CN115637234A - 一种圆红酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种圆红酵母以及采用该诱变选育的圆红酵母发酵制备鲨鱼酸甘油酯的方法和应用，属于生物技术与食品工程领域。所述圆红酵母为经过多轮传统诱变选育的圆红酵母，采用所述圆红酵母制备鲨鱼酸甘油酯，所得产物鲨鱼酸甘油酯发酵效价高，产物中芥酸含量低，生物安全性高。所述方法的菌体需氧量少，菌体的生长速度快、代谢碳源速度快和鲨鱼酸甘油酯的产量高，有利于产业化生产。

Description

一种圆红酵母及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术与食品工程领域，涉及一种圆红酵母及其应用。

背景技术

鲨鱼酸，学名二十四碳-顺-15-烯酸，在动物大脑白质和外周神经组织中含量丰富，是脑苷脂和神经纤维髓鞘的主要组成成分，在脑苷脂总脂肪酸中占比高达40％，在维持神经系统正常功能方面的作用正受到越来越多的关注。有研究表明，鲨鱼酸是大脑发育和正常功能维持必须的一种营养元素。母乳中含有丰富的鲨鱼酸暗示鲨鱼酸可能在婴幼儿神经系统发育中扮演重要的角色。鲨鱼酸还因其神经保护和能量补充的双重功效在运动员营养强化方面有潜在的应用前景。除了保健作用外，鲨鱼酸在医药方面也显示了巨大的应用前景。有研究表明，鲨鱼酸可用于治疗多发性硬化症、精神分裂症、阿兹海默症、帕金森综合症等神经系统紊乱病症，还可以用于治疗一些遗传性的脂质代谢紊乱疾病如齐薇格综合征和肾上腺脑白质营养不良。

鲨鱼酸可由廉价的芥酸通过化学增碳合成。但化学合成的鲨鱼酸由于使用了大量的有毒试剂，有潜在的安全风险，不适用于食品领域的应用。

天然来源的鲨鱼酸具有较高的安全性。研究发现，多种植物、海洋鱼类、微藻、霉菌油脂含有鲨鱼酸，其中微藻，霉菌油脂鲨鱼酸含量较低，研究得较少。植物油为目前天然鲨鱼酸最主要的来源，其中蒜头果油鲨鱼酸含量最高，可达总脂肪酸的40％-60％。但蒜头果属于濒危植物，加上人工种植困难与生长缓慢等因素，产能极低，无法满足市场的需求。目前商业化的鲨鱼酸产品主要来源于元宝枫油，但元宝枫同样存在培育周期长，籽油产量不稳定等问题，使得其生产成本居高不下，限制了鲨鱼酸的大规模应用。更重要的是，元宝枫油中含有大量的芥酸，可能对心脏健康带来不利的影响。

微生物发酵生产鲨鱼酸不受季节与环境影响，且微生物生长代谢快，具有较高的时空生产率，是大规模生产鲨鱼酸的理想途径。但使用野生型菌株鲨鱼酸的发酵效价普遍较低，如霉菌Mortierella capitata RD000969仅可以产186.3mg/L鲨鱼酸；微藻Mychonastes afer HSO-3-1仅可以产61.56mg/L鲨鱼酸。使用基因工程菌株可以大幅提升鲨鱼酸的发酵效价，如王士安等报道以基因工程改造的解脂耶氏酵母可从葡萄糖发酵合成25.7g/L的鲨鱼酸，为目前微生物发酵生产鲨鱼酸的最高水平。但从生物安全性和消费者接受度的角度，使用非基因工程改造的自然株或经过传统诱变选育的突变株发酵生产鲨鱼酸在食品领域的应用更具优势。

因此，亟需一种鲨鱼酸或鲨鱼酸甘油酯产量高，芥酸含量低，且不使用基因工程改造菌株发酵的生产鲨鱼酸或鲨鱼酸甘油酯的方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明使用一种经过多轮传统诱变选育的圆红酵母，以及采用该诱变选育的圆红酵母发酵制备鲨鱼酸甘油酯的方法，所述方法的鲨鱼酸发酵效价高，产物中芥酸含量低，生物安全性高。

