PT975754E

PT975754E - Proteínas e receptores para as proteínas de ligação de osteoprotegerina

Info

Publication number: PT975754E
Application number: PT98918244T
Authority: PT
Inventors: William J Boyle
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2007-08-20
Also published as: JP2009001566A; MEP32808A; RO122495B1; US20050003400A1; US6316408B1; CN103990122A; EP2311955A2; US20030100488A1; CY1108998T1; CN103990122B; JP2013028622A; US7807795B2; YU50699A; KR101314478B1; CA2706609A1; IL132304A; KR20120108046A; KR101328809B1; ME00184B; KR20010006405A

Description

PROTEÍNAS E RECEPTORES DE PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A

OSTEOPROTEGERINA teifeito da Invenção A presente invenção tem por objecto polipéptidos que estão envoividos na diferenciação de osteoclastos. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto proteínas de ligação a usteoprotegerina, ácidos nucleicos que codificam as proteínas, vectores de expressão e células hospedeiras para a produção das proteínas e ensaios de ligação. As composições e os processos para o tratamento de doenças ósseas, tais como osteoporose, perda Cssea resultante de artrite, doença de Paget e hipercalcémia, constituem também objectos da presente invenção. A presente invenção também tem por objecto receptores para as proteínas de ligação a ostecprotegerina e processos e composições para o tratamento de doenças ósseas, utilizando os receptores.

Antecedentes da invenção 0 tecido vivo do osso exibe um equilíbrio dinâmico entre a deposição e a reabsorção do osso. Estes processos são mediados principalmente por dois tipos de células: osteoblastos, que segregam as que compreendem a matriz orgânica do osso; e csteoclmstosq que promovem a dissolução da matriz óssea e o dos sais do osso, Em indivíduos jovens, com o crescimento do osso, a taxa de íMposiqSft de asso excede a taxa de reabsorção do osso, enquanto que em indivíduos mais velhos, a taxa de reabsorção pode exceder a de deposição. Nesta Última situação, a crescente diminuição do osso leva a uma massa óssea reduzida e aumenta o risco de fracturas e ou repara de forma lenta ou incompleta os ossos partidos.

Os osteociastcs são células multínucleadas, grandes, fagocíticas, que são formadas a partir de células percursoras hematopoíéticas na medula óssea. Õmbors o crescimento e a formação de osteoclastos funcionais maduros não seja bem compreendida, pensa-se que os sstsçç· se torram maduros em conjunto com as linhas de células de monócitos/macrófagos em resposta a exposição a vários factores promotores do crescimento. 0 desenvolvimento precoce das células precursoras da medula óssea para se transformarem em pré-osteoclastos, crê-se que é mediado por factores solúveis, tais como, o factor a da necrose do tumor (FNT-a), o factor £ da necrose do tumor (FNT-β), a interleucina 1 (IL-1), a interleucina 4 (IL-4), a interieucina 6 (IL-6) e o factor inibidor de leucemia . Em cultura, os pré-osteoclastos formam-se na presença do factor de estimulação de colónias de macrófagos adicionados (FEC-M). Estes factores actuam principalmente nas primeiras etapas do desenvolvimento dos osteoclastos. 0 envolvimento de factores de pclipéptidos nos estados terminais da formação de osteoclastos, ainda não foi reportado de uma forma extensiva. Já foi relatado, contudo, que a hormona da paratíróide estimula a formação e a actividade de osteoclastos e que a calcitonina tem o efeito oposto, embora sus menor extensão.

Recentemente, foi descrito um -ãm-o factor de N°S. polipéptido, designado por osteoprotegerina (OPG), que regula tequíflia fqrqqçáo de osteoclastos in vitro e tu vivo (ver, as patentes de invenção norte-americanas U.5» registada em 22 de Dezembro de 1995, Ou/'?í> registada em 3 de Setembro de 1996 e 01/7?I+-7 77, registada em W de Dezembro de 1996, co-pendentes e co-atribuídas, aqui incorporadas como referência; e o pedido de patente de invenção PCT N°. WQ Ιο/ΟνΙΠ!;, A CPG aumentou drasticamente a densidade óssea » ratos transgénicos que expressam o polipéptido de OPG e reduziu a extensão aa perda óssea quando administrada a ratos, a que foram retirados os ovários. Uma análise da actividade de OPG na formação de osteoclastos ín vitro revelou que a OPG não interfere com 3 crescimento e a diferenciação dos percursores de monócitos/macrófagos, mas provavelmente bloqueia a diferenciação dos osteoclastoç dos percursores dos monócitos/macrófagos. Assim, a OPG parece ter uma especificidade na da extensão da formação de osteoclastos. A OPG compreende dois domínios de polipéptidos com diferentes propriedades estruturais e funcionais. O domínio do terminal amino estende-se desde cerca dos resíduos 22 até cerca de 194 do polipéptido de comprimento completo (a metionina do terminal N e designada por resíduo 1) e mostra homologia com outros membros da família dos receptores do factor da necrose do tumor (R-FNT), especialmente R-FNT2, através da conservação de domínios ricos em cisteína, característicos dos elementos da família dos R-FNT. O domínio do terminal carboxi estende-se desde os resíduos 194 a 401 e não tem uma homologia significativa com nenhuma dãs sequências conhecidas. Ao contrario de um certo número de outros elementos da família dos R-FNT, a OPG parece ser •vccius , v-vív;:: v proteína segregada e não parece pco*· r ser sintetizada como forma associaaa à membrana. 0« bm s-ca actividade ceso regulador negativo nc dss báGéççiaçfpobzuXbu-sb que a OPG pode ligar—se a um factor de polipéptido envolvido na diferenciação de osteoclastos e, por isso, bloqueia uma ou mais das etapas terminais que levam à formação de um osteoclasto maduro.

Constitui por isso um objecto da presente invenção identificar polipéptidos que interagem com a OPG. Os referidos polipéptidos podem desempenhar um papel na íiaticsuçlo dòâ osteoclastos e poetem ser úteis no tratamento das doenças ósseas.

Sumário da Invenção

Identificou-se um novo membro da família dos factores da necrose do tumor a partir de uma biblioteca de ADNc de murino, expressa em células COS avaliadas utilizando uma proteína de fusão de OPG-Fc recombinante, como uma sonda de afinidade. 0 novo polipéptido é uma proteína de ligação a OPG da transmembrana, que é previsível que tenha 316 aminoácidos de comprimento e tenha um domínio citoplásmico do terminal amino, um domínio de transmembrana e um domínio extracelular do terminal de carboxi. As proteínas de ligação a OPG da presente invenção podem estar associadas a membrana ou podem estar sob uma forma solúvel. A presente invenção tem por objecto ácidos nueleicos que codificam uma proteína de ligação a OPG, vectores e células hospedeiras que expressam o polipéptido e processos pora a produção de ama proteína recombinante de ligação a OPG. o.ms; por o&jsetb anticorpos ou os seus fragmentos que se ligam especificamente a proteína de .aiplldo de OPG.

As proteínas de liueúpAo a ΐ - i dera ser utilizadas em ensaios para os níveis de OPG em amostras 0:1:::1-601000,. identificar ollodóA c tecidos que exibem a proteína de Ligação a SPG e identificar novos elementos da família das proteínas de ligação a OPG sm novas OPGs. Os processos de identificação dcs compostos que interagem com a proteína de ligação de OPG, constituem também objecto da presente invenção. Esses compostos incluem ácidos nucleicos, pêpbiaotí proteínas, hidratos Po caiitdíb:) * lípidos ou moléculas átqâxá.Qã't de baixo peso molecular e podem actuar quer como agonistas, quer antagonistas da actividade dõ proteína de ligação de OPG.

As proteínas de ligação a OPG estão envolvidas na diferenciação de osteoelastos e o nível de actividade dos oçteoclastos, por sua vez, modulam a reabsorção do osso. Os agonistas e os antagonistas da proteína de ligação de OPG, modulam a formação de osteoelastos e a reabsorção do osso e podem ser utilizados para tratar doenças ósseas, caracterizadas por alterações na reabsorção óssea, tais como, osteoporose, hipercalcémía, perda óssea devida a metástases de artrite, imobilização ou doença periodontal, doença de Paget, osteopetrose, perda prostetica e similares. As composições farmacêuticas que compreendem proteínas de ligação a OPG e agonistas e antagonistas de proteínas de ligação de OPG constituem também objecto da presente invenção.

Os receptores para as proteínas de ligação a OPG também têm sido identificados a partir de uma biblioteca de ADNc do Purina construída a partir de células da medula Sssea, que se ligam a uma proteína m. ligação a OPG marcada por fluorescência. Os receptores pPiltiP ser dóiiioõdos para identificar agonistas e antagonistas das interaeções da proteína de ligação a CPG com o seu receptor, que poetem ser sitili-iádriis para tratar doenças ósseas.

Descrição das Figuras

Figuras 1 A-F. Estrutura e sequência da inserção .32D-F3 que codifica a proteína de ligação de OPG. C domínio ptéwi&iiM da transmembrana e os sítios para as cadeias ds hídratos de carbono ligados a asparagina, uotim sublinhados.

Figuras 2 A-C. Expressão de ligação âs. proteína de OPG em células COÇ-7 transfectadas com pADNc/32D-F3. As células foram lípofectadas com pADNc/32D-F3 ADN, sendo que o ensaio de ligação para qualquer um dos conjugados de fosfatase alcalina de IgGl, anti-humana, de cabra (apenas secundário), OPG [22-201]-Fc humano mais secundário (OPG-Fc) ou uma proteína de fusão Fc do domínio extracelular quimérico de ATAR (sATAR-Fc). ATAR é um novo membro da super-família dos R-FNT e a proteína de fusão sATAR-Fc serve como um controlo tanto para a ligação do domínio Fc de IgGl humana; como da proteína genérica relacionada com R-FNT, ligação a moléculas de superfície das células 32D.

Figura 3. Expressão da proteína de ligação a OPG em tecidos humanos. A anaiise de transferência para a matriz de Northern íàDR/MIfe; de ARNm de tecido humano (Clontech)5 utilizando uma sonda de hibridização derivada de 32D-F3 marcada com rádio. A mas» molecular x:ei*i ova esta isbiossa á esquerda em pares de quilobase As setas no lado direito indicam a mtgrdçs© ae um transcrito de ,4·.:. th xoocnovo d 0 ;L-S kb dotíuooado no ARNm de nódulos ae linfa, Idsiiêm se detectou uma banda estranha da mesma massa no fígado fetal.

Figuras 4 A-F. Estrutura e sequência do pADNc/OPG humana, inserção de 1,1 pb codificando a proteína de ligação humana de OPG. 0 domínio previsto da transmembrana e o sítio para as cadeias de hidrato de carbono ligadas à asparagina, esta sublinhado.

Figure 5. Estimulação do desenvolvimento do osteoclasto ín vitro a partir de macrófagos da medula óssea e co-culturas de células ST2 tratadas com a proteína de ligação a OPG de murino, recombínante [158-316]. Trataram-se as culturas com concentrações variadas da proteína de ligação a OPG de murino, variando de 1,6 a 500 ng/mL. Passados 8-10 dias, fez-se a lise das culturas e mediu-se a actividade de TRAP por meio de um ensaio em solução. Além disso, trataram-se simultaneamente algumas culturas com 1, 10, 100, 500 e 1.000 ng/mL de OPG 122-4011-proteína de Fc, recornbinante, de murino. A proteína de ligação a OPG de murino induz uma estimulação dependente da dose na formação de osteoclastos, enquanto que OPG [22-401]-Fc inibe a formação de osteoclastos.

Figura 6. Estimulação do desenvolvimento de osteoclastos a partir de percursores de medula óssea in vitro, na presença de FEC-M e proteína de ligação a OPG de sirino 8-31 Colheu-se a medula óssea de ratos e fez-se uma cultura, na presença de 250, 500, l.OSé e 2.000 U/mL de FEC-M. Variando as concentrações da proteína de ligação a OPG [158-316], w inhco de 1,6 a 500 cg/rli, foram adicionadas às mesmas culturas. D desenvolvimento de osteoclastos, foi medido por meio de um ensaio em solução C-v: AAA.A,

Figuras 7 A-C. Csteoclastos derivados de células de medula óssea na presença tanto de FEC-M como da proteína de ligação a OPG [Χ5·'8”316], reabsorvem osso ín viíro. As células de medula óssea tratadas quer com FEC-M, quer com proteína de ligação a OPG ou com ambos os factores combinados, foram postos em placas e fizeram-se lâminas de osso em microtubos de cultura e deixou-se desenvolver, para se obter osteoclastos maduros. As culturas resultantes foram então coradas com azul de toluidina (coluna da esquerda) ou histoquimicamente para detectar a actividade da enzima de TRAP (coluna da direita). Nas culturas que receberam ambos os factores, formaram-se osteoclastos maduros, que foram capazes de erodir o osso conforme se pode ver pela presença de pintas coradas de azul na superfície do osso. Isto está correlacionado com a presença de células múltiplas, grandes, multinucleadas, positivas de TRAP.

Figura 8. Gráfico que mostra os níveis de cálcio ionizado (Cai) no sangue completo, de ratos injectados com a proteína de ligação de OPG, 51 horas após a primeira injecção e em ratos que receberam ao mesmo tempo CPG. A proteína de ligação a OPG aumentou significativamente e de uma forma dependente da dose os níveis de Cai. A OPG (1 mg/kg/dia) bloqueou completamente o aumento de Cal numa dose de proteína de ligação a CEG de 5 pg/dia e bloqueou parcialmente c aumento, numa dcse de proteína de ligação a OPG de 25 μρ/Ρίο. , diferente para o controlo tratado com vudoulo (p <<g 111. t o nível de Cãi tratado com OPG é slgtdfic-stávdmsfptíí òifíorsttú do nível em ratos ãue receberam essa dose da proteína os ligação a OPG de forma isolada (p ,05).

Figuras 9 A-D. Radiografias do fémur e da tíbia esquerdas em rates tratados com 0, 5, 25 ou 103 pg/dia de proteína de ligação de OPG, durante dias. Há um decréscimo dependente da aose na densidade do osso, evidente e mais claro na metáfise da tíbia proximal destes ratos e que é profundo de ama dose de 100 ορό:;!!».

Figuras 10 A-F. Sequência de ADNc de ODAR de murino e sequência da proteína. Mostra-se a sequência de ácidos nucleicos do clone de ADNc de -2,1 kb e a tradução da secção de leitura aberta com um comprimento de 625 resíduos, indicada antes. 0 péptido de sinal hidrofóbíco está sublinhado e a sequência hidrofóbica da transmembrana (resíduos 214-234), está a negrito. Os resíduos de cisteína que englobam os elementos repetitivos ricos em cisteína no domínio extracelular, estão a negrito.

Figuras 11 A-C. Coloração por imunofluorescência da ligação de ODAR-Fc às células transfectadas pela proteína de ligação de OPG. As células de COS-7 transfectadas com o plasmido de expressão da proteína de ligação de OPG, foram incubadas com IgG-Fc humano (painel de cima), ODAR-Fc (painel do meio) ou OPG-Fc (painel de baixo) . Utilizou-se um anticorpo de IgG-Fc anti-humano, de cabra, marcado com FITC como um anticorpo secundário. Examinaram-se as células de i:igííçâ:o positiva por ívi.cmscosia uuetfomml

Figuras 12 0--0, Efeitos de ODAR-Fc na permuto de a partir de medula óssea de rato ín oouto.. as culturas de medula óssea de murino, tal como no exemplo 8 e expuseram-se à proteína de lígtiçSo a OPG (5 e CSF-1 (30 tg/qy r Adicionaram- se várias concentrações de ODAR-Fc variando de 1.500 ng/raL até 65 ng/mL. Avaliou-se a formação dos osteoclastos por citoquímica de TRAP e o ensaio da solução de TRAP após 5 dias em cultura.

