KR20070091648A - 오스테오프로테게린 변이체 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천연형 오스테오프로테게린에 비해 그것의 리간드인 TRAIL에 대한 결합 친화력 감소를 보이는 신규한 오스테오프로테게린 변이체 단백질(OVP)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 OVP를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, OVP를 발현하는 재조합 벡터 및 숙주 세포는 재조합 OVP 제조 방법에 포함된다. 또한, 본 발명은 이들 OVP를 포함하는 조성물과, 골 교체율 및/또는 소실 증가를 특징으로 하는 골 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 OVP는 골 재흡수를 예방하는데 유용하며, 골다공증, 고칼슘혈증, 골의 파제트 질환, 다발성 골수종, 골암 및 류마토스 관절염이나 골수염과 같은 골 소실과 같은 비정상적인 골 교체 또는 골 소실을 초래하는 모든 상태를 치료하는데 사용할 수 있다.

Description

오스테오프로테게린 변이체 단백질{OSTEOPROTEGERIN VARIANT PROTEINS}
본 발명은 RANK와 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 조절하는데 유용한 것으로 판명된 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 천연형 오스테오프로테게린에 비해 변화된 결합 특이성을 가지고 있는 신규한 오스테오프로테게린 변이체 단백질(OVP)에 관한 것이다. 또한, 상기 OVP를 코딩하는 핵산도 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 OVP를 발현하는 재조합 벡터 및 숙주 세포, 및 재조합 OVP를 생산하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 OVP를 포함하는 조성물, 및 RANK와 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용과 관련있는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
Rank 리간드(RANKL)/OPG/RANK 생화학적 축(axis)은 골다공증, 류마티스 관절염, 암 유발성 골절, 전이, 고칼슘혈증 및 통증을 치료하는데 성공적인 타겟이었다(Hofbauer et al., Cancer 92(3): p.460-470 (2001)). OPG(Honore et al., Nature Medicine 6(5):521-528 (2000)), RANKL에 대한 항체, 또는 가용성 RANK-Fc 단백질(Oyajobi et al., Cancer Res 61(6): p. 2572-8 (2001))을 이용하는 요법도 개발중에 있다. OPG 및 가용성 RANK-Fc 단백질 구조체는 RANKL에 결합하여, RANKL 리셉터 활성화에 이용가능한 RANK의 양을 감소시킨다.
RANKL는 골(bone) 생물학에서도 중요할 뿐만 아니라, 항원 특이적인 T 세포 반응을 조절함으로써 면역계에서도 기능을 수행한다(Anderson et al., Nature 390(6656):175-9 (1997)). RANKL은 활성화된 T 세포상에서 높은 수준으로 발현되며, RANK 리셉터는 성숙형 수지상 세포(DC)에서 높은 수준으로 발현된다. RANKL와 RANK간의 상호작용은 공동-자극 신호로 작용하며, DC 분화, 사이토카인 생산 및 DC 및 T 세포의 세포 자살 감소를 유발함으로써, DC의 생존과 T 세포 증식을 증진시킨다. RANK 길항제를 이용하여 공동-자극 신호(costimulatory signal)를 차단함으로써, 이식된 조직 및/또는 기관에 대한 면역 관용을 유도하는 면역요법을 달성할 수 있다. 공동-자극을 차단하면, DC에 의한 T 세포 활성화가 방지되며, 동종이계반응성(alloreactive) T 세포가 무반응성(anergic)으로 되거나 및/또는 세포자살이 진행되게 된다(Adler et al., Current Opinion in Immunology 14:660-665 (2002)). 유사한 작용 기전에 의해, RANK 시그널링에 대한 길항화는 전신 홍반성 루푸스, 염증성 장 질환, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염과 같은 자가면역 및 면역 매개성 염증 질환의 치료 방법일 수 있다.
오스테오프로테게린(OPG)은 종양 괴사 인자(TNF) 리셉터 패밀리에 속하는 단백질이며, Simonet et al. (Cell, 89, 309-319 (1997))이 최초로 언급하였다.
OPG는 자연적인 뼈 형성 및 교체(turnover) 현상을 조절하는 주된 요소인 것으로 보인다. 비정상적인 골 대사와 관련있는 다수의 증상들에서 OPG와 이의 표적 리셉터인 RANKL 사이의 균형 변화가 관찰되어 있다.
OPG는 골다공증, 류마티스 관절염, 파제트 질환, 치주질환, 혈관 질환 및 골 에 위치되어 있거나 골에 전이된 종양을 포함한, 골 교체율 증가 및 골 소실율 증가와 관련있는 다양한 상태들에 대한 적용 가능성에 대해, 전임상 및 임상 테스트를 거쳤다(검토안으로, Lorenz et al., J. Amer Med Assoc 292: 490-5(2004) 및 기재된 참고문헌 참조). 광범위한 OPG 동물 테스트가 문헌으로 보고되었으며, 이들 문헌에서는 골 소실을 감소시키기 위해 현재 사용되고있는 다른 치료제와 비교하여 성능이 동일하거나 또는 보다 우수한 것으로 시사되어 있다(Simonet et al., Cell, 89, 309-319 (1997); Bolon et al., Cell Mol Life Sci 59, 1569-76 (2002)). 또한, OPG가 골 암 관련 통증을 경감시키는 것으로 입증되었다(Luger et al., Cancer Research 61, 4038-4047 (2001)).
OPG는 US 6,015,938, US 6,284,740, US 6,284,728, US 6,613,544, US 6,316,408, US 6,288,032 및 US 6,369,027에 상세히 설명되어 있다. US 6,087,555에는 OPG 발현이 결핍된 형질전환 마우스가 개시되어 있다.
다발성 골수종 환자와 골다공증 환자를 대상으로, OPG의 골 교체율 감소에 대한 1상 시험이 진행되었다. 골다공증을 겪고 있는 폐경기 이후의 여성 환자에 대한 1상/2상 예비 연구를 통해, OPG 1회 주사로 수일간 골 교체 마커를 30-80% 정도 억제가능하다는 것이 확인되었다(Bekker et al., J. Bone Miner Res 16, 348-360 (2001)). 다발성 골수종 환자에게 OPG를 투여량 범위로 처리한 결과, 30일 또는 그 이상의 기간동안 골 흡수율이 최대 50%까지 감소하는 것으로 확인되었다(Body et al., Cancer 97, 887-892 (2003)). 즉, 전임상 연구 및 임상 연구들에서, OPG가 비정상적인 골 대사를 특징으로 하는 다양한 상태에 매우 효과적인 치료 제임이 틀림없다는 것이 확실하게 입증되었다.
종양 괴사 인자(TNF) 패밀리의 사이토카인과 이의 수용체에는 상당 수의 구성원(member)이 있으며, 리간드-리셉터 상호작용에서 이들 구성원들간에 실질적인 교차 반응성이 있다(검토문헌으로, Igney, F.H. and Krammer, P.H Nature Reviews Cancer 2, 277-288 (2002)을 참조함). TNF 리셉터는 일반적으로 전사인자 NFκB의 활성화를 통해 세포자살(프로그래밍된 세포 사멸) 또는 세포 대사 경로에 대한 작용 중 한가지 반응을 촉발시킨다. 또한, 상기 리셉터 패밀리는 유인체로 작용하는 구성원을 함유하고 있어, 다른 패밀리의 리간드-리셉터 쌍간의 상호작용 효과를 감소시킨다. OPG는 이러한 리셉터 클래스에 속하는 것으로 보인다.
많은 수의 TNF 리셉터 패밀리 구성원들에 비해, OPG는 비교적 그것의 표적 특이성이 제한되어 있다. 현재 공지된 바에 따르면, OPG는 오직 TNF형 리간드 2종에만 결합한다:
1. RANKL(NFκB의 리셉터 활성자), TNF형 세포 표면 분자는 정상적으로 TNF 리셉터 패밀리 구성원인 RANK와 상호작용하며, 이는 파골세포 전구체, 수지 세포, T 세포 및 조혈 전구체에서 발현된다(Kong et al., Nature 397:315-323 (1999). RANKL은 세포 표면상의 RANK와 상호작용하여, 골 교체에 관여하는 기본 세포인 파골세포의 생성 및 활성을 자극한다(Hsu, H et al., Proc Natl Acad Sci USA 96, 3540-3545 (1999)). RANKL은 기질 세포(stromal cell)/골모세포 상에서 발현된다(Kong et al., Nature 397:315-323 (1999)). OPG와 RANKL의 상호작용은 RANKL이 RANK에 접촉하여 파골 세포를 자극하는 능력을 저해하며, 이러한 능력을 부여하는 OPG의 활성은 골 소실을 감소시킨다(Lacey et al., Amer J Pathol 157, 435-448 (2000); Simonet et al., Cell, 89, 309-319 (1997)). RANKL에 결합하는 이량성 OPG의 결합 상수는 6.7nM로 보고되었으며(Willard et al., Protein Expr. Purif 20, 48-57 (2000)), 2 내지 10nM의 결합 상수를 보고한 다른 문헌도 있다.
2. TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand), TNF형 세포 표면 분자는 암 세포에서 세포자살 유도에 관여한다. OPG는 TRAIL에 대한 소수의 유인체 리셉터들중 하나로서, 암 세포를 타겟으로 하는 그것의 능력을 조절는 작용을 한다(Igney and Krammer (2002)). 따라서, OPG는 해당 부위에 충분한 함량으로 존재하는 경우에 암세포의 생존율을 증강시키는 것으로 예상되며, 종양 세포의 생존율을 증가시키는 그것의 능력이 입증되었다(예, Neville-Webbe et al., Breast Cancer Res Treat. 86, 271-82 (2004); Holen I et al., Cancer Res 62, 1619-1623 (2002)). 온도에 따라 달라지지만(Truneh et al., J. Biol Chem. 275, 23319-25 (2000)), TRAIL에 대한 OPG의 친화력은 3nM인 것으로 보고되었다(Emery et al., J. Biol Chem. 273, 14363-7 (1998)).
TRAIL 활성을 저해하는 OPG의 암 발생 위험성을 증가시킬 수 있는 가능성으로 인해, 이러한 물질을 치료제로 사용할 수 없는 것으로 의학 문헌에 언급되어 있다. 골 소실을 저해하는 물질의 적용 분야는 자신의 생명에 위협이 되지 않으면서 장기간의 치료가 요구되는 골다공증 및 파제트 질환과 같은 상태이다. 더욱이, OPG의 가장 중요한 잠재적인 용도 중 한가지는 골 전이가 일어난 암 환자에 대한 보조 치료제로서 이용하는 것이다. 이러한 잠재적인 적용 분야에서, 치료로 인한 암 세포의 증식 및 생존 증가 현상은 이의 사용을 단념시킨다. 그러므로, TRAIL에 대한 결합력이 실질적으로 결핍되어 있는 신규한 OPG 변이체 개발이 필요한 실정이다. 이러한 변이체는 파골세포의 형성과 활성을 자극하여 궁극적으로 골 소실을 자극하는 RANK/RANKL 상호작용을 방해하는 능력은 유지하고 있지만, 항암 기전을 현저하게 방해하는 본래의 능력은 결핍된 것이다.
발명의 개요
본 발명은 TRAIL에 대해 감소된 결합 친화성을 가지며 TRAIL과 그 리셉터간의 상호작용으로부터 초래되는 정상적인 생물학적 작용을 저해하는 능력이 감소된, 신규한 OPG 변이체 단백질(OVP)를 제조하였다.
본 발명의 OVP 분석을 통해, 천연형 OPG 단백질 서열의 특정 부위에 점 돌연변이가 집중적으로 발생되어 있음이 확인되었다. 특히, 상기 돌연변이는 OPG의 잔기 102-130번이 포함된 부위에 밀집되어 있다. 본 발명의 OVP에 대해 수행된 모델 연구를 통해, OPG/OVP 부위가 결합중에 TRAIL 및 RANKL 단백질 둘다와 인터페이스를 형성한다는 사상이 뒷받침되고 있다. 따라서, RANKL 부착에 영향을 미치지 않으면서 TRAIL에 대한 결합 친화성을 실질적으로 변화시킬 수 있는 이러한 부위에서의 돌연변이 확인은 놀라운 일이다.
중요한 것은, 본 발명의 OVP는 RANKL에 결합하는 능력과 RANK-RANKL 상호작용 및 이러한 상호작용으로 발생되는 생물학적인 작용을 감소 또는 저해시키는 능력을 유지한다는 것이다. 본 발명의 바람직한 OVP는 TRAIL의 작용 저해를 통해 암세포의 생존을 증강시키는 바람직하지 않은 효과를 가지지 않으면서, 골 대사를 조절하는 천연형 OPG의 능력을 유지할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 천연형 OPG와 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하는 OPG 변이체 단백질을 제공하며, 상기 OPG 변이체 단백질은 RANKL에 대한 결합 친화성을 유지하지만 천연형 OPG에 비해 TRAIL에 대한 결합 친화성은 감소되어 있다.
본 발명의 OPG 변이체는 절단형 또는 전장형의, 단량체 또는 이량체 형태이며, 단백질 변형으로 인해 TRAIL에 대한 부착성이 현저하게 감소되었지만 RANKL에 대한 부착성은 실질적으로 유지된, 임의의 OPG 변이체 단백질을 포함한다. OVP 활성과 천연형 OPG 활성 비교는, 크기 및 이합체 상태(dimerisation state) 측면에서 유사한 형태의 단백질을 기초로 이루질 것으로 이해될 것이다.
바람직한 예로, OPG 변이체 단백질은 아미노산 잔기 102-130을 포함하는 부위에 하나 이상의 변형을 포함한다. 예로, OPG 변이체 단백질은 잔기 102, 111, 115, 122, 128 또는 130번 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 이합체화를 유도하거나, 안정성, 발현 또는 생물학적인 반감기를 유지하거나 개선시키기 위해 변형된 OVP 단백질을 제공한다. 이러한 변형은 알부민 모이어티의 부가, Fc 부위 또는 폴리에틸렌 글리콜으로의 치환, 또는 이량체 형태로 OVP를 유지시키도록 작용하는 연장(extention)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 OPG 변이체 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하기로는, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 변이체이며, 상기 변이체는 본 발명의 원하는 OPG 변이체 단백질을 코딩하도록 핵산 변화를 포함한다. 이러산 핵산 변화를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 본원에 개시되어 있다.
