CN106010868A

CN106010868A - 一种低醇苹果酒的制备方法

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Publication number: CN106010868A
Application number: CN201610532954.6A
Authority: CN
Inventors: 高振鹏; 刘瑞; 岳田利; 袁亚宏
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: CN106010868B

Abstract

本发明公开了一种低醇苹果酒的制备方法，采用本发明的方法制备得到的苹果酒酒精度为6.35％，达到低醇标准；低醇苹果酒的制备方法包括：以鲜榨苹果汁为原料，通过在果汁中同时添加酿酒酵母和葡萄糖氧化酶，然后利用单因素试验和响应面分析，得到最佳的发酵工艺，酿造低醇苹果酒。利用上述公开发酵工艺可酿造出低醇苹果酒，采用在苹果汁中添加葡萄糖氧化酶以及优化后的工艺酿制的低醇苹果酒的香气物质种类丰富，低醇苹果酒感官指标良好，具有苹果酒应有的色泽，澄清透明，无明显悬浮物，口感柔和，酒体醇和协调，是一种健康养生的低度果酒。

Description

一种低醇苹果酒的制备方法

技术领域

本发明属于苹果酒酿造技术领域，具体涉及一种低醇苹果酒的制备方法。

背景技术

苹果酒的香气作为评价苹果酒品质的重要指标之一，是由很多种挥发性化合物共同作用的结果。低醇苹果酒的生产方法有很多，总体可以分为两大类，一类是控制发酵法，即通过控制发酵过程的各关键因素达到控制酒精的目的，使得酒精度达到标准要求，如特殊酵母法，中断发酵法，高温糖化法，高度稀释法等；另一类是酒精脱除法，即按正常发酵条件发酵完成的酒品，通过各种物理化学的方法，将酒精去除掉，达到标准要求，如反渗透法，超临界CO₂萃取法，真空蒸馏法等。这些方法大多都对酒的香气成分及口感产生很大影响。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种更加简单的低醇苹果酒的制备方法，同时该制备方法得到的低醇苹果酒的香气浓郁，以解决现有低醇苹果酒香气不足的问题。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种低醇苹果酒的制备方法，包括将酵母菌和葡萄糖氧化酶同时加入苹果汁中进行苹果酒的发酵酿制。

具体的，以苹果汁的体积计，酵母菌种子液的接种量为8％，葡萄糖氧化酶的添加量为1～3mg/L；

所述的酵母菌种子液的制备包括：将酵母菌接种于YPD培养基中28℃、150rpm摇床培养12h进行活化，然后将活化后的酵母菌按8％的接种量接种于苹果汁中，28℃、150rpm摇床培养18h得到酵母菌种子液。

更具体的，所述的发酵温度为18～24℃，苹果汁的pH为3.9～4.7。

优选的，以苹果汁的体积计，酵母菌种子液的接种量为8％，葡萄糖氧化酶的添加量为2.84mg/L；

优选的，所述的发酵温度为22.90℃，苹果汁的pH为4.65。

进一步的，所述的苹果汁的可溶性固形物含量为10～13°Brix。

还有，所述的苹果汁的制备包括：将苹果果肉在护色剂中浸泡15min后榨汁，榨汁后添加60～80mg/L的偏重亚硫酸钾和450mg/L的果胶酶进行酶解，酶解温度为45℃，酶解时间为2h，过滤得到澄清的苹果汁。

与现有技术相比，本发明的优点为：

(1)该方法通过将葡萄糖氧化酶和酵母同时加入苹果汁中，葡萄糖氧化酶可将苹果汁中的葡萄糖转化为葡萄糖酸，在酒精发酵的前处理过程中，通过葡萄糖氧化酶将苹果汁中一部分可利用的葡萄糖转化成葡萄糖酸，从而降低苹果酒的酒精度；