第一方面，本发明提供一种圆红酵母。

一种圆红酵母(拉丁名：Rhodotorula toruloides)，其于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 20221564。所述圆红酵母在本发明中可以代称为圆红酵母OMK-87(Rhodotorula toruloides OMK-87)。

第二方面，本发明提供第一方面所述圆红酵母的应用。

第一方面所述圆红酵母在制备鲨鱼酸或鲨鱼酸甘油酯中的应用。

第三方面，本发明提供一种制备鲨鱼酸甘油酯的方法。

一种制备鲨鱼酸甘油酯的方法，其包括：将权利要求1所述圆红酵母置于发酵培养基中发酵，得到鲨鱼酸甘油酯。

在一些实施例中，所述方法包括：将第一方面所述圆红酵母经扩大培养后，置于发酵培养基中发酵，得到鲨鱼酸甘油酯。

在一些实施例中，所述发酵培养基包括碳源、氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钙、硫酸钠、微量元素和维生素。

在一些实施例中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油中的至少一种，优选为葡萄糖。所述碳源包括葡萄糖，有利于降低菌体需氧量，有利于工业化发酵。

在一些实施例中，所述氮源包括硫酸铵、尿素、酵母膏、大豆蛋白胨中的至少一种，优选为硫酸铵。所述氮源包括硫酸铵，有利于提高产物产量和鲨鱼酸甘油酯发酵效价。

在一些实施例中，所述微量元素包括铁元素、硼元素、铜元素、锰元素、钼元素、锌元素中的至少一种。在一些实施例中，所述微量元素包括铁元素，采用铁元素有利于提高菌体的生长速度、代谢碳源速度和提高鲨鱼酸甘油酯的产量。在一些实施例中，所述微量元素包括铁元素、硼元素、铜元素、锰元素、钼元素和锌元素。

在一些实施例中，所述微量元素包括氯化铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌中的至少一种。在一些实施例中，所述微量元素包括氯化铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锰、钼酸钠和硫酸锌。

在一些实施例中，所述维生素包括生物素、泛酸或其盐、叶酸、肌醇、烟酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素中的至少一种。在一些实施例中，所述维生素包括生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素中的至少一种。在一些实施例中，所述维生素优选包括泛酸或其盐(如泛酸钙)，所述泛酸或其盐有利于提高菌体的生长速度、代谢碳源速度和提高鲨鱼酸甘油酯的产量。在一些实施例中，所述维生素包括生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素。

在一些实施例中，所述发酵培养基的pH为4.5-7.0。在一些实施例中，所述发酵培养基的pH为5.5-6.5。在一些实施例中，所述发酵培养基的pH优选为6.0。所述发酵培养基的pH为6.0有利于提高菌株生长代谢和鲨鱼酸甘油酯的产量。

在一些实施例中，所述发酵的发酵温度为25℃-30℃，优选为28℃。所述发酵的发酵温度为28℃有利于提高菌株生长代谢和鲨鱼酸甘油酯的产量。

在一些实施例中，以发酵培养基的总体积计算，所述发酵培养基包含硫酸铵15g/L-25g/L、葡萄糖30g/L-600g/L、磷酸二氢钾13g/L-22g/L、硫酸镁3g/L-8g/L、硫酸亚铁10mg/L-40mg/L、硫酸钙0.2g/L-2g/L、硫酸钠0.2g/L-2g/L、微量元素溶液0.5ml/L-3ml/L和维生素混合液0.5ml/L-3ml/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述微量元素溶液包含硼酸2.23g/L-5.67g/L、硫酸铜102.2mg/L-309.6mg/L、氯化铁1.22g/L-4.55g/L、硫酸锰0.32g/L-1.53g/L、钼酸钠0.95g/L-2.31g/L和硫酸锌1.23g/L-4.87g/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述维生素混合液包含生物素2.3mg/L-21.2mg/L、泛酸钙1.00g/L-40.56g/L、叶酸2.6mg/L-23.4mg/L、肌醇4.3g/L-23.1g/L、烟酸1.02g/L-3.56g/L、吡哆醇1.26g/L-3.78g/L、核黄素0.54g/L-3.45g/L和硫胺素0.66g/L-3.89g/L，以及溶剂，溶剂为水。

