CN105062769B - 一种提高浓香型基酒中3‑羟基‑2‑丁酮和2,3‑丁二醇的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高浓香型基酒中3‑羟基‑2‑丁酮和2,3‑丁二醇的工艺方法，其特征在于：通过对解淀粉芽孢杆菌GJJNBL004进行菌种活化、种子液培养和发酵培养获得发酵液；在由出池酒醅和粮食混合后蒸馏获得浓香型基酒时，先用发酵液浸润粮食原料或喷洒出池酒醅，然后再进行蒸馏获得浓香型基酒，即可提高浓香型基酒中3‑羟基‑2‑丁酮和2,3‑丁二醇含量。本发明的方法能够大幅提高基酒中3‑羟基‑2‑丁酮和2,3‑丁二醇含量，改善基酒风味，使酒体更加醇厚、绵甜，提高酒的质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域具体涉及一种提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的工艺方法。
背景技术
3-羟基-2-丁酮又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，在自然界存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于作为奶油、干酪、咖啡、坚果的香味增强剂。2,3-丁二醇在自然界中存在于玉米、葡萄、苹果等许多食品中。3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇被认为是白酒质量的重要成分，在白酒中起着缓冲、平衡的作用，能使酒产生优良的酒香和绵甜的口味，同时白酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇是呈甜味物质，并有助香作用，特别是在回味上使之有醇厚感，能使酒醇厚绵甜、有自然感。
当前白酒消费处于由香向味、高度向低度的发展趋势下，它在保持浓香白酒风格的前提下，更加注重酒体的淡雅、绵甜与醇和，这就需要提高白酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的含量。目前大部分白酒的基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量较低，3-羟基-2-丁酮在10mg/L以下，平均在4mg/L左右，2，3-丁二醇在15mg/L以下，平均在5mg/L左右；清香型白酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇最少，有的白酒中这些物质含量为零。这主要是由于窖池内酒醅中酸性大、氧气含量少、底物(单糖、双糖等)浓度小，众多微生物在一起生长、代谢，它们之间又相互制约，使产3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的解淀粉芽孢杆菌等菌在窖池内产量较小。而高档酒如浓香型五粮液白酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量较高，3-羟基-2-丁酮在40-70mg/L，2,3-丁二醇在30-50mg/L；酱香白酒中含量最高，茅台酒3-羟基-2-丁酮在158mg/L，2,3-丁二醇在160mg/L，大部分白酒基酒中这两种物质含量与它们相比有一定的差别，有必要提高基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量。
3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇是微生物糖代谢的中间代谢产物。以糖质为原料利用微生物发酵可以产生3-羟基丁酮，但是目前有关微生物产生3-羟基-2-丁酮的报道很少。国内山东大学利用一株克雷伯氏茵在以葡萄糖和磷酸氢二铵为主要成分的培养基中发酵生产2,3-丁二醇；山东省化工研究院应用一株产酸克雷伯式菌发酵生产2,3-丁二醇；R.M.Teixeira等报道汉逊酵母发酵产3-羟基丁酮，产量最高可达0.36g/L。据目前国内外报道显示，2,3-丁二醇生产菌种主要是克雷伯氏菌和产气肠杆菌，但这些菌属于致病性菌株，难以符合生物技术产业化安全生产的要求。经安徽省科技情报研究所科技查新表明，未见高产3-羟基，2-丁酮、2,3-丁二醇的解淀粉芽孢杆菌在酿酒中用于提高基酒中3-羟基，2-丁酮、2,3-丁二醇含量的应用报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量的方法，能够解决浓香型白酒3-羟基-2-丁酮和2,3—丁二醇含量较低的问题。
