CN104975051B - 一种富集桑叶中gaba的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种富集桑叶中GABA的方法，是将灵芝菌经PDA平板培养基活化后，转接到PDA液体培养基中培养至菌种开始长出菌球，用作发酵种子；按照1体积％‑3体积％的接种量将培养出来的菌种接种于桑叶培养基中，经过震荡、恒温发酵，得到高GABA含量的桑叶灵芝菌发酵液。所述的桑叶培养基包括1质量％‑5质量％桑叶粉，0.1‑0.5mg/100mL氯化钙,pH为6‑8的PDA液体培养基。本发明操作简便、产量高、无污染、易于分离纯化。所得高GABA含量的桑叶发酵液可以进一步开发成功能食品，兼具防治老年疾病和精神疾病的药理学功能，具有较高的应用价值。

Description

一种富集桑叶中GABA的方法

技术领域

本发明属于发酵工程和食品功能成分生产工艺领域，具体涉及一种提高桑叶中的GABA含量的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸(简称GABA，又名氨酪酸)，是一种非蛋白质的功能性氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能：有调节血压与心率、营养神经细胞、治疗癫痫、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、促进生长激素分泌、辅助治疗哮喘、活化肝肾功能、预防肥胖、促进乙醇代谢、改善初老期精神障碍和更年期综合症等多种功效。国家卫生部于2009年9月27号正式发文将GABA列为新资源食品。作为一种具有多种生理功能的生物活性功能因子，GABA是绿色食品和有机食品的理想的功能因子，也是十分理想的防治老年疾病和精神疾病的保健食品及药品。当人体缺乏GABA时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪，一般长久处于高压力族群如身处竞争环境中的人群、运动员、上班族等，都很容易缺乏GABA，需要及时补充以便舒缓情绪。随着人类年龄增长及生活压力的加剧，人体积累GABA日益困难，自身合成的GABA含量已不能满足身体需求，日常饮食中GABA含量较少，人体需额外补充GABA。一般来说，人体每天摄入30～50mg纯天然GABA就能起到十分理想的保健作用。

GABA在美国、日本等国家已广泛用于营养补充剂和功能食品中，1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本实现了商业化。日本科学家利用茶叶、米胚芽等原料开发制造出富含GABA的功能食品配料，并将其应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。有报道显示，应用生物技术制造的高浓度GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。而我国在这方面的研究尚处于起步阶段，亟待发展和提高。

GABA广泛存在于自然界中，但天然食材中GABA的含量极少，高等植物组织中GABA的含量通常为0.13～32.15μmol/g，对于需要改善健康的人群来说远远不够。例如，GABA需要达到26mg/天的摄入量，才能用于改善更年期障碍。因此，要让人们能够摄取足够的GABA来预防疾病、增进健康，必须要研究出能够简单、快速和低成本的方法生产出高GABA含量的食品。

目前，GABA的生产方法有化学合成法、微生物发酵法和富集法等。化学合成法的反应较快，但是有害成分易残留，因此化学合成法制备的GABA不能用于食品。微生物发酵法，是医学界和食品科学界关注的热点之一，所得GABA含量较高，可安全用于食品，是利用微生物生产的谷氨酸脱羧酶(GAD)将底物谷氨酸或谷氨酸钠转化成GABA。富集法的原理与微生物发酵法类似。目前，高效、安全的GABA富集及提取方法，能够让消费者没有了后顾之忧，将会促进GABA在新型食品领域更好地发展。