在一些实施例中，以发酵培养基的总体积计算，所述发酵培养基包含硫酸铵16g/L、葡萄糖300g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸镁4g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸钙0.5g/L、硫酸钠0.8g/L、微量元素溶液1ml/L和维生素混合液1ml/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述微量元素溶液包含硼酸3.89g/L、硫酸铜205.9mg/L、氯化铁3.22g/L、硫酸锰0.98g/L、钼酸钠1.86g/L和硫酸锌3.73g/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述维生素混合液包含生物素16.3mg/L、泛酸钙20.66g/L、叶酸16.3mg/L、肌醇18.3g/L、烟酸2.56g/L、吡哆醇2.56g/L、核黄素1.23g/L和硫胺素1.36g/L，以及溶剂，溶剂为水。

在一些实施例中，所述扩大培养包括采用固体斜面培养基培养和种子培养基培养。

在一些实施例中，所述发酵的发酵pH为2-8。在一些实施例中，所述发酵的发酵pH为4.5-7.0。在一些实施例中，所述发酵的发酵pH为5.5-6.5。在一些实施例中，所述发酵的发酵pH优选为6.0。

所述发酵pH采用氨水或NaOH水溶液进行控制。

在一些实施例中，所述发酵的温度为18℃-37℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为20℃-35℃。在一些实施例中，所述发酵的温度为25℃-30℃。在一些实施例中，所述发酵的温度优选为28℃。

在一些实施例中，所述发酵在溶解氧含量为5％-60％。在一些实施例中，所述发酵在溶解氧含量优选为15％-60％。

在一些实施例中，所述发酵过程还包括通入空气。

在一些实施例中，所述发酵的发酵通气比为1.0VVM-1.5VVM。

在一些实施例中，所述方法还包括在发酵过程中，溶解氧含量反弹上升后开始流加葡萄糖溶液。

在一些实施例中，所述葡萄糖溶液中葡萄糖的含量为30wt％-70wt％。

在一些实施例中，所述葡萄糖溶液的流加速度为200g/L发酵液/天。

在一些实施例中，所述发酵过程中还进行搅拌，所述搅拌转速为100rpm-600rpm。

在一些实施例中，所述发酵的时间为60-210h。

在一些实施例中，所述方法包括：将第一方面所述圆红酵母采用固体斜面培养基和种子培养基进行扩大培养后，置于发酵培养基中发酵，得到鲨鱼酸甘油酯；以发酵培养基的总体积计算，所述发酵培养基包含硫酸铵16g/L、葡萄糖300g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸镁4g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸钙0.5g/L、硫酸钠0.8g/L、微量元素溶液1ml/L和维生素混合液1ml/L，以及溶剂，溶剂为水；所述微量元素溶液包含硼酸3.89g/L、硫酸铜205.9mg/L、氯化铁3.22g/L、硫酸锰0.98g/L、钼酸钠1.86g/L和硫酸锌3.73g/L；所述维生素混合液包含生物素16.3mg/L、泛酸钙20.66g/L、叶酸16.3mg/L、肌醇18.3g/L、烟酸2.56g/L、吡哆醇2.56g/L、核黄素1.23g/L和硫胺素1.36g/L，以及溶剂，溶剂为水；所述发酵的发酵pH为6.0；所述发酵的温度为28℃；所述发酵过程还包括通入空气，所述气体的通气比为1.0VVM-1.5VVM；用氨水维持pH为6.0(以氨水控制pH以提供足够的氮源供菌体生长)；溶解氧含量＞40％进行发酵；在溶解氧含量反弹上升时流加70％的葡萄糖溶液，维持溶解氧含量为15％-60％；在OD₆₀₀约为300时，用NaOH水溶液替换氨水调节pH(限制氮源以刺激菌体积累油脂和鲨鱼酸甘油酯)。

有益效果

相比现有技术，本发明的某一个实施例包括以下至少一个有益效果：

(1)相比其他微量元素，本发明中所述发酵培养基中加入铁元素有利于提高菌体的生长速度、代谢碳源速度和提高鲨鱼酸甘油酯的产量。

(2)相比其他碳源，本发明中所述发酵培养基中所述碳源包括葡萄糖，有利于降低菌体需氧量，有利于工业化发酵。

(3)相比其他氮源，本发明中所述发酵培养基中所述氮源包括硫酸铵，有利于提高产物产量和鲨鱼酸甘油酯发酵效价。

(4)相比其他维生素，本发明中所述发酵培养基中加入泛酸或其盐有利于提高菌体的生长速度、代谢碳源速度和提高鲨鱼酸甘油酯的产量。

(5)本发明所述圆红酵母OMK-87为传统诱变选育的圆红酵母，非转基因工程菌，采用所述圆红酵母OMK-87制备鲨鱼酸甘油酯，消费者接受程度高。

(6)采用本发明所提供的圆红酵母OMK-87，所得鲨鱼酸甘油酯发酵效价高，产物中芥酸含量低，生物安全性高。

(7)采用本发明所提供的鲨鱼酸甘油酯的制备方法，所得鲨鱼酸甘油酯发酵效价高，产物中芥酸含量低，生物安全性高，是一种优良的膳食补充剂。

附图说明

图1为本发明实施例3中不同碳源对圆红酵母OMK-87生长、产油及积累鲨鱼酸甘油酯的影响统计图。

图2为本发明实施例3中不同氮源对圆红酵母OMK-87生长、产油及积累鲨鱼酸甘油酯的影响统计图。

图3为本发明实施例3中铁元素及泛酸钙对圆红酵母OMK-87生长、产油及积累鲨鱼酸甘油酯的影响统计图。

图4为本发明实施例3中pH对圆红酵母OMK-87生长、产油及积累鲨鱼酸甘油酯的影响统计图。

图5为本发明实施例3中温度对圆红酵母OMK-87生长、产油及积累鲨鱼酸甘油酯的影响统计图。

图6为本发明实施例4中圆红酵母OMK-87在30L发酵罐水平的生长曲线及油脂和鲨鱼酸效价曲线图。

图7为本发明实施例4中获得的鲨鱼酸甘油酯经KOH甲醇溶液衍生后的气相色谱图。各附图中“鲨鱼酸效价”表示鲨鱼酸甘油酯效价(以鲨鱼酸计算)。

术语说明

在本发明的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如±1％、±2％、±3％、±4％或±5％的差异。

术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

术语“VVM”表示通气比(airvolume/culture volume/min)，即每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。

术语“wt％”表示质量百分比。

术语“rpm”表示转速：转/分钟。

具体实施例

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

为描述本发明，以下列出了实施例。但需要理解，本发明不限于这些实施例，只是提供实践本发明的方法。

实施例1：高产鲨鱼酸甘油酯微生物的分离与筛选

从不同的自然环境，如海洋沉积物、滨海红树林、油脂精炼厂、菜园土壤、苹果、奶酪等食物表面搜集样品。环境样品直接采集深层土壤，食物样品如苹果刮取果皮。称取1.5g样品加入到100mL富集培养基(以2g/L橄榄油为唯一碳源)中培养，富集细菌采用橄榄油M9培养基(配方为：橄榄油2g/L(PVA乳化)、Na₂HPO₄·7H₂O 12.8g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl 1g/L、MgSO₄ 0.24g/L和CaCl₂ 0.011g/L，余量为水)；富集放线菌采用橄榄油高氏1号培养基(配方为：橄榄油2g/L(PVA乳化)、硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.5g/L和重铬酸钾0.1g/L，余量为水)；富集酵母菌与霉菌采用橄榄油PDB培养基(配方为：橄榄油2g/L(PVA乳化)和马铃薯浸粉4g/L，pH 5.6±0.2，余量为水)。培养一周后，得到一级培养物，取1mL一级培养物接种于100mL新鲜二级富集培养基中继续富集培养一周后，取富集培养物梯度稀释后涂布于相应的固体培养基上分离纯培养，固体培养基为相应的富集培养基额外添加2％的琼脂。一共分离得到165株细菌、35株放线菌、56株酵母菌、67株霉菌。

将分离得到的纯培养物接种于相应的限氮培养基中培养3-6天，细菌采用限氮M9培养基(配方为：葡萄糖50g/L、Na₂HPO₄·7H₂O 12.8g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH₄Cl0.9g/L、MgSO₄ 0.24g/L和CaCl₂ 0.011g/L)；放线菌采用限氮高氏1号培养基(配方为：葡萄糖50g/L、硝酸钾1.69g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.5g/L和重铬酸钾0.1g/L)；酵母菌采用限氮SD培养基(配方为：葡萄糖50g/L、YNB 1.7g/L、(NH₄)₂SO₄ 1.1g/L)；霉菌采用限氮PDB培养基(配方为：葡萄糖50g/L和马铃薯浸粉2g/L，pH5.6±0.2)。离心搜集菌体，冷冻干燥后直接采用KOH甲醇溶液衍生，采用GC-MS定性定量评估各个菌种积累鲨鱼酸甘油酯的能力，发现酵母菌Y26产鲨鱼酸甘油酯最高，为12mg/L(以鲨鱼酸计算)，鲨鱼酸占总油脂比为0.5％。经18S rDNA，ITS和形态特征鉴定，该酵母菌Y26为圆红酵母，命名为圆红酵母Y26。

实施例2：圆红酵母Y26的EMS化学诱变

将圆红酵母Y26接种于YPD培养基中培养至OD₆₀₀＝2-3，离心收集菌体，使用100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)重悬至OD₆₀₀＝10，加入EMS溶液至终浓度0.05mol/L，于28℃，100rpm摇床中振摇30分钟后加入5％硫代硫酸钠溶液终止。将菌悬液按1∶100接种于YPD培养基中培养至OD₆₀₀＝20，梯度稀释后涂布于YPD平板上分离单菌落。分别挑取单菌落接种于SD限氮培养基中培养，评估突变体库中各菌株的产油和积累鲨鱼酸甘油酯的能力，选取最优突变体作为下一轮诱变选育的出发菌株。其中圆红酵母M1在SD限氮培养基中干重可达10.25g/L，干细胞含油量31.2％，油脂发酵效价3.2g/L，油脂中鲨鱼酸含量2.1％，鲨鱼酸发酵效价67.2mg/L，相比于出发菌株有较明显的提升，故作为下一轮诱变选育的出发菌株继续诱变。

取圆红酵母M1，重复以上诱变流程一次，获得最优突变体圆红酵母M2，所述圆红酵母M2在SD限氮培养基中干重可达10.11g/L，干细胞含油量41.2％，油脂发酵效价4.17g/L，油脂中鲨鱼酸含量8.9％，鲨鱼酸发酵效价370.7mg/L，相比于出发菌种有大幅的提升；取圆红酵母M2，再重复此诱变流程一次，获得最优突变体圆红酵母M3，所述圆红酵母M3在SD限氮培养基中干重可达10.35g/L，干细胞含油量45.5％，油脂发酵效价4.7g/L，油脂中鲨鱼酸含量12.2％，鲨鱼酸发酵效价574.5mg/L，相比于出发菌种也有较明显的提升；继续在此基础上诱变，菌株产鲨鱼酸能力没有再次提升，并且负向突变体显著增多。因此选取第三轮诱变获得的最优突变体圆红酵母M3进行后续培养基配方及发酵参数优化实验，其中圆红酵母M3重命名为圆红酵母OMK-87，于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20221564。