目前解淀粉芽孢杆菌等菌在窖池内由于糖浓度、pH、氧气、二氧化碳等因素的影响导致其3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇产量很小，而它们在液体培养基中通气发酵产量是窖池内发酵产量的几十倍。为解决上述技术问题，本发明把解淀粉芽孢杆菌在发酵罐内进行液体通气培养，所得发酵液中产物3-羟基-2-丁酮达6000mg/L、2,3-丁二醇达30000mg/L，把发酵液按一定比例通过润粮或洒入出池酒醅，通过蒸馏大幅提高基酒中3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的含量，使酒体更加醇厚、绵甜，提高了酒的质量。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明首先公开了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GJJNBL004，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014494，保藏日期为2014年10月19日；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。菌株经生工生物工程(上海)股份有限公司进行分子生物学鉴定，Bacillusamyloliquefaciens GJJNBL004菌株的26S rDNA序列与其它多株Bacillusamyloliquefaciens.的26S rDNA序列有99.6％的相似性。
本发明的解淀粉芽孢杆菌是来源于安徽古井贡酒股份有限公司的窖泥中。该菌是窖池体系内的微生物，是生物安全菌种，不会给白酒产品带来不良发酵产物。
本发明的解淀粉芽孢杆菌的形态学和生理化特征为：菌株呈杆状，为革兰氏阳性菌，白色、半透明，菌落光滑湿润、稍隆起；菌株在温度20℃-45℃内、pH5.0-10.0内都能正常生长，最适生长温度为35℃。
本发明的解淀粉芽孢杆菌可用于提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量。
本发明进一步公开了提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量的方法，其是对上述的解淀粉芽孢杆菌进行菌种活化、种子液培养和发酵培养获得发酵液；在由出池酒醅和粮食混合后蒸馏获得浓香型基酒时，先用所述发酵液浸润粮食原料，或将发酵液喷洒出池酒醅，然后再进行蒸馏获得浓香型基酒，即可提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量；所述发酵液质量为所述出池酒醅和所述粮食总质量的5％～10％。具体步骤为：
步骤1、菌种活化
将菌种活化培养基在121℃下灭菌20min，用接种环蘸取两环解淀粉芽孢杆菌接种到含10-15mL所述菌种活化培养基的培养瓶中，有氧条件下35℃活化培养24小时，获得活化菌种；
所述菌种活化培养基的组分及其重量百分比为：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、 氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl20.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％，余量为蒸馏水，pH7.0；
步骤2、种子液培养
将种子培养基在121℃下灭菌20min，用接种环蘸取两环活化菌种接种到含15mL所述种子培养基的摇瓶中，35℃、140rpm摇床培养24h或35℃静态培养24h，获得种子液；
所述种子培养基的组分及其重量百分比为：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl20.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％，余量为蒸馏水，pH7.0；
步骤3、发酵培养
按10％的接种量，将种子液接种到装有发酵培养基的三角瓶中，35℃、140rpm摇床培养72h，获得发酵液；
或按10％的接种量，将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，35℃进行通气搅拌培养72h，其中搅拌转速为200转/分钟，通入无菌空气的量为0.5vvm；
所述发酵培养基的组分及其重量百分比为：以糖度为9°BX的糖化液为基准，加入蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0；
步骤4、用于浓香型基酒生产
在由出池酒醅和粮食原料混合后蒸馏获得浓香型基酒时，先用所述发酵液浸润粮食原料，和/或用发酵液喷洒所述出池酒醅，然后再进行蒸馏后获得浓香型基酒，即可提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量；所述发酵液质量为所述出池酒醅和所述粮食总质量的5％～10％。
所述酒醅浸提液按如下方法制备获得：取出池酒醅样品20g，加蒸馏水250mL，在超声波清洗器上振荡浸提20min后，过滤所得过滤液即为酒醅浸提液。
所述糖化液按如下方法制备获得：将玉米、高粱和大米按质量比7:2:1混合构成原料组；在原料组中加入4倍质量的水和占原料组质量0.2％的淀粉酶，加热至120℃，然后降温至90℃并再次加入占原料组质量0.2％的淀粉酶，保温1h；继续降温至60℃，加入占原料组质量1％的糖化酶，保温1h；降至室温，此时所得糖化液的糖度约在9～10°BX，加水调节糖度，获得糖度为9°BX的糖化液。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明从窖泥中分离出的解淀粉芽孢杆菌，在窖池体系外，通过改变该菌株的生长代谢条件，在发酵罐内进行液体通气培养发酵，提高发酵液中代谢产物3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的量，然后把发酵液按一定比例润粮或洒入出池酒醅，大幅提高了基酒中3-羟基-2-丁酮和 2,3-丁二醇的含量，改善基酒风味，使酒体更加醇厚、绵甜，提高了酒的质量。
