KR101314478B1

KR101314478B1 - 오스테오프로테게린 결합 단백질 및 이를 코드하는 핵산

Info

Publication number: KR101314478B1
Application number: KR1019997009492A
Authority: KR
Inventors: 보일윌리엄제이
Original assignee: 암젠 인크
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2014-01-17
Also published as: EP2311955A3; CN103990122A; RS50358B; US20030100488A1; EP2311955A2; KR20120108046A; NO2010022I2; US6316408B1; ME00184B; US7807795B2; RO122495B1; YU50699A; CY1108998T1; KR20010006405A; CA2706609A1; LTC0975754I2; PT975754E; GEP20033002B; CN103990122B; JP2009001566A

Abstract

본 발명은 파골세포에 포함되는 신규한 폴리펩티드, 오스테오프로테게린 결합 단백질을 오스테오프로테게린의 친화성을 기초로하여 확인했다. 또한 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 유사체나 유도체를 암호화하는 핵산 배열, 단백질 제조용 벡터와 숙주 세포, 오스테오프로테게린 결합 단백질의 제조 방법과 결합 검정을 기술하고, 골다공증, 관절염 또는 전이로 인한 골 손실, 칼슘과다 혈증과, 파제트 병과 같은 골질병 치료용 조성물과 방법을 기술한다. 수용체와, 이의 작용물질 및 길항물질을 사용하여 골질병을 치료한다.

Description

오스테오프로테게린 결합 단백질 및 이를 코드하는 핵산{OSTEOPROTEGERIN BINDING PROTEINS AND NUCLEIC ACID ENCODING THE SAME}

본 발명은 파골세포 분화에 관련되어 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 오스테오프로테게린 결합 단백질, 단백질을 코드하는 핵산, 단백질 제조용 숙주 세포 및 발현 벡터 및 결합 검정에 관한 것이다. 또한 골다공증, 관절염으로 인한 골손실, 파제트병 및 칼슘과잉혈증과 같은 골질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 오스테오프로테게린 결합 단백질에 대한 수용체와 이 수용체를 사용하여 골질환을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

생골 조직은 골의 침착 및 흡수 사이에서 동적 평형을 나타낸다. 이러한 과정은 두 세포형 : 골의 유기 기질을 함유하는 분자를 분비하는 조골세포 ; 골 기질의 분해와 골염의 용해를 촉진하는 파골세포에 의하여 최초로 매개된다. 생장하는 골을 갖는 어린 개체에 있어서, 골 침착율이 골 흡수율을 초과하는 반면에, 늙은 개체에서는, 흡수율이 침착율을 초과할 수 있다. 후자 상태에서, 골의 파괴증가는 골질량과 강도를 감소시키고 파손위험 증가와 골절의 치료속도가 느리거나 불완전한 치료를 유도한다.

파골세포는 골수의 조혈 전구체 세포로부터 형성되는 대식세포성 다중유핵세포이다. 성숙한 기능성 파골세포의 생장 및 형성은 잘 알려져 있지 않지만 파골세포는 여러가지 생장-촉진 인자에 노출에 대한 반응에서 단핵세포/대식세포계에 따라 성숙하는 것으로 생각된다. 골수 전구체 세포의 예비파골세포로의 초기 발육은 종양괴사 인자-α (TNF-α), 종양괴사 인자-β(TNF-β), 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6) 및 백혈병 억제인자(LIF)와 같은 가용성 인자에 의하여 매개되는 것이다. 배양에서, 예비파골세포는 첨가된 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)의 존재하에 형성된다. 이러한 인자는 주로 파골세포 발육의 초기 단계에 작용한다. 파골세포 형성의 말기 단계에서 폴리펩티드 인자와의 관련은 광범위하게 보고되지 않았다. 그러나, 부갑상선 호르몬이 파골세포의 형성과 활성을 자극하고 칼시토닌이 더 적은 범위까지 반대 작용을 갖는 것은 보고되었다.

최근, 오스테오프로테게린(OPG)이라는 새로운 폴리펩티드 인자가 생체외 및 생체내에서 파골세포의 형성을 음성적으로 조절한다는 것이 기술되었다(본원에서 참고문헌으로 인용한 공동 소유 및 공동 계류 중인 1995. 12. 22 일자로 제출된 미국 출원 번호 제 08/577,788 호, 1996. 9. 3 일자 로 제출된 제 08/706,945 호 및 1996. 12. 20 일자로 제출된 제 08/771,777 호 및 ; PCT 출원 번호 제 WO 96/26271 호를 참조하라). OPG 는 OPG 폴리펩티드를 발현하는 형질전환 마우스의 골밀도를 극적으로 증가시키고 난소절제된 랫에 투여했을 때 골 손실 범위를 감소시켰다. 생체외 파골세포 형성에서 OPG 활성도 분석은, OPG 가 단핵세포/대식세포 전구체의 생장과 분화를 방해하지는 않으나 단핵세포/대식세포 전구체로부터 파골세포의 분화를 차단하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, OPG 는 파골세포 형성의 범위를 조절하는 특이성을 갖는 것으로 나타났다.

OPG 는 다른 구조 및 기능적 특성을 갖는 두 폴리펩티드 도메인을 포함한다. 전장의 폴리펩티드 중 잔기 22 - 194 에 해당하는 아미노-말단 도메인(N-말단 메티오닌은 잔기 1 로 표시한다)은, 시스테인이 풍부한 도메인 특성의 보존을 통하여 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)군 (특히, TNFR-2)의 다른 구성요소와 상동관계를 나타낸다. 잔기 194 - 401 에 해당하는 카르복시 말단 도메인은 어떠한 공지된 서열과는 현저한 상동성을 갖지 않는다. 많은 다른 TNFR 군의 구성요소와 달리, OPG 는 유일하게 분비되는 단백질을 나타내고 막 결합 형태로 합성되는것 같지는 않다.

파골세포 형성의 음성 조절자로서 이의 활성도를 기초로 하여 OPG 는 파골세포 분화에 관련되어 있는 폴리펩티드 요소에 결합함으로써 성숙한 파골세포의 형성을 유도하는 하나 또는 그 이상의 말단 단계를 차단한다.

그러므로 본 발명의 목적은 OPG 와 상호작용하는 폴리펩티드를 확인하는데 있다. 이 폴리펩티드는 파골세포 성숙의 역할을 하고 골질환 치료에 유용하다.

발명의 요약

종양 괴사 인자 군의 새로운 구성요소는 친화성 프로브로서 재조합 OPG-Fc 융합 단백질을 사용하여 선별한 COS 세포에서 발현되는 마우스 cDNA 라이브러리에서 확인하였다. 새로운 폴리펩티드는 316 개의 아미노산 길이인 것으로 예측되는 트랜스멤브레인 OPG 결합 단백질이고, 아미노의 말단 세포질 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 카르복시 말단의 세포외 도메인을 갖는다. 본 발명의 OPG 결합 단백질은 막-결합 형태이거나 용해된 형태이다.

본 발명은 OPG 결합 단백질을 코드하는 핵산, 폴리펩티드를 발현하는 벡터와 숙주 세포 및 재조합 OPG 결합 단백질의 제조방법을 제공한다. 또한 OPG 결합 단백질에 특이하게 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

OPG 결합 단백질은 생물학적 시료에서 OPG 수준을 정량하고, OPG 결합 단백질을 나타내는 세포와 조직을 확인하며 새로운 OPG 및 OPG 결합 단백질 군의 구성요소를 확인하는 검정에 사용할 것이다. OPG 결합 단백질과 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법 또한 제공한다. 이러한 화합물에는 핵산, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 저분자량의 유기 분자가 있으며, 이는 OPG 결합 단백질 활성의 작동물질 또는 길항물질로서 작용할 것이다.

OPG 결합 단백질은 파골세포 분화에 관련되어 있고 파골세포 활성도의 수준은 차례로 골흡수를 조정한다. OPG 결합 단백질 작동물질과 길항물질은 파골세포 형성과 골흡수를 조정하고, 골다공증, 칼슘과잉혈증, 관절염 전이로 인한 골손실, 부동화 또는 치근질환, 파제트병, 골화석증, 보철 분해 등과 같은 골흡수 변환으로 특징되는 골 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한 OPG 결합 단백질 및 OPG 결합 단백질 작동물질 및 길항물질을 함유하는 약학적 조성물도 본 발명에 포함된다.

또한 OPG 결합 단백질의 수용체는 형광표지한 OPG 결합 단백질에 결합하는 골수 세포로부터 구성된 마우스 cDNA 라이브러리에서 확인하였다. 골질환을 치료하는데 사용되는 수용체와 상호작용하는 OPG 결합 단백질의 작동물질과 길항물질을 확인하는데 사용될 것이다.

도 1. OPG 결합 단백질을 코드하는 32D-F3 삽입물의 구조와 서열. 예상되는 트랜스멤브레인 도메인과 아스파라긴-결합 탄수화물 쇄 부위는 밑줄을 그었다.

도 2. pcDNA/32D-F3 으로 트랜스펙션된 COS-7 세포에서 OPG 결합 단백질 발현. 세포는 pcDNA/32D-F3 DNA 로 리포펙션되고, 염소 항-인체 IgG1 알카리성 포스파타제 접합체(이차 단독), 인체 OPG[22 - 201]-Fc 플러스 이차(OPG-Fc) 또는 키메라 ATAR 세포외 도메인-Fc 융합 단백질(sATAR-Fc)에 결합하는 것으로 검정된다. ATAR 은 TNFR 상과의 새로운 구성요소이고, sATAR-Fc 융합 단백질은 32D 세포 표면 분자에 결합하는, 인체 IgG1 Fc 도메인 결합과 TNFR 속 관련 단백질의 대조군으로서 작용한다.

도 3. 인체 조직에서 OPG 결합 단백질의 발현. 방사성표지한 32D-F3 유도 혼성 프로브를 사용하여 인체 조직 mRNA(클론테크에서 입수)를 노던 블롯 분석한다. 상대 분자량은 킬로염기쌍(Kb)에서 좌측에 나타난다. 우측 화살표는 림프절 mRNA 에서 검출된 약 2.5 Kb 전사물의 이동을 나타낸다. 또한 동일한 질량의 매우 엷은 띠가 태아 간에서 검출된다.

도 4. 인체 OPG 결합 단백질을 코드하는 pcDNA/huOPGbp 1.1 삽입물의 구조와 서열. 예상되는 트랜스멤브레인 도메인 및 아스파라긴-결합 탄수화물 쇄의 부위는 밑줄을 그었다.

도 5. 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]로 처리된 골수 대식세포와 ST2 세포 공동배양물에서 나온 생체외 파골세포 발육의 자극. 배양물을 1.6 ~ 500 ng/㎖ 범위의 마우스 OPG 결합 단백질의 다양한 농도로 처리했다. 8 - 10 일후, 배양물은 용해되었고, TRAP 활성도는 가용 검정으로 측정했다. 더불어, 몇몇 배양물은 1, 10, 100, 500 및 1000 ng/㎖ 의 재조합 마우스 OPG[22 - 401]-Fc 단백질로 동시에 처리한다. 마우스 OPG 결합 단백질은 파골세포 형성에서 투여량-의존 자극을 유도하는 반면에, OPG[22-401]-Fc 는 파골세포 형성을 억제한다.

도 6. M-CSF 및 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 존재하에 골수 전구체에서 나온 파골세포 발육의 자극. 마우스 골수를 수집하여, 250, 500, 1000 및 2000 u/㎖ 의 M-CSF 의 존재하에 배양했다. 1.6 ~ 500 ng/㎖ 의 다양한 농도의 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 동일한 배양물에 첨가했다. 파골세포 발육은 TRAR 가용 검정에 의하여 측정했다.

도 7. 생체외의 M-CSF 와 OPG 결합 단백질[158 - 316] 흡수골의 존재하에 골수세포에서 유도된 파골세포. M-CSF, OPG 결합 단백질 또는 조합된 두 인자로 처리한 골수세포를 배양 웰에서 골 박편상에 평판하고, 성숙한 파골세포로 발육시킨다. 생성된 배양물을 톨루이딘 블루(좌측컬럼)로 또는 조직화학적으로 염색하여 TRAP 효소 활성(우측 컬럼)을 검출한다. 두 인자를 받은 배양물에서, 골 표면에 청색으로 염색된 막공의 존재에 의하여 판단되는 골을 침식할 수 있는 성숙한 파골세포를 형성했다. 이것은 다수의 큰 다핵, TRAP 양성세포와 연관된다.

도 8. 첫번째 주사를 한후 51 시간에 OPG 결합 단백질을 주사한 마우스에서와 OPG 투여를 동시에 받은 마우스에서 전체 혈액 이온화 칼슘(i Ca)수준을 나타내는 그래프. OPG 결합 단백질은 상당하게 투여량에 의존하여 iCa 수준을 증가시켰다. OPG (1 ㎎/㎏/일)은 5 ㎍/일의 OPG 결합 단백질의 투여량으로 iCa 의 증가를 완전히 차단했고, 25 ㎍/일의 OPG 결합 단백질의 투여량으로 증가를 부분적으로 차단했다. (★)는 부형제 처리 대조군과 다른것(P<0.05). (#)는 오직 OPG 결합 단백질의 투여량을 받은 마우스의 수준과 현저히 다른 OPG 처리 iCa 수준(P<0.05).

도 9. 3.5 일 동안 0, 5, 25 또는 100 ㎍/일의 OPG 결합 단백질로 처리한 마우스의 좌측 대퇴골과 경골의 방사선그래프. 이는 이들 마우스의 근위 경골 골단중절에서 가장 분명하게 나타난 골밀도의 투여량 의존 감소를 뜻하고, 여기서는 100 ㎍/일의 투여량으로 충분하다.

도 10. 마우스 ODAR cDNA 서열과 단백질 서열. ~2.1 Kb cDNA 클론의 핵산 서열을 나타내고, 상술한 625 개 잔기의 긴 오픈리딩프레임의 번역을 나타낸다. 소수성 신호 펩티드는 밑줄을 그었고, 소수성 트랜스멤브레인 서열(잔기 214 - 234)은 굵은 글씨로 표시했다. 세포외 도메인에서 시스테인 - 풍부 반복 모티프를 갖는 시스테인 잔기는 굵은 글씨로 표시했다.

도 11. 세포에 트랜스펙션된 OPG 결합 단백질에 결합하는 ODAR-Fc 의 면역형광 염색. OPG 결합 단백질 발현 플라스미드로 트랜스펙션된 COS - 7 세포를 인체 IgG Fc(도 11A), ODAR-Fc(도 11B) 또는 OPG-Fc(도 11C)와 함께 배양했다. FITC-표지 염소 항-인체 IgG Fc 항체를 이차 항체로 사용했다. 양성 결합 세포는 공초점 현미경으로 검사했다.

도 12. 생체외 마우스 골수에서 파골세포 발생에 관한 ODAR-Fc 의 효과. 마우스 골수 배양물은 실시예 8 에서와 같이 확립하고, OPG 결합 단백질(5 ng/㎖) 및 CSF-1(30 ng/㎖)에 노출시킨다. 1500 ng/㎖ 내지 65 ng/㎖ 의 다양한 농도의 ODAR-Fc 를 첨가한다. 파골세포의 형성은 5 일후 배양물에서 TRAP 용액 검정과 TRAP 세포화학으로 평가한다.

도 13. 다양한 투여량의 ODAR-Fc 로 4 일 동안 처리한 후 마우스에서의 골 무기질 밀도. 마우스에 일일 피하주사로 인산염완충식염수 부형제에 용해된 ODAR-Fc 를 투여했다. 무기질 밀도는 주변 정량 컴퓨터 단층찰영법(pQCT0)(XCT - 960 M, 위스콘신 에프티 아트킨선에 소재하는 놀랜드 메디컬 시스템스에서 입수)에 의하여 근위 경골 골단중절 마우스의 70 % EtOH 로 고정된 골에서 측정한다. 경골의 근위 말단부에서 골의 두 0.5 ㎜ 단면, 1.5 ㎜ 와 2.0 ㎜ 를 분석하여(XMICE 5.2, 독일에 소재하는 스트라테크에서 입수) 골단중절에서 전체 골 무기질 밀도를 측정한다. 1500 의 연조직 분리 역치를 사용하여 골단중절 골의 한계선을 정의한다. ODAR-Fc 는 투여량 의존 방법으로 근위 경골 골단중절에서 골 무기질 밀도의 현저한 증가를 나타냈다. 그룹 n=4.

삭제

본 발명은 OPG 와 특이하게 결합하고 파골세포 분화와 관련되어 있는 OPG 결합 단백질이라 칭하는 폴리펩티드를 제공한다. 마우스 형태의 폴리펩티드를 코드하는 cDNA 클론은 마우스 골수단구성 세포주 32 - D 로부터 제조한 라이브러리에서 확인한 다음 COS 세포에 트랜스펙션한다. 트랜스펙탄트를 그들의 OPG[22-201]-Fc 융합 폴리펩티드에 결합하는 능력에 대해 스크리닝한다(실시예 1). 핵산 서열은 OPG 결합 단백질이 TNF 군의 새로운 구성요소이고 1996. 6. 7 일자로 제출된 공동 소유되고 공동 계류 중인 미국 특허 출원 번호 제 08/660,562 호에 이미 기재되어 있는 폴리펩티드, AGP-1 에 가장 밀접하게 관련되어 있다는 것을 나타낸다[AGP-1 으로 확인되고 TRAIL 로 표시되는 폴리펩티드는 Willey 등의 Immunity 673 - 682 (1995)에 기재했다]. OPG 결합 단백질은 아미노 말단에서 세포질 도메인, 트랜스멤브레인 도메인과 카르복시 말단 세포외 도메인(도 1)을 갖는 제 Ⅱ 형 트랜스멤브레인 단백질인 것으로 예상된다. 아미노 말단 세포질 도메인은 도 1 에 도시된 잔기 1 - 48 에 해당하고 트랜스멤브레인 도메인은 도 1 에 도시된 잔기 49 - 69 에 해당하며 세포외 도메인은 도 1 에 도시된 잔기 70 - 316 에 해당한다(SEQ ID NO : 2). 막-결합 단백질은 OPG(도 2)에 특이하게 결합한다. 따라서 OPG 결합 단백질과 OPG 는 다른 OPG 결합 단백질의 자연-발생 수용체가 존재할 가능성이 있어도 수용체-리간드 쌍의 많은 특성을 공유한다.