实施例3：圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯培养基组分及发酵条件的优化

3.1初始发酵参数

利用四联平行生物反应器对圆红酵母OMK-87的培养基组分及发酵参数进行系统优化：

初始培养基配方如下：硫酸铵13g/L、磷酸二氢钾16g/L、硫酸镁3g/L、硫酸钙0.8g/L、硫酸钠2g/L、微量元素溶液1ml/L、维生素混合液1ml/L和碳源甘油，以及溶剂，溶剂为水，碳源甘油根据需求流加。其中微量元素溶液组成为：硼酸3.89g/L、硫酸铜205.9mg/L、氯化铁3.22g/L、硫酸锰0.98g/L、钼酸钠1.86g/L和硫酸锌3.73g/L。维生素混合液组成为：生物素16.3mg/L、泛酸钙2.07g/L、叶酸16.3mg/L、肌醇18.3g/L、烟酸2.56g/L、吡哆醇2.56g/L、核黄素1.23g/L和硫胺素1.36g/L，以及溶剂，溶剂为水。

发酵条件：初始发酵pH为4.8，初始发酵温度为28℃，发酵161h。

结果：按上述初始培养基和发酵条件发酵后所得菌体干重为121.5g/L，油脂发酵效价为45.6g/L，鲨鱼酸发酵效价为9.6g/L。

3.2碳源的筛选

研究圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的最优碳源种类：

发酵培养基：将上述初始培养基配方中的碳源分别以葡萄糖、蔗糖、果糖或山梨醇替代甘油作为碳源，其余成分不变。

发酵条件：发酵pH为4.8，发酵温度为28℃，发酵161h。

结果：见图1。

按上述发酵培养基和发酵条件发酵后，圆红酵母OMK-87除了不能有效利用山梨醇外，葡萄糖、蔗糖、果糖均可以很好的支持菌体生长，其中以葡萄糖为碳源的发酵结果最优，采用葡萄糖作为碳源，发酵161h后菌体干重为135.1g/L，油脂发酵效价为58.7g/L，鲨鱼酸发酵效价为12.1g/L，为所有碳源中最优，且以葡萄糖作为碳源菌体需氧量明显低于其他碳源，对于工业发酵有利，因此确定葡萄糖为最优碳源。

3.3氮源的筛选

研究圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的最优氮源：

发酵培养基：将初始培养基配方中的氮源分别以尿素、酵母膏、大豆蛋白胨替代硫酸铵作为氮源，其余成分不变。

发酵条件：发酵pH为4.8，发酵温度为28℃，发酵161h。

结果：见图2。

按上述发酵培养基和发酵条件发酵后，除硫酸铵外，采用酵母膏、大豆蛋白胨等有机氮源作为发酵培养基的氮源可以有效缩短菌株的延滞期，但会严重抑制菌株积累油脂与鲨鱼酸，如以酵母膏为氮源，发酵161h菌体干重为100.8g/L，油脂发酵效价23.7g/L，鲨鱼酸发酵效价4.3g/L，其鲨鱼酸甘油酯发酵效价远低于采用硫酸铵作为氮源的培养基的鲨鱼酸甘油酯发酵效价，因此确定硫酸铵为最优氮源。

3.4微量元素的筛选

研究不同微量元素对圆红酵母OMK-87菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力的影响：

发酵培养基：分别在初始培养基配方的基础上删除某种微量元素，或者以10倍量额外添加某种微量元素，考察不同微量元素对菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力的影响。

发酵条件：发酵pH为4.8，发酵温度为28℃，发酵161h。

结果：

经筛选考察发现，按上述发酵培养基和发酵条件发酵后，在初始培养基配方的基础上删除铁元素后，发酵161h菌体干重为56.4g/L，油脂发酵效价为17.8g/L，鲨鱼酸发酵效价为2.3g/L；而删除其他元素对菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力无明显影响。

经筛选考察发现，按上述发酵培养基和发酵条件发酵后，在初始培养基配方的基础上以10倍量额外添加铁元素后，菌体干重略有增加，菌体代谢葡萄糖的能力得到较大提升，鲨鱼酸甘油酯发酵效价大幅增加，发酵161h菌体干重为136.4g/L，油脂发酵效价为61.2g/L，鲨鱼酸发酵效价为12.4g/L；而10倍量额外添加其他微量元素对菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力无明显影响。