Figura 13. Densidade mineral dos ossos em ratos, após o tratamento durante 4 dias com ODAR-Fc em doses variadas. Os ratos receberam ODAR-Fc por injecção subcutânea diária num veiculo de solução salina tampcnada com fosfato. Determinou-se a densidade mineral dos ossos fixados em ETOH a 70 % na metáfise da tibia proximal de ratos, por tomografia computorizada, quantitativa, periférica (TCQp) Norland Medicai Systems, Ft Atkinson, WI). Analisaram-se duas secções transversais do osso de 0,5 mm, 1,5 mm e 2,0 mm da extremidade proximal da tibia (XMICE 5.2, Stratec, Alemanha), para determinar a densidade mineral total do osso na metáfise. Utilizou-se um limiar de separação do tecido mole de 1.500 para definir a fronteira do osso metafisial. ODAR-Fc produziu um aumento significativo na densidade mineral do osso na metáfise da tibia proximal numa forma dependente da dose. Grupo n = 4.

Descrição Detalha da Invenção A presente invenção tem por objecto um polipéptido referido como uma proteína de Ligação de OPG, que liga especificamente OPG e está envolvida na diferenciação dos osteoclastos. Identificou-se um clone de ADNc que codifico a forma do polipéptido de murino a partir de uma biblioteca preparada ai da linha de uéirrlã:* mítilóZmiiçipiticss de

rato 32-D e transfectaram-se em células de COS. Avaliaram-se os transfectantes quanto à sua capacidade para se ligarem o um polipéptido dê fação do OPG [22-201] -Fc (exemplo I) . A sequência de ácidos nucleicos, revelou que a proteína de ligação a OPG é um novo membro da família dos FNT e está mais próxima de AGP-1, um polipéptido previamente descrito na patente de invenção norte-americana U.S. N°. 08/660.562, co-pendente, de propriedade mista, registada em 7 de Junho de 1996. (Um polipéptido idêntico a AGP-I e designado por TRAIL, esta descrito em Wiley et al. Immunity 3, 673-682 (1995)}. £ previsível que a proteína de ligação a CPG seja uma proteína da transmembrana de tipo II com um domínio citoplásmíco nas terminações amíno, um domínio de transmembrana e um domínio extracelular do terminal carboxi (figuras 1 A-F). 0 domínio citoplásmíco de terminal amino expande-se por cerca dos resíduos 1-48, o domínio da transmembrana ocupa os resíduos de 49-69 e o domínio extracelular estende-se por os resíduos próximos de 70-316, conforme se mostra nas figuras 1 A-F (SEÇ ID N°. 2). A proteína associada a membrana liga-se especificamente a OPG (figuras 2 A-C). Assim, a proteína de ligação a OPG e OPG partilham muitas características de um par de receptor/ligando, embora seja possível que existam outros receptores de ocorrência natural para a proteína de ligação de OPG.

Isolou-se um clone de ADN que codifica a proteína humana de ligação a OPG a partir de uma biblioteca de ADNc de nódulos de linfa. A sequência humana (figuras 4 A-E) é homóloga da sequência de murino. A proteína de ligação a OPG de murino, sdlÒPél e purificada estimulou a formação de c-steoclastos m vitro e Ϊ® hipercalcémia e reabsorção do OSSO ΐη Ηϊϋ, reíere-se a com una sequência de amínoácídos da proteína do ligação a OPG da mamífero ou aa: seu fragmento, análogo mm derivado o comportando, pelo menos, a de ligação de OPG. Em enquadramentos preferidos, a proteína de ligação a OPG é Se origem humana ou de murino. Noutro enquadramento, a proteína de ligação a OPG é uma proteína solúvel comportando, numa das suas formas, um domínio extracelular isolado, separado dos domínios citopiãsmico e de transmembrana. A proteína de ligação a OPG está envolvida na diferenciação dcs osteoclastos e na taxa e extensão de reabsorção do osso e verificou-se que estimula a formação de osteoclastos e estimula a reabsorção do osso. Ácidos Nucleicos A presente invenção tem por objecto ácidos nucleicos isolados, que codificam proteínas de ligação de OPG. Tal como se utiliza aqui, a expressão, ácido nucleico, compreende ADNc, ADN genómico, ADN total ou parcialmente sintético e ARN. Os ácidos nucleicos da presente invenção seleccionam-se a partir do grupo que consiste em: os ácidos nucleicos, conforme se mostra nas figuras 1 A-F (SEQ ID N°. 1) e nas figuras 4 A-F (SEQ ID N°. 3); £0 ácidos nucleicos que hibridizam com o polipéptido que codifica as regiões dos ácidos nucleicos mostrados nas figuras 1 A-F (SEQ ID N°. 1) e nas figuras 4 A-F (SEQ ID N°. 3); e permanecem hibridados com os ácidos nucleicos em condições altamente severas; e c) ácidos nucleicos que são degenerados em relação aos ácidos nucleicos de alínea ou alínea (b).

As de ácidos nucleicos eneívem imontó um processo em várias etapas, que compreende uma prbrsdca etapa se hibridação para formar duplexes de ácidos nucleicos a partir de estruturas helicoidais simples seguida de uma segunda etapa de hibridação, realizada em condições mais severas para reter de forma selectiva os dupiexes de ácidos nucleicos que comportam a htitõXõ-ífih desejada. As condições da primeira etapa de hibridação, não são geralmente cruciais, desde que elas não sejam mais severas do que as da segunda etapa de hibridação. Geralmente, a segunda hibridação realiza-se em condições de elevada severidade, em que condições de "alta severidade" referem-se a condições de temperatura e do sal que são cerca de 12-20 "C abaixo da temperatura de fusão hlbç de um híbrido perfeito ou todas as estruturas helicoidais complementares correspondentes Is figuras 1 A-F (SEQ ID N°. 2) e às figuras 4 A-F (SEQ ID N°. 4). Num enquadramento, condições de "elevada severidade" referem-se a condições de cerca de 65 "C e não mais do que cerca de In' 1 M. Entende-se que a concentração do sal, a temperatura e/ou o tempo de incubação podem variar quer na primeira etapa de hibridação, quer na segunda, de tal maneira que se obtenham moléculas de ácido nucleico de hibridação de acordo com a presente invenção. As condições para hibridação dos ácidos nucleicos e os cálculos de Tf para os híbridos de ácidos nucleicos estão descritos em Sambrook et al. Molecular Cloninq: A Laboratory Manual Cold Spríng Harbor Laboratory Press, New York (1989).

Os ácidos nucleicos da presente invenção podem hibridizar com parte ou com todos os poiipéptidos que codificam as regiões da proteína de ligação de OPG, conforme mostra nas figuras 1 A-F (SEQ ID N°. 2) e nas figuras 4 A-F (SEQ IO N°. 4); e, por isso, podem ser truncagens ou extensões das sequências de loidos nucleicos que se mostram aqui, Os ácidos nucleicos truncados ou aumentados, estão englobados na presente invenção desde que retenham pelo menos a propriedade de ligação a OPG. enquadramento, o ácido nucleico vai codificar um polipéptido de, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos. Noutro enquadramento, o ácido nucleico ira codificar um polipéptido de, pelo menos, cerca de 20 aminoácidos. Ainda noutro enquadramento, c ácido nucleico vai codificar um polipéptido de, pelo menos, cerca de 50 aminoácidos. Os ácidos nucleicos da biferidaçto podem também incluir sequências não codificantes, localizadas nos terminais 5' e/ou 3' em relação as regiões de codificação da proteína de ligação de OPG. As sequências não oodificantes incluem regiões reguladoras envolvidas na expressão da proteína de Ligação de OPG, tais como, promotores, regiões melhoradoras, sítios de iniciação de tradução, sítios de terminação da transcrição e similares.

Em enquadramentos preferidos, os ácidos nucleicos da presente invenção codificam a proteína de ligação a OPG humana ou de rato. Os ácidos nucleicos podem codificar uma forma de ligação da membrana, da proteína de ligação a OPG ou as suas formas solúveis a que falta uma região funcional da transmembrana. A região da transmembrana prevista para a proteína de ligação a OPG de murino inclui os resíduos de aminoácidos 46-69, inclusive tal como se mostra na figura 1 (SEQ ID N°. 1). A região da transmembrana prevista para a proteína de ligação a OPG humana, inclui os resíduos 49-69, conforme se mostra na figura 4 (SEQ ID N°. 3). As substituições que substitui os resíduos de aminoácidos hídrofóbicos nesta região por resíduos de aminoácidos neutros ou hídrofílicos, vão expectavelmente romper a associação da membrana e resultam numa proteína de ligação a OPG solúvel. MêíS disso, as eliminações de parte ou de todas as regiões da transmembrana, ϋαρ produzir, expectavelmente, formas ssLãtoníí da pvtPtbiíiã de ligação de OPG. Os ácidos nucleicos que codificam os resíduos de aminoácidos 70-316, conforme se mostra na figura 1 (SEQ ID N°. 1) ou os seus fragmentos e análogos, englobam as proteínas de ligação a OPG solúveis.

Os ácidos nucleicos que codificam formas truncadas de proteínas de ligação a OPG humanas, solúveis, estão também incluídos. As formas solúveis incluem os resíduos 69-317, conforme mostrado na figura 4 (SEQ 1D N°. e as suas truncagens. iium. enquadramento, as truncagens do terminal N geram gclipégbiúvo a partir dos resíduos 70-317, 71-317, 72-317, etc. Noutro enquadramento, os ácidos nucleicos codificam pl de CPG solúvel, compreendendo os resíduos 69-317 e as suas truncagens do terminal N até aos pl de OPG [158--3171 ou, alternativamente, até aos pl de OPG [166-317]. O plasmido phuOPGbp 1.1 na estirpe DH10 de E. coli, que codifica a proteína humana de ligação de OPG, foi depositado na American Type Culture Collection, Rcckville, MD em 13 de Junho de 1997.

As sequências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser utilizadas para a detecção de sequências que codificam a proteína de ligação a OPG em amostras biológicas. Em particular, as sequências podem ser utilizadas para rasurear bibliotecas de ADNc e ADN genómico para sequências relacionadas de proteína de ligação de CPG, especialmente, as de outras espécies. Os ácidos nucleicos são úteis para a modulação dos níveis da proteína de ligação a OPG por uma tecnologia antiparalela ou expressão de genes ín vivo. O d tto de animais transgénicos que expressam a pr-nf nino de Inoíoçlú) de OPG, é útil para a produção do pblibégtido e poio o ertbúo da a.bt4:'¥.i:dac!p biológica injorno.

Vectores e Células Hospedeiras

Os ácidos nucleicos 3a presente invenção, estarão ligados com sequências de ACN de forma a expressar a proteína de ligação de OPG, activa sob o ponto de rtátm biológico. G:s sequências necessárias para a expressão, são conhecidas pelos na matéria a incluem promotores e tequêntits melhoradoras para a iniciação da síntese de ARE, os sítios de terminação da transcrição, os sítios de ligação do ribossoma para a iniciação das sínteses das proteínas e as sequências lideres para a secreção. As sequências que dirigem a expressão e a secreção da proteína de ligação de OPG, podem ser feomòi ogâsg isto é, as sequências são idênticas ou semelhantes as sequências no genoma envolvido na expressão e na secreção da proteína cie ligação a OPG ou podem ser beterólogas. Esta disponível uma variedade de vectores de plasmidos para a expressão da proteína de ligação a OPG em células hospedeiras (ver, por exemplo, Methods in Enzymology v. 185, Goeddel, D.V. ed., Academíc Press (1990)). Para a expressão em células hospedeiras de mamíferos, um enquadramento preferido é o plasmido pDSRa, descrito no pedrdo de patente de invenção PGT N°. 90/14363. Para a expressão em células hospedeiras bacterianas, os enquadramentos preferidos incluem plasmidos, que comportam o promotor lnx (ver, a patente de invenção norte-americana U.S. N°. e=>-pendente, de co-propriedade, registada em 22 de de 1995) . M-fe disso, estão disponíveis vectores para & exprertlo especifica do tecido da proteína de Xifá-çâfô a OPG em animais t :o:md'Ggéúi cdú, Os vuciorvs dt transferência de genes com base rttrittirul mu de got;i:rcvt;nn.nGf podem também ser utilizados para a expirosld da proteína de Lcpivlc a OPG em cél~ ... para a terapia in vivo (ver, de patente de ihvun-çâm 1(11 N°. 3

As células hospedeiras procarióticas e eucarióticas que expressam a proteína de ligação de QPG, constituem também um objecto da presente invenção. Ao células hospedeiras incluem células bacterianas, de leveduras, de plantas, de insectos ou de mamíferos. A proteína de ligação a OPG pode também sei produzida em animais transgénícos, tais como, ratos ou cabras. Os plasmidos e os vectores que contêm os ácidos nucleícos da presente invenção, são introduzidos nas células hospedeiras apropriadas utilizando técnicas de transfecção ou de transformação conhecidas pelos especialistas na matéria. As células hospedeiras podem conter sequências de ADN que codificam a proteína de ligação de OPG, conforme se mostra nas figuras 1 A-F ou uma porção dela, tal como, o domínio extracelular ou o domínio citoplásmico. Os ácidos nucleícos que codificam as proteínas de ligação de OPG, podem ser modificados por substituição dos codões, que permitem a expressão Óptima num dado hospedeiro. Pelo menos alguns dos codões podem ser designados por codões de preferência, que não alteram a sequência de aminoácidos e que se encontram frequentemente nos genes que são altamente expressos. Contudo, entende-se que as alterações do codão para optimizar a expressão não se restringem a introdução de codões de preferência. Exemplos de células hospedeiras preferidas de mamíferos, para a expressão da proteína de ligação a OPG incluem, mas não se limitam, a células COS, CHOd-, 293 e 3T3. Uma célula hospedeira bacteriana preferida è a Escherichia ccli.

Fti ipétldvF A presente invenção também tem par objecto a proteína de llqçoâç & OPG íuff o prbtmto d« expressão ou eiicaf ide loa de 0=:¾¾ de ADN oxâg sev;:.t i«to e' urna

proteína de ligação 3 OPG é proteína de lígaçlo a recombinante. As células de ADN exógeno incluem sequências de ADNc, ADN genómico e ADN sintético. A proteína de ligação de OPG, pode ser c produto Se expressão de células de plantas, de insectos tu de mamíferos ou de sistemas de tradução e centros iis células. A proteína de ligação a OPG produzida nas células bacterianas terá um resíduo de no terminal N. A presente inveçla também tem por objecto um processo de produção de proteínas de ligação de OPG, que compreende o crescimento de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, transformadas ou transfectadas com ácidos nucleicos, que codificam a proteína de ligação a OPG e isolam os produtos de expressão de polipéptidos dos ácidos nucleicos.

Os polipéptidos que são proteínas de ligação a OPG de mamíferos ou são os seus fragmentos, análogos ou derivadas, estão englobados pela presente invenção. Num enquadramento preferido, a proteína de ligação a OPG é uma proteína de ligação humana. Um fragmento de proteína de ligação a OPG refere-se a um polipéptido com uma eliminação de um ou mais aminoácidos, de tal modo, que o polipéptido resultante tem, pelo menos, a propriedade de se ligar a OPG. Os referidos fragmentos torâo eliminações, que tem origem na extremidade do terminal amino, na extremidade do terminal de carboxi e nas regiões internas do polipéptido. Os fragmectos da proteína de Ligação a OPG são, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos, pelo menos, cerca de 20 aminoácidos ou, pelo menos, cerca de 50 em termos de comprimento. Nút enquadramentos preferidos, a oroteína de a OPG t#râ u.:sa ui imin&çãd d® um ou mnis ao imoâoidço: da região da í resíduos de a^iB-íiáuidvS 45-69, tal como se mostra nem ãispansf i A-F) ou, em ou ma.xs mírKmúxítM da terminação amimo e/ou :;aaalar::ato a nátiáo da transrnemJorana (resíduos de aminoácidos 1-49, tal como se mostra nas figuras 1 R-F). Noutro enquadramento, a proteína de ligação a OPG é uma proteína solúvel que compreende, por exemplo, os resíduos de aminoácidos 69-316 ou 70-316 ou as suas formas truncadas no terminal N ou no terminal C, que retêm actividade de ligação de GPG. A proteína de ligação a OPG é também uma proteína humana solúvel, conforme se mostra nas figuras 4 A-F, compreendo os resíduos 69-317, conforme se mostra nas figuras 4 A-F e as suas formas truncadas no terminai N, por exemplo, 70-517, 71-517, 71-31'?, 72-317 e etc. Num enquadramento preferido, a proteína de ligação a CPG humana, solúvel, compreende os resíduos 69-317 e a sua truncagem no terminal N até pl de OPG [158-317] ou alternativamente, até a OPG [166-317] .