(2)对经葡萄糖氧化酶作用酿造的苹果酒进行苹果酒香气成分的测定及分析，结果表明，采用在苹果汁中添加葡萄糖氧化酶以及优化后的工艺酿制的低醇苹果酒的香气物质种类丰富，低醇苹果酒感官指标良好，具有苹果酒应有的色泽，澄清透明，无明显悬浮物，口感柔和，酒体醇和协调，是一种健康养生的低度果酒。

附图说明

图1为不同pH值对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图2不同温度对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图3酶用量对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图4酶添加时间对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图5为发酵温度对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图6为酶添加量对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图7为酶添加量对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图8为pH对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响；

图9为苹果酒原酒GC-MS总离子流程图；

图10为低醇酒GC-MS总离子流程图；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

本发明以鲜榨苹果汁为原料，采用响应面分析法对经葡萄糖氧化酶作用的低醇苹果酒的发酵工艺进行优化，同时采用顶空固相微萃取结合气质联用法对低醇苹果酒进行香气成分检测，测定未经GOD作用的苹果原酒以及低醇苹果酒的理化指标、香气成分，分析原酒与低醇苹果酒的理化指标、香气成分。

葡萄糖氧化酶可将苹果汁中的葡萄糖转化为葡萄糖酸，在酒精发酵的前处理过程中，通过葡萄糖氧化酶将苹果汁中一部分可利用的葡萄糖转化成葡萄糖酸，从而降低苹果酒的酒精度，研制低醇苹果酒。

本发明中所用的酿酒酵母可选用适用常规苹果酒的酿酒酵母，优选WLS21酵母菌菌种(文献“王林松.苹果酒专用酵母的构建及发酵动力学研究[D].西北农林科技大学，2007”中公开的21#菌株)。

试验时的过程如下：

(1)工艺流程

鲜榨苹果汁→成分调整→同时加入GOD和酵母菌→不同条件下进行主发酵→测定可滴定酸的含量→测定酒精度、香气成分分析、理化指标分析及感官品尝。

(2)苹果汁的制备

将充分成熟、无腐烂变质的苹果充分清洗、切块、去核，在护色剂(0.05％Vc和1.5％柠檬酸)中浸泡15min后分别榨汁，榨汁后需添加一定量的偏重亚硫酸钾(60～80mg/L)，偏重亚硫酸钾在苹果汁中能够起到抑菌以防止苹果汁受到杂菌的污染、抗氧化以防止苹果汁褐变的作用，同时添加偏重亚硫酸钾对苹果汁的澄清也有一定的作用，然后添加一定量的果胶酶(450mg/L)酶解，酶解条件为：酶解温度45℃；酶解时间：水浴2h，然后抽滤，得到澄清的苹果汁。

(3)苹果酒的酿造

酵母菌种子液的制备：将WLS21酵母菌菌种接种于YPD培养基(酵母浸粉1％，葡萄糖2％，蛋白胨2％)中，28℃、150rpm摇床培养12h进行活化，活化后的酵母菌按8％的接种量接种于可溶性固形物含量为13°Brix的混合苹果汁中，28℃、150rpm摇床培养18h得到酵母菌种子液，苹果汁需在90℃灭菌10min。

苹果酒的酿造：将酵母菌种子液和GOD同时接种于可溶性固形物含量为13°Brix的苹果汁中，21℃下发酵7天后，进行倒罐，陈酿。

(4)香气成分测定

①香气成分富集：采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)进行香气成分的富集。移取8mL苹果汁样品于15mL样品瓶中，加入5g氯化钠和一定量的内标溶液，在磁力搅拌器上，45℃平衡10min，再用老化处理过的100μmPDMS萃取头插入样品瓶，顶空吸附35min。