또한, 코딩된 단백질이 동일한 생물 활성 범위를 유지하는 서열 변이체를 제공한다. 뉴클레오티드 서열은 변이되어, 하나 이상의 발현 시스템에서 코딩된 단백질의 발현을 개선시키거나, RNA 안정성을 증가시키거나 또는 우연히 핵산 또는 코딩 단백질의 생물학적 기능이 없어지지 않는 변화를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 복제 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합하다. 벡터는 예컨대 복제 기원 및 바람직하기로는 폴리뉴클레오티드 발현용 프로모터 및 선택적으로 프로모터 조절자가 있는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선별 마커, 예컨대 세균성 플라스미드의 경우 암피실린 내성 유전자 또는 포유류 발현 벡터를 위한 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 예컨대 RNA 생산 또는 숙주 세포 형질감염 또는 형질전환에 시험관내에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상 단백질의 발현 및 생성을 허용하는 조건하에서, 본 발명에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 본 발명의 단백질들 중 하나를 코딩하는 유전자를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 OPG 변이체 단백질 생산을 허용하는 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 OPG 변이체 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 OPG 변이체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 코딩된 OPG 변이체 단백질을 상업적으로 유용한 함량으로 생산하는데 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 OPG 단백질 또는 그의 단편내 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 생산하는 단계 및 상기 OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화성을 테스트하는 단계를 포함하는, OPG의 TRAIL 결합 친화성을 감소시키는 방법을 제공한다.
바람직한 일 예에서, 상기 방법은 천연형 OPG의 102-130 잔기를 포함하는 부위에서 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 제조하는 단계 및 상기 OPG 변이체 단백질의 TRAIL 결합 친화성을 테스트하는 단계를 포함한다.
본 발명의 OVP를 사용하여 생체내 RANK의 RANKL 결합을 감소 또는 저해시키거나, 또는 RANK와 RANKL간의 상호작용 및 상기 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 감소 또는 저해할 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는, RANK의 RANKL 결합성을 저해 또는 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 OPG 변이체 단백질, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 가용화제, 안정화제 및 항산화제를 포함하는, 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 RANKL 분자를 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANK과 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 RANK과 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
"대상자"는 본원에서 인간 및 그외 동물, 특히 본원에서 제시된 바와 같이 포유류를 의미하며, 인간이 바람직하다.
또한, 본 발명은 파골세포 또는 파골세포 전구세포를 함유하는 조직을 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 환자에게 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 명세서 전반에 거쳐, 용어 "포함한다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 요소, 정수 또는 단계나 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하며, 그외 다른 요소, 정수 또는 단계나 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
본원에서 각각의 섹션에 언급되어 있는 본 발명의 다양한 구성 및 구현예는 또한 다른 섹션에 적절하게 적용된다. 따라서, 본 발명의 한가지 구현예와 관련하여 명시된 구성은 적절하게 다른 구현예와 관련되어 명시된 구성과 조합될 수 있다.
발명의 상세한 설명
일반적인 기술
별다른 언급이 없는 경우, 본원에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 당업자(세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 혼성화기법, 화학 및 생화학)가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다.
별다른 언급이 없는 경우, 본 발명에서 이용되는 재조합 DNA 기법은 당업계에 잘 알려져 있는 표준적인 방법이다. 이러한 방법은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), 및 F.M. Ausubel et al. (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present)과 같은 문헌에 개시 및 설명되어 있다.
오스테오프로테게린(OPG)
OPG는 골 대사와 관련있는 활성, 특히 골 재흡수를 저해하여 골 밀도를 증가시키는 활성을 가지는, TNF 리셉터 슈퍼패밀리의 구성원이다. 특히, OPG와 RANKL의 상호작용은 RANK과의 상호작용을 통해 파골세포 형성 및 활성을 자극하는 RANKL 능력을 저해하는데, 이러한 OPG 활성이 골 소실을 감소시키는 능력을 부여한다.
또한, OPG의 생물학적인 활성은 TRAIL과의 결합과 관련된 활성을 포함한다. TRAIL(TNF 관련 세포자살 유도 리간드)는 암 세포의 세포자살 유도에 참여하는 TNF형 세포 표면 분자이다. OPG는 암 세포를 표적화하는 그 능력을 조절하도록 작용하는, TRAIL에 대한 소수의 유인 리셉터들중 하나인 것으로 보인다. OPG는 따라서 충분한 함량으로 관련부위에 존재되는 경우 암세포의 생존을 증강시키는 원하지 않는 효과를 가질 것으로 예상된다.
다양한 OPG 활성 단편들이 개시되어 있다. Yamaguchi et al.(J. Biol Chem. 273, 5117-5123 (1998))는 OPG 잘린 및 결손 변이체에 OPG 유사 활성이 남아있으며, 단량체 또는 이량체 형태의 OPG 모두에 생물학적 활성이 유지되고 있는 것으로 언급하였다(Tomoyasu, A et al., Biochem Biophys Res Commun 245, 382-387 (1998)). Schneeweis et al.,(J. Biol. Chem. Oct 7 2005 (epub))는 RANKL에 대한 OPG의 조합, 상태 및 친화성을 조사하였다. 이들은, 사멸 도메인 부위내 비공유 상호작용에 의해 이량화가 매개된 전장 형태의, 또는 Fc 부착에 의해 이량화가 매개될 수 있는 잘린 형태의, OPG 이량화가 RANKL에 OPG 고친화성 부착에 필요하다고, 보고하였다.
천연형 인간, 랫 및 마우스 오스테오프로테게린의 아미노산 서열을 각각 서열번호 2 내지 4로 나타낸다.
또한, 천연형 OPG 서열은 제거된 21개의 아미노 말단 리더 서열을 가지는 것 및/또는 C-말단에서 아미노산 185번까지 제거되어 있으며 아미노산 185를 포함하는 것을, 포함한다.
OPG 변이체 단백질
본원에서, "단백질"은 공유 부착된 2개 이상의 아미노산을 의미하며, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함한다. 단백질은 천연 아미노산 및 펩티드 결합으로 구성될 수 있으며, 또는 일반적으로 합성 방법에 따라, 합성 펩티드모방 구조체, 즉 펩티드류와 같은 "유사체"일 수 있다(Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 89(20:9367-71 (1992)). 예컨대, 호모-페닐알라닌, 시트룰린 및 노르루신(noreleucine)은 본 발명의 목적에 있어 아미노산으로 간주된다. 또한, "아미노산"은 프롤린 및 하이드록시프롤린과 같은 이미노산 잔기를 포함한다. D- 및 L-아미노산 모두 이용될 수도 있다.
본 발명자들은 TRAIL에 대한 결합 친화성 감소가 확인된 새로운 OPG 변이체 단백질(OVP)를 제조하였다. 중요한 점은, 본 발명의 OVP가 RANKL에 결합하는 능력을 유지한다는 것이다. 따라서, 본 발명의 OVP는 골 대사를 조절하는 천연 OPG 능력을 유지하지만, 암 세포의 생존을 증강시키는 원하지 않는 TRAIL 관련 특성은 없을 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명은 천연형 OPG와 비교하여 하나 이상의 변형을 포함하는 OPG 변이체 단백질을 제공하며, 상기 OPG 변이체 단백질은 RANKL에 대한 결합 친화성은 유지하지만, 천연형 OPG와 비교하여 TRAIL에 대해서는 낮은 결합 친화성을 보인다.
"RANKL에 대한 결합 친화성을 유지한다"는, OPG 변이체 단백질이 천연형 OPG와 비교하여 20% 이상의 RANKL 결합 친화성을 보임을 의미한다.
천연형 OPG는 임의의 종, 바람직하게는 포유류 종으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 예에서, 천연형 OPG는 일반적인 인간 OPG 단백질이다. 더 바람직하게는, 천연형 OPG는 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.
본 발명의 OPG 변이체 단백질은 바람직하기로는 천연형 OPG의 한가지 이상의 생물학적인 활성을 가진다.
일 예에서, 천연형 OPG의 생물학적인 활성은 골 대사에 관한 것이며, 특히 RANKL에 의한 파골세포의 자극 및/또는 활성을 저해 또는 감소시키는 능력에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 골 밀도 또는 비정상적인 골 교체율 감소와 관련있는 질환을 예방하는 능력을 유지한다.
다른 예에서. 천연형 OPG의 생물학적인 활성은 T 세포 활성, 특히 T 세포 활성화를 감소 또는 저해하는 능력에 관한 것이다. 바람직하기로는, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 전신성 홍반성 루푸스, 염증성 대장 질환, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염과 같은, 자가면역 질환에 대한 유용한 치료제이다.
다른 예에서, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 심혈관 질환 치료, 혈관 및 판막의 석회화 예방 또는 감소, 또는 혈관 증식 증강에 유용하다.
일 예에서, OPG 변이체 단백질은 전장의 천연형 OPG 서열의 변형된 형태이다. 다른 예로, OPG 변이체 단백질은 N-말단, C- 말단 또는 내부에 하나 이상의 부가적인 삽입 또는 결손을 함유한다. 예를 들면, OPG 변이체 단백질은 OPG의 임의의 변형된 활성 단편으로 구성될 수 있다. 상기 활성 단편은 예컨대 아미노산 22-294, 아미노산 22-201, 22-194 또는 아미노산 1-197로 구성될 수 있다.
바람직한 예에서, OPG 변이체 단백질은 천연형 OPG 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하며, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 상이한 잔기를 포함하는 것이 더 바람직하다. 변형은 아미노산 치환이 바람직하며, OPG의 표면 또는 노출된 부위에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. OPG 변이체 단백질은 링커 서열에 의해 연결된 하나의 도메인 또는 다수개의 도메인을 포함할 수 있다. OPG 변이체 단백질은 추가적인 변형, 예컨대, PEG화 또는 당화와 같은 번역후 수정을 실현할 수 있거나 또는 안정성이나 면역원성을 변형시키는 수정을 포함할 수 있다.
바람직한 예에 있어서, OPG 변이체 단백질은 아미노산 잔기 102-130번을 포함하는 부위내 하나 이상의 변형을 포함한다. 예컨대, OPG 변이체 단백질은 잔기 102, 111, 115, 122, 128 또는 130번 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
바람직한 일예에서, OPG 변이체 단백질은 잔기 107-118번을 포함하는 루프 구조내에 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히 바람직한 예에서, 상기 부위내 변형은 잔기 115번 Ile의 치환이다. 115번 위치의 Ile는 좀 더 극성인 아미노산으로 치환되거나 또는 보다 짧은 측쇄를 가지는 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하기로는, 115번 위치의 Ile은 Thr, Met, Val, Asp, Gly, Ser 또는 Arg로 치환된다. 따라서, 바람직한 변형은 I115T, I115M, I115V, I115D, I115G, I115S 및 I115R을 포함한다.
바람직한 일예에서, OPG 변이체 단백질은 아미노산 잔기 120-130번을 포함하는 부위내에 하나 이상의 변형을 포함한다. 바람직한 다른 예에서, 변형은 122번 위치 Arg의 치환이 있다. 바람직하기로는, 122번 위치의 Arg는 Gly, Gln, Ser, Asn 또는 Glu로 치환된다. 따라서, 바람직한 변형은 R122G, R122Q, R122S, R122N 및 R122E를 포함한다.
또다른 특히 바람직한 예에서, 변형은 잔기 128번 위치에서의 Phe 치환을 포함한다. 바람직하기로는, 128번 위치의 Phe는 Val, Ala, Leu, Ile 또는 Ser로 치환된다. 따라서, 바람직한 변형은 F128V, F128A, F128L, F128I 및 F128S를 포함한다.
또다른 바람직한 예에서, 변형은 130번 위치 Val의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 130번 위치의 Val은 Glu 또는 Ala로 치환된다.
더 바람직한 예로, OPG 변이체 단백질은 2개 이상의 변형을 포함한다.
2 이상의 변형은 모두 잔기 102-130번을 포함하는 부위에서 발생할 수 있다. 예컨대, 2 이상의 변형은 잔기 115번 및 122번 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 상기 부위에서의 적합한 이중 변형의 예는, R122N 및 I115M; R122N 및 I115M; F128S 및 I115M; F128I 및 I115M; 및 F128L 및 I115M이다.
대안적으로, 2 이상의 변형은 아미노산 잔기 102-130번을 포함하는 부위내의 하나 이상의 변형과 상기 부위 이외에서의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
상기 부위 이외에서의 변형은 예컨대 잔기 31, 40, 51, 100, 155, 167 또는 168번 중에서 임의의 한 곳 이상에서 이루어질 수 있다. 바람직한 일 예로, 변형은 잔기 40번에서 이루어진다. 바람직하기로는, 변형은 40번 위치의 Leu의 Ser로의 치환을 포함한다.
다른 예에서, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 아미노산 잔기 102-130번을 포함하는 부위내 하나 이상의 변형과, 하기 아미노산 잔기들 중 임의의 하나 이상의 변형을 포함한다: Gln21, Glu22, Thr23, Phe24, Pro25, Pro26, Lys27, Tyr28, Leu29, His30, Tyr31, Asp32, Glu33, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Gln38, Asp42, Lys43, Pro45, Pro46, Thr48, Lys51, Gln52, His53, Cys54, Thr55, Ala56, Lys57, Trp58, Lys59, Thr60, Val61, Ala63, Pro64, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Asp72, Ser73, Trp74, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Leu81, Tyr82, Ser84, Pro85, Val86, Lys88, Glu89, Leu90, Tyr92, Val93, Lys94, Gln95, Glu96, Asn98, Arg99, Thr100, His101, Val131, Gln132, Ala133, Gly134, Thr135, Pro136, Glu137, Arg138, Val141, Lys143, Arg144, Cys145, Pro146, Asp147, Gly148, Phe149, Phe150, Ser151, Asn152, Glu153, Thr154, Ser155, Ser156, Lys157, Ala158, Pro159, Cys160, Arg161, Lys162, His163, Thr164, Asn165, Cys166, Ser167, Val168, Phe169, Gly170, Leu171, Leu172, Leu173, Thr174, Gln175, Lys176, Gly177, Asn178, Ala179, Thr180, His181, Asp182, Asn183, Ile184, Cys185, Ser186, Gly187, Asn188, Ser189, Glu190, Ser191, Thr192, Gln193, Lys194, Cys195, Gly196, Ile197, Asp198, Val199, Thr200 및 Leu201.
다른 예로, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 아미노산 잔기 102-130번을 포함하는 부위내 하나 이상의 변형과, 하기 아미노산 잔기들중 임의의 하나에서의 변형을 포함한다: Tyr28, His30, Tyr31, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Lys43, Tyr49, Gln52, His53, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Tyr70, Thr71, Asp72, Ser73, Trp74, His75, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Cys80, Leu81, Tyr82, Cys83, Ser84, Pro85, Val86, Cys87, Lys88, Glu89, Leu90, Gln91, Asn139 및 Glu153.
또한, 본 발명은 잔기 40번의 변형을 포함하는, RANKL에 대한 결합 친화성을 유지하지만 천연형 OPG와 비교하여 TRAIL에 대해선 낮은 결합 친화성을 보이는, OPG 변이체 단백질을 제공한다. 바람직하기로는, 변형은 40번 위치의 Leu의 Ser로의 치환을 포함한다.
본 발명의 OPG 변이체 단백질은 표 1에 나타낸 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
더 바람직한 예에서, OPG 변이체 단백질은 서열번호 5 내지 47중 임의의 하나로 나타낸 서열을 포함한다.
본 발명의 더 바람직한 예에서, OVP는 천연형 OPG의 RANKL에 대한 결합 친환성의 50% 이상, 더 바람직하기로는 60% 이상, 더 바람직하기로는 70% 이상, 더 바람직하기로는 80% 이상, 더 바람직하기로는 90% 이상, 및 더 바람직하기로는 95% 이상의, RANKL에 대한 결합 친화성을 가진다.
일 예로, OVP는 천연형 OPG에 비해 RANKL에 대해 증가된 결합 친화성을 보인다.
더 바람직한 예에서, OVP의 RANKL 부착 EC50(nM)은 5 nM 미만, 더 바람직하기로는 1 nM 미만이다.
본 발명의 더 바람직한 예로, OVP의 TRAIL에 대한 결합 친화성은 천연형 OPG에 대비 50% 미만, 더 바람직하기로는 40% 미만, 더 바람직하기로는 30% 미만, 더 바람직하기로는 20% 미만, 더 바람직하기로는 10% 미만, 및 더 바람직하기로는 5% 미만이다.
더 바람직한 예로, 실시예 8에 기재된 분석 조건에서의, OVP의 TRAIL 부착 EC50(nM)은 5 nM 보다 높으며, 더 바람직하기로는 10 nM 보다 높으며, 더 바람직하기로는 25 nM 보다 높으며, 더 바람직하기로는 50 nM 보다 높다.
또한, 본 발명은, OPG의 아미노산 잔기들 195-401 또는 198-401 모두 또는 일부가 결손된 것, 또는 상기 195-401이나 198-401 모두나 일부에 카르복시 말단이 절단된 것; 잔기 195-401 또는 198-401에서의 하나 이상의 아미노산 변화; 시스테인이 다량 함유된 OPG 도메인의 일부 또는 전체 결손, 특히 말단(카르복시 말단) 시스테인이 다량 함유된 도메인의 결손; 및 시스테인이 다량 함유된 도메인내 하나 이상의 아미노산 변화, 특히 시스테인이 다량 함유된 말단(카르복시 말단) 도메인내 하나 이상의 아미노산 변화가 있는 OPG 변이체 단백질을 포함한다.
일반적으로 약 1 내지 30개, 더 바람직하기로는 약 1 내지 10개의 잔기, 및 전형적으로 약 1 내지 5개의 연속된 아미노산 서열 결손이 바람직하다.
돌연변이유발 부위를 나타내기 위해 본원에서 사용한 아미노산 번호 부여는 서열번호 1 및 2에 나타낸 인간 OPG 서열의 번호 부여와 관련있음을 이해할 수 있을 것이다. 동족체, 유사체 및 대립유전자 변이체의 해당 부위 역시 본 발명에 포함된다.
용어 "해당"은 본 발명에서 서열번호 1 및 2와 관련있는(예컨대, 서열번호 1 및 2와 70% 이상 동일한, 80% 이상 동일한, 90% 이상 동일한 또는 95% 이상 동일한) OPG 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내기 위해 사용되지만, 관련 폴리펩티드의 대응 잔기의 번호 부여는 서열번호 1 및 2의 번호 부여와 상이할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열에 부가적인 보존적인 치환이 포함된 본 발명의 OPG 변이체 단백질을 포함한다. 이러한 보존적인 치환은 다음과 같다:
원 잔기 치환 예
Ala (A) val; leu; ile; gly
Arg (R) lys
Asn (N) gln; his;
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gln (Q) asn; his
Glu (E) asp
Gly (G) pro, ala
His (H) asn; gln
Ile (I) leu; val; ala
Leu (L) ile; val; met; ala; phe
Lys (K) arg
Met (M) leu; phe;
Phe (F) leu; val; ala
Pro (P) gly
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr
Tyr (Y) trp; phe
Val (V) ile; leu; met; phe, ala
또한, 선택적으로, 본 발명의 폴리펩티드에 치환 또는 부가로서, 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체 화합물을 도입할 수 있다. 이러한 아미노산으로는, 일반적으로, 일반적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥사노익산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테익산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 플루오로-아미노산, 베타-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드의 안정성 및 순환시간 증가, 또는 면역원성 감소와 같은 부가적인 이점을 제공할 수 있는 OPG 변이체 단백질의 화학적으로 변형된 유사체를 제공한다(미국 4,179,337). 유도체화를 위한 화학적 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등과 같은 수용성 폴리머들로부터 선택할 수 있다. 또한, 본 발명은 바이오틴화, 벤질화, 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단 등에 의한, 합성 중에 또는 합성 이후에 차별적으로 변형된 OVP를 포함한다. 폴리펩티드의 분자내 무작위 위치에 또는 분자내 미리 결정된 위치가 변형될 수 있으며, 1, 2, 3 또는 그 이상의 부착된 화학적인 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 변형을 제공하여 본 발명의 폴리펩티드의 안정성 및/또는 생활성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 포함된 OPG 변이체 단백질의 추가적인 변형은, 번역후 수정(예, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 체인, N-말단 또는 C-말단의 처리), N- 또는 O- 연결된 탄수화물 체인의 화학적 변형 및 원핵 숙주 세포의 발현 결과로서 N-말단의 메티오닌 잔기의 부가를 포함한다. 또한, OVP는 검출가능한 표지물질, 예컨대 효소, 플루오레센트, 방사성동위원소 또는 친화성 표지물질로 변형하여, 단백질의 검출 및 분해를 가능하게 할 수 있다.
OPG 변이체 단백질의 다른 변형은 OPG 변이체 단백질이 이종의 아미노산 서열에 융합된 키메라 단백질을 포함한다. 상기 이종 서열은 제조되는 융합 단백질이 OPG 변이체 단백질의 활성을 적어도 유지하도록 하는 임의의 서열일 수 있다. 이종 서열은 예컨대, Fc 융합과 같은 면역글로불린 융합, 또는 단백질의 안정성을 증가시키거나 정제를 보조할 수 있는 다른 세포성 리간드와의 융합이 있다.
일 예로, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 이량체 분자 또는 올리고머성 단쇄 분자로서 생산되며, 2, 3 또는 가능하게는 그 이상의 단량체를 가질 수 있다.
단량체는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커, 또는 예컨대 PEG 분자의 수단에 의해 연결될 수 있다.
또한, Ig 감마 1의 Fc-부분(GenPept accession No. M87789.1)을 가진 용합 단백질로서 화합물을 생산함으로써, 이량체화를 실현시킬 수 있다. 분자는 C-말단의 Fc-파트 또는 N-말단의 Fc 파트를 가진, 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다.
또한, 이량체화는 융합 단백질의 이량체화를 유도하는 것으로 보고된, GCN4 루신 지퍼에 후보 산물을 용합시킴으로써 이룰 수 있다(Donate, et al., Biochemistry, 39 11467-76 (2000)).
대안적으로, 이량성 분자는 마지막 5개의 아미노산 잔기들 중 하나, 또는 대안적으로 처음 5개의 아미노산 잔기들중의 하나를 시스테인 잔기로 돌연변이유발함으로써, 제조할 수 있다. 정제한 화합물의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 이후 기존의 티올 반응성 부착기를 이용함으로써 "두가지 활성의(di-active)" PEG기에 부착시킬 수 있다. 대안적으로, 이량체 분자는 2개의 후보 분자(동일하거나 심지어 상이한)를 유연한 적정 폴리펩티드 링커를 이용하여 적합한 발현 벡터에 플래임내로(in-frame) 삽입함으로써 제조할 수 있다.
OPG 변이체 단백질의 또다른 변형은, OPG 변이체 단백질의 단량체 단위가 화학적으로 또는 유전자적으로 펩티드 또는 화학 링커를 포함할 수 있는 적정 링커 분자나 또는 시스테인 잔기간의 이황화 연결에 의해 함께 연결될 수 있는, 이량체 또는 다량체를 포함한다. 부가적으로, 대상 단백질의 이량체 또는 다량체는 OPG가 융합된 단백질, 예컨대 Fc 부위 사이를 연결함으로써, 성취할 수 있다.
본 발명의 OPG 변이체 단백질은 바람직하게는 조직, 세포주 및 형질전환된 OVP 발현 숙주 세포에 존재하는 다른 폴리펩티드에서 분리 및 정제하거나, 또는 분비된 단백질을 포함하고 있는 세포 배양물내 성분들로부터 정제한다. 일 예로, OVP는 세균성 숙주 세포의 발현 산물과 같이, 다른 단백질과 조합된 상태에서 벗어나 있다.
본 발명의 OPG 변이체 단백질은 당업계에 공지된 임의 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예로, 서열번호 1로서 제공된 폴리뉴클레오티드는 시험관내 돌연변이 유발에 적용할 수 있다. 이러한 시험관내 돌연변이 유발 기법은 적정 벡터에 폴리뉴클레오티드를 서브클로닝하는 단계, 벡터를 E. coli XL-1 red(Stratagene)와 같은 "돌연변이 유발 유전자(mutator)" 균주에 형질전환시키는 단계, 및 적정 세대수로 상기 형질전환된 세균을 증식시키는 단계를 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Harayama (1998)에 폭넓게 개시된 바와 같이 DNA 셔플링 기법(DNA shuffling technique)에 적용시킨다. 돌연변이된/변이된 DNA로부터 유래된 단백질 산물은, 이들이 증강된 및/또는 변이된 기질 특이성을 가지는 지를 결정하기 위해 본원에 개시된 기법으로 이용하여 쉽게 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 돌연변이는 적정 뉴클레오티드 변화를 핵산 서열에 도입하거나, 또는 원하는 폴리펩티드를 시험관내에서 합성함으로써 제조할 수 있다. 예컨대, 이러한 돌연변이는, 아미노산 서열내 잔기의 결손, 삽입 또는 치환이 있다. 결손, 삽입 및 치환을 조합하여, 최종 단백질 산물이 원하는 특징들을 보유하는 최종 구조체를 이룰 수 있다.
치환 돌연변이는 제거된 천연형 OPG 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기와 그 위치에 삽입된 다른 잔기를 가진다. 치환 돌연변이에서 가장 중요한 위치는 하기 예시된 위치를 포함한다. 돌연변이 부위는, (1) 보존적인 아미노산을 선택하여 치환한 다음 나타난 결과에 따라 보다 많은 급진적인 옵션으로 치환하거나, (2) 타겟 잔기를 제거하거나, 또는 (3) 상기 위치 옆에 다른 잔기를 삽입함으로써, 개별적으로 또는 연속적으로 변형시킬 수 있다.
대안적으로, OPG 변이체 단백질은 세포 결핍성 시험관내 발생 돌연변이유발 시스템(cell-free in vitro evolution mutagenesis system)을 이용하여 제조할 수 있다. 세포 결핍성 시험관내 발생 시스템의 일 예로, WO 99/58661 또는 WO 2004/039995에 개시된 것과 유사한 시스템이 이용된다.
세포 결핍성 시험관내 발생 방법은, 돌연변이 유발원(QB 레플리카제, 리바비린 또는 이의 유사체/유도체)의 존재에서 중합효소의 작용에 의해 직접 또는 간접적으로 생성된 OPG 돌연변이 RNA 분자를, 돌연변이 단백질 집단을 만드는 조건에 번역 시스템에 노출시키는 단계를 포함한다. 이들 OPG 돌연변이 단백질은 이들이 번역되는 RNA에 연결되어, 돌연변이 단백질/RNA 컴플렉스 집단을 형성하게 된다. 돌연변이 OPG 단백질/RNA 복합체 집단은 TRAIL에는 결합하지 않으면서 RANKL에만 결합하는 것과 같은, 원하는 생물학적 활성에 대해 스크리닝한다. 원하는 활성을 가진 돌연변이 단백질/RNA 복합체를 분리할 수 있으며, RNA에 의해 코딩된 단백질의 서열을 표준 기법에 의해 특정화할 수 있다.
또한, 본 발명은 OPG 변이체 단백질의 생산을 허용하는 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 OPG 변이체 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 OPG 변이체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 세포는 코딩된 OPG 변이체 단백질을 상업적으로 유용한 함량으로 생산하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 OPG 변이체 단백질은, 천연 단백질의 생산 및 회수 방법, 재조합 단백질의 생산 및 회수 방법, 및 단백질의 화학적인 합성 방법을 포함하는, 여러가지 방법으로 생산할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 OPG 변이체 단백질을 발현할 수 있는 세포를 OPG 변이체 단백질 생산에 유효한 조건하에서 배양한 다음 OPG 변이체 단백질을 회수함으로써, 생산한다. 유효한 배양 조건으로는, 단백질 생산을 허용하는 유효한 배지, 생물반응조, 온도, pH 및 산소 조건이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 유효한 배지는 세포를 배양하여 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 모든 배지를 의미한다. 이러한 배지는 전형적으로 동화가능한 탄소원, 질소원 및 인산원과, 적합한 염류, 미네랄류, 금속류 및 비타민류와과 같은 영양분이 함유된 수성 배지를 포함한다. 본 발명의 세포는 통상적인 발효 생물반응조, 교반 플라스크, 테스트 튜브, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트에서 배양할 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소량으로 수행할 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 전문적 지식내에 속한다.
또한, 본 발명은 OPG 변이체 단백질을 형질전환된 숙주 세포로부터 정제하는 방법을 제공한다. 정제 방법은 크로마토그래피와 같은 한가지 이상의 표준적인 단백질 정제 단계들을 적절한 순서로 사용하여, 정제된 단백질을 수득할 수 있다. 크로마토그래피 단계들은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 크로마토포커싱 크로마토그래피, 항-OPG 항체 또는 바이오틴-스트렙타비딘 친화성 컴플렉스 등을 이용한 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 OPG 단백질 또는 그 단편에 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 제조하는 단계 및 OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화성을 테스트하는 단계를 포함하는, OPG의 TRAIL에 대한 결합 친화성을 저하시키는 방법을 제공한다.
바람직한 일 예에서, 상기 방법은 천연형 OPG의 102-130 잔기를 포함하는 부위내의, 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 제조하는 단계 및 OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화성을 테스트하는 단계를 포함한다.
OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화성을 테스트하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 적합한 분석 방법으로는, 비제한적으로, 동력 및 평형 결합 상수를 비교하는 정량적인 비교 방법이 있다. Kon(kinetic association rate) 및 Koff(kinetic dissociation rate) 및 Kd(equilibrium binding constant)는 문헌에 개시된 표준적인 방법을 따라, BIAcore 장치로 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 결정할 수 있다(Pearce et al., Biochemistry, 38:81-89, 1999). 또한, 여러가지 대체 방법을 사용하여, 결합 친화성 및 동력학을 결정할 수 있으며, 하기 실시예에 그 예가 개시되어 있다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 본 발명의 OPG 변이체 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예로는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 RNA가 있다.
바람직하기로는, 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 원하는 OPG 변이체 단백질을 코딩하도록 하는 핵산 변화를 포함하는, 서열번호 1의 변이체이다. 이러한 핵산 변화를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 본원에 언급되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 벡터는 폴리뉴클레오티드의 복제 및/또는 발현에 적합하다. 벡터는 예컨대, 복제 기원 및 바람직하기로는 폴리뉴클레오티드 발현용 프로모터와 선택적으로 프로모터 조절자가 포함된, 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선별 마커, 예컨대 박테리아 플라스미드의 경우에는 암피실린 내성 유전자나 또는 포유류의 경우에는 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 예컨대 RNA 제조를 위해 시험관내에서 사용될 수 있으며, 또는 숙주 세포에 형질 감염 또는 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 대상 단백질의 발현 및 생산을 허용하는 조건으로 본 발명의 단백질들중 하나를 코딩하는 유전자를 함유하는, 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 핵산은 기술자가 이용가능한 발생 또는 특정 위치 돌연변이형성 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 출발 물질은 예컨대 천연형 OPG를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. cDNA는 오스테오프로테게린을 발현하는 다양한 조직으로부터 분리한 mRNA 라이브러리로부터 수득된다. 인간의 경우, 오스테오프로테게린의 조직원은 신장, 간, 태반 및 심장이다. 오스테오프로테게린을 코딩하는 게놈 DNA는 다양한 종으로부터 입수가능한 게놈 라이브러리에서 수득된다.
대안적으로, 본 발명의 핵산은 합성 핵산일 수 있다. 합성 DNA는 예로, 오버랩핑 올리고뉴클레오티드 단편들을 합성한 다음, 상기 단편들을 조합하여 일부 또는 전체 코딩 부위와 측면에 위치하는 서열을 재구성함으로써, 수득한다(U.S. Pat. No. 4,695,623, 인터페론 유전자의 화학 합성법이 기재되어 있음). RNA는 원핵 발현 벡터 또는 T7 프로모터 및 RNA 중합효소와 같이 mRNA를 고수준으로 합성시키게 하는 시험관내 구조체에 의해 가장 쉽게 수득된다.
또한, 본 발명은 OVP를 코딩하는 핵산 서열 함유 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 OVP 생산 방법을 제공한다. 재조합 단백질의 발현 개요는 Methods of Enzymology Vol. 185(Goeddel, D. V. ed.) Academic Press (1990)에 있다.
OVP 생산용 숙주 세포는 E. coli와 같은 원핵 숙주 세포, 효모, 식물, 진균, 곤충 및 포유류 숙주 세포를 포함한다. HB101 또는 JM101과 같은 E. coli 균주가 발현에 적합하다. 바람직한 포유류 숙주 세포로는 COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포 등이 있다. 포유류 숙주 세포는 당화 및 폴리펩티드 프로세싱과 같은 번역후 변형이 OVP 활성에 중요할 경우에 바람직하다. 포유류에서 발현시킴으로써, 성장 배지로부터 회수가능한 분비된 폴리펩티드를 생산할 수 있다.
OVP 발현용 벡터는 바람직하기로는 클로닝한 삽입체의 발현과 벡터 증식에 필수적인 최소한의 서열을 함유한다. 이러한 서열로는 복제 기원, 선별 마커, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 서열, RNA 스플라이스 부위 및 전사 종결 부위가 있다. 전술한 숙주 세포에서 발현시키기에 적합한 벡터는 용이하게 이용가능하며, 본 발명의 핵산은 표준적인 재조합 DNA 기법을 이용하여 벡터에 삽입된다. 또한, 오스테오프로테게린의 조직 특이적인 발현용 벡터도 있다. 이러한 벡터는 간, 신장 또는 그외 기관에서 특이적으로 작용하는 마우스 생산용 프로모터를 포함하며, 표적화된 인간 세포에서의 오스테오프로테게린 발현을 위한 바이러스 벡터가 있다.
적절한 숙주-벡터 시스템을 이용하여, OVP를 코딩하는 핵산 서열을 함유하고 있는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 OVP가 생산되게하는 조건하에서 배양한 다음, 발현 산물을 분리함으로써, OVP를 재조합 방법으로 제조할 수 있다. OVP는 형질감염된 포유류 세포의 상층액으로 또는 형질전환된 박테리아 숙주 세포의 봉입체내로 생산될 수 있다. 이렇게 생산된 OVP는 후술한 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제가능할 수 있다. 실시예 2에 OVP의 E.coli 발현이 개시되어 있다. 실시예에 언급되어있는 특정 플라스미드 및 숙주 세포는 예시하기 위한 것일 뿐, 이용할 수 있는 그외 플라스미드 및 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 OVP를 발현시킬 수 있는 것으로 이해될 것이다.
약학 조성물
본 발명은 본 발명의 따른 OPG 변이체 단백질과 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는, RANK의 RANKL 결합을 저해 또는 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 따른 OPG 변이체 단백질과 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는, RANK와 RANKL 간의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 저해 또는 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 따른 OPG 변이체 단백질과 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는, RANKL에 의해 파골세포의 자극을 저해 또는 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 따른 치료학적 유효량의 OPG 변이체 단백질과 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 가용화제, 안정화제 및 항산화제를 포함하는, 약학 조성물을 제공한다.
용어 "치료학적 유효량"은 특정 상태 및 투여 경로에서 치료 효과를 제공하는 함량을 의미한다. 상기 조성물은 액상 또는 동결건조된 형태일 수 있으며, 다양한 pH와 이온 강도를 가지는 희석제(트리스, 아세테이트 또는 인산 완충제), 트윈 또는 폴리소르베이트와 같은 가용화제, 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알코올과 같은 보존제, 및 아스코르브산이나 소듐 메타바이설피트와 같은 항산화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 가용성 또는 안정성을 증가시키기 위해, 수용성 폴리머로 변형된 OVP를 포함하는 조성물을 포함한다. 또한, 조성물에서 장기간의 조절성 전달을 위해, 리포좀, 마이크로에멀젼, 마이셀 또는 베시클(vesicle)내로 OPV가 병합될 수 있다. 특정 조성물의 선택은 치료중인 상태, 투여 경로 및 원하는 약동학적 파라미터를 포함한 여러가지 인자들에 따라 결정될 것이다. 약학 조성물에 적합한 성분에 대한 보다 광범위한 개론은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, Pa. (1980)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해, 또는 구강, 코, 폐 또는 직장 투여에 의해 투여될 수 있다. 최종적으로 선택된 투여 경로는 다양한 인자들에 따라 결정될 것이며, 당업자들에게 자명할 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 핵산과 약학적으로 허용가능한 보강체(adjuvant)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 핵산 조성물은 일부 또는 전체 OVP를 세포 및 조직에 유전자 치료 요법의 일부로서 전달하기에 적합할 것이다.
본원에서 "유전자 치료"는 치료학적 유효량의 DNA, mRNA 또는 그외 핵산의 1회 또는 반복 투여를 의미한다. 일 예로, 치료학적으로 유효한 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 유전자를 세포에 도입한다.
치료 방법
OPG는 골 교체율 증가 및 골 소실 증가와 관련있는 다양한 상태, 예를 들면 골다공증, 류마티즈 관절염, 파제트 질환, 치주염 질환, 혈관 질환 및 골에 위치되어 있거나 골로 전이된 암을 포함한 상태에 이용 가능성이 있는지에 대해 전임상 및 임상 테스트를 하였다(Lorenz et al., J. Amer Med Assoc 292: 490-5(2004) 및 상기 문헌의 참조문헌).
RNAK 시그널링의 길항으로 전신성 홍반 루푸스, 염증성 장 질환, 당료병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염과 같은 자가면역 질환을 치료할 수 있는 것으로, 또한 알려져 있다.
또한, 최근 보고에 따르면 OPG는 심혈관 질환의 치료 또는 예방에, 혈관 및 판막의 석회화 예방 또는 경감에(Kaden et al., J. Mol. Cardiol. 36: 17-19 (2004), 그리고 혈장 성장 촉진(Cross et al; Int J Cancer Nov 14, 2005 (epub))에 사용될 수 있다. OPG 유전자의 다형성(polymorphism)은 소아 파제트 질환의 발병(Daroszewska et al., J. Bone Miner. Res 19: 1506-11 (2004))과, 백인 남성의 관상 동맥 질환 발생 고위험성(Soufi et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 3764-8 (2004))과 관련있다.
따라서, 본 발명의 OPG 변이체 단백질이 다양한 치료학적 용도를 가질 것임이 분명하다.
따라서, 본 발명은 RANKL 분자를 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANK의 RANKL에 대한 결합을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포를 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, 상기 세포내에서 RANK과 RANKL간의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서 RANK과 RANKL간의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적인 작용을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자의 자가 면역 질환 또는 면역 매개의 염증 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자의 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 파골세포 또는 파골세포 전구체를 함유하고 있는 조직을 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자에게 본 발명에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 대상자에서의 RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
본원에서 "대상자"는 인간 및 다른 동물, 특히 본원에 개략적으로 나타낸 포유류 모두를 의미하며, 바람직하기로는 인간이다.
또한, 본 발명은 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 골 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 본원에서 치료 측면에서의 치료 뿐만 아니라 질환 또는 질병의 예방적인 조치 또는 억제성 조치를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 예컨대, 질환이 발병하기 이전에, 성공적인 OPG 변이체 단백질 투여로 질병을 치료할 수도 있다. 다른 예로, 질병의 증상과 싸우기 위한 질병의 임상적인 표시가 나타난 이후의, 성공적인 OPG 변이체 단백질 투여는 질병의 "치료"이다. "치료"는 또한 질환을 완치하기 위한, 질병의 발현 이후의 OPG 변이체 단백질 투여를 포함한다. 발병된 후 그리고 임상 징후가 나타난 이후의 약제의 성공적인 투여로, 임상 징후의 감소 및 아마 질병 개선을 보이는 것도 질병의 "치료"이다.
본 발명의 OVP로 치료가능한 상태는 다음과 같다:
- 원발성 골다공증, 내분비 골다공증(endocrine osteoporosis)(갑상선 기능 항진증, 부갑상선 기능 항진증, 쿠싱 증후군 및 말단 비대증), 유전성 및 선천성 골다공증(골형성 부전증, 시스틴뇨증, 멘케스 증후군 및 릴리 데이 증후군), 및 사지 부동(immobilization of extremities)으로 인한 골다공증과 같은, 골다공증,
- 성인과 소아기 뼈의 파제트 질환(변형성 골염).
- 골수염 또는 골 소실을 일으키는 골의 감염성 병변.
- 고형 종양(유방, 폐 및 신장)으로부터 유발되는 고칼슘혈증 및 혈액 종양(다발 골수종, 림프종 및 백혈병); 특발성 고칼슘혈증, 및 갑상선 기능 항진과 신장 기능 장애와 관련된 고칼슘혈증.
- 스테로이드 복용에 의해 유발되며, 소장 및 대장 장애, 만성 간 질환 및 신장 질환과 관련있는, 수술 후 골 감소증
- 외상성 손상, 또는 가셰 질환, 겸상 적혈구 빈혈, 전신성 홍반 루푸스 및 그외 질환과 관련된 비-외상성 손상과 관련있는, 골 괴사증 또는 골 세포 사멸.
- 류마티스 관절염, 강직성 척추염 및 그외 면역 매개 염증성 질환으로 인한 골 소실.
- 혈관계의 석회화.
- 치주 골 소실.
- 다발성 골수종, 원발성 골 암 및 전이된 유방 암 및 전립선 암으로 인한 용골성 전이에 작용하는 암.
- 심혈관 질환.
- 관상 동맥 질환.
- 전신성 홍반 루푸스, 염증성 장 질환, 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염과 같은 자가면역 질환.
본 발명의 OVP는 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예로, 본 발명의 OVP는 치료학적 유효량의 TRAIL 활성자 항체 또는 항-TNF 항체와 함께 사용될 수 있다.
바람직한 일 예에서, 본 발명의 OPG 변이체 단백질은 과도한 골 교체 또는 소실과 관련있는 골 질환을 치료하는데 사용된다. 상기 골 질환으로는, 골다공증, 골의 파제트 질환, 고칼슘혈증, 부갑상선 기능 항진증, 스테로이드 유발성 골 감소증, 류마티스 관절염, 골수염, 다발성 골수종, 골 암, 혈관 석회화, 용골성 전이 및 치주 골 소실이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 OVP는 단독으로 또는 골 질환 치료를 위한 다른 인자들과 함께 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
일 예로, OVP는 골 형성을 자극하는 치료학적 유효량의 인자와 함께 사용된다. 이러한 인자로는, BMP-1에서 BMP12로 명기되는 골 다형성 인자들, 전환 성장 인자(transforming growth factor)-β(TGF-β) 및 TGF-β패밀리의 구성원들, 인터루킨-1 저해제, TNFα 저해제, 부갑상선 호르몬 및 그 유사체, 부갑상선 관련 단백질 및 그 유사체, 비타민 E 시리즈, 프로스타글란딘류, 비스포스포네이트류(예, 알렌드로네이트 등), 및 불소 및 칼슘과 같은 골 강화 미네랄류가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 들어 보다 상세하게 설명된다.
도 1: A. OPG 유전자 구조. CRD - 시스테인 다량 함유 도메인; DD - 사멸 도메인; HBD: 헤파린 결합 도메인. B. pEGX254 돌연변이유발 및 디스플레이 카세트.
도 2: RANKL 및 TRAIL에 대한 정제된 OVP 및 OPG의 결합을 비교한 ELISA. 결합 곡선은 테스트하는 변이체 번호에 따라 표시되어 있다. WT는 돌연변이되지 않은 OPG를 의미한다. 끝에 R로 표시한 곡선은 RANKL 결합을 의미하며; 끝에 T로 표시한 곡선은 TRAIL 결합을 의미한다. 이들 실험은 E. coli에서 발현된 단량체형 OPG 22-194를 이용하여 수행되었다.
도 3: RANKL 및 TRAIL에 대한 정제된 OVP 및 OPG의 결합을 비교한 ELISA. 곡선 표시 및 조건은 도 3에 나타낸다.
도 4: RANKL(A) 및 TRAIL(B)에 대한 포유류에서 발현된 정제된 OVP의 결합을 비교한 ELISA. 이들 실험은 이량성 Fc가 연결된 OPG 또는 OVP 22-194를 이용하여 수행되었다.
도 5: (A) OPG 천연형 단백질에 의한 HCT116 세포에서의 TRAIL 유도성 세포자살의 저해. (B) OVP에 의한 HCT116 세포에서의 TRAIL 유도성 세포자살의 저해.
도 6: (A) RAW264.7 세포의 RANKL 매개성 파골세포 활성화에 대한, 천연형 OPG 저해. (B) RAW264.7 세포의 RANKL 매개성 파골세포 활성화에 대한, OVP 저해.
도 7: RANKL 유도성 파골세포 매개의 재흡착에 대한 OVP의 저해. OVP 모두 1 nM로 사용하였다. UT - OVP 무처리.
도 8: 인간 OPG 천연형과 바람직한 OVP 아미노산 서열의 정렬
도 9: 마우스 RANKL에 결합한 OPG의 구조 모델(pdb 파일 1JTZ). RANKL 삼량체는 윗쪽의 연회색 리본 다이아그램으로 나타나있으며, OPG는 진한 회색 리본 다이아그램으로 나타나 있다. RANKL 5 Å내 하나 이상의 원자로 OPG 잔기는 ●로 강조하였다. 밝은 구는 N-말단 리셉터 도메인에서 RANKL에 접촉 가능성 있는 OPG 잔기(OPG의 42 내지 91 잔기, 특이적인 접촉 잔기는 42, 43, 49, 50, 52, 53, 69, 71-82, 85-91)를 나타내며, 어두운 구는 C-말단 리셉터 도메인(OPG 105-130 잔기, 특이적인 접촉 잔기는 105, 106, 107, 108, 110-130)를 나타낸다.
도 10: 2번째 TNF 리셉터 도메인에 촛점을 맞춘, TRAIL과 접촉한 상태의 OPG 모델의 부분도. 상단에서 TRAIL 절반은 리본 다이어그램으로 나타나 있다. OPG는 연회색으로 알파 카본 트레이스로서 묘사되어 있다. 불랙 부분에서, OPG 변이체는 OPG와 정렬되어 있으며, Ile 115가 Glu로 돌연변이된 것이다. 잔기 115와 122번의 측쇄는 막대 형태로 나타나있다. OVP 모델링은, 115번 잔기의 돌연변이가 107-118 루프의 구조 변형을 유발하며, 인터페이스에서 재편성된 접촉을 가짐을 시사한다. 구조 변화는 122번 잔기의 측쇄 이동(shift)에 의해 강조하여 나타낸 바와 같이, 120-130번 잔기 부위에서의 접촉을 없앨 수 있는 부가적인 접촉을 변형할 수 있다. 이러한 접촉은 RANKL 결합 보다 TRAIL 결합에 더 중요한 것으로 보인다. 이는 본 분석에서 이들 돌연변이들에서 관찰된 TRAIL 결합의 거의 완전한 무효화와 일치된다.
도 11: OPG(하단) 및 TRAIL(상단, 리본 다이아그램)간의 조합을 예측한 모델. 잔기 102-130은 공간 충전 형태(space-filling form)로 나타낸다. 이 모델에서, OPG 잔기 115(긴 화살표)를 포함하는 루프와 이(루프의 115번의 우측)의 C-말단 잔기는 TRAIL(짧은 화살표)과 다중 접촉을 형성한다. TRAIL(짧은 화살표)의 튀어나온 195-202 루프는 RANKL에서 가능한 것 보다 OPG, 특히 OPG 잔기 120-130(도 12와 비교)과의 부가적인 또는 보다 확대된 접촉을 허용하는 것으로 보인다. 이는, 상기 부위가 돌연변이가 TRAIL 결합을 변이시킬 것으로 보이는 영역이며, RANKL 결합은 변형시키지 않을 것으로 보인다.
도 12: 마우스 RANKL 구조를 이용한, 모델화 OPG-TRAIL 복합체 모델에 정렬 된. OPG(하단) 및 RANKL(상단, 리본 다이아그램)간의 조합을 예측한 모델. 잔기 102-130은 공간 충전 형태(space-filling form)로 나타낸다. 잔기 115번을 포함하는 루프(긴 화살표)는 그 방향을 겨누며 RANKL와 접촉하지만, 이 영역의 C-말단 잔기(루프의 우측)는 RANKL(짧은 화살표-RANKL 잔기 225-233, 도 11의 TRAIL에서 튀어나온 루프 195-202에 해당됨)과 거의 접촉하지 않는 것으로 보인다. 이는 이전 다이아그램에서 보인 TRAIL과 OPG 접촉으로부터 RANKL과 OPG의 접촉을 구분짓는다.
서열목록
서열번호 1 - 인간의 천연형 오스테오프로테게린 유전자;
서열번호 2 - 인간의 천연형 오스테오프로테게린;
서열번호 3 - 랫의 천연형 오스테오프로테게린;
서열번호 4 - 마우스의 천연형 오스테오프로테게린;
서열번호 5 - 47 - 인간 오스테오프로테게린 변이체 단백질(OVP); 및
서열번호 48 및 49 - OPG 유전자 분리에 사용한 프라이머들.
실시예 1: 인간 OPG 유전자의 클로닝
인간의 태아 신장 cDNA 라이브러리(Spring Bioscience, Fremont, CA)로부터 OPG 유전자를 분리하였다. OPG 서열의 5' 및 3' 말단에 대한 프라이머를 설계하여, 표준 PCR 방법으로 상기 유전자를 증폭시켰다. OPG 유전자 분리에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
정방향: 5' TATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGAACAAGTTGCTGTGCTGCGCGCTCG 3' (서열 번호 48)
역방향: 5' CATCTTTATAATCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGACC 3' (서열번호 49).
프라이머의 돌출부(overhang)에 pGC(Coia et al., (1996), J. Immunol . Meth. 192:13-23)와 같은 E. coli에서의 증식에 적합한 벡터로의 클로닝을 허용하는 제한효소 자리를 삽입하였고, DNA 서열분석으로 클로닝 성공을 검증하였다. 전장 401aa OPG 단백질을 코딩하는 1203개의 뉴클레오티드 이외에도, 신호 펩티드(aa 1-21)가 제외된 OPG 서열이 증폭되었다(OPG 22-401). 또한, 4개의 Cys가 풍부한 도메인을 포함하며 신호 펩티드가 있거나 없는, aa 194번까지의 N-말단 절반 단백질이 증폭되었다. OPG 유전자 구조의 도식적인 또는 도 1A에 나타낸다.
RANKL 및 TRAIL 결합을 담당하는 단백질의 부분을 포함하는, OPG 단편 22-194(Simonet et al., (1997), Yamaguchi et al., (1998), 전술한 바와 같음)를 2 L의 2 x YT/100 ㎍/mL 암피실린 중에서 발현시키고, IPTG로 pGC 벡터로부터 유도하였다. 이렇게 하면 E. coli 세포막 공간(periplasmic) 추출물로부터 검출 및 친화성 정제용 C-말단 이중 FLAG 펩티드 테그가 융합되어 있는 단백질이 생산된다. 유도는 20-22℃에서 3-4시간동안 수행하였다. 친화성으로 정제한 물질은 슈퍼덱스 200 컬럼에서의 겔 여과 크로마토그래피에 의해 피크 정제를 추가로 실시하였다. 크기상 OPG 단량체에 해당되는 피크를 모았다. 크기상 OPG 이량체에 해당되는 작은 피크도 정제하였다. 정제한 피크는 대략 예상한 크기로의 항-FLAG 항체 이동을 이용한 웨스턴 블롯으로 검출할 수 있었다. OPG 검출 키트(R&D systems, Minneapolis, MN)와 함께 제공된 특이적인 항체로 정제된 단량체 단백질을 검출하였다. 이 단백질의 정체는 공지된 서열과 상호관련성이 있는 1에서 19번까지의 19개의 잔기들을 N-말단 아미노산 서열분석함으로써, 검증하였다.
실시예 2: OPG 변이체 단백질( OVP )의 제조
OPG 변이체 라이브러리를 제조하기 위해, OPG(22-194) DNA 서열을 pEGX 돌연변이유발 및 디스플레이 벡터(도 1B)에 클로닝하였고, DNA 서열분석으로 검증하였다. OPG 함유 플라스미드(~ 0.5 - 1.0 ㎍)는 SmaI 절단에 의해 선형화하였고, 분해 산물 100 - 200 ng을 37℃에서 16-24시간동안 실시하는 T7 RNA 중합효소 전사에 주형으로서 직접 사용하였다. 전사 성공은 상기 반응물 20 ㎕ 중 1 ㎕을 아가로스 겔 전기영동하여, 검증하였다. 가능하다면, 라이보솜 디스플레이를 포함하여 RNA가 사용되는 모든 조작들에는, RNA 분해를 최소화하기 위해 DEPC가 처리된 완충액, 반응제 및 튜브를 사용하였다.
37℃에서 16-24시간 실시하는, Qβ리플리카제에 의한 복제 반응에 주형으로서 RNA 전사체를 직접 사용하였다:
T7 RNA 전사체 0.5 ㎕
25 mM rNTPs 1 ㎕
5 X T7 중합효소 완충액 4 ㎕
100 mM DTT 2 ㎕
100 mM MgSO4 0-1.6 ㎕
Qβ리플리카제 1 ㎕
H20 10.5-8.9 ㎕
복제 성공은 반응물 1 ㎕을 아가로스 겔 전기영동하여, 분석하였다. 이러한 과정으로 OPG 변이체를 코딩하는 이중 가닥 RNA 라이브러리를 제조한다. 유전자 카피수 당 1-3가지의 랜덤 돌연변이를 얻기 위해, 돌연변이 조건을 조절하였다. 이 단계에서, 디스플레이용으로 제조중인 OPG RNA 라이브러리 1 ㎍은 약 7 x 1011개의 분자에 해당된다. 이후 샘플 농도를 분광 광도계로 추정하였다.
이후, OPG RNA 라이브러리를 라이보좀 디스플레이에 사용하였다. 상기 라이브러리를 토끼 레티큘로사이트 용해물(Reticulocyte lysate) 번역 시스템(Promega)을 이용하여 30℃에서 30분간 번역하였다:
레티큘로사이트 용해물 33 ㎕
Leu를 제외한 아미노산 혼합물 0.5 ㎕
Met를 제외한 아미노산 혼합물 0.5 ㎕
25 mM MgCl2 0.5 ㎕
RNasin 0.5 ㎕
KCl 1.5 ㎕
OPG RNA 1-2 ㎍
H2O 총 부피 50 ㎕가 되도록 첨가
CL 스페이서 도메인의 끝에 정지 코돈이 없으면, 번역 말미에 라이보좀이 움직이지 못하게 되어, RNA/라이보좀/단백질 복합체가 형성된다. 번역이 종료되면, 이들 복합체를 차가운 상태(얼음상)에서 유지시키고, 마그네슘 아세테이트(MgOAc)를 첨가하여, 안정화시켰다. 번역 반응물에 60 ㎕의 빙냉한 PBS/50 mM MgOAc/10% 스킴 밀크(바이오킨 결핍)와 190 ㎕의 PBS/50 mM MgOAc/0.05% Tween/2.5mg/mL 헤파린을 첨가하여, 300 ㎕로 희석하였다. 이후, 상기 혼합물을 3 x 100 ㎕로 분주하였다.
실시예 3: 패닝 OVP( Panning OVP )
실시예 2에서 제조한 복합체를 용액중에서 RANKL(Roche) 및 TRAIL(Peprotech)에 대해 패닝하였다(pan). 스트렙타비딘이 코팅된 자기 비드(Dynal)를 이용하여 용액중에서 선별한 복합체를 포획가능하게 하기 위해, Sulfo-NHS-LC-바이오틴(Pierce)을 이용하여 바이오틸화한 RANKL 및 TRAIL을 제조하였다.
패닝 반응은 3개의 각 번역 혼합 분주물 중에서 수행하였다. 2가지의 다른 전략을 채택하여, RANKL 결합 친화력을 유지하면서, TRAIL에 대한 결합 친화력을 감소시키는, 잔기에 아미노산 변화가 있는 OVP 서열을 분리하는데 우호적인 선별압을 형성하였다. 사용한 한가지 방법은, 가용성 RANKL에 대해 일차로 패닝한 다음, 과잉의 유리 TRAIL 단백질을 이용하여 TRAIL 바인더를 경쟁에서 탈락시켰다(compete off). 번역 반응물 분주물 하나에, 바이오틸-RANKL를 투입 RNA 양과 거의 동일한 몰수의 농도로 첨가하였다. 이후, 이 혼합물은 4 ℃에서 40-60분간 회전시켰다. 스트렙타비딘이 코팅된 자기 비드(Dynal)를 세정하여, PBS/50 mM MgOAc/0.05% Tween에 재현탁하였다. RANKL 패닝 이후에, 상기 비드 10 ㎕을 첨가하여, 4 ℃에서 10분간 혼합하였다. 라이보좀-디스플레이된 OPG과의 복합체 형태로 바이오틸-RANKL을 포획한 비드를 자기를 이용하여, PBS/50 mM MgOAc/ 0.05% Tween으로 2번, PBS/50 mM MgOAc로 2번 세정한 다음, 상기 완충액 100 ㎕에 재현탁하였다. 이 혼합물에, TRAIL 바인더를 경쟁에서 탈락시키기 위해 첨가한 RANKL의 몰 농도에 2 또는 그 이상의 배수로, 가용성 TRAIL을 과잉 첨가하였고, 4 ℃에서 30분간 회전시켰다. 상기 과정 중에 비드로부터 용리된 모든 복합체는 전술한 바와 같이 세정하여 제거하였고, 결합된 RANKL-결합 복합체를 가진 비드는 물 20 ㎕에 재현탁하였다. 이러한 패닝 방법은 "RANKL-1st"으로 표시한다.
사용한 다른 방법은, 보다 강한 TRAIL 바인더를 제거하기 위해 가용성 TRAIL에 대한 일차 패닝을 실시한 다음, 혼합물을 RANKL에 대해 패닝하여 남아있는 RANKL 바인더를 분리하는 것이다. 제2 번역 반응물 분주물에, 바이오틸-TRAIL을 투입 RNA 몰 수에 약 1/2 또는 1/4로 첨가하였다. 이 혼합물은 4 ℃에서 40-60 분간 회전시킨 다음, 스트렙타비딘 비드 10 ㎕을 10분간 첨가하였다. 리보좀-디스플레이된 OVP와 복합체 형태로 바이오틸-TRAIL를 포착한 비드를 자기를 이용하여 제거하여, 보다 강한 TRAIL 바인더 혼합물을 제거하였다. 이후, 바이오틸-RANKL을 투입 RNA의 약 1/2 몰량으로 혼합물에 첨가한 다음, 이를 4 ℃에서 30-40분간 회전 시켜, RANKL 결합 친화력이 남아있는 OPG 변이체를 선별하였다. 이후, 비드는 전술한 바와 같이 세정하여 물에 재현탁하였다. 이러한 패닝 방법은 "TRAIL-1st"로 나타낸다. 대조군 팬은 3차 번역 반응물 분주물 중에 RANKL-1st 팬으로 수행하였고, 바이오틸-RANKL 대신 바이오틸-IGF-I(Gropep)을 사용하였다. 가용성 바이오틸화된 형태로 항원을 이용하는 대신에, 사용 항원을 에폭시 자기 비드(Dynal)에 커플링한, 전술한 RANKL-1st 및 TRAIL-1st 선별 방법의 변형 방법을 실시하였다.
실시예 4: 선별한 OVP 의 클로닝
복합체를 이용하여 선별한 RNA를 주형으로서 비드 현탁물 5 ㎕을 이용한 표준 방법에 의해, RT-PCR로 cDNA로 변환시켰다. RT-PCR 산물은 아가로스 전기영동으로 분리하였다. RANKL-1st 및 TRAIL-1st 팬(pan)에 대한 밴드 뿐만 아니라, IGF-I 팬에서 약한 밴드를 관찰할 수 있다면, 이는 상기 선별 과정에 내재된 일부 비-특이적인 선별이 존재함을 시사한다. 다음으로, 선택한 DNA 풀을 상기 겔로부터 정제하고, 제한 효소로 분해한 다음, 원하는 결합 특성을 스크리닝 할 수 있도록, 발현 벡터 pGC에 연결시켰다. 연결한 산물은 적합한 E. coli 균주에 전기충격으로 도입하여, 형질전환체 콜로니를 제조하였다.
실시예 5: OVP 클론 스크리닝
각 디스플레이 및 선별 실험으로부터 수득한 약 100개의 클론을 스크리닝하였다. OVP 유전자를 가지고 있는 클론은, 스타터 배양으로서 마이크로타이터 플레 이트 웰상에서 암피실린과 글루코스가 보충된 2 X YT 200 ㎕ 중에서 37 ℃로 철야 배양하였다. 이러한 배양물은 발현 배양을 위한 접종원으로서 암피실린이 보충된 2 X YT 200 ㎕에 사용한다. 배양물의 OD600nm이 약 1.0이 되면, 0.5 - 1 mM의 IPTG를 첨가하여 20-22 ℃에서 16시간 배양하여, pGC에서 변이체 발현을 유도하였다. 마이크로타이터 플레이트의 웰 표면상에서 코팅된 RANKL 및 TRAIL에 대한 ELISA 결합을 철야 분석하기 위하여, 배양물의 상층물을 수확하였다. 표면을 0.5% 카세인으로 2시간 블록킹하였다. 100 kD의 MWCO(molecular weight cut-off) 막이 장착된 마이크로타이터 플레이트로 상층액을 여과시켜, ELISA에서 백그라운드 신호를 줄이는데 도움이 되는 분자량이 큰 종들과 응집체들을 제거하였다. 상기 여과한 상층액을 항원을 코팅한, 블록킹한 웰에 적용하였다. 결합된 OVP는 마우스 항-FLAG 항체와 이후의 염속 항-마우스-페록시다제 접합체(BioRad)를 이용하여 검출하였다. 페록시다제 기질로서 TMB(KPL)을 사용하였고, 결합 신호는 450 nm에서의 흡광도를 판독하여 측정하였다. 단계들 사이에 세정은 PBS/0.05% Tween으로 3번, PBS로 3번 한 다음, 0.25% 카세인 중에 희석하였다. 일차 스크리닝 산물을 분석하여, (천연형 OPG의 활성이 또는 그 활성에 근접한 수준으로 활성이 유지되어 있는 RANKL 결합 신호 및 실질적으로 감소된 TRAIL 결합 신호를 토대로)확인된 클론들은 이차 스크리닝용으로 선별하였다.
이차 스크리닝은 20-22℃에서 3시간 동안의 유도기를 이용하여 10 ml 배양액에서 선별한 클론들을 발현시키는 단계이다. 이들 세포 유래 세포막간 공간의 추출물을 수확하여 상기와 같이 여과한 다음, 상기와 같이 ELISA에 의해 여러가지 희 석 범위(일반적으로 1:2 내지 1:32)에서 조사하였다. 전술한 OPG 천연형에서와 같이, 대량(0.5 - 2 L) 발현 및 정제에 있어서 최상의 단백질들을 선별하였다. 정제한 단백질은 Trp 및 Tyr 잔기에 의한 A280nm에서의 흡수 계수 측정으로 정량하였다. 다음으로, OVP를 상기 ELISA에 의한 OPG 천연형 단백질과의 비교에서와 동일한 농도에서 테스트하였다. 일반적으로 0.5 μM 내지 0.031 μM의 이배수 희석 연속물중에서 단백질의 결합을 테스트하였다. 대부분의 단량체 형태의 단백질은 OPG 천연형 수준의 또는 천연형 수준에 가까운 수준의 RANKL 결합력과, 실질적으로 감소된 TRAIL 결합 신호를 보였다. 이러한 ELISA 결과의 예는 도 2에 나타나 있다. 모든 선별 방법으로 필요한 결합 특성 프로파일을 보이는 변이체가 생산되었다.
실시예 6: 반복 라이보좀 디스플레이(Repeat ribosome display) 및 선별 과정
이후의 라이보좀 디스플레이 및 선별은 최상의 OVP 후보체들중 일부를 추가적으로 개선시키기 위해, 수행되었다. 이를 위해, 이들 OVP의 유전자를 pEGX에 클로닝하여 돌연변이를 유발시킨 다음 전술한 바와 같이 TRAIL 결합성 감소 및 RANKL 결합성 유지 쪽으로 선택압을 강행하기 위한 변형 선별에서 사용한 가용성 항원의 몰량으로 디스플레이를 수행하였다. 최상의 변이체 스크리닝은 전술한 바와 같이 행하였고, 원하는 특성이 명백하게 개선된 돌연변이를 추가로 분리하였다. 모든 선별 단계에서 선별한 최상의 라이보좀 디스플레이-OVP의 서열은 도 3에 나타낸다. 선별한 많은 변이체들에서 Cys107-Cys118 루프내 aa 115 부위 돌연변이가 관찰되었고, aa 102-130을 포함하는 영역에 근접한 아미노산에서의 일부 돌연변이가 관찰되 었다. 이러한 결과는, 상기 부위, 특히 aa 115가 TRAIL 결합에 중요하며, 일부 변화가 RANKL 결합성이 없어지지 않으면서도 허용될 수 있음을 시사한다.
실시예 7: 부위 특이적인 돌연변이 유발( Site directed mutagenesis )
OPG의 특이성의 변형하는데 도움이 되는 것으로 확인된 라이보좀 디스플레이 선별에 의해 정확하게 확인된 돌연변이 위치를, 그 위치에 부위 특이적인 돌연변이 유발을 적용하여, 추가적으로 조사하였다. 부가적인 아미노산 변화는 잔기 115, 122 및 128에서 시험하였고, L40S 돌연변이를 이들 위치에서의 일부 돌연변이와 조합하였다. 특정 돌연변이 잔기를 코딩하는 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하여, 상보적인 돌출 부위를 가지는 OVP 돌연변이 유전자의 정방향 및 역방향 단편의 PCR 증폭이 가능하게 하였다. PCR을 실시하여 프라이머 없이 실시한 첫 10번의 사이클 동안에 서로 프라이밍 오프(priming off)한 다음, 클로닝을 위한 제한효소자리를 포함하는 전장 돌연변이 유전자 증폭용 플랭킹(flanking) 5' 및 3' 프라이머를 첨가하여 30회 사이클을 실시하여, 2개의 DNA 세그먼트를 연결시켰다.
이후의 ELISA와 세포성 분석에서 생물학적으로 상대적으로 보다 안정적인 이량체 형태의 단백질을 보다 높은 수준으로 제조가능하도록, 포유류 발현 시스템을 채택하였다. 부위 특이적인 돌연변이와 최상의 라이보좀 디스플레이-OVP 선별 후보제(1-194) 유전자(잔기 1-21은 신호 펩티드를 구성함)를 포유류 발현 벡터 pAPEX-3.Fc에 클로닝하였다. 이러한 방법은 OVP를 인간 Fc 도메인과의 융합체로서 발현시켜, 안정적인 이량체를 형성시킨다. 또한, C-말단 FLAG 테그를 추가하였다. 발현에 HEK 293 EBNA 세포를 사용하였다. 이들 유착성 세포는 2 mM Glutamax(Invitrogen), 10% 우태아 혈청 및 200 ㎍/mL 제네티신(geneticin)이 보충된 DMEM 배지중에서, 37℃, 5% CO2 조건에서 계대 배양하였다. 리포펙타민(Invitrogen)을 이용한 일시적인 형질감염에서, 거의 컨플루언트 상태의 세포를 회수하여, 5 x 106 세포를 10 mL 부피로 10 cm의 조직 배양 접시에 접종하였다. 24시간 동안 세포 유착 및 배양하였다. 원하는 OVP를 가지고 있는 pAPEX-3.Fc 플라스미드 DNA 24 mg을 DMEM 1.5 mL과 혼합하였다. 리포펙타민 60 ㎕을 1.5 ml의 DMEM에 희석하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 희석한 DNA와 리포펙타민을 혼합하여, 실온에서 20분간 인큐베이션한 다음, 배양 접시에 점적하였다. 하룻밤 배양한 후, 하나의 배양 접시에서 수득한 세포 모두를 회수하여, T175 접시에 25 - 30 mL 중에 접종하였다. 세포가 거의 컨플루언스(1-2일)에 도달하면, 혈청을 함유하는 DMEM은 4 mM 글루타맥스(Glutamax)가 첨가된 Ex-cell 293T 무혈청 배지(JRH Biosciences) 25 - 30 mL로 교체하였다. 3-4일 후, 배지를 모아 원심분리한 다음 0.22 ㎛의 시린지 필터를 통해 여과하였다.
배지로 분비된 단백질을 정제하기 위해, 상층액을 PBS로 평형화한 단백질A(Sigma) 수지(resin)에 가하였다. 자신의 Fc 부분을 통해 단백질A에 결합한 단백질은 0.1 M Gly, pH 3으로 용출시켰으며, 용출은 A280nm에서 모니터링하였다. 용출물은 PBS에 대한 즉각적인 투석을 통해 중성화하였다. 투석한 단백질은 0.5 ml로 농축시킨 다음 Superdex 200 컬럼을 이용한 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. OVP-Fc 이량체에 해당하는 두드러진 피크를 모아, 항-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블롯과 처리되는 신호 펩티드가 있는 OPG를 확인하는 N-말단 서열분석을 통해, 정체를 검증하였다. 겔 여과로 정제한 OVP를 이온 교환 크로마토그래피를 실시한 결과 하나의 단백질 피크만 용출되었으며, 이는 동종임을 시사한다.
실시예 8: 부위 특이적인 OVP 돌연변이의 스크리닝
포유류에서 발현시킨 정제한 OVP 단백질은, ELISA에 의해 RANKL 및 TRAIL에 대한 결합성을 테스트하였다. 웰을 PBS 중에 RANKL 5 ㎍/mL로, 또는 TRAIL 10 ㎍/mL로, 4 ℃에서 철야 코팅하고, PBS고 세정하고, PBS 중의 0.5% 카세인으로 실온에서 2시간 블롯킹한 다음, PBS로 다시 세정하였다. 테스트 OVP의 농도는 약 10 nM로 표준화하였고, 이후 50 ㎕을 항원 코팅 웰 6- 7개에 이배수 희석 시리즈로 1시간동안 적용하였다. 모든 희석물은 0.25% 카세인 중에서 행하였다. 결합 인큐베이션 단계 사이에 실시하는 모든 세정은 PBS/0.05% Tween으로 3회로 행한 후, PBS로 3회 수행하였다. 결합된 OVP의 검출은 1.2 mg/mL로 항-FLAG 50 ㎕과 20분간 인큐베이션한 다음, 50 ㎕의 염소 항-마우스-페록시다제 접합체(BioRad)를 1:1500 비율로 20분간 인큐베이션하여 행하였다. 효소 기질로는 TMB를 사용한 다음, 결합 신호는 A450nm에서 측정하였다. OVP 또는 OPG wt 모두 C-말단 Fc-연결형으로 테스트하였다. OPG(22-194) 천연형에 대한 다양한 OVP 결합성을 비교하는 ELISA 결과는 예로 도 4A 및 4B에 나타낸다. 데이타는, OPG(22-194) wt가 RANKL과 TRAIL 둘다에 결합하며, 대부분의 OVP는 천연형 단백질 수준의 또는 근접한 수준의 RANKL 결합력을 유지함을 나타낸다. 본 실험에서 테스트한 OVP는 모두 wt에 비해 TRAIL에 대한 결합력의 적어도 일부 감소를 보이며, 라이보좀 디스플레이로 선별한 1R17(I115M)과 115 - 115D, 115G 및 115R 위치의 부위 특이적인 돌연변이는 매우 낮은 TRAIL 결합력을 나타내었다. ELISA에서 상대적인 OVP 결합력을 대략적으로 비교 가능하도록, 상기 데이타의 EC50 값을 표 1에 요약 개시한다. EC50 값은 OVP 농도에 대한 결합 반응을 로그 스케일로 곡선을 그려 추정하였고, 데이타가 EC50 범위에 이르지 않은 경우에는 외삽하였다. OVP 일부는 RANKL에 대한 결합력이 약간 증가됨을 보였지만, 일부는 RANKL 결합력이 최대 3배 감소하였다.
실시예 9: HCT116 세포에서의 TRAIL 유발성 세포자살 분석에 의한 OVP의 생물학적 테스트
ELISA에서 관찰된 OVP의 TRAIL 결합 활성 감소를, 이들 OVP의 존재하에서의 HCT116 세포의 TRAIL 유발성 세포자살 분석으로, 추가적으로 테스트한다. 이들 세포는 10% 소태아 혈청(FCS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 37℃ 5% CO2로 배양하였다. HCT116 세포는 7.5 x 104 cells/well 밀도로 12웰 플레이트에 1 ml DMEM + FCS 중에 접종하여, 24시간 동안 유착 및 배양하였다. 이후, 배양 배지를 제거하고, 신선한 배지 500 ㎕을 넣어 37℃에서 한시간 인큐베이션하였다. OVP 또는 재조합 인간 OPG.Fc(R&D Systems)을 0.56, 1.69, 5.6 및 11.2 nM로 첨가하여, 37℃에서 15분간 세포를 배양한 다음, 재조합 인간 TRAIL(R&D Systems)을 10 ng/ml (0.53 nM)로 첨가하였다. 다음으로, 세포를 37℃에서 16시간 배양하고, 이를 수확하여 각 웰내 세포자살 세포율을 구하였다. OVP를 최대 농도 로 사용하여 TRAIL 부재하의 세포 독성을 테스트하였다. 세포 모두(유착성 및 부유성) 회수하여 1 mg/ml 프로피듐 요오드화물(PI), 0.1% Triton X-100 및 0.1% 소듐 아세테이트를 포함하는 PBS 20 ㎕에 현탁하였다. 세포를 PI 염색한 다음 형광 현미경으로 핵 형태를 분석하여, 하기 중 한가지 이상의 특징으로 나타내는 경우에 세포자살로 두어, 세포 자살을 측정하였다: 핵 변연화(nuclear margination), 염색질 응축, 세포자살체의 형성. 편견(bias)을 방지하기 위해, 샘플에 가해진 처리를 모르는 상태에서 샘플을 측정하였다. 이러한 분석의 예를 도 5A 및 5B에 나타낸다. 천연형 OPG 단백질의 효과는 도 5A에 나타내며, 도 5A에서 OPG 5.6 nM 농도에서의 TRAIL 유발성 세포자살을 보이는 세포 비율은 약 70% 이상에서 10% 미만으로 감소되었다. OPG(22-194).Fc는 전장 OPG.Fc(R&D systems) 분자와 유사한 효과를 가진 것으로 보이지만, N-말단에 Fc가 연결된 천연형 단백질 형태는 거의 효과가 없었다. 도 5B에서 확인된 OVP들 모두 TRAIL 유도성 세포자살을 거의 저해하지 못하거나 또는 저해하는 능력이 없었다. 여기에서 나타낸 것 보다 4배 높은 농도에서도, 선별한 OVP의 TRAIL 차단 활성이 거의 무시할만한 수준이다.
실시예 10: RANKL 매개 RAW264.7 세포의 분화 분석에 의한 OVP의 생물학적인 테스트
뮤라인 백혈병 바이러스 유도성 종양 단핵 세포주 RAW264.7은 RANKL 자극하에서 파골세포로 분화된다. RANKL에 결합하여 RANK 결합을 통해 매개되는 그것의 생물학적인 작용을 차단하는, OVP의 능력을 추가적으로 테스트하기 위해, OVP의 존재하에 RAW264.7 세포의 RANKL-매개 분화를 분석하였다. RAW264.7 세포는 5% FCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 DMEM에서, 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양하였다. RAW264.7 세포(3x103 cells/well)를 96웰 플레이트상에서 5% FCS가 포함된 DMEM 100 ㎕에 접종하여, 24시간 배양하였다. 15 ng/mL(0.75 nM) 인간 RANKL(Roche) 및 0 내지 0.5 nM의 OVP를 포함하고 있는 배지 100 ㎕을 각 웰에 추가로 첨가하여, 3일간 세포를 배양하였다. 파골세포 생성은 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 활성을 측정함으로써, 평가하였다. 세포는 고정, 건조시킨 후, 100 ㎕의 50 mM 시트레이트 완충액 pH 4.6, 10 mM 타르트레이트, 1 mg/mL p-니트로페닐포스페이트를 첨가하여, TRAP 활성을 측정하였다. 30분간 인큐베이션 한 다음, 반응을 중지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 분석은 도 6A에 나타낸다. 0.4 nM 농도에서, 확인된 모든 OVP들은 0.75 nM RANKL에 의해 유도된 RAW264.7 세포의 파골세포로의 분화를 모두 차단할 수 있다. 또한, 도 6B는 부위 특이적인 돌연변이에 의해 aa 115를 돌연변이시킨 OVP를 이용한 분석을 나타낸다. 매우 작은 낮은 농도 범위에서, 단백질 모두 TARIL 유발성 세포자살을 저해하는 능력이 실질적으로 소실됨에도 불구하고, 본 발명자들은 RANKL 결합 활성을 식별할 수 있었다(도 5B). 일부 변이체들이 이러한 분석에서 OPG의 활성과 동등하거나 또는 향상된 활성을 보였음을 참조하여햐 한다. 반면에, 비교적 적당한 수준의 RANKL 결합성 감소를 보인 일부 변이체들은(표 1) RANKL 매개성 파골세포 활성화를 차단하는 능력이 현저하게 감소되었다.
실시예 11: 자이언트 세포 종량 파골세포에서의 재흡수 분석을 통한 OVP의 생물학적 테스트
자이언트 세포 종양 파골세포 재흡수 분석을 RANKL에 대한 OVP 결합으로 인한 생물학적인 작용을 측정하는 방법으로서 사용하였다. 이 방법은, 상아질 조각에서의 재흡수 pit 생성 수준 측정에 의한 RANKL 매개 파골세포형성 분석법(Atkins et al., Bone 28:370-37 (2001))이다. 이러한 분석을 사용하여, OPG 매개의 상기 작용 저해를 볼 수 있다. 재흡수 pit의 수 및 면적을 정량할 수 있다. 여러가지 OVP를 테스트하는 이러한 분석의 예는 도 7에 나타낸다. 모든 구조체들은 저해하였으며, OPG wt의 저해율은 약 55%이었고, 최적의 OVP R23(I115M, L40S)의 저해율은 75%였다.
실시예 12: OVP의 생물학적인 테스트 결과
라이보좀 및 디스플레이 선별에 의해 분리한 OVP 선별 서열은 도 8에 나타낸다. 이들 OVP와 부위 특이적인 돌연변이 유발에 의해 제조한 다른 OVP를 대상으로 수행한 결합 연구 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1의 데이타에서, 115번 위치의 잔기 치환이 OVP의 TRAIL 결합력에 가장 주된 영향력을 가진다는 것이 명확해졌다. 특히, 이 위치에 Met, Gly, Asn, Asp 및 Glu와 같은 잔기로 치환하면, TRAIL 결합력이 실질적으로 감소되며, RANKL 결합력에는 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 또한, 이러한 치환이 가미된 OVP들은 종양 세포의 TRAIL 유발성 세포자살 분석에서 어떠한 활성을 나타내지 않았다.
또한, 122번 위치의 잔기에서의 돌연변이는 OVP의 TRAIL 결합력에 영향을 미친다. 예를 들면, 이중 돌연변이들, 1I115M, R122N 및 I115M, R122E은 TRAIL에 대 한 실질적인 결합 친화력 감소를 나타내었다.
또한, 128번 위치의 잔기에서의 돌연변이는 OVP의 TRAIL 결합력에 영향을 미친다. 예를 들면, 이중 돌연변이들, 1I115M, F128L 및 I115M, F128I는 TRAIL에 대한 실질적인 결합 친화력 감소를 나타내었다.
이중 돌연변이 I115M, L40S의 RANKL 매개 파골세포 생성 저해율은 75%이며, 이는 40번 잔기의 돌연변이 중요성을 강조한다.
세포 분석을 통해 선별한 OVP의 생물학적인 활성 개요는 표 2에 나타낸다.
실시예 13: OPG/OVP의 3차 구조 모델링
OPG는 TNF-리셉터 슈패밀리 단백질의 구성원으로서 분류된다. 대부분의 구성원은 약 40개의 시스테인이 다량 포함된 도메인이 여러번 반복된 것을 특징으로 하며, 이는 리간드 결합에 관여한다. 공지된 리간드로는 구조적으로 동일한 TRAIL과 RANKL 단백질이 있다.
OPG는 단독 또는 그것의 리간드인 RANKL이나 TRAIL 중 어느 것과 조합한 형태의 3차 구조는 공개되어 있지 않다. 이에, 바람직한 OVP에 함유된 돌연변이의 가능성 있는 효과를 조사하기 위한 시도로, OPG의 아미노 말단 단편에 있는 2개의 시스테인 다량 함유 도메인의 구조 모델을 확립하였다.
브룩헤이븐 단백질 구조 데이타베이스(PDB)의 BLAST 검색을 통해, 3차 구조를 결정하기 위한 3종의 매우 상동한 TNF - 리셉터 관련 단백질들, 즉 pdb 파일 1SG1(신경 성장 인자와 공통(common) 뉴크로트로핀 리셉터 p75간의 리셉터-리간드 복합체)의 폴리펩티드, 및 1D4V 및 1DU3 파일로부터 사멸 리셉터5 구조를 선택하였 다. 또한, 파일 1DoG로부터 구조를 입력하였다. TNF-리셉터 슈퍼패밀리 구성원인 DR5(TRAIL 리셉터 단백질)은 OPG 리간드 복합체에 대한 모델 설계를 위해 조사한 TRAIL 트리머에 착화된 구조로 표시된다. 모델링은 InsightII software package (Molecular Simulations Inc.)에 포함된 모듈 Modeller를 이용하여 수행하였다. 또한, 1SG1 X 쇄의 구조를 N-말단 도메인과 C-말단 도메인으로 나누고, 2개의 도메인 모두 OPG에 동종성을 보였기에 도메인 2개를 각각 나머지 주형들과 정렬하였다. 다른 3종의 주형와 비교해 볼때, C-말단 도메인이 교체되는 것을 허용하는, 단백질내 힌지 부분이 있었다. 선별 실험과 다수의 선별 OVP 서열에 대한 출발점으로서 사용한, 천연형 OPG 단편에 대해 50가지의 모델을 만들었다. 이 모델들은 Modeller로 매긴 점수에 따라 등급화하였고, 상위 10가지의 모델을 1D0G 구조로 DR5에 정렬하였다. 다음으로, 결정된 마우스 RANKL 구조(pdb file 1JTZ)를 이용하여, 상기 구조의 TRAIL 컴포넌트의 리셉터 접촉부로, RANKL상에서의 가능성 있는 리셉터 접촉 구조를 모델링하였다. 이러한 방법은 TRAIL에 결합하였을 때와 RANKL 구조에 결합하였을 때의 OPG 모델을 비교할 수 있다. 제조한, TRAIL 또는 RANKL 각각과의 OPG 복합체 모델을 대상으로, 모델 구조에서의, 공간적인 배치 부조화(steric clash)와 가능한 결합 상호작용을 조사하였다.
본원의 OPG 단백질 모델은, 유사한 TNF-리셉터 - 리간드 상호작용(Hymowitz et al., Mol. Cell 4:563-571 (1999); He et al., Science 304: 870-875 (2004))에서 발견되는 바와 같이, 광범위의 인터페이스로 RANKL 및 TRAIL 둘다에 결합함을 시사한다. 본원의 모델에서 예상되는 바에 따르면, OPG의 TNF-리셉터 유사 도메인 2개는 RANKL과 TRAIL과의 결합에 참여하는데(도 9 내지 12), N-말단 도메인은 42번 잔기에서 92번 잔기 부분이 접촉하며 C-말단 도메인은 107번 잔기에서 154번 잔기 부분이 접촉한다. 2곳의 서브-영역은 특히 107-118 및 120-142인 것으로 검출되었다. N-말단 도메인의 OPG와의 접촉은 RANKL 및 TRAIL 사이와 유사한 것으로 보여, 따라서, 이 부분의 돌연변이는 둘다와의 결합 상호작용에 틀림없이 영향을 미칠 것이다. 이 부위는 RANKL이 아닌 TRAIL에 대해 결합이 감소되는 것으로 선별된 OVP들에서 돌연변이가 흔히 발견되는 곳이 아니므로, 이러한 사실은 본원에 기재된 선별 실험의 결과와 일치된다.
124에서 142번 잔기들 간의 이황화 결합 주변 힌지는 C-말단 도메인이 리간드로부터 다른 방향으로 굽게 하는 것으로 보여, 상호작용 또는 보다 많은 상호작용을 형성하기 위한 리간드쪽으로 구부러지게하는데에 한계가 있다. 또한, 조사한 2개의 리간드, TRAIL 및 RANKL 간의 구조 측면에서 차이가 있다. TRAIL의 잔기 Glu195 내지 Asn202, 특히 Asn199, Thr200 및 Lys201은 OPG의 잔기 Leu119에서 Arg143 잔기로 이루어진 영역내에서 OPG와 접촉가능하게, 특히 Lys120, His121, Arg122, Cys124, Pro125, Pro126, Gly127, Phe128, Cys141, Lys142 잔기를 통해 OPG와 접촉가능하게, OPG 결합부 쪽으로 루프 영역으로서 돌출되어 있다.
그러나, 상기 영역의 정확한 위치화는 돌출성 루푸 N-말단내에서의 Cys107 및 Cys118 사이를 포함하는 힌지 영역과의 접촉에 의해 추가적으로 안내되는 것으로 보인다. 상기 루프내에서, Glu116 및 Phe117은 적어도 두가지 방향(orientation)의 우호적인 상호작용 세트를 형성할 수 있을 것으로 보인다. 주 변 잔기 Ile115의 돌연변이, 예컨대 I115G 또는 I115E는 보다 개방형 위치로 전환될 수 있는 한가지 방향으로 치우치는 것으로 보이며, 따라서, C-말단 접촉부와 TRAIL의 195-202 루프 사이의 상호작용은 약해지지만, RANKL 상호작용은 유지된다. 그러나, 잔기 115번의 일부 변화는 RANKL 뿐만 아니라 TRAIL에 대한 결합을 파괴하는 것으로 실험들에서 확인되었다. 이러한 변화는 치환된 아미노산이 양성 또는 음성 전하를 띄는 보다 큰 측쇄를 가지는 것이다. 이는, 잔기 115번이 RANKL 접촉에 관여하거나, 또는 115번 잔기에 대한 비우호적인 변화가 116과 같은 주변 잔기에 의해 형성된 매우 중요한 접촉을 파괴함을 시사한다.
120-142 영역내에서의 변화 모델링을 통해, 상기 영역에서의 잔기들중 임의의 하나의 변이가 특이적으로 TRAIL에 대한 결합성에 영향을 미치는 것으로 추측되며, 이러한 다수의 변화들은 테스트한 OVP 대부분에서 검출되었다.
N-말단 결합 영역내에서, OPG의 42-92번 잔기들은 RANKL 및 TRAIL 둘다와 넓은 접촉 영역을 형성한다. 이들 모두의 리간드 구조는 이 인터페이스에서 유사한 것으로 보인다. 이 영역은 본원의 실험에서 TRAIL 결합 소실을 유도하는 돌연변이가 관찰된 영역이 아니므로, 본 발명자들은 상기 영역내의 잔기들이 TRAIL 결합성에 대해 보다 약하게 작용하는 실재 기여일 수 있거나, 또는 상기 영역에서의 돌연변이가 TRAIL 및 RANKL에 대한 결합성에 동시에 작용할 수 있는 것이므로, 상기 부위에서의 변화는 본 발명의 스크리닝 방법들에 의해 선별되지 않았던 것으로 결론내렸다. 그렇지만, 이 영역이나 근처 영역의 돌연변이로 인한 미묘한 구조 변화는, 115번 잔기의 돌연변이로 인한 구조 변경(conformational shift)에 대해 상기 에서 추측한 바와 같이, 그것의 RANKL-매개 작용에 우호적으로 분자의 특성을 변형할 수 있다. 특히 흥미로운 변화는 테스트한 OVP들에서 확인한 40번 잔기의 변화이다. 이 잔기는 접촉부에 인접하여 위치하기 때문에, 근처 잔기 변화는 상기 루프의 형태에 미묘하게 변화를 줄 가능성이 있으며, 따라서, TRAIL 접촉을 희생시키고 RANKL과의 결합에 우선적으로 편향될 수 있다. 이러한 미묘한 형태 변화는 이 도메인의 폴딩에 작용할 수 있는 OPG 다른 잔기의 돌연변이에 의해 달성될 수 있는 것으로 보인다.
본원에 인용된 모든 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 발명에 포함된다.