本发明获得的高含量3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的基酒，可将浓香型白酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的含量提高到合适的量，改善白酒风味，从而使酒体更加醇厚、绵甜；本发明基酒也可作为调味酒使用。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1小试发酵
1、实验材料：
菌种：从安徽古井贡酒股份有限公司窖泥中分离的解淀粉芽孢杆菌菌种(Bacillus amyloliquefaciens)GJJNBL004；
菌种活化培养基：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl20.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％、余量为蒸馏水，pH7.0，在121℃下灭菌20min。
种子培养基：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl20.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％、余量为蒸馏水，pH7.0，在121℃下灭菌20min。
发酵培养基：以糖度为9°BX的糖化液为基准，加入蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0。
2、小试发酵：
(1)菌种活化
用接种环蘸取两环解淀粉芽孢杆菌接种到含15mL菌种活化培养基的培养瓶中，有氧条件下、35℃活化培养24小时，获得活化菌种；
(2)种子液培养
用接种环蘸取两环活化菌种接种到含15mL种子液培养基的25mL摇瓶中，摇床(35℃、140rpm)培养24h，获得种子液；
(3)发酵培养
将15mL种子液接种到装有150mL发酵培养基的三角瓶中，35℃、140rpm摇床培养72h，获得发酵液。
3、采用气相色谱测定，分析发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量
气相色谱分析条件：
a、色谱柱：CP-WAX 50CB(50m×0.25mm×0.2um)毛细管柱；
b、色谱柱温度：35℃保持3min,然后以5℃/min程序升温至100℃，不保持，再以10℃/min升温至195℃，保持18min；
c、载气：氮气，纯度≥99.999％，流速：1.0ml/min；
d、进样量：1μL；
e、进样口温度：230℃；
f、进样方式：分流进样，分流比60:1。
4、分析结果
经测试，发酵产物3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量如表1所示：
表1
实施例2、蒸馏
(1)在大楂出池酒醅100g中加入200mL蒸馏水，放入蒸馏瓶中进行蒸馏，取100mL馏出液进行分析，结果如表2所示。
(2)在大楂出池酒醅100g中加入195mL蒸馏水，再加入5mL实施例1所获得的发酵液，放入蒸馏瓶中进行蒸馏，取100mL馏出液进行分析，结果如表2所示。
(3)在大楂出池酒醅100g中加入190mL蒸馏水，加入10mL实施例1所获得的发酵液，放入蒸馏瓶中进行蒸馏，取100mL馏出液进行分析，结果如表2所示。
表2
从表2的分析结果可以看出：在大楂出池酒醅中加入发酵液，可以大幅增加蒸馏液中3- 羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的含量(3-羟基-2-丁酮由于沸点低在蒸馏液中增加量更大)，而不加入发酵液的则量不大，证实在出池酒醅中加入发酵液以增加蒸馏液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇方法可行。
实施例3生产上试运用
本实施例是在安徽古井贡酒股份有限公司的一个酿酒车间进行了应用研究，具体过程为：
发酵液制备：按实施例1相同的方法扩大制备种子液，以10％体积比的接种量，将16L种子液接种于罐装有160L发酵培养基的200L发酵罐中，35℃进行通风搅拌培养，其中搅拌转速为200转/分钟，通入无菌空气的量为0.5vvm。发酵过程中控制发酵温度35±0.2℃，通过调节搅拌转速和通气比控制溶解氧为15％，发酵过程中流加酸碱使发酵液的pH维持为7.0左右，当发酵液中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇浓度不再上升时，结束发酵，发酵时间约为72小时。
先用发酵液按照粮食原料和出池酒醅总质量的0％、5％和10％浸润粮食原料或喷洒出池酒醅，然后按照常规工艺再进行蒸馏后获得浓香型基酒，测试基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的含量，结果如表3所示。
表3