②香气成分GC-MS检测：将吸附香气成分的PDMS纤维头插入气相色谱进样口，250℃下解析5min。使用的色谱柱为DB-WAX弹性石英毛细管柱(30m*0.25mm*0.25μm)。分流方式为不分流，色谱柱升温程序为，起始温度40℃,保持5min，以3℃/min的升温速度升至120℃，再以8℃/min的升温速度升至230℃，保持10min，载气为He，流速为0.8mL/min。质谱条件：EI电离源，电子能量为70eV，离子源温度为200℃，扫面范围为33-450AMU，灯丝流量为0.25mA，检测器电压为350V。

(5)发酵工艺单因素试验筛选影响显著的因素

用可滴定酸(以苹果酸计算)的增加量来间接测定葡萄糖到葡萄糖酸的转化率和酶的效率。筛选出对葡萄糖氧化酶转化率影响显著的因素。分别考察了不同pH值和温度对葡萄糖氧化酶活力的影响。分别对酶用量和酶的添加时间对苹果汁中葡萄糖转化效率的影响进行了研究。

①果汁中pH值对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响

鲜榨苹果汁，糖含量10.71g/100mL，可滴定酸含量3.42g/L，用苹果酸调节苹果汁pH分别为3.5、3.9、4.3、4.7、5.1，开始时接种8％的酵母菌种子液，按照2mg/L的浓度在苹果汁中加入GOD，在21℃下用200mL鲜榨苹果汁进行试验，记录不同pH值下主发酵结束后苹果酒的可滴定酸含量。结果如图1。

由图1可知，在不同的pH条件下，可滴定酸的含量有明显差异，即葡萄糖的转化效率不同。随着pH的增加，可滴定酸的含量也逐渐增加。GOD催化的最适pH为4.5左右，该酶在3.5～6.5之间稳定。较低的pH限制葡萄糖向葡萄糖酸的转化，因此，选择苹果汁的pH分别为3.9、4.3和4.7来进行响应面优化。

②酵温度对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响

鲜榨苹果汁，糖含量10.71g/100mL，可滴定酸含量3.42g/L，pH 3.90，接种8％的酵母种子液，开始时加入3mg/L的GOD。调节温度分别为18℃、21℃、24℃、27℃、30℃下，用200mL鲜榨苹果汁进行试验，记录不同温度下主发酵结束后苹果酒的可滴定酸含量。结果如图2。

由图2可知，随着温度升高可滴定酸的含量逐渐增加，但增长的幅度不大。葡萄糖氧化酶反应体系中含有气体反应物氧，反应温度的变化导致氧在反应底物中浓度的改变，温度升高时，反应体系中氧的溶解度下降，这就部分抵消了温度升高对酶反应速率的影响。因为低温处理可以更好地保持苹果酒的质量和色泽，有利于发酵，因此为了更好地保持苹果酒的质量和色泽，选泽发酵温度为18℃、21℃和24℃来进行响应面优化。

③酶的添加量对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响

鲜榨苹果汁，糖含量10.71g/100mL，可滴定酸含量3.42g/L，pH 3.90，接种8％的酵母种子液，开始时分别加入0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L和5mg/L的GOD，21℃下，用200mL相同的鲜榨苹果汁样品进行试验。结果如图3。

由图3可以得出，葡萄糖转化速率随着葡萄糖氧化酶用量的增加而增加，但增加趋势逐渐缓慢，这可能是由于在一定底物浓度下，随着酶用量的增加及体系酶活增大，因而反应速率增大，但酶用量增加到一定值时，底物逐渐被饱和，进一步提高酶的用量，底物不能完全反应或是底物浓度增大产生的反馈抑制作用，导致反应速率变化缓慢。使用高剂量的酶可以提高反应速率，但从经济角度考虑，酶的消耗费用随着转化速率的增加而增加，因此，选择酶的添加剂量分别为1mg/L、2mg/L和3mg/L来进行响应面优化。