본원에 기재된 문헌, 법, 물질, 장치, 논문 등은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐이다. 이러한 어떠한 또는 모든 사실은 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하기 때문에, 종래기술의 일부분이거나 또는 본 발명이 속하는 해당 분야의 일반적인 지식이었음을 용인하는 것으로 여겨지는 것은 아니다.
표 1: OVP 결합 실험
외삽법에 의한 #
결합 증가 = EC50 작아짐; 결합 감소 = EC50 증가
변이체 wt 대비 RANKL 변화율(fold change) wt 대비 TRAIL 변화율
I115V 1.5 (4)
I115L 1.75 (4.3)
I115M 1.2 (25)
I115W (1.4) (5)
I115A 2.25 (2.5)
I115G 2.1 (>125#)
I115N (1.1) (390#)
I115S (1.4) (3.1)
I115R (2.3) (50#)
I115K (60) No binding
I115Y 1.1 (3)
I115D 1.5 (>125)
I115E (2.25) (>250)
N102D 1.1 (1)
I115M,L40S 1.1 (>250)
I115M, N139D (1.75) (60)
I115T,K51R (1.75) (0.8)
I115M plus:
R122G 1 (12.5)
R122N (1.1) (>250)
R122Q 2.5 (3)
R122S 1.5 (3.5)
R122D (6) (23)
R122E (1.2) (>250)
I115M plus:
F128L 1.2 (250#)
F128A 1.2 (2)
F128S 1 (50)
F128T (3.3) (7)
F128I (2.1) (250#)
I115T,K51R,R111H 1.5 (7.5)
I115T,K51R,S167G 1.5 (15)
표 2: 세포성 분석에 의한 생물학적 활성의 요약
OPG 변이체 단백질 TRAIL-유발성 세포자살 분석* RAW 세포 분석 GCT 재흡수 분석
OPG wt +++++ +++++ +++
OPG (R&D systems) +++++ ++++
I115T, K51R +++ +++++
I115M ++ +++ ++
I115M, N139D ++/+++ +++++ ++
I115T, K51R, S167G +++ +++++
I115T, F128V ++ +++++
I115V ++++ +++++ +++
I115M,L40S ++ +++++ ++++
I115D + ++++
I115G + +++++
I115R - ++
I115E - +
* - TRAIL 유발성 세포자살을 차단하는 최소 능력
+++++ TRAIL 유발성 세포자살을 차단하는 최대 능력
SEQUENCE LISTING <110> EvoGenix Ltd <120> Osteoprotegerin variant proteins <130> 504034 <150> US 60/635,722 <151> 2004-12-13 <160> 49 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2291 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (252)..(1454) <400> 1 ctttccgccc cagccctgaa agcgttaacc ctggagcttt ctgcacaccc cccgaccgct 60 cccgcccaag cttcctaaaa aagaaaggtg caaagtttgg tccaggatag aaaaatgact 120 gatcaaaggc aggcgatact tcctgttgcc gggacgctat atataacgtg atgagcgcac 180 gggctgcgga gacgcaccgg agcgctcgcc cagccgccgc ctccaagccc ctgaggtttc 240 cggggaccac a atg aac aag ttg ctg tgc tgc gcg ctc gtg ttt ctg gac 290 Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp 1 5 10 atc tcc att aag tgg acc acc cag gaa acg ttt cct cca aag tac ctt 338 Ile Ser Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu 15 20 25 cat tat gac gaa gaa acc tct cat cag ctg ttg tgt gac aaa tgt cct 386 His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro 30 35 40 45 cct ggt acc tac cta aaa caa cac tgt aca gca aag tgg aag acc gtg 434 Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val 50 55 60 tgc gcc cct tgc cct gac cac tac tac aca gac agc tgg cac acc agt 482 Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser 65 70 75 gac gag tgt cta tac tgc agc ccc gtg tgc aag gag ctg cag tac gtc 530 Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val 80 85 90 aag cag gag tgc aat cgc acc cac aac cgc gtg tgc gaa tgc aag gaa 578 Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu 95 100 105 ggg cgc tac ctt gag ata gag ttc tgc ttg aaa cat agg agc tgc cct 626 Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro 110 115 120 125 cct gga ttt gga gtg gtg caa gct gga acc cca gag cga aat aca gtt 674 Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val 130 135 140 tgc aaa aga tgt cca gat ggg ttc ttc tca aat gag acg tca tct aaa 722 Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys 145 150 155 gca ccc tgt aga aaa cac aca aat tgc agt gtc ttt ggt ctc ctg cta 770 Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu 160 165 170 act cag aaa gga aat gca aca cac gac aac ata tgt tcc gga aac agt 818 Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser 175 180 185 gaa tca act caa aaa tgt gga ata gat gtt acc ctg tgt gag gag gca 866 Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala 190 195 200 205 ttc ttc agg ttt gct gtt cct aca aag ttt acg cct aac tgg ctt agt 914 Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser 210 215 220 gtc ttg gta gac aat ttg cct ggc acc aaa gta aac gca gag agt gta 962 Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val 225 230 235 gag agg ata aaa cgg caa cac agc tca caa gaa cag act ttc cag ctg 1010 Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu 240 245 250 ctg aag tta tgg aaa cat caa aac aaa gac caa gat ata gtc aag aag 1058 Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys 255 260 265 atc atc caa gat att gac ctc tgt gaa aac agc gtg cag cgg cac att 1106 Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile 270 275 280 285 gga cat gct aac ctc acc ttc gag cag ctt cgt agc ttg atg gaa agc 1154 Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser 290 295 300 tta ccg gga aag aaa gtg gga gca gaa gac att gaa aaa aca ata aag 1202 Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys 305 310 315 gca tgc aaa ccc agt gac cag atc ctg aag ctg ctc agt ttg tgg cga 1250 Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg 320 325 330 ata aaa aat ggc gac caa gac acc ttg aag ggc cta atg cac gca cta 1298 Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu 335 340 345 aag cac tca aag acg tac cac ttt ccc aaa act gtc act cag agt cta 1346 Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu 350 355 360 365 aag aag acc atc agg ttc ctt cac agc ttc aca atg tac aaa ttg tat 1394 Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr 370 375 380 cag aag tta ttt tta gaa atg ata ggt aac cag gtc caa tca gta aaa 1442 Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys 385 390 395 ata agc tgc tta taactggaaa tggccattga gctgtttcct cacaattggc 1494 Ile Ser Cys Leu 400 gagatcccat ggatgagtaa actgtttctc aggcacttga ggctttcagt gatatctttc 1554 tcattaccag tgactaattt tgccacaggg tactaaaaga aactatgatg tggagaaagg 1614 actaacatct cctccaataa accccaaatg gttaatccaa ctgtcagatc tggatcgtta 1674 tctactgact atattttccc ttattactgc ttgcagtaat tcaactggaa attaaaaaaa 1734 aaaaactaga ctccattgtg ccttactaaa tatgggaatg tctaacttaa atagctttga 1794 gatttcagct atgctagagg cttttattag aaagccatat ttttttctgt aaaagttact 1854 aatatatctg taacactatt acagtattgc tatttatatt cattcagata taagatttgt 1914 acatattatc atcctataaa gaaacggtat gacttaattt tagaaagaaa attatattct 1974 gtttattatg acaaatgaaa gagaaaatat atatttttaa tggaaagttt gtagcatttt 2034 tctaataggt actgccatat ttttctgtgt ggagtatttt tataatttta tctgtataag 2094 ctgtaatatc attttataga aaatgcatta tttagtcaat tgtttaatgt tggaaaacat 2154 atgaaatata aattatctga atattagatg ctctgagaaa ttgaatgtac cttatttaaa 2214 agattttatg gttttataac tatataaatg acattattaa agttttcaaa ttatttttta 2274 aaaaaaaaaa aaaaaaa 2291 <210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile 1 5 10 15 Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 20 25 30 Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr 35 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro 50 55 60 Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu 85 90 95 Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr 100 105 110 Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe 115 120 125 Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg 130 135 140 Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys 145 150 155 160 Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe 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Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Asp Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 40 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 40 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Glu Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 41 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 41 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Leu Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 42 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 42 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ala Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 43 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 43 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Pro Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 44 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 44 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ser Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 45 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 45 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Thr Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 46 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 46 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Ile Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 47 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human variant protein <400> 47 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Ser Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly His Tyr Leu Glu Met Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys 165 170 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Primer <400> 48 tattactcgc ggcccagccg gccatgaaca agttgctgtg ctgcgcgctc g 51 <210> 49 <211> 50 <212> DNA <213> Primer <400> 49 catctttata atctgcggcc gctaagcagc ttatttttac tgattggacc 50

Claims (37)

  1. RANKL에 대한 결합 친화력을 유지하지만 천연형 OPG에 비해 TRANIL에 대한 결합 친화력은 감소되고, 천연형 OPG에 비하여 한가지 이상의 변형을 포함하는 OPG 변이체 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 잔기 102-130번을 포함하는 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 아미노산 잔기 102, 111, 115, 122, 128 또는 130번 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  4. 제 2항에 있어서, 잔기 107-118번을 포함하는 루프 구조내에 한가지 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  5. 제 4항에 있어서, 잔기 115번 위치에 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  6. 제 5항에 있어서, 잔기 115번 위치의 Ile는 Thr, Met, Val, Asp, Gly, Ser 또는 Arg로 치환된 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  7. 제 2항에 있어서, 잔기 122번 위치에 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  8. 제 7항에 있어서, 잔기 122번 위치의 Arg가 Gly, Gln, Ser, Asn 또는 Glu로 치환된 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  9. 제 2항에 있어서, 잔기 128번 위치에 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  10. 제 9항에 있어서, 잔기 128번 위치의 Phe는 Val, Ala, Leu, Ile 또는 Ser으로 치환된 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  11. 제 2항에 있어서, 잔기 130번 위치에 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  12. 제 11항에 있어서, 잔기 130번 위치의 Val이 Glu 또는 Ala으로 치환된 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  13. 제 1항 내지 12항 중 어느 한항에 있어서, 2개 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  14. 제 13항에 있어서, 잔기 122-130번을 포함하는 부위에 2개 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  15. 제 14항에 있어서, 하기 군으로부터 선택된 2개 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질:
    (i) R122N 및 I115M;
    (ii) R122N 및 I115M;
    (iii) F128S 및 I115M;
    (iv) F128I 및 I115M; 및
    (v) F128L 및 I115M.
  16. 제 13항에 있어서, 잔기 122-130번을 포함하는 부위에서의 하나 이상의 변형과 상기 부위를 제외한 부위에서의 하나 이상의 추가적인 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 추가적인 변형은 잔기 31, 40, 51, 100, 155, 167 또는 168번 잔기들중 어느 하나 이상에서 이루어진 것을 특징으로 하는, OPG 변이 체 단백질.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 추가적인 변형은 Gln21, Glu22, Thr23, Phe24, Pro25, Pro26, Lys27, Tyr28, Leu29, His30, Tyr31, Asp32, Glu33, Glu34, Thr35, Ser36, His37, Gln38, Asp42, Lys43, Pro45, Pro46, Thr48, Lys51, Gln52, His53, Cys54, Thr55, Ala56, Lys57, Trp58, Lys59, Thr60, Val61, Ala63, Pro64, Pro66, Asp67, His68, Tyr69, Asp72, Ser73, Trp74, Thr76, Ser77, Asp78, Glu79, Leu81, Tyr82, Ser84, Pro85, Val86, Lys88, Glu89, Leu90, Tyr92, Val93, Lys94, Gln95, Glu96, Asn98, Arg99, Thr100, His101, Val131, Gln132, Ala133, Gly134, Thr135, Pro136, Glu137, Arg138, Val141, Lys143, Arg144, Cys145, Pro146, Asp147, Gly148, Phe149, Phe150, Ser151, Asn152, Glu153, Thr154, Ser155, Ser156, Lys157, Ala158, Pro159, Cys160, Arg161, Lys162, His163, Thr164, Asn165, Cys166, Ser167, Val168, Phe169, Gly170, Leu171, Leu172, Leu173, Thr174, Gln175, Lys176, Gly177, Asn178, Ala179, Thr180, His181, Asp182, Asn183, Ile184, Cys185, Ser186, Gly187, Asn188, Ser189, Glu190, Ser191, Thr192, Gln193, Lys194, Cys195, Gly196, Ile197, Asp198, Val199, Thr200 또는 Leu201 잔기들 중 어느 하나 이상에서 이루어진 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  19. 제 1항 내지 18항중 어느 한항에 있어서, 표 1에 나타낸 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  20. 제 1항 내지 19항중 어느 한항에 있어서, RANKL에 대한 결합 친화력이 천연형 OPG의 80% 이상인 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  21. 제 1항 내지 20항중 어느 한항에 있어서, 실시예 8에 기재된 분석 조건에서 RANKL에 대한 EC50(nM)은 1 nM 미만인 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  22. 제 1항 내지 제 21항에 있어서, TRAIL에 대한 결합 친화력은 천연형 OPG의 20% 미만인 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  23. 제 1항 내지 22항중 어느 한항에 있어서, 실시예 8에 기재된 분석 조건에서 TRAIL에 대한 EC50(nM)은 10 nM 미만인 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  24. 제 1항 내지 23항중 어느 한항에 있어서, OPG 변이체 단백질은 폴리펩티드에 접합되어 있는 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린 불변 도메인인 것을 특징으로 하는, OPG 변이체 단백질.
  26. 제 1항 내지 25항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 2개 이상 포함하 는 이량체 또는 다량체.
  27. 제 1항 내지 25항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  28. OPG 단백질 또는 그 단편에 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 제조하는 단계, 및 상기 OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화력을 테스트하는 단계를 포함하는, TRAIL에 대한 OPG 결합 친화력을 감소시키는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 천연형 OPG의 잔기 102-130번을 포함하는 영역에 하나 이상의 아미노산을 변형시켜 OPG 변이체 단백질을 제조하는 단계, 및 상기 OPG 변이체 단백질의 TRAIL에 대한 결합 친화력을 테스트하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, TRAIL에 대한 OPG 결합 친화력을 감소시키는 방법.
  30. 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질 및 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는, RANK의 RANKL 결합을 저해 또는 감소시키기 위한 조성물.
  31. RANKL 분자를 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANK의 RANKL 결합을 저해 또는 감소시키는 방법.
  32. 세포를 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, 세포에서 RANK와 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적 작용을 저해 또는 감소시키는 방법.
  33. 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, RANK와 RANKL의 상호작용을 통해 매개되는 생물학적 작용을 저해 또는 감소시키는 방법.
  34. 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환 또는 면역 매개의 염증 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  35. 제 1항 내지 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  36. 파골세포 또는 파골세포 전구체를 함유하고 있는 조직을 제 1항 내지 제 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질에 노출시키는 단계를 포함하는, RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법.
  37. 대상자에게 제 1항 내지 제 26항중 어느 한항에 따른 OPG 변이체 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, RANKL에 의한 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 저해 또는 감소시키는 방법.
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