从大生产的实验结果可以看出，把发酵液按一定比例通过润粮或洒入出池酒醅后再蒸馏，可以大幅提高基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇的含量，实验方法是可行的。得到的高含量3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的基酒可以作为调味酒使用，可将成品酒中3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇的含量提高到合适的量，改善基酒风味，从而使酒体更加醇厚、绵甜。
Claims (6)
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的保藏名称为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GJJNBL004，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014494，保藏日期为2014年10月19日；
所述解淀粉芽孢杆菌是来源于安徽古井贡酒股份有限公司的窖泥中。
2.一种权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：用于提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量。
3.一种提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量的方法，其特征在于：对权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌进行菌种活化、种子液培养和发酵培养获得发酵液；
在由出池酒醅和粮食混合后蒸馏获得浓香型基酒时，先用所述发酵液浸润粮食原料，或将发酵液喷洒出池酒醅，然后再进行蒸馏获得浓香型基酒，即可提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量；所述发酵液质量为所述出池酒醅和所述粮食总质量的5％～10％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于按如下步骤进行：
步骤1、菌种活化
将菌种活化培养基在121℃下灭菌20min，用接种环蘸取两环解淀粉芽孢杆菌接种到含10-15mL所述菌种活化培养基的培养瓶中，有氧条件下35℃活化培养24小时，获得活化菌种；
所述菌种活化培养基的组分及其重量百分比为：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl2 0.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％，余量为蒸馏水，pH7.0；
步骤2、种子液培养
将种子培养基在121℃下灭菌20min，用接种环蘸取两环活化菌种接种到含15mL所述种子培养基的摇瓶中，35℃、140rpm摇床培养24h或35℃静态培养24h，获得种子液；
所述种子培养基的组分及其重量百分比为：蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、葡萄糖3％、氯化钠0.05％、硫酸铵0.09％、硫酸铁0.01％、硫酸镁0.03％、CaCl2 0.5％、酒醅浸提液20％、琼脂2％，余量为蒸馏水，pH7.0；
步骤3、发酵培养
按10％的接种量，将种子液接种到装有发酵培养基的三角瓶中，35℃、140rpm摇床培养72h，获得发酵液；
或按10％的接种量，将种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，35℃进行通气搅拌培养72h，其中搅拌转速为200转/分钟，通入无菌空气的量为0.5vvm；
所述发酵培养基的组分及其重量百分比为：以糖度为9°BX的糖化液为基准，加入蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、硫酸镁0.3g/L，pH7.0；
步骤4、用于浓香型基酒生产
在由出池酒醅和粮食原料混合后蒸馏获得浓香型基酒时，先用所述发酵液浸润粮食原料，和/或用发酵液喷洒所述出池酒醅，然后再进行蒸馏后获得浓香型基酒，即可提高浓香型基酒中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇含量；所述发酵液质量为所述出池酒醅和所述粮食总质量的5％～10％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述酒醅浸提液按如下方法制备获得：取出池酒醅样品20g，加蒸馏水250mL，在超声波清洗器上振荡浸提20min后，过滤所得过滤液即为酒醅浸提液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述糖化液按如下方法制备获得：将玉米、高粱和大米按质量比7:2:1混合构成原料组；在原料组中加入4倍质量的水和占原料组质量0.2％的淀粉酶，加热至120℃下糊化；降温至90℃并再次加入占原料组质量0.2％的淀粉酶，保温1h；继续降温至60℃，加入占原料组质量1％的糖化酶，保温1h；降至室温后，加水调节糖度，获得糖度为9°BX的糖化液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |