MXPA01004745A

MXPA01004745A - Nuevos dnas. y polipeptidos.

Info

Publication number: MXPA01004745A
Application number: MXPA01004745A
Authority: MX
Inventors: Karl W Hasel
Original assignee: Digital Gene Tech Inc
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2003-06-09
Also published as: AU2023800A; CA2351167A1; WO2000028033A2; WO2000028033A3; EP1131431A2

Abstract

La presente invencion esta dirigida a la purificacion y aislamiento de nuevos polipeptidos, el acido nucleico que codifica a los polipeptidos, el proceso para la produccion de formas recombinantes de los polipeptidos, anticuerpos generados contra esos polipeptidos, peptidos fragmentados derivados a partir de esos polipeptidos, y su uso.

Description

NUEVOS DNAs Y POLIPEPTIDOS Campo de la Invención La invención se dirige a moléculas novedosas de polipéptidos aislados y purificados y fragmentos de los mismos, a las moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos, a los procesos para la producción de formas recombinantes de tales moléculas de polipéptidos, a anticuerpos generados en contra de tales moléculas de polipéptidos, a péptidos fragmentados derivados de estas moléculas de polipéptidos y usos de los mismos. En particular, la invención se dirige al uso de moléculas de ácido nucleico y polipéptido en el estudio de enfermedades inflamatorias del vientre (IBD) . Descripción del Arte Previo El daño a la barrera epitelial intestinal es un sello distintivo de las enfermedades inflamatorias del vientre (IBD) . Ejemplos de enfermedades inflamatorias del vientre incluyen ileitis, enfermedad de Crohn (CD), que puede afectar el tracto digestivo completo desde la boca hasta el ano, y colitis ulcerante (UC), que afecta solamente al intestino grueso. El estudio de los factores que tienen influencia en la integridad de REF: 129644 la barrera epitelial i n vi vo , es una tarea dificil por una diversidad de razones que incluyen la complejidad del tejido mismo (hay numerosos tipos de células en el intestino incluyendo epiteliales, estromales, endocrinas, neuronales y hematopoyéticas) y los problemas técnicos asociados con la manipulación de tejidos en animales o en órganos aislados. Como resultado de estas cuestiones, se han desarrollado una diversidad de modelos in vi t ro de la función de barrera epitelial durante varios años. El mejor caracterizado de estos modelos, es el sistema de barrera epitelial intestinal T84 ( Dharmsathaphorn y colaboradores, Am . J . Phys i ol . , 246 : G20 -G208 , 1984 y Madara y colaboradores, J. Cel l Bi ol . , 101:2124-2133, 1985) . Las células T84, ya que se derivan de un adenocarcinoma colónico humano, han retenido muchas de las propiedades asociadas con las células de glándulas tubulares colónicas normales. Las células T84 forman monocapas polarizadas que muestran una alta resistencia eléctrica y fluido vectorial y una secreción de cloro recordativa de las glándulas tubulares colónicas í n vi vo . Estas propiedades dependen directamente de un complejo de proteinas referido como uniones firmes y las células T84 expresan mucho de los miembros conocidos de este complejo (Youakim y colaboradores, Submitted for publication, 1998). Estas células también responden a citocinas proinflamatorias, tales como el gamma-interferon (gamma-INF), al disminuir la función de barrera (Youakim y colaboradores, Submitted for publication, 1998; Madara y colaboradores, J. Clin. Invest., 83:724-727 , 1989; y Adams y colaboradores, J. Immunol . , 150:2356-2363, 1993) y al sobre-regular las moléculas MHC de clase II y el antígeno que presenta actividad (Hershberg y colaboradores, J. Clin. Invest. , 102:792-803, 1998) . Este sistema modelo se usa para examinar como se regula la barrera epitelial por diversos agentes tales como el gamma-interferon y células del sistema inmune (por ejemplo, neutrófilos) . El modelo T84 ayuda en la aclaración del mecanismo de rompimiento y recuperación de la barrera en respuesta a estos agentes, y en la identificación de proteina (y genes) que pueden evitar el rompimiento de barrera o estimular la recuperación de barrera. Dada la función importante de la barrera epitelial del intestino y a pesar del creciente campo de conocimiento, existe una necesidad en el arte para el descubrimiento, la identificación, y la clarificación de los papeles de las nuevas proteinas involucradas en la función de barrera del intestino y las IBD. La identificación de la estructura primaria o secuencia, de una proteina desconocida es la culminación de un proceso profundo de experimentación. Con objeto de identificar una proteina desconocida, el investigador puede confiar en la comparación de la proteina desconocida con péptidos conocidos usando una diversidad de técnicas conocidas por aquellos hábiles en el arte. Por ejemplo, las proteinas se analizan rutinariamente utilizando técnicas tales como electroforesis, sedimentación, cromatografia, secuenciado y espectrometría de masa. En particular, la comparación de una proteina desconocida con polipéptidos de peso molecular conocidos permite la determinación del peso molecular aparente de la proteina desconocida (T.D. Brock y M.T. Madigan, Bi ol ogy of Mi croorga n i sm s 76-77 (Prentice Hall, 6a ed. 1991) ) . Los estándares del peso molecular de proteinas, están comercialmente disponibles para ayudar en la estimación de los pesos moleculares de proteínas desconocidas (New England Biolabs Inc. Catalog: 130-131, 1995; J.L. Hartley, U.S. Patent No. 5,449,758) . Sin embargo, los estándares de peso molecular pueden no corresponder lo suficientemente próximo en tamaño a la proteina desconocida, para permitir una estimación precisa del peso molecular aparente. La dificultad en la estimación del peso molecular está combinada en el caso de las proteínas que se someten a fragmentación por medios enzimáticos o químicos, modificadas por modificación o procesamiento por post-traduccional, y/o asociadas con otras proteinas en complejos no covalentes. Además, la naturaleza única de la composición de una proteína con respecto a sus constituyentes específicos de aminoácidos, resulta en un posicionamiento único de sitios de desdoblamiento dentro de la proteina. La fragmentación especifica de una proteina por desdoblamiento químico o enzimático, resulta en una "huella digital de péptido" única (D. W. Cleveland y colaboradores, J. Bi o l . Ch em . 252:1102-1106, 1977; M. Brown y colaboradores, J. Gen . Vi rol . 50:309-316, 1980) . Consecuentemente, el desdoblamiento en sitios específicos resulta en una fragmentación reproducible de una proteina dada en péptidos de pesos moleculares precisos. Además, estos péptidos poseen características únicas de carga que determinan el pH isoeléctrico del péptido. Estas características únicas se pueden explotar usando una diversidad de técnicas electroforét icas y otra (T.D. Brock y M.T. Madigan, Bi ol ogy of Mi croorga n i sm s 79-77 (Prentice Hall, 6d . 1991) ) . La fragmentación de proteinas se emplea además para el análisis de composición de aminoácidos y la formación de secuencias de proteinas (P. Matsudiara, J. Bi ol . Ch em . 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskorn y colaboradores, El ec t roph ores i s 1988, 9:830-838, 1988), particularmente la producción de fragmentos a partir de proteina con un término N "bloqueado". Además, las proteinas fragmentadas se pueden usar para inmunización, para selección por afinidad (R. A. Brown, U.S. Patent No. 5,151,412), para la determinación de sitios de modificación (por ejemplo, fosforilación), para la generación de compuestos biológicos activos (T.D. Brock y M.T. Madigan, Bi o l ogy of Mi croorga n i sm s 300-301 (Prentice Hall, 6d. 1991)), y para la diferenciación de proteinas homologas (M. Brown y colaboradores, J. Gen . Vi rol . 50 : 309-316, 1980) . Además, cuando se obtiene la huella digital de un péptido de una proteína desconocida, se puede comparar con una base de datos de proteinas conocidas para ayudar en la identificación de la proteina desconocida usando espectrometría de masas (W.J. Henzel y colaboradores, Proc. Na t i . Aca d . S ci . USA 90:5011-5015, 1993; D. Fenyo y colaboradores, El e c t rophores i s 19:998-1005, 1998) . Una diversidad de programas de cómputo para facilitar estas comparaciones está disponible por medio del Internet, tales como el Protein Prospector (sitio Internet: prospector.uscf.edu), Multildent (sitio Internet: www. expasy. ch/sprot/multiident-html) , Pept ideSearch (sitio Internet: www.mann.emblheiedelberg.de... deSearch/ FR_Pept ideSearch For. html), y ProFound (sitio Internet: www. chait-sgi . rockefeller. edu/cgi-bin/prot-id-frag.html) . Estos programas le permiten al usuario especificar el agente de desdoblamiento y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia diseñada. Los programas comparan estos pesos moleculares con la información de peso molecular de las proteinas almacenada en bases de datos para ayudar en la determinación de la identidad de la proteina desconocida. La información precisa relativa al número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de esos péptidos, se requiere para identificación precisa. Por lo tanto, el incremento en la precisión para determinar el número de péptidos fragmentados y su peso molecular, debe resultar en una probabilidad creciente de éxito en la identificación de proteínas desconocidas. Además, los productos de digestión de péptidos de proteinas desconocidas, se pueden formar en secuencia utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS), y la secuencia resultante buscarla contra bases de datos (J.K. Eng, Y colaboradores, J . Am . Soc . Ma ss Spec . 5:976-989 (1994); M. Mann y M. Wilm, Ana l . Ch em . 66:4390-4399(1994); J.A. Taylor y R.S. Johnson, Rapi d Comm . Ma ss Spec . 11:1067-1075 (1997)). Los programas de búsqueda que se pueden usar en este proceso existen en el Internet, tal como Lutefisk 97 (sitio Internet: www . lsbc . com : 70 /Lutef is k97. html ) , y los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound arriba descritos. Por lo tanto, al agregar la secuencia de un gen y su secuencia predecible de proteina y fragmentos de péptido a una base de datos de secuencias, puede ayudar a la identificación de proteinas desconocidas utilizando espectrometría de masas en tándem. Asi, también existe una necesidad en el arte de polipéptidos apropiados para su uso en estudios de fragmentación de péptidos, preferiblemente, polipéptidos que han alterado la expresión en enfermedades irritantes del vientre, para su uso en mediciones de peso molecular, y para uso en formación de secuencias de proteina utilizando espectrometría de masas en tándem. Descripción de la Invención Utilizando el modelo T84, se determinó que ciertos polipéptidos han alterado (sobre-regulado o sub-regulado ) patrones de expresión en respuesta al INF-gamma. Dichas moléculas pueden tener un papel en la función de barrera en el intestino y en las IBD y pueden ser útiles como agentes terapéuticos potenciales en el tratamiento de IBD y otras patologías del intestino. La invención ayuda a cumplir estas necesidades en el arte, al proporcionar ácidos nucleicos y polipéptidos aislados codificados por estos ácidos nucleicos que tienen características alteradas de expresión en el modelo de barrera de intestino T84. Las modalidades particulares de la invención, se dirigen a moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden las secuencias ADN de SEC ID Nos. 1-23, y las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácido de SEC ID Nos. 24-33, asi como las moléculas de ácido nucleico complementarias a estas secuencias. Las secuencias de ácido nucleico de ADN y ARN de simple hebra y de doble hebra, están comprendidas por la invención, asi como moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a un ADN de doble hebra desnaturalizado, que comprenden todo o una porción de la SEC ID Nos. 1-23 y/o, el ADN que codifica las secuencias de aminoácido de la SEC ID Nos. 24-23. También están comprendidas las moléculas aisladas de ácido nucleico que se derivan por mutagénesis i n vi t ro a partir de moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de SEC ID Nos. 1-23, que se degeneran de moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de SEC ID Nos. 1-23, y que son variantes alélicas del ADN de la invención. La invención también comprende vectores recombinantes que dirigen la expresión de estas moléculas de ácido nucleico y células huésped transformadas o transfectadas con estos vectores. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos 80%, preferiblemente 85%, más preferiblemente 90%, óptimamente 95%, idéntica a la secuencia de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de : (a) un fragmento de polinucleótido de la SEC ID NO: 1-23 o un polinucleótido que se puede hibridizar a la SEC ID NO: 1-23; (b) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 1-23 o un fragmento polipéptido codificado por la secuencia cADN que se puede hibridizar a la SEC ID NO: 1-23; (c) un polinucleótido que codifica un epitope de polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 1-23 o un epitope de polipéptido codificado por una secuencia cADN que se hibridiza a una SEC ID NO: (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 1-23 que tiene actividad biológica; (e) un polinucleótido que es una variante de SEC ID NO: 1-23; (f) un polinucleótido que es una variante alélica del SEC ID NO: 1-23; (g) un polinucleótido que codifica un homólogo de especie de una traducción de SEC ID NO: 1-23 (h) un polinucleótido capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas cualquiera de los polinucleótidos especificados en (a)-(h), en donde el polinucleótido no se hibridiza bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de solamente residuos A o de solamente residuos T. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos 80%, preferiblemente 85% más preferiblemente 90%, óptimamente 95%, idéntica a una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupos que cons i s t e de : (a) un fragmento polinucleótido de la SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21 o un polinucleótido que se puede hibridizar a la SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21; (b) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de una traducción de la SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21 o un fragmento polipéptido codificado por la secuencia de cADN que se puede hibridizar a la SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21; (c) un polinucleótido que codifica un epitope de polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21 o un epitope de polipéptido codificado por una secuencia de cADN, que se puede hibridizar a SEC ID NO: 1,7,8,10,1 -17,19,21; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21 que tiene actividad biológica; (e) un polinucleótido que es una variante de SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,21; (f) un pol mucleótido que es una variante alélica de SEC ID NO: 1,7,8,10,1 -17,19,21; (g) un polinucleótido que codifica un homólogo de especie de una traducción de SEC ID NO: 1,7,8,10,14-17,19,211,7,8,10,14-17,19,21; (h) un polinucleótido capaz de hibridizarse bajo condiciones rigurosas a cualquiera de los polinucleótidos especificados en (a)-(h), en donde el polinucleótido no se hibridiza bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia en nucleótido de solamente residuos A o solamente residuos T. En otra modalidad, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 80% preferiblemente 85% más preferiblemente 90%, óptimamente 95%, idéntica a una secuencia de polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un fragmento de polinucleótido de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23 o un polinucleótido que se puede hibridizar a SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23; (b) un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23 o un fragmento de polipéptido codificado por la secuencia cADN que se hibridiza a SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23; (c) un polinucleótido que codifica un epitope de polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23 o un epitope de polipéptido codificado por una secuencia cADN que se hibridiza a SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido de una traducción de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23, que tiene actividad biológica; (e) un polinucleótido que es una variante de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23; (f) un polinucleótido que es una variante alelica de SEC ID NO: 2-6,9,11-13,18,20,22,23; (g) un polinucleótido que codifica un homólogo de especie de una traducción de SEC ID NO: 2 -6,9,11-13,18,20,22,23; (h) un polinucleótido capaz de hibridizarse bajo condiciones rigurosas a cualquiera de los polinucleótidos especificados en (a)-(h), en donde el polinucleótido no se hibridiza bajo condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido de solamente residuos A o solamente residuos T.

En una modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteina segregada. En las modalidades preferidas, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido elegido del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de polipéptido identificada como una traducción de SEC ID NO: 1-23; (b) un polipéptido que tiene la secuencia de polipéptido de SEC ID NO: 24-33; y (c) un polipéptido codificado por el cADN que se puede hibridizar a SEC ID NO: 1-23. Tipicamente, la molécula aislada de ácido nucleico comprende la secuencia completa de nucleótido de SEC ID NO: 1-23 o una secuencia cADN que se puede hibridizar a SEC ID NO: 1-23. Tipicamente la molécula aislada de ácido nucleico comprende eliminaciones secuenciales de nucleótidos a partir de las porciones de la secuencia de nucleótido que codifica el término C o el término N del pol ipépt ido . En otros aspectos, la invención proporciona un vector recombinante que comprende la molécula aislada de ácido nucleico y un método de elaboración de una célula huésped recombinante que comprende la molécula aislada de ácido nucleico y la célula huésped recombinante producida por tal método . En otras modalidades preferidas, la invención proporciona un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80% preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, idéntica a la secuencia de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un fragmento polipéptido de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; (b) un polipéptido que tiene la secuencia de SEC ID NO: 24-33; (c) un dominio polipéptido de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; (d) un epitope de polipéptido de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; (e) una forma segregada de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; (f) una proteina de longitud completa de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; (g) una variante de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID N0 : 1 -23 ; (h) una variante alélica de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23; y (i) un homólogo de especies de un polipéptido codificado por un polinucleótido de SEC ID NO: 1-23. En algunas modalidades, el polipéptido de longitud completa comprende eliminaciones secuenciales de amino ácidos de la terminación C. En otras modalidades, los polipéptidos maduros comprenden eliminaciones secuenciales de aminoácidos de la terminación C. Alternativamente, el polipéptido de longitud completa puede comprender eliminaciones secuenciales de aminoácidos a partir de la terminación N o el polipéptido maduro puede comprender eliminaciones secuenciales de aminoácidos a partir de la terminación N. En otros aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al polipéptido aislado, una célula huésped recombinante que expresa el polipéptido aislado, y un método de elaboración de un polipéptido aislado que comprende el cultivo de la célula huésped recombinante bajo condiciones tales que el polipéptido se expresa; y la recuperación de dicho pol ipépt ido . La invención en otra modalidad, es un método para la prevención, tratamiento o mejoramiento de enfermedades irritantes del vientre que comprende la administración a un mamífero sometido a una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido aislado o de la molécula de ácido nucleico aislado. En otra modalidad, la invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad irritante del vientre o una susceptibilidad a enfermedad irritante del vientre en un sujeto que comprende: determinar la presencia o ausencia de una mutación en la molécula aislada de ácido nucleico, y diagnosticar una enfermedad irritante del vientre o una susceptibilidad a enfermedad irritante del vientre con base en la presencia o ausencia de dicha mutación. Alternativamente, la enfermedad irritante del vientre o una susceptibilidad a enfermedad irritante del vientre en un sujeto, se puede diagnosticar por un método que comprende: determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido en una muestra biológica; y diagnosticar la enfermedad irritante del vientre o una susceptibilidad a enfermedad irritante del vientre con base en la presencia o cantidad de la expresión del polipéptido. Tipicamente, un componente de enlace del polipéptido se identifica al poner en contacto el polipéptido con un componente de enlace; y determinar si el componente de enlace afecta una propiedad fisica o una actividad del polipéptido. Tipicamente la actividad en un ensayo biológico de un polipéptido segregado, se identifica al expresar el polinucleótido de SEC ID NO: 1-23 en una célula; aislar el sobrenadante; detectar la actividad en un ensayo biológico; e identificar el polipéptido en el sobrenadante que tiene la actividad.