④酶添加时间对葡萄糖氧化酶酶解作用的影响

鲜榨苹果汁，糖含量10.71g/100L，可滴定酸含量3.42g/L，pH 3.90，接种8％的酵母种子液，加入2mg/L的GOD，酶的添加时间分别为反应开始后0、12、24、36、48h，在21℃下，用200mL相同的鲜榨苹果汁样品进行试验。结果如图4。

由图4可知，GOD的添加时间不同，对葡萄糖的酶解作用有显著影响，在刚开始的48小时内葡萄糖氧化酶的催化活力达最大值，随后葡萄糖酸的催化活力明显降低。葡萄糖氧化酶和酵母构成葡萄糖的竞争抑制作用，与酵母同时添加GOD时，由于酵母接种到新环境需要有一定的适应期，此时，GOD会发挥其最大活力，快速将一部分葡萄糖转化成葡萄糖酸。如果发酵开始后添加GOD，一部分葡萄糖已经被酵母先利用，从而降低了葡萄糖的转化速率。因此，本试验选择将酵母与GOD同时加入苹果汁中。

(6)响应面优化试验

①根据单因素结果以及响应面设计原理，对利用葡萄糖氧化酶研制低醇葡萄酒的工艺进行优化。以可滴定酸含量为响应值，对影响发酵工艺的因素进行3因素3水平组合设计，对结果进行响应面分析，响应面设计因素水平见表1。

表1因素水平编码表

②响应面模型的建立与分析

根据上述单因素结果以及响应面设计原理，采用Design Expert V8.06，以主发酵结束后可滴定酸含量为响应值，对影响苹果酒发酵的3个因素每个因子设计3个水平进行组合设计，得到设计方案，并对设计结果进行响应面分析。

表2Box-Behnken设计方案及结果

表3回归模型方差分析表

注：*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示极显著。

各因素方差分析如表3。根据结果通过统计分析初步建立了苹果酒可滴定酸含量与各处理因素之间的归方程，其中X₁是发酵温度的编码值，X₂是pH的编码值，X₃是酶添加量的编码值：

Y = 5.34 + 0.23 X_{1} + 0.059 X_{2} + 0.15 X_{3} + 0.025 X_{1} X_{2} - 0.050 X_{1} X_{3} + 0.043 X_{2} X_{3} - 0.17 X_{1}^{2} + 0.037 X_{2}^{2} + 0.012 X_{3}^{2}

由表3可知，所建的二次模型是极显著的(p<0.01)，失拟项不显著，说明该模型拟合程度较好。模型的R²＝0.9894，说明该模型能解释98.94％的变化，与实际拟合良好，试验误差小，证明应用响应面法优化苹果酒的可滴定酸含量是可行的。

由表3还可以看出，A(发酵温度)、B(pH)、C(酶添加量)、AC、BC、A²为显著性影响因素。说明各影响因素对苹果酒可滴定酸含量的影响不是简单的线性关系。为了简化二次回归方程，剔除偏回归系数不显著的AB项、B²、C²项，可得到如下的回归方程：

Y = 5.36 + 0.23 X_{1} + 0.059 X_{2} + 0.14 X_{3} - 0.050 X_{1} X_{3} + 0.043 X_{2} X_{3} - 0.17 X_{1}^{2},

其方差分析如表4所示。

表4回归模型方差分析表

注：*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示极显著。

由表4可知，所建的二次方程模型是极显著的(p<0.01)，失拟项在p＝0.05水平不显著，说明该模型拟合程度较好。模型的R2＝0.9776，说明该模型能解释97.76％响应值的变化，与实际拟合良好，试验误差小，证明应用响应面法优化苹果酒的可滴定酸含量是可行的。

由表4还可以看出，A(发酵温度)、B(pH)、C(酶添加量)、AC、BC、A2为显著性影响因素。A(发酵温度)和C(酶添加量)、B(pH)和C(酶添加量)的交互项是显著的(p<0.05)，表明各参数对可滴定酸含量的影响不是简单的线性关系。