Um análogo de uma proteína de ligação a OPG refere-se a um polipéptido que tem uma substituição ou uma adição de um ou mais aminoácidos, de tal maneira que o polipéptido resultante tem, pelo menos, a propriedade de se ligar a OPG. Os referidos análogos terão substituições ou adições em qualquer lugar ao longo do péptido. Os análogos preferidos incluem cs de proteínas de ligação a OPG solúveis. Os fragmentos ou análogos podem ser de ocorrência natural, tal como, um produto de polipéptido de uma variante alélíca ou uma variante de uma secção de ARNm ou podem ser construídos utilizando técnicas disponíveis para os especialistas na matéria para a manipulação e síntese de ácidos nucleicos. Os polipéptídos podem ou não ter um rõniúuo de metionina no terminal amino.

Também estão incluídos na presente os derivados da proteína do ligação de OPG, que são poiipèpf iifes que sofreram modificações pós-translacionais [gou: exemplo, adição de cadeias de hidrates de carbono ligadas a N ou ligadas a 0, tratamento das extremidades do terminal N ou do terminal C), ligação das partes químicas a estrutura do aminoácido, modificações químicas das cadeias de hidratos de carbono ligadas a N ou ligadas a C e sdlcio de um resíduo de metionina no terminal N, como cus rtMsltaJs da expressão da céiulís hospedeira procariótica. Em particular, os derivados modificados quimicamente da proteína de ligação a OPG que providencia vantagens adicionais, tais como, uma maior estabilidade, tempo de circulação mais prolongado ou: uma diminuição da imunogenicidade, estão contempiados. De utilização particular, é a modificação com polímeros solúveis em agua, tal como, polietileno-glicol e os seus derivados (ver, por exemplo, a patente de norte-americana U.S. N°. 4.179.337) . As partes químicas para a derivação podem seleccionar-se entre polímeros solúveis em água, tais como, polietileno-glicol, copolimeros de etileno-glicol/propileno-glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool de polivinilo e similares. Os polipéptidos podem ser modificados em posições aleatórias dentro da molécula ou em posições pré-determinadas dentro da molécula e podem Incluir um, dois, três ou mais partes químicas ligadas. Os polipéptidos podem também ser modificados em posições pré-determinadas no polípéptido, tal como na terminação amino ou num resíduo seleccionado de lisína ou de arginina dentro do polípéptido. Outras modificações químicas providenciadas incluem um marcador detectável, tal como, um marcador enzímático, fluorescente, isotópico ou de afinidade, para permitir a detecção e o isolamento da proteína.

As proteínas de ligação a OPG quiméricas compreendem qeeee: ou toda õ pppincl-ã: de amínoácídos da proteína de ligação de OPG, fundida com uma sequência de a^lse-ácid-ô-a hetedòlQqso estão também incluídas. A Kecpfecie heteróloaa pode ser qualquer sequência que permita que a proteína de fusão resultante reteres pelo menos a activídade de ligação de OPG. Num enquadramento preferido, o domínio extracelular do terminal carboxi da proteína de ligação de OPG, está fundido com uma sequência heteróloga. Essas sequências incluem domínios citoplásmicos heterólogos, que permitem eventos de sinalização intracelular alternativos, sequências que promovem a olígomerização, tais como, a região de Fc de IgG, sequências de enzimas que providenciam um marcador para o polipéptido e sequências que providenciam sondas de afinidade, tal como, um reconhecimento de antigénio-anticcrpo.

Os polipéptidos da presente invenção isolam-se e purificam-se a partir de tecidos e de linhas células que expressam a proteína de ligação de OPG, que se extraem quer de Usados, quer de meio de crescimento condicionado e de células hospedeiras transformadas que expressam a proteína de ligação de OPG. A proteína de ligação a OPG pode ser obtida a partir da linha de células mielomonocíticas de murino 32-D (n°. de acesso da ATCC CRL11346). A proteína humana de ligação a OPG ou os ácidos nucleicos que a codificam, podem ser isolados de nódulos linfáticos humanos ou de tecido de fígado fetal. A proteína de ligação a OPG isolada está isenta da associação com proteínas humanas e de outros constituintes da célula.

Um processo para a purificação da proteína de Ligação a OPG de fontes naturais (por exemplo, tecidos e linhas de células que normaimente expressam c proteína de Ilgogâo de OPG) e de Oéihlaò hospedeiras transfectadas também englobado pela presente invenção. O processo de purlifipaçâo pode utilizar uma ou mais etapas de purificação de proteínas normalizadas numa ordem apropriada, para se obter a proteína purificada. As etapas de croinatograf ia podem incluir a permuta iónica, a filtração em gel, a ihtypscçáo hidrofóbica, a fase inversa, a focagem cromatográfica, a cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo de proteína de ligação anti-OPG ou um complexo de afinidade de bíotina-estreptavidina e similares.

Os anticorpos que se ligam específicamente aos polipéptidos da presente invenção, estão também englobados pela presente Invenção. Os antsccrpos podem ser produzidos por imunização ccm proteína de ligação a OPG de comprimento completo, formas solúveis da proteína de ligação a OPG ou de um seu fragmento. Os anticorpos da presente invenção podem ser policlonais ou monoclonais ou podem ser anticorpos recombinantes, tal corno, antscorpos quiméricos em que as reqiões constantes de murino, nas cadeias leves e pesadas, estão substituídas por sequências humanas ou por anticorpos enxertados em CDR, em que apenas as regiões de determinação complementar são de origem de murino. Os anticorpos da presente invenção, podem também ser anticorpos humanos, por exemplo, por imunização de animais transgénicos, capazes de produzir anticorpos humanos (ver, por exemplo, o pedido de patente de invenção PCT N°. WO ' .Os anticorpos são úteis para a detecção da proteína de ligação a OPG em amostras biológicas, permitindo assim a identificação de células ou de tecidos que produzem a proteína. Ãiém disso, os anticorpos que se ligam, à proteína e ligação a SPG e bloqueiam a interacçâo com outros compostos de liipzjúbo, podem ter utiliosglo terapêutica na Bodiilàgad da ae b-Sóboclnof us e os untuorς'..ίο ao osso.

Os anticorpos da proteína de ligação a OPG podem ser úteis no tratamento de doenças ÉdbõlSf tais çsfcp osteoporose e doença de Paget. Os anticorpos podem ser quanto á ligação à proteína de ligação de OPG, na presença ou na ausência de GPG e examinados quanto à sua capacidade para a inibir a osteoclastogenese mediada pelo ligando (proteína de ligação de OPG) e/ou a reabsorção do osso. Também se antecipa que os próprios péptidos podem actuar como um antagonista da interacçãc ligando:receptor e inibir a osteoclastogenese mediada pelo ligando e péptidos da proteína de ligação a OPG serão também explorados com este fim. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico da proteína de ligação a OPG da presente invenção em conjunto com um diluente, veículo, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas, que compreendem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico, de um agonista ou antagonista de uma proteína de ligação de OPG. A expressão "quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico" significa uma quantidade que providencia um efeito terapêutico para uma condição especificada e uma via de administração. A composição pode estar numa forma líquida ou liofilizada e compreender um diluente (tampões de Tris, de acetato ou de fosfato) tendo vários valores de pH e forças iMloas, solubilizantes, tais como, Tween ou polisorbato, veículos, tais como, albumina de soro ou gelatina, conservantes, tais como, timerosal ou álcool de benzi.lo e antioxidantes, tais como, ácido ou metabi-sulfureto de sólido. A selecção de uma composição particular dependerá um certo número de factores, inolu.lndís a çondiçdõ a ser tratada, a via de e os parâmetros desejados. Uma visão mais extensa dos componentes apropriados para as composições farmacêuticas podem encontrar-se em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. A.R. Gennaro, ed. Mack, Eastcn, PA (1980). enquadramento preferido, as trríraS douto que compreendem proteínas de líg&çãd a OPG solúveis, são também providenciadas. Também estão englobadas as composições que compreendem proteína de ligação a OPG solúvel, modificada com polímeros solúveis em água, para aumentar a solubilidade, a estabilidade, o semi-período de vida no plasma e a biodisponibilidade. As composições podem também compreender a incorporação de proteínas de ligação a OPG solúveis em lipossomas, micro-emulsões, micélulas ou vesículas, para libertação controlada durante um período de tempo prolongado. A proteína de ligação a OPG solúvel pode ser formulada em micropartículas apropriadas para administração pulmonar.

As composições da presente invenção podem ser administradas por injecção quer subcutânea, intravenosa ou intramuscular ou por administração oral, nasal, pulmonar ou rectal. A via de administração eventualmente escolhida dependera de um certo número de factores e pode ser acertada por um especialista na matéria. A presente invenção também tem por objecto composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade efectiva t:..b o ponto de vista terapêutico dos ácidas nucleicos da presente invenção, em conjunto com um ' „ sob e ponto de v:md.o farmacêutico. M: de icidos nucleicos serão eprtpr radas pista a tooPo de parte ou de toda e ruoiôo oo codificação cta proteína de lig&çfe a OPG e/ou as regiões de flanqueio das céio:ioo e tecidos como parte de 0:.:0 regime da terapia anti-paralela.

Processos de Utilização

As proteínas de ligação a OPG podem ser utilizadas numa variedade de ensaios para a detecção de OPG e a caracterização das interacções com OPG. Km geral, o ensaio compreende a incubação da proteína de ligação a OPG com uma amostra biológica contendo OPG, em condições que permitem a ligação a OPG ou a uma proteína de ligação a OPG e a medição da extensão da ligação. A OPG pode ser purificada ou estar presente em misturas, tal como nos fluidos do corpo ou em meio de cultura. Os ensaios que podem ser desenvolvidos, podem ser qualitativos ou quantitativos, sendo este ultimo útil para a determinação dos parâmetros de ligação (constantes de afinidade e cinética) de OPG com a proteína de ligação a OPG e para a quantificação dos níveis de OPG, activa sob o ponto de vista biológico nas misturas. Os ensaios podem também ser utilizados para avaliar a ligação de fragmentos, análogos e derivados de OPG da proteína de ligação a OPG e para identificar nova OPG e elementos da família das proteínas de ligação de OPG.

A ligação de OPG a uma proteína de ligação a OPG pode ser realizada em vários formatos, incluindo os ensaios de ligação à base de eélM&S* os ensaios de ligação da membrana, os ensaios em fase de solução e os imuno-ensaios. Em geral, faz-se a incubação de níveis de traços de OPG marcada com amostras da proteína de ligação a OPG durante um período de tempo especificado, seguido da riádiçfc da ligação de OPG por f iltração, e ..-r' :--00000 oionvorctè;n.t.t (EQL, sistema ORIGEM do IGEN), ensaios à base de células ou imuno-ensaios. As tecnologias de ensaios homogéneos para a radioactividade (SPA; e a fluorescência resolvida &c tempo (HTRF, Packard) podem tâ?sbáit ser A ligação 0 detectada pela marcação de OPG o··: de um anticorpo anti-OPG com isótopos radioactivos (1251, 3M> 3H), corantes fluorescentes (fluoresceina), quelatos ou criptatos de lantanídos {Έλχ3*} ,· complexos de orbipíridil-ruténio (Ru2 + ) . Entende-se que a escolha de uma sonda marcada dependerá do sistema de detecção utilizado. Alternativamente, a OPG pode ser modificada com um marcador de epítopo não marcado (por exemplo, bíotina, péptidos, Hidln mic) e ligada a proteínas, tais como, estreptavidina, anti-péptido ou anticorpos anti-proteína, que tem um marcador detectâvel conforme se descreveu antes.

Num processo alternativo, a proteína de ligação a OPG pode ser avaliada directamente utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais com as proteínas de ligação a OPG num irnuno-ensaio. As formas adicionais das proteínas de ligação a OPG contendo os marcadores de epítopos, tal como se descreveu antes, podem ser utilizadas em solução e imuno-ensaios.

Os processos para a identificação de compostos que interagem com a proteína de ligação de OPG estão também englobados pela presente invenção. 0 processo compreende a inmdb&çlio de proteína de ligação a OPG com um composto, em condições gue permitem a ligação do composto a proteína de a OPG e a medição da extensão da ligação. 0 composto pode ser praticamente purificado ou estar presente numa mistura impura. Os compostos de lig.EçIw podem ser ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, hidratos carbono, lípidos ou crçliU lis de baixo peso molecular. Os ç» podem ainda ser caracterizados quanto a sua capacidade para aumentar ou diminuir a actividade da proteína de l.lfsgãi; a OPG de forma a determinar se elas actuam como um antagonista ou como um agonista.

As proteínas de ligação a OPG são também Úteis para a identificação de proteínas intracelulares, que interagem com o domínio cítoplásmico, por meio de um processo de rastreio com dois híbridos de leveduras. Como exemplo, as estruturas híbridas compreendem ADN que codifico os 50 aminoácidos de terminal N, de uma prcteína de ligação de CLG, fundida com um domínio de ligação dé ADN a levedura GAL4, que pode ser atlljifcáda como um plasmido de dois híbridos. Os clones positivos que emergem do rastreio podem ser caracterizados ainda para identificar as proteínas de interacção. Esta informação pode ajudar a explicar o mecanismo de sinalização intercelular associado com a proteína de ligação a OPG e providenciar alvos intracelulares para novos fármacos que modulam a reabsorção do osso. A proteína de ligação a OPG pode ser utilizada para tratar condições caracterizadas por uma excessiva densidade óssea. A condição mais comum é a osteopetrose, em que um defeito genético resulta numa elevada massa óssea e é normalmente fatal nos primeiros anos de vida. A osteopetrose é tratada, preferencialmente, por administração de proteína de ligação a OPG solúvel. A presente invenção também engloba moduladores (agonistas e antagonistas) da proteína de ligação a OPG e os processos para a sua obtenção. Um modulador da proteína de lifbvio a OPG pode aumentar ou diminuir pelo menos uma actividade associada com a proteína de ligação de pgp# tal como, a capacidade para se ligar a OPG ou a alguma outra molécula de interacção ou para regalar a pa/iurrçip dos osteoclastos, Normalmente, um agonista ou um antagonista pode eor oís so'crçotõíd tal como, orna proteína, 5¾¾ péptido, nm hidrato de carbono, um lípido ou uma molécula de peso molecular pequeno, que interage com a proteína de ligação a OPG para regular a sua actividade. Os antagonistas potenciais do polipéptido incluem anticorpos que reagem quer com as formas solúveis, quer com as formas associadas à membrana da proteína de ligação a OPG e as formas solúveis ds proteína ligação a OPG que compreendem parte ou todo o domínio extracelular da proteína de ligação de OPG. As moléculas que regulam a expressão da proteína de ligação a OPG incluem normalmente ácidos nucleicos, que são complementares dos ácidos nucleicos, que codificam a proteína de ligação a OPG e que actuam como reguladores de expressão anti-paralelos. A proteína de ligação a OPG esta envolvida no controlo da formação de osteoclastos maduros, o tipo de célula primária implicada na reabsorção do osso. Um aumento na taxa de reabsorção óssea (superior á da formação óssea), pode levar a vários distúrbios dos ossos, referidos de uma forma colectiva como osteopenias e incluem osteoporose, osteomielite, hípercalcémia, osteopenia resultante de cirurgia ou de administração de esteróides, doença de Paget, osteonecrose, perda óssea devida a artrite reumatóide, perda Cssea periodontal, imobilização, perda prostética e metástases osteolíticas. Inversamente, uma diminuição na taxa de reabsorção do osso pode levar a osteopetrose, uma condição marcada por uma excessiva densrdade óssea. Os agonistas e antagonistas da proteína de ligação a OPG modulam a formação de osteoclastos e podem ser administrados a pacientes que sofrem de distúrbios dos ossos. Os agonistas e antagonistas dd proteína de litdlgaO a OPG utilizados para o tratamento de osteopenias, podem ser administrados isoladamente ou em com uma quantidade efectíva sob o ponto de ae um agente o.e ao crescimento dos ossos por BMP-1 a factores morfogénicos dos ossos 1, faotor t de crescimento da tt elementos da £: dos FCT-β, e factores do crescimento do fibroblasto (FCF-1 a FCF-10), inibidores de interleucina 1, inibidores ae FNT-a, hormona da paratiróide, prosta-giandinas da série E, bisfosfonatos e minerais que aumentam os ossos, tais como, fluoreto o cálcio. Qs antagonistas da de ligação a OPG podem ser particularmente úteis no tratamento de irr.òtrtni.t,

Receptores para as Proteínas de Llgmoêt a Osteoproteqerina A presente invenção também tem por objecto receptores que interagem com as proteínas de ligação a OPG. Mais particularmente, a presente invenção tem por objecto um receptor de activação e diferenciação de osteoclastos (RDAO). 0 RDAO é um pclipéptido da transmembrana que exibe o mais elevado grau de homolugia com CD40, um elemento da família dos receptores de FNT. A sequência de ácido nucleico do RDAO de murino e o polipéptido codificado, estão indicados nas figuras 1 0 A-F. 0 homólogo humano de RDAO de murino pode ser facilmente isolado por rastreio de hibridação de um ADNc humano ou de uma biblioteca genómica com a sequência de ácidos nucleicos das figuras 10 A-E?. Os processos para a clonagem de humano, são semelhantes aos descritos no exemplo 5 para a clonagern das proteínas de ligação a OPG humanas. O homólogo humano do polipéptido mostrado nas figuras 10 A-F apareceu em Anderson et al. (Nature 390, 175-179 (1997)) e é ai referido como RANK. iJIM é caracterizado como uma proteína da transmembrana do tipo I com uma homologia com os elementos da família dos receptores de FNT e que está envolvida na função das células dendríticas. A . c d,s proteína de ligação a OPG está indicada no exemplo 13. Uma forma solúvel de RDAO (proteína de fusão de RDAO-Fc) previne a maturação dm» ústmmXéstxs !,n ui· m (figura 12 A-H) e aumenta a densidade óssea em ratos normais após injecção subcutânea (figura 13) . Os resultados são consistentes cots a interacção da proteína de ligação a OPG com RDAO de para promover a maturação dos osteoclastos. 0 desenvolvimento de osteoclastos e a taxa e duração da reabsorção óssea são regulados pela interacção da proteína de ligação a OPG e por RDAO. Os compostos que diminuem ou bloqueiam a interacção da proteína de Ligação a OPG e de RDAO, são antagonistas potenciais da actividade da proteína de ligação a OPG e podem interromper o desenvolvimento de osteoclastos, o que leva a uma diminuição da reabsorção óssea. Alternativamente, os compostos que aumentam a interacção da proteína de ligação a OPG e RDAO, são agonistas potenciais, que promovem o desenvolvimento dos osteoclastos e aumentam a reabsorção Óssea.

Uma variedade de ensaios pode ser utilizada para medir a interacção da proteína de ligação a OPG e RDAO in vitro, utilizando proteínas purificadas. Estes ensaios podem ser utilizados para rastrear compostos quanto â sua capacidade para aumentar ou diminuir a taxa ou a extensão da ligação a RiSQ-, por meio da proteína de ligação a OPG. Num tipo de ensaio, a proteína de RDAO pode ser imobilizada por ligação ao fundo dos microtubos de uma placa microtituladora. A proteína de ligação a OPG rádio-marcada (por exemplo, proteína de ligação a OPG iodada) e os compostos de ensaio, podem então ser adicionados uns aos outros, de uma só vez (numa certa ordem) ou simultaneamente nos eícisòí®sv Após a Incuiísçlo, lavam-se os xdvrtãsibos e contam-se utilizando um contador de cintilação para a radioactivídade, para determinar a extensão da lifâflo de d''·' pela proteína de lioinção a OPG na presença da composto de ensaio. Normalmente, o exposto será ensaiado num intervalo de concentrações e pode-se utilizar uma série de rnicrotubos de controlo a que falta um ou mais elementos dos ensaios de teste, para dar mais precisão à avaliação dos resultados. Uma alternativa a este processo, envolve a possibilidade de reverter as "posições" das proteínas, Istc é, a .imoMXls&Ç&â da proteína dê Ligação a OPG com os rnicrotubos da placa microtituladora, incubando com o composto de ensaio e RDAO rádio-%arcado e determinando da extensão da ligação de RCAC (ver, por exemplo, capítulo 18 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York, NY [!&&$!) .

Como uma alternativa à rádio-marcação, pode-se conjugar a proteína de ligação a OPG ao RDAO com biotina e a presença de proteína biotiniladã pode ser detectada utilizando estreptavidina ligada a uma enzima, tal como, a uma peroxidase de rábano (PRR) ou a fosfatase alcalina (FA), que pode ser detectada por colorometria ou por marcação fluorescente da estreptavidina. Um anticorpo dirigido a proteína de ligação a OPG ou a RDAO, que esteja conjugado com biotina, pode ser utilizado e pode ser detectado após a incubação com estreptavidina ligada a enzima, ligada a FA ou PRR. A proteína de ligação a GPG e RDAC podem também ser imobilizados por ligação a pérolas de agarose, pérolas acrílicas ou outro tipo de substratos Inertes. 0 complexo de substrato-proteína pode ser colocado em solução contendo uma proteína çcopíRmsvitvr e c composto de ensaio; após a íntuibaçlo., as pérolas podem precipitar por çsntrifuçççAò e pode-se ovoliví a quantidade de ligação entre a proteína de ligação a OPG e RDAO, utilizando processos descritos antes. MfAmaT.J.vt ' g o complexo de substrato-proteína pode ser imobilizado numa coluna e faz-se passar a molécula de ensaio e a proteína complementar sobre a coluna. A de um complexo entre a proteína de ligação a OPG e RDAO pode então ser avaliada utilizando qualquer uma das técnicas estabelecidas antes, isto é, rádio-marcação, ligação de anticorpo ou similares.

Um outro tipo de ensaio ín vitro que é útil para identificar um composto que aumenta ou diminui a formação de um complexo de RDAO/proteína de ligação a OPG, é um sistema detector de ressonância plasmónica de superfície, tal como o sistema de ensaio da Biacore (Pharmacia, Piseataway, NJ) . 0 sistema Biacore pode ser realizado utilizando o protocolo do fabricante. Este ensaio envolve essencialmente uma ligação covalente quer da proteína de ligação a OPG, quer do RDAO a um chip sensor revestido de dextrano, que esta localizado num detector. 0 composto de ensaio e a outra proteína complementar pode então ser injectada na câmara que contém o chip sensor, quer simultaneamente, quer sequencialmente e a quantidade de proteína complementar que se liga pode ser detectada com base na alteração da massa moleeular, que está fisicamente associada com o lado revestido com dextrano do chip sensor; a alteração na massa moleeular pode ser medida pelo sistema detector.

Nalguns casos, pode ser desejável avaliar dois ou mais compostos de em conjunto, para serem utilizados no aumento ou na da formsoât do complexo de de ligiylo a OPG. Nestes casos, 3s ensaios estabelecidos antes podem ser facilmente modificados adicionando compostos cãs ensaio adicionais, quer simultaneamente com os anteriores ou em sequência ao dõ&posts do primeiro ensaio. As restantes etapas do ensai-o são tal se antes.

Os ensaios ín vitro, tais como, os descritos antes, podem ser utilizados com vantagem para rastrear rapidamente um grande número de compostos para efeitos da formação de complexos por meio de RDAO e da proteína de ligação a OPG. Os ensaios podem ser automatizados para rastrear compostos gerados na exibição de fagos, péptidos sintéticos e bibliotecas de sínteses químicas.

Os ccmpcstos que aumentam ou diminuem a formação de complexos da proteína de ligação a OPG e RDAO, podem também ser avaliados em culturas de células utilizando células e linhas de células que comportam RDAO. As células e as linhas de células podem obter-se de qualquer mamífero, mas serão preferencialmente de seres humanos ou de outros primatas, caninos ou roedores. As células contendo RDAO, tais como, os osteoclastos, podem ser enriquecidos a partir de tipos de células variados por cromatografia de afinidade, utilizando processos que estão disponíveis publicamente. A ligação da proteína de ligação a OPG às células que comportam RDAO, é avaliada na ausência ou na presença dos compostos de ensaio e determina-se a extensão de ligação, por exemplo, por citometria de fluxo, utilizando um anticorpo biotinilado da proteína de ligação a OPG. Alternativamente, pode-se estabelecer uma cultura de usteoclastos de ratos ou de seres humanos, tal como descrito na exemplo 8 e podem avaliar-se cs compostos do ensaio quanto n sua capacidade para bloquear a níiAtrnaãç de osteoclastos estimulada pela adição de CFS 1 e da proteína de 1 · O- a OPG. Os ensaios de cultura de célulat textos ser utilizados com vantagem siums para avaliar compostos que pontuam de forma positiva nos ensaios de ligação aa proteína cescritos antes. podem também ser ds aiKTípnntaS ípt ou dindaunís a ίηΐηηήίοαίί; da puni A ín·? d-:·; iiqnçto a OPG com avaliados quanto a sua actividade in vivo, por meio da aarninistração dos compostos a ratos seguida das medições da densidade óssea, utilizando densitometrla de digitalização de ossos ou radiografia, Os processos para a medição da densidade Qssea, estão descritos na publicação da patente de invenção PGT WQ 97/23614 e no exemplo 13. A presente invenção toe por objecto compostos que diminuem ou bloqueiam a interacção da proteína de ligação a CPG e RDAC e são antagonistas da formação de osteoclastos. Esses compostos geralmente caem num de dois grupos. Um grupo inclui os compostos que derivam da proteína de ligação a OPG ou que interagem com a proteína de ligação a OPG. Estes já foram descritos antes. Um segundo grupo inclui os compostos que derivam de RDAO ou que interagem com RDAO. Exemplos de compostos que são antagonistas de RDAO, incluem ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos ou compostos orgânicos de baixo peso molecular.

Os antagonistas de RDAO podem ser compostos que se ligam aos sítios de ligação ou muito próximos deles, para as pl de OFG no domínio extracelular de RDAO e diminuem ou bloqueiam completamente a formação do complexo. Essas regiões em RDAO estão envolvidas na formação do complexo com a proteína de ligação a OPG, podem ser identificadas por analogia com a estrutura dos complexos homólogos de FNT-p/FNT-R55, que já foram descritos em Banner et al. (Cell 11, 431-445 (1993)). Por exemplo, a estrutura do CChfílÁAs de FNT-p/FNT-R55 pode ser utili/câdt para identificar regiões da proteína de ligação a GFG e de RDAO, que estão envolvidas na formação do complexo, Os compostos podem ser desenhados ae tal forma que se liguem preferencialmente ãs regiões envolvidas na formação do complexo e actuam como antagonistas. Numa abordagem estabelecida no exemplo 1, os Má.íqêrà.'á® de péptidos foram preparados para serem utilizados no aparecimento de anticorpos i proteína de ligação a OPG, que actuam como antagonistas. É expectável que estes anticorpos se liguem à proteína ae ligação a GPG e bloqueiem a formação do complexo com RDAO. Numa abordagem similar, os antigénios de péptidos I base da estrutura de RDAO podem ser utilizados para originar anticorpos anti-RDAO que actuam como antagonistas.

Os antagonistas de RDAO podem também ligar-se a RDAO em localizações distintas dos sítios de ligação para as pl de OPG e induzem alterações da conformação no polipéptido do RDAO, que resulta numa diminuição ou numa formação não produtiva do complexo com as proteínas de ligação a OPG.

Num enquadramento, um antagonista é uma forma solúvel de RDAO a que falta um domínio funcional da transmembrana. As formas solúveis de RDAO podem ter uma eliminação de um ou mais aminoácidos no domínio da transmembrana (aminoácidos 214-234, conforme se mostra nas figuras 10 A-F). Os polipéptidos solúveis de RDAO podem ter parte ou todo o domínio extracelular e são capazes de se ligar à proteína de ligação a OPG. Eventualmente, o RDAO solúvel pode ser parte de uma proteína quimérica, em que parte ou todo o domínio extracelular de RDAO está fundido com uma sequência de aminoácidos heteróloga. Num enquadramento, a sequência de aminoácidos heteróloga é uma .região Fc da IgG humana.

Os moduladores (agonístas e antagonistas) de RDAO podem ser utilizados para pttèWé&ix ou tratar osteopenia, incluindo osteoporose, osteomielite, hipercalcémia resultante de doenças malignas, osteopenia causada per cirurgia ou de doença de Paget, m-devu d aso perda óssea devida a artrite reumatóide, perda óssea periodontal, iasòfei 1 í ι.Μβχ>; perda prostética e metástases osteolíticas. Os agonistas e antagonistas de RDAO utilizados para o tratamento das osteopenias, podem ser administraaos sozinhos ou em combinação com uma quantidade efectiva sob o pente de vista terapêutico de um agente de promoção do crescimento ósseo, incluindo morfogénicos do osso designados por BMP-1 a BMP-12, factzr B do crescimento da transformação e elementos da família dos FCT-β, factores de crescimento do fíbroblasto (FCF-1 a £'4^·^, inibidores de interleucina 1, inibidores de hormona aa paratiróide, prostaglandinas da série E, bifosfonatos, estrogénios, SERMs e minerais que melhoram os ossos, tais como, fluoreto e cálcio. Os antagonistas de RDAO são particularmente Úteis no tratamento da osteopenia.

Os exemplos que se seguem são dados para se compreender melhor a presente invenção, mas não foram construídos como um limite ao seu âmbito.

Exemplo 1

Identificação de hirta fonte de linhas de células para uma

proteína de ligação a OPG A osteoprotegerina (OPG) regula negativamente a génese dos osteociastos In vitro e in vive. Dado que a OPG é uma proteína relacionada orm o receptor de FNT, é provável que

interaja com um membro da família relacionada com os ENT embora mediando os seus Com ama excepção, todos os membros conhecidos da lia doo FNT são proteínas da transmembrana do tipo ir, expressas na superfície da célula. Para identificar uma fonte de rma proteína ae 'Π pt;p§ o a OPG, nti 1 proteínas recombinantes de fusão ta OPF-Fc como

a OPG para rastrear as localizadas na superfície de várias linhas de células e de células hematopoiéticas primárias.

As linhas de células que cresceram como culturas aderentes in virro foram tratadas utilizando os seguintes prccessos: as células furam colocadas em placas, em placas de cultura de tecido de 24 micrctubos (Falcon), depois deixaram-se crescer até, aproximadamente, 80 % de confluência.

Retirou-se então o meio de crescimento e lavaram-se as culturas aderentes com uma solução salina tampenada com fosfalo (STF) (Gibco) contendo soro bovino fetal a 1 % (SEF). Ai proteínas de fusão recombinantes de OPG [22-194]-Fc de rato OPG [22-201]-Fc humanas (ver, a série da patente de invenção norte-americana N°. 08/706.945, registada em 3 de Setembro de 1996) , foram individualmente diluídas com 5 pg/mL, no seio de STF contendo SBF a 1 % e depois adicionaram-se às culturas e deixaram-se em incubação durante 45 minutos, a 0 °C. A solução da proteína de fusão de OPG-Fc foi retirada e lavaram-se as células com uma solução de STF-SBF, tal como se descreveu antes. Expuseram-se então as culturas a um anticorpo secundário de IgG anti-humano de cabra F(ab') conjugado com ficoeritrina (Southern

Biotechnology Associates Cat. # 2043-09), diluiu-se em STF-SBF. Passados 30-45 minutos de incubação, a 0 °C, retirou-se a solução e lavaram-se as culturas como se descreveu antes. Analisaram-se òcíoío as células por microscopia de ímunofluorescência para detectar as linhas de células que expressam proteína de ligação a OPG da superfície das C-j i. d— tu, «

As culturas das células em foram analisadas de uma forma semelhante com as seguintes modificações: o diluente e o tampão de lavagem consistiram em solução tamponada com fosfato isenta de scáXãio e de magnésio, contendo SBF a 1 %. Colheram-se as células das culturas de replicação exponencial em meio de crescimento, aglomeraram-se por centrifugação e depois voltaram a suspender-se a 1 x Xíi células/mL, numa placa de cultura de tecido microtituladora de 96 microtubos (Falcon). Expuseram-se sequencialmente as células a proteínas de fusão recombinantes de OPG-Fc e depois a um anticorpo secundário, conforme se descreveu antes e lavaram-se as células por centrifugação entre cada etapa. Analisaram-se então as células por SCAF, saída das células activada por fluorescência utilizando um FACscan da Becton Díckinson. Utilizando esta abordagem, verificou-se que a linha de células míelomonocítica de murino 32D (numero de acesso da ATCG CRL11346), expressava uma molécula de superfície, que podia ser detectada tanto com as proteínas de fusão de CPG [22-194]-Fc de rato como de OPG [22-201]-Fc humanas. O anticorpo secundário sozinho não se ligou à superfície das células 32D nem Fc de IgGl humana purificada, indicando que a ligação das proteínas de fusão de OPG-Fc, foi devida a parte de OPG. Esta ligação podia ser concorrente de uma forma dependente da dose, por meio da adição de proteína recombinante de OPG [22-401]-Fc de murino ou humana. Assim, a região de OPG necessária para a sua actividade biológica, é capaz de se ligar especif icamente a uma molécula de superfície derivada de 32D.

Exemplo 2

Clonagem de expressão de uma proteína de ligação a OPG de murino

Preparou-se uma biblioteca de ADNc a partir de ARNm 32D e ligou-se a eu vector de expressão de mamífero pADNc 3.1 (+) (Invitrogen, San Díego, CA} . At éíMiilM 32D de crescimento exponencial, que se únruH/uuutt-s na presença de interleucina 3 recombinante foram colhidas e purificou-se o ARN total das células por meio de extracçãc, no seio de tiocianato de ácido de í hy. τί .1 íf—à. c,I ts ίϊ:.ϊ:·ϊτ;.1 íh· (Chomczynski and Sacchi. teaà, Biochem. 1£2, 156-159, (1987)). Obteve-se a tmcçã-C· pcli (A+) de M&s a partir da preparação total de ARN por meio da absorção e eluição de Oligo Dynabeads Cbf) 25 (Dynal CorpS, utilizando uc processos recomendados pelo fabricante. Preparou-se uma biblioteca de ADNc iniciada por oligo-dT, direccional, utilizando o sistema de plasmidos superscript (Gibco BRL, Gaithersburg, Md), utilizando os processos recomendados pelo fabricante. 0 ADNc resultante foi digerido ate à compleição com endonuclease de restrição Sall e Notl, depois foi fraccionado por cromatografia em gel de exclusão de dimensão. Seleccionaram-se as fracções com o peso molecular mais elevado e depois ligaram-se na região de poliligação do vector do plasmido pADNc 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA) . Este vector contém o promotor de CMV a montante do sítio de clonagem múltiplo e dirige um elevado nível de expressão nas células eucarióticas. A biblioteca foi depois electroporada em E. coli concorrente (ElectroMAX PH108# Gibco, NY) e titulada em meio de agar LB, contendo 100 gg/bú de ampicilina. A biblioteca foi então fraccionada em conjuntos segregados contendo, aproximadamente, 1.000 clones/conjunto e fez-se crescer :.« a mL de culturas de cada conjunto, durante 16-20 horas, a 37 °C. Preparou-se o ADN do plasmido de cada cultura utilizando o kit de plasmidos 96 Ultra da Qiagen Qiawell (catálogo, # 16191), seguindo os processos recomendados pelo fabricante. conjuntos separados da biblioteca de expressão de ADNc de 32D, foram lipofectados em culturas de COS-7 e e foram ensaiados para a âípiaibbii do uma çibbibiuã de ligação a GPG da superfície ã&à células. Para fazer isto, colocaram-se em placas células COS-7, a UBã densidade de 1 x 1D" |xsr mL, em placas de cultura de tecido de 6 microtubos (Gostar) e depois fez-se a cultura em meio DMEM (Gíbco) , contendo SBF a 10 . Aproximadamente L pg do ADN do plasmido de cada conjunto, foi diluído em 0,,¾ mL de DMEM isento ae soro, depois foi esterilizado por centrifugação através de uma coluna Spín-X de 0,2 p* (Gostar). Simultaneamente, adicionou-se 10 pL de lipofectamina (Life Technologies, Cat. # 18324-012) a um tubo separado contendo 0,5 mL de DMEM isento se soro. As soluções de ADN e de lipofectamina foram misturadas e deixaram-se em incubação a TA, durante 30 minutos. Depois lavaram-se as culturas de células COS-7 com DMEM isento de soro e expuseram-se os complexos de ADN-lipofectamina a culturas durante 2-5 horas, a 37 °C. Passado este período, retirou-se o meio e substituiu-se com DMEM contendo SBF a 10 %. Fez-se então a cultura das células durante 48 horas, a 37 "C.

Para detectar as culturas que expressam uma proteína de ligação a OPG, retirou-se o meio de crescimento e lavaram-se as células com uma solução de STF-SBF. Adicionou-se a cada microtubo um volume de 1,0 mL de STF-SBF contendo 5 pg/mL de uma forma de fusão OPG [22-201]-Fc humana e incubou-se à TA, durante 1 hora. Lavaram-se as células três vezes com uma solução de STF-SBF e depois ficaram-se em STF contendo para formaldeído a 2 % e glutaraldeído a 0,2 %, no seio de STF, a TA, durante 5 minutos. As culturas foram lavadas uma vez com STF-SBF, aepcis foram incubadas durante 1 hora, a 65 °C, ao mesmo tempo que se imergiam numa iítlyçlú de STF-SBF. Deixaram-se as culturas arrefecer e aspirou-se a solução do STF-SBF. As culturas foram então incubadas com um anticorpo de IgG (específico de Fc), ootLAomáto, ,1o caora, octnoptdu coo fosfatase alcalina (SIGMA, PtcdatO: # A-9544) , o TA, durante 30 minutos, dopoi* lâoaro-t-.so troo vezes com Irto:--21 20 mM çtd a 7,6) e NaCl 137 mM. Os complexos munee que se formaram durante estas etapas foram detectados por meio de ensaio para avaliar a actividade da fosfatase alcalina, utilizando um kit de substratos Fast Red 7R/AS-MX (Pierce, Cat. 340345, seguindo os processos recomendados pelo fabricante.

Utilizando esta abordagem, rastreou-se total de, aproximadamente, 300.000 cloneç d© ADNc de 32D independentes, representados por 300 conjuntos transfectados d·* 1.000 clones cada. Identificou-se que um único microtubo, que cuntinha as células, que adquiriram a capacidade de serem especificamente devoradas pela proteína de fusão de OPG-Fc. Este conjunto foi dividido por ciclos sequenciais de selecção de sib, originando um único clone do plasmido 32D-F3 (figuras 1 A-F). C ADN do plasmido 32D-F3 foi então trançfectado em células COS-7, que foram imunocoradas quer com apenas o anticorpo secundário de IgG anti-humano, de cabra, conjugado com FITC, mais a proteína de fusão secundária, humana, de OPG [22—201]— Fc ou com a proteína de fusão de ATAR-Fc (ATAR também conhecida por como HVEM; Montgomery et al. Cell .8.1, 427-436 (1996)) (figuras 2 A-C). 0 anilcorpo secundário sozinho não se ligou as células COS-7/32D-F3, nem a proteína de fusão ATAR-Fc. Apenas a proteína de fusão de OPG-Fc se ligou às células de COík k3, indicando que 32D-F3 codificou uma proteína de ligação a OPG existente na superfície das células de expressão.

Sequência -ii proteína de ligação a OPG cloiw sis 3:)G3ko ipoladc; antes continha uma inserção de Sk, aproximadamente, 2,3 kb (fi.gpr-á l.k que foi cdatk em atbíss as dírecçoes num secci.onadcr asksmiátd sss; de ADN 373Ά da Applied Biosystems, utilizando reacções de corante Taq - terminador, conduzidas pelo iniciador (Applied Biosystems), seguindo os processes recomendados pelo fabricante. A sequência de nucleótidos resultante obtida quando comparada opa a base ae écfcs de sequências de ADN utilizando o programa FASTA (GCG, Univeristy of Wisconsin) e analisadas quanto à presença ae secções lonqas de leitura aberta í&LLMè utilizando a "aplicação de secções leitura aberta de seis vias" (Frames) (GCG, Univeristy of Wisconsin). Uma SLLA de 316 resíduos de aminoácidos (aa) começando na metionina, foi detectada na orientação apropriada e estava precedida por uma região de 5' não traduzida de cerca de 150 pl. A região 5' não traduzida continha um codão de paragem numa secção a montante do codão inicial previsto. Isto indica que a estrutura do plasmido de 320-F3 é consistente com a sua capacidade para utilizar a região do promotor de CMV para dirigir a expressão de um produto de genes de 316 aa em células de mamíferos.

Comparou-se então a sequência da proteína de ligação a OPG prevista com a base de dados existentes de sequências de proteínas conhecidas, utilizando uma versão modificada do programa FASTA (Pearson, Meth. Enzymol. 183, 63-98 (1990))., Analisou-se a sequência de aminoácidos também quanto à presença de elementos específicos conservados em todos os elementos conhecidos da super-família do facto da necrose do tumor (FNT), utilizando o processo do perfil de sequências ae ÍMtWãké*/ et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 4355-4359 llfêl} modificado por Líiethy et al. Protein Scí. 3, 139-146 (ΙΑΝΠ, Pareceu haver ova homologia entre e de ligação a OPG e vários M.s&sritoss da super-família dos . A proteína de .UzrsiolO: a OPG de rato parece estar mais fortemente com os ho:iÁIo>o-or de rato e humanos ac como < - !ma análise posterior da sequência da proteína de ligação a OPG indicou um emparelhamento forte com a super-família dos FNT, com uma pontuação de Z altamente significativa de 19,46. Ά sequência de aminoácidos da proteína de ligarão a CLG sontfe um provável domínio de transmembrana lii.dboMbl.ctf que começa em M44 e se estende até L69. Com base nesta configuração relativa com o codão de iniciacão de metionina, prevê-se que a proteína de ligação a OPG seja uma pruteioa da transmembrana do tipo II, com um domínio intracelular curto de terminal N e um domínio extracelular mais comprido de terminal C (figuras 4 A-E). Isto seria semelhante a todos os elementos conhecidos da família dos FNT, com excepção da linfotoxina alfa (Nagata and Golstein, Science 2£1, 1449-1456 (1995)).

Exemplo 4

Expressão de ARNm da proteína humana de ligação a OPG

Fizeram-se sondagens das transferências para uma matriz imobilizada ADN/ARNm de tecido humano múltiplo (Clontech, Paio Alto, CA) com um fragmento de restrição de 32D-F3 de 32P-dCTP, para detectar a dimensão do transcripto humano e para determinar os modelos de expressão. 0 ADN/ARNm transferido para uma matriz imobilizada (Northern), foram pré-hidridízados) em 5 X SSPE, formamida a 50 I, 5 X solução dó Denhardt, SDS a 0,5 % i 100 pq/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado, durante 2-4 horas, a 42 ':::'Ch Os conjuntos foram stitib híbridados em 5 X SSPE, formamída a 50 %, 2 7 O.· o- Denhardt, SDS a 0,1 %, 100 ug/itt de ADN de esperma de salmão desnaturado e 5 mg/ml ae sonda durante 18-24 horas, a 42 °C. Imhht irurã ο (Northern) em 2 X SSC, durante 10 imxnutsç, a TA, 1 X S3C, durante 10 minutos, a 50 °C e depois em 0,5 X SSG, durante 10-15 minutos.

Utilizando uma sonda derivada de ADNc de rato e fazendo a hibridação « condições severas, detectaram-se espécies predominantes de ARNm, com uma massa molecular relativa de cerca de 0*0 kb em nódulos de linfa (figura 3) . Detectou-se um sinal fraco na mesma massa molecular relativa no ARNm de fígado fetal. Não se detectaram transcriptos da proteína de lisçiç a OPG nss outros tecidos examinados. Os dados sugerem que a expressão do ARNm da proteína de ligação a OPG era extremamente restrito nos tecidos humanos. Os dados também indicam que o clcne de ADNc isolado está muito próximo da dimensão do transcripto original, sugerindo que 32D-F3 é um clone de comprimento completo.

Exemplo 5

Glonagem molecular da proteína humana de ligação a OPG . 0 homólogo humano da proteína de ligação a OPG é expresso como um ARNm de aproximadamente 2,5 kb em nódulos linfáticos periféricos humanos e detecta-se por hibridação com uma sonda de ADNc de rato em condições de hibridação severas. O ADN que codifica a proteína de ligação humana a OPG obtém-se por rastreio de uma biblioteca de ADNc de nódulos linfáticos humanos, quer por meio da placa bacteriófaga recombínante su por colónias bacterianas transformadas, processos de í (Sambrook et al. ΑΡ,Ιόç:jΜ: €1 í. h :ό:Νθ:>ϊ',:; ό·ί>£ν ha1 Cold Spring Harbor

Press, New York (1989)}. Com este fago ou com a biblioteca de marcadas radioactívamente d:srí?3dás do clone da proteína de ligação a OPG de murino 32D-F3. Utilizaram-se as sondas para rastrear o Filtro de nitroceiulose deixado a partir de uma biblioteca em placa. Estes filtros são pré-hibridados e depois hibridados utilizando as condições especificas do exemplo 4, cpe em última análise, dão origem a clones pi>rifl€â'sl0§ do ADNc da proteína humana de ligação a OPG. As idSdrttte obtidas a partir de quaisquer clones humanos da proteína de ligação & OPG seriam sequenciados e analisaaos como se descreveu no exemplo 3.

Analisou-se o ARN de poli «··· de um nódulo linfático humano (Clontech, Inc., Paio Alto, CA), quanto a presença de transcriptos de pl de OPG, tal como se descreveu previamente na patente de invenção norte-americana 13. S. n°. 08/577.788, registada em 22 de Dezembro de 1995. Uma análise da transferência de ADN/ARNm para uma matriz imobilizada (Northern), desta amostra de ARN sondada em condições severas com uma sonda de pl de OPG de rato marcada com 32P, indicou a presença de transcriptos de pl de OPG humana. Sintetizou-se então uma biblioteca de ADNc iniciada por oligo dT a partir do ARNm de nódulos linfáticos, utilizando o kit de

SuperScript (GIBCO Life Technologies, Gaithersberg, MD), conforme descrito no exemplo 2. O ADN resultante foi seleccionado por dimensão e a fracção de elevado peso molecular foi ligada ao vector de plasmido pADNc 3.1 < ϊ > (Invítrogen, San Díego, CA) . Transformou-se DH10 de E, coli concorrente sob o ponto de vista electrolítico (GIBCO Life Technologies, Gaithersberg, MD'; e rastreou-se 1 X 10* transformantes resistentes a ampicilina, por meio da de coihnip: t: uLlilcnndto uma sonda de oro v.ádoa ae a OPG do rato marcada com 32P.

Isolou-se m clone do plasmido do putativo ADNc da proteína humana de ligação a OPG, «. contendo uma inserção de 2,3 kp. A sequência de nucleótídos resultante da inserção de phuQPGbp-1.1 era, aproximadamente, 80-85 8 homóloga da sequência do ADNc da proteína de ligação a OPG de rato. A tradução da sequência do ADN da inserção indicou a presença de uma secção de leitura aberta longa, que se prevê que codifica um polipéptido de 317 aa (figuras 4 A-i). A comparação dos polipéptidos de pl de CPG de rato e humana, mostrou que eles eram ~87 % idênticos, indicando que esta proteína está altamente conservada durante a evolução. 0 ADN da proteína humana de ligação a CPG e as sequências de proteína não estavam presentes no Genbank e não havia sequências homólogas de EST. Tal como com o homólogo de murino, a proteína humana de ligação a OPG mostra uma forte semelhança da sequência com todos os membros da super-família de citocinas de FNT-a.