Además, la invención comprende métodos de uso de ácidos nucleicos observados arriba para identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas homologas a la SEC ID NO: 24-23; para identificar cromosomas humanos que contienen las secuencias de nucleótido de la invención; para mapear genes cerca de las secuencias de nucleótido de la invención en cromosomas humanos; y para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras condiciones humanas asociadas con los cromosomas humanos que contiene la secuencia de la invención. Por ejemplo, cuatro de las secuencias de nucleótido de la invención IMX4 e IMX56, IMX21, e IMX44 se localizan en los cromosomas 22, 22 7 y 19, respectivamente (el IMX4 y el IMX56 se localizan ambos en el cromosoma 22) . De esta manera, las secuencias de nucleótido arriba nombradas IMX4, IMX56, IMX21, e IMX44) se pueden mostrar para identificar los cromosomas humanos número 22, 7 y 19; para mapear genes en los cromosomas humanos número 22, 7 y 19; para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras condiciones humanas asociadas con los cromosomas humanos de números 22 , 7 y 19. La invención también comprende el uso de oligonucleótidos de sentido o antisentido a partir de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 1-23 para inhibir la expresión de los polinucleótidos codificados por las secuencias de nucleótidos de la invención . La invención también comprende polipéptidos aislados y fragmentos de los mismos, codificados por estas moléculas de ácido nucleico incluyendo porciones solubles de polipéptidos de SEC ID NO: 24-33. La invención comprende además métodos para la producción de estos polipéptidos, incluyendo el cultivo de células huésped bajo condiciones que promueven la expresión y recuperación del polipéptido a partir del medio de cultivo si se segregan o a partir de células cultivadas si no se segregan. Especialmente, la expresión de estos polipéptidos en bacterias, levadura, plantas, insectos y células animales esta cubierta por la invención . Además, la invención incluye ensayos que utilizan estos polipéptidos, para tamizar inhibidores potenciales de la actividad asociados con moléculas de polipéptido de estructura contraria, y métodos de uso de estos polipéptidos como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por las moléculas de estructura contraria de polipéptidos además, los métodos de uso de estos polipéptidos en el diseño de inhibidores de los mismos es también un aspecto de la invención. La invención incluye además un método de uso de estos polipéptidos como marcadores de peso molecular que permiten la estimación del peso molecular de una proteina o una proteina fragmentada, asi como un método para la visualización de los marcadores de peso molecular de la invención usando electroforesis. La invención comprende además métodos para uso de los polipéptidos de la invención como marcadores para determinar el punto isoeléctrico de una proteina desconocida, asi como controles para establecer el grado de fragmentación de una proteina. También cubierto por esta invención están los estuches para auxiliar en estas determinaciones. También cubierto por esta invención, está el uso de secuencias de ácido nucleico IMX, secuencias predecibles de aminoácidos del polipéptido o fragmentos de los mismos, para su uso en la búsqueda en bases de datos electrónicas para ayudar en la identificación de proteinas y/o ácidos nucleicos de muestra. La invención también cubre los polipéptidos IMX y el uso de estos polipéptidos como reactivos de investigación para estudiar adicionalmente la función y regulación de la barrera epitelial del intestino, y reactivos terapéuticos para tratar enfermedades inflamatorias del vientre y otras patologías del intestino. Los anticuerpos policlonales o monoclonales aislados que se enlazan a estos polipéptidos también están cubiertos por la invención, además del uso de estos anticuerpos para ayudar en la purificación de pol ipépt idos" IMX. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 4 (SEC ID NO: 1) . La figura 2 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 10 (SEC ID NO: 14) . La figura 3 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 21 (SEC ID NO: 15) . La figura 4 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 28 (SEC ID NO: 16) .

La figura 5 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 32 (SEC ID NO: 17) . La figura 6 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 39 (SEC ID NO: 19) . La figura 7 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 40 (SEC ID NO: 7) . La figura 8 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 42 (SEC ID NO: 8) . La figura 9 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 44 (SEC ID NO: 21) . La figura 10 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 56 (SEC ID NO: 10) . La figura 11 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 4 (SEC ID NO: 24) . La figura 12 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 10 (SEC ID NO: 25) . La figura 13 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 21 (SEC ID NO: 26) . La figura 14 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 28 (SEC ID NO: 27) . La figura 15 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 32 (SEC ID NO: 28). La figura 16 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 39 (SEC ID NO: 29) .

La figura 17 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 40 (SEC ID NO: 30) . La figura 18 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 42 (SEC ID NO: 31) . La figura 19 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 44 (SEC ID NO: 32) . La figura 20 presenta la secuencia de nucleótido de IMX 56 (SEC ID NO: 33) . La figura 21 presenta la secuencia de nucleótido de la terminación 5' del clon (SEC ID NO: 13) acoplado a una parte del gene humano ApoL (AF019225) . La figura 22 presenta la comparación de la terminación 5' del clon que sugiere que representa un producto de división alternativo al reportado por ApoL, i.., bases 1-168 acoplado a 2 exones en el PAC que lleva al gen ApoL pero que no está incluido en el cADN completo reportado. Descripción Detallada de la Invención Definiciones Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados a través de esta especificación. En la presente invención, "aislado" se refiere al material separado de su medio original (por ejemplo, el medio natural en caso de que se presente naturalmente), y se altera de esta manera "por la mano del hombre" de su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede ser parte de un vector o una composición de materia, o puede contenerse dentro de una célula, y aún "aislarse" debido a que el vector, composición de materias o célula particular no es el medio original del polinucleótido. En la presente invención, una proteina "segregada" se refiere a aquellas proteinas capaces de dirigirse al ER, vesículas segregantes, o el espacio extracelular como el resultado de una secuencia de señal, asi como aquellas proteinas liberadas dentro del espacio extracelular sin contener necesariamente una secuencia de señal. Si la proteina segregada se libera dentro del espacio extracelular, la proteína segregada puede someterse a un procesamiento extracelular para producir una proteina "madura". La liberación dentro del espacio extracelular, puede suceder por diversos mecanismos, incluyendo la exocitosis y el desdoblamiento proteoli t ico . Como se usa aqui, un "polinucleótido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en la SEC ID NO: 1-23. Por ejemplo, el polinucleótido puede contener todo o un parte de la secuencia de polinucleótido de la secuencia cADN de longitud completa, incluyendo las secuencias no traducidas 5' y 3', la región codificante, con o sin la secuencia de señal, la región codificante de proteína segregada, asi como fragmentos, epitopes, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico, además, como se usa aqui, un "polipéptido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia traducida de aminoácido generada a partir del polinucleótido como se describe ampliamente. Un "polinucleótido" de la presente invención también incluye aquellos polinucleótidos capaces de hibridizar, bajo condiciones de hibridización rigurosas, a secuencias contenidas en SEC ID NO: 1-23, o el complemento de la misma o el cADN . "Condiciones rigurosas de hibridización" se refiere a una incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende formamida al 50% 5x SSC (NaCl 750 mM , citrato de sodio 75mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), una solución Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en O.lx SSC a alrededor de 65°C. También están contempladas las moléculas de ácido nucleico que se hibridizan a los polinucleótidos de la presente invención en condiciones menos rigurosas de hibridización. Los cambios en el rigor de la hibridización y la detección de señal, se llevan a cabo principalmente a través de la manipulación de la concentración de formamida (los porcentajes menores de formamida resultan en una rigurosidad disminuida); condiciones de sal o temperatura. Por ejemplo, las condiciones de rigurosidad menor incluyen una incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = NaCl 3M; NaH2PO$ 0.2M; EDTA 0.02M, pH 7.4), 0.5% de SDS, formamida al 30%, y 100 ug/ml de esperma de salmón que bloquea el ADN; seguido por lavados a 50°C con 1XSSPE, 0.1% de SDS. Además, para alcanzar una rigurosidad aún menor, se pueden hacer lavados llevados a cabo siguiendo la hibridización rigurosa a concentraciones superiores de sal (por ejemplo, %X SSC) . Obsérvese que las variaciones en las condiciones anteriores se pueden llevar a cabo a través de la inclusión y/o substitución de reactivos de bloqueo alterno usados para suprimir los antecedentes en los experimentos de hibridización. Los reactivos típicos de bloqueo incluyen el reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y formulaciones propietarias disponibles comercialmente. La inclusión de reactivos específicos de bloqueo, puede requerir lá modificación de las condiciones de hibridización arriba descritas, debido a problemas con la compatibilidad. Por supuesto, un polinucleótido el cual se hibridiza solamente a secuencias poliA+ (tal como un tracto poliA+ terminal 3' de un cADN mostrado en el listado de secuencia) o a una extensión complementaria de los residuos T (o U) no estarla incluida en la definición de "polinucleótido", ya que tal polinucleótido hibridizará cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una extensión poli (A) o el complemento en la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cADN de doble hebra ) . El polinucleótido de la presente invención, se puede componer de cualquier pol i r ibonucleót ido o polidesoxiribonucleótido, el cual puede ser un ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos de ADN de doble o simple hebra, el ADN que es una mezcla de regiones de doble o simple hebra, ARN de doble o simple hebra, y ARN que es una mezcla de regiones de doble o simple hebra, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de simple hebra o más típicamente de doble hebra o una mezcla de regiones de simple y doble hebra. Además, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. Un polinucleótido puede también contener una o más bases modificadas o columnas de ADN o ARN modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no usuales tales como inosina. Se pueden hacer una diversidad de modificaciones al ADN y ARN; asi, el "polinucleótido" abarca formas modificadas química enzimática o metabólicamente. El polipéptido en la presente invención se puede componer de aminoácidos unidos a cada uno de los enlaces péptidos o enlaces péptidos modificados, esto es, isoésteres de péptido y puede contener aminoácidos diferentes a los aminoácidos codificados de 20 genes. Los polipéptidos se pueden modificar por cualesquiera procesos naturales, tales como procesamiento pos t traduccional , o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en el arte. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, asi como en la literatura de investigación voluminosa. Las modificaciones pueden suceder en cualquier lugar en el polipéptido, incluyendo la columna del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y las terminaciones aminocarboxi lo . Se apreciará que el mismo tipo de modificación, puede estar presente en grados iguales o variables en diversos sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados por ejemplo, como resultado de la ubicuidad, y pueden ser típicos con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos ramificados y cíclicos ramificados, pueden resultar de procesos naturales de pos t t raducción o pueden hacerse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, colocación covalente de flavina, colocación covalente de una porción hemo, colocación covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, colocación covalente de un lipido o un derivado de lipido, colocación covalente de fosfot idilinositol , reticulado, ciclización, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación , glicosilación, formación de anclajes GPl, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteol it ico , fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación , sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteinas tal como la arginilación, y la ubicuidad. (Ver por ejemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter y colaboradores, Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan y colaboradores, Ann NY Acad Sci 663: 48-62 (1992) ) . "Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a polipéptidos que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de un polipéptido de la presente invención, incluyendo formas maduras, como se mide en el ensayo biológico particular con o sin la dependencia de dosis. En el caso donde existe la dependencia de dosis, no necesita ser idéntica a aquella del polipéptido, sino más bien substancialmente similar a la dependencia de dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención, (esto es, el polipéptido candidato mostrará una actividad mayor o no mayor de 25 veces menos y, preferiblemente, no mayor de alrededor de 10 veces menos actividad y más preferiblemente, no mayor que alrededor de 3 veces menos actividad en relación al polipéptido de la presente invención) . La secuencia traducida de aminoácido, que comienza con la metionina, se identifica aunque otras estructuras de lectura se pueden traducir fácilmente usando técnicas conocidas de biología molecular. Los polipéptidos producidos por la traducción de estas estructuras de lectura alternativas abiertas, se contemplan específicamente por la presente invención. La SEC ID NO: 1-23 y las traducciones de la SEC ID NO: 1-23 asi como la SEC ID NO: 24-33 son suficientemente precisas y de otra manera apropiadas, para una diversidad de usos bien conocidos en el arte y descritos adicionalmente abajo. Estas sondas también hibridizarán las moléculas de ácido nucleico en las muestras biológicas, permitiendo asi una diversidad de métodos de diagnóstico y forenses de la invención. Similarmente, los polipéptidos de las traducciones de la SEC ID NO: 1-23 se pueden usar para generar anticuerpos los cuales se enlazan específicamente a las proteinas segregadas codificadas por los clones identificados de cADN . Sin embargo, las secuencias de ADN generadas por la reacción en secuencia pueden contener errores de formación de secuencia. Los errores existen como nucleótidos mal identificados o como inserciones o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia generada de ADN. Los nucleótidos erróneamente insertados o eliminados, provocan cambios en las estructuras de lectura de la secuencia predecible de aminoácido. En estos casos, la secuencia predecible de aminoácido difiere de la secuencia actual de aminoácido aunque la secuencia generada de ADN puede ser mayor en un 99.9% idéntica a la secuencia actual de ADN (por ejemplo, una inserción o eliminación base en una estructura de lectura abierta sobre 1000 bases) . La presente invención también se refiere a los genes que corresponden a la SEC ID NO: 1-23, y traducciones de la SEC ID NO: 1-23. El gen correspondiente se puede aislar de conformidad con los métodos conocidos utilizando la información de secuencia aqui descrita. Tales métodos incluyen la preparación de sondas o cebadores a partir de la secuencia descrita e identificando o amplificando el gen correspondiente a partir de las fuentes apropiadas de material genómico. También proporcionando la presente invención están los homólogos de especie. Los homólogos de especie se puede aislar e identificar al hacer sondas o cebadores de las secuencias aquí proporcionadas y tamizando una fuente apropiada de ácido nucleico para el homólogo deseado.

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar de cualquier manera en particular. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que se presentan naturalmente, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Los medios para la preparación de tales polipéptidos son bien entendidos en el arte. Los polipéptidos pueden estar en forma de proteina segregada, incluyendo la forma madura, o pueden ser una parte de una proteina mayor, tal como una proteina de fusión (ver abajo) . Es a menudo ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácido que contiene secuencias segregantes o libres, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tal como residuos múltiples de histidina o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y están preferiblemente purificados substancialmente. Una versión producida de forma recombinante de un polipéptido que incluye el polipéptido segregado, se puede purificar substancialmente por un método de una etapa descrito en Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988). Los polipéptidos de la invención también se pueden purificar a partir de fuentes naturales o recombinantes, utilizando anticuerpos de la invención presentados en contra de las proteinas segregadas en los métodos que son bien conocidos en el arte . Secuencias de señal Están disponibles métodos para predecir si una proteína tiene una secuencia de señal, asi como el punto de desdoblamiento para esa secuencia. Por ejemplo, el método de McGeoch, Virus Res. 3:271-286 (1985), utiliza la información a partir de una región de carga terminal N corta y una región subsecuente no cargada de la proteina completa (no partida) el método de von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986) utiliza la información a partir de los residuos que rodean el sitio de partición, tipicamente los residuos -13 a +2 en donde +1 indica la terminación amino de la proteina segregada. Por lo tanto, a partir de una secuencia deducida de aminoácido, se puede identificar una secuencia de señal y una secuencia madura .

Variantes de Polinucleótido y Polipéptido "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido de la presente invención, pero que retiene las propiedades esenciales de los mismos. Generalmente, las variables son cercanamente similares en lo global y, en muchas regiones idénticas al polinucleótido o polipéptido de la presente invención. Modalidades adicionales de la presente invención, incluyen polinucleótidos que tienen al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad y más preferiblemente al menos 95%, 96% 97% 98% ó 99% de identidad con una secuencia contenida en SEC ID NO: 1-23. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien con habilidad ordinaria en el arte reconocerá inmediatamente que un gran número de polinucleótido que tiene al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97; 98%, ó 99% de identidad, codificará un polipéptido idéntico a una secuencia de aminoácido contenida en las traducciones de SEC ID NO: 1-23. Similarmente, por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene al menos por ejemplo, 95% "identidad" a un polipéptido de referencia, se pretende que la secuencia de amino'ácido del polipéptido, sea idéntica al polipéptido de referencia excepto en que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de longitud total del polipéptido de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a la secuencia de referencia de aminoácido, pueden eliminar o substituir hasta un 5% de los residuos aminoácido en la secuencia de referencia con otro aminoácido, o se puede insertar un número de aminoácido hasta del 5% de los residuos totales de aminoácido en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia, pueden suceder en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de referencia de aminoácido o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, diseminadas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Las modalidades adicionales de la presente invención, incluyen polipéptidos que tienen al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad y más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97% 98% ó 99% de identidad a una secuencia de aminoácidos contenida en la traducciones de SEC ID NO: 1-23. Preferiblemente, los polipéptidos anteriores deben mostrar al menos una actividad biológica de la proteina. En una modalidad preferida, los polipéptidos de la presente incluyen polipéptidos que tienen al menos 90% de similaridad, más preferiblemente al menos 95% de similaridad, y todavia más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98% o 99% de similaridad con una secuencia de aminoácido contenida en las traducciones de SEC ID NO: 1-23 asi como las secuencias de aminoácido de SEC ID NO: 24-33. Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones de código, regiones no de código o ambas. Se prefieren especialmente variantes de polinucleótido que contienen alteraciones que producen substituciones, adiciones o eliminaciones silentes, pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren las variantes de nucleótido producidas por substituciones silentes debido a la degeneración del código genético. Más aun, también se prefieren variantes en las cuales 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos se substituyen eliminan o agregan en cualquier combinación. Se pueden producir las variantes de polinucleótido por una diversidad de razones, por ejemplo, para optimizar la expresión del codón para un huésped particular (codones de cambio en el mARN humano a aquellos preferidos por el huésped bacteriano tal como el E . co l i ) . Las variantes que se presentan naturalmente se llaman "variantes alélicas" y se refieren a una de varias formas alternas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985) ) . Estas variantes alélicas pueden variar en el nivel de polinucleótido y/o polipéptido.

Alternativamente, las variantes que se presentan de forma no natural se pueden producir por técnicas de mutagénesis o por sintesis directa. El uso de métodos conocidos de ingeniería de proteinas y de tecnología recombinante de ADN, puede generar variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden eliminar de la terminación N o la terminación C de la proteina segregada sin una pérdida substancial de la función biológica. Los autores de Ron y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993), reportan proteínas variantes KGF que tienen una actividad de enlace a la heparina aún después de eliminar 3,8, ó 27 residuos de aminoácidos de terminación amino. Similarmente, el gamma-interferon muestra hasta 10 veces mayor actividad después de eliminar 8-10 residuos de aminoácido a partir de la terminación carboxi de esta proteina. (Dobeli y colaboradores, J. Biotechnology 7:199-216 (1988)) . Más aún, la evidencia amplia demuestra que las variantes a menudo retienen una actividad biológica similar a aquella de la proteina que se presenta naturalmente. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993)) llevaron a cabo un análisis mutacional detallado de la citocina humana IL-la. Utilizaron mutagénesis aleatoria para generar más de 3,500 mutantes individuales de IL-la que promediaron 2.5 cambios de aminoácido por variante durante la longitud completa de la molécula. Las mutaciones múltiples se examinaron en cada posición posible de aminoácido. Los investigadores encontraron que "la mayoría de la molécula se puede alterar con un efecto menor en la actividad biológica o de enlace" (ver Gayle y colaboradores, (1993) Abstract) . De hecho, solamente 23 secuencias particulares de aminoácido, de más de 3,500 secuencias de nucleótido examinadas, produjeron una proteina que diferia significativamente en actividad del tipo silvestre. Adicionalmente, aún eliminando uno o más aminoácidos de la terminación N o de la terminación C de un polipéptido, resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, otras actividades biológicas que pueden todavia retener. Por ejemplo, la capacidad de una variante de eliminación para inducir o para enlazar anticuerpos que reconocen la forma segregada, probablemente será retenida cuando menos de la mayoría de los residuos de la forma segregada se eliminen a partir de la terminación N o la terminación C. Un polipéptido en particular que carece de residuos terminales N o C de una proteina retiene tales actividades inmunogénicas, se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aqui descritos y conocidos de otra forma en el arte . Asi, la invención incluye además variantes de polipéptido que muestran actividad biológica substancial. Tales variantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones seleccionadas de conformidad con las reglas generales conocidas en el arte, de manera de tener un efecto menor en la actividad. Por ejemplo, la guía en cuanto a como se hacen las substituciones de aminoácidos silentes fenot ipicament e se proporciona en Bowie, J.U. y colaboradores, Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos principales estrategias para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácido al cambio como los autores lo mencionan, estas dos estrategias, selección natural e ingeniería genética han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes de las substituciones aminoácido. Los autores indican además cuales cambios de aminoácido son probables de permitirse en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteina. Por ejemplo, los residuos de aminoácido más ocultos (dentro de la estructura terciaria de la proteina requieren cadenas laterales no polares, puesto que se conservan generalmente algun'as características de las cadenas laterales de superficie. Más aun, las substituciones de aminoácido conservadoras toleradas involucran la substitución de los aminoácidos alifáticos o hidrofóbicos Ala, Val, Leu e lie; la substitución de los residuos hidroxilo Ser y Thr; la substitución de los residuos ácidos Asp y Glu; la substitución de los residuos amida Asn y Gln; la substitución de los residuos básicos Lys, Arg, e His; la substitución de los residuos aromáticos Phe, Tyr, y Trp, y la substitución de los aminoácidos de tamaño pequeño Ala, Ser, Thr, Met, y Gly. Además de la substitución conservadora de aminoácidos, variantes de la presente invención incluyen (i) substituciones con uno o más de los residuos no conservados de aminoácidos, en donde los residuos substituidos de aminoácidos pueden o no pueden ser alguno codificado por el código genético, o (ii) substitución con uno o más de los residuos de aminoácido que tienen un grupo substituyente, o (iii) la fusión del polipéptido maduro con otro compuesto tal como un compuesto para incrementar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) o, (iv) la fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales tal como un péptido de la región de fusión IgG o una secuencia segregante o lider, o una secuencia que facilite la purificación. Tales polipéptidos variantes merecen estar dentro del alcance de aquellos hábiles en el arte a partir de las enseñanzas de esta invención. Por ejemplo, las variantes de polipéptido que contienen substituciones de aminoácido de aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutrales, pueden producir proteinas con características mejoradas tal como una agregación menor. La agregación de las formulaciones farmacéuticas reduce la actividad e incrementa el espacio debido a la actividad inmunogénica del agregado. (Pinckard y colaboradores, Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins y colaboradores, Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland y colaboradores, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993) ) .

Fragmentos de polinucleótidos y polipéptidos En la presente invención, un "fragmento de polinucleótido" se refiere a un polinucleótido corto que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en aquella mostrada en SEC ID NO: 1-23. Los fragmentos de nucleótido corto, están preferiblemente al menos alrededor de 15 nt, y más preferiblemente al menos alrededor de 20 nt, todavia más preferiblemente al menos alrededor de 30 nt, y aún más preferiblemente al menos alrededor de 40 nt, de longitud. Un fragmento "al menos de 20 nt de longitud" por ejemplo, pretende incluir 20 o más bases contiguas a partir de la secuencia de cADN contenida en aquella mostrada en SEC ID NO: 1-23. Estos fragmentos de nucleótido son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se discutió aqui. Por supuesto, se prefieren los fragmentos más grandes (por ejemplo, 50, 150, o más nucleótidos) . Además, ejemplos representativos de los fragmentos de polinucleótido de la invención, incluyen por ejemplo, fragmentos que tienen una secuencia desde alrededor de un número de nucleótido 1-50, 51-230, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, y asi sucesivamente, hasta el final de la SEC ID NO: 1-23. En este contexto "cercano" incluye los intervalos particularmente mencionados más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5,4,3,2, o 1,) en cualquier terminación o en ambas terminaciones. Preferiblemente estos fragmentos codifican un polipéptido que tiene una actividad biológica . En la presente invención, un "fragmento de polipéptido" se refiere a una secuencia corta de aminoácido contenido en las traducciones de la SEC ID NO: 1-23 así como la SEC ID NO: 24-33. Los fragmentos de proteina pueden ser "auto-sostenibles" o estar comprendidos dentro de un polipéptido mayor de cuyo fragmento forma una parte o región, más preferiblemente como una región continua simple. Ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptidos de la invención incluyen por ejemplo, fragmentos desde alrededor del numero de aminoácido 1-20, 21-40, 41-60, y asi sucesivamente, hasta el extremo de la región codificante. Más aún los fragmentos de polipéptidos pueden ser alrededor de 20, 30, 40, 50, o 60, aminoácidos de longitud. En este contexto, "alrededor" incluye los intervalos particularmente mencionados, más grandes o más pequeños por varios aminoácidos (5, 4, 3, 2 ó 1), en cualquier extremo o en ambos extremos. Los fragmentos preferidos de polipéptidos incluyen la proteina segregada así como la forma madura. Fragmentos preferidos de polipéptidos adicionales incluyen la proteina segregada o la forma madura que tiene una serie continua de residuos eliminados de las terminaciones amino o carboxi, o ambas. Por ejemplo, cualquier número de aminoácido, en el intervalo desde 1-60, se puede eliminar de la terminación amino ya sea del polipéptido segregado o de la forma madura. Similarmente, cualquier número de aminoácidos, en el intervalo de 1-30, se puede eliminar de la terminación carboxi de la proteina segregada o de la forma madura. Más aún, se prefiere cualquier combinación de las eliminaciones anteriores de la terminación amino y carboxi. Similarmente, también se prefieren los fragmentos de polinucleótido que codifican estos fragmentos de polipéptido. También se prefieren los fragmentos de polipéptido y polinucleótido caracterizados por dominios estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden las regiones de formación de hélice alfa y hélice alfa, regiones de formación de lámina beta y lámina beta, regiones de giro y formadoras de giro, regiones de serpentín y formadoras de serpentín, regiones hidrofilicas, regiones hidrofóbicas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficie, regiones aglutinantes de substrato, y regiones de alto Índice antigénico. Los fragmentos de polipéptido de las traducciones de la SEC ID NO: 1-23 así como de la SEC ID NO: 24-33 caen dentro de los dominios conservados, se contemplan específicamente por la presente invención. Más aún, los fragmentos de polinucleótidos que codifican estos dominios también están contemplados . Otros fragmentos preferidos son los fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que muestran una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos, puede incluir una actividad deseada mejorada o una actividad indeseable disminuida.

Epítopes y Anticuerpos En la presente invención, "epítopes" se refie're a los fragmentos de polipéptido que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, especialmente en un humano. Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un fragmento de polipéptido que comprende un epítope, así como el polinucleótido que codifica este fragmento. Una región de una molécula de proteina, a la cual se puede enlazar un anticuerpo, se define como un "epítope antigénico". En contraste, un "epítope inmunogénico" se define como una parte de una proteína que clarifica una respuesta de anticuerpo. (ver por ejemplo, Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983) ) . Los fragmentos que funcionan como epítopes se pueden producir por cualquier medio convencional, (ver por ejemplo, Hoghten, R.A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985) adicionalmente descrito en la Patente U.S. No. 4,631,211). En la presente invención, los epitopes antigénicos contienen preferiblemente una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve, y mucho más preferiblemente entre alrededor de 15 hasta alrededor de 30 aminoácidos. Los epitopes antigénicos, son útiles para crecer anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se enlazan específicamente al epitope. ( ver por ejemplo, Wilson y colaboradores, Cell 37:767-778 (1984); Sutcliffe, J.G. y colaboradores, Science 219:660-666 (1983)). Similarmente, los epítopes inmunogénicos se pueden usar para inducir anticuerpos según los métodos bien conocidos en el arte. (ver por ejemplo, Sutcliffe y colaboradores, supra; Wilson et al.; supra; Chow, M. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F.J. y colaboradores, J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)). Un epitope inmunogénico preferido, incluye la proteina segregada. Los epitopes inmunogénicos se pueden presentar junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un sistema, animal (tal como conejo o ratón) si es lo suficientemente larga (al menos alrededor de 25 aminoácidos), sin un portador. Sin embargo, los epitopes inmunogénicos que comprenden tan pocos como 8 a 10 aminoácidos se ha demostrado que son suficientes para crecer anticuerpos capaces de enlazarse a, muy al final, epitopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en la prueba de manchado Western) . Como se usa aquí, el termino "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) quiere decir que incluye moléculas intactas asi como fragmentos de anticuerpos (tal como por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) son capaces de enlazarse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2, carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, que aclaran más rápidamente de la circulación pueden tener menos tejido no especifico que se enlaza en comparación con el anticuerpo intacto. (Wahl y colaboradores, J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)) . De esta manera, se prefieren estos fragmentos así como los productos de un Fab u otra colección de expresión de inmunoglobulina. Más aún, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena simple y humanizados. Proteínas de Fusión Cualquier polipéptido de la presente invención se puede usar para generar proteinas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención, cuando se funde a una segunda proteina, se puede usar como una etiqueta antigénica. Los anticuerpos que crecen contra el polipéptido de la presente invención, se pueden usar para detectar indirectamente la segunda proteína al enlazarse al polipéptido. Más aún, ya que las proteinas segregadas se dirigen a ubicaciones celulares basadas en señales de tráfico, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar como moléculas objetivo una vez que se funden a otras proteinas . Ejemplos de los dominios que se pueden fundir a polipéptidos de la presente invención, incluyen no solamente secuencias de señal heteróloga, sino también otras regiones funcionales heterólogas. La fusión no necesita ser necesariamente directa, pero puede suceder a través de secuencias de unión . Más aún, las proteinas de fusión se pueden preparar por ingeniería para mejorar las características del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, aminoácidos particularmente cargados, se puede agregar a la terminación N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación de la célula huésped o el manejo y almacenamiento posterior.

También, las porciones de péptido se pueden agregar al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden separar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de las porciones de péptido para facilitar el manejo de polipéptidos son técnicas familiares y de rutina en el arte. Además, los polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos y epitopes específicamente, se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), que resultan en polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media incrementada in vivo. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido humano CD4 y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos ((EP A 394,827; Traunecker y colaboradores, Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas ligadas a bisulfuro (debido al IgG), pueden ser también más eficientes en enlazarse y neutralizar a otras moléculas, que la proteína monomérica segregada o el fragmento de proteína solo. (Fountoulakis y colaboradores, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Similarmente, la EP-A-0 464 533 (Contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de una región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteina humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en la terapia y el diagnóstico, y puede así resultar en por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0 232 262). Alternativamente, la eliminación de la parte Fc después de que ha sido expresada detectada y purificada la proteina de fusión, sería deseable. Por ejemplo, la porción Fc puede agrupar terapia y diagnóstico si la proteina de fusión se usa como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de medicamentos por ejemplo, las proteinas humanas tales como la hIL-5, se han fundido con porciones Fc para el propósito de ensayos de tamizado de alta producción, para identificar antagonistas del hIL-5 (ver D. Bennett y colaboradores, J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K, Johanson y colaboradores, Biol. Chem. 270 : 9459-9471 (1995) ) .

Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden fundir a secuencias de marca'dor, tales como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fundido. En modalidades preferidas, las secuencias de aminoácido marcador, es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-hist idina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra etiqueta de péptido útil para la purificación, la etiqueta HA, corresponde a un epítope derivado de la proteina de hemaglutinina de la influenza. (Wilson y colaboradores, Cell 37:767 (1984)). Asi, cualquiera de estas fusiones anteriores se puede preparar por ingeniería usando los polinucleótidos o los polipéptidos de la presente invención .

Vectores, Células huésped, y Producción de Proteínas . La presente invención, también se refiere a vectores que contienen al polinucleótido de la presente invención, células huésped, y la producción de polipéptidos por técnicas recombinantes. El vector puede ser por ejemplo, un vector fago, plásmido, viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser adecuados para la replicación o defectuosos para replicación. En el último caso, la propagación viral generalmente sucederá solo en las células huésped complementarias . Moléculas de Ácido Nucleico y Polipéptidos de la Presente Invención. Las moléculas de ácido nucleico agrupadas en la invención comprenden secuencias de nucleótido SEC ID NO: 1-23. Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos modificados por las secuencias de nucleótido de la invención se dan en SEC ID NO: 24-33. El descubrimiento de los ácidos nucleicos de la invención, permite la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos; células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; polipéptidos activos biológicamente purificados y aislados y fragmentos de los mismos; el uso de ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos como sondas para identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen secuencias de aminoácido homologas a la SEC ID NO: 24-23; el uso de los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos para identificar cromosomas humanos, por ejemplo 22, 7, y 19; el uso de los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos para mapear genes en cromosomas humanos, por ejemplo 22, 7, y 19; el uso de los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de los mismos para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras condiciones humanas asociadas con los cromosomas humanos tales como 22, 7, y 19; el uso de oligonucleótidos de sentido o antisentido de hebra simple a partir de los ácidos nucleicos para inhibir la expresión de polinucleótidos codificados por las secuencias IMX; el uso de tales polipéptidos y fragmentos solubles como marcadores de peso molecular; el uso de tales polipéptidos y péptidos fragmentados como controles para la fragmentación de péptidos, y estuches que comprenden estos reactivos; el uso de tales polipéptidos y fragmentos de los mismos para generar anticuerpos, y el uso de anticuerpos para purificar los polipéptidos de IMX. Moléculas de Ácido Nucleico En una modalidad particular, la invención se refiere a ciertas secuencias aisladas de nucleótido que están libres de material endógeno contaminante. Una "secuencia de nucleótido" se refiere a una molécula de polinucleótido en forma de un fragmento separado o como un componente de un constructo más grande de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico se ha derivado de ADN o ARN aislados al menos una vez en una forma substancialmente pura y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes por métodos estándar de bioquímica (tal como aquellos explicados en Sambrook el al., Mol ecu l a r Cl on ing : A Labora t ory Man ua l , 2nd sed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Tales secuencias se proporcionan y/o construyen preferiblemente en forma de una estructura de lectura abierta no interrumpida por secuencias internas no traducidas, o intrones, que están típicamente presentes en los genes eucarióticos. Las secuencias del ADN no traducido pueden estar presentes 5' o 3' desde una estructura de lectura abierta, en donde la misma no interfiere con la manipulación o expresión de la región codificadora . Las moléculas de ácido nucleico de la invención, incluyen ADN en forma de hebra simple y de hebra doble, asi como el complemento de ARN del mismo. El ADN incluye por ejemplo, cADN, ADN genómico, ADN sintetizado quimicamente, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico se puede aislar por técnicas convencionales, por ejemplo, usando el cADN de la SEC ID NO: 1-23, o un fragmento apropiado del mismo, como una sonda. Las moléculas de ADN de la invención, incluyen genes de longitud completa así como polinucleótidos y fragmentos de los mismos. El gen de longitud completa puede incluir al péptido de señal terminal N. Otras modalidades incluyen ADN que se codifica en una forma soluble, por ejemplo, codificando el dominio extracelular de la proteina ya sea con o sin el péptido de señal. Los ácidos nucleicos de la invención, se derivan preferiblemente de fuentes humanas, pero la invención incluye aquellos derivadas de especies no humanas también. Secuencias Preferidas Las secuencias de nucleótido particularmente preferidas de la invención son la SEC ID NO: 1-23, como se establece arriba. Los clones de cADN que tienen la secuencia de nucleótido SEC ID NO: 1-23 se aislaron como se describe en el ejemplo 1. Las secuencias de aminoácidos codificadas por el ADN de la secuencia SEC ID NO: 1-23 se muestran en la SEC ID NO: 24-23. Secuencias Adicionales Debido a la degeneración conocida del código genético, en donde más de un codón puede codificar al mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de aquella mostrada en la SEC ID NO: 1-23, y codificar todavía un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 24-33. Tales secuencias variantes de ADN, pueden resultar de mutaciones silentes (por ejemplo que se presentan durante la amplificación de PCR), o pueden ser el producto de una mutagénesis deliberada de una secuencia nativa. La invención proporciona así, secuencias adicionales de ADN aislado que codifican a los polipéptidos de la invención, seleccionadas de: (a) ADN que comprende las secuencias de nucleótido de SEC ID NO: 1-23; (b) ADN que codifica a los polipéptidos de SEC ID NO: 24-33; (c) ADN capaz de hibridizar a un ADN del (a) o (b) bajo condiciones de rigor moderadas y el cual codifica los polipéptidos de la invención; (d) ADN capaz de hibridizar a un ADN de (a) o (b) bajo condiciones de alto rigor el cual codifica polipéptidos de la invención, y (e) ADN que se degenera como resultado del código genético, a un ADN definido en (a) , (b) , (c) , o (d) y que codifica polipéptidos de la invención. Por supuesto, los polipéptidos codificados por tales secuencias de ADN, están agrupados por la invención. Como se usa aquí, se pueden determinar fácilmente las condiciones de rigor moderado por aquellos que tienen habilidad ordinaria en el arte con base en por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas se establecen por Sambrook y colaboradores, Mol ecul a r Cl oning : A Labora tory Ma n ua l , 2 ed. Vol. 1, pp . 1.101-234, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), e incluyen el uso de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, 0.5% de SDS, EDTA 1.0 mM (pH 8.0), condiciones de hibridización de alrededor de 50% de formamida, 6X SSC a alrededor de 42°C (u otra solución similar de hibridización tal como la solución Stark, en alrededor de 50% de formamida a alrededor de 42°C), y condiciones de lavado de alrededor de 60°C, 0.5X de SSC, 0.1% de SDS. Las condiciones de alto rigor se pueden también determinar fácilmente por el técnico habilitado con base en por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridización como arriba, y con el lavado a aproximadamente 68°C, 0.2X de SSC, 0.1% de SDS. El técnico capacitado reconocerá que la temperatura y la concentración de sal en la solución de lavado se pueden ajustar como sea necesario según los factores tales como la longitud de la sonda. También incluido como una modalidad de la invención están los fragmentos de polipéptido que codifican al ADN y polipéptidos que comprende sitios inactivados de N-glicosilación, sitios de procesamiento de proteasa inactivada, o substituciones conservadoras de aminoácidos, como se describen abajo. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también comprenden secuencias de nucleótido que están al menos 80% idénticas a una secuencia nativa. También están contempladas modalidades en las cuales la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 99% idéntica, o al menos 99.9% idéntica a una secuencia nativa. El porcentaje de identidad se puede determinar por la inspección visual y el calculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico, se puede determinar al comparar la información de secuencia usando el programa de cómputo GAP, versión 6 descrita por Devereux y colaboradores, (Nucí.

Acids Res. 12:387, 1984) y disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) . Los parámetros preestablecidos preferidos para el programa GAP incluyen: (I) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de O no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Pro t ei n Se c u en ce a n d S t ru c t u re , National Biomedical Research Foundation, pp . 353-358, 1979; (2) una penalización de 3.0 por cada espacio y una penalización adicional 0.10 por cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna penalización para los espacios terminales. También se pueden usar otros programas utilizados por alguien habilitado en el arte de la comparación de secuencias . La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, útiles en la producción de polipéptidos. Tales polipéptidos se pueden preparar por cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido IMX o un fragmento deseable del mismo. Se puede subclonar en un vector de expresión para la producción del polipéptido fragmento. La secuencia de ADN se funde ventajosamente a una secuencia que codifica un líder apropiado o un péptido de señal. Alternativamente, el fragmento deseado puede sintetizarse quimicamente usando técnicas conocidas. Los fragmentos de ADN también pueden producirse por la digestión de endonucleasa de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislada por electroforesis en geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen el termino 5' ó 3' hasta un punto deseado, se pueden ligar a un fragmento de ADN generado por la digestión de la enzima de restricción. Tales oligonucleótidos, pueden contener adicionalmente un sitio de partición de endonucleasa de restricción en la dirección 5' de la secuencia de codificación deseada, y posesionar un codón de iniciación de (ATG) en la terminación N de la secuencia de codificación . El procedimiento bien conocido de reacción de cadena de polimerasa (PCR) también se puede emplear para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento deseado de proteína. Los oligonucleótidos que definen la terminación deseada del fragmento de ADN, se emplean como cebadores 5' y 3' . Los oligonucleótidos pueden adicionalmente contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento amplificado de ADN dentro de un vector de expresión. Las técnicas PCR se describen en Saiki y colaboradores, Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu y colaboradores, eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp . 189-196; y and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications , Innis y colaboradores, eds., Academic Press, Inc. (1990). Polipéptidos y Fragmentos de los Mismos La invención abarca polipéptidos y fragmentos de los mismos en diversas formas, incluyendo aquellos que se presentan naturalmente o que se producen a través de diversas técnicas tales como los procedimientos que involucran tecnología recombinante del ADN. Tales formas incluyen, pero no se limitan a, derivados, variantes y oligómeros, asi como proteinas de fusión o fragmentos de las mismas. Polipéptidos y Fragmentos de los Mismos Los polipéptidos de la invención incluyen proteínas de longitud completa codificadas por las secuencias de ácido nucleico arriba establecidas. Los polipéptidos particularmente preferidos comprenden las secuencias de aminoácido de SEC ID NO: 24-33.

Los polipéptidos de la invención pueden incluir una región hidrofóbica N-terminal que funciona como un péptido de señal y puede contener un dominio extracelular y puede también contener una región de transmembrana y un dominio citoplásmico C-terminal así como una región espaciadora. Se puede usar el análisis de computadora para predecir la ubicación del péptido de señal . Por ejemplo, los polipéptidos aislados de la SEC ID NO: 16 (IMX 28) y la SEC ID NO: 21 (IMX 44) incluyen una región hidrofóbica de terminación N que funciona como un péptido de señal. El análisis de computadora predice que el péptido de señal corresponde a los residuos 1 al 17 de SEC ID NO: 16, y el desdoblamiento del péptido de señal de SEC ID NO: 16 resulta en una proteína madura que comprende a los aminoácidos 18 a 372. El péptido de señal de IMX 44 corresponde a los residuos 1 a 37 de SEC ID NO: 21. Los siguientes más probables sitios de desdoblamiento de péptidos de señal predecibles por la computadora (en orden descendente), sucederían después de los aminoácidos 36, 26 y 27 de la secuencia SEC ID NO: 21. El desdoblamiento del péptido de señal en la posición 37, resultaría así en una proteína madura que comprende los aminoácidos 38 al 261 de la SEC ID NO: 21. El técnico capacitado reconocerá que las fronteras arriba descritas de tales regiones de los polipéptidos son aproximadas. Para ilustrar, las fronteras de la proteina madura (que se pueden predecir usando programas de cómputo disponibles para ese propósito) pueden diferir de aquellas arriba descritas. Los polipéptidos de la invención pueden estar enlazados por membrana o pueden ser segregados y así ser solubles. Los polipéptidos solubles son capaces de segregarse a partir de células en las cuales se expresan. En general, se pueden identificar polipéptidos solubles (y distinguirse de sus contrapartes enlazadas por membrana no soluble) al separar las células intactas que expresan el polipéptido deseado del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) para presencia del polipéptido deseado. La presencia del polipéptido en el medio, indica que el polipéptido se segregó a partir de las células y asi está en una forma soluble de la proteina.

En una modalidad, los polipéptidos solubles y fragmentos de los mismos, comprenden todo o una parte de un dominio extracelular, pero carecen de la región de transmembrana que provocarla la retención del polipéptido en una membrana de célula. Un polipéptido soluble puede incluir el dominio citoplásmico, o una porción del mismo, con tal de que el polipéptido se segregue de la célula en la cual se produce. En general, el uso de formas solubles es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de los polipéptidos a partir de células huésped recombinantes se facilita, ya que los polipéptidos solubles se segregan de la célula. Además, los polipéptidos solubles son generalmente más apropiados para administración intravenosa . La invención también proporciona polipéptidos y fragmentos del dominio extracelular que retienen una actividad biológica deseada. Las modalidades particulares se dirigen a fragmentos de polipéptido que retienen la capacidad de enlazar el similar nativo, substrato o contra-estructura ("agente enlazante") tal fragmento puede ser un polipéptido soluble como se describe arriba. En otra modalidad, los polipéptidos y fragmentos incluyen ventajosamente regiones que se conservan en la familia como se describe arriba. También se proporciona aquí, fragmentos de polipéptidos que comprenden al menos 20, o al menos 30 aminoácidos contiguos de la secuencia de SEC ID NO: 24-33. Los fragmentos derivados del dominio citoplásmico, encuentran uso en estudios de transducción de señal en la regulación de procesos celulares asociados con la transducción de señales biológicas. Los fragmentos de polipéptidos también se pueden emplear como inmunógenos al generar anticuerpos. Variantes Las variantes que se presentan naturalmente asi como las variantes derivadas de los polipéptidos y fragmentos se proporcionan aqui. Las variantes pueden mostrar secuencias de aminoácido que son al menos 80% idénticas. También se contemplan modalidades en las cuales un polipéptido o fragmento comprende una secuencia de aminoácido que es 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 99% idéntica, o al menos 99.9% idéntica al polipéptido preferido o fragmento del mismo, la identidad del porcentaje se puede determinar por inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, la identidad de porcentaje de dos secuencias de proteínas se puede determinar al comparar la información de secuencia utilizando el programa de computadora GAP, con base en el algoritmo de Needleman y Wunsch 11 . Mol. Bio. 48:443, 1970) y disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por eliminación para el programa GAP incluyen: (I) una matriz de registro, Blosum62, como se describe por Henikoff y Henikoff (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915, 1992); (2) un peso de espacio de 12; (3) un peso de longitud de espacio de 4; (a) ninguna penalización para los espacios de extremo. Otros programas usados por alguien hábil en el arte de la comparación de secuencias se pueden también usar . Las variantes de la invención incluyen por ejemplo, aquellas que resultan de eventos de separación de mARN alternos o de desdoblamiento proteolit ico . La división alterna del mARN puede por ejemplo, producir una proteina truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble que se presenta naturalmente de la proteína. Las variaciones atribuibles a la proteólisis incluyen por ejemplo, diferencias en los términos N o C con la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la separación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteina (generalmente de aminoácidos 1-5 terminal) . Las proteinas en las cuales son atribuibles diferencias en la secuencia de aminoácido al polimorfismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína) también se contemplan aquí. Las variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mismos, al formar conjugados covalentes o agregados con otras porciones químicas tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes se pueden preparar al enlazar las porciones químicas a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos o en la terminación N o terminación C de un polipéptido. Los conjugados comprenden agentes terapéuticos o de diagnóstico (detectable) colocados a los mismos también se contemplan aquí, como se discute con mayor detalle abajo.

Otros derivados incluyen conjugados agregados o covalentes de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos, tales como por sintesis en cultivos recombinantes como fusiones N-terminal o C-terminal. Ejemplos de las proteinas de fusión se discuten abajo en conexión con oligómeros. Además, las proteinas de fusión pueden comprender péptidos agregados para facilitar la purificación e identificación. Tales péptidos incluyen por ejemplo, péptidos de identificación antigénica o poli-His descritos en la patente No. 5,011,912 y en Hopp y colaboradores, Bi o/ Te chn ol ogy 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG©, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys , el cual es altamente antigénico y proporciona un epítope enlazado reversiblemente por un anticuerpo especifico monoclonal, permitiendo un ensayo rápido y una fácil purificación de la proteina recombinante expresada. Un hibridoma de murina designado como 4E11, produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente Americana 5,011,912, incorporada aquí como referencia. La linea de célula del hibridoma 4E11, se ha depositado con la American Type Culture Collection bajo el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se enlazan al péptido FLAG® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems División, New Haven, Connecticut . Entre los polipéptidos que se proporcionan aquí, hay variantes de polipéptidos nativos que retienen la actividad biológica nativa o el equivalente substancial del mismo. Un ejemplo es una variante que se enlaza con esencialmente la misma afinidad de enlace como lo hace la forma nativa. La afinidad de enlace se puede medir por procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en la Patente Americana 5,512,457 y como se establece más abajo. Las variantes incluyen polipéptidos que son substancialmente homólogos a la forma nativa, pero que tienen una secuencia de aminoácido diferente de la forma nativa debido a una o más eliminaciones, inserciones o substituciones. Las modalidades particulares incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que comprenden desde una a diez eliminaciones, inserciones o substituciones de residuos de aminoácido, cuando se comparan a la secuencia nativa. Un aminoácido dado se puede reemplazar por ejemplo, por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Ejemplos de tales substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo alifático por otro, tal como lie, Val, Leu, o Ala uno para el otro; substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp, o Gln y Asn; o substituciones de un residuo aromático por otro tal como Phe, Trp, o Tyr por otro. Otras substituciones conservadoras, por ejemplo, involucran la substitución de regiones completas que tienen características similares de hidrofobicidad, son bien conocidas. Similarmente, los ADNs de la invención incluyen variantes que difieren de una secuencia nativa de ADN debido a una o más eliminaciones, inserciones o substituciones, pero que codifican a un polipéptido biológicamente activo. La invención incluye además polipéptidos de la invención con o sin una glicosilación de patrón nativo asociada. Los polipéptidos expresados en levadura o en sistemas de expresión de mamíferos (por ejemplo, células COS-1 o COS-7) pueden ser similares a o significativamente diferentes de un polipéptido nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión del polipéptido de la invención en sistemas de expresión bacteriano, tal como E . col i , proporcionan moléculas no glicosiladas. Además, una preparación dada puede incluir especies múltiples diferencialmente glicosiladas de la proteina. Los grupos glicosilo se pueden separar a través de métodos convencionales, en particular aquellos que utilizan glicopept idasa . En general, los polipéptidos glicosilados de la invención se pueden incubar con un exceso molar de gl icopept idasa (Boehringer Mannheim) . Correspondientemente, están comprendidos por la invención, constructos similares de ADN que codifican diversas adiciones o substituciones de residuos o secuencias de aminoácido, o eliminaciones de residuos o secuencias terminales o internos. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular del polipéptido, se pueden modificar para excluir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en sistemas de expresión de levadura y mamíferos. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos, se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro y Y es Ser o Thr. Las substituciones, adiciones o eliminaciones apropiadas a las secuencias de nucleótidos que codifican estos tripletes, resultará en la prevención de la colocación de los residuos carbohidratos en la cadena lateral Asn. La alteración de un nucleótido simple, escogido de manera que Asn se substituye por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Alternativamente, el Ser o Thr, se puede reemplazar con otro aminoácido tal como Ala. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glicosilación en proteína, incluyen aquellos descritos en la Patente Americana 5,071,972 y EP 276,846, que se incorporan aqui como referencia. En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican los residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica, se pueden alterar para provocar que se eliminen los residuos Cys o se substituyan con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos al multiplicarse o en la renaturalización. Otras variantes se preparan por la modificación de residuos de aminoácido dibásico adyacente, para aumentar la expresión en sistemas de levadura en los cuales está presente la actividad de la proteasa KEX2. La Patente EP 212,914 describe el uso de mutagénesis específica del sitio para inactivar los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 se inactivan al eliminar, agregar o substituir residuos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg, para eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys, son considerablemente menos susceptibles a la partición de KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un enfoque conservador o preferido para inactivar los sitios KEX2. 01 igómeros Agrupados por la invención, están los oligómeros o proteinas de fusión que contienen polipéptidos IMX. Tales oligómeros pueden estar en forma de multimeros ligados de forma no covalente o ligados de forma covalente, incluyendo dímeros, trímeros u oligómeros superiores. Como se observa arriba, los polipéptidos preferidos son solubles y asi estos oligómeros pueden comprender polipéptidos solubles. En un aspecto de la invención, mantienen la capacidad de enlace de los componentes del polipéptido y proporcionan por lo tanto sitios de enlace bivalentes, trivalentes, etcétera . Una modalidad de la invención se dirige a oligómeros que comprenden polipéptidos múltiples unidos por via de interacciones covalentes o no covalentes entre las porciones de péptido fundidas a los polipéptidos. Tales péptidos pueden ser ligadores de péptidos (espaciadores) o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que puede promover la oligomerización de los polipéptidos colocados a los mismos, como se describe en mayor detalle abajo. Oligómeros de base inmunoglobulina Como una alternativa, un oligómero se prepara usando polipéptidos derivados de las inmunoglobulinas. La preparación de las proteínas de fusión comprende ciertos polipéptidos heterólogos fundidos a diversas funciones de polipéptidos derivados del anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) han sido descritos por ejemplo, por Ashkenazi et al. ( PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. ( Na t ure 344:677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", in Current Pro t o col s i n Imm un o l ogy , Suppl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992). Una modalidad de la presente invención, se refiere a un dimero que comprende dos proteinas de fusión creadas al fundir un polipéptido de la invención con un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo. Una fusión de genes que codifica la proteína de fusión de polipépt ido/Fe, se inserta en un vector apropiado de expresión. Las proteínas de fusión Fc/pol ipépt idos se expresan en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitidas para ensamblarse muy parecidas a las moléculas de anticuerpo, en donde los enlaces de disulfuro entre cadenas forman entre las porciones Fc para reducir moléculas diva lentes .

El término "polipéptido Fc" como se usa aquí, incluye formas nativas y de muteína de los polipéptidos que comprenden la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región de articulación que promueve la dimerización. Los polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido Fc derivado de un anticuerpo humano IgGl que comprende alguno o todos los dominios CH de la región Fc . Un polipéptido Fc apropiado, descrito en la Solicitud PCT WO 93/10151, que se incorpora aquí como referencia, es un polipéptido de cadena simple que se extiende desde la región de articulación terminal N a la terminación C de la región Fc de un anticuerpo humano IgGl. Otro polipéptido Fc útil es la muteina Fc descrita en la Patente Americana 5,457,035 y en Baum y colaboradores, (EMBO J. 13:3992-4001, 1994) incorporada aqui como referencia. La secuencia de aminoácido de esta muteina es idéntica a aquella de la secuencia nativa Fc presentada en WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido de Gly a Ala. La muteina exhibe una afinidad reducida por los receptores Fc . Las proteínas de fusión arriba descritas, que comprenden porciones Fc ( y oligómeros formados de las mismas) ofrecen la ventaja de una purificación sencilla por cromatografía de afinidad sobre columnas de proteína A o proteína G. En otras modalidades, los polipéptidos de la invención se pueden substituir por la porción variable de una cadena de anticuerpos pesada y ligera. Si las proteinas de fusión se hacen con cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero con tantas como cuatro regiones solubles de las proteinas de la invención. Oligómeros basados en el ligador de péptido Alternativamente, el oligómero es una proteina de fusión que comprende polipéptidos múltiples, con o sin ligadores de péptidos (péptidos espaciadores) . Entre los ligadores apropiados de péptido están aquellos descritos en las Patentes Americanas 4,751,180 y 4,935,233, que se incorporan aquí como referencia. Una secuencia de ADN que codifica un ligador deseado de péptido, se puede insertar entre, y en la misma estructura de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, usando cualquier técnica convencional apropiada. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica el ligador, se puede ligar entre las secuencias. En modalidades particulares, una proteina de fusión comprende desde 2 hasta 4 polipéptidos solubles IMX, separados por ligadores de péptidos. Cierres de leucina Otro método de preparación de los oligómeros de la invención involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina, son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina se identificaron originalmente en varias proteinas de enlace de ADN (Lanschulz y colaboradores, Sci en ce 240:1759, 1988), y se han encontrado desde entonces en una diversidad de proteínas diferente. Entre los cierres conocidos de leucina, están los péptidos que se presentan naturalmente y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de los dominios de cierre de leucina apropiados para producir proteinas oligoméricas solubles, se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y el cierre de leucina derivado de la proteina tensoactiva del pulmón (SPD) descrita en Hoppe et al. (FEBS Letters 344:191, 1994), que se incorpora aqui como referencia. El uso de un cierre de leucina modificado que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fundida al mismo, se describe en Fanslow et al. ( Sem i n . Imm un o l . 6:267-278, 1994) . Las proteínas de fusión recombinantes comprenden un polipéptido soluble fundido a un péptido de cierre de leucina, se expresan en células huésped apropiadas, y el oligómero soluble que forma se recupera del sobrenadante del cultivo. En modalidades particulares, los residuos de leucina en una porción de cierre de leucina, se substituyen por residuos de isoleucina. Dichos péptidos que comprenden isoleucina se pueden referir como "cierres de isoleucina" pero se agrupan por el término "cierres de leucina" como se emplea aqui . Producción de polipéptidos y fragmentos de los mi smos . La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención, se puede llevar a cabo por cualquier técnica apropiada, incluyendo pero no limitándose a las s iguientes . Sistemas de Expresión La presente invención también proporciona vectores de expresión y clonación recombinante que contienen ADN, así como células huésped que contiene los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden ADN se pueden usar para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un método para la producción de polipéptidos comprende el cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido, recuperando entonces los polipéptidos expresados del cultivo. El técnico hábil reconocerá que el procedimiento para la purificación de los polipéptidos expresados, variará según tales factores como el tipo de células huésped empleadas, y de si el polipéptido está enlazado a la membrana o una forma soluble que se segrega de la célula huésped. Puede ser empleado cualquier sistema apropiado de expresión. Los vectores incluyen un ADN que codifica a un polipéptido o fragmento de la invención, ligado de forma operativa a secuencias apropiadas de nucleótidos regulatorias tradu'ccionales o transcripcionales, tales como aquellas derivadas de un gen de mamífero, microbio viral o insecto. Ejemplos de las secuencias regulatorias incluyen promotores transcripcionales, operadores o enriquecedores, un sitio de enlace ribosomal mARN, y secuencias apropiadas que controlan la iniciación y terminación de la traducción y la transcripción. Las secuencias de nucleótido se ligan de forma operativa cuando la secuencia regulatoria se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN. Asi, una secuencia promotora de nucleótidos se liga de forma operativa a una secuencia de ADN, si la secuencia promotora de nucleótidos controla la transcripción de la secuencia de ADN. Un origen de replicación que otorga la capacidad para replicar en las células huésped deseadas, y un gen de selección mediante el cual se identifican los transformantes, se incorporan generalmente dentro del vector de expresión. Además, una secuencia que codifica un péptido apropiado de señal (nativo o heterólogo) se puede incorporar dentro de los vectores de expresión.

Una secuencia de ADN para un péptido de señal (lider segregador) se puede fundir en la estructura a una secuencia de ácido nucleico de la invención de manera que el ADN se transcribe inicialmente, y el mARN traducido, en una proteína de fusión que comprende el péptido de señal. Un péptido de señal que es funcional en las células huésped pretendidas, promueve la secreción extracelular del polipéptido. El péptido de señal se desdobla del polipéptido con la secreción del polipéptido de la célula. El técnico habilitado también reconocerá que la posición (es) en la cual el péptido de señal se desdobla, puede diferir de aquella predecible por el programa de cómputo, y puede variar según factores tales como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. Una preparación de proteína puede incluir una mezcla de moléculas de proteina que tienen diferentes aminoácidos N-terminal que resultan de la partición del péptido de señal en más de un sitio. Las células huésped apropiadas para la expresión de polipéptido incluyen procariotas, levaduras o células eucarióticas superiores. Las células de insectos o mamíferos se prefieren generalmente para usarse como células huésped. La clonación apropiada y los vectores de expresión para uso con huéspedes celulares bacterianos, de hongos, de levaduras y mamíferos, se describen por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors : A Laboratory Manual. Elsevier, New York, (1985) . Los sistemas de traducción libres de células, pueden también emplearse para producir polipéptidos utilizando los ARN derivados de constructos de ADN aqui descritos. Sistemas procarióticos Las procariotas incluyen organismos gram-positivo y gram-negat ivo . Las células huésped procarióticas apropiadas para la transformación incluyen por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium , y diversas otras especies dentro de los géneros Pseudomonas , Streptomyces , y Staphylococcus . En una célula huésped procariótica, tal como E . coli, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met N-terminal, se puede desdoblar de un polipéptido recombinante expresado.

Los vectores de expresión para usarse en células huésped procarióticas, comprenden generalmente uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotipico es por ejemplo, un gen que codifica una proteína que otorga resistencia a antibióticos o que proporciona requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procarióticas incluyen aquellos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) . PBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y proporciona asi medios simples para identificar células transformadas. Un promotor apropiado y una secuencia de ADN, se insertan dentro del vector pBR322. Otros vectores comercialmente disponibles incluyen por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) . Las secuencias promotoras comúnmente usadas para vectores de expresión de células huésped procarióticas recombinantes, incluyen 3-lactamasa ( penici 1 inasa ) , sistema promotor de lactosa ((Chang y colaboradores, Na t u re 275:615, 1978; y Goeddel y colaboradores, Na t ure 281:544, 1979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel y colaboradores, Nucí. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y promotor de tac (Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982) . Un sistema de expresión de célula huésped procariótica particularmente útil, emplea un promotor del fago 8PL y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores de plásmidos disponibles del American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor 8PL, incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E . col i JMB9ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E . col i RR1, ATCC 53082). Sistemas de levadura Alternativamente, los polipéptidos se pueden expresar en células huésped de levadura, preferiblemente del género Sa cca romyces (por ejemplo, S cerevi s i a e ) . Otros géneros de levadura, tales como el Pi ch i a o el Kl uyveromyces , se pueden también emplear. Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2µ, una secuencia replicante autónomamente (ARS), una región de promotor, secuencias de poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras apropiadas para vectores de levadura incluyen entre otros, promotores para la metalot ioneina , 3- fos fogl icerato cinasa (Htzeman y colaboradores, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicoliticas (Hess y colaboradores, J. Adv. Anzyme Reg 7:149, 1968; y Holland y colaboradores, Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato de descarboxilasa, fos fofructocinasa , glucosa- 6-fosfato isomerasa, 3-fos fogl icerato metasa, piruvato cinasa, t riosefos fato isomerasa, fosfo-glucosa isomerasa, y glucosinasa. Otros vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión de levadura, se describen además en Hitzeman, EPA-73,657. Otra alternativa es el promotor represor de glucosa ADH2, descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:124, 1982). Los vectores de traslado replicables en levadura y E. coli se pueden construir al insertar secuencias de ADN del pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen Amp y origen de replicación) dentro de los vectores de levadura arriba descritos. La secuencia lider del factor de levadura V se pueden emplear para dirigir la secreción del polipéptido, la secuencia líder del factor V, se inserta a menudo entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural. Ver por ejemplo Kurjan y colaboradores, CeJl 30:933, 1982 y Bitter y colaboradores, Pro c . Na t i . Aca d . Sci . USA 81:5330, 1984. Otras secuencias líder apropiadas para facilitar la segregación de polipéptidos recombinantes a partir de huéspedes de levadura, se conocen por aquellos hábiles en el arte. Una secuencia lider se puede modificar cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitara la fusión de la secuencia lider al gen estructural. Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por aquellos hábiles en el arte. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen y colaboradores, Pro c . Na t i . Aca d . S ci . USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. Selecciona los transformantes Trp en un medio selectivo, en donde el medio selectivo consiste de 0.67% de levadura de base nitrógeno, 0.5% de casaminoácidos, 2% glucosa, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracil.

Las células huésped de levadura transformadas por vectores que contienen una secuencia de promotor ADH2 pueden crecer por la inducción de la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste de 1% de extracto de levadura, 2% peptona, y 1% glucosa complementada con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracil. La desrepresión del promotor ADH2 sucede cuando la glucosa esta agotada del medio. Sistemas de insectos o mamíferos Los sistemas de cultivo de células huésped de insectos o mamíferos, también se pueden emplear para expresar polipéptidos recombinantes. Los sistemas de Baculovirus para la producción de proteinas heterólogas en células de insectos se revisan por Luckow y Summers, Bi ol / Techn o l ogy 6:47 (1988) . Las líneas de célula establecidas de origen mamífero también se pueden emplear.

Ejemplos de lineas de células huésped de mamíferos apropiadas incluyen la linea COS-7 de células de riñon de simio (ATCC CRL 1651) (Gluzman y colaboradores, Cel l 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y lineas de célula BHK (ATCC CRL 10), la linea de célula CVI/EBNA derivada de la linea de célula de riñon del mono verde Africano CVl (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al. (EMBO J. 10 : 2821, 1991) . Los métodos establecidos para introducir el ADN dentro de células de mamíferos, se han descrito (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp . 15-69) . Protocolos adicionales que usan reactivos comercialmente disponibles tales como el reactivo de lipidos de Lipofectamina (Gibco/BRL) o reactivo de lípido de Lipofectamina- Plus , se pueden usar para células transfectadas (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7 17, 1987). Además, la electroforación se puede usar para transfectar células de mamíferos utilizando procedimientos convencionales tales como aquellos de Sambrook et al. {Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . La selección de transformantes estables se puede llevar a cabo usando métodos conocidos en el arte tales como por ejemplo, la resistencia a medicamento citotóxico. Kaufman y colaboradores, Me th . In En zym o l o gy 185:487-511, 1990, describe esquemas diversos de selección, tales como la resistencia a la dihidrofolato reductasa (DHFR) . Una cepa apropiada huésped para la selección de DHFR puede ser la cepa CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Na t i . Aca d . Sci . USAS 77:4216-4220, 1980) . Un plásmido que expresa el cADN de DHFR, se puede introducir dentro de la cepa DX-B11, y solamente las células que contienen el plásmido pueden crecer en medios selectivos apropiados. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse dentro de un vector de expresión incluyen los cADN que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e hidromicina B. Las células que alojan al vector, se pueden seleccionar con base a la resistencia a estos compuestos. Las secuencias de control traduccional y transcripcional para vectores de expresión de células huésped de mamíferos, se pueden elegir de genomas virales. Las secuencias de promotor y secuencias de enriquecedor comúnmente usadas se derivan del virus de poliona, adenovirus 2, virus 40 de simio (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40 por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y tardío, enriquecedor, divisor y sitios de poliadenilación, se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamíferos. Promotores virales tempranos y tardíos son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento lo cual también contiene un origen de replicación viral (Fiers y colaboradores, Na t ure 273:113, 1978; Kaufman, Me th , i n En zym o l ogy, 1990) . Fragmentos más pequeños o más grandes del SV40 también se pueden usar, con la condición de que aproximadamente una secuencia de 250 bp se extienda desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgll localizado en el sitio de origen de replicación viral SV4Q incluido. La secuencia adicional de control mostrada para mejorar la presión de los genes heterólogos de vectores de expresión mamíferos, incluyen elementos tales como el elemento de secuencia aumentador de la expresión (EASE) derivado de la célula CHO (Morris y colaboradores, Animal Cell Technology, 1997 , pp .529-534 y la aplicación WO 97/25420 y el lider tripartita (TPL) y el gen de VA del ARN del adenovirus 2 (Gingeras y colaboradores, J. Biol. Chem.257: 13475-13491, 1982) . Las secuencias del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) y origen viral permiten que el ARN dicistrónico se traduzca eficientemente (Oh and Sarnow, Current Opinión in Genetics and Development 3:295-1993; Ramesh y colaboradores, Nucleic Acids Research 24:2697-2700,1996) . La expresión de cADN heterólogo como parte de un mARN dicistrónico seguido por el gen de un marcador seleccionable (por ejemplo DHFR) ha demostrado mejorar la transfectabilidad del huésped y la expresión del cADN (Kaufman, Meth. In Enzymology; 1990) . Los vectores de expresión ejemplares que emplean el mARN dicistrónico, son pTR-DC/GFP descritos por Mosser y colaboradores , Bi o t echn i ques 22:150-161,1997, y p2A5I descrito por Morris y colaboradores , An im a l Cel l Te chn ol ogy, 1997, pp. 529-534. Un vector de alta expresión útil, pCAVNOT ha sido descrito por Mosley y colaboradores, Cel l 59:335-348, 1989. Otros vectores de expresión para su uso en células huésped mamiferas, se puede construir como se describe por Okayama y Berg (Mol .Cell . Biol .3 : 280, 1983) . Un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de cADNs en células epiteliales mamarias de murina cl27, se puede construir sustancialmente como se describe por Cosman et al Mol . Imm un ol . 23:935, 1986) . Un vector útil de alta expresión, PMLSV N1/N4. Descrito por Cosman y colaboradores , Nature 312:768, 1984, ha sido depositado como ATCC 39890. Vectores adicionales de expresión mamifera útiles se describen en EP-A-0367566 , y WO 91 18982, que se incorpora aqui como referencia. Todavia en otra alternativa, los vectores se puede derivar de retrovi rus . Otro vector de expresión útil, pFlAG®, se puede usar. La tecnología FLAG® se centra en la fusión de un péptido marcador FLAG®, hidrofilico, de bajo peso molecular (lkD), al término N de una proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG. Con referencia a los péptidos de señal que se pueden emplear, el péptido de señal activa se puede reemplazar por un péptido de señal heteróloga o secuencia lider si se desea. La elección del péptido de señal o de líder puede depender de factores tales como el tipo de células huésped en las cuales se ha producido por el polipéptido recombinante. Para ilustrar, los ejemplos de péptidos de señal heteróloga que son funcionales en las células huésped mamiferas, incluyen la secuencia de señal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente americana 4,965,195, la secuencia de señal para el receptor interleucina 2 descrita en Cosman y colaboradores, Nature 312:768 (1984); el péptido de señal receptor interleucina-4 descrito en EP 367,566; el péptido de señal receptor de interleucina-1 de tipo 1 descrito en la patente americana 4,968,607; el péptido de señal receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la patente EP 460,846. Purificación La invención también incluye métodos de aislamiento y purificación de polipéptidos y fragmentos de los mismos. Aislamiento y Purificación Los polipéptidos "aislados" o fragmentos de los mismos cubiertos por esta invención, son polipéptidos o fragmentos que no están en un medio idéntico al medio al cual se encontraron en la naturaleza. Los polipéptidos "purificados" o fragmentos de los mismos abarcados por esta invención, están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de sistema de expresión recombinante tales como aquellos descritos arriba o como un producto purificado a partir de una fuente no recombinante tal como célula y/o tejido que se presenta naturalmente . En una modalidad preferida, la purificación de polipéptidos o fragmentos recombinantes, se puede lograr usando fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención con otro polipéptidos para ayudar en la purificación de péptidos o fragmentos de la invención. Tales patrones de fusión pueden incluir el poli-His u otros péptidos de identificación antigénica descritos arriba asi como las porciones Fc descritas previamente. Con respecto a algún tipo de célula huésped, como se conoce por el técnico habilitado, los procedimientos para purificar un péptido recombinante o fragmento, variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas y el polipéptido recombinante o fragmento se segrega o no dentro del medio de cultivo.

En general, el polipéptido recombinante o fragmento se puede aislar de la célula huésped si no se segrega, o del medio o sobrenadante si es soluble y segregado, seguido por etapas de una o más concentración, de salado, intercambio iónico, interacción hidrofóbica, purificación por afinidad, o cromatografía de exclusión de tamaño. En cuanto a las vías especificas para alcanzar estas etapas, el medio de cultivo se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteinas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, una resina de intercambio aniónico se puede emplear por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos colgantes diet ilaminoet il (DEAE) . Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteinas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes apropiados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, una etapa de cromatoenfoque se puede emplear. Alternativamente se puede emplear una etapa de cromatografia de interacción hidrofóbica. Las matrices apropiadas pueden ser porciones fenilo u octilo enlazadas en la resina. Además, la cromatografia de afinidad con una matriz que se enlaza selectivamente a la proteína recombinante, se puede emplear. Ejemplos de tales resinas empleadas son las columnas de lectina, columnas de colorante, columnas de quelato-metal . Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) empleando medios hidrofóbicos de RP-HPLC (por ejemplo, gel de silice o resina de polímero que tiene grupos colgantes metilo, octilo, octilodetilo u otros alifáticos) se puede emplear para purificar adicionalmente los polipéptidos. Algunos o todos los pasos anteriores purificación, en diversas combinaciones, son bien conocidos y se pueden emplear para proporcionar una proteina recombinante aislada y purificada. También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteina de enlace del polipéptido de la invención, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra los polipéptidos de la invención, a polipéptidos expresados a purificación de afinidad. Estos polipéptidos se pueden separar de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo en una solución amortiguadora de elución de alta sal y después dializada en una solución amortiguadora de menor sal para su uso o para cambiar el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o ser eliminado competitivamente utilizado el substrato que se presenta naturalmente de la porción de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la invención. En este aspecto de la invención, las proteinas que enlazan polipéptidos, tal como los anticuerpos ant ipolipépt idos de la invención u otras proteinas que pueden interactuar con el polipéptido de la invención, se pueden enlazar a un soporte de fase sólida tal como una matriz de cromatografia de columna o un substrato similar apropiado para identificar, separar o purificar las células que expresan los polipéptidos de la invención en su superficie. La adherencia de las proteinas que enlazan polipéptidos de la invención, a una superficie de contacto de fase sólida se puede llevar a cabo por cualquier medio. Por ejemplo, las microesferas magnéticas se pueden recubrir con estas proteinas que enlazan polipéptidos y mantenerse en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células se ponen en contacto con la fase sólida que tiene tales proteinas que enlazan polipéptidos en las mismas. Las células que tienen a los polipéptidos de la invención en la superficie, se enlazan a la proteina fija que enlaza polipéptidos y las células no enlazadas se desechan después. Este método de afinidad enlace se usa para purificar, tamizar o separar tales células que expresan polipéptidos de una solución. Métodos para liberar positivamente células seleccionadas de fase sólida, se conocen en el arte y abarcan por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no tóxicas o no dañinas a las células y se dirigen preferiblemente a partir al agente de enlace a la superficie de la célula. Alternativamente, las mezclas de células que se sospecha contienen células que expresan polipéptidos de la invención, se pueden primero incubar en una proteina que enlaza polipéptidos biotinilados de la invención. Los periodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar el enlace suficiente a los péptidos de la invención. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna empacada con perlas recubiertas de avidina, con lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona el enlace de las células que enlazan polipéptidos a las perlas. El uso de perlas recubiertas con avidina se conoce en el arte. Ver Berenson, et al. J. Cel l . Bi o ch em . , 10 D : 239 ( 1986 ) . El lavado de material no enlazado y la liberación de las células enlazadas se lleva a cabo utilizando métodos convencionales. El grado deseado de pureza depende del uso pretendido de la proteina. Se desea un grado de pureza relativamente alto cuando el polipéptido se va a administrar i n vi vo , por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de manera que ninguna banda de proteína que corresponde a otras proteínas sea detectable con el análisis de electroforesis de gel de poliacrilamida por SDS (SDS-PAGE) . Se reconocerá por alguien habilitado en el campo pertinente que las bandas múltiples que corresponden al polipéptido, se pueden visualizar por el SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, procesamiento post traduccional diferencial, y similares. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica hasta la homogeneidad substancial, como se indica por una banda de proteina simple en el análisis por SDS-PAGE. La banda de proteína se puede visualizar por coloración con plata, coloración con azul Coomassie o (si la proteina esta radioetiquetada) por autoradiografía. Ensayos El polipéptido purificado de la invención (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros y otras formas) se puede probar en cuanto a su capacidad para enlazarse a similares, ligandos, receptores, substratos, o contra estructura y similares ("Agente enlazante") en cualquier ensayo apropiado, tal como un ensayo de enlace convencional. Para ilustrar, el polipéptido se puede etiquetar con un reactivo detectable (por ejemplo, radionúclido, cromoforo, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluoromé trica y similares) . El polipéptido etiquetado se pone en contacto con células que expresan el agente enlazante. Las células se lavan después de separar el polipéptido etiquetado no enlazado, y la presencia de la etiquetada enlazada a la célula se determina por una técnica apropiada, escogida según la naturaleza en la etiqueta . Un ejemplo del procedimiento de ensayo enlazante es como sigue. Un vector de expresión recombinante que contiene un agente de enlace cADN se construyen usando los métodos conocidos en el arte. Células de CV1-EBNA-1 en 10 cm2 se transfectan con el vector de expresión recombinante. Las células CV-1 EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresan constitutivamente el antigeno 1 nuclear EBV utilizado por el promotor /enriquecedor temprano-inmediato VMV . La CV1-EBNA-1, se derivó de la linea de célula de riñon del mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70), como se describe por McMahan y colaboradores , ( EMBO J. 10:2821, 1991). Las células transfectadas se cultivan durante 24 horas , y las células en cada plato se dividen en una placa de 24 pozos. Después de un cultivo por 48 horas adicionales, la célula transfectada (de alrededor de 4xl04 por pozo) se lavan con BM- NFDM, que es un medio enlazante (RPMI 1640 conteniendo 25 mg/ml de albúmina de suero de bovino, 2 mg/ml de azida de sodio, 20 mM Hepes pH 7.2) a las cuales se han agregado 50 mg/ml de leche seca sin grasa. Las células se incuban entonces durante 1 hora a 37°C con concentraciones diversas de, por ejemplo, una proteina de fusión Fc/polipépt ido soluble elaborada como se estableció arriba. Las células se lavan y se incuban después con una concentración saturadora constante de un IgG antihumano de ratón y 125I en medio de enlace, con agitación suave durante 1 hora a 37°C. Después de un lavado extenso, las células se liberan por tripsinización. El IgG antihumano de ratón empleado arriba se dirige contra la región Fc de IgG humano y se puede obtener de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA . El anticuerpo se radioyoda usando el método estándar de cloramina-T. El anticuerpo se enlazará a la porción de Fc de cualquier pol ipépt ido/proteina Fc que se ha enlazado a la célula. En todos los ensayos, el enlace no específico del anticuerpo 125I, se ensaya en ausencia de la proteina de fusión/Fe, asi como en presencia de la proteina de fusión Fc y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo IgG antihumano de ratón no etiquetado. El anticuerpo 125I enlazado a células se cuantifica en un contador Packard Autogamma . Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660,1949) se generan en una corrida RS/1 (BBN Software, Boston, MA) en una computadora Microvax . Otro tipo de ensayo de enlace apropiado, es un ensayo de enlace competitivo. Para ilustrar, la actividad biológica de una variante se puede determinar al ensayar la capacidad de la variante para competir en la proteína nativa para enlazarse al agente enlazante. Los ensayos competitivos de enlaces se pueden llevar a cabo por metodologías convencionales. Los reactivos que se pueden emplear en ensayos competitivos de enlace incluyen polipéptidos IMX radioetiquetados y células intactas que expresan el polipéptido IMX (endógeno o recombinante) sobre la superficie de la célula. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido IMX radioetiquetado soluble se puede usar para competir con una variante de polipéptido IMX soluble para enlazarse al agente de enlace a la superficie de la célula. En lugar de células intactas, uno puede substituir un agente soluble de enlace/proteina de fusión Fc enlazada a una fase sólida a través de la interacción de la proteína A o la proteína G (sobre una fase sólida) con la porción Fc . Las columnas de cromatografia que contienen la protéína A y la proteína G incluyen aquellas disponibles de Pharmacia Biotech, Ine ., Piscataway , NJ. Otro tipo de ensayo de enlace competitivo, utiliza el agente de enlace soluble radioetiquetado, tal como un agente soluble de enlace/proteina de fusión Fc, y células intactas que expresan el polipéptido IMX. Se pueden obtener resultados cualitativos por ensayo de enlace de plata autoradiográfica competitivos, mientras que las gráficas Scatchard (Scatchard, Ann. N . Y. Acad. Sci . 51:660,1949) se pueden utilizar para generar resultados cuantitativos. USO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS IMX U OLIGONUCLEÓTIDOS Además de usarse para expresar los polipéptidos como se describió arriba los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo el ADN, y los oligonucleótidos de los mismos se pueden usar: • como sondas para identificar ácido nucleico que codifica proteinas homologas a los polipéptidos IMX; • para identificar cromosomas humanos; • para mapear genes en los cromosomas humanos de números 7, 19, y 22; • para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras condiciones asociadas con los cromosomas humanos de números 7, 19, y 22; • como oligonucleótidos de sentido o anti sentido de hebra simple, para inhibir la expresión del polipéptido codificado por la secuencia IMX; • para ayudar a detectar los genes defectuosos en un individuo; y • para terapia de genes. Sondas Entre los usos de los ácidos nucleicos de la invención, está el uso de fragmentos como sondas o cebadores. Tales fragmentos comprenden generalmente al menos alrededor de 17 nucléotidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60, nucléotidos contiguos en una secuencia de ADN. Debido a que los homólogos de la secuencia SEC ID NOs:l-23, de . otras especies mamíferas se contemplan aquí, las sondas basadas en la secuencia humana del ADN de SEC ID Nos: 1-23, se pueden usar para tamizar colecciones de cADN derivadas de otras especies de mamíferas, usando técnicas de hibridación convencional de especies cruzadas . Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácido establecidas arriba, se pueden preparar conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones de cadena de polimerasa (CPR) en donde los fragmentos del ADN son aislados y amplificados . Identificación del Número de Cromosomas Todos o una porción del ácido nucleico de SEC ID Nos: 1-23, incluyendo oligonucleótidos, se pueden usar por aquellos hábiles en el arte utilizando técnicas bien conocidas para identificar los cromosomas humanos, y en lugares específicos de los mismos, que contienen el ADN de los miembros de la familia IMX. Las técnicas útiles se incluyen, pero no se limitan al uso de la secuencia o porciones, incluyendo oligonucleótidos, como una sonda en diversas técnicas bien conocidas tales como la hibridización para extensiones de cromosomas, hibridización de manchado Southern, para hibridizar líneas de células, etiquetado fluorescente, y mapeo híbrido de radiación. Por ejemplo, se pueden mapear los cromosomas por hibridización por radiación. El PCR se lleva a cabo utilizando el panel Genebridge 4 del panel Whitehead Inst itute/MIT Center for Genome Research de los húbridos de radiación 93 (http : / /genome . wi . mit . edu/ftp/distribut ion /human S TS releases /j uly97 /rhmap/genebridge4. html ) . Se usan los cebadores que yacen dentro de un exon putativo del gen de interés y en el cual amplifican un producto a partir del ADN genómico humano, pero no amplifican el ADN genómico del hámster. Los resultados del PCR se convierten en un vector de base que se remite al sitio Whitehead/MT Radiation Mapping en internet (http://www-SEC.wi.mit.edu) . Los datos se registran y se proporciona la asignación de cromosomas y colocación con relación a los marcadores del sitio de etiquetado de secuencia conocido (STS) en el mapa híbrido de radiación. El siguiente sitio de internet proporciona información adicional acerca del mapeo híbrido por radiación: http : / /www-genome . wi . mit . edu/ftp/distribut ion/human STS relea ses/july97/07-97. INTRO. html) . Enfermedades Asociadas con la Identificación Como se describió previamente las moléculas IMX numeradas 4,21,44 y 56 han sido mapeadas en ubicaciones particulares de cromosomas. Aqui, el ácido nucleico de una molécula particular IMX o un fragmento del mismo, se puede usar por alguien hábil en el arte utilizando técnicas bien conocidas para analizar las anormalidades asociadas con el mapeo de genes a tales cromosomas. Esto permite a alguien distinguir las condiciones en las cuales este marcador se rearregla o elimina. Además, el nucleótido de tales moléculas de IMX o fragmentos del mismo se pueden usar como un marcador posicional para mapear otros genes de ubicación previamente desconocida . El ADN se puede usar en el desarrollo de tratamientos para cualquier enfermedad mediada (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas o insuficientes de los genes que corresponden a los ácidos nucleicos de la invención. La descripción de aquí de la secuencia de nucleótidos nativos permite la detección de genes defectuosos, y la substitución de los mismos con genes normales. Los genes defectuosos se pueden detectar en ensayos de diagnóstico i n vi t ro , y por comparación de una secuencia de nucleótido nativo aquí descrita con aquella de un gen derivado de una persona que se sospecha que aloja un defecto en este gen. Sentido-Antisentido Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos de antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra simple (ya sea ARN o ADN) capaz de enlazarse a secuencias de ADN (antisentido) o de mARN (sentido) objetivo. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido de conformidad con la presente invención, comprenden un fragmento de ADN (SEC ID NOs:l-23). Tal fragmento comprende generalmente al menos alrededor de 14 nucleótidos, preferiblemente desde alrededor de 14 a alrededor de 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido de antisentido o sentido, con base a la secuencia de cADN que codifica una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein and Cohén ( Cán cer Res . 48:2659,1988) y van der Krol et al. ( Bi o t echn i ques 6:958, 1988). El enlace de oligonucleótidos de sentido o antisentido a la secuencia de ácido nucleico objetivo, resulta en la formación de duplas que bloquean o inhiben la expresión de proteinas por uno o varios medios, incluyendo la degradación aumentada del mARN por ARNseH, la inhibición de la división, terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos de antisentido pueden así usarse para bloquear la expresión de proteína. Los oligonucleótidos de sentido y antisentido, comprenden además oligonucleótidos que tienen columnas de fosfodiéster-azúcar modificada (u otras ligaduras de azúcar, tales como aquellas descritas en WO91/06629) y en donde tales ligaduras de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con ligaduras resistentes al azúcar son estables i n vi vo (esto es, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para poder enlazarse a la secuencia de nucléotido efectivo.

. Otros ejemplos de oligonucleótidos de sentido o antisentido, incluyen aquellos oligonucleótidos que están ligados en forma covalente a porciones orgánicas, tales como aquellas descritas en WO 90/10448, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli- ( L-lisina ) . Todavia además, los agentes intercaladores tales como la elipticina, y agentes de alquilación o complejos de metal, se pueden colocar a los oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de enlace del oligonucleótido de sentido o antisentido para la secuencia de oligonucleótidos objetivo. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido, se pueden introducir dentro de una célula que contiene la secuencia efectiva del ácido nucleico por cualquier método de transferencia de genes, incluyendo por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediada por CaP04, elect roforación , o por el uso de vectores de transferencia de genes tales como el virus de Epstein-Bar. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido también se pueden introducir dentro de una célula que contiene la secuencia objetivo de nucleótidos, por la formación de un conjugado con una molécula de enlace a ligando, tal como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de enlace a ligando apropiadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie de célula, factores de crecimiento, otras citocinas, otros ligandos que se enlazan a los receptores de superficie de células. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de enlace a ligando no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula de enlace a ligando para enlazarse con su molécula receptor correspondiente, o bloquear la entrada de oligonucleótidos de sentido o antisentido o su versión conjugada dentro de la célula. Alternativamente, se puede introducir el oligonucleótido de sentido o antisentido dentro de una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico, por la formación de un complejo de lipido- oligonucleótido, como se describe en WO 90/10448. El complejo lipido- oligonucleótido de sentido o antisentido, se disocia preferiblemente dentro de la célula por una lipasa endógena. USO DE POLIPETIDOS IMX Y POLIPÉPTIDOS FRAGMENTADOS Los usos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes : Purificación de proteinas y medición de la actividad de las mismas Agentes de entrega Reactivos de investigación y terapéuticos - Marcadores de enfoque isoeléctrico y peso molecular Controles para la fragmentación de péptidos Identificación de proteínas desconocidas Preparación de anticuerpos Reactivos de Purificación Cada uno de los polipéptidos de la invención encuentra uso como un reactivo de purificación de proteina. Los polipéptidos se pueden colocar a un material de soporte sólido y usarse para purificar (agente de enlace) proteína por cromatografía de afinidad. En modalidades particulares, un polipéptido (en cualquier forma aqui descrita que sea capaz de enlazar (agente de enlace)) se coloca a un soporte sólido por procedimientos convencionales. Como un ejemplo, están disponibles las columnas de cromatografia que contienen grupos funcionales que reaccionarán como grupos funcionales sobre cadenas laterales de aminoácido de las proteinas (Pharmacia Biotech, Ine Piscataway, NJ) . En una alternativa, un polipépt ido/proteína Fc (como se discute arriba) se coloca con una columna de cromatografía que contiene proteína A o proteína G que dió la interacción con la porción Fc . El polipéptido también encuentra uso en la purificación o identificación de células que se expresan (agente de enlaces) sobre la superficie de la célula. Los polipéptidos se enlazan a una fase sólida tal como una matriz de cromatografia de columna en un substrato apropiado similar. Por ejemplo, las microesferas magnéticas se pueden recubrir con los polipéptidos y mantenerse en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de las mezclas de células que contienen células expresantes (agentes de enlaces) se ponen en contacto con la fase sólida que tiene en los polipéptidos en las mismas. Las células que se expresan (agentes de enlaces) sobre la superficie de la célula se enlazan a los polipéptidos fijos y las células no enlazadas se desechan después. Alternativamente los polipéptidos se pueden conjugar con una porción detectable, después incubarse con células para probarse con expresión (agentes de enlace) . Después de la incubación, se elimina la materia etiquetada no enlazada y se determina la presencia o ausencia de la porción detectable en la célula. En un alternativa adicional, las mezclas de células sospechosas de contener células (agentes de enlace) se incuban con polipéptidos biotinilados. Los periodos de incubación son típicamente al menos de 1 hora de duración para asegurar el enlace suficiente. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna empacada con perlas recubiertas de avidina, por lo cual la elevada afinidad de la biotina por la avidina proporciona el enlace de las células deseadas a las perlas. Se conocen procedimientos para el uso de perlas recubiertas con avidina (ver Berensson, et al . J . Cell . Biochem . , 10D : 239 , 1986 ) . El lavado para lavar el material no enlazado, y la liberación de la célula enlazada, se llevan a cabo utilizando métodos convencionales. Medición de la Actividad Los polipéptidos también encuentran uso en la medición en la actividad biológica de la proteina (agentes de enlaces) en términos de su afinidad de enlace. Los polipéptidos se pueden así emplear por aquellos estudios que llevan a cabo el "aseguramiento en la calidad", por ejemplo, para observar la vida de anaquel y la estabilidad de proteína bajo condiciones diferentes. Por ejemplo, se pueden emplear los polipéptidos en un estudio de afinidad de enlace para medir la actividad biológica de una proteína (agentes de enlace) que ha sido almacenada a temperaturas diferentes, o producida en tipos de células diferentes. Las proteínas también se pueden usar para determinar si la actividad biológica que mantiene después de la modificación de una proteína (agentes de enlaces), (por ejemplo, modificación química, truncado, mutación, etc.). La afinidad de enlace de la proteina modificada (agentes de enlaces) se compara con aquellas de una proteina no modificada (agentes de enlaces) para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica del (agentes de enlace) . La actividad biológica de una proteina de (agente de enlace), se puede entonces asegurar antes de que se usen en un estudio de investigación, por ej emplo .

Agentes de Entrega Los polipéptidos también encuentran uso como portadores para agentes de entrega colocados a los mismos agentes de enlace que soportan células. La expresión de células (agentes de enlace) incluyen aquellas identificadas en (agregar la cita si se conoce la referencia) . Los polipéptidos entonces se pueden usar para entregar agentes de diagnóstico terapéuticos a tales células (u otros tipos de células encontradas para expresar (agentes de enlace) de la superficie de células) en procedimiento in vi t ro o in vi vo . Los agentes detectables (diagnóstico) y terapéuticos que se pueden colocar a un polipéptido incluyen pero no se limitan a toxinas, otros agentes citotóxicos, medicamentos, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluoromét rica , y similares, una vez escogido el agente particular de conformidad con aplicación pretendida. Entre las toxinas esta la ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de la Ps e udom on a s a eru gi n osa , proteínas inactivantes de ribosoma, micotoxinas tales como los t r icot ecenos , y derivados y fragmentos de los mismos (por ejemplo cadenas simples). Los radionúclidos apropiados para uso diagnóstico incluyen pero no se limitan a 123I, 131I, 99mTc, 211In, y 76Br. Ejemplos de radionúclidos apropiados para uso terapéutico están 1 3 1 t I, 2 I KlA4t. 7 7 'DBr_, 1i886btR,e?, 2 1 2 n /lzP,b, 2¿ 1i 2Z QBi •, 110U 93 DPd J, 604",Cu, y 67Cu Tales agentes se pueden colocar al polipéptido por cualquier procedimiento convencional apropiado. El polipéptido comprende grupos funcionales sobre las cadena laterales de aminoácido que pueden reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar enlaces covalentes por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente se puede derivar para generar o colocar un grupo funcional reactivo deseado. La derivación puede involucrar la colocación de uno de los reactivos de acoplamiento difuncionales, disponibles para colocar diversas moléculas a proteinas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen varias técnicas para proteinas de radioetiquetado. Los metales de radionúclidos se pueden colocar a los polipéptidos mediante el uso de un agente quelante apropiado difuncional, por ejemplo.

Los conjugados que comprenden polipéptidos y un agente terapéutico de diagnóstico apropiado (preferiblemente ligado de forma covalente) se preparan así. Los conjugados se administran o se emplean de otra manera en una cantidad apropiada para la aplicación en particular. Agentes Terapéuticos Se pueden usar los polipéptidos de la invención en el desarrollo del tratamiento para cualquier enfermedad mediada (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas o insuficientes de los polipéptidos. Estos polipéptidos se pueden administrar a un mamífero que padece tal enfermedad. Los polipéptidos también se puede emplear para inhibir la actividad biológica de (agentes de enlace) , en procedimientos in vi t ro o in vi vo . Por ejemplo, se puede usar el polipéptido purificado para inhibir el enlace (agentes de enlace) a una superficie de células endógena (agentes de enlace) . Los efectos biológicos que resultan del enlace (agentes de enlace) a los receptores endógenos se inhiben de esta manera. Se pueden administrar polipéptidos IMX a un mamífero para tratar una enfermedad mediada por el agente de enlace. Tales enfermedades mediadas por (agentes de enlace) incluyen condiciones causadas (directa o indirectamente) o exacerbadas por (agentes de enlaces) . Las composiciones de la presente invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma aquí descrita, tal como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros y fragmentos biológicamente activos. En modalidades particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprenden polipéptidos solubles. Las composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un polipéptido de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como diluyentes fisiológicamente aceptables, portadores o excipientes, se proporciona aqui. Se pueden formular los polipéptidos de conformidad con métodos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se pueden combinar en mezcla, ya sea como el material activo único o con otros materiales activos conocidos apropiados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo solución salina, acetato, Tris-HCl, y soluciones amortiguadoras de fosfato), conservadores, (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabeno), emulsificantes, solubilizantes, adyuvantes y/o portadores. Las formulaciones apropiadas para composiciones farmacéuticas, incluyen aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton. PA. Además, tales composiciones pueden formar complejos con polietilenglicol (PEG), iones de metal, o incorporarse dentro de los compuestos poliméricos tales como el ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelos, vesciculas unilamelares o multilamelares, espectros o esferoblastos de eritrocitos. Tales composiciones tendrán influencia en el estado fisico, solubilidad, estabilidad, velocidad de la liberación i n vi vo , y la velocidad de la separación i n vi vo , y se escogen entonces de conformidad con la aplicación pretendida. Las composiciones de la invención se pueden administrar de cualquier manera apropiada, por ejemplo, tópicamente, parenteralmente, por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección por ejemplo, por vía subcutánea intravenosa o intramuscular, también incluyendo administración localizada, por ejemplo, en el sitio de la enfermedad o herida. También se contempla la liberación prolongada de implantes. Alguien con habilidad en el arte pertinente reconocerá que dosis apropiadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza de la enfermedad tratada, el peso corporal del paciente, edad y la condición general y la via de administración. Se pueden determinar las dosis preliminares de conformidad con pruebas de animales, y el escalamiento de dosis para administración humana se lleva a cabo según las prácticas aceptadas en el arte. Las composiciones que comprenden ácidos nucleicos en formulaciones fisiológicamente aceptables también se contemplan. Se puede formular el ADN por inyección, por ejemplo. Agentes de Investigación Otro uso del polipéptido de la presente invención, es como una herramienta de investigación para el estudio de los efectos biológicos que resultan de la inhibición de interacción dentro de los polipéptidos de la invención y su "agente de enlace". También se pueden emplear los polipéptidos en ensayos i n vi t ro para detectar el agente de enlace o las células que expresan el agente de enlace o las interacciones de los mismos. Peso Molecular, Marcadores de Punto Isoeléctrico Los polipéptidos de la presente invención se pueden someter a fragmentación en péptidos más pequeños mediante medios químicos y enzimáticos, y los fragmentos de péptidos asi producidos se pueden usar en el análisis de otras proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, tales fragmentos de péptidos se pueden usar como marcadores de peso molecular de péptidos, marcadores de punto isoeléctrico de péptido, o en el análisis del grado de la fragmentación de péptido. Aquí, la invención también incluye estos polipéptidos y fragmentos de péptidos, así como estuches para auxiliar en la determinación del peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de una proteína desconocida y estuches para evaluar el grado de fragmentación de una proteína desconocida. Aunque todos los métodos de fragmentación están cubiertos por la invención, la fragmentación química es una modalidad preferida, e incluye el uso de bromuro de cianógeno para desdoblar bajo condiciones acidas neutrales tales que el desdoblamiento específico suceda en los residuos de metionina (E. Gross, Methods in En=. 11:238-255,1967). Esto puede también incluir etapas adicionales, tales como etapas de carboximetilación para convertir los residuos de cisteína en especies no reactivas. La fragmentación enzimática es otra modalidad preferida, que incluye el uso de una proteasa como la asparaginilendo-pept idasa , arginilendo-peptidasa, proteasa I de Ach romoba c t er , tripsina, proteasa V8 de S taph l ococcus a ure us , Asp-N endoproteinasa, o Lys-C endoproteinasa bajo condiciones convencionales que resultan en el desdoblamiento en residuos específicos de amino ácido. La asparagini lendo-pept idasa se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de la asparagina presentes dentro de los polipéptidos de la invención. La argini lendo-pept idasa se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de arginina presentes dentro de estos polipéptidos. La proteasa I Ach romoba c t er se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de lisina presente dentro de los polipéptidos (Sakiyama and Nakat, U.S. Patent No. 5,248,599; T. Masaki y colaboradores , Bi och im . Bi ophys . Ac ta 660:44-50,1981; T Masaki y colaboradores, Biochim. Biophys. Acta 660:51-55,1981). La tripsina se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de arginina y de lisina presentes dentro de los polipéptidos de la invención. La fragmentación enzimática puede también suceder con una proteasa que inhibe residuos múltiples de aminoácido. Por ejemplo, la proteasa V8 de S t aph l o co ccu s a u re u s se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de ácido glutámico y aspártico presentes dentro de los polipéptidos (D.W. Cleveland, J. Bi ol . Ch em . 3:1102-1106,1977) . La Asp-N endoproteinasa se puede desdoblar específicamente en el costado amino de los residuos de asparagina presentes dentro de los polipéptidos. La Lys-C endoproteinasa se puede desdoblar específicamente en el costado carboxilo de los residuos de lisia presentes dentro de los polipéptidos de la invención. Otros tratamientos químicos y enzimáticos se pueden similarmente utilizar para fragmentar específicamente estos polipéptidos en un conjunto único de péptidos específicos. Por supuesto, los péptidos y fragmentos de los polipéptidos de la invención también se pueden producir por procesos recombinantes convencionales y procesos sintéticos bien conocidos en el arte. Con respecto a los procesos recombinantes, los polipéptidos y fragmentos de péptidos cubiertos por la invención pueden tener pesos moleculares variables dependiendo de la célula huésped en la cual se expresan. La glicosilación de polipéptidos y fragmentos de péptidos de la invención en diversos tipos de células, puede resultar en variaciones de peso molecular de estas piezas, dependiendo del grado de modificación. El tamaño de estas piezas puede ser más heterogéneo con fragmentos de polipéptidos derivados de la porción extra celular del polipéptido. Los polipéptidos consistentes y fragmentos de péptidos se pueden obtener mediante el uso de polipéptidos derivados completamente de la región citoplásmica y de la transmembrana, pretratamiento con N-glicanasa para eliminar la glicosilación, o la expresión de los polipéptidos en huéspedes bacterianas.

El peso molecular de estos polipéptidos también puede variarse al fundir las secuencias adicionales de péptidos a los extremos terminales amino y carboxilo de los polipéptidos de la invención. Las fusiones de secuencias adicionales de péptidos en los extremos terminales amino y carboxilo de los polipéptidos de la invención, se pueden usar para aumentar la expresión de estos polipéptidos o ayudar en la purificación de la proteina. Además, las fusiones de secuencias adicionales de péptidos en los extremos terminales amino y carboxilo de polipéptidos de la invención alterarán algunos pero usualmente no todos, los péptidos fragmentados de los polipéptidos generados por tratamiento enzimático o químico. Por supuesto, se pueden introducir mutaciones dentro de los polipéptidos de la invención utilizando técnicas de rutina y conocidas de biología molecular. Por ejemplo, se puede designar una mutación para eliminar un sitio de desdoblamiento proteolitico por una enzima especifica o un sitio de desdoblamiento por un procedimiento de fragmentación especifico inducido químicamente. La eliminación del sitio, alterará las huellas digitales del péptido del polipéptido de la invención con la fragmentación con la enzima específica o procedimiento químico. Los polipéptidos y los péptidos fragmentados resultantes, se pueden analizar por métodos que incluyen sedimentación, electroforesis, cromatografia, y espectrometría de masas para determinar su peso molecular. Ya que la secuencia particular de aminoácido de cada pieza especifica un peso molecular, estas piezas pueden de aquí en adelante servir como marcadores de peso molecular usando técnicas de análisis tales para ayudar en la determinación del peso molecular de una proteina desconocida, polipéptidos o fragmentos de los mismos. Los marcadores de peso molecular de la invención sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes similares y consecuentemente, permiten una precisión aumentada en la determinación del peso molecular aparente de las proteinas. Cuando la invención se refiere al uso de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados, estos marcadores son preferiblemente de al menos 10 aminoácidos de tamaño. Más preferiblemente, estos marcadores de peso molecular de péptido fragmentados, están entre 10 y 100 aminoácidos de tamaño. Aún más preferiblemente, son marcadores de peso molecular de péptidos aumentados entre 10 y 50 aminoácidos tamaño y especialmente entre 10 y 35 aminoácido de tamaño. Más preferiblemente son marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados entre 10 y 20 aminoácidos de tamaño. Entre los métodos para la determinación del peso molecular está la sedimentación, electroforesis de gel, cromatografía y espectrometría de masa. Una modalidad particularmente preferida, es la electroforesis desnaturalizante con gel de poliacrilamida (U . K. Laemmli, Nature 227:680-685,1970) . Convencionalmente, el método usa dos sendas separadas con un gel que contiene dodecil sulfato de sodio y una concentración de acrilamida entre 6-20%. La capacidad de resolverse simultáneamente el marcador y la muestra bajo condiciones idénticas permiten una precisión creciente. Se defiende por supuesto, que se puede usar muchas técnicas diferentes para la determinación del peso molecular de una proteína desconocida usando los polipéptidos de la invención, y que esta modalidad no limita de ninguna manera el alcance de la invención . Cada polipéptido no glicosilado o fragmento del mismo tiene un pl que se determina intrínsicamente por su secuencia particular de aminoácido (cuyo pl se puede estimar por el técnico habilitado utilizando cualquiera de los programas de cómputo diseñados para predecir valores de pl actualmente disponibles, calculado utilizando cualquier tabla bien conocida de pKa de aminoácido, o midiendo empíricamente) . Por lo tanto estos polipéptidos y fragmentos de los mismos pueden servir como marcadores específicos para ayudar en la determinación del punto isoeléctrico de una proteina desconocida, polipéptido, o péptido fragmentado utilizando técnicas tales como el enfoque isoeléctrico. Estos polipéptidos y marcadores de péptidos fragmentados sirven particularmente bien para la estimación de los puntos isoeléctricos aparentes de proteínas desconocidas que tienen puntos isoeléctricos aparentes cercanos a aquellos del polipéptido o los marcadores de péptidos fragmentados de la invención .

La técnica del enfoque isoeléctrico, se puede además combinar con otras técnicas tales como la electroforesis con gel para separar simultáneamente una proteina con base en su peso molecular y carga. La capacidad de resolver simultáneamente estos polipéptidos o marcadores de péptidos fragmentados y la proteina desconocida bajo condiciones idénticas, permite una precisión creciente en la determinación del punto isoeléctrico aparente de la proteína desconocida. Esto es de interés particular en técnicas, tales como la electroforesis de dos dimensiones (T.D. Brock and M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)), en donde la naturaleza del procedimiento dicta que cualquier marcador debe resolverse simultáneamente con la proteina desconocida. Además, con tales métodos estos polipéptidos y péptidos fragmentados de los mismos pueden ayudar en la determinación del punto isoeléctrico y el peso molecular de una proteína desconocida o péptido fragmentado. Se pueden visualizar polipéptidos y péptidos fragmentados utilizando dos métodos diferentes que permiten una discriminación entre la proteína desconocida y los marcadores de peso molecular. En una modalidad, el polipéptido y los marcadores de peso molecular de péptido fragmentado de la invención, se pueden visualizar usando anticuerpos generados en contra de estos marcadores y técnicas convencionales de inmunomanchado. Esta detección se lleva a cabo bajo condiciones convencionales que no resultan en la detección de la proteína desconocida. Se entiende que no puede ser posible generar anticuerpos contra todos los fragmentos de polipéptidos de la invención, ya que péptidos pequeños pueden no contener epítopes inmunogénicos. Se entiende además que no todos los anticuerpos trabajarán en este ensayo; sin embargo, aquellos anticuerpos que son capaces de enlazar polipéptidos y fragmentos de la invención, se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales . La proteina desconocida también se visualiza usando un procedimiento de coloración convencional. El exceso molar de la proteina desconocida al polipéptido o marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de la invención, es tal que el procedimiento de coloración convencional detecta predominantemente la proteina desconocida. El nivel de este polipéptido en marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados es tal, que permite poca o ninguna detección de estos marcadores por el método convencional de coloración. El exceso molar preferido de proteína desconocida a los marcadores de peso molecular de polipéptido de la invención es entre 2 y 10,000 veces. Más preferiblemente, el peso molecular preferido de proteína desconocida para estos marcadores de peso molecular de polipéptidos es entre 10 y 10,000 veces y especialmente 100 y 1,000 veces. Se entiende por supuesto, que se pueden usar muchas técnicas para la determinación y detección del peso molecular y del punto isoeléctrico de una proteina desconocida, polipéptido, y péptido fragmentados del mismo usando estos marcadores de peso molecular de polipéptidos y fragmentos de péptidos de los mismos y que estas modalidades no limitan de alguna manera el alcance de la invención . En otra modalidad, el análisis de la fragmentación progresiva de los polipéptidos de la invención en péptidos específicos (D.W. Cleveland y colaboradores, J. Bi o l . Ch em . 252:1102-1106,1977), tal como por la alteración del tiempo o temperatura de la reacción de fragmentación, se puede usar como un control para el grado de desdoblamiento de una proteína desconocida. Por ejemplo, el desdoblamiento de la misma cantidad de polipéptido y proteína desconocida bajo condiciones idénticas, puede permitir una comparación directa del grado de fragmentación. Las condiciones que resultan en fragmentación completa del polipéptido, pueden también resultar en una fragmentación completa de la proteina desconocida . En cuanto al uso especifico de los polipéptidos y péptidos fragmentados de la invención como marcadores del peso molecular, la fragmentación de los polipéptidos de SEC ID NOs:24-33 con bromuro de cianógeno, genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados. Un fragmento adicional resulta si está presenta la metionina de inicio. La distribución de los residuos de metionina determina el número de aminoácidos en cada péptido y la composición particular de aminoácido de cada péptido determina su peso molecular. Además, los polipéptidos purificados preferidos de la invención (SEC ID NOs:24-33) tienen pesos moleculares calculados de aproximadamente 3683, 1783, 11248, 75503, 43040, 8051, 33306, 3515, 10736, 25162, y 2450 daltones. En donde se usa una proteína intacta, el uso de estos marcadores de peso molecular de polipéptido, permite una precisión presente en la determinación del peso molecular aparente de las proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 3683, 1783, 11248, 75503, 43040, 8051, 33306, 3515, 10736, 25162, o 2450 daltones. En donde se usan fragmentos, hay una precisión creciente en la determinación del peso molecular sobre el intervalo de pesos moleculares del fragmento . Finalmente, en cuanto a los estuches que están cubiertos por la invención, los constituyentes de tales estuches pueden variar pero contienen tipicamente al polipéptido y marcadores de peso molecular de péptido fragmentado. También dichos estuches pueden contener los polipéptidos en donde se ha separado un sitio necesario para la fragmentación. Adicionalmente, los estuches pueden contener reactivos para el desdoblamiento específico de polipéptidos y la proteína desconocida por desdoblamiento químico o enzimático. Los estuches pueden además contener anticuerpos dirigidos en contra de polipéptidos o fragmentos de los mismos de la invención. Identificación de Proteínas Desconocidas Como se estableció arriba, un polipéptido o huella digital de péptido puede entrar dentro o compararse con una base de datos de proteinas conocidas para ayudar con la identificación de la proteína desconocida usando espectrometría de masas (W.J. Henzel y colaboradores , Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90:5011-5015,1993; Fenyo y colaboradores, Elect rophoresis 19:998-1005,1998) . Una diversidad de programas de cómputo para facilitar estas comparaciones, está disponible por vía del internet, tal como Protein Prospector (Internet site: prospector.uscf.edu), Multident ( Internet site : www. expasy. chsprot/multident . html) , Pept ideSearch (Internet site: www . mann . embl-heiedelberg.de...deSearch/FR PeptideSearchForm.htm 1 ) , y ProFound (Internet site: www . chai t-sgi . roe ke fe 11er. edu/egi-bin/prot-id-frag . html) . Estos programas permiten al usuario especificar el agente de desdoblamiento de los pesos moleculares de los péptidos fragmentados dentro de una tolerancia designada. Los programas comparan estos pesos moleculares con las bases de datos de la proteína para ayudar en determinar la identidad de la proteína desconocida. Además, un polipéptido o un producto de digestión de péptido se puede formar en secuencia utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y la secuencia resultante buscarse en la base de datos (J.K. Eng, y colaboradores, J. Am . Spec. 5: 976-989 (1994 ) ;M. Mann and M. Wilm, Anal. Chem. 66: 390-4399 (1994) ; J.A. Taylor and R.S. Johnson. Rapid Comm. Mass Spec. 11:1067-1075 (1997) ) . Los programas de búsqueda que se pueden usar en este proceso existen en el internet, tal como el Lutefisk 97 ((Internet site: www . lsbc . com: 70 utefisk97.html) , y Protein Prospector, Peptide Search y programas ProFound arriba descritos. Por lo tanto, la agregación de una secuencia de un gel y su secuencia predecible de proteinas y fragmentos de péptidos a una base de datos de secuencia, puede ayudar en la identificación de proteinas desconocidas usando espectrometría de masas en tándem.

Anticuerpos Los anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos de la invención se proporcionan aqui. Tales anticuerpos se enlazan específicamente a los polipéptidos por medio de los sitios de enlace antígeno del anticuerpo (en oposición al enlace no especifico). Asi, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteinas de fusión, etc., como se establecen arriba se pueden emplear como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoreactivos de los mismos. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales y policlonales por técnicas convencionales. Ver por ejemplo, Monoclonal Antibodies , Hybridomas : A New Dimensión in Biological Analyses , Kennet et al. (eds.), Plenum Presss, New York(1980); y Antibodies : A laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Los fragmentos de enlace antígeno de tales anticuerpos, que se pueden producir por técnicas convencionales, también están cubiertos por la presente invención. Ejemplos de tales fragmentos incluyen pero no se limitan a fragmentos a Fab y (ab' ) . Los fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de ingeniería genética también se proporcionan. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales de murina. Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar por técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a los humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo de murina (o solo el sitio de enlace de antigeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de enlace de antigeno de un anticuerpo monoclonal de murina y un fragmento de región variable (que carece del sitio de enlace de antigeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales preparados por ingeniería y quiméricos, incluyen aquellos descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al . (Bio/Technology 7:934, 1989), Winter y Harris (TIPS 14:139, May, 1993). Los procedimientos para generar anticuerpos t ransgénicamente se pueden encontrar en GB 2,272,440, Patentes US Nos. 5,569,825 y 5,545,806 y patentes relacionadas que reclaman prioridad de las mismas, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos de la presente invención, y no reaccionan en forma transversal con otras proteinas. Los procedimientos de tamizado mediante los cuales se pueden identificar estos anticuerpos son bien conocidos, y pueden involucrar cromatografía de inmunoafinidad por e j emplo . Las lineas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención también se contemplan aqui. Tales hibridomas se pueden producir e identificar por técnicas convencionales. Un método para la producción de tal linea de célula de hibridoma comprende la inmunización de un animal con un polipéptido; células del bazo cosechadas de un animal inmunizado, la succión de dichas células del bazo a una línea de células de mieloma, con lo cual se genera células de hibridoma; y la identificación de una línea de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales se pueden recuperar por técnicas convencionales. Usos de los Mismos Los anticuerpos de la invención se pueden usar en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos o fragmentos de la invención, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención por cromatografía de inmunoafinidad . Aquellos anticuerpos que pueden adicionalmente bloquear el enlace de los polipéptidos de la invención al agente de enlace, se pueden usar para inhibir la actividad biológica que resulte de dicho enlace. Tales anticuerpos de bloqueo se pueden identificar usando cualquier procedimiento de ensayo apropiado, tal como anticuerpos de prueba para la capacidad de inhibir enlaces del agente de enlace a ciertas células que expresan el agente de enlace. Alternativamente, los anticuerpos de bloqueo se pueden identificar en ensayos para la capacidad de inhibir un efecto biológico que resulta del enlace del agente de enlace a las células objetivo. Tal anticuerpo se puede emplear en un procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que generó el anticuerpo. Se pueden asi tratar las enfermedades causadas o exacerbadas (directa o indirectamente) por la interacción de un (agente de enlace) con el receptor de la superficie de célula (agente de enlace) . Un método terapéutico involucra la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad efectiva para inhibir la actividad biológica mediada por un (agente de enlace) . Los anticuerpos monoclonales se prefieren generalmente para su uso en tales métodos terapéuticos. En una modalidad, se emplea un fragmento de anticuerpos de enlace antigeno. Los anticuerpos se pueden tamizar para sus propiedades agonísticas (esto es, imitadoras de ligando) . Tales anticuerpos, al enlazarse a un antigeno de superficie de célula, inducen efectos biológicos (por ejemplo, la transducción de señales biológicas) similar a los efectos biológicos inducidos cuando el agente de enlace se enlaza con el antígeno de superficie de célula. Las composiciones que comprenden un anticuerpo que se dirige contra un polipéptido de la invención, y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable se proporcionan aqui. También se proporcionan aquí los conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo de diagnostico) o terapéutico, colocado al anticuerpo. Ejemplos de tales agentes se presentan arriba. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar además las modalidades particulares de la invención, y no se conjuguen como limitantes del alcance de la presente invención. Ejemplo 1: Aislamiento de los ácidos nucleicos IMX El modelo de barrera epitelial T84 Como se discutió arriba, el daño a la barrera epitelial intestinal, es un sello distintivo de (IBD), y se han desarrollado diversos modelos i n vi t ro de la función de barrera epitelial durante los años. El mejor caracterizado de estos modelos es el sistema de barrera epitelial intestinal T84, Dharmsathaphorn y colaboradores, Am . J . Phys i o l . , 246: G204-G208, 1984 y y colaboradores, J. Cel l Bi ol . , 101:2124-2133, 1985) . Las células T84 se colocaron en placas sobre insertos de filtro de policarbonato para transpozos de 75 mm (Costar) y se hicieron crecer en DME/F12(1:1) conteniendo suero de bovino y cordero inactivado por calor al 10%. Las células se mantuvieron en confluencia durante 2-3 días, y se determinó la integridad de la barrera epitelial al medir la resistencia eléctrica t ransepitelial (TER) usando un voltóhmetro epitelial EVOM (World Precisión Instruments) . Cuando los valores TER eran superiores a 1000 ohms/cm2 y eran estables, se trataron las células con interferon-g (30 ng/ml, Genzyme) agregados al costado basolateral de la membrana. En diversos momentos después del tratamiento (4, 24 y 44 horas), se midió la TER para observar la disrupción inducida por el interferon de la barrera, y se recolectó el ARN de las células en aquellos puntos de tiempo utilizando el reactivo TRIzol (Life Technologies) . Se extrajo el ARN utilizando métodos convencionales y posteriormente usado para el análisis TOGA™ como se describe en el ejemplo 2.

Aná l i s i s TOGATM Este ejemplo describe un método para la determinación de las características de expresión del mARN. El ARN aislado se analizó usando un método de identificación específico de secuencia simultánea de mARN conocido como TOGA™ (Análisis de expresión total de genes) descrito en la Patente U.S. No. 5,459,037 y Patente U.S. 5,807,680, que se incorporan aquí como referencia. Preferiblemente, antes de la aplicación de la técnica TOGA™, el ARN aislado se enriqueció para formar una población de partida de mARN que contenia poliA por los métodos conocidos en el arte. En una modalidad preferida, el método TOGA™ comprendió además una etapa adicional PCR utilizando cuatro reacciones separadas, una por cada uno de los cuatro cebadores 5' PCR, y plantillas de cADN preparadas a partir de una población de cARN de antisentido. Una etapa final de PCR utilizó 256 cebadores de PCR 5' en 64 subdepósitos para cada una de las cuatro reacciones de los productos PCR producidos en la etapa previa que eran fragmentos de cADN que correspondían a la región 3' de la población de partida mARN.

Los productos PCR producidos se identificaron después por a) la secuencia de al menos los 7 pares base 5', preferiblemente la secuencia del fragmento completo, y b) la longitud del fragmento. Estos dos parámetros, secuencia y longitud de fragmento se usaron para comparar los productos PCR obtenidos con una base de datos de secuencias conocidas de polinucleótidos. Una búsqueda de base de datos para las secuencias homologas en el Genbank resultó en que no habia correspondencias, indicando la novedad de las secuencias IMX de la invención. Las intensidades de los productos PCR se compararon a través de muestras de ARN de cuatro entradas (t=0, 4 horas, 24 horas, 44 horas) y las especies que se regularon se identificaron y caracterizaron adicionalmente (Tabla 1). El DST de la SEC ID NO: 1-23 y fragmentos de los mismos son útiles como sondas para estudiar y diagnosticar los cambios en la expresión de genes demostrados por los datos de la Tabla 1. Alternativamente, los polipéptidos y fragmentos de los mismos que son las traducciones de la SEC ID NO: 1-23 y fragmentos de los mismos, son útiles como sondas para estudiar y diagnosticar los cambios en la expresión de genes demostradas por los datos de la tabla 1.