인체 OPG 결합 단백질을 코드하는 DNA 클론은 림프절 cDNA 라이브러리에서 분리한다. 인체 서열(도 4)은 마우스 서열과 동일하다. 정제된 가용성 마우스 OPG 결합 단백질은 생체외의 파골세포 형성을 자극하고 생체내 칼슘과잉혈증과 골흡수를 유도한다.

OPG 결합 단백질은 포유동물 OPG 결합 단백질 또는 이의 단편, 유사체나 유도체의 아미노산 서열을 갖고 최소한의 결합 OPG 활성을 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 바람직한 실시형태에서, OPG 결합 단백질은 마우스 또는 인체에서 유래한 것이다. 다른 실시형태에서, OPG 결합 단백질은 한가지 형태로, 세포질 및 트랜스멤브레인 도메인에서 분리한 세포외 도메인을 갖는 가용성 단백질이다. OPG 결합 단백질은 파골 세포 분화와 골흡수 속도 및 범위에 관련되어 있고, 파골세포 형성을 자극하고 골흡수를 자극한다는 것을 알았다.

핵산

본 발명은 OPG 결합 단백질을 코드하는 분리된 핵산을 제공한다. 본원에 사용된, 핵산이란 용어는 cDNA, 게놈 DNA, 전체 또는 부분합성 DNA 및 RNA 을 뜻한다. 본 발명의 핵산은 다음 그룹 중에서 선택한다 :

a) 도 1 (SEQ ID NO : 1) 및 도 4 (SEQ ID NO : 3)에 표시된 핵산 ;

b) 도 1 (SEQ ID NO : 1) 및 도 4 (SEQ ID NO : 3)에 표시된 핵산의 폴리펩티드를 코드하는 영역에 혼성화하고 ; 매우 엄격한 조건하에서 핵산과 혼성화 상태를 유지하는 핵산 ; 및

c) (a) 또는 (b)의 핵산에 대해 변성적인 핵산.

핵산 혼성은 대표적으로 제일 혼성 단계에서 단선으로부터 핵산 이중분자를 형성시킨 다음, 더 엄격한 조건하에서 원하는 상동성을 갖는 핵산 이중분자를 선택적으로 보유하는 제이 혼성 단계로 이루어진 다-단계 공정과 관련되어 있다. 제일 혼성 단계의 조건은 이들이 제이 혼성 단계보다 더 크게 엄중하지 않으면, 일반적으로 중요하지 않다. 일반적으로, 제이 혼성은 고도의 엄격한 조건하에서 수행되며, 여기서 "고도의 엄격한" 조건이란 도 1 (SEQ. ID. NO : 2)과 도 4 (SEQ ID NO : 4)에 해당하는 상보적 가닥의 부분 또는 전부의 완전한 혼성체의 융점(Tm) 이하인 약 12 - 20 ℃ 의 온도와 염의 조건을 뜻한다. 한 실시형태에서, "고도의 엄격한" 조건이란 약 65 ℃ 및 약 1 M 이하의 Na⁺ 의 조건을 뜻한다. 염 농도, 배양의 온도 및/또는 길이는 본 발명에 따른 혼성 핵산 분자를 얻기 위하여 제일 또는 제이 혼성 단계에서 달라질 수 있음이 이해된다. 핵산 혼성과 핵산 혼성체의 Tm 계산의 조건은 Sambrook 등의 MolecularCloning : A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)에 기재되어 있다.

본 발명의 핵산은 도 1 (SEQ ID NO : 2)과 도 4 (SEQ ID NO : 4)에 표시된 OPG 결합 단백질의 폴리펩티드 코딩 영역의 부분 또는 전부를 혼성화할 수 있으며 ; 그러므로 여기에 표시된 핵산 서열을 단절 또는 연장할 수 있다. 단절 또는 연장된 핵산은 이들이 최소한 결합 OPG 성질을 보유한다는 점에서 본 발명에 포함된다. 한 실시형태에서, 핵산은 최소한 약 10 개의 아미노산의 폴리펩티드를 코드한다. 다른 실시형태에서, 핵산은 최소한 약 20 개의 아미노산의 폴리펩티드를 코드한다. 또 다른 실시형태에서 핵산은 최소한 약 50 개의 아미노산의 폴리펩티드를 코드한다. 또한 혼성 핵산은 OPG 결합 단백질 코딩 영역의 5' 및/또는 3' 에 위치하는 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 비코딩 서열에는 프로모터, 인핸서 영역, 번역 개시 부위, 전사 말단 부위 등과 같은 OPG 결합 단백질의 발현에 관련되는 조절 영역을 포함한다.

바람직한 실시형태로, 본 발명의 핵산은 마우스 또는 인체 OPG 결합 단백질을 코드한다. 핵산은 기능적 트랜스멤브레인 영역이 부족한 OPG 결합 단백질의 막 결합 형태 또는 가용 형태를 코드할 수 있다. 마우스 OPG 결합 단백질의 예상되는 트랜스멤브레인 영역에는 도 1 (SEQ ID NO : 1)에 표시된 아미노산 잔기 49 - 69 을 포함한다. 인체 OPG 결합 단백질의 예상되는 트랜스멤브레인 영역에는 도 4 (SEQ ID NO : 3)에 표시된 잔기 49 - 69 가 있다. 이 영역에서 소수성 아미노산 잔기를 중성 또는 친수성 아미노산 잔기로 대치한 치환기는 막 결합을 분열시키고 가용성 OPG 결합 단백질을 일으킬 것으로 기대된다. 더불어, 트랜스멤브레인 영역의 부분 또는 전부의 결실은 OPG 결합 단백질의 가용 형태를 생성시킬 것으로 기대된다. 도 1 (SEQ ID NO : 1)에 표시된 아미노산 잔기 70 ~ 316 또는 이의 단편 및 유사체를 코드하는 핵산은 가용성 OPG 결합 단백질과 관련되어 있다.

또한 단절 형태의 가용성 인체 OPG 결합 단백질을 코드하는 핵산도 관련되어 있다. 가용성 형태는 도 4 (SEQ ID NO : 3)에 표시된 잔기 69 - 317 및 이의 단절이 관련되어 있다. 한 실시형태에서, N-말단 단절은 잔기 70 - 317, 71 - 317, 72 - 317 등에서 폴리펩티드를 발생시킨다. 다른 실시형태에서, 핵산은 잔기 69 - 317 및 이의 N-말단 단절을 OPGbp [158 - 317]까지 또는 OPGbp [166 - 317]까지로 함유하는 가용성 OPGbp 를 코드한다.

인체 OPG 결합 단백질을 코드하는 플라스미드 phuOPGbp 1.1 을 함유하는 E. coli 균주 DH10 은 1997. 6. 13 일자로 매릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 제 98457 호로 기탁하였다.

본 발명의 핵산 서열은 생물학적 시료에서 OPG 결합 단백질을 코드하는 서열을 검출하는데 사용한다. 특히 서열을 사용하여 관련된 OPG 결합 단백질 서열에 관한, 특히 다른 종의 cDNA 와 게놈 라이브러리를 선별한다. 또한 핵산은 항-민감성방법 또는 생체내 유전자 발현에 의한 OPG 결합 단백질의 수준을 조정하는데 유용하다. OPG 결합 단백질을 발현하는 형질전환 동물의 발육은 폴리펩티드의 제조와 생체내 생물학적 활성도을 연구하는데 유용하다.

벡터와 숙주 세포

본 발명의 핵산은 DNA 서열과 결합하여 생물학적으로 활성 OPG 결합 단백질을 발현한다. 발현에 요구되는 서열은 본 분야의 숙련자들에게 알려져 있고 RNA 합성의 개시용 프로모터와 증폭제 서열, 전사 말단부위, 단백질 합성 개시용 리보솜 결합부위와 분비용 선도서열이 있다. OPG 결합 단백질의 발현과 분비를 선도하는 서열은 동일하며, 즉 서열은 OPG 결합 단백질 발현과 분비에 관련되어 있는 게놈에서 이들 서열과 동일하거나 유사하며, 또는 이들은 이종일 수 있다. 여러가지 플라스미드 벡터는 숙주 세포에서 OPG 결합 단백질을 발현하는데 이용할 수 있다(예를 들어, Methods in Enzymology V. 185, Goeddel, D. V. ed. Academic Press(1990)를 참조하라). 포유동물 숙주 세포의 발현에 있어서, 바람직한 실시형태에서 PCT 출원번호 제 90/14363 호에 기재된 플라스미드 pDSRα 를 사용한다. 박테리아 숙주 세포의 발현에 있어서, 바람직한 실시형태에서 룩스(lux) 프로모터를 함유하는 플라스미드를 사용한다(본원에서 참고문헌으로 인용한 1995, 12, 22 일자로 제출된 공동 소유 및 공동 계류 중인 미국 특허 출원 번호 제 08/557,778 호를 참조하라). 더불어, 벡터는 형질전환 동물에서 OPG 결합 단백질의 조직-특이성 발현에 이용할 수 있다. 또한 레트로바이러스 및 아데노바이러스-기저 유전자 전이 벡터도 생체내 치료를 위한 인체 세포의 OPG 결합 단백질을 발현하는데 사용할 수 있다(본원에서 참고문헌으로 인용한, PCT 출원 번호 제 86/00922 호를 참조하라).

또한 OPG 결합 단백질을 발현하는 원핵 및 진핵 숙주 세포는 본 발명에 의하여 제공된다. 숙주 세포에는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포가 관련되어 있다. OPG 결합 단백질은 마우스 또는 염소와 같은 형질전환 동물에서 생성될 수 있다. 본 발명의 핵산을 함유하는 플라스미드와 벡터는 본 분야의 숙련자들에게 알려져 있는 트랜스펙션 또는 형질전환 방법을 사용하여 적당한 숙주 세포에 주입한다. 숙주 세포는 도 1 에 도시된 OPG 결합 단백질 또는 세포외 도메인 또는 세포질 도메인과 같은 이의 부분을 코드하는 DNA 서열을 함유한다. OPG 결합 단백질을 코드하는 핵산은 주어진 숙주로 최적의 발현을 하도록 하는 코돈의 치환에 의하여 수정될 수 있다. 최소한 몇몇 코돈은 아미노산 서열을 변경시키지 않고 높게 발현되는 유전자에서 자주 발견되는 바람직한 코돈으로 불리운다. 그러나, 발현을 최적화하는 코돈 변경은 바람직한 코돈의 주입에 한정되는 것은 아님을 이해할 수 있다. OPG 결합 단백질 발현을 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포의 예를들면 COS, CHOd-, 293 과 3T3 세포가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 박테리아 숙주 세포에는 E. coli 가 있다.

폴리펩티드

또한 본 발명은 외인성 DNA 서열의 원핵세포 또는 진핵세포 발현의 산물로서 OPG 결합 단백질을 제공하고, 즉 OPG 결합 단백질은 재조합 OPG 결합 단백질이다. 외인성 DNA 서열에는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA 서열이 있다. OPG 결합 단백질은 박테리아, 효모, 식물 곤충 또는 포유동물 세포 발현의 산물 또는 비세포 번역계의 산물이다. 박테리아 세포에서 생성된 OPG 결합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다. 또한 본 발명은 OPG 결합 단백질을 코드하는 핵산으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 생장시키고 핵산의 폴리펩티드 발현 산물을 분리하는 OPG 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

포유동물 OPG 결합 단백질 또는 이의 단편, 유사체 또는 유도체인 폴리펩티드는 본 발명에 포함된다. 바람직한 실시형태에서, OPG 결합 단백질은 인체 OPG 결합 단백질이다. OPG 결합 단백질의 단편은 생성한 폴리펩티드가 최소한 결합 OPG 의 성질을 갖도록 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실을 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 이 단편은 아미노 말단 단부, 카르복시 말단 단부와 폴리펩티드의 내부 영역으로부터 비롯되는 결실을 갖는다. OPG 결합 단백질의 단편은 최소한 약 10 개의 아미노산, 최소한 약 20 개의 아미노산 또는 최소한 약 50 개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, OPG 결합 단백질은 트랜스멤브레인 영역(도 1 에 표시된 아미노산 잔기 49 - 69)에서 나온 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 선택적으로 트랜스멤브레인 영역(도 1 에 표시된 아미노산 잔기 1 - 49)까지 및/또는 이를 포함하는 아미노-말단에서 나온 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 갖는다. 다른 실시형태에서, OPG 결합 단백질은 예를 들어, 아미노산 잔기 69 - 316 또는 70 - 316 이나, 이의 N-말단 또는 C-말단 단절 형태를 갖는 가용성 단백질이며, 이는 OPG 결합 활성을 갖는다. 또한 OPG 결합 단백질은 도 4 에 표시된 잔기 67 - 317 와 이의 N-말단 단절 형태, 예를 들어, 70 - 517, 71 - 517, 71 - 317, 72 - 317 등을 함유하는 도 4 에 표시된 인체 가용성 단백질이다. 바람직한 실시형태에서, 가용성 인체 OPG 결합 단백질은 잔기 67 - 317 과 OPGbp[158 - 317]까지 또는 선택적으로 OPG[166 - 317]까지의 이의 N-말단 단절을 갖는다.

OPG 결합 단백질의 유사체는 생성된 폴리펩티드가 최소한의 결합 OPG 성질을 갖도록 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환 또는 부가를 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 이 유사체는 폴리펩티드에 따라 어떠한 위치에서 치환 또는 부가를 갖는다. 바람직한 유사체로는 가용성 OPG 결합 단백질의 유사체가 있다. 단편 또는 유사체는 대립 변이체 또는 mRNA 스플라이싱 변이체의 폴리펩티드 산물과 같이, 자연적으로 발생하거나 또는 이들은 핵산을 조작하고 합성하는 본 분야의 숙련자들이 이용할 수 있는 방법을 사용하여 구성할 수 있다. 폴리펩티드는 아미노 말단 메티오닌 잔기를 갖거나 또는 갖지 않는다.

또한, 본 발명에는 번역후 변이(예를 들어, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 부가, N-말단 또는 C-말단 단부의 처리), 아미노산 골격에 화학적 부분의 부착, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 화학적 변이와 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가를 받은 폴리펩티드인 OPG 결합 단백질의 유도체가 포함된다. 특히, 증가된 안정성, 좀더 긴 주기 시간 또는 감소된 면역원성과 같은 부가적 이점을 제공하는 OPG 결합 단백질의 화학적 변이 유도체가 기대된다. 특별한 용도로는 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체와 같은 수용성 중합체로의 변이가 있다(본원에서 참고문헌으로 인용한 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,179,337 호를 참조하라). 유도하기 위한 화학적 부분은 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 등과 같은 수용성 중합체에서 선택한다. 폴리펩티드는 분자내의 임의 위치 또는 분자내의 예측된 위치에서 변이되고, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 부착된 화학 부분을 포함한다. 또한 폴리펩티드는 아미노 말단에서 또는 폴리펩티드내에서 선택된 리신 또는 아르기닌 잔기에서와 같이 폴리펩티드의 예측된 위치에서 변이될 수 있다. 제공되는 다른 화학적 변이물에는 단백질의 검출과 분리를 위한 효소, 형광, 동위원소 또는 친화성 표지와 같은, 검출성 표지가 있다.

또한, 이종 아미노산 서열에 융합되는 OPG 결합 단백질 아미노산 서열의 부분 또는 전부를 함유하는 OPG 결합 단백질 키메라도 포함한다. 이종 서열은 생성된 융합 단백질이 최소한의 결합 OPG 활성을 보유하도록 하는 서열이다. 바람직한 실시형태에서, OPG 결합 단백질의 카르복시 말단 세포외 도메인을 이종 서열과 융합한다. 이와같은 서열에는 선택적으로 세포내 신호표시 결과를 허용하는 이종 세포질 도메인, IgG 의 Fc 영역과 같은 올리고머화를 촉진하는 서열, 폴리펩티드용 표지를 제공하는 효소 서열과 항원-항체 인지와 같은 친화성 프로브를 제공하는 서열이 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 OPG 결합 단백질을 발현하는 조직과 세포주에서 분리되고 정제되며, 여액에서 또는 조절된 생장 배지에서 추출되고, OPG 결합 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주 세포에서 추출한다. OPG 결합 단백질은 마우스 골수단구성 세포주 32 - D (ATCC 기탁 번호 CRL - 11346)에서 얻는다. 인체 OPG 결합 단백질 또는 동일하게 코드된 핵산은 인체 림프절 또는 태아간 조직에서 분리한다. 분리된 OPG 결합 단백질은 인체 단백질과 다른 세포 성분과의 결합에서 유리한다.

천연급원(예를 들어, 정상적으로 OPG 결합 단백질을 발현하는 조직과 세포주)에서와 트랜스펙션된 숙주 세포에서 OPG 결합 단백질의 정제 방법은 본 발명과 관련되어 있다. 정제 방법은 정제된 단백질을 얻기위하여 적당한 순서의 하나 또는 그 이상의 표준 단백질 정제 단계를 사용한다. 크로마토그래피 단계는 이온 교환, 겔 여과, 소수성 상호작용, 역상, 크로마토포커싱, 항-OPG 결합 단백질 항체 또는 바이오틴-스트렙타비딘 친화성 복합물을 사용하는 친화성 크로마토그래피 등을 포함한다

항체

본 발명의 폴리펩티드와 특이하게 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 항체는 전장 OPG 결합 단백질, 가용 형태의 OPG 결합 단백질 또는 이들의 단편과의 면역에 의하여 생성된다. 본 발명의 항체는 경쇄와 중쇄상의 마우스 불변 영역을 인체 서열로 대치한 키메라 항체 또는 상보성 결정 영역만이 마우스 공급원인 CDR-이식 항체와 같은, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이거나 또는 재조합 항체이다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어, 인체 항체를 생성하는 형질전환 동물의 면역에 의하여 제조되는 인체 항체이다(예를 들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 출원번호 제 WO93/12227 호를 참조하라). 항체는 생물학적 시료에서 OPG 결합 단백질을 검출함으로써, 단백질을 생성하는 세포 또는 조직을 확인하는데 유용하다. 더불어, OPG 결합 단백질에 결합하고 다른 결합 화합물과의 상호작용을 차단하는 항체는 파골세포 분화와 골흡수를 조정하는데 치료적으로 사용한다.

OPG 결합 단백질에 대한 항체는 골다공증과 파제트병과 같은 골질환을 치료하는데 유용하다. 항체는 OPG 부재시 또는 이의 존재하에 OPG 결합 단백질에 결합하는 시험을 행할 수 있고, 리간드(OPG 결합 단백질)매개 파골세포 형성 및/또는 골흡수를 억제하는 이들의 능력을 검사할 수 있다. 또한 펩티드 그자체는 리간드 : 수용체 상호작용의 길항물질로서 작용하고 리간드-매개 파골세포 형성을 억제하고, OPG 결합 단백질의 펩티드는 이러한 목적을 위하여 조사한다.

조성물

또한, 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제와 함께 치료학적 유효량의 OPG 결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 OPG 결합 단백질 작동물질 또는 길항물질을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. "치료학적 유효량" 이란 용어는 투여 방법과 특이한 조건에 대하여 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미한다. 조성물은 액체 또는 동결건조 형태이고 여러가지 pH 값과 이온 강도를 갖는 희석제(트리스, 초산염 또는 인산염 완충제), 트윈 또는 폴리솔베이트와 같은 가용화제, 인체 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알콜과 같은 방부제와, 아스코르브산 또는 메타이아황산 나트륨과 같은 산화방지제를 함유한다. 특수한 조성물의 선택은 치료되는 조건, 투여 방법과 원하는 약물동태학적 파라미터를 포함하여 여러가지 인자에 따라서 선택한다. 약학적 조성물에 적합한 성분을 더 광범위하게 조사하면 Remington's pharmaceutical Sciences, 제 18 판, A. R. Gennaro, ed. 펜실베이니아, 맥, 이스톤(1980)에서 볼 수 있다.

바람직한 실시형태에서는, 가용성 OPG 결합 단백질을 함유하는 조성물을 제공한다. 또한 가용성, 안정성, 플라스마 반감기와 생체이용성을 증가 시키기 위하여 수용성 중합체로 변이시킨 가용성 OPG 결합 단백질을 함유하는 조성물도 포함한다. 또한 조성물에는 연장된 기간 동안 방출을 조절하기 위하여 리포솜, 마이크로에멀션, 미셀 또는 운반체에 가용성 OPG 결합 단백질의 혼입을 포함할 수 있다. 가용성 OPG 결합 단백질은 폐 투여에 적합한 미립자로 제제화한다.

본 발명의 조성물은 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의하여 또는 경구, 코, 폐 또는 직장 투여에 의하여 투여할 수 있다. 최종적으로 선택한 투여 방법은 여러가지 인자에 따르고 본 분야의 숙련자들에 의하여 확인될 수 있다.

또한 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 보조제와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 핵산을 함유하는 약학적 조성물과 관련되어 있다. 핵산 조성물은 항-민감성 치료 섭생의 부분으로 세포와 조직에 OPG 결합 단백질의 코딩 영역 및/또는 플랭킹 영역의 부분 또는 전부를 방출하는데 적합하다

사용방법

OPG 결합 단백질은 OPG 를 검출하고 OPG 와의 상호작용의 특징을 나타내는 여러가지 검정에 사용될 것이다. 일반적으로, 검정은 OPG 가 OPG 결합 단백질에 결합하는 조건하에서 OPG 를 함유하는 생물학적 시료로 OPG 결합 단백질을 배양하고, 결합 범위를 측정하는 것으로 이루어진다. OPG 는 정제된 것이거나 체액 또는 배지에서와 같은 혼합물에 존재한다. 검정은 정성적 또는 정량적인 것으로 나타내고, 후자는 OPG 결합 단백질에 OPG 의 결합 파라미터(친화성 항수 및 동력학)를 측정하고 혼합물에서 생물학적 활성 OPG 의 수준 양을 측정하는데 유용하다. 또한, 검정으로 OPG 결합 단백질의 단편, 유사체 및 유도체에 OPG 결합을 평가하고 새로운 OPG 와 OPG 결합 단백질군의 구성요소를 확인하는데 사용한다.

OPG 의 OPG 결합 단백질에 결합은 세포-기저 결합 검정, 막 결합 검정, 용액-상 검정 및 면역 검정을 포함한 여러가지 형태로 행할 수 있다. 일반적으로, 미량 수준의 표지된 OPG 를 특별한 기간 동안 OPG 결합 단백질 시료로 배양한 다음 여과, 전기화학 발광법(ECL, IGEN 에 의한 ORIGEN 시스템), 세포-기저 또는 면역 검정법에 의하여 결합된 OPG 를 측정한다. 또한 방사능(SPA ; Amersham) 및 시간분해형광법(HTRF, Packcard)은 동종 검정법으로 수행할 수 있다. 결합은 방사능동위원소(125I, 35 S, 3H), 형광염료(플루오레신), 란탄족(Eu3⁺) 칼레이트 또는 크립테이트, 오르비 피리딜-루테늄(Ru2⁺) 복합물로 OPG 또는 항-OPG 항체를 표지하여 검출한다. 표지된 프로브는 사용되는 검출 시스템에 따라 선택한다는 것을 이해할 수 있다. 또한, OPG 는 비표지된 에피토프 태그(예를 들어, 바이오틴, 펩티드, His₆, myc)로 변이되고 상술한 바와같은 검출할 수 있는 표지를 갖는 스트렙타비딘, 항-펩티드 또는 항-단백질 항체와 같은 단백질에 결합된다.

다른 방법으로는, 면역검정으로 OPG 결합 단백질에 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 OPG 결합 단백질을 직접 검정할 수 있다. 상기한 에피토프 태그를 함유하는 다른 형태의 OPG 결합 단백질을 용액과 면역검정법에 사용할 수 있다.

또한 OPG 결합 단백질과 상호 작용하는 화합물을 확인하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 방법은 화합물을 OPG 결합 단백질에 결합 하게하는 조건하에서 화합물로 OPG 결합 단백질을 배양하고 결합 범위를 측정하는 것으로 이루어진다. 화합물은 실질적으로 정제할 수 있고 초기 혼합물에 존재한다. 결합 화합물에는 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 저분자량의 유기 화합물이 있다. 화합물은 이들이 작동물질 또는 길항물질로서 작용하는지 여부를 결정하기 위하여 OPG 결합 단백질 활성도를 증가 또는 감소시키는 이들의 능력에 따라 다른 특징을 나타낼 수 있다.

OPG 결합 단백질은 또한 효모 두-혼성체 스크리닝 과정에 의해 세포질 도메인과 상호 작용하는 세포내 단백질을 입증하는데 유용하다. 예를 들어, 효모 GAL4 - DNA 결합 도메인에 융합되는 OPG 결합 단백질의 N-말단 50 개의 아미노산을 코드하는 DNA 를 함유하는 혼성체 구조는 두-혼성체 유인 플라스미드로 사용한다. 스크리닝으로 나온 양성 클론은 단백질의 상호 작용을 확인하기 위한 추가적인 특징을 나타낸다. 이러한 정보는 OPG 결합 단백질과 결합된 세포내 신호표시 메카니즘을 명료하게하고 골흡수를 조장하는 새로운 약제의 세포내 표적을 제공한다.

OPG 결합 단백질은 과대한 골밀도의 특징을 나타내는 증상을 치료하기 위해 사용한다. 가장 보편적인 증상은 유전자 결함이 골질량 상승을 가져오고 통상 처음 몇 년안에 사망하는 골화석증이 있다. 골화석증은 가용성 OPG 결합 단백질을 투여하여 치료하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 OPG 결합 단백질의 활성조절인자(작동물질과 길항물질) 및 이를 얻는 방법도 포함한다. OPG 결합 단백질 활성조절인자는 OPG 또는 몇몇 다른 상호작용 분자를 결합시키고 또는 파골세포 성장을 조절하는 능력과 같은 OPG 결합 단백질에 결합된 최소한 하나의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 대표적으로, 작동물질 또는 길항물질이 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 저분자량 분자와 같은 보조-인자일 수 있고, 이는 OPG 결합 단백질과 상호작용하여 이의 활성도를 조절한다. 우수한 폴리펩티드 길항물질에는 가용 또는 막-결합 형태의 OPG 결합 단백질과 OPG 결합 단백질의 세포외 도메인의 부분 또는 전부를 함유하는 가용 형태의 OPG 결합 단백질과 반응하는 항체가 있다. OPG 결합 단백질 발현을 조절하는 분자에는 대표적으로 OPG 결합 단백질을 코드하는 핵산에 상보성을 가지며 발현의 안티센스 조절인자로서 작용하는 핵산이 있다.

OPG 결합 단백질은 성숙한 파골세포, 즉 골흡수에 관여하는 주된 세포형의 형성을 조절하는데 관련된다. 골흡수율의 증가(골 형성 그 이상)는 총괄적으로 골감소증이라 칭하는 여러가지 골질환을 유도할 수 있으며, 이것에는 골다공증, 골수염, 칼슘과잉혈증, 외과적 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생하는 골감소증, 파제트병, 골괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화, 보철 분해, 골용해 전이가 있다. 역으로 골 흡수율의 감소는 과도한 골밀도에 의하여 표시되는 증상인 골화석증을 유발할 수 있다. OPG 결합 단백질의 작동물질과 길항물질은 파골세포 형성을 조절하고 골질환으로 고통을 받고 있는 환자에게 투여할 수 있다. 골감소증을 치료하는데 사용되는 OPG 결합 단백질의 작동물질과 길항물질은 단독으로 또는 BMP-1 내지 BMP-12 로 표시되는 골 형태형성인자, 형질변환 생장인자-β 와 TGF-β 군의 구성요소, 섬유아세포 생장인자 FGF-1 내지 FCF-10, 인터루킨-1 저해제, TNFα 저해제, 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스폰산염, 플루오르화물 및 칼슘과 같은 골-증강 무기질을 포함한 치료학적 유효량의 골 생장 촉진제와 조합하여 투여할 수 있다. OPG 결합 단백질의 길항물질은 골감소증을 치료하는데 특히 유용하다.

오스테오프로테게린 결합 단백질용 수용체

또한 본 발명은 OPG 결합 단백질과 상호작용하는 수용체를 제공한다. 특히, 본 발명은 파골세포 분화 및 활성화 수용체(ODAR)를 제공한다. ODAR 은 TNF 수용체 군의 구성요소인 CD40 에서 가장 높은 상동성을 나타내는 트랜스멤브레인 폴리펩티드이다. 마우스 ODAR 및 코드된 폴리펩티드의 핵산 서열은 도 10 에 표시했다. 마우스 ODAR의 인체 동종체는 도 10 의 핵산 서열로 인체 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 혼성 스크리닝하여 쉽게 분리할 수 있다. 인체 ODAR 을 클로닝하는 과정은 인체 OPG 결합 단백질을 클로닝하는 실시예 5 에 기재된 것과 유사하다. 도 10 에 표시된 폴리펩티드의 인체 동종체는 Anderson 등(Nature 390, 175 - 179(1997))에 표시되어 있고 여기서는 RANK 라 칭한다. RANK 는 TNF 수용체 군의 구성요소와 상동성을 갖는 제 Ⅰ형 트랜스멤브레인 단백질로서의 특징을 나타내고 수지상 세포 기능에 포함된다.

ODAR 과 OPG 결합 단백질의 상호작용에 대한 증거는 실시예 13 에 표시되어 있다. 가용 형태의 ODAR (ODAR-Fc 융합 단백질)은 생체외의 파골세포 발육(도 12)을 예방하고 피하주사후 정상 마우스의 골밀도를 증가시킨다(도 13). 그 결과는 파골세포 발육을 촉진하기 위하여 ODAR 과 상호작용하고 활성화하는 OPG 결합 단백질과 일치한다.

파골세포 발육과 골흡수의 속도 및 범위는 OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용에 의하여 조절된다. OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용을 감소시키거나 차단하는 화합물은 OPG 결합 단백질 활성의 우수한 길항물질이며 골흡수 감소를 유도하는 파골세포 발육을 분열시킨다. 또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호 작용을 증가시키는 화합물은 파골세포 발육을 촉진하고 골흡수를 증강시키는 우수한 작동물질이다.

정제된 단백질을 사용하여 OPG 결합 단백질과 생체외 ODAR 의 상호 작용을 측정하기 위하여 여러가지 검정법을 사용한다. 이러한 검정법은 OPG 결합 단백질에 의하여 ODAR 에 결합하는 속도 또는 범위를 증가시키거나 감소시키는 능력을 갖는 화합물을 스크리닝하는데 사용한다. 검정의 한 형으로, 마이크로플레이트의 웰의 바닥에 ODAR 단백질을 부착시켜서 부동화할 수 있다. 방사능 표지된 OPG 결합 단백질(예를 들면, 요오드화 OPG 결합 단백질) 및 시험 화합물은 한번에 하나씩(어느쪽 순서에 따라) 아니면 동시에 웰에 첨가할 수 있다. 배양후, 웰을 세척하고 방사성용 섬광 계수기를 사용하여 계산하고 시험 화합물의 존재하에 OPG 결합 단백질에 의하여 ODAR 에 결합하는 범위를 측정한다. 대표적으로, 화합물을 농도범위에 걸쳐 시험하고, 시험 검정의 하나 또는 그 이상의 요소가 없는 일련의 대조군 웰은 결과의 정확도를 평가하는데 사용한다. 이러한 방법에 대한 대안은 단백질의 "위치" 를 역전시키는 것, 즉, 마이크로플레이트 웰에 OPG 결합 단백질을 부동화하고, 시험 화합물과 방사성표지된 ODAR 로 배양하고, ODAR 결합의 범위를 측정하는 것을 포함한다(예를 들어, 본원에서 참조문헌으로 인용한 Current Protocols in Molecular Biology 의 18 장, Ausubel 등의 eds, John Wiley 및 Sons, New York, NY[1995]을 참조하라).

방사성표지에 대한 대안으로서, OPG 결합 단백질 또는 ODAR 을 바이오틴에 접합시키고 바이오틴화 단백질의 존재는 비색적으로 검출될 수 있는 고추냉이 과산화효소[HRP] 또는 알칼리성 포스파타제[AP]와 같은 효소에 결합되는 스트렙타비딘을 사용하거나 또는 스트렙타비딘을 형광 표지하여 검출할 수 있다. 바이오틴에 접합하는 OPG 결합 단백질 또는 ODAR에 결합하는 항체를 AP 또는 HRP 에 결합된 효소-결합 스트렙타비딘으로 배양한 후 사용하고 검출할 수 있다.

또한 OPG 결합 단백질과 ODAR 은 아가로스 비드, 아크릴 비드 또는 다른형의 이러한 불활성 기질에 부착시켜서 부동화할 수 있다. 기질-단백질 복합물은 상보성 단백질 및 시험 화합물을 함유하는 용액에 넣을 수 있고 ; 배양후, 비드를 원심분리로 침전 시킬 수 있고, OPG 결합 단백질과 ODAR 사이의 결합량은 상술한 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 선택적으로, 기질-단백질 복합물은 컬럼에서 부동화하고 시험 분자 및 상보성 단백질은 컬럼위로 통과시킨다. 다음, OPG 결합 단백질과 ODAR 사이의 복합물 형성은 상기 열거한 방법, 즉, 방사성 표지, 항체 결합 등을 사용하여 평가할 수 있다.

ODAR/OPG 결합 단백질 복합물의 형성을 증가 또는 감소시키는 화합물을 확인하는데 유용한 다른 형의 생체외 검정법은 비아코어(Biacore) 검정 시스템(뉴저지 피스케타웨이에 소재하는 파마시아에서 입수)과 같은 표면 플라스몬 공명 검출기 시스템이 있다. 비아크레(Biacre) 시스템은 제조자의 계획안을 사용하여 수행한다. 이러한 검정에는 검출기에 위치하는 덱스트란-피복 센서 칩에 OPG 결합 단백질 아니면 ODAR 의 공유 결합이 필수적으로 포함된다. 시험 화합물 및 다른 상보성 단백질은 센서 칩을 함유하는 챔버에 동시에 아니면 계속적으로 주사할 수 있고 결합하는 상보성 단백질의 양은 센서 칩의 덱스트란-피복면과 물리적으로 관련된 분자량의 변화에 기초하여 평가할 수 있고 ; 분자량 변화는 검출기 시스템에 의하여 측정할 수 있다.

몇몇 경우에, ODAR/OPG 결합 단백질 복합물의 형성을 증가시키거나 또는 감소시키는데 사용하기 위하여 둘 또는 그 이상의 시험 화합물을 함께 평가하는 것이 좋다. 이들 경우에서, 상기 열거한 검정은 이러한 부가적 시험 화합물을 동시에 아니면 계속적으로, 첫번째 시험 화합물에 첨가하여 쉽게 변경할 수 있다. 검정의 나머지 단계는 상기에서 열거한 바와 같다.

상술한 바와 같은 생체외 검정을 유리하게 사용하여 ODAR 와 OPG 결합 단백질에 의한 복합물 형성에 대한 많은 수의 화합물의 효과를 빠르게 스크리닝할 수 있다. 검정을 자동화하여 파아지 표시, 합성 펩티드 및 화학 합성 라이브러리에서 발생된 화합물을 스크리닝한다.

또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 복합물 형성을 증가시키거나 감소시키는 화합물은 ODAR-함유 세포와 세포주를 사용하여 세포 배양물에서 선별한다. 세포와 세포주는 포유 동물에서 얻을 수 있지만, 인체 또는 다른 영장류, 개 또는 설치류에서 얻는것이 바람직하다. 파골세포와 같은 ODAR 함유 세포는 공식적으로 이용할 수 있는 공정을 이용해서 친화성 크로마토그래피로 다른 세포형으로부터 풍부하게 할 수 있다. OPG 결합 단백질의 ODAR-함유 세포에 부착은 시험 화합물의 존재하에 또는 부재시 평가되고, 결합 범위는 예를 들어, OPG 결합 단백질에 바이오틴화 항체를 사용하여 유동세포 계측법에 의하여 측정할 수 있다. 또한, 마우스 또는 인체 파골세포 배양물은 실시예 8 에 기재된 바와같이 확립하고 시험 화합물은 그들의 능력이 CSF-1 및 OPG 결합 단백질의 첨가에 의하여 자극을 받는 파골세포 발육을 차단하는 것으로 평가할 수 있다. 세포 배양물 검정을 유리하게 사용하여 상술한 단백질 결합 검정에서 양성을 나타내는 화합물을 추가적으로 평가할 수 있다.

또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 화합물은 화합물을 마우스에 투여한 다음 골 주사 밀도측정법 또는 방사선사진법을 사용하여 골밀도를 측정하여 생체내 활성도를 평가한다. 골밀도를 측정하는 방법은 PCT 공보 제 WO97/23614 호와 실시예 13 에 기재되어 있다.

본 발명은 OPG 결합 단백질 및 ODAR 의 상호작용을 감소시키거나 차단하고 파골세포 형성의 길항물질인 화합물을 제공한다. 일반적으로 이와같은 화합물은 두 그룹에 속한다. 한 그룹은 OPG 결합 단백질에서 유도되거나 또는 OPG 결합 단백질과 상호작용하는 화합물이다. 이들은 상기에서 설명하였다. 두번째 그룹은 ODAR 에서 유도되거나 또는 ODAR 과 상호작용하는 화합물이다. ODAR 의 길항물질인 화합물의 예를들면 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 저분자량의 유기 화합물이 있다.

ODAR 의 길항물질은 ODAR 세포외 도메인에서 OPG bp 의 하나 또는 그이상의 결합 부위에 또는 이에 인접하여 결합하고 복합물 형성을 감소시키거나 또는 완전히 차단하는 화합물이다. OPG 결합 단백질과 복합물 형성에 관련된 ODAR 상의 이들 영역은 Banner 등의(Cell 73, 431 - 445(1993)참조)에 기재되어 있는 동종성 TNFβ/TNF-R55 복합물의 구조와의 유사성에 의하여 확인될 수 있다. 예를 들면, TNFβ/TNF-R55 복합물의 구조를 사용하여 복합물 형성에 포함된 OPG 결합 단백질과 ODAR 의 영역을 확인할 수 있다. 화합물은 복합물 형성에 포함되는 영역에 바람직하게 결합하고 길항물질로 작용하도록 설계한다. 실시예 11 에 열거한 한가지 방법에서, 펩티드 항원은 길항물질로서 작용하는 OPG 결합 단백질에 대한 항체를 상승시키는데 사용하도록 설계한다. 이러한 항체는 OPG 결합 단백질에 결합해서 ODAR 과의 복합물 형성을 차단하는 것으로 기대된다. 유사한 방법으로, ODAR 구조에 기초를 둔 펩티드 항원을 사용하여 길항물질로서 작용하는 항-ODAR 항체를 상승시킨다.

또한 ODAR 의 길항물질은 OPG bp 의 결합 부위와 다른 위치에서 ODAR 에 결합하고 OPG 결합 단백질과 감소적 또는 비생산적 복합물 형성을 가져오는 ODAR 폴리펩티드의 형태 변화를 유도한다.

한 실시형태에 있어, 길항물질은 기능적 트랜스멤브레인 도메인이 부족한 가용형태의 ODAR 이다. 가용형태의 ODAR 은 트랜스멤브레인 도메인(도 10 에 표시된 아미노산 214 - 234)에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 결실한다. 가용성 ODAR 폴리펩티드는 세포외 도메인의 부분 또는 전부를 갖고 OPG 결합 단백질을 결합할 수 있다. 임의적으로, 가용성 ODAR 은 키메라 단백질의 부분이고, 여기서 ODAR 의 세포외 도메인의 부분 또는 전부는 이종성 아미노산 서열에 융합한다. 한 실시형태에 있어, 이종성 아미노산 서열은 인체 IgG 에서 나온 Fc 영역이다.

ODAR 의 조절인자(작동물질과 길항물질)를 사용하여, 골다공증, 골수염, 악성 칼슘과잉혈증, 외과 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생한 골감소증, 파제트병, 골괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화, 보철 분해와 골용해 전이를 포함한 골감소증을 예방 또는 치료한다. 골감소증의 치료에 사용되는 ODAR 의 작동물질과 길항물질은 단독으로 투여되거나 또는 BMP - 1 내지 BMP - 12 로 표시되는 골 형태 형성 인자, 형질전환 생장 인자-β 와 TGF-β 군의 구성요소, 섬유아세포 생장 인자 FGF - 1 내지 FGF 10, 인터루킨 - 1 저해제, TNFα 저해제, 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스폰산염, 에스트로겐, SERMs 와 플루오르화물 및 칼슘과 같은 골-증강 광물질 포함한 치료학적 유효량의 골 생장 촉진제와 조합하여 투여할 수 있다. ODAR 의 길항물질은 골 감소증을 치료하는데 특히 유용하다.

다음 실시예는 본 발명을 더 충분하게 예시한 것이나, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

OPG 결합 단백질의 세포주 급원의 확인

오스테오프로테게린(OPG)은 생체외 및 생체내의 파골세포 형성을 음성적으로 조절한다. OPG 는 TNFR-관련 단백질이기 때문에, 이의 효력을 조정하면서 TNF-관련 군의 구성요소과 상호작용한다. 하나의 예외로, TNF 상과의 공지된 모든 구성요소는 세포 표면에서 발현되는 제 Ⅱ 형 트랜스멤브레인 단백질이다. OPG 결합 단백질의 급원을 확인하기 위하여, 재조합 OPG-Fc 융합 단백질을 면역프로브로 사용하여 여러가지 세포주 및 일차 조혈 세포의 표면에 위치하는 OPG 결합 단백질을 스크리닝한다.

생체외의 부착 배양물로서 생장하는 세포주를 다음 방법을 사용하여 처리한다 : 세포를 24 웰 조직 배양판(팔콘에서 입수)에 평판한 다음, 약 80 % 유착으로 생장하게 한다. 생장 배지를 제거한 다음, 1 % 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 인산염완충식염수(PBS)(기브코에서 입수)로 부착 배양물을 세척한다. 재조합 마우스 OPG[22 - 194]-Fc 및 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질(참조, 1996. 9. 3 자로 출원된 미국 출원 번호 제 08/706,945 호)을 1 % FCS 를 함유하는 PBS 를 사용하여 5 ug/㎖ 가 되도록 개별적으로 희석한 다음, 배양물에 첨가하고 0 ℃ 에서 45 분 동안 배양한다. OPG-Fc 융합 단백질 용액을 버리고 세포를 상술한 PBS-FCS 용액으로 세척한다. 배양물을 PBS-FCS 로 희석된 피코에리드린-접합 염소 F(ab') 항-인체 IgG 이차 항체(서던 바이오테크놀로지 어소우시에이츠 카탈로그 # 2043 - 09)에 노출시킨다. 0 ℃ 에서 30 - 45 분 배양시킨 후, 용액을 버리고 배양물을 상술한 바와 같이 세척한다. 세포를 면역형광 현미경법으로 분석하여 세포 표면 OPG 결합 단백질을 발현하는 세포주를 검출한다.

현탁한 세포 배양물을 다음 변이와 유사한 방법으로 분석한다 : 희석제 및 세척 완충제는 1 % FCS 를 함유하는 칼슘- 및 마그네슘-부재 인산염완충식염수로 구성되어 있다. 생장 배지의 지수복제 배양물에서 세포를 수집하고 원심분리하여 펠릿으로 만든 다음, 96 웰 마이크로타이터 조직 배양판(팔콘에서 입수)에 1×10⁷ 세포/㎖ 로 재현탁시킨다. 세포를 재조합 OPG-Fc 융합 단백질에 계속하여 노출시킨 다음, 상술한 이차 항체에 노출시키고 세포를 각 단계 사이에서 원심분리하여 세척한다. 벡톤 딕킨선 에프에이씨스캔(FACscan) 을 사용하여 형광 활성화 세포 선별(FACS : fluorescene activated cell sorting)로 세포를 분석한다.

이 방법을 사용하면, 마우스 OPG[22 - 194]-Fc 와 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질로 검출할 수 있는 표면 분자를 발현하는 마우스 골수단구성 세포주 32D(1993 년 5 월 13 일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁함, ATCC 기탁번호 CRL - 11346)를 알 수 있다. 이차 항체는 단독으로 32D 세포의 표면에 결합하지도 않고 정제된 인체 IgG1 Fc에 결합하지도 않으며, OPG-Fc 융합 단백질의 결합이 OPG 부분에 기인함을 나타낸다. 이 결합은 재조합 마우스 또는 인체 OPG[22 - 401] 단백질을 첨가에 의해 투여량 의존 방식으로 경쟁될 수 있다. 따라서, 생물학적 활성에 요구되는 OPG 영역은 32D-유도 표면 분자에 특이하게 결합할 수 있다.

실시예 2

마우스 OPG 결합 단백질의 발현 클로닝

cDNA 라이브러리를 32D mRNA 로 제조하여 포유동물 발현 벡터 pcDNA 3.1(+)(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)에 결합시킨다. 재조합 인터루킨 - 3 의 존재하에 유지되는 지수 생장 32D 세포를 수집하고, 전체 세포 RNA 를 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출물[Chomczynski 및 Sacchi. Anal. Biochem. 162, 156 - 159(1987) 참조]로 정제한다. 폴리 (A⁺) mRNA 분획을 제조자가 권고한 방법을 사용하여 다이나비드 올리고(dT) 25 (다이날 코포레이션에서 입수)에 흡수 및 이로부터 용리시켜 전체 RNA 제제로부터 수득한다. 제조자가 권한 방법을 사용한 수퍼스크립트 플라스미드 시스템(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 기브코 비알엘에서 입수)을 사용하여 지향성 올리고-dT 초회항원자극 cDNA 라이브러리를 제조한다. 생성한 cDNA 를 Sa1 I 와 Not I 제한 엔도뉴클레아제로 완전히 절단시킨 다음 크기 배제 겔 크로마토그래피로 분별한다. 최고 분자량 분획을 선택한 다음 플라스미드 벡터 pcDNA 3.1(+)(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)의 폴리커 영역에 결합시킨다. 이 벡터는 다중 클로닝 부위의 CMV 프로모터 상류를 함유하고, 진핵 세포에서 높은 수준의 발현을 조작한다. 라이브러리를 유능한 E. coli(ElectroMAX DH 10B, 뉴욕에 소재하는 기브코에서 입수)에 일렉트로포레이션한 다음 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 한천에 적정한다. 라이브러리를 약 1000 클론/풀을 함유하는 분리된 풀에 배열한 다음 37 ℃ 에서 16 - 20 시간 동안 각 풀의 1.0 ㎖ 배양물을 생장시킨다. 각 배양물에서 수득한 플라스미드 DNA 를 제조자가 권한 방법에 따라 퀴아겐 퀴아웰 96 울트라 플라스미드 키트(카탈로그 #16191)를 사용하여 제조한다.

32D cDNA 발현 라이브러리의 서열 풀을 COS - 7 배양물에 개별적으로 리포펙션한 다음 세포 표면 OPG 결합 단백질을 취하여 분석한다. 이를 위하여, COS - 7 세포를 6 - 웰 조직 배양판(코스탈에서 입수)에서 ㎖ 당 1×10⁶ 의 밀도로 평판한 다음 10 % FCS 를 함유하는 DMEM(기브코에서 입수)에서 밤새 배양한다. 각 풀에서 수득한 약 2 ㎍ 의 플라스미드 DNA 을 0.5 ㎖ 의 무-혈청 DMEM 으로 희석한 다음, 0.2 ㎛ 스핀-X 컬럼(코스탈에서 입수)을 통하여 원심분리하여 살균한다. 동시에, 10 ㎕ 의 리포펙타민(라이프 테크놀로지스 Cat # 18324 - 012)을 0.5 ㎖ 의 무-혈청 DMEM 을 함유하는 분리관에 가한다. DNA 와 리포펙타민 용액을 혼합하고, 30 분 동안 RT 에서 배양한다. COS - 7 세포 배양물을 무-혈청 DMEM 으로 세척한 다음, DNA-리포펙타민 복합물을 37 ℃ 에서 2 - 5 시간 동안 배양물에 노출시킨다. 이 기간 후, 배지를 제거하고, 10 % FCS 를 함유하는 DMEM 으로 대치한다. 다음에 세포를 37 ℃ 에서 48 시간 동안 배양한다.
OPG 결합 단백질을 발현하는 배양물을 검출하기 위하여, 생장 배지를 제거하고, 세포를 PBS-FCS 용액으로 세척한다. 5 ㎍/㎖ 의 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질을 함유하는 1.0 ㎖ 의 PBS-FCS 를 각 웰에 가하고 1 시간 동안 RT 에서 배양한다. 세포를 PBS-FCS 용액으로 3 회 세척한 다음 5 분 동안 RT 하에 PBS 에서 2 % 파라포름알데히드와 0.2 글루타르알데히드를 함유하는 PBS 에 고착시킨다. 배양물을 PBS-FCS 로 한 번 세척한 다음, PBS-FCS 용액에 침지시켜 65 ℃ 에서 1 시간 동안 배양한다. 배양물을 냉각시키고, PBS-FCS 용액을 흡인한다. 배양물을 30 분 동안 RT 에서 알칼리-포스파타아제 접합 염소 항-인체 IgG(Fc 특이성) 항체(시그마 제품 # A-9544)로 배양한 다음, 20 mM Tris-Cl (pH 7.6)과 137 mM NaCl 로 3 회 세척한다. 이들 단계에서 형성된 면역 복합물을 제조자가 권한 방법에 따라 파스트 레드 TR/AS-MX 기질 키트(피어스, 카탈로그 # 34034)를 사용하여 알칼리 포스파타제 활성을 검정하여 검출한다.

이 방법을 사용하여 약 300,000 의 총 독립 32D cDNA 클론을 스크리닝하면 각 1000 클론의 300 트랜스펙션된 풀로 나타난다. 단일 웰은 OPG-Fc 융합 단백질에 의하여 특이하게 장식된 능력을 획득한 세포를 함유하는 것으로 확인되었다. 이 풀을 순차적 범위의 친계 선발에 의하여 분획구분하여 단일 플라스미드 클론 32D-F3(도 1)을 수득한다. 32D-F3 플라스미드 DNA 을 COS - 7 세포에 트랜스펙션한 다음, 이를 FITC-접합 염소 항-인체 IgG 이차 항체 단독으로나 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질과 함께 사용하거나 ATAR-Fc 융합 단백질[HVEM 으로 알려진 ATAR ; Montgomery 등의 Cell 87, 427 - 436 (1996)]을 사용하여 면역염색한다(도 2). 이차 항체는 단독으로 COS - 7/32D-F3 세포에 결합하지 않고 ATAR-Fc 융합 단백질에도 결합하지 않는다. COS - 7/32D-F3 세포에 OPG Fc 융합 단백질만이 결합하고 32D-F3 는 발현 세포의 표면 상에 나타나는 OPG 결합 단백질을 코드하는 것을 나타낸다.

실시예 3

OPG 결합 단백질 서열

상기에서 분리한 32D-F3 클론은 약 2.3 kb cDNA 삽입물(도 1)을 함유하고, 이를 제조자가 권한 방법에 따라 프라이머-조정 Taq 염료-종결인자 반응물(어플라이드 바이오시스템에서 입수)을 사용하여 어플라이드 바이오시스템 373A 자동화 DNA 시퀀서 상에 양 방향으로 배열한다. 생성된 뉴클레오티드 서열을 FASTA 프로그램(GCG, 위스콘신 대학에서 입수)을 사용하여 DNA 서열 데이타베이스와 비교하고, "식스-웨이(six-way) 오픈리딩프레임"(Frames)(GCG, 위스콘신 대학에서 입수)을 사용하여 긴 오픈리딩프레임(LORF's)의 존재를 분석한다. 메티오닌에서 시작하는 316 아미노산(aa) 잔기의 LORF 를 적당한 방향에서 검출하고 약 150 bp 의 5' 비번역 영역이 이에 앞선다. 5' 비번역 영역은 예상되는 개시 코돈의 인-프레임 정지 코돈 상류를 함유한다. 이것은 32D-F3 플라스미드의 구조가 포유동물 세포에서 316 aa 유전자 생성의 발현을 조절하기 위하여 CMV 프로모터 영역을 실용화하는 이의 능력과 일치함을 나타낸다.

예상되는 OPG 결합 단백질 서열을 FASTA 프로그램[Pearson, Meth. Enzynol. 183, 63 - 98(1990) 참조]의 변이된 버전을 사용하여 공지된 단백질 서열의 기존 데이타베이스와 비교한다. Luethy 등의 Protein Sci. 3, 139 - 146 (1994)에 의하여 변이되는 바와 같이, Gribskov 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355 - 4359 (1987)에 기재되어 있는 서열 프로필 방법을 사용하여 종양 괴사 인자(TNF) 상과의 모든 공지된 구성요소에 보존되어 있는 특이적 모티프의 존재에 대하여 아미노산 서열을 분석한다. OPG 결합 단백질을 통하여 TNF 상과의 몇몇 구성요소에 상당한 상동 관계가 있음을 나타낸다. 마우스 OPG 결합 단백질이 두 TRAIL 과 CD40 리간드의 마우스와 인체 동종체에 가장 가깝게 관계됨을 나타낸다. OPG 결합 단백질 서열을 더 분석하면, 19.46 의 아주 높은 Z 점수로, TNF 상과에 대한 강한 조화를 나타낸다.

OPG 결합 단백질 아미노산 서열은 M49 에서 시작하여 L69 로 연장하는 예상되는 소수성인 트랜스멤브레인 도메인을 함유한다. 메티오닌 개시 코돈과 관계되는 이 서열을 기초로하면 OPG 결합 단백질이 짧은 N-말단 세포내 도메인과 더 긴 C-말단 세포외 도메인(도 4)을 갖는 제 Ⅱ 형 트랜스멤브레인 단백질인 것이 예상된다. 이것은 림포톡신알파[Nagata 및 Golstein, Science 267, 1449 - 1456(1995), 참조]를 제외하고 모든 공지된 TNF 군의 구성요소와 유사하다.

실시예 4

인체 OPG 결합 단백질 mRNA 의 발현

다중 인체 조직 노던 블롯(캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클론테크에서 입수)을 ³²P-dCTP 표지 32D-F3 제한 단편으로 탐침하여 인체 전사물의 크기를 검출하고 발현 모양을 측정한다. 노던 블롯은 42 ℃ 에서 2 - 4 시간 동안 5X SSPE, 50 % 포름아미드, 5X 덴하르트(Denhardt) 용액, 0.5 % SDS 및 100 ㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA 로 예비 혼성한다. 블롯은 42 ℃ 에서 18 - 24 시간 동안 5X SSPE, 50 % 포름아미드, 2X 덴하르트 용액, 0.1 % SDS, 100 ㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA 및 5 ng/㎖ 의 표지 프로브로 혼성한다. 그 다음에 RT 에서 10 분 동안 2X SSC 로 세척하고 50 ℃ 에서 10 분 동안 1X SSC 로 세척한 다음 10 - 15 분 동안 0.5X SSC 로 세척한다.

엄격한 조건하에서 마우스 cDNA 에서 유도된 프로브로 혼성하여, 약 2.5 kb 의 상대 분자량을 갖는 우세한 mRNA 종을 림프절에서 검출한다(도 3). 또한 태아간 mRNA 의 동일한 상대 분자량에서 약한 신호를 검출하였다. 검사된 다른 조직에서는 OPG 결합 단백질 전사물이 검출되지 않았다. 데이터로 OPG 결합 단백질 mRNA 의 발현이 인체 조직에서 극히 제한됨을 알 수 있다. 또한 데이터는 분리된 cDNA 클론이 원래의 전사물 크기와 유사하고, 예상하는 32D-F3 가 전장의 클론임을 나타낸다.

실시예 5

인체 OPG 결합 단백질의 분자 클로닝

OPG 결합 단백질의 인체 동종체는 인체 말초 림프절에서 약 2.5 kb mRNA 로서 발현되고 엄격한 혼성화 조건하에서 마우스 cDNA 프로브로 혼성하여 검출한다. 인체 OPG 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 재조합 박테리오파아지 플라크 또는 형질전환된 박테리아 콜로니, 혼성방법[Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Prss, New York(1989), 참조]에 의한 인체 림프절 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 얻는다. 여기서 파아지 또는 플라스미드 cDNA 라이브러리를 마우스 OPG 결합 단백질 클론 32D-F3 에서 유도된 방사성-표지 프로브를 사용하여 스크리닝한다. 프로브를 사용하여 평판한 라이브러리가 옮겨진 니트로셀룰로스 필터를 선별한다. 이들 필터를 실시예 4 에 명시된 조건을 사용하여 예비 혼성한 다음 혼성하여 최종적으로 인체 OPG 결합 단백질 cDNA 의 정제된 클론을 얻는다. 인체 OPG 결합 단백질 클론에서 얻은 삽입물을 실시예 3 에 기재된 바와 같이 배열하고 분석한다.

1995. 12. 22 일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제 08/577,788 호 에 기재된 OPG-bp 전사물의 존재에 대하여 인체 림프절 폴리 A+ RNA (캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클로테크 인코포레이티드에서 입수)을 분석한다. 엄격한 조건하에서 32P-표지 마우스 OPG-bp 프로브로 탐침된 이 RNA 시료의 노던 블롯을 탐침하여 인체 OPG-bp 전사물의 존재를 나타낸다. 올리고 dT-초회항원자극 cDNA 라이브러리를 실시예 2 에 기재된 수퍼스크립트 키트(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 기브코 라이프 테크놀로지스에서 입수)를 사용하여 림프절 mRNA 에서 합성한다. 생성한 cDNA 의 크기를 선택하고 고분자 분획을 플라스미드 벡터 pcDNA 3.1(+)(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)에 결합시킨다. 전기수용능 E. coli DH10 (메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 기브코 라이프 테크놀로지스에서 입수)을 형질전환하고 1×10⁶ 암피실린 저항성 형질전환체를 32P-표지 마우스 OPG 결합 단백질 프로브를 사용하는 콜로니 혼성화에 의하여 스크리닝한다.

추정한 인체 OPG 결합 단백질 cDNA 의 플라스미드 클론을 분리하면, 2.3 kp 삽입물(phuOPGbp - 1.1)을 함유한다. 생성한 phuOPGbp - 1.1 삽입물의 뉴클레오티드 서열은 마우스 OPG 결합 단백질 cDNA 서열과 약 80 - 85 % 의 상동성을 갖는다. 삽입물 DNA 서열의 번역은 317 aa 폴리펩티드(도 4)를 코드하는 것으로 예상되는 긴 오픈리딩프레임의 존재를 나타낸다. 마우스와 인체 OPG-bp 폴리펩티드를 비교하면 이들이 ~87 % 는 동일하고, 이 단백질은 진화하는 동안 높게 보존되었음이 나타난다.

인체 OPG 결합 단백질 DNA 와 단백질 서열은 젠뱅크에는 존재하지 않고, 상동의 EST 서열이 아니다. 마우스 동종체에 있어서, 인체 OPG 결합 단백질은 사이토카인 TNTα 상과의 모든 구성요소에 대하여 서열의 높은 유사성을 나타낸다.

실시예 6

OPG 결합 단백질의 클로닝과 박테리아 발현

하기에 기재한 프라이머 쌍과 주형을 사용한 PCR 증폭을 사용하여 여러가지 형태의 마우스 OPG 결합 단백질을 생성한다. 각 쌍중 한 프라이머는 유전자의 카르복시 말단 다음에 오는 유일한 XhoI 또는 SocⅡ 부위및 TAA 정지 코돈에 결합한다. 각 쌍중 다른 프라이머는 유일한 NdeI 부위, N-말단 메티오닌 및 유전자의 아미노 말단 부분의 최적의 코돈에 결합한다. PCR 및 열순환은 표준의 재조합 DNA 방법론에 따라 수행한다. PCR 산물을 정제하고 제한 절단시킨 다음 벡터 pAMG 21 (ATCC 기탁번호 98113)의 유일한 NdeI 및 XhoI 또는 SacⅡ 부위에 삽입하고 원영양성 E.coli 393 또는 2596 으로 형질전환시킨다. 또한 통상적으로 사용되는 다른 E.coli 발현 벡터와 숙주 세포도 발현에 적합하다. 형질전환 후, 클론을 선택하고 플라스미드 DNA 를 분리한 다음 OPG 결합 단백질 삽입물의 서열을 확인한다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [75 - 316]

이 구조는 242 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met(75)-Asp-Pro-Asn-Arg----Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1581 - 72 와 # 1581 - 76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [95 - 316]

이 구조는 223 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-His(95)-Glu-Asn-Ala-Gly------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용된 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1591 - 90 과 # 1591 - 95 는 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

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pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [107 - 316]

이 구조는 211 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Ser(107)-Glu-Asp-Thr-Leu-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용된 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1591 - 93 과 # 1591 - 95 는 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [118-316]

이 구조는 199 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C- 말단 잔기, NH₂-Met(118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1591 - 94 와 # 1591 - 95 는 PCR 및 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [128 - 316]

이 구조는 190 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Lys(128)-Glu-Leu-Gln-His-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1591 - 91 과 # 1591 - 95 는 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [137 - 316]

이 구조는 181 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Gln(317)-Arg-Phe-Ser-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1591 - 92 와 # 1591 - 95 는 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [146 - 316]

이 구조는 171 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met(146)-Glu-Gly-Ser-Trp-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 상술한 pAMG 21-마우스 OPG 결합 단백질 [75-316]이고, 올리고뉴클레오티드 # 1600 - 98 과 # 1581-76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [156 - 316]

이 구조는 162 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Arg(156)-Gly-Lys-Pro-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 하기 pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]이고, 올리고뉴클레오티드 # 1619 - 86 과 # 1581 - 76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]

이 구조는 160 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Lys(158)-Pro-Glu-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1581 - 73 과 # 1581 - 76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [166 - 316]

이 구조는 152 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNG/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1581 - 75 와 # 1581 - 76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [168 - 316]

이 구조는 150 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음의 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Thr(168)-Ile-Asn-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고뉴클레오티드 # 1581 - 74 와 # 1581 - 76 은 PCR 및 이 유전자 구조의 클로닝에 사용되는 프라이머 쌍이다.

상기 구조들은 예를 든 것이고, 본 분야의 숙련자들은 본원에 기술되어 있는 일반적 방법론을 사용하여 다른 형태의 OPG 결합 단백질을 쉽게 얻을 수 있다.

재조합 박테리아 구조 pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [75 - 316], [95 - 316], [107 - 316], [118 - 316], [128 - 316], [137 - 316] 및 [158 - 316]을 클로닝하고 DNA 서열을 확인한 다음 유도에 따른 재조합 유전자 생성 발현의 정도를 검사한다. 모든 구조는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 정제되지 않은 용해액의 쿠마시 염색에 의해 쉽게 볼 수 있는 재조합 유전자 산물의 정도를 나타낸다. 형질전환된 E. coli 393 또는 2596 의 생장, OPG 결합 단백질 발현의 유도와 OPG 결합 단백질을 함유하는 봉입체의 분리는 PCT 제 WO 97/23614 호에 기재되어 있는 방법에 따라 행한다. 봉입체로부터 OPG 결합 단백질을 정제하기 위해서는 본 분야의 숙련자들이 이용할 수 있는 방법을 사용하여 OPG 결합 단백질을 용해시키고 복원하는 것이 필요하다. 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]은 대부분 불용성으로 생성됨이 알려져 있으나, 약 40 % 는 가용성 분획임이 알려져 있다. 재조합 단백질은 하기에 기재된 바와 같이 가용성 분획에서 정제하고 이의 생체 활성을 검사한다.

실시예 7

재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]의 정제

발현된 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]을 갖는 냉동 박테리아 세포를 해동시키고 20 mM 트리스-HCl pH 7.0, 10 mM EDTA 로 재현탁시킨다. 세포 현탁액(20 % w/v)은 미소 용제를 3 회 통과시켜서 균일화한다. 용해된 세포 현탁액을 45 분 동안 10,000 rpm 의 JA14 회전기에서 원심분리한다. SDS-PAGE 분석하면 봉입체 및 상층액 둘 다에 존재하는 약 18 kd 분자량의 밴드가 나타난다. 가용성 분획을 10 mM MES pH 6.0 으로 평형이 유지되는 파마시아 SP 세파로오스 4 FF 컬럼에 사용한다. OPG 결합 단백질을 MES pH 6.0 에서 0 - 0.4 M NaCl 의 20 컬럼 체적 기울기로 용출한다. OPG 결합 단백질을 함유하는 분획을 20 mM MES pH 6.0 으로 평형이 유지되는 ABX 베커본드 컬럼에 사용한다. OPG 결합 단백질은 MES pH 6.0 에서 0 - 0.5 M NaCl 의 15 CV 기울기로 용출한다. 최종 산물은 SDS-PAGE 에 의하여 95 % 이상의 균질성을 갖는다. N-말단 서열은 잔기 158 에서 (개시인자 메티오닌으로)시작하는 폴리펩티드에서 예상되는 것과 동일한 다음의 서열을 나타낸다 : Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His. SDS-PAGE 에서 단백질의 상대 분자량은 감소되지 않는다.

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실시예 8

재조합 가용성 OPG 결합 단백질의 생체외 생체 활성

재조합 OPG 단백질은 미국 특허 출원 번호 제 08/577,788 호에 기재되어 있는 파골세포 형성 검정으로 골수와 비장 전구체로부터의 비타민 D3-의존형 파골세포 형성을 차단하는 것으로 이미 알려져있다. OPG 결합 단백질은 OPG 에 결합하고 리간드의 TNF 계통의 새로운 구성요소이기 때문에 이는 OPG 생체 활성의 우수한 표적이다. 최소의 코어 TNFα-유사 도메인을 나타내는 재조합 가용성 OPG 결합 단백질(158 - 316)을 이의 능력이 파골세포 전구체로부터 파골세포 분화를 조절하는 것에 대하여 시험한다. 골수세포를 성숙한 마우스 대퇴골에서 분리하고, M-CSF 로 처리한다. 비-유착 분획을 두 비타민 D3 및 덱사메타손의 존재와 비 존재하에 ST2 세포로 공동 배양한다. 이미 나타난 바와 같이, 파골세포는 간질세포(ST2), 비타민 D3 및 덱사메타손을 함유하는 공동-배양물에서만 발육한다. 재조합 가용성 OPG 결합 단백질을 0.16 - 500 ng/ml 의 다양한 농도로 첨가하고, 파골세포 발육을 TRAP 용액검정 및 가시적 관찰에 의하여 측정한다. OPG 결합 단백질은 1 - 2 ng/ml 범위에서 반-최대 효과를 갖는 투여량 의존형 방식으로 파골세포 분화와 발육을 강하게 자극하고, 이는 생체외 파골세포 형성의 우수한 유도물질로서 작용하는 것으로 생각된다(도 5). OPG 결합 단백질의 작용은 재조합 OPG 에 의하여 차단된다(도 6).

OPG 결합 단백질이 간질 및 첨가되는 스테로이드를 대체할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 파골세포 전구체의 생장을 촉진하는 다양한 농도의 M-CSF 를 사용하여 배양물을 처리하고 또한 다양한 양의 OPG 결합 단백질을 첨가한다. 도 6 에 나타낸 바와 같이, OPG 결합 단백질은 투여량 의존적으로 TRAP 활성을 자극하고 자극의 크기는 첨가되는 M-CSF의 농도에 의존적인 것으로, 이들 두 인자가 함께 파골세포 발육에 중심이 되는 것을 보여준다. 이러한 최종 관찰의 생물학적 적합성을 확인하기 위하여, 배양물을 소 피질성 골 조각에 처리하고 M-CSF 와 OPG 결합 단백질이 단독으로 또는 함께 사용될 때의 효과를 시험한다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, M-CSF 의 존재하에 OPG 결합 단백질은 골 표면을 침식시켜 막공을 일으키는 큰 TRAP 양성 파골세포의 형성을 자극한다. 따라서, OPG 결합 단백질은 파골세포 형성 자극(분화) 인자로서 작용한다. 이것은 OPG 가 OPG 결합 단백질을 격리하여 파골세포 발육을 차단하는 것으로 예상한다.

실시예 9

재조합 가용성 OPG 결합 단백질의 생체내 활성

생체외 연구를 기초로 할때, E. coli. 에 생성된 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316] 은 골수 전구체로부터 파골세포를 발육시키는 우수한 유도물질이다. 이의 생체내 효과를 측정하기 위하여, 생후 4 - 5 주의 수컷 BDF 1 마우스(찰스 리버 라보라토리스에서 입수)에 3 일 동안 하루에 2 회 및 4 일째(0. 1. 2 및 3 일)의 아침에 OPG 결합 단백질을 피하주사한다. 5 개 그룹의 마우스(n=4)에 매일 담체만 투여하거나 1, 5, 25 또는 100 ㎕/일 의 OPG 결합 단백질[158-316]을 투여한다. 다른 5 개 그룹의 마우스(n=4)에 상기 투여량의 담체 또는 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 투여하고 매일 단일 피하주사로 1 mg/kg/일(약 20 ㎍/일)의 인체 Fc-OPG[22 - 194] 를 더 투여한다. OPG 결합 단백질[158-316]을 처리하기에 앞서 전체 혈액 이온화칼슘을 0 일에 측정하고, 1, 2 및 3 일에는 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 하루에 1 회 주사한 다음 3-4 시간 후에 측정하였다. 3 일에 최종 주사한 후 네 시간안에 마우스를 희생시켜 방사선 사진을 찍었다.

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OPG 결합 단백질[158 - 316]의 재조합체로 인해 5 ㎍/일 및 그 이상의 투여량으로 치료한지 2 일후에 혈액 이온화칼슘이 현저하게 증가하였다(도 8). 칼슘과잉혈증의 피해도는 골흡수를 증가시키는 파골세포 활성의 우세한 유도를 나타낸다. 동시 OPG 투여는 100 ㎍/일 이 아닌, 5 와 25 ㎍/일 의 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 투여량으로 칼슘과잉 혈증을 제한했다. 이들 동일한 동물을 방사선 사진법으로 분석하여 X-선에 의하여 볼 수 있는 골 광물질 밀도에 어떠한 효과가 있는지를 측정한다(도 9). 3 일 동안 주사한 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 재조합체는 투여량-의존형 방식으로 마우스의 근위 경골의 골밀도를 감소시켰다. 골밀도의 감소는 특히 100 ㎍/일 을 투여한 마우스에서 일어났으며, 이들 동물의 심한 칼슘과잉혈증은 증가된 골흡수 및 이로 인한 골격으로부터의 칼슘 방출에 의해 일어나는 것임을 확인했다. 이들 데이터는 OPG 결합 단백질[158 - 316]이 생체내에서 작용하여 전신 칼슘과잉혈증을 유도하는 골흡수를 촉진하고, 재조합 OPG 가 이러한 작용을 제거함을 분명하게 나타낸다.

실시예 10

포유동물 세포에서 가용성 OPG 결합 단백질의 클로닝과 발현

마우스와 인체 OPG 결합 단백질의 전장 클론은 실시예 2 에서 이미 기술한 바와 같이 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. cDNA 클론을 포유동물 세포에서 발현될 때 분비형태의 단백질을 코드하도록 변이시킬 수 있다. 트랜스멤브레인 신장(spanning) 영역을 포함하는 단백질의 대략 처음 69 아미노산을 포함하고, 개시 코돈을 코드하는 cDNA 의 자연 5' 말단을 신호 펩티드 선도 서열로 대치할 수 있다. 예를 들면, 개시 코돈과 알려진 유전자의 신호 펩티드를 코드하는 DNA 서열은 영역이 아미노산 잔기 68 을 코드하는 영역 다음의 어디서나 시작하는 OPG 결합 단백질 cDNA 서열에 스플라이싱될 수 있다. 생성된 재조합 클론은 포유동물 세포에서 분비형태의 OPG 결합 단백질을 생성하고, OPG 결합 단백질의 C-말단 세포외 도메인에서 정상적으로 일어나는 글리코실화와 같은 번역후 변이를 받는 것으로 예상된다. 이러한 방법으로, 5' 말단에 마우스 OPG 신호 펩티드를 갖고 3' 말단에 인체 IgG1 Fc 영역을 갖는 분비형태의 OPG 결합 단백질을 제조한다. 1995. 12. 22 일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제 08/577,788 호에 기재된 플라스미드 벡터 pCEP4/muOPG[22 - 401]-Fc 를 NotI 로 OPG 의 3' 단부 및 Fc 유전자 사이를 절단하여 분열시킨다. 선형화된 DNA 를 XmnI 로 OPG 의 잔기 23 과 24 사이만을 절단하여 평활 말단(blunt end)을 남게한다. 제한 절단물을 CIP 로 탈인산화시키고 이 절단물의 벡터 부분(OPG 와 Fc 의 잔기 1 - 23 를 포함) 을 겔 정제한다.

다음의 올리고뉴클테오티드를 프라이머로 사용한 플라스미드 주형으로부터 Pfu 폴리머라제(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 스트라타겐에서 입수)를 사용하여 아미노산 잔기 69 - 316 을 코드하는 마우스 OPG 결합 단백질 cDNA 를 PCR 증폭시킨다 :

1602 - 61 올리고뉴클레오티드는 유전자의 5' 말단을 증폭하고 인공 StuI 부위를 함유한다. 1602 - 59 프라이머는 유전자의 3' 말단을 증폭하고 인공 NotI 부위를 함유한다. 최종의 PCR 산물을 NotI 와 StuI 로 절단한 다음 겔 정제한다. 정제된 PCR 산물을 벡터에 결합시킨 다음 전기 수용능 E. coli. DH10B 세포를 형질전환 하는데 사용한다. 최종적으로 생성된 클론을 배열하여 증폭된 서열과 제한 부위 접합의 보존성을 확인한다. 이 플라스미드를 사용하여 인체 293 섬유아세포를 트랜스펙션한 다음, 1995. 12. 22 일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제 08/577,788 호에 이미 기재된 배지로부터 OPG 결합 단백질-Fc 융합 단백질을 수집한다.

유사한 방법을 사용하여, 발현 벡터를 인체 IgG1 Fc 도메인에 융합되는 N-말단 단절을 발현할 수 있는 것으로 설계한다. 이러한 구조는 마우스 OPG 결합 단백질 잔기 158 - 316 의 골격내에 융합된 다음 인체 IgGI Fc 영역의 골격내에 융합되는 마우스 OPG 신호 펩티드(아미노산 잔기 1 - 21)로 구성되어 있다. 이것을 행하기 위하여, 플라스미드 벡터 pCEP 4/마우스 OPG [22 - 401] (1995, 12. 22 일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제 08/577,788 호 참조)을 HindⅢ 와 NotI 으로 절단시켜서 전체 OPG 리딩 프레임을 제거한다. 다음의 프라이머를 사용한 플라스미드 주형 pCDNA/32D-F3 를 사용하여 마우스 OPG 결합 단백질 잔기 158-316 을 PCR 증폭한다 :

1616 - 44 는 인공 XhoI 부위를 갖는 muOPG 신호 펩티드의 잔기 16-21 을 함유함을 물론 잔기 158 에서 시작하는 OPG 결합 단백질을 증폭한다. 1602 - 59 는 유전자의 3' 말단을 증폭하고 골격내 NotI 부위를 첨가한다. PCR 산물을 NotI 와 XhoI 로 절단시킨 다음 겔 정제한다.

다음의 상보성 프라이머를 서로 어닐링시켜서 마우스 OPG 신호 펩티드를 코드하는 어댑터와 번역 개시 부위를 둘러싸는 코자크 서열을 형성 시킨다 :

이들 프라이머를 어닐링하여, 5' 말단 상의 HindⅢ 와 3' 말단 상의 XhoI 가 양립할 수 있는 5' 돌출부를 생성한다. 상기에서 수득한 절단된 벡터, 어닐링한 올리고 및 절단된 PCR 단편을 DH10B 세포에 함께 결합하고 전기영동시킨다. 생성한 클론을 배열하여 신호 펩티드, 잔기 158-316 을 코드하는 OPG 결합 단백질 단편과 IgG1 Fc 도메인 사이의 접합의 확실한 재구성을 확인한다. 재조합 플라스미드를 정제하고, 인체 293 섬유아세포에 트랜스펙션한 다음 상술한 바와 같이 조절된 배지 산물로서 발현시킨다.

전장의 마우스 cDNA 및 인체 cDNA 를 pCEP4 발현 벡터(캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)로 클로닝한 다음, 실시예 1 에 기재된 인체 293 섬유아세포의 배양물에 트랜스펙션한다. 세포 배양물을 상술한 하이그로마이신으로 선택하고 무혈청 조절 배지를 제조한다. 조절된 배지를 부동화 재조합 OPG 의 컬럼에 노출시키고 탈립성(shed) 형태의 마우스 및 인체 재조합 OPG bp 를 친화력으로 정제한다. 정제된 가용성 OPG 결합 단백질의 N-말단 서열 분석은 마우스 단백질이 페닐알라닌 139 전에 우선적으로 절단되고, 인체 단백질은 동종성 잔기, 이소루이신 140 앞에서 우선적으로 절단됨을 나타낸다. 또한, 인체 단백질은 글리신 145 앞에서 우선적으로 절단된다. 이로인해 자연 발생적으로 용해되는 형태의 인체 OPG 결합 단백질이 위치 140 의 이소루이신 또는 위치 145 의 글리신으로 아미노 말단 잔기를 갖는 것으로 여겨진다.

실시예 11

OPG 결합 단백질의 펩티드와 단백질에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조

OPG 결합 단백질의 특이적 영역에 대한 항체는 OPG 결합 단백질로 부터 펩티드를 면역화하여 얻을 수 있다. 이러한 펩티드는 단독으로 사용하거나 또는 접합 형태의 펩티드를 면역화하는데 사용할 수 있다.

성숙한 TNFα 의 결정구조는 E.Y Jones, D.I Stuart 및 N.P.C Walker(1990) J. Cell Sci. Suppl. 13, 11 - 18 에 기재되어 있고, 단량체는 젤리롤 위상을 갖는 역평행 β-주름진 시트 샌드위치를 형성한다. 열 개의 역평행 β-가닥이 이 결정 구조에서 관찰되고, 가닥 B' BIDG 와 다른 가닥 C'CHF [E.Y Jones 등의 동일문헌 참고]를 구성하는 하나의 베타 시트와 베타 샌드위치를 형성한다. 두 루프의 성숙한 TNFα 는 돌연변이유발 연구로부터 수용체와 접촉하는 것이 보여지는데, 이들은 베타 가닥 B ＆ B′사이에서 형성된 루프와 베타 가닥 E & F 사이의 루프[C.R. Goh, C-S. Los 및 A.G. Porter(1991) Protein Engineering 4, 785 - 791, 참조]이다. TNFβ 와 55 Kd TNF 수용체(TNF-55)의 세포외 도메인 사이에서 형성된 복합물의 결정 구조는 분해되고 수용체-리간드 접촉은 참고문헌 D.W. Banner, A. D’Arcy, W. Janes, R. Gentz, H-J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher 및 W. Lesslauer(1993) Cell 73, 431 - 445 에 기재되어 있다. 상술한 돌연변이 유발[C.R. Goh 등의 동일문헌 참고]에 따라서 리간드 TNFβ 에 대응하는 루프 BB' 와 EF는 TNFb : TNF-R 55 복합물의 분해된 결정 구조의 수용체와 대부분 접촉한다는 것을 알 수 있다. 마우스 OPG 결합 단백질의 아미노산 서열을 TNFα 와 TNFβ 의 아미노산 서열과 비교한다. BB'와 EF 루프에 대응하는 마우스 OPG 결합 단백질의 영역은 이러한 비교를 기초로 할 때 예측되고 펩티드를 설계하여 하기에 기재했다.

A. 항원(류) : 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]을 하기 동물의 면역화 항원(ag)으로 사용하고 혈청은 하기 방법을 사용하여 검사한다. 마우스 OPG 결합 단백질의 추정 BB' 와 EF 루프에 대한 펩티드를 합성하고 면역화에 사용한다 ; 이들 펩티드는 다음과 같다 :

BB' 루프 펩티드 : NH₂--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS--COOH
(SEQ ID NO : 33)

BB' 루프-Cys 펩티드 : NH₂--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC--COOH
(SEQ ID NO : 34)

EF 루프 펩티드 : NH₂--VYVVKTSIKIPSSHNLM--COOH
(SEQ ID NO : 35)

EF 루프-Cys 펩티드 : NH₂-VYVVKTSIKIPSSHNLMC--COOH
(SEQ ID NO : 35)

카르복시-말단 시스테인 잔기를 갖는 펩티드를 하기 섹션 B 에 기재된 방법을 사용하는 접합에 사용하고, 면역화에 사용한다.

B. 키홀 림페트 헤모시아닌 또는 소 혈청 알부민 접합 : 선택된 펩티드 또는 단백질 단편을 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 접합시켜서 이들의 동물 면역원성을 증가시킨다. 또한 소 혈청 알부민(BSA) 접합 펩티드 또는 단백질 단편을 EIA 프로토콜에 이용한다. 임젝트 말레이미드(Imject Maleimide) 활성 KLH 또는 BSA(일리노이 록포오드에 소재하는 피어스 케미칼 컴파니에서 입수)를 10 mg/ml 의 최종 농도로 dH₂O 에서 재구성한다. 펩티드 또는 단백질 단편을 인산염 완충제에 용해시킨 다음 등가질량(g/g)의 KLH 또는 BSA 와 혼합한다. 가볍게 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 반응시켜서 접합시킨다. 용액을 탈염 컬럼위를 통과시키거나 밤새 PBS 로 투석한다. 펩티드 접합물을 면역화에서 또는 EIA 에서 사용할때 까지 20 ℃ 에서 저장한다.

C. 면역 : Balb/c 마우스, (메릴랜드 월밍톤에 소재하는 찰스 리버스 라보라토리스에서 입수)Lou 랫 또는 뉴질랜드 흰 토끼를 완전 프로인트 보조제(CFA, 50 % vol/vol ; 미시간 디트로이트에 소재하는 디프코 라보라토리스에서 입수)와 에멜젼화한 ag(각각 50 ㎍, 150 ㎍ 및 100 ㎍)을 피하주사(SQI)한다. 토끼에게 불완전 프로인트 보조제(ICFA ; 미시간 디트로이트에 소재하는 디프로 라보라토리스에서 입수)와 유사한 모양으로 제조된 항원을 2 주 간격으로 두 세 차례 추가항원자극을 시킨다. 마우스 및 랫을 약 4 주마다 추가항원자극시킨다. 두번째 추가항원자극 다음 칠일에, 실험 채혈을 행하고 혈청 항체 역가를 측정한다. 역가가 토끼에 전개되었을때, 50 ㎖ 의 주 생성 채혈을 6 주 연속 취한다. 마우스와 랫은 혈청 역가 수치를 기초로 하는 하이브리도마 생성을 위해 선택하며 ; 5000 이상의 반-최대 역가를 갖는 동물을 사용한다. 본 분야의 숙련자들은 이러한 프로토콜을 조정하여 사용할 수 있으며 ; 예를 들면, 현재, 여러가지 형의 면역조절인자를 이용하고 이 프로토콜에 혼입시킬 수 있다.

D. 효소-결합 면역흡수 검정(EIA) : ElA 를 행하여 각 동물의 혈청 항체(ab) 역가를 측정한 다음 우수한 하이브리도마를 선별한다. 평저면, 높은-결합의 96-웰 미세적정 EIA/RlA 판(매사추세츠 켐브리지에 소재하는 코스타르 코포레이션에서 입수)을 pH 9.2 의 탄산염-중탄산염완충제 (0.015 M Na₂CO₃, 0.035 M NaHCO₃)에서 ㎖ 당 5 ㎍ 으로 정제된 재조합 단백질 또는 단백질 단편(항원, ag)으로 피복한다. 필요에 따라, 단백질 단편을 소 혈청 알부민(BSA)에 접합시킨다. 50 ㎕ 의 ag 를 각 웰에 첨가한다. 판을 아세트산염 필름(캘리포나아 코스타 메사에 소재하는 아이씨엔, 바이오메디칼스에서 입수)으로 덮고 4 ℃ 에서 2 시간 또는 밤새 흔들리는 플랫폼에서 실온(rt)하에 배양한다. 1 부의 탈염수(dH₂O)와 1 부의 BSA 희석제/차단용 농축물(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 키르케가아드 및 페리 라보라토리스에서 입수)을 혼합하여 제조한 5 % BSA 용액을 웰 당 250 ㎕ 로 실온에서 30 분 동안 판을 차단한다. 차단용액을 버리고 50 ㎕ 의 혈청 2-배 희석물(1 : 100 내지 1 : 12,800) 또는 하이브리도마 조직 배양 상층액을 각 웰에 첨가한다. 혈청 희석제는 1 % BSA(둘베코 인산 완충 생리식염수, D-PBS 로 1 : 10 으로 희석된 10 % BSA 희석제/차단 농축액 ; 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 기브코 비알엘에서 입수)이고 반면에 하이브리도마 상층액은 희석하지 않고 시험한다. 하이브리도마 스크리닝의 경우, 한 웰은 접합 대조군으로서 유지하고, 두번째 웰은 양성 ab 대조군으로서 유지한다. 판을 다시 실온에서 1 시간 동안 흔들면서 배양한 다음 dH₂0 에 용해된 세척 용액 20×농축물(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 키르케가아드 및 페리 라보라토리스에서 입수)의 1×제제를 사용하여 4 회 세척한다. 다음에 1 % BSA 로 희석된 고추냉이의 퍼옥시다제 접합 이차 ab (인디애나 인디아나폴리스에 소재하는 보에링거 맨헤임 바이오메디칼스에서 입수)를 30 분 동안 각 웰에서 배양한다. 판을 얼룩이 건조하기전에 세척하고 ABTS 퍼옥시다제 단일 성분 기질(메릴랜드 가이더스버그에 소재하는 키르케가아드 및 페리 라보라토리스에서 입수)을 첨가한다. 미소평판 EL 310 판독기(버몬트 위누스키에 소재하는 바이오-테크 인스트루먼츠 인코포레이티드에서 입수)를 사용하여 각 웰에 대하여 405 nm 에서 흡광도를 판독한다. 405 에서 흡광도 대 혈청 희석의 log₁₀ 을 계산하여 반-최대 역가의 혈청 항체를 계산한 다음 이 혈청에 의하여 얻은 최대 흡광도의 50 % 포인트에서 외삽한다. 흡광도가 배경값 보다 5 배 이상 높으면 하이브리도마를 양성으로 선택한다. 이 프로토콜을 조정하여 사용하고 ; 예를 들어, 접합된 이차 항체는 특이성 또는 비-교차-반응성으로 선택한다

E. 세포 융합 : 하이브리도마 생성를 위하여 선택한 동물에 50 ~ 100 μg 의 PBS 내 ag 를 정맥내 주사한다. 4 일 후, 동물을 이산화탄소로 희생시키고, 200 U/㎖ 페닐실린 G, 200 μg/㎖ 스트렙토마이신 황산염 및 4 mM 글루타민(2 × P/S/G DMEM)을 함유하는 35 ㎖ 의 둘베코스 변이 이글 배지로 살균 조건하에 이의 비장을 수집한다. 비장에서 여분의 지방 조직을 제거한 다음, 4 접시의 깨끗한 2 × P/S/G DMEM 으로 행군다. 다음 10 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 함유하는 살균한 스토머커 백(오하이오 신시내티에 소재하는 테크마에서 입수)에 옮기고 스토머커 랩 블렌더 80 (영국 런던에 소재하는 시워드 라보라토리 유에이씨 하우스에서 입수)을 갖는 단일 세포 현탁액으로 분열시킨다. 세포가 비장 피막으로부터 배지로 방출될때, 이들을 백에서 제거하고 살균한 50 ㎖ 원뿔형 원심분리관(뉴저지 링컨 파크에 소재하는 벡톤 디킨슨 및 컴파니에서 입수)으로 옮긴다. 백에 새로운 배지를 첨가하고 비장의 전 세포 함유물이 방출될때까지 공정을 계속한다. 이러한 비장세포를 10 분 동안 225 × g 로 원심분리에 의하여 3 회 세척한다.

삭제

동시에, 완전한 배지(DMEM, 10 % 비활성화 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨과 10 mM 헤페스 완충제 ; 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 기브코 라보라토리스에서 입수)에서 생장한 각 마우스 또는 랫 비장세포 융합물의 골수세포, Sp2/0-Ag14 또는 Y3-Ag1. 2. 3 의 대수기 배양물을 비슷한 방식으로 세척한다. 비장세포를 골수세포와 조합하고 다시 한번 펠릿화한다. 배지를 세포 펠릿에서 흡인하고 2 ㎖ 의 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG 1500 ; 인디애나 인디아나폴리스에 소재하는 보에링거 만헤임에서 입수)을 1 분 이상 과정에서 세포에 가볍게 혼합한다. 다음 동일한 체적의 2 × P/S/G DMEM 을 서서히 가한다. 세포를 2 분 동안 37 ℃ 에서 융합시킨 다음 부가적으로 6 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 가한다. 세포를 다시 3 분 동안 37 ℃ 에서 정치시킨다. 끝으로, 35 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 세포 현탁액에 첨가하고 세포를 원심분리하여 펠릿화한다. 배지를 펠릿에서 흡입하고 세포를 완전한 배지에 가볍게 재현탁시킨다. 세포를 5 ㎖ 피펫으로 한 방울씩 96-웰 평-저면 조직 배양판(뉴저지 링컨 파크에 소재하는 벡톤 다킨슨 랩웨어에서 입수)위에 살포한다. 판을 37 ℃, 5 % CO₂ 에서 가습 조건하에 밤새 배양한다. 다음날, 동일 체적의 선택 배지를 각 웰에 가한다. 선택 배지는 완전한 배지로 0.1 mM 히폭산틴, 4 × 10^-4 mM 아미노프테린과 1.6 × 10^-2 mM 티미딘으로 구성된다. 융합판을 7 일 동안 배양한 후, 다음 3 일 동안 두 배지를 바꾸고 ; 각 유체 변형후 HAT 선택 배지를 사용한다. 각 잡종-함유 웰로부터 최종 유체 변경후 3 ~ 4 일에 조직 배양 상층액을 취하고 EIA 로 특이한 항체 반응성을 시험한다. 이 프로토콜은 블렉웰 사이언티픽 퍼블리케이션스에서 출판한 Hudson 및 Hay 의 "Practical Immunology, 제 2 판" 에 기재된 내용에 의해서 수정되었다.

실시예 12

조혈의 전구체 세포로 발현되는 OPG 결합 단백질 수용체의 클로닝

생물학적 활성 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316] 을 플루오레신-이소티오시아네이트(FITC)에 접합하여 형광 프로브를 생성시킨다. 4 ℃ 에서 12 시간 동안 1 : 6 몰비로 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 6-플루오레신-5-(및 6) 카르복시아미도 헥산산 석신이미딜 에스테르(오리건 유진에 소재하는 모리큐라 프로브스에서 입수)로 배양하여 형광 표지를 행한다. FITC-표지 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 겔 여과 크로마토그래피하여 더 정제한다. 마우스 골수세포를 분리하고 실시예 10 에 기재된 CSF-1 및 OPG 결합 단백질 [158 - 316] 의 존재하에 배양물에서 배양한다. 마우스 골수세포를 CSF-1(30 ng/㎖)과 OPG 결합 단백질 [158 - 316] (20 ng/㎖)에서 밤새 배양한다. 비-유착 세포를 먼저 제거한 다음 얼음에 저장하고 세포 해리 완충제(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미컬스에서 입수)로 배양하여 남은 유착 세포를 제거하고 비-유착 개체군에 풀한 다음 상술한 바와 같이 FITC-OPG 결합 단백질로 염색한다. 세척하고 0.5 % BSA 를 갖는 PBS 에 현탁시킨 후, 세포를 FITC-OPG 결합 단백질에 노출시키고 세척한 다음 FACS 로 분류한다. FITC-OPG 결합 단백질로 염색한 양성의 세포 개체군을 수집하고 실시예 2 에 기재된 바와 같이 mRNA 을 분리한다. 이 mRNA 제제를 사용하여 실시예 2 에 기재된 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제조한다.

삭제

이 급원에서 생성된 cDNA 라이브러리를 PCT 공고번호 제 WO 97/23614 호와 Simonet 등의 cell 89, 309 - 319(1997)에 이미 기재되어 있는 무작위 EST 서열 분석에 사용한다. 이 방법을 사용하여 새로운 TNFR-관련 단백질을 코드하는 ~2.1 Kb cDNA 을 검출한다. 마우스 ODAR cDNA 긴 오픈리딩프레임은 625 아미노산 잔기의 단백질을 코드하고 TNFR-관련 단백질의 검증 특징 : N-말단에서 소수성 신호 펩티드, 4 개의 종열 시스테인-풍부 반복 서열, 소수성 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 신호표지 도메인을 함유한다. 이 단백질과 다른 TNF 수용체 군의 구성요소와의 상동성과 FITC-표지 OPG 결합 단백질에 결합하는 골수세포에서 이의 발현은 TNF-관련 OPG 결합 단백질에 대한 우수한 수용체인 것으로 예상하게 한다. 이 단백질은 ODAR 또는 파골세포 분화와 활성화 수용체로 표시된다. 핵산 서열과 마우스 ODAR 의 예상되는 아미노산 서열은 도 10 에 나타내었다.

공식적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로 최근 서열을 분석하면, 이 단백질은 RANK[Anderson 등의 Nature 390, 175 - 179 (1997) 참조]로서 알려져 있는 인체 TNFR-관련 단백질의 마우스 동종체임을 나타낸다.

실시예 13

포유동물 세포에서 재조합 ODAR 단백질의 제조

상기 제 WO 97/23614 호와 Simonet 등의 상기문헌에 이미 기재되어 있는 Fc 융합 단백질의 구성과 발현 방법을 사용하여 인체 IgG1 의 Fc 영역에 융합되는 가용성 ODAR 세포외 도메인을 제조한다. 포유동물 세포에서 가용성 ODAR 단백질을 발생시키기 위하여, 마우스 ODAR(아미노산 27-211)의 세포외 도메인을 코드하는 cDNA 를 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 PCR 증폭시킨다 :

20 mM 트리스-HCl pH 8.8, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1 % 트리톤-X 100, 10 μM 의 각 dNTP, 1 μM 의 각 프라이머와 10 ng 의 ODAR cDNA 주형에서 1 단위의 벤트 DNA 폴리머라제(뉴잉글랜드에 소재하는 바이오랩스에서 입수)를 50 ㎕ 의 체적으로 PCR 반응을 행한다. 전체 16 주기로하여, 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 55 ℃ 와 1 분 동안 72 ℃ 에서 반응을 행한다. PCR 단편을 전기영동에 의하여 분리한다. PCR 단편은 5' 말단에서 Hind Ⅲ 제한 부위와 3' 말단에서 NotI 제한 부위를 갖는다. 상기 제 WO 97/23614 호와 Simonet 등의 상기문헌에 이미 기재되어 있는 인체 IgG-γ1 중쇄 서열전에 변이된 pCEP4-Fc 벡터내로 HindⅢ-NotI 절단 PCR 단편을 골격내에 서브클론화한다. ODAR 세포외 도메인과 IgG Fc 영역사이의 접합부에 걸쳐 두 개의 관련없는 아미노산을 코드하는 링커를 도입한다.

삭제

구조물을 NheI, HindⅢ 로 절단한 다음 OPG 신호 펩티드를 코드하는 다음의 어닐링된 올리고뉴클레오티드 쌍(아미노산 1 - 21)을 골격내에 삽입한다 :

두 부적절한 아미노산을 코드하는 링커를 OPG 신호 펩티드와 ODAR 서열 사이에 삽입한다. 최종 계획된 구조(ODAR-Fc/pCER4) 는 아미노 말단에서부터 카르복시 말단까지를 함유하는 융합 단백질을 코드한다 ; OPG 신호 펩티드 (아미노산 1-21)-링커 (LysLeu)-ODAR (아미노산 27 - 211)-링커 (AlaAla)-인체 IgG Fc.

삭제

Ausubel 등의 Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9. 1. 1-9. 1. 3, (1994)에 기재된 인산 칼슘 방법에 의하여 구조물을 293-EBNA-1 세포로 트랜스펙션한다. 트랜스펙션된 세포를 200 μg/㎖ 하이그로마이신(기브코 비알엘에서 입수) 에서 선택한 다음 생성한 약제-저항성 대량 배양물을 모으고 컨플루언시로 생장시킨다. 세포를 PBS 로 한 번 세척한 다음, 72 시간 동안 무-혈청 배지에서 배양한다. 조절된 배지를 수집한다. 배지에서 ODAR-Fc 융합 단백질을 항-인체 IgG Fc 항체로 웨스턴 블롯 분석하여 검출한다.

제조자가 권한 방법을 사용하여 단백질-A 컬럼 크로마토그래피(피어스에서 입수)에 의하여 Fc 융합 단백질을 정제한다. 50 몰의 정제된 단백질을 Matsudaira 등의 J. Biol. Chem. 262, 10 - 35(1987)에 기술된 자동화 에드맨 분해에 의한 N-말단 서열을 갖게한다. 아미노산 서열은 10 주기후 다음과 같이 판독된다 :

NH₂-K L V T L Q V T P-CO₂H.

OPG 결합 단백질을 갖는 ODAR-Fc 의 결합 활성은 실시예 2 에 기재된 트랜스펙션된 COS-7 세포 배양물의 면역형광염색에 의하여 검사한다. 마우스 OPG 결합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 1 ㎍ 의 발현 벡터로 COS-7 세포를 리포펙션한다. 48 시간 배양한 후, 1 시간 동안 4 ℃ 에서 10 ㎎/㎕ 의 인체 IgG Fc, ODAR-Fc 또는 OPG-Fc 단백질을 함유하는 PBS-FBS 용액으로 세포를 배양한 다음 세포를 PBS 로 2 회 세척한 후, 다른 시간 동안 20 ㎍/㎖ FITC-표지 염소 항-인체 IgG(사우던 바이오테크 어소시에이트스에서 입수)를 함유하는 PBS-FBS 용액에서 배양한다. PBS 로 세척한 후, 공초점 현미경(ACAS, 미시간 오케모스에 소재하는 울티마 인사이트 바이오메디칼 이메이징 인코포레이티드에서 입수)으로 세포를 검사한다. OPGL 트랜스펙트 COS-7 세포(도 11)에 두 ODAR-Fc 와 OPG-Fc 가 결합한다.

삭제

실시예 14

재조합 가용성 ODAR 의 생체외 생물학적 활성

OPG 결합 단백질에 의한 파골세포 형성의 자극을 억제하는 ODAR 의 능력을 CSF-1(30 ng/㎖)과 OPG 결합 단백질(5 ng/㎖)의 존재하에 마우스 골수 배양물로 평가한다. 파골세포 발육을 연구하는 마우스 골수 배양물의 사용 방법은 제 WO 97/23614 호와 실시예 8 에 기재되어 있다. 실시예 12 에 기재된 바와 같이 제조된 ODAR-Fc 융합 단백질을 65 ~ 1500 ng/㎖ 의 농도로 첨가한다. 타르타르산염 저항성 알칼리 포스포타제(TRAP) 세포화학에 의하여 파골세포 형성을 평가하고 배양 5 일후 TRAP 용액을 검정한다. 세포 화학과 TRAP 활성에 의해 ODAR-Fc 융합에 의해 용량 의존적 파골세포 형성 억제가 관찰된다(도 12). ODAR-Fc 융합 단백질은 약 10 - 50 ng/㎖ 의 ED₅₀ 에서 파골세포 형성을 억제한다.

실시예 15

재조합 가용성 ODAR 의 생체내 생물학적 활성

생 후 3 ~ 4 주의 빠르게 생장하는 어린 수컷 BDF1 마우스에 4 일 동안 담체(PBS/0.1 % BSA)하에 매일 일회 피하주사에 의하여 여러가지 투여량의 ODAR-Fc 융합 단백질을 투여한다. 마우스의 X-선 사진을 5 일에 찍는다. 사용되는 ODAR-Fc 융합 단백질의 투여량은 0.5, 1.5 와 5 ㎎/㎏/일 이다. 각 실험에서, 이 마우스 그룹과 PBS/0.1 % BSA 를 투여한 대조그룹 모두를 단일 필름으로 X-선 찰영한다. 대조군 쌍과 처리된 경골 간에 근위 경골 골간단의 영역을 비교하고 처리된 경골이 가시적 평가에 의하여 하기에 표시된 8 스코어를 나타내는 대조군보다 더 조밀하면 "+" 로 표시한다. "양성" 결과에 있어서는 5/8 의 임의 스코어가 요구된다(투여량은 ㎎/㎏/일 로 한다)(n=4).

희생 시킨 후 우측 경골을 각 동물에서 제거하고 근위 경골 골간단에서 골밀도를 주변 정량 컴퓨터 단층촬영법(pQCT) (독일에 소재하는 스트라텍에서 입수)으로 측정한다. 경골의 근위 단부에서 나온 골, 1.5 mm 와 2.0 mm 의 두 0.5 mm 단면을 분석하여(XMICE 5.2, 독일에 소재하는 스트라텍에서 입수) 골간단에서의 전체 골 광물질 밀도를 측정한다. 1500 의 연조직 분리 한계치를 사용하여 골간단의 골의 한계선을 정의한다.

어린 생장 마우스에 ODAR-Fc 를 투여하면 방사선 사진에서 가시적으로 분명하게 볼 수 있는 증가된 골밀도의 영역을 생성시키는 근위 경골 생장 판에서 골흡수를 억제한다. 방사선 사진의 변화는 두 실험(표 1)에 있어 1.5 ㎎/㎏/일과 그 이상에서 볼 수 있다. 경골의 유사한 영역의 이차 실험에서 시료의 pQCT 에 의하여 골밀도를 측정하면 이들 마우스의 골밀도 증가(도 13)는 투여량에 따름을 확인했다.

삭제

본 발명을 바람직한 실시형태에 의하여 설명했으며, 본 분야의 숙련자들은 수정 및 변경을 할 수 있음을 이해 할 것이다. 그러므로 첨부된 특허 청구의 범위는 청구된 본 발명의 범위내에 있는 이러한 모든 동등한 변경을 포함하고 있다.

SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> Osteoprotegerin Binding Proteins and Receptors <130> PC12X039 (A-451-KR-PCT - 2012-06-19) <140> 10-1999-7009492 <141> 1998-04-15 <150> PCT/US98/07584 <151> 1998-04-15 <150> 09/052,521 <151> 1998-03-30 <150> 08/880,855 <151> 1997-06-23 <150> 08/842,842 <151> 1997-04-16 <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2295 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (158)..(1105) <400> 1 gagctcggat ccactactcg acccacgcgt ccggccagga cctctgtgaa ccggtcgggg 60 cgggggccgc ctggccggga gtctgctcgg cggtgggtgg ccgaggaagg gagagaacga 120 tcgcggagca gggcgcccga actccgggcg ccgcgcc atg cgc cgg gcc agc cga 175 Met Arg Arg Ala Ser Arg 1 5 gac tac ggc aag tac ctg cgc agc tcg gag gag atg ggc agc ggc ccc 223 Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu Glu Met Gly Ser Gly Pro 10 15 20 ggc gtc cca cac gag ggt ccg ctg cac ccc gcg cct tct gca ccg gct 271 Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 25 30 35 ccg gcg ccg cca ccc gcc gcc tcc cgc tcc atg ttc ctg gcc ctc ctg 319 Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met Phe Leu Ala Leu Leu 40 45 50 ggg ctg gga ctg ggc cag gtg gtc tgc agc atc gct ctg ttc ctg tac 367 Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Ile Ala Leu Phe Leu Tyr 55 60 65 70 ttt cga gcg cag atg gat cct aac aga ata tca gaa gac agc act cac 415 Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser Glu Asp Ser Thr His 75 80 85 tgc ttt tat aga atc ctg aga ctc cat gaa aac gca ggt ttg cag gac 463 Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn Ala Gly Leu Gln Asp 90 95 100 tcg act ctg gag agt gaa gac aca cta cct gac tcc tgc agg agg atg 511 Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro Asp Ser Cys Arg Arg Met 105 110 115 aaa caa gcc ttt cag ggg gcc gtg cag aag gaa ctg caa cac att gtg 559 Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val 120 125 130 ggg cca cag cgc ttc tca gga gct cca gct atg atg gaa ggc tca tgg 607 Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala Met Met Glu Gly Ser Trp 135 140 145 150 ttg gat gtg gcc cag cga ggc aag cct gag gcc cag cca ttt gca cac 655 Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu Ala Gln Pro Phe Ala His 155 160 165 ctc acc atc aat gct gcc agc atc cca tcg ggt tcc cat aaa gtc act 703 Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr 170 175 180 ctg tcc tct tgg tac cac gat cga ggc tgg gcc aag atc tct aac atg 751 Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met 185 190 195 acg tta agc aac gga aaa cta agg gtt aac caa gat ggc ttc tat tac 799 Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr 200 205 210 ctg tac gcc aac att tgc ttt cgg cat cat gaa aca tcg gga agc gta 847 Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His Glu Thr Ser Gly Ser Val 215 220 225 230 cct aca gac tat ctt cag ctg atg gtg tat gtc gtt aaa acc agc atc 895 Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile 235 240 245 aaa atc cca agt tct cat aac ctg atg aaa gga ggg agc acg aaa aac 943 Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Asn 250 255 260 tgg tcg ggc aat tct gaa ttc cac ttt tat tcc ata aat gtt ggg gga 991 Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly 265 270 275 ttt ttc aag ctc cga gct ggt gaa gaa att agc att cag gtg tcc aac 1039 Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile Ser Ile Gln Val Ser Asn 280 285 290 cct tcc ctg ctg gat ccg gat caa gat gcg acg tac ttt ggg gct ttc 1087 Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe 295 300 305 310 aaa gtt cag gac ata gac tgagactcat ttcgtggaac attagcatgg 1135 Lys Val Gln Asp Ile Asp 315 atgtcctaga tgtttggaaa cttcttaaaa aatggatgat gtctatacat gtgtaagact 1195 actaagagac atggcccacg gtgtatgaaa ctcacagccc tctctcttga gcctgtacag 1255 gttgtgtata tgtaaagtcc ataggtgatg ttagattcat ggtgattaca caacggtttt 1315 acaattttgt aatgatttcc tagaattgaa ccagattggg agaggtattc cgatgcttat 1375 gaaaaactta cacgtgagct atggaagggg gtcacagtct ctgggtctaa cccctggaca 1435 tgtgccactg agaaccttga aattaagagg atgccatgtc attgcaaaga aatgatagtg 1495 tgaagggtta agttcttttg aattgttaca ttgcgctggg acctgcaaat aagttctttt 1555 tttctaatga ggagagaaaa atatatgtat ttttatataa tgtctaaagt tatatttcag 1615 gtgtaatgtt ttctgtgcaa agttttgtaa attatatttg tgctatagta tttgattcaa 1675 aatatttaaa aatgtctcac tgttgacata tttaatgttt taaatgtaca gatgtattta 1735 actggtgcac tttgtaattc ccctgaaggt actcgtagct aagggggcag aatactgttt 1795 ctggtgacca catgtagttt atttctttat tctttttaac ttaatagagt cttcagactt 1855 gtcaaaacta tgcaagcaaa ataaataaat aaaaataaaa tgaatacctt gaataataag 1915 taggatgttg gtcaccaggt gcctttcaaa tttagaagct aattgacttt aggagctgac 1975 atagccaaaa aggatacata ataggctact gaaatctgtc aggagtattt atgcaattat 2035 tgaacaggtg tcttttttta caagagctac aaattgtaaa ttttgtttct tttttttccc 2095 atagaaaatg tactatagtt tatcagccaa aaaacaatcc actttttaat ttagtgaaag 2155 ttattttatt atactgtaca ataaaagcat tgtctctgaa tgttaatttt ttggtacaaa 2215 aaataaattt gtacgaaaac ctgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg gcggccgctc 2275 tagagggccc tattctatag 2295 <210> 2 <211> 316 <212> PRT <213> Mouse <400> 2 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Gly Lys Tyr Leu Arg Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Pro His Glu Gly Pro Leu His Pro 20 25 30 Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser 35 40 45 Met Phe Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser 50 55 60 Ile Ala Leu Phe Leu Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile 65 70 75 80 Ser Glu Asp Ser Thr His Cys Phe Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu 85 90 95 Asn Ala Gly Leu Gln Asp Ser Thr Leu Glu Ser Glu Asp Thr Leu Pro 100 105 110 Asp Ser Cys Arg Arg Met Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln Lys 115 120 125 Glu Leu Gln His Ile Val Gly Pro Gln Arg Phe Ser Gly Ala Pro Ala 130 135 140 Met Met Glu Gly Ser Trp Leu Asp Val Ala Gln Arg Gly Lys Pro Glu 145 150 155 160 Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser 165 170 175 Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp 180 185 190 Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Leu Ser Asn Gly Lys Leu Arg Val Asn 195 200 205 Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His His 210 215 220 Glu Thr Ser Gly Ser Val Pro Thr Asp Tyr Leu Gln Leu Met Val Tyr 225 230 235 240 Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu Met Lys 245 250 255 Gly Gly Ser Thr Lys Asn Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe Tyr 260 265 270 Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ala Gly Glu Glu Ile 275 280 285 Ser Ile Gln Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp Ala 290 295 300 Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Gln Asp Ile Asp 305 310 315 <210> 3 <211> 2274 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (185)..(1135) <400> 3 aagcttggta ccgagctcgg atccactact cgacccacgc gtccgcgcgc cccaggagcc 60 aaagccgggc tccaagtcgg cgccccacgt cgaggctccg ccgcagcctc cggagttggc 120 cgcagacaag aaggggaggg agcgggagag ggaggagagc tccgaagcga gagggccgag 180 cgcc atg cgc cgc gcc agc aga gac tac acc aag tac ctg cgt ggc tcg 229 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser 1 5 10 15 gag gag atg ggc ggc ggc ccc gga gcc ccg cac gag ggc ccc ctg cac 277 Glu Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His 20 25 30 gcc ccg ccg ccg cct gcg ccg cac cag ccc ccc gcc gcc tcc cgc tcc 325 Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser 35 40 45 atg ttc gtg gcc ctc ctg ggg ctg ggg ctg ggc cag gtt gtc tgc agc 373 Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser 50 55 60 gtc gcc ctg ttc ttc tat ttc aga gcg cag atg gat cct aat aga ata 421 Val Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile 65 70 75 tca gaa gat ggc act cac tgc att tat aga att ttg aga ctc cat gaa 469 Ser Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu 80 85 90 95 aat gca gat ttt caa gac aca act ctg gag agt caa gat aca aaa tta 517 Asn Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu 100 105 110 ata cct gat tca tgt agg aga att aaa cag gcc ttt caa gga gct gtg 565 Ile Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val 115 120 125 caa aag gaa tta caa cat atc gtt gga tca cag cac atc aga gca gag 613 Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu 130 135 140 aaa gcg atg gtg gat ggc tca tgg tta gat ctg gcc aag agg agc aag 661 Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys 145 150 155 ctt gaa gct cag cct ttt gct cat ctc act att aat gcc acc gac atc 709 Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile 160 165 170 175 cca tct ggt tcc cat aaa gtg agt ctg tcc tct tgg tac cat gat cgg 757 Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg 180 185 190 ggt tgg gcc aag atc tcc aac atg act ttt agc aat gga aaa cta ata 805 Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile 195 200 205 gtt aat cag gat ggc ttt tat tac ctg tat gcc aac att tgc ttt cga 853 Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg 210 215 220 cat cat gaa act tca gga gac cta gct aca gag tat ctt caa cta atg 901 His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met 225 230 235 gtg tac gtc act aaa acc agc atc aaa atc cca agt tct cat acc ctg 949 Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu 240 245 250 255 atg aaa gga gga agc acc aag tat tgg tca ggg aat tct gaa ttc cat 997 Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His 260 265 270 ttt tat tcc ata aac gtt ggt gga ttt ttt aag tta cgg tct gga gag 1045 Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu 275 280 285 gaa atc agc atc gag gtc tcc aac ccc tcc tta ctg gat ccg gat cag 1093 Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln 290 295 300 gat gca aca tac ttt ggg gct ttt aaa gtt cga gat ata gat 1135 Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 305 310 315 tgagccccag tttttggagt gttatgtatt tcctggatgt ttggaaacat tttttaaaac 1195 aagccaagaa agatgtatat aggtgtgtga gactactaag aggcatggcc ccaacggtac 1255 acgactcagt atccatgctc ttgaccttgt agagaacacg cgtatttaca gccagtggga 1315 gatgttagac tcatggtgtg ttacacaatg gtttttaaat tttgtaatga attcctagaa 1375 ttaaaccaga ttggagcaat tacgggttga ccttatgaga aactgcatgt gggctatggg 1435 aggggttggt ccctggtcat gtgccccttc gcagctgaag tggagagggt gtcatctagc 1495 gcaattgaag gatcatctga aggggcaaat tcttttgaat tgttacatca tgctggaacc 1555 tgcaaaaaat actttttcta atgaggagag aaaatatatg tatttttata taatatctaa 1615 agttatattt cagatgtaat gttttctttg caaagtattg taaattatat ttgtgctata 1675 gtatttgatt caaaatattt aaaaatgtct tgctgttgac atatttaatg ttttaaatgt 1735 acagacatat ttaactggtg cactttgtaa attccctggg gaaaacttgc agctaaggag 1795 gggaaaaaaa tgttgtttcc taatatcaaa tgcagtatat ttcttcgttc tttttaagtt 1855 aatagatttt ttcagacttg tcaagcctgt gcaaaaaaat taaaatggat gccttgaata 1915 ataagcagga tgttggccac caggtgcctt tcaaatttag aaactaattg actttagaaa 1975 gctgacattg ccaaaaagga tacataatgg gccactgaaa tctgtcaaga gtagttatat 2035 aattgttgaa caggtgtttt tccacaagtg ccgcaaattg tacctttttt tttttttcaa 2095 aatagaaaag ttattagtgg tttatcagca aaaaagtcca attttaattt agtaaatgtt 2155 atcttatact gtacaataaa aacattgcct ttgaatgtta attttttggt acaaaaataa 2215 atttatatga aaaaaaaaaa aaaagggcgg ccgctctaga gggccctatt ctataggct 2274 <210> 4 <211> 317 <212> PRT <213> Human <400> 4 Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu 1 5 10 15 Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala 20 25 30 Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met 35 40 45 Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val 50 55 60 Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn 85 90 95 Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile 100 105 110 Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln 115 120 125 Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys 130 135 140 Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu 145 150 155 160 Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro 165 170 175 Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly 180 185 190 Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val 195 200 205 Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His 210 215 220 His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val 225 230 235 240 Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met 245 250 255 Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe 260 265 270 Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 285 Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp 290 295 300 Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp 305 310 315 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 5 gttctcctca tatggatcca aaccgtattt ctgaagacag cactcactgc tt 52 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <400> 6 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 7 atttgattct agaaggagga ataacatatg catgaaaacg caggtctgca g 51 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 8 tatccgcgga tcctcgagtt agtctatgtc ctgaactttg aa 42 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 9 atttgattct agaaggagga ataacatatg tctgaagaca ctctgccgga ctcc 54 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 10 tatccgcgga tcctcgagtt agtctatgtc ctgaactttg aa 42 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 11 atttgattct agaaggagga ataacatatg aaacaagctt ttcagggg 48 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 12 tatccgcgga tcctcgagtt agtctatgtc ctgaactttg aa 42 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 13 atttgattct agaaggagga ataacatatg aaagaactgc agcacattgt g 51 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 14 tatccgcgga tcctcgagtt agtctatgtc ctgaactttg aa 42 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 15 atttgattct agaaggagga ataacatatg cagcgtttct ctggtgctcc a 51 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 16 tatccgcgga tcctcgagtt agtctatgtc ctgaactttg aa 42 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 17 gttctcctca tatggaaggt tcttggttgg atgtggccca 40 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 18 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 19 gttctcctca tatgcgtggt aaacctgaag ctcaaccatt tgca 44 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 20 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 21 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 21 gttctcctca tatgaaacct gaagctcaac catttgcaca cctcaccatc aat 53 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 22 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 23 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 23 gttctcctca tatgcattta actattaacg ctgcatctat cccatcgggt tcccataaag 60 tcact 65 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 24 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 25 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 25 gttctcctca tatgactatt aacgctgcat ctatcccatc gggttcccat aaagtcact 59 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 26 tacgcactcc gcggttagtc tatgtcctga actttga 37 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 27 cctctaggcc tgtactttcg agcgcagatg 30 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 28 cctctgcggc cgcgtctatg tcctgaactt tg 32 <210> 29 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 29 cctctctcga gtggacaacc cagaagcctg aggcccagcc atttgc 46 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 30 cctctgcggc cgcgtctatg tcctgaactt tg 32 <210> 31 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 31 agcttccacc atgaacaagt ggctgtgctg cgcactcctg gtgctcctgg acatca 56 <210> 32 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 32 tcgatgatgt ccaggagcac caggagtgcg cagcacagcc acttgttcat ggtgga 56 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 33 Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 Trp Tyr His Asp Arg Gly Thr Ala Lys Ile Ser 20 25 <210> 34 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 34 Asn Ala Ala Ser Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Thr Leu Ser Ser 1 5 10 15 Trp Tyr His Asp Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Cys 20 25 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 35 Val Tyr Val Val Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Asn Leu 1 5 10 15 Met <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 36 tctccaagct tgtgactctc caggtcactc c 31 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 37 tctccgcggc cgcgtaagcc tgggcctcat tgggtg 36 <210> 38 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 38 ctagcaccat gaacaagtgg ctgtgctgcg cactcctggt gctcctggac atcattgaat 60 ggacaaccca ga 72 <210> 39 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 39 agcttctggg ttgtccattc aatgatgtcc aggagcacca ggagtgcgca gcacagccac 60 ttgttcatgg tg 72 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Oligonucleotide <400> 40 Lys Leu Val Thr Leu Gln Val Thr Pro 1 5

Claims

SEQ ID NO: 2의 오스테오프로테게린 결합 단백질(OPGbp)에 특이적으로 결합하는, 파골세포 형성을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
SEQ ID NO: 4의 오스테오프로테게린 결합 단백질(OPGbp)에 특이적으로 결합하는, 파골세포 형성을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 70 - 316인 OPGbp의 가용 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 69 - 317인 OPGbp의 가용 형태에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 OPGbp의 BB' 루프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 골 흡수를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 키메라 또는 CDR-이식 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, SEQ ID NO: 4의 OPGbp, 그의 막-결합 형태, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 69 - 317인 OPGbp의 가용 형태, 또는 그의 면역원성 단편으로 면역화하여 얻어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코드하는 핵산의 발현에 의해 제조되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 골다공증, 골수염, 칼슘과잉혈증, 외과적 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생하는 골감소증, 파제트병, 골괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화로 인한 골감소증, 보철 분해, 및 골용해 전이로부터 선택되는 골질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
제1항 또는 제2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 골흡수를 억제하기 위한 조성물.
제14항에 있어서, 약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제, 및 보조제 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
제15항에 있어서, 약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제, 및 보조제 중 하나 이상을 포함하는 조성물.
제15항에 있어서, 골흡수가 골다공증, 골수염, 칼슘과잉혈증, 외과적 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생하는 골감소증, 파제트병, 골괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화로 인한 골감소증, 보철 분해, 및 골용해 전이로부터 선택되는 골질환과 관련된 것인 조성물.
제14항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 OPGbp의 막-결합 형태 또는 OPGbp의 가용 형태에 결합하는 것이고, 여기서 가용 형태는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 70 - 316 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 69 - 317인 조성물.
제15항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 OPGbp의 막-결합 형태 또는 OPGbp의 가용 형태에 결합하는 것이고, 여기서 가용 형태는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 70 - 316 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 69 - 317인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 OPGbp, 또는 그의 면역원성 단편에 대해 생성된 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 OPGbp, 또는 그의 면역원성 단편에 대해 생성된 것인 조성물.
제14항에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 2의 OPGbp의 아미노산 잔기 70 - 316 또는 SEQ ID NO: 4의 OPGbp의 아미노산 잔기 69 - 317에 대해 생성된 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항체가 SEQ ID NO: 2의 OPGbp의 아미노산 잔기 70 - 316 또는 SEQ ID NO: 4의 OPGbp의 아미노산 잔기 69 - 317에 대해 생성된 것인 조성물.
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SEQ ID NO: 4의 오스테오프로테게린 결합 단백질(OPGbp), 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 158 - 317부터 아미노산 잔기 69 - 317까지의 OPGbp의 가용 형태의 존재하에 파골세포가 형성되는 조건하에 시험 화합물을 첨가하여, 파골세포 형성을 측정하는 것을 포함하고, 시험 화합물의 존재하에 파골세포 형성의 감소는 상기 시험 화합물이 OPGbp의 활성을 감소시킴을 의미하는 것인, OPGbp 활성을 감소시키는 화합물을 확인하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 시험 화합물이 SEQ ID NO: 4의 OPGbp에 결합하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 시험 화합물이 OPGbp의 가용 형태에 결합하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 시험 화합물이 골밀도를 증가시키는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 시험 화합물이 골흡수를 감소시키는 것인 방법.
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