Exemplo 6

Clonagem e expressão bacteriana da proteína de ligação a OPG A amplificação por RCP utilizando os pares de iniciadores e as matrizes descritas a seguir, foi utilizada para gerar várias formas de proteínas de ligação a OPG de murino. Um iniciador de cada par introduz um codâo de paragem TAA e um sítio único de Xhol ou SacII a seguir a terminação carboxi do gene. O outro iniciador dê cada par introduz um sítio único de Ndel, uma metionina do terminal N e codões optimizados para a porção do terminal amino dc gene. Realiza-oo a RCP e a termociclização utilizando uma metodologia padronizada de ADN recombinante. Purificam-se om produto» da RCP, são digeridos por restrição e inseridos nos tldior drúouA de Ndel e Xhol eu SacII do ' . , de transformam-se em 393 acesso da ATCC 98113) e transformam-se em 393 cu 2.596 tcíil normalmente utilizados e células de nospedeiros, são também apropriados para a expressão. Depois da transformação, seleccionam-se os clones, isola-se c AGN do plasmido e a sequência da proteína de ligação a OPG é confirmada.

Proteína ΓΙΙ-uuln; de ligação a PPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 242 amínoácidos de comprimento e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, NH2-Met(75)-Asp-Pro-Asn-Arg-Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. A matriz utilizada para a RCP foi pADNc/32D-F3 e os oligonucleótidos # 1581-72 e # 1581-76 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1581-72: (SEQ ID N°. 5) 1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEQ ID N°. 6)

Proteína [95-316] de ligação a OPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 123 aminoácidos de comprimento e r os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, (95) -Glu-Asn-Ala-Gli—

------ -ο:':····Αρη····· Γ1:::- As ρ --7771-0. A matriz 01.111::110.1:¾ para a RCP foi pMMc?$ZS”f3 aa oligonucleótidos # 1591-90 e # 1591-95 !-SfSf o gar ia iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. c: g/oíâqcc cccaci p;p::ct>.iciC:GT< · h cã cc ceccc? : tcc ~ & · (SEQ ID N°. 7) 1591-95: 5' -TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3' (SEQ ID N°.

Proteína [ 10Q—31.6(J de a PPG de muríno - pAMG21

Fez-se engenharia gfidéficíâ desta estrutura para ter 211 aminoác.i dos de comprimento e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, KiC-Puf -:>?r MúD •-••Ρΐο,-Εί-ρ····':1 ............Gln-Asp-Ile-Asp (316) -CQOH. A matriz utilizada para a RCP foi pADNc/32D-F3 e os oligonucleótidos # 1591-93 e # 1591-95 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1591-93 ICTQAAÇACdCTCTvCÇQQAQTCC ·· 5 * (SEQ ID N°. 9) 1591-95: 5'-TATCCGCGGATCCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAA-3' (SEQ ID N°. IO)

3'"' icip 5.:,:0:- ...A,.:.:... a ® mi:·· i no ·"

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 199 aminoácidos de comprimento e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, NH2-MetílCSi-Lis-Gln-Ala-Fen-Gln-............Gln-Asp-Ile-Asp : 316) -C00H. A asât&ís utilizada para a RCP im pADNc/32D-F3 e as oligonucleótidos # 1591-94 e # 1591-95 foram o par de iniciadores que se utillccc para RCP e para a clonagem da estrutura deste §ers&. ;3:: JSEQID Ν°. 11) 1591-95: ^TTistrcimtofccfSÃií

3V (SQ ID

Sf -mf CCGCSS&f 50 12)

Proteína [128-3161 de ligação a PPG de murino - pAM621

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 190 aminoacidos de comprimento e ter os seguintes resíduos ae

terminal N e de terminal C, NH2-Met-Lis(128)-Glu-Leu-Gln-His-—„.„Gln-Asp-ile-Asp (316)-COOH. A matriz utilizada para a RCP foi pADNc/32D-F3 e os oligonuclectidos # 1591-91 e # 1591-95 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. V; p ;-R v jx :-v Ϊ'.; f ... f: ;γ·-S. Síi.s JSEQID N° . 13) 1SÍ!Í-:JS: 5 -f ^TC:CSC0SsÁ'rCCt! .0/ ·.·;:· v,v j'i ·:· ííí !¥ í.js ;·

Proteína [137-316] de ligação a PPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 181 aminoácidos de e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, - 137) -Arg-Fen-Ser-Gli-

____Gln-Asp-Ile-Asp (316)-''ODDS< A irra utilizada para a RCP roa pAO!fc/32ov---o3 e os oligonucleótidos * 1591-92 e # 1591-95 foram o par ae initiitíetêo que se ut.llxis.ss para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. IGílaKP Cl>·- .5' (SEQ ID N°. 15) 1591-95: fí·;" /·> ·Ν> Χν('·ΧΛ·Χ Λ·ν;Ν»ν>::ν·>;·'ν.Λ>·Ή ·\ ·χ·:; ··:(«^..^^ν/ι ίχ ·κ ·:···ί^·"::"·./:'s ··>. V· t :-./::-7.1 :. Λ A.:'·; .:. U A U w S \A;;tó:.., Λ Λ = ./ÍV.?:." .í (SEQ ID NO: 16)

3&: O® iai'ÍSS _'_

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 171 atdaaáeddns de comprimento e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, NH;-if:vv. (146)-01 u-h i i~S>vi-'Trp-........ G1 n Asρ lie-Asp í .316)··COO::. A matriz utilizada para a RCP foi a proteína [75-316] ae ligação a OPG de murino, pAMG21, descrita antes e os oligonucleótidos # 1600-98 e # 1581-76 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1600-98: 5' -GTTCTCCTCATATGGAAGGT1CTTGGTTGGATGTGGCCCA-3' (SEQ ID N°. 17) 1581-76: "t (SEQ ID N°. 18)

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 162 amiahdaidát de etapa::0a:a:ita e ter ca seguintes resíduos aa terminal N e ae terminal C, t: m çs. (I ,:D,S | - ti 1,11; i. m. — G: ........

Gln-Asp-Ile-Asp (316) -lalOan A matriz utilizada para a RCP foi a pmt%i:nã [75-316] de ligação a OPG da murino, pAMG2i, descrita antes e os # 1619-86 e # 1581-76 foram o pai de iniciadores que se ;arll .ursa pap® RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1619-86: 5'-GTTCTCCTCATATGCGTGGTAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCA-3* (SEÇ ID N°. 19) 1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEG 13 N°. 20)

Proteína [158-316] de ligação a PPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 160 aminoácidos de comprimento e ter os seguintes resíduos de terminal N e de terminal C, NH2-Met-Lis(158)-Pro-Glu-Ala---

Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. A matriz utilizada para a RCP foi pADNc/32D-F3 e os oligonucleótidos # 1581-73 e # 1581-76 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1581-73: 5'-GTTCTCCTCATATGAAACCTGAAGCTCAACCATTTGCACACCTCACCATCAAT-3' (SEQ ID N°. 21) 1581-76: 5'-TACGCACTCCGCGGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGA-3' (SEQ ID N°. 22)

Proteína Π tt ·· 516) de ligação a PPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 152 de comprimento e tez os seguintes resíduos de tmmrml S e de C, Hlis (166)-Leu-Tre-Ile--- G.Ln'·'Aro····11 c··.S.Ep : 31 i; ··iOD;·),% A matriz utilicodi para a RCP foi pADlic/GiD-ro o os ó'J g<mrci.e-òt i # 1581-75 e # 1581-76 foram c par de iniciadores que se utilizou pars RCP & para c clonagem da estrutura deste gene. AAGTCACT-3' (SEQ ID 1*. 23) 1581-76 5' -lliCíl • XXU .· ν'. ν:· \ Ο-.-: λ · x·..· xOxOΧΛ,'ο s,x. X .Xwí v ”' V;

ID 54)

Proteína [168-316] de ligação a PPG de murino - pAMG21

Fez-se engenharia genética desta estrutura para ter 150 aminoácidos de comprimento e ter os seguintes resíduos dh terminal N e de terminal C, 2¾--1101--71 o (lió j ·· T Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. A matriz utilizada para a RCP foi pADNc/32D-F3 e os oligonuclectidos # 1581-74 e # 1581-76 foram o par de iniciadores que se utilizou para RCP e para a clonagem da estrutura deste gene. 1581-74: 5'-GTTCTCCTCATATGACTATTAACGCTGCATCTATCCCATCGGGTTCCCATAAAGTC-ACT-3' (SEQ ID N°. 25) 1581-76: (seq id n°. 26j

Entende-se que as estruturas anteriores são exemplos e que um especialista na matéria facilmente obtém outras formas da proieína de lifagâo a OFG, utilizando a metodologia geral aqui apresentada.

As estruturas bacrerianas recombinantes da proteína de ligação a OPG de murino, pAMG21, [75-316], i.95-316], uOd- 316], [118-3161, :128-----3131, [137-316] e fXS£~3;L6.] foram clonadas, confirmou-se a de Aid e os nlosls de expressão do produto de gene recombinante no seguimento da indução, foram οχαοοοΟλχοχο , Todas as estruturas produziram níveis de produto de gene recombinante, que foi facilmente visível no seguimento de uma electroforese em gel de SDS e poliacrilamída e a coloração com Coomassie dos lísados impuros. 0 crescimento de 393 ou 2.596 de Γ coli transformadas, a indução da expressão da proteína de ligação a OPG e o isolamento dos corpos inclusão contendo a proteína de ligação a OPG, foram realizados de acordo com os processos descritos na patente de invenção PCT WO 97/23614. A purificação das proteínas de ligação a CPG a partir de corpos de inclusão, requer a solubilização e a renaturação da proteína de ligação a OPG, utilizando processos disponíveis para os especialistas na matéria. Verificou-se que a proteína [158-316] de ligação a OPG de murino, recombinante, foi produzida principalmente sob uma forma insolúvel, ias verificou-se que havia uma fracção de 40 % sob uma forma solúvel. Purificou-se a proteína recombinante a partir da fracção solúvel, conforme se descreve a seguir e examinou-se a sua bioactividade.

Purificação da proteína [158-316] de ligação a OPG de murino, recombinante

Descongelaram-se células bacterianas congeladas comportando proteína de ligação a OPG de murino [1:5:1-316] e voltou a suspender-se em tris-HCl 20 mM, a pH 7,0, EDTA 10 mM.

Homogeneizou-se a suspensão de células 12C % p/v), por meio de três passagens através de um microfluídizador. Centrifugou-se a suspensão de células lisadas rocor JA14 a 10. OCO rpm, dtrsct·® 45 A por SDS-PAGE mcatrítú uma banda ae, aproximadamente, 18 kd de peso molecular, pZM-mmzm tanto nos corpos de inclusão como co sobrenadante. Aplicou-se então a fracção icslútcl a ursa coluna 4FF SP sefarose da tn::cvscra equilibrada com MES 10 mM, a pH

6.0. Eluiu-se a proteína de ligação a OPG com um gradiente com um volume de 20 colunas de NaCl 0-0,4 M, no seio de MES, :S;, pH 6,0. Aplicaram-se então as fracções contendo a proteína de ligação a OPG a uma coluna ABX Bakerbond, equilibrada com MES 20 mM, a pH 6,0. Eluiu-se a proteína de ligação a OPG com um gradiente de 15 CV de NaCl 0-0,5 M, no seio de MEÇ, a pH 6.0. O produto finai era mais do que 95 3 homogéneo, como se verificou por SDS-PAGE. A sequenciação do terminal N deu a seguinte sequência: Met-Lis-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Fen-Ala-His, que foi identificada como a prevista para um polipéptido começando no resíduo 158 (com um iniciador de metionina) . O peso molecular relativo da proteína durante SDS-PAGE não se alterou após redução.

Exemplo 8

Bioactividade in vitro de proteína de ligação a OPG recombinante, solúvel A proteína recombinante de OPG tinha mostrado antes que bloqueava a formação de osteoclastos dependentes de vitamina D3 de medula óssea e percursores de baço, num ensaio de formação de osteoclastos, conforme descrito na patente de invenção norte-americana U.S. n°. 08/577.788. Dado que a proteína de ligação a OPG se liga a OPG e é um novo elemento da família de ligsndos dos FNT, é um alvo potencial da bioactividade de OPG. A proteína [158-316] de ligação a OPG recombinante, solúvel, representando um domínio semelhante ao FNT-oí do núcleo mínimo, foi avaliada quanto á sua capacidade para modular a diferenciação de osteoclastos a partir de percursores de osteoclastos. Isolaram-se as células de medula óssea de fémor-so de ratos adultos e trataram-se com M-CSF. A fracção não aderente foi posta numa cultura em conjunto com céHlliSs ST2 na presença e na ausência tanto de vitamina D3 como de dexametasona. Como se mostrou previamente, os osteoclastos desenvolveram-se apenas nas co-culturas contendo células do estroma f vitamina 23 e dexametasona. Ά proteína de ligação a OPG recornbinante, solúvel, foi adicionada, em várias concentracões variando de a 5CC ng/mL e determinou-se a maturação dos osteoclastos por um ensaio de solução TEM5 e por observação visual. A proteína de ligação a OPG estimulou fortemente a diferenciação de osteoclastos e a maturação de uma forma dependente da dose, com efeitos semi-máximos num intervalo de 1-2 ng/mL, sugerindo que actua como um indutor potente de osteoclastogenese ín vítro (figura 5). 0 efeito da proteína de ligação a OPG é bloqueado pela OPG recornbinante (figura 61.

Para verificar se a proteína de ligação a OPG podia substituir o estroma e os esteróides associados, estabeleceram-se culturas utilizando M-CSF em várias concentrações para promover o crescimento dos percursores de osteoclastos e também se adicionaram varias quantidades de proteína de ligação a OPG. Como se mostra na figura 6, consoante a dose, a proteína de ligação a OPG estimulou a actividade de TRAP e a amplitude da estimulação esteve dependente do nível de M- CSF adicionando, sugerindo que estes dois factores em conjunto são os pivots do desenvolvimento dos osteoclastos. Para confirmar a relevância biológica desta Ultima observação, fizeram-se culturas em lâminas de osso cortical de bovino e ensaiaram-se os efeitos de M-CSF e da proteína de ligação a OPG, quer ; soladas, quer em .>> Como se mosrra nas £ig.ur$$ i A-C, a proteína ae IlípçGb a OPG na presença Ga M-CSF estimulou a de grandes osteoclastos positivos a TRAP, que erodiram a superfície do osso, resultando covas. Assim, a proteína de ligaçâd a CPG actua como um idutor Gt estimulação (diferenciação) da osteoclastogénese. Isto sugere que QPG bloqueia o desenvolvimento de osteoclastcs se sequestrando a proteína de ligação c OPG.

Exemplo 9

Actividade in vivo aa proteína de ligação a OPG recombinante, solúvel

Com base em estudos in vitro, verificou-se que a proteína [IS;S~3iê·] de ligação a OPG recombinante, de murino produzida na 3- coli ê um indutor potente do desenvolvimento de osteoclastos a partir de percursores mielóides. Para determinar s© seus efeitos in vivo, ratos machos BDF1 com 4-5 semanas de idade (Charles River Laboratories) receberam injecções subcutâneas da proteína [158-316] de ligação a OPG, duas vezes por dia, durante três dias e na manhã do A® dia (dias 0, 1, 2 e 3) . Cinco grupos de ratos (n = 4j receberam apenas veículo ou 1, 5, 25 ou 100 pg da proteína [158-316] de ligação a OPG por dia. Mais 5 grupos de ratos (n = 4) receberam as doses anteriores de veiculo ou da proteína [158— 316] de ligação a OPG e, além disso, receberam Fc-OPG [22-194] humana a 1 mg/kg/dia (aproximadamente, 20 pg/dia) por meio de uma única injecção diária subcutânea, Determinou-se o elloio ionizado de sangue completo antes do tratamento no dia 0 e 3-4 horas após a primeira injecção diária de proteína !Í53'~'31e:| de ligação a OPG nos dias 1, 2 e 3. Quatro horas após a última injecção no dia 3, os ratos foram sacrificados e tiraram-se radiografias.