③响应面分析

响应面分析可以直观反映各因素对于响应值的交互作用。图5和6表示酶添加量和发酵温度对苹果酒可滴定酸含量的影响。当发酵温度一定时，可滴定酸含量随着酶添加量的增加而增加。这是因为随着酶用量的的增加，反应体系酶活增大，因而反应速率增大，转化的葡萄糖的含量就增加，因而可滴定酸含量就增加。当酶添加量一定时，随着温度的升高，可滴定酸含量也会增加。

图7和8表示酶添加量和果汁pH对苹果酒可滴定酸含量的影响。当pH一定时，可滴定酸含量随着酶添加量的增加而增加。

④验证

由Design Expert V8.06软件分析可知，最优的苹果酒发酵工艺条件为发酵温度22.90℃、苹果汁pH为4.65、GOD添加量为2.84mg。在此条件下，苹果酒可滴定酸含量的预测值为5.64498g/L。采用优化后的最佳工艺参数进行验证，在此条件下，得到的苹果酒的可滴定酸含量为5.66g/L，苹果酒的酒精度为6.35％(V/V)，比对照组酒精度9.25％(V/V)降低了2.9％。采用响应面法优化得到的苹果酒酿造工艺参数比较可靠，具有一定的实用价值。采用葡萄糖氧化酶可以有效的降低苹果酒酒精度。

(7)苹果酒基本理化指标测定

对苹果汁的基本理化指标进行了测定，结果如表5所示。

表5

	酒精度(°)	总糖(g/L)	总酸(g/L)	总多酚(g/L)	pH
						原酒	9.25	13.10	7.13	0.52	3.82
低醇酒	6.35	11.06	8.36	0.43	3.43

对经优化条件下制得的低醇苹果酒和未添加GOD的原酒(原酒是指未添加GOD，同时确保其他发酵条件均相同发酵得到的酒)进行理化指标测定，低醇苹果酒的各项理化指标均符合标准，酿制过程中产生的某些酸，可能会使酒体不协调，但通过苹果酸-乳酸发酵，可降低该酸度，使苹果酒更成熟，达到口感协调的效果。

(8)苹果酒风味物质分析

采用GC-MS检测加入葡萄糖氧化酶酒样和未加葡萄糖氧化酶酒样香气成分的对比，GC-MS总离子流程图见图9(原酒)和图10(低醇酒)，具体成分对比见表6。

表6苹果酒香气成分的GC-MS分析结果

根据表6可以看出，未添加葡萄糖氧化酶和添加葡萄糖氧化酶后的酒样主要挥发性香气成分的种类在数量上基本上不变，但挥发性香气成分的组成发生了变化，未添加葡萄糖氧化酶的酒样共检测到47种挥发性香气物质，共33.93mg/L，其中检测到酯类物质23种，总含量为18.672mg/L；检测到醇类物质14种，总含量为9.957mg/L；检测到酸类物质共7种，总含量为3.867mg/L；其他物质3种，总含量1.434mg/L。添加葡萄糖氧化酶的酒样共检测到45种挥发性香气成分，共30.909mg/L，其中检测到酯类物质21种，总含量为18.147mg/L；检测到醇类物质13种，总含量为9.787mg/L；检测到酸类物质共8种，总含量为2.856mg/L；其他物质3种，总含量0.119mg/L。与未添加葡萄糖氧化酶的酒样相比，添加葡萄糖氧化酶的酒样挥发性香气物质的总含量减少了3.021mg/L。添加葡萄糖氧化酶的酒样相较于未添加的酒样保留了33种香气成分，主要为酯类和醇类物质，其中乙酸乙酯富含强烈的酯香味、微带果香的酒香；丁酸乙酯富含优雅的、果香、香蕉味、菠萝味；乙酸异戊酯富含新鲜的果香、香蕉香味、香味；辛酸乙酯富含果香、芳香、菠萝香味、白兰地酒香味；癸酸乙酯富含甜的、坚果味、酵母味；异戊醇富含强烈的醇味、水果香味；正己醇富含水果香味；2-甲基丁醇富含酒香味、果香；苯乙醇富含强烈的醇味、玫瑰味、蜂蜜味。这些香气成分对于苹果酒香气结构的丰富性及多元性具有重要的贡献，利用葡萄糖氧化酶处理苹果汁的方法酿制的低醇苹果酒酒香浓郁，具有低醇苹果酒的风格。因此，利用葡萄糖氧化酶水解苹果汁中部分葡萄糖，生产低醇苹果酒的方法是可行的。生产的低醇苹果酒具有较高的感官品质：从色泽方面看，呈金黄色，澄清透明，有光泽；从香气方面看，香气协调、浓郁，没有异香；从滋味角度看，具有低醇苹果酒的典型性。

实施例1：

(1)取斜面保存的WLS21酿酒酵母于YPD平板培养基上进行划线培养，培养温度为24～30℃，培养时间为24h；

(2)液体培养：将经过24h活化的酵母菌种挑取两环接种到YPD液体培养基中，培养条件为：24～30℃，24h，120rpm；

(3)酵母菌种子培养液：吸取在YPD液体培养基中培养的种子液按8％的接种量加入装有400ml鲜榨苹果汁的500ml三角瓶中进行扩大培养得到发酵种子液，培养条件为：24～30℃，24h，120rpm，该实施例所用鲜榨苹果汁的可溶性固形物含量为10～13°Brix；

(4)低醇苹果酒的发酵：在500ml三角瓶中装入400ml鲜榨苹果汁，发酵温度22.90℃、调整苹果汁的pH为4.65，将活化好的酵母种子液和葡萄糖氧化酶在发酵前同时加入鲜榨苹果汁中，酵母种子液的添加量为8％，GOD的添加量为2.84mg，静置发酵，直至发酵液的可溶性固形物含量保持稳定，连续3天酒中的可溶性固形物不再下降即认为发酵结束。

该实施例得到的低醇苹果酒的可滴定酸含量为5.66g/L，苹果酒的酒精度为6.35％(V/V)。低醇苹果酒酒样共检测到45种挥发性香气成分，共30.909mg/L，其中检测到酯类物质21种，总含量为18.147mg/L；检测到醇类物质13种，总含量为9.787mg/L；检测到酸类物质共8种，总含量为2.856mg/L；其他物质3种，总含量0.119mg/L。低醇苹果酒具有较高的感官品质：从色泽方面看，呈金黄色，澄清透明，有光泽；从香气方面看，香气协调、浓郁，没有异香；从滋味角度看，具有低醇苹果酒的典型性。

Claims

1.一种低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，包括将酵母菌和葡萄糖氧化酶同时加入苹果汁中进行苹果酒的发酵酿制。

2.如权利要求1所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，以苹果汁的体积计，酵母菌种子液的接种量为8％，葡萄糖氧化酶的添加量为1～3mg/L；

3.如权利要求1或2所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，所述的发酵温度为18～24℃，苹果汁的pH为3.9～4.7。

4.如权利要求1所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，以苹果汁的体积计，酵母菌种子液的接种量为8％，葡萄糖氧化酶的添加量为2.84mg/L；

5.如权利要求4所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，所述的发酵温度为22.90℃，苹果汁的pH为4.65。

6.如权利要求1、2、4或5所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，所述的苹果汁的可溶性固形物含量为10～13°Brix。

7.如权利要求1、2、4或5所述的低醇苹果酒的制备方法，其特征在于，所述的苹果汁的制备包括：将苹果果肉在护色剂中浸泡15min后榨汁，榨汁后添加60～80mg/L的偏重亚硫酸钾和450mg/L的果胶酶进行酶解，酶解温度为45℃，酶解时间为2h，过滤得到澄清的苹果汁。