公开号为CN1939144A的专利申请文件公开了一种将稻谷先制成糙米，再进行发芽处理，再进行富集加工的方法，使γ-氨基丁酸含量达到500-900mg/100g甚至更高。日本专利特開2004-159617公开了富含GABA发芽糙米的制造方法及利用发芽糙米的食品，将糙米在35～45℃水中浸泡0.5～2h后，取出后在35～45℃条件下保持1～8h使其发芽，8h以内的发芽时间可以避免12h发芽出现的微生物繁殖问题，富集前糙米胚芽的GABA含量为25～50mg/100g，富集后GABA大约提高到300～400mg/100g。公开号为CN100577031C的专利申请文件公开了一种通过浸泡、冷冻和解冻过程增加大豆中γ-氨基丁酸含量的方法，γ-氨基丁酸含量最高为1.9144mg/g-干物大豆。日本专利特開2006-345708公开了发芽大豆粉及其制造方法，在27～42℃水中浸泡24h，使大豆发芽，在此发芽过程中大豆中GABA含量从0增加到142mg/100g。公开号为CN100478447C的专利申请文件公开了一种以米糠为原料制备高浓度γ-氨基丁酸粉的方法，以米糠为原料，添加谷氨酸、氯化钙和磷酸吡哆醛，反应温度40℃，pH5.6，6～8h的条件下得到富含γ-氨基丁酸的反应液，然后经过离心分离、超滤、浓缩和喷雾干燥后，得到含量为50％的GABA粉。公开号为CN101294155A的专利申请文件公开了一种米糠中谷氨酸脱羧酶的酶激活方法，通过添加谷氨酸(Glu)、谷氨酸钠(Glu-Na)、氯化钙、磷酸吡哆醛(PLP)、VB6，利用磷酸缓冲液或抗坏血酸或乳酸调节pH，在一定温度下激活谷氨酸脱羧酶，得到富含GABA的反应液。公开号为CN1840672A的专利申请文件公开了一种将谷氨酸加入到南瓜中并通过南瓜中固有的酶转化为γ-氨基丁酸的方法，采用未经盐渍保藏处理的南瓜，优选收获后在8～12℃下低温处理7～14天的南瓜来生产南瓜加工品，可得到含有10％～20％γ-氨基丁酸的南瓜加工品。以上这些国内外采用生物富集法对γ-氨基丁酸的研究，原料大多集中在糙米、果品、蔬菜、茶叶、豆类等食品原料，其中以糙米发芽富集γ-氨基丁酸研究最多。国内外鲜有学者采用桑叶富集γ-氨基丁酸。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用灵芝菌发酵富集桑叶GABA的方法，以桑叶为特征发酵底物，通过液态发酵的方式使灵芝菌丝体在桑叶液体培养基内生长，得到富含GABA和灵芝菌丝体营养的发酵液。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种富集桑叶中GABA的方法，包括如下步骤：

(1)、灵芝菌液体发酵菌种的制备：将PDA斜面保藏的灵芝菌经活化培养后，接入PDA液体培养基中，培养至菌种开始长出菌球。

(2)、桑叶发酵培养基的配制：取PDA液体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，按1％-5％的质量百分比加入桑叶粉，再加入体积百分比为0.1-0.5(mg/100mL)的氯化钙，混匀后调节pH至6.0-8.0之间，121℃灭菌20min；

其中桑叶粉的获得方式是：选取新鲜、完整的桑叶叶片，用蒸馏水清洗叶片，烘干后用粉碎机粉碎或者研钵研磨，过40-200目筛即得所需桑叶粉。

(3)、发酵：将步骤(1)得到的对数生长期的灵芝菌液体发酵菌种以1.0体积％-3.0体积％的接种量接种于步骤(2)的桑叶发酵培养基中，15-35℃振荡培养50h～100h，在22～30℃的恒温箱内下发酵，持续发酵5～10天，每隔24小时测定发酵液的GABA含量，每个样本重复测定3次；得到高GABA含量的桑叶灵芝菌发酵液，可以进一步加工成各种功能食品，使人们可以安全、方便地食用和消化吸收桑叶和灵芝的营养成分，同时，解决生物富集GABA生产工艺复杂、成本高的问题。

(4)、在发酵时，采用28kHz超声波，功率90-150W，处理发酵液5-60分钟/天，能更有效地提高发酵液中的GABA含量。

有益效果：

(1)本发明采用桑叶为原料富集γ-氨基丁酸，桑叶与谷类的生长环境、组成成分、应用范围等存在明显差异，桑叶中GABA的含量较谷类高，能达到226mg/100g，富集之后含量更高。而且桑叶营养丰富，含有多种维生素及矿物质、氨基酸、碳水化合物和植物纤维，开展桑叶在食品领域的研究，促进了桑叶食品的多样化和桑树产业结构的多元化发展，促进了以食用价值为导向的蚕桑资源更好地发展。

(2)本发明通过灵芝菌发酵含桑叶的液体培养基，未使用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等菌种，克服了这些工程菌在安全性方面的问题，相比较未经灵芝菌发酵的培养液，采用灵芝发酵后，培养液的GABA含量最高提高4.17倍。

(4)经过灵芝菌发酵含桑叶的液体培养基，可以将灵芝菌与桑叶的药效有机结合起来，最终得到的桑叶灵芝发酵液除了富含GABA外，还含有多种营养成分和矿物质元素：麦角甾醇、灵芝菌溶菌酶及酸性蛋白酶、L-甘露醇、灵芝多糖和灵芝酸，其中灵芝多糖含量≥5g/100mL，具有提高机体免疫力等功效。