结论：铁元素有利于提高圆红酵母OMK-87的菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力。

3.5维生素的筛选

研究维生素对圆红酵母OMK-87菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力的影响：

发酵培养基：分别在初始培养基配方的基础上删除某种维生素，或者以10倍量额外添加某种维生素，考察不同维生素对菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力的影响。

发酵条件：发酵pH为4.8，发酵温度为28℃，发酵161h。

结果：

经筛选考察发现，在初始培养基配方的基础上删除泛酸或其盐，菌体生长、代谢葡萄糖和产鲨鱼酸甘油酯的能力受到明显的影响，如删除泛酸或其盐后，发酵161h菌体干重为54.6g/L，油脂发酵效价为9.7g/L，鲨鱼酸发酵效价为1.4g/L；如以10倍量添加泛酸钙后，发酵161h，菌体干重为145.3g/L，油脂发酵效价为62.2g/L，鲨鱼酸发酵效价为16.8g/L，证明泛酸或其盐对于圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯具有明显的促进作用。

3.6发酵pH的考察

研究发酵pH对圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的影响：

发酵培养基：初始培养基。

发酵条件：发酵温度为28℃，发酵161h，分别考察发酵pH为2.5、3.5、4.8、6.0、7.0、8.0。

结果：见图4。

pH 6.0为圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的最适发酵pH，pH太低或太高会显著影响菌株生长代谢和产鲨鱼酸甘油酯的能力。

3.7发酵温度的考察

研究发酵温度对圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的影响：

发酵培养基：初始培养基。

发酵条件：发酵pH为4.8，发酵161h，分别考察发酵温度为18℃、23℃、28℃、32℃、37℃。

结果：见图5。

28℃为圆红酵母OMK-87发酵产鲨鱼酸甘油酯的最适发酵温度，发酵温度太低或太高会显著影响菌株生长代谢和产鲨鱼酸甘油酯的能力。

3.8发酵最优培养基的确定

发酵最优培养基：在单因素试验结果的基础上，采用响应面法进行培养基组分的进一步优化，获得发酵最优培养基组成为：硫酸铵16g/L、初始葡萄糖30g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸镁4g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸钙0.5g/L、硫酸钠0.8g/L、微量元素溶液1ml/L和维生素混合液1ml/L，余量为水，碳源葡萄糖根据需求流加，其中微量元素溶液组成为：硼酸3.89g/L、硫酸铜205.9mg/L、氯化铁3.22g/L、硫酸锰0.98g/L、钼酸钠1.86g/L和硫酸锌3.73g/L，余量为水。维生素混合液组成为：生物素16.3mg/L、泛酸钙20.66g/L、叶酸16.3mg/L、肌醇18.3g/L、烟酸2.56g/L、吡哆醇2.56g/L、核黄素1.23g/L和硫胺素1.36g/L，余量为水。

实施例4：低芥酸高鲨鱼酸甘油酯的生产(30L发酵罐发酵)

在30L发酵罐水平验证圆红酵母OMK-87产鲨鱼酸甘油酯的能力。将圆红酵母OMK-87依次经固体斜面培养基和种子培养基培养后，获得种子培养液；将该种子液接种于实施例3中获得的最优发酵培养基中培养，控制pH为6.0，温度为28℃，搅拌转速100rpm-600rpm，通气量1VVM-1.5VVM，溶解氧含量＞40％进行发酵。待底料中葡萄糖耗尽，溶解氧含量反弹后开始流加70％的葡萄糖溶液，控制残糖(残留葡萄糖)浓度为1-10g/L，控制搅拌转速400rpm-600rpm，维持溶解氧含量＞15％。发酵前期以氨水控制pH以提供足够的氮源供菌体生长，待菌体生长至OD₆₀₀＝300左右时，换以30％NaOH溶液控制pH，限制氮源以刺激菌体积累鲨鱼酸甘油酯。最终发酵132h，菌体干重达186.6g/L，菌体含油量57.8％，油脂发酵效价107.9g/L。总油脂中鲨鱼酸占比26.1％，芥酸占比1.6％，折合鲨鱼酸发酵效价28.2g/L。