A proteína recombinante de ligação a OPG produziu um aumento significativo no câldia ionizado do sangue, após dois dias de tratamento a uma dose de 5 pg/día e em doses superiores (figura 8). A severidade da hipercaicémia indica uma indução potente da actividade de osteoclastos resultando do aumento da reabsorção óssea. A administração simultânea de OPG limitou a hipercalcémia em doses de proteína [158-316] de ligação a OPG de 5 e 25 pg/dia, mas não u j ço uç / u i a., Analisaram· se estes mesmos animais por radiografia para determinar se houve quaisquer efeitos na densidade mineral dos ossos, visível por raio X (figures 9 A-D) , A proteína [158-316] de ligação a OPG recornbinante, injectada durante 3 dias, fez diminuir a densidade óssea na tíbia proximal de rates de uma forma dependente da dose. A zéáugãú da densidade óssea foi particularmente evidente em ratos que receberam 100 pg/dia confirmado que a hipercalcémia profunda nestes animais foi produzida pelo aumento da reabsorção du osso e a libertação resultante de oâleia a partir do esqueleto. Estes dados indicam claramente que a proteína [158-316] de ligação a OPG actua in vivo para promover a reabsorção óssea, levando a hipercalcémia sistémica e a OPG recornbinante elimina estes efeitos.

Exemplo 10

Clonagem e epasslsí de proteína de ligação a OPG solúvel em células de mamíferos C clone de comprimento completo da proteína de ligação a OPG de murino e humana, pode ser expresso em células de mamíferos conforme se descreveu previamente no exemplo 2. Alternativamente, os clones ® ADNc poetem ser modificados para codificar formas segregadas da proteína qmftúo. expressas em releias de r Para fazer isto, a extremidade 5' eetaeai de ADNc que eoalílléP o codão de iniciação e que se eztmsdx MpzômMêúmsMMítB ao longo dos primeiros 69 aminoácidos da proteína, [ m: :Lodo a região cia transmembrana, ser substituídas por una reçeineie líder de péptído de sinal. Por exemplo, as sequências de AND que codificam o codão de iniciação e o péptido de sinal de um gene conhecido, podem ser seccionadas em sequências de ADNc da proteína de ligação a OPG, começando em qualquer parte após a região que codifica o resíduo de amínoãcido 68. Os clones recombinantes resultantes é provável que produzam formas segregadas de proteína de ligação a OPG em células de mamíferos e devem sofrer modificações após a tradução, que normalmente ocorrem no domínio extracelular do terminal C da proteína de ligação a OPG, tal como, glicosilação. Utilizando esta estratégia, construiu-se uma forma segregada da proteína de ligação a OPG, que tem na sua extremidade 5' o péptido de sinal de OPG de murino e na sua extremidade 3' o domínio Fc de IgGl humana. 0 vector de plasmido pC.EP4/muOPG [22-401]-Fc, tal como descrito na patente de invenção norte-americana U.S. n°. 08/577.788, registado em 22 de Dezembro de 1995, foi digerido com Notl para clivar entre a extremidade 3' de OPG e o gene de Fc. O ADN linearizado foi então parcialmente digerido com Xmnl para clivar apenas entre os resíduos 23 e 24 de OPG, deixando uma terminação abrupta. Os produtos da digestão por restrição foram então desfosforílados com CIP e a porção de vector do produto da digestão (incluindo os resíduos 1-23 de CPG e de Fc) foram purificados em gel. A região de ADNc da proteína de ligação a OPG de murino, que codifica os resíduos de aminoácidos 69-316, foi amplificada por RCP, utilizando Pfu polimerase (Stratagene, San Diego, CA) a partir de uma matriz de plasmido utilizando como iniciadores os oligonucleótidos seguintes: 1602-61:

CTA GGC CTG TAC TTT CGA GCG

ATG

(SEQ

1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGS CCT GAA CTT TG (SEQ ID N°. 28) O oliqonucleótido 1602-61 amplifica a extremidade 5' do gene e um sitio artificial de Stul. O iniciador 1602— 59 amplifica a extremidade 3' do gene e contém um sitio artificial de NotI. O produto de RCP resultante obtido, foi digerido com NotI e Stul e depois foi purificado em gel. C produto de RCP purificado foi ligado com o v%çxQ.$f depois foi utilizado para transformar as células DH10B de E. -t-o JI concorrentes sob c ponto de vista electrolitico. O clone resultante foi sequenciado para confirmar a integridade da sequência amplificada e as junções dos sítios de restrição. Este plasmido foi então utilizado para transfectar 293 fibroblastos humanos e recolheu-se a proteína de fusão da proteína de ligação a OPG-Fc a partir do meio de cultura, conforme descrito previamente na patente de invenção norte-americana U.S. n°. 08/577.788, registada em 22 de Dezembro de 1995.

Utilizando uma estratégia semelhante, preparou-se um vector de expressão que è capaz de expressar uma truncagem do terminal N do domínio Fc de IgG humana fundido. Esta estrutura consiste num péptido de sinal de OPG de murino (resíduos de aa 1-21), fundidos numa com os resíduos 158-316 da proteína de X.t$&Ç!k> a OPG de murino, seguido de uma fdnãn em com o domínio Fc de IgGl humana. Para fazer isto, o mnihr ;:kí plasmido pCEP4/'p!~-áO!| de OPG de murino (p&t&X® de iíhhàímte U.S. n°.. uf/d/idlld., registada em 22 de Dezembro de 1995), foi digerido com HindIII e NotI para el tlniutmf téâé a secção de leitura de OPG. A proteína de líqãção a OPG de moriuq,: nos resíduos 158-316, foi amplificada por RGP utilizando a matriz do plasmido utilizando os iniciadores seguintes: 1616-44: CCT CTC TCG AGT GGA CM CCC AGA AGC CTG AGG CCC AGC CAT TTG C (SEQ ID N°. 29) 1602-59: CCT CTG CGG CCG CGT CTA TGT CCT GAA CTT TG (SEQ ID N°. 30) 1616-44 amplifica a proteína dt ligação a OPG começando nos resíduos 158 assim como os resíduos contendo 16-21 do péptido de sinal de OPG de muríno com um sítio artificial de Xhcl. 1602-59 amplifica a extremidade 3' do gene e adiciona um sítio de Notl numa secção. O produto de FCP foi digerido com Notl e Xhol e depois foi purificado em gel.

Os iniciadores complementares que se seguem enrolaram-se um no outro para formar um adaptador que codifica o péptido de sinal de OPG de murino e a sequência de Kozak, que rodeia o sítio de iniciação da tradução: 1616-41: AGC TTC CAC CAT GAA CAA GTG GCT GTG CTG CGC ACT CCT GGT GCT CCT GGA CAT CA (SEQ ID N°: 31) 1616-42: TCG ASG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGF GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTG ASG GTG GA (SEQ ID n°. 32)

Estes iniciadores enrolaram-se, gerando ramificações de 5' compatíveis com ΜΙηόΙΓΧ na extremidade 5' e Xhol na extremidade 3' . D wctó:?: digerido obtido antes, os tidos enrolados e o fragmento de RCP digerido, foram ligados em conjunto e electroporados em cèlal®# DRICBv clone mtiilteíiif· foi tGgtttçxGGv para ectiflxeiar a reconstrução autMtlcB da jurição entre o péptido de sinal, o fragmento da proteína ae ligayfo a OPG qut gòíGíGtg: os resíduos e o Fc de IgGl. Purificou-se o piosmiSv recombínante, transf ectou-se o::: 293 fibroblastos humanos e expressou-se como um produto condicionado pelo meio, conforme se descreveu antes.

Os ADNcs de murlno e humanos de comprimento completo, foram clonâdcs vector de expressão pCEP4 (Invitrogen,

San Diug-h,. CA) e ' g ' transfectados em culturas de 293 fibroblastos humanos, conforme se descreveu no exemplo 1. Seleccionaram-se as culturas de células com higromicina conforme se descreveu antes e preparou-se um meio condicionado, isento de soro. 0 meio condicionado foi exposto a uma coluna de OPG recombinante imobilizado e as formas resultantes de pl de OPG recombinante de murino e de humano, foram purificadas por afinidade. A análise da sequência de terminal N das proteínas de Ligação a OPG solúveis, purificadas, indica que a proteína de murino tàil clivada, preferencialmente, antes da fenilalanina 139 e a proteína humana esta clivada, preferencialmente, antes do resíduo homólogo, isoleucina 140. Alem disso, a proteína humana e também clivada, preferencialmente, antes da glicina 145. Isto sugere que as formas solúveis de ocorrência natural da proteína de ligação a OPG humana têm resíduos de terminal amino, quer na isoleucina na posição i40 ou na glicina na posição 145. Péptídos da proteína de ligação a OPG e preparação dos anticorpos monoclonais <ê a esta proteína

Podem obter-se anticorpos das regiões especificas da proteína de ligação a GFG por imunização com pipi:idos a partir da proteína de ligação a OPG. Estes péptídos podem ser utilizados isoladamente ou em f&zm® conjugadas do péptido, qsa podem ser utilizadas para ;diopi;:p:açço·, A estrutura cristalina do FNT-cx maduro já fci descrita [E. Y. Jones, D. I. Stuart e N. P. C. Walker (1990) J. Cell Bí:i> Suppl. 13, IIPP e o monómero forma uma sanduíche de folhas β dobradas, antíparalelas, com uma típologia de rebuçado. Observaram-se dez estruturas helicoidais β anti-paralelas nesta estrutura cristalina e que forma uma sanduíche de g com um* folha δ consistindo nas estruturas helicoidais B'BIDG e as cutras estruturas helicoidais C'CHEF [E. ϊ. Jones et al., ibid.]. Dois aftèis de FNT-α maduro têm. estado implicados em estudos die mutagénese para fazer contactos com o receptor, sendo estes méis formados entre a estrutura helicoidal js B & B' e o anel entre as estruturas β E & F [C. R. Goh, C-S. loh, e A. G. Porter (1991) Protein Engineering 4, 785-791]. A estrutura cristalina do complexo formado entre e o domínio extracelular do receptor de FNT de 55 kd (R55-FNT) foi resolvida e os contactos receptor-ligando já foram descritos [D. W. Banner, A. D'Arcy, W. Janes, R. Gentz, H-J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher e W. Lesslauer (1993) Cell 73, 431-4451. De acordo com estudos de mutagénese descritos antes [C. R. Goh et al., ibid.], os anéis BB' e EF correspondendo ao ligando de FNT-β, verificou-se que faziam a maioria dos contactos com o receptor na estrutura cristalina resolvida do complexo FNT-β:R55-FNT. A sequência de aminoácidos da proteína de ligação a OPG de murino, foi comparada eoss as sequências de aminoácidos de FNT'"0 e de FNT-β. As regiões da proteína de Ilpvãe de OPG de murino correspondendo aos anéis de BB' e EF, foram previstas com base nesta comparação e prepararam-se os péptidos como se descreve a seguir. soro utilizando A. le :.t: idéoj ót; corno antigénio (ag) a proteína ΡΡΑΒΙίΑ ] de iinpifio a CPG de murino, reconibínante, para imurdouplm de animais conforme se descreve a seguir e examinou-se abordagens descritas a seguir. Sintetizaram-se os péptidos para os putativos anéis BB' e EF da proteína de ligação a OPG de murino e utilizaram-se para imunização; estes péptidos são: péptido do anel BB' : IS-COOK ID N°. 33) péptido do anel BB'-Cis: 1' ’ RGWAKISC-COOH (SEQ ID N°. 34) peptido do anel EF: (SEQ ID N°. 35) péptido do anel EF-Cis: NH2—VYVVKTSIKIPSSHNLMC-COOH (SEQ ID N°. 36)

Utilizaram-se os péptidos com um resíduo de cisteína de terminal carboxi para a conjugação, utilizando as abordagens descritas na secção B a seguir e utilizaram-se para imunização. de B. Hemocianina de Concha aberta ou Conjugação de Albumina de Çorc Bovino: Pode-se conjugar péptidos seleccionados ou fragmentos de proteína com hemocianina de concha aberta (KLH) de modo a aumentar a sua imunogenicidade em animais. Também se podem utilizar péptidos conjugados de albumina de soro bovino (ASB) ou fragmentos de proteínas no protocolo EIA. Reconstitui-se KLH activado de maleimida ou ASB (Píerce Chemical Company, Rockford, IL) tm dHaO, até a uma concentração final de 10 mg/mL. Díssolvem-se o péptido ou os fragmentos de proteína em tampão de fosfato, depois misturam-se com uma massa Ca/srô d® KLH ou ASB. Deixa-se a reagir durante 2 horas, á. temperatura ambiente (ta), com uma ligeira agitação.

Faz-se então passar a solução sobre uma coluna dessalínízada ou faz-se a sua diálise em função de STF durante a noite. C conjugado de péptido é armazenado a -20 ser utilizado em imunizações ou em EIAs. C. Imunização: Injectaram-se subcutaneamente ratos 3alb/c (Charles Rívers Laboratories, Wilmington, HA), ratos Lou ou coelhos brancos da Nova Zelândia com ag (50 , 150 pg e 100 pg, respectivamente)s emulsionadas em adjuvante de Freund completo (CFA, 50% vol/vol; Difco Laboratories, Detroít, MI) . Deu-se um aos coelhos duas ou três vezes com Intervalos de 2 semanas, com um antigénio preparado de uma forma semelhante em adjuvante de Freund incompleto (IGFA; Difco Laboratories, Detroit, MI). Deu-se reforço a ratos e murganhos aproximadamente de 4 em 4 semanas. Sete dias após o segundo reforço, realizaram-se testes de colheitas de sangue e determinou-se os títulos dos anticorpos no soro. Quando se desenvolveu um titulo em coelhos, produziu-se semanalmente hemorragias de 50 mL e recolheram-se durante 6 semanas consecutivas. Seleccionaram-se os ratos e os murganhos pela produção de hibridomas com base nos níveis do título no soro; os animais com títulos semi-máximos superiores a 5.000. Um especialista na matéria pode fazer ajustamentos a este protocolo; por exemplo, hoje em dia ttt.lò dispçriivvls vários tipos de iísuncítódoib" dores que podem ser Incorporados neste protocolo. D. Ensaio Imune-absorvente Ligado a Enzimas toflj: Os ΕΪ.Ε& serão realizados para determinar os titdl®ís de anticorpo (ac) no soro de Mtbtsir e, mais tarde, par-: o rastreio de potenciais hibridomas. Revestiram-se placas de EIE/RIA de microtitulação, com 96 miorotubos de fundo plano, de elevada ligação (Costar Corporation, Cambridge, NA) com proteína recombínante purificada ou fragmentos de proteína (antigénio, ag) a 5 pg por mL, no seio de tampão de carbonato-bicarbonato, a pH 9,2 (M&sQCH 0,015 M, HEHCCp 0,035 Hl, Os fragmentos de proteína podem ser conjugados, se necessário, com albumina de soro bovino (ASB). Adicionou-se 50 pL de ag a cada microtubo. As placas são então cobertas com um filme de acetato (ICN Biomedícals, Inc., Costa Mesa, CA) e incubadas a temperatura ambiente (ta), numa plataforma de agitação, durante 2 horas ou durante a noite, a 40 °C. Bloquearam-se as placas durante 30 minutos, a ta, com 250 pL por microtubo de uma solução de ASB a 5 %, preparada misturando uma parte de diluente de ASB/concentrado de solução de bloqueio (Kirkegaard e Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) com uma parte de água desionizada (dH20) . Quando se retirou a solução de bloqueio, adicionou-se a cada microtubo 50 pL de diluições de duas vezes de soro (1:100 ate 1:12.800) ou de sobrenadantes da cultura de tecido de hibridoma. O diluente do soro é ASB a 1 % (diluente de ASB a 10 %/concentrado de solução de bloqueio, diluído em solução de Dulbecco tamponada com fosfato, d-STF, a 1:10, Gibco BRL, Grana Island, 1 IY)), com os sobrenadantes dos hibridomas sendo testados sem diluição. Mo caso do rastreio ; :1o hibridoma, manteve-se o microtubo como um controlo conjugado e um segundo microtubo como um controlo positivo de ac. Incubaram-se novamente as

placas i ta, agitaram-se durante I hora, depois lavaram-se 4 vezes utilizando uma preparação Ix de sPlmçto aquosa, 20x concentrado (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), no seio de dE-sCH

99 qç-T °P Γ: |í um moi ap

Bjed qs-sq.i,:Aq: 3 ._· q4p q/g/,.? >:o ap "pa: gq ao ooes um poop; £/&/£ X2 sp ' ' ap Poopoíí p ap oiaiu jod as-HABT siodap 'oprroõ

