 내로 유입된 게르마늄이 유기 게르만늄을 형태로 존재하는지를 확인하기 위하여 본 발명의 방법에 따른 효모 용액과 무기 게르마늄 용액을 동일한 조건 하에 투석하였다. 각각의 투석액의 게르마늄을 정량한 결과, 제2도에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 효모 용액에서의 게르마늄은 시간의 경과에도 일정량을 유지한 반면, 무기 게르마늄의 정량곡선은 급강하하였다. 즉, 무기 게르마늄은 그 분자가 매우 미세하여 쉽게 투석막을 통과하므로 정략곡선이 급강하하였으나 효모 용액에 함유된 단백질 등의 거대분자와 결합한 형태의 유기 게르마늄은 투석막을 통과하기가 어려워서 그 정량곡선이 시간의 경과에도 불구하고 크게 떨어지지 않은 것이다.

본 발명에 따른 유기 게르마늄을 함유하는 효모를 상기 분석법에 따라 실험한 결과, 인삼의 10배, 영지의 5배에 달하는 유기 게르마늄이 정량되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

균체의 대량 생산을 위한 최적 배지조건 결정

단백질원으로 육즙, 콘-스팁액(CLS), 맥아 추출물, 펩톤, 폴리펩톤, 트리펩톤, 소이톤, 효모 추출물, 탈지대두단백, 밀크 카제인을 전체 배지 조성물에 대하여 각 1중량 %씩을 함유하고, 탄수화물원으로 글루코스, 락토스, 슈크로스를 각각 1중량%씩 함유한 배지 100ml에 효모 1v/v%를 첨가하여 28℃에서 170rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 표 1에 기재한 바와 같이 탈지대두단배과 글루코스가 함유된 배지에서 가장 많은 양의 균이 생산되었다.

탄수화물원 및 단백질원에 따른 효모의 생장량(mg/ml, 젖은 상태)

[실시예 2]

영양소의 최적 농도 비율 결정

균체 생산이 가장 우수하였던 탈지대두단백과 글루코스, 균체 생산을 위해 필요한 필수 미량 원소가 함유되어 있는 효소 추출물을 다음 표 2와 같이 변화시킨 배지 100ml에 효모 1v/v%를 접종하여 28℃, 170rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 표 2에 기재한 바와 같이 글루코스 1.0중량%, 탈지대두단백 0.8중량%, 효모 추출물 0.1중량% 및 물을 함유하는 배지에서 가장 많은 양의 균체 생산이 이루어졌으며, 이 배지를 SY배지로 명명하였다.

[실시예 3]

균체의 대량 생산을 위한 배지의 농축 정도의 결정

균체 생산의 수율을 극대화하고 균체내 게르마늄의 함량을 높일 수 있는 배지 조성을 찾기 위하여 실시예 2에서 결정된 SY 배지의 농도를 다음 표3과 같이 변화시킨 배지에 효모를 접종하여 28℃, 170rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 그 결과, 표 3에 기재한 바와 같이 균체 생산 수율이 가장 좋은 배지는 6배농축 배지였으며 전체 배지 조성물에 대하여 탈지대두단백 4.8중량%, 효모 추출물 0.6중량%, 글루코스 6.0중량% 및 물을 함유하였고, 이를 SY-6 배지로 명명하였다.

그 생장곡선을 제1도에 나타내었다.

[실시예 4]

게르마늄 함유 배지 적응 효모 균주의 선별

게르마늄 100ppm을 첨가한 SY-6배지에서 효모를 증식시킨 후 100ppm씩 게르마늄의 양을 점진적으로 증가시키는 방법으로 활성화하였다. 그 결과 5,000ppm의 게르마늄이 함유된 배지에서 생물학적인 증식 및 활동이 활발한 활성화된 효모 균주를 선별하였다.

활성화된 효모와 비활성화된 효모를 5,000ppm의 게르마늄 첨가 배지에서 배양하여 비교한 실험에서 활성화된 효모가 매끄러운 타원형의 정상 상태를 유지하는 반면, 비활성화된 효모는 모양이 일정하지 않았으며 균체 표면이 거친 비정상상태를 나타내었다.

비교결과를 다음 표 4에 기재하였다.

[실시예 5]

게르마늄의 정량을 위한 표준화

게르마늄 표준용액(Aldrich, 10,000㎍/ℓ)을 0 내지 10.000㎍/ℓ의 용액으로 희석하였다. 각 용액 1ml 씩을 취하여 6N 염산 0.43ml를 함유하는 에탄올 100ml에 용해된 페닐플루오론 0.04% 용액과 착물을 형성시켰다. 이 용액에 안정제로 아라비아 고무 2×10^-30%를, 흡광도 증폭을 위해 암모늄 브로마이드 2×10^-4%를 첨가하고 20분간 방치한 후, 클로로포름과 에탄올의 3 : 2 혼합용매를 첨가하였다. 이 용액을 5분간 강하게 진탕한 후 분리된 유기용매층을 석영 셀에 옮기고 505㎚에서 흡광도를 측정하였다.

얻어진 결과를 표준 정량곡선으로 사용하였다.