(5)经本申请发酵得到的是液态的发酵液，发酵液的桑叶灵芝菌丝体不像灵芝子实体和孢子，其木质化程度和几丁质含量都很低，菌丝体内各种营养能够很容易地被人体消化和吸收。

(6)通过采用28kHz超声波处理发酵液，进一步提高了GABA含量。

附图说明

图1是本申请的工艺流程图。

图2是GABA含量的标准曲线图，其中r²＝0.995。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

GABA含量的测定：采用改良比色法测量发酵液的GABA含量，在实验过程中加入AlCl₃可以去除桑叶提取液中的水溶性色素及杂质，去除对GABA含量测定的干扰，因为AlCl₃与水溶性色素结合形成不溶性络合物，经过离心之后可以去除。

(1)GABA标准曲线的绘制：

准确称取GABA标准样品0.050g，用蒸馏水溶解，定容至50mL，配制不同浓度的GABA标准溶液：分别取0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8mL前面配制的GABA标准溶液，并加入1.8、1.4、1.2、0.8、0.4、0mL的蒸馏水，配成不同浓度的标准液，而后，分别加入150μL 2mol/L的AlCl₃溶液，混匀后室温振荡15min，高速冷冻离心机11000r/min离心10min，取上清液0.5mL于离心管中，加入600μL 1mol/L的KOH溶液，室温振荡6min，11000r/min离心5min。然后，分别取上清液300μL入小试管中，加0.2mol/L pH10.0的硼酸盐缓冲液200μL，6％的重蒸酚100μL，混匀后再加入0.8mL 5％的NaClO溶液，充分混匀。然后，迅速放入沸水浴中加热11min，立即置冰浴中10min，待溶液出现蓝绿色后，加入3.0mL 50％酒精，于643nm波长处测定吸光值。以GABA含量为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制GABA标准曲线，标准曲线见附图2。

(2)桑叶中GABA含量的测定：

桑叶的预处理：选取新鲜、完整的桑叶叶片，用蒸馏水清洗叶片，50℃烘干5h；用粉碎机粉碎或者研钵研磨，经40-200目筛子筛后，得到本发明用桑叶粉。

桑叶中GABA含量的测定：称取2.5g桑叶粉加入装有10mL甲醇的50mL离心管中，室温振荡10min，然后在离心5000r/min，15min,弃上清液，将沉淀全部转移至干燥的滤纸上，置于烘箱里(50℃)烘干，待完全干燥后，将沉淀转移至120mL离心管中，加水25mL，放入恒温振荡器中，50℃条件下提取2h后，5000r/min离心15min，取上清液，定容至25mL，得到的提取液，置于3℃～5℃的低温条件下保存备用。测定提取液的吸光度，并将测定的吸光度代入标准曲线中，得到GABA的含量，根据GABA含量以及桑叶粉的取量，可以计算出未经发酵处理的桑叶GABA含量为：106.25mg/100g。

实施例1-8所采用的工艺参数或组份添加量见表1所示：

表1

Claims (2)

1.一种富集桑叶中GABA的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤（1）、灵芝菌液体发酵菌种的制备：将PDA斜面保藏的灵芝菌经活化培养后，接入PDA液体培养基中，培养至菌种开始长出菌球；

步骤（2）、桑叶发酵培养基配制：取PDA液体培养基，加入桑叶粉、氯化钙，混匀后，调节pH至6.0-8.0，灭菌，备用，桑叶粉的用量是PDA液体培养基的1质量%-5质量%，氯化钙的加入量是PDA液体培养基的百分比为0.1体积%-0.5体积%；

步骤（3）、发酵：将步骤（1）得到的对数生长期的灵芝菌液体发酵菌种接种于步骤（2）的桑叶发酵培养基中，15-35℃振荡培养 50h~100h，在22~30℃的恒温箱内下发酵，持续发酵5~10天，得到高GABA含量的桑叶灵芝菌发酵液；灵芝菌液体发酵菌种以 1.0体积%-3.0体积%的接种量接种于桑叶发酵培养基中；在发酵时对发酵液加载超声波，超声波的频率是28kHz、功率为90-150W，加载时间是5-60分钟/天。

2.根据权利要求1所述的富集桑叶中GABA的方法，其特征在于步骤（2）中其中桑叶粉的制备方法如下：选取新鲜、完整的桑叶叶片，用蒸馏水清洗，烘干后用粉碎机粉碎或者研钵研磨，过40-200目筛即得所需桑叶粉。