Tabla 1. Moléculas de ácido nucleico IMX. Niveles relativos de expresión determinados por TOGA™. Ejemplo 2: Caracterización Adicional de las Moléculas de Ácido Nucleico de IMX4 y Polipéptidos Se obtuvo una secuencia adicional 569bp (SEC ID NO: 11) que incluyó el DST IMX4 (SEC ID NO: 1) por PCR de anclaje a partir de una colección T84. Un clon de aproximadamente 2.0 Kb de longitud se aisló después a partir de una colección comercial (Origene) . La secuencia del extremo 3' del clon (SEC ID NO: 12) incluyó la secuencia del IMX4 DST. La secuencia del extremo 5' del clon (SEC ID NO: 13) se acopló con parte del gen humano ApoL (AF019225, Figura 21) . No se obtuvo la secuencia completa del clon. Sin embargo, la comparación del extremo 5' del clon, sugiere que representa un producto de partición alternativo a la secuencia reportada del ApoL, esto es, las bases 1-168 se acoplan a 2 exones en el PAC, llevando el gen ApoL pero no incluyéndolo en el cADN completo reportado. Ver figura 22. Un polipéptido traducido de IMX4, se proporciona en SEC ID NO: 24. Ejemplo 3: Caracterización Adicional de las Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX10 e IMX21. Los experimentos adicionales fallaron al mostrar la regulación de estos DST en replicaciones utilizando PCR con cebadores extendidos y manchados Northern. Un polipéptido traducido de IMX 10 (SEC ID NO: 14) se proporciona en SEC ID NO: 25. Un polipéptido traducido de IMX 21 (SEC ID NO: 15) se proporciona en SEC ID NO: 26. Ejemplo 4 : Caracterización Adicional de las Moléculas de Acido Nucleico de IMX28 y Polipéptidos Se proporciona un polipéptido traducido del IMX 28 en la SEC ID NO: 27. Una proteina de fusión GST del IMX28 se usó en los estudios diseñados para identificar ligandos potenciales para esta enzima. La fusión GST del IMX28 se preparó como sigue: IMX28-8, un clon con una secuencia de codificación de longitud completa, se extirpó del pGEM por digestión Sall-Not I y se subclonó en pGEX-5X-3 digerido con Sall-Notl (Pharmacia) . El plásmido de pGEX-5X-3 contiene el gen 5' de la glutation-S-transferasa (GST) del Schistosoma japonicum al sitio de clonación Sall-Not I . La inserción del fragmento IMX28-8 de ADN dentro de este sitio de clonación, resulta en un gen de fusión que contiene GST-IMX28 en la estructura de lectura apropiada. La secuencia completa de la proteina de fusión consiste de GST seguido de un sitio de desdoblamiento de tripéptidos del Factor Xa, el péptido consiste de Gly-Ile-Pro-Arg-Asn-Ser-Arg-Val-Asp-Ala-Thr que se deriva parcialmente del vector pGEXy parcialmente del fragmento Sall-Not I de IMX28 e IMX28. El vector que contiene el gen de fusión se electroforó en células bacterianas competentes y una colonia simple que contenía el ADN, confirmada por digestión de restricción de diagnóstico, se expandió a un cultivo de 250 ml para purificación de la proteína de fusión. Brevemente, las células de estos cultivos se peletizaron y volvieron a suspender en una solución amortiguadora STE que contenía un cóctel inhibidor de proteasa y 20 ug/ml de lisozima de huevo de gallina. Las células se Usaron por la adición de 10% de sarcosil en STE (concentración final de sarcosil fue 1.5%), se sonicaron y centrifugaron para eliminar los desechos de las células. El sobrenadante se pasó sobre una columna de glut at ión-Se farosa 4B, se lavaron secuencialmente con 1.5% de sarcosil en STE y después STE. El material enlazado, que contenia la proteina de fusión GST-IMX28, se eluyó agregando Glutatión 20 mM en STE. El material eluido se analizó por SDS-PAGE paras confirmar la presencia de la proteína de fusión GST-IMX28.

Un constructo recombinante de adenovirus expresando el IMX28 se usó para infectar las células T84 para determinar los efectos en la formación de barrera epitelial. Para construir los vectores adenovirales con IMX28 no etiquetado de longitud completa e IMX28 etiquetado con FLAGcon terminal NH2, se usó el sistema pADEASYl descrito por He et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:2509-2514. Para el constructo no etiquetado, un fragmento Notl que llevaba la región completa de codificación del Imx28 se insertó en el poliligador del vector de transporte pAdtrackCMV. Después de la confirmación de la orientación correcta, el vector se cortó con la enzima de restricción Pací y se co-t ransformó en la cepa E . coli . BJ5183 junto con el vector pADEasyl. Los recombinantes que contenían el producto Imx28 se tamizaron como se describe y por el PCR especifico de genes. Para generar partículas virales infecciosas no replicantes, la cepa de ayuda 293EBNA o 293MSR se transfectó con un vector recombinante linealizado Pme I . Después de tres dias el virus se recolectó por lisis de congelación-descongelación de las células transfectadas. Diversas rondas de infección de estas células con sobrenadantes virales se llevaron a cabo para disparar los titulados. La versión etiquetada se preparó por adición de la secuencia FLAG y una región espaciadora Gly-Gly-Gly-Gly sobre la secuencia de codificación de longitud completa del Imx28 por medio del PCR con un oligo 5' con los nucleótidos incorporados para la etiqueta y el espaciador. El producto PCR se clonó en un vector TA y se extirpó con Not I y se clonó como arriba. El tamizado y la producción de la partícula viral fueron como arriba. No se observaron efectos positivos o perjudiciales en la función de barrera T84 en presencia o ausencia de I FN-gamma . Ejemplo 5: Caracterización Adicional de las Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX32 El clon original producido por la extensión del IMX32 DST, fue de 1588 bp de longitud (SEC ID NO: 17) . La primera ronda del PCR de anclaje produjo un producto 670 bp que se usó para producir un contiguo que extendió la secuencia de 585 bases a 2173 (SEC ID NO: 18). Otra ronda del PCR de anclaje produjo el producto 1676 bp, secuencia immunex32 -a24 , que además se extendió el contiguo de Imx32 a 2834 bp . Además el producto immunex32-a24. SEC . reveló una base que carece de partición alternativa 211-639 del clon IMX32-1. Hay un ORF para 155 aminoácidos en el extremo 5' de la secuencia (SEC ID NO: 28 traducido de SEC ID NO: 17). El análisis BLAST sugiere que el ORF puede contener un dominio como KRAB debido a que tiene acoplamientos parciales en las proteinas de digitación de Zn que contienen los dominios KRAB en la terminación N tal como ZNF140. Ejemplo 6: Caracterización Adicional de las Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX39 Un polipéptido traducido de IMX39 se proporciona en la SEC ID NO: 29. Las versiones del vector adenoviral no etiquetadas y etiquetadas IMX39 FLAG, se prepararon como se detalló arriba para el IMX28 en el ejemplo 4 anterior. Los controles para la expresión fueron la infección con otras proteinas entregadas adenovirales etiquetadas FLAG tal como la IMX5. Con base en la estructura predecible de su secuencia cADN, se esperó que el polipéptido IMX39 fuera una proteina citoplásmica. Sin embargo, ya que algunas citocinas secretadas, tales como aquellas de la familia IL-1, carecen de una secuencia de señal predecible pero se segregan de la célula, esta expectativa se probó experimentalmente en ambas células T84 por vía adenoviral mediada por transducción y por vía de transfección en células CVIEBNA con otro vector de expresión, pDC412. Independientemente de la evidencia para una expresión exitosa en células transfectadas, no se encontró producto en los medios como se determinó por el western FLAG (sistema T84) o el producto radioetiquetado 35-S (sistema CVIEBNA) . El control positivo en el sistema CVl fue una proteína de fusión IMX44-Fc conocida por segregarse. En ambos sistemas los vectores vacíos se usaron como control negativo. La expresión pretendida de los polipéptidos IMX39, no tuvo efecto aparente en la función de barrera en ausencia o presencia de gamma-IFN. Ejemplo 7: Caracterización Adicional de Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX40 El PCR de anclaje utilizando una colección humana Origene del intestino delgado, reveló un producto de 1669 bp(SEC ID NO: 20) . Las bases 1-235 del DST IMX40 (SEC ID NO: 7) se alinean con las bases 1565-1669 de esta secuencia. El producto de anclaje PCR tiene un potencial de 155 aa ORF de las bases 185-650. Una traducción de la SEC ID NO: 7 se da en la SEC ID NO: 30. Este ORF no tiene características reconocibles, porciones u homologías de bases de datos. Ejemplo 8: Caracterización Adicional de Moléculas de Acido Nucleico IMX42 y Polipéptidos Diversos esfuerzos para tamizar las colecciones utilizando DST IMX42 (SEC ID NO: 8) así como el PCR de anclaje y RACE no han producido un clon con una secuencia más larga. La comparación BLAST en contra del imxhutdb extendió la secuencia aproximadamente de 200 bases a 592 bases. Sin embargo, la extensión de la secuencia no incrementó algunos acoplamientos de bases de datos encontrados por comparación con la secuencia DST IMX42. El contiguo tiene un potencial ORF de 134 aminoácidos los cuales, a la vez que una extensión terminal COOH de la SEC ID NO. 31, puede ser una secuencia parcial. Ejemplo 9: Caracterización Adicional de Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX44 Los polinucleótidos más largos que corresponden al DST IMX44 han sido identificados (SEC ID NO:21, 22). Se encuentra un polipéptido traducido en la SEC ID NO: 32. Una forma soluble Fc del polipéptido IMX44 se sintetizó y usó en diversos ensayos. El Fc IMX44 no tuvo efecto en la función de barrera T84 en ausencia o presencia del IFN-gamma. El Fc IMX44 no tuvo efecto en la activación natural de células de exterminio (NK) . El IMX44-FC no tuvo aciertos positivos en los ensayos de tamizado de los similares. También se produjo un FLAG poliHis soluble. No se encontró actividad en los ensayos de activación celular ni alguna alteración en la producción de citocinas utilizando este polipéptido en ensayos. La expresión del IMX44 en diversos modelos de murina de inflamación de los intestinos, se determinó por los análisis de arreglo y Northern. Se encontró poca o ninguna regulación del transcripto en ileitis inducida por anti-CD3 en ratones C57BL/6, colitis inducida por DSS en ratones BALB/c o ratones C57BL/6, el jndrl en ratones no transgénicos con colitis y células LN T estimuladas por I FN gamma. Ejemplo 10: Caracterización Adicional de Moléculas de Acido Nucleico y Polipéptidos IMX56 Un polipéptido traducido IMX56 se encuentra en la SEC ID NO: 33. La comparación de la secuencia DST del IMX56 con los clones del consorcio IMAGE, extendieron la secuencia (SEC ID NO: 23) que fue 3' en el PAC formado en secuencia con el extremo descrito del ApoL humano. El PCR de anclaje usando una colección T84 produjo los resultados que indicaron que el IMX56 DST se deriva de un UTR 3' alterno del ApoL. Ejemplo 11: Anticuerpos Monoclonales que se Enlazan a los Polipéptidos IMX Los anticuerpos monoclonales que se enlazan a los polipéptidos de la invención, se pueden preparar por métodos bien conocidos en el arte. Los inmunógenos apropiados que se pueden emplear al generar tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos purificados IMX o un fragmento inmunogénico del mismo tal como el dominio extracelular o proteínas de fusión que contienen polipéptidos IMX (por ejemplo, un polipéptido soluble IMX 21/proteina de fusión Fc).

Los polipéptidos purificados IMX de la invención, se pueden usar para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con los mismos, usando técnicas convencionales tales como aquellas descritas en la Patente Americana 4,411,993. Brevemente, los ratones se inmunizan con el inmunógeno de polipéptido IMX emulsificado en un adyuvante completo de Freund, y se inyectan en cantidades que van desde 10-100 mg subcutánea o intraperitonealmente. De diez a doce dias después, los ' animales inmunizados se disparan con inmunógeno de polipéptido IMX emulsificado adicional en un adyuvante incompleto de Freund. Los ratones se disparan periódicamente de ahi en adelante en una programación de inmunización semanal o bisemanal. Se toman periódicamente muestras de suero por sangrado retro orbital o por escisión en la punta de la cola para probar anticuerpos de polipéptidos anti-IMX por ensayo de coagulación de puntos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o la inhibición de interacciones de agente de enlace/polipépt ido IMX. Después de la detección de un titulador de anticuerpos apropiados, a los animales positivos se les suministra una última inyección intravenosa del inmunógeno del polipéptido IMX en solución salina. De tres a cuatro días después, se sacrifican los animales, se recolectan las células del bazo, y las células del bazo se funden a una línea de célula de mieloma de murina, por ejemplo, NS1 o preferiblemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) . Las fusiones generan células de hibridoma, las cuales se colocan en placas múltiples de microtitulación en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fundidas, híbridos de mieloma, e híbridos de células del bazo. Las células de hibridoma se tamizan por ELISA para su reactividad en contra del polipéptido purificado IMX de interés por adaptaciones de las técnicas descritas en Engvall y colaboradores, Imm un o ch em . 8:871, 1971 y en la Patente Americana 4,703,004. Una técnica preferida de tamizado es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckman y colaboradores, ( J. Imm un ol . 144:4212, 1990) . Las células positivas de hibridoma se pueden inyectar intraperitonealmente dentro de ratones singénicos BALB/c para producir ascitos que contienen altas concentraciones de anticuerpos monoclonales de polipéptidos anti-IMX. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer i n vi t ro en matraces o en botellas cilindricas por diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitos de ratón se pueden purificar por precipitación con sulfato de amonio, seguida por cromatografia de exclusión de gel. Alternativamente, también se puede usar la cromatografía de afinidad con base en el enlace del anticuerpo a la proteina A o la proteina G, como también la cromatografia de afinidad basada en el enlace al polipéptido IMX de interés. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico IMX o fragmentos de las mismas se pueden expresar para producir polipéptidos IMX o fragmentos de los mismos que se pueden usar para hacer anticuerpos que son útiles para identificar los polipéptidos correspondientes en técnicas tales como el manchado Western, inmunocitoquímica , y ensayos ELISA usando las técnicas estándar tales como aquellas descritas en la Patente U.S. No. 4,900,811, que se incorpora aquí como referencia. Las referencias aquí mencionadas se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, -el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucleótido elegido del grupo que consiste de SEC ID NO:l, SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, SEC ID NO:14, SEC ID NO:15, SEC ID NO:16, SEC ID NO:17, SEC ID NO:18, SEC ID NO:20, SEC ID NO:21 y SEC ID NO:23.
2. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un polinucleótido mostrado en la SEC ID NO: 1
3. Un polipéptido aislado, caracterizado porque se escoge del grupo que consiste de SEC ID NO:24, SEC ID NO:25, SEC ID NO:26, SEC ID NO:27, SEC ID NO:28, SEC ID NO:29, SEC ID NO:30, SEC ID NO:31, SEC ID NO:32 y SEC ID NO:33.
4. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende un polipéptido mostrado en la SEC ID NO: 24.
5. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque comprende un polinucléotido al menos 95% idéntico a la molécula aislada de ácido nucleico de la rei indicación 1.
6. Una molécula aislada de ácido nucleico con al menos diez bases de longitud, caracteri ada porque se puede hibridizar con la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 bajo condiciones rigurosas.
7. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica al polipéptido de la reivindicación 3.
8. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un fragmento del polipéptido de la reivindicación 3.
9. Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque codifica un epítope de polipéptido del polipéptido de la reivindicación 3.
10. El polipéptido de la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad biológica.
11. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica un homólogo de especie del polipéptido de la reivindicación 3.
12. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótido comprende eliminaciones secuenciales de nucleótidos desde ya sea el extremo 5' o el extremo 3' .
13. Un vector recombinante caracterizado porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.
14. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque comprende la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1.
15. Un método para la elaboración de una célula huésped recombinante de la reivindicación 14, caracterizada porque comprende la transformación de una célula huésped con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
16. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende secuencias de vector .
17. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende eliminaciones secuenciales de amino ácidos de la terminación C o de la' terminación N.
18. Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente al polipéptido aislado de la reivindicación 3.
19. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
20. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
21. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque expresa el polipéptido aislado de la reivindicación 3.
22. Un polipéptido aislado, caracterizado porque se produce por las etapas de: (a) cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 14, bajo condiciones tales que se exprese el polipéptido; y (b) aislar el polipéptido
23. Un método para evitar, tratar, modular, o aminorar una condición médica, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto mamífero, de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de la reivindicación 3 o del polinucleótido de la reivindicación 1.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la condición médica es una enfermedad inflamatoria del vientre.
25. Un método para evitar, tratar, modular, o aminorar una condición médica, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto mamífero de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la rei indicación 18.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la condición médica es una enfermedad inflamatoria del vientre .
27. Un método para el diagnóstico de una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en un sujeto, caracterizado porque comprende: (a) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de la reivindicación 1; y (b) diagnosticar una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica con base en la presencia o ausencia de la mutación .
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la condición patológica es una enfermedad inflamatoria del vientre.
29. Un método para el diagnóstico de una condición patológica o una susceptibilidad a una condición patológica en un sujeto que comprende detectar una alteración en la expresión del polipéptido de la reivindicación 3, caracterizado porque la presencia de la alteración en la expresión del polipéptido, es indicativa de la condición patológica o de la susceptibilidad a la condición patológica.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la alteración en la expresión, es un incremento en la cantidad de expresión o una disminución en la cantidad de expresión.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la condición patológica es una enfermedad inflamatoria del vientre.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, en donde el método comprende además las etapas de: obtener una primera muestra biológica a partir de un paciente que se sospecha que tiene enfermedad inflamatoria del vientre y obtener una segunda muestra de una fuente de control apropiada comparable; (a) determinar la cantidad de al menos un polipéptido codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1 en la primera y segunda muestra; y (b) comparar la cantidad del polipéptido en la primera y segunda muestras; caracterizado porque un paciente se diagnostica que tiene enfermedad inflamatoria del vientre, si la cantidad de polipéptido en la primera muestra es mayor a o menor que la cantidad de polipéptido en la segunda muestra.
33. El uso del polinucleótido de la reivindicación 1 o el polipéptido de la reivindicación 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del vientre.
34. El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, para la fabricación de una medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del vientre.
35. Un método para la identificación de un agente de enlace al polipéptido de la reivindicación 3, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto al polipéptido de la reivindicación 3 con un agente de enlace; y (b) determinar si el agente de enlace afecta una actividad del polipéptido.
36. El gen correspondiente a la secuencia de cADN del ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.
37. Un método para la identificación de la actividad de un polipéptido expresado en un ensayo biológico, caracterizado porque el método comprende : (a) expresión del polipéptido de la reivindicación 3 en una célula; (b) aislamiento del polipéptido expresado; (c) prueba del polipéptido expresado por actividad en un ensayo biológico; y (d) identificación de la actividad del polipéptido expresado con base en los resultados de prueba .
38. Una molécula aislada de ADN substancialmente pura, apropiada para usarse como una sonda para genes regulados en enfermedades inflamatorias del vientre, escogido del grupo que consiste de las moléculas de ADN identificadas en la Tabla 1, que tienen una secuencia parcial de nucleótidos 5' y una longitud como se describe por su dirección digital, y que tiene un patrón de regulación característico en la enfermedad inflamatoria del vientre.
39. Un estuche para detectar la presencia del polipéptido de la reivindicación 3 en una muestra de tejido mamífero, caracterizado porque comprende un primer anticuerpo que reacciona de forma inmune con una proteina de mamífero codificada por un gen que corresponde al polinucleótido de la reivindicación 1 o con un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 3 en una cantidad suficiente para al menos un ensayo y el material apropiado de empaque.
40. El estuche de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque comprende además un segundo anticuerpo que se enlaza al primer anticuerpo.
41. El estuche de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el segundo anti cuerpo está etiquetado.
42. El estuche de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la etiqueta comprende enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimoluminiscentes , compuestos fosforescentes o compuestos bioluminiscentes.
43. Un estuche para detectar la presencia de genes que codifican una proteina que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que tiene al menos 10 bases contiguas, en una cantidad suficiente para al menos un ensayo, y material apropiado de empaque.
44. Un método para la detección de la presencia de un ácido nucleico que codifica una proteína en una muestra de tejido e mamíferos, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) hibridizar un polinucleótido de la reivindicación 1 o un fragmento del mismo que tiene al menos 10 bases contiguas, con el ácido nucleico de la muestra; y (b) detectar la presencia del producto de hibridización.