[실시예 6]

활성화된 효모에 대한 게르마늄 첨가 효과 비교

활성화된 효모를 취하여 2개의 배양기로 분리하였다. 분리된 각각의 효모를 본 발명에 따른 SY-6배지에서 9시간 동안 배양하였다. 2개의 활성 효모 중 하나의 배지에만 효모의대수기에 100ppm의 게르마늄과 6% 글루코스를 첨가하여 다시 15시간을 더 배양하였다.

배양액을 원심분리하고 얻어진 침전물을 0.85% 농도의 생리식염수로 3회, 증류수로 3회 세척하여 효모 균체 표면에 잔류하는 게르마늄 이온을 완전히 제거하였다.

상기 효모 균체를 완전히 파쇄하여 실시예 5의 방법에 따라 505nm에서 게르마늄 농도를 결정하였다.

그 결과, 게르마늄을 첨가한 배지에서 배양된 활성 효모에서는 1,580㎍/g (ppm ), 게르마늄을 첨가하지 않은 배지에서 배양된 활성 효모에서는 147㎍/g (ppm)의 게르마늄이 정량되어 상기 결과로부터 활성화된 효모에 게르마늄을 첨가하므로써 얻어지는 활성화된 효모로의 게르마늄 대량 유입 효과를 확인할 수 있었다.

[실시예 7]

활성화된 효모 균체 내로 유입된 무기 게르마늄의 유기태 전환 확인

상기 실시예 6에서 얻어진 유기 게르마늄을 함유하는 효모를 완전히 파쇄하여 함유된 게르마늄의 초기량을 실시에 5의 방법에 따라 정량하고 이 파쇄된 효모 용액 20ml를 취하여 투석 튜브에 담았다. 한편, 산화게르마늄 0.01M 용액을 실시예 5의 방법에 따라 게르마늄 초기량을 정량하고 이 용액 20ml를 취하여 투석 튜브에 담았다. 상기한 2개의 투석튜브를 각각 투석용액 500ml를 함유하는 1ℓ 플라스크 중에서 투석하였다. 이 때, 투석용액으로는 증류수를 사용하였고 매 6시간마다 투석용액을 교환하였다. 매 3시간 마다 각각의 투석튜브로부터 시료 1ml를 취하여 실시예 5의 방법에 따라 게르마늄을 정량하였다.

그 결과를 표 6 및 제2도에 나타내었다. 이 결과들에 따르면 효모용액의 게르마늄 함량의 감소폭이 무기 게르마늄인 산화게르마늄보다 작은데, 즉 효모 세포 내의 게르마늄은 투석막을 통과할 수 없는 거대분자인 유기물과 결합된 형태임을 알 수 있다.

[실시예 8]

연속배양법에 의한 활성 효모 및 일반 효모의 배양

활성화된 효모 및 일반 효모 1v/v%를 SY-6 배지 100ml에 접종하고 공기흡입량을 1vvm으로 하여 28℃, 400rpm의 조건 하에서 배양하였다. 배양 9시간 후, 게르마늄 100ppm과 전체 배지에 대하여 글루코스 5 내지 7중량%를 첨가하고, 다시 15시간 배양하였다. 증식된 각각의 효모 균주에 SY-6 배지액을 연속적으로 공급하고, 아울러 동일한 속도로 게르마늄 및 글루코스를 첨가하는 고농도 연속 배양방식으로 게르마늄 함유 효모를 제조하였다.

그 결과를 다음 표 7에 나타내었다.

상기 결과로부터 활성화된 효모가 일반 효모보다 게르마늄 첨가 조건하에서의 생장력이 월등히 우수하고 게르마늄의 유입량도 높은 것을 알 수 있다.

[실시예 9]

게르마늄 함유 식물과의 게르마늄 함량 비교

영지버섯과 6년근 인삼 각각 10g을 취하여 이를 분쇄하였다. 각각의 분말을 100ml의 증류수에 첨가하여 80℃로 8시간 동안 물중탕하고 유기 게르마늄을 추출하여 실시예 5와 동일한 방법으로 게르마늄을 정량하였다.

그 결과를 표 8에 기재하였다.

Claims (3)

1. (1) 탈재대두단백, 효모 추출물, 글루코스 및 물로 이루어지는 기본 배지에 효모균주에 대하여 게르마늄 6내지 10중량%를 첨가한 후, 효모를 배양하는 단계; (2) 기본 배지에 상기 단계(1)에서 보다 증가된 양의 게르마늄을 첨가시킨 후, 이 배지에서 상기 단계(1)에서 배양된 효모 균주를 배양하는 단계; (3) 상기 단계(1)과 (2)를 수회 반복 실시한 후 효모를 선별하는 단계; (4) 상기 단계(3)에서 선별된 효모를 기본 배지에서 증식시킨 후, 효모의 생장대수기에 게르마늄 및 글루코스를 첨가하여 배양하는 것으로 이루어진 다량의 유기 게르마늄을 함유하는 효모의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 기본 배지는 탈지대두단백 4.2 내지 5.2%, 효모 추출물 0.5 내지 0.7%, 글루코스 6.5 내지 중량 7.5%와 나머지 물로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 다량의 유기 게르마늄을 함유하는 효모의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 효모의 생장대수기에 전체 배지 조성물에 대하여 게르마늄 0.01 내지 0.1 중량%, 글루코스스눈 5내지 7중량%를 첨가하는 것임을 특징으로 하는 다량의 유게 게르마늄을 함유하는 효모의 제조방법.