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种圆红酵母(拉丁名：Rhodotorula toruloides)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 20221564。

2.权利要求1所述圆红酵母在制备鲨鱼酸或鲨鱼酸甘油酯中的应用。

3.一种制备鲨鱼酸甘油酯的方法，其包括：将权利要求1所述圆红酵母置于发酵培养基中发酵，得到鲨鱼酸甘油酯。

4.根据权利要求3所述的方法，其包括：将权利要求1所述圆红酵母经扩大培养后，置于发酵培养基中发酵，得到鲨鱼酸甘油酯。

5.根据权利要求3所述的方法，所述发酵培养基包括碳源、氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸钙、硫酸钠、微量元素和维生素；和/或

所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油中的至少一种，优选为葡萄糖；和/或

所述氮源包括硫酸铵、尿素、酵母膏、大豆蛋白胨中的至少一种，优选为硫酸铵；和/或

所述微量元素包括铁元素、硼元素、铜元素、锰元素、钼元素、锌元素中的至少一种；和/或

所述微量元素包括氯化铁、硼酸、硫酸铜、硫酸锰、钼酸钠、硫酸锌中的至少一种；和/或

所述维生素包括生物素、泛酸或其盐、叶酸、肌醇、烟酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素中的至少一种；和/或

所述发酵培养基的pH为4.5-7.0，优选为6.0；和/或

所述发酵的发酵温度为25℃-30℃，优选为28℃。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，以发酵培养基的总体积计算，所述发酵培养基包含硫酸铵15g/L-25g/L、葡萄糖30g/L-600g/L、磷酸二氢钾13g/L-22g/L、硫酸镁3g/L-8g/L、硫酸亚铁10mg/L-40mg/L、硫酸钙0.2g/L-2g/L、硫酸钠0.2g/L-2g/L、微量元素溶液0.5ml/L-3ml/L和维生素混合液0.5ml/L-3ml/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述微量元素溶液包含硼酸2.23g/L-5.67g/L、硫酸铜102.2mg/L-309.6mg/L、氯化铁1.22g/L-4.55g/L、硫酸锰0.32g/L-1.53g/L、钼酸钠0.95g/L-2.31g/L和硫酸锌1.23g/L-4.87g/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述维生素混合液包含生物素2.3mg/L-21.2mg/L、泛酸钙1.00g/L-40.56g/L、叶酸2.6mg/L-23.4mg/L、肌醇4.3g/L-23.1g/L、烟酸1.02g/L-3.56g/L、吡哆醇1.26g/L-3.78g/L、核黄素0.54g/L-3.45g/L和硫胺素0.66g/L-3.89g/L，以及溶剂，溶剂为水。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，以发酵培养基的总体积计算，所述发酵培养基包含硫酸铵16g/L、葡萄糖300g/L、磷酸二氢钾14g/L、硫酸镁4g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸钙0.5g/L、硫酸钠0.8g/L、微量元素溶液1ml/L和维生素混合液1ml/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述微量元素溶液包含硼酸3.89g/L、硫酸铜205.9mg/L、氯化铁3.22g/L、硫酸锰0.98g/L、钼酸钠1.86g/L和硫酸锌3.73g/L，以及溶剂，溶剂为水；

所述维生素混合液包含生物素16.3mg/L、泛酸钙20.66g/L、叶酸16.3mg/L、肌醇18.3g/L、烟酸2.56g/L、吡哆醇2.56g/L、核黄素1.23g/L和硫胺素1.36g/L，以及溶剂，溶剂为水。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，所述扩大培养包括采用固体斜面培养基培养和种子培养基培养。

9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，所述发酵的发酵pH为2.0-8.0，优选为6.0；和/或

所述发酵的温度为18℃-37℃，优选为28℃；和/或

所述发酵在溶解氧含量为5％-60％，优选为15％-60％；和/或

所述发酵还包括通入空气；和/或

所述发酵的发酵通气比为1.0VVM-1.5VVM。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，所述方法还包括在发酵过程中，溶解氧含量反弹上升后开始流加葡萄糖溶液。

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