Opí ;;:i:sd op opxoopooo 0 M T W: 1 " ijdidd dd d Pd p:·' ;i pp!;: f -ai; #·,* PX$' i::lp: Pd·"'':.^ ; d «í Idf dOf Pd «'dορΐ:οο|οΡ; rP PP p'p:/'p Pf:/' Pppe p:pj::P:i "PPPPP ίΤΡΡ : dfP;::Uf,p|pOP. dqPSp: ,¾ ψ ee qm qs mê PiPipppxfflddP d- ;χ P KPP BqdPiOdí ma oôeq nas 0 9S-amooaj a aaoq a ao Pp ppppfTp: ap -éjm ;i< ai φφ^τχ^ f 1 paífyí? id 5? a A A. ap' p|da pp d&p s Pd m m. ® p:;d SPSS? *· ·»' «ί;.;.·':·;;} v<. I. . q;' . 'Pdxvqp.' xtp pp PfdrvP p 0 ooosi ορρορ q 00: o:q a a V ;.’pNv,V·."o ' *; ; q·q;, .·' > Pp PlPPi ’d 'ppappaa oeu ap: fPTPpppppp ens f no pppppdqJtpp OOi® ens :P v.· .·.?; ví xd s ^Λν P^Póv ; ·. -i . ;νΐ^ΐΫ,·: oxaepunoas ρρρρρρ: ppp mn jaupooso as- apod Oxduiaxa jod /oxoooqoãd aqsa e iíooyfpdpo í Γφ f :0.w jppildp ιοοροο -g-p |p| op e 39ΖΘΑ Ç anb op pp y. vd-PÍ- ·,’\ a: •A V.-A tPTqdp apepxsuep e as soatρτ sod c " .p.- axíví-pv ^- qd· y 'w.v'·;·;··..' x> v· -·.->>····:·?:·: <« -i- :u 8S-; assa aod epiqqo PPfKfqí Pã'T PP?: pjsusp ep Á 0¾ e oquod um erred sxodap as-opuexodexqxa í A: <\ 1? e pppqpp apepxsuap e snsxaA orros op qqdqq. 'p BP ddPPp ep ^T.mh um ppupppq ρρρ|!¥Ρ r»p p ojos ou Pd-P- %>a q d:o t a p aa;; a fia-: a m mm.T2 g - (ιλ "xqaoippif ‘ ’; a:oo ο-χορ:; iooq - · nidãdi áBDdfílPPB q:P ap ρρο, X 00' uin opuaapTipa pqqrqpopp to; «ppp exed mu ρρ ? e Oqp e os-naq " hdp ‘-βχ nqsisq'qxjp: ^ > ppf ‘SPPOBEBP píf'” ΛΧΡ: ap: pue p.s aPidPf;rqqp ap psapfpcippí· :: Op J. :.·::v: POP ooxun um ap aqertqsqns ss-nouoTDxpe a op- ,,:?ΐϊ" TBpfíf ^:·ΐ:Ρ 0 00: ouioo TPã spopqd se pop pp;í pp.p!I · % τ e a ap ura ρρτρ'ΓϊΡ ff T dír B "í ·:·':; Z ' -&:£§0 i|p-p:l'i pfPPPUPp spí ipXXSPPi PPP Ovd ep ase pixcaad uioo ep a d P. dá v 0 ρ τ .í ppqp a a?: PP.; 00 T: gP":: um (Seward Laboratory UAC House; Londres, Inglaterra). À medida que as células se libertam da cápsula do baco para o meio, elas são eliminadas do saco e transformadas num tubo centrífugo, cónico, de 50 mL, esterilizado (Becton Dickinson and Company, Lincoln Park, NJ) . Adicionou-se meio fresco ao saco e o prccesso continua i&é todo o conteúdo das células inteiras do baço ter sido libertado. Lavam-se estes esplenócítos 3 vezes por centrifugação, a 225 x g, durante 10 minutos.

Ao mesmo tempo, culturas em fase logarítmica de células de miei orna, Sp2/Q-Agl4 ou Y3-Agl .2.3 para fusões de esplenócítos de ratos ou murganhos, respectivamente (American Type Culture Collectíon; Rockville, MD) cresceram em meio completo (DMEM, soro de bovino fetal a 10 % inactivado, glutamina 2 rnM, aminoácídos não essenciais 0,1 , piruvato de sódio 1 mM e tampão de Hepes 10 mM; Gibco

Laboratories, Grand Island, NY) , lavam-se da mesma maneira. Combinam-se os esplenócítos com as células de mieloma e aglomeram-se mais uma vez por centrifugação. O meio é aspirado a partir do aglomerado de células e mistura-se cuidadosamente 2 mL de polietileno-glicol 1500 (PEG 1503; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) com as células, durante um período de 1 minuto. Depois, adiciona-se lentamente um volume igual de 2x P/S/G DMEM, Deixam-se as células fundir a 37 °C, dsrsgfs; 2 minutos, depois adiciona-se mais 6 mL de 2x P/S/G DMEM. Deixam-se as células novamente em repouso, a 37 °C, durante 3 Finalmente, adícíona-se à cia células 35 mL de 2x P/S/G DMEM e μΙ««··ι® a ajuda de as dilddids por centrifugação. 0 meio é aspirado do aglomerado e as células são novamente, cuidadosamente, suspensas em meio completo. Distribuem-se as tÉlults em placas de cairura de tecido, de fundo plano, de 96 tuutrotddtd; (B Labware; Lincoln Park, NJ) , por meio de gotas uma pipeta de 5 mL. Faz-se a incubação dcs placas durante a noite em condições húmidas, a 35 °C, em atmosfera de C02 a 5 %. No dia seguinte, adiciona-se a cada microtcbo um volume igtll do méio de selecçãc. 0 meio de selecção consiste em hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 4 x 10~? mM e timídína 1,6 x 10 i; mM em meio completo. Faz-se a iacmçás das placas de fusão aurante 7 dias, seguidas de 2 alterações do meio, durante os três dias seguintes. O meio de selecção HAT # utilizado após cada reMlmo.® de fluido, Retiram-se os sobrenadantes da cultura de tecido 3 a 4 dias após a última vXt&Vã’Ç&® de fluido de cada microtubo contendo o híbrido e faz-se o seu ensaio por meio de EIE para avaliar a reactivídade especifica do anticorpo. Este protocolo foi modificado a partir de Hudson e Hay, "Practical Immunology, segunda edição", Blackwell Scientífic Publications.

Exemplo 12

Clonagem de um receptor de uma proteína de ligação a OPG, expresso em células hematopoiéticas percursoras

Conjugou-se proteína [Idíf-PntG de ligação a CPG de muríno, recombinante, activa sob o ponto de vista biológico, com fluoresceína-isotiocianato (FITC) para gerar uma sonda fluorescente. Realizou-se a marcação por fluorescência, por meio da incubação da proteína [loib-dird de ligação a OPG de recombinante, com éster de succinimídílo do ácido 6- -h ®®a® d.:. co (Molecular dar de 1:6, durante 12 de ligação a OPG marcada por cromatografia de í de medula óssea de rato f luoresceína-5- í® ú;

Probes, Eugene, OR) , numa relação horas, a 4 "C. A proteína j 1SíH3X&.

a OPG com FITC, foi depois c filtração em gel. Isolaram-se eálul e incubaram-se em cultura na presença de CSF-l e proteína de luorííprad a OPG, cnrrmr®®; descrito no exemplo 10. tez-se a cultura das células de medula óssea de rato durante a noite, no seio de GSF-1 (30 e proteína [158-316] de lÃyâçãg a OPG (20 ng/rttL) . Retiraram-se as células não aderentes primeiro e armazenaram-se em gelo e removeram-se as células aderentes remanescentes por incubação com um tampão de dissociação de délUl-M (Sigma Chemicals, st. Louis, MO), aglomeraram-se com a população não aderente e depois coraram-se com FITC-proteína de ligação a OPG, conforme descrito antes. Após a lavagem e uma nova suspensão no seio de STF com ASB a 0.,5 %, expuseram-se as células a FITC-proteína de ligação a OPG, lavaram-se, depois fez-se a sua contagem por SCAF. A população áao; células que tinha sido positiva para a coloração com FITG-proteína de ligação a OPG, foi recolhida e isolou-se o ARNrtt, conforme descrito no exemplo 2. Esta preparação de ARNm foi utilizada para fazer uma biblioteca de ADNc seguindo os processos descritos no exemplo 2. A biblioteca de ADNc produzida a partir desta fonte, foi utilizada para análises de sequência de EST aleatórias, como foi previamente descrito na publicação da patente de invenção PCT N°. WO 97/23614 e em Simonet et al. (Cell 89, 309-319

(1997)). Utilizando este processo, detectou-se ADNc de ~2,1 kb que codificou uma nova proteína relacionada com o receptor de FNT. A secção de leitura aberta longa do ADNc de RDAO de naurino, codifica uma proteína de 625 resíduos de aminoácidos e contém as características da marca das proteínas relacionadas com os receptores d® FNT: g» péptido de sinal 1!àrcdl/biá:® na sua terminação N, quatro sequências repetidas ricas em cisteína em tandem, um déml:á.te ae transmembrana Li·..·. e ; de i.inelIÇSçi::':· citoplásmico. A immlcgid desta proteína ocm outros membros da família dos rórmipltt-i-m de FNT e a sua expressão cm célcudc ae medula óssea que se Itqm i proteína de a CPG marcada com FITC, sugere <pe é em receptor potencial para a proteína de ligação a OPG relacionada com o FNT. Esta proteína é designada por RTAO, ou por diferenciação de osteoclasto e receptor de acui. vmçic·. A sequência de ácidos nucleicos e a sequência de aminoácidos prevista para RDAO de murino, está indicada nas figures 10 A-F.

Análises recentes de sequências que «tló disponíveis publicamente em bases de dados, indicam que esta proteína é o homólogo de murino de uma proteína humana relacionada com o receptor de FNT, conhecida como RANK (Anderson et ai., Nature ·.·:· ···: ·>: ··: i ··>. >>: ·:· . ·*. uvo, ; í ·:;··· ·.. í 3· ; · r? >· : .5 .

Exemplo 13

Produção da proteína RDAO recombinante em células de mamífero

Produziu-se um domínio extracelular de RDAO solúvel fundido com a região Fc de IgGl humana, utilizando processos para a construção e a expressão de proteínas de fusão de Fc, conforme descrito previamente na patente de invenção WO 97/23614 e em Simonet c·. al., supra. Para gerar a proteína RDAO solúvel em células de mamífero, amplificou-se por RCP ADNc que codifica um domínio extracelular de RDAO de murino (aminoácidos 27-211) oom o seguinte conjunto de iniciadores de oligonucleótídos: 5' TCT CCA AGC TTG TGA CTC TCC AGG TGA CIC C-3' (SEQ ID N°. 373 W%' no

Realizaram-se as reaccões de RCP num uclum® de 5 çC uma unidade de polimerase de ADN ÍNew England iíibs i; ^ seio de Tris-HCl 20 wM-t a pH 8,8, KCl 10 ÇmidaâvC 10 mM,

Tritcn-XlOO a 0,1 %, 10 μΜ de cada am de dNTP, 1 μΜ de cada iniciador e 10 ng da matriz de ADNc de ASM;As reacções realizaram-se a 94 "C, durante 3C segundos, a 55 "C, durante 30 segundos e 72 "C, durante 1 minuto, para um total de 16 ciclos, "solou-se o fragmento de RCP por electrofcrese. C fragmento de RCP criou um sitio de restrição de HindIII na extremidade 5' e um sitio de restrição de Notl na extremidade 3' . HindIII-Notl digeriu o fragmento de RCP, que foi depois subclonado em secções num vecror pCEP4-Fc modificado face à sequência da cadeia pesada de IgG-yl humana, conforme se descreveu previamente na patente de invenção WO 97/23614 e em Simonet et al. supra. Introduziu-se um ligante que codifica dois aminoácidos irrelevantes, que se encontram na junção entre o domínio extracelular de RDAO e a região Fc de IgG.

A estrutura foi então digerida com Nhel e HindIII e inseriu-se numa secção o par de oligonucleótidos enrolado que se segue e que codifica o péptido de sinal de OPG (aminoácidos 1-21):

5' -CTA GCA CCA IGA ACA AGT GGC TGT GCT GCG CAC TCC TGG TGC TCC TGG AGA TCA TTG AAT GGA CM CCC AGA-3' (SEQ ID N°. 39)

TTC TGG GTT GTC CAT TCA ATG ATG TCC AGG AGC ACC AGG AGT GCG CAG CAC AGC CAC TTG TTC ATG GTG-3' (SEQ ID N". 40)

Cm 1igMits que codifica dois cmiccâcidoc irrelevantes foi introduzido entre o pipiido de sinal de OPG e as sequências de EBML A estrutura final tratada por engenharia gci-dfiSíí : CQÀO- Fo./pCCi-í 5 codifica ama proteína de fusão que saddic desde a terminação amino até à tacmastclo carboxi: ligante de peptido de sinal de OPG (arninoácidos 1-21), ligante (arninoácidos 27-211) de RDAO (Lis-Leu), Fc de IgG humana (Ala-Ala).

Transferiu-se a estrutura para células 293-EBNA-l pelo processo do fosfato de cálcio, conforme descrito (Ausubel et al., Gurr. Prot. Mol. 'Μ·ϋΊ, 1, 9.1.1-9.1.3, (1994). Seleccio- naram-se então as células transfectadas em 20C pg/mL de higromicina AlltCivBRld e agruparam-se as culturas de massa resistentes ao fármaco resultante e deixaram-se crescer até à confluência. Lavaram-se as células em STF uma vez e depois fez-se a sua cultura em meio isento de soro, durante 72 horas. Recolheu-se o meio condicionado. A proteína de fusão de RDAO-Fc no meio foi detectada por análise de transferência de anticorpc/proteína (Western) com um anticorpo anti-humano de Fc de IgG.

Purificou-se a proteína de fusão de Fc por meio de uma cromatogrãfia em coluna da proteína A (Pierce), utilizando os processos recomendados pelo fabricante. Submeteu-se então 5 pmoles da proteína purificada a uma análise da sequência de terminal N, por meio da degradação automatizada de Edman, como está de uma forma essencial descrita por Matsudaira et al. (J. Biol. Chem. 2£2, 10-35 (1987)). A sequência de arninoácidos que se segue foi lida após 10 ciclos: A actividade de ligação de F17.: --Fr com a proteína ae ligação a OPG, foi analisada por meio da imunofluorescente de culturas de células de CCS-7 braiPiconforme descrito no exemplo 2. As células de CCS-7 foram lipofectadas com 1 pg de um vector de expressão, contendo ADN que codifica a proteína de ligação a OPG de murico. Passadas 48 horas de incubação, incubaram-se então as células no seio de uma solução de STF-SBF contendo 10 de Fc de IgG humana, RDAO-Fc ou proteina de OPG-Fc, a 4 °C, durante 1 hora. Lavaram-se então as células duo» vezes com STF e depois incubaram-se no seio á% uma solução ae STF-SBF contendo 20 pg/mL de IgG anti-humano, de cabra, marcado com FITC íGMtlwiTí Biotech Associates), durante mais i hora. Depois da lavagem com STF, examinaram-se as células por microscopia confocal (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imagina, Inc., Okemos, MI). Tanto RDAO-Fc como OPG-Fc ligaram-se às células de COS-7 transfectadas com LOPG (figuras li A-C).

Exemplo 14

Actividade biológica in vitro de RDAO solúvel, recombinante A capacidade de RCAO para inibir a estimulação da formação de osteoclaçtos por meio da proteína de ligação a OPG, foi avaliada numa cultura de medula óssea de rato, na presença de CSF-1 (30 ng/mL) e proteína de ligação a OPG (5 ng/mL). Os processos para a utilização das culturas de medula óssea de rato para estudar a maturação dos osteoclastos, estão descritos na patente de Invenção WO 97/23614 e no exemplo 8. A proteína de fusão de RDAO-Fc, produzida como se descreveu no exemplo 12, foi adicionada así concentrações de 65 a 1.500 tg/Mn Avaliou-se a ftnmaçâo de osteoclastos por íscco da citoquímica da fosfatase alcalina resistente a tartrato (FART) e um ensaia da aòiuçfc do FART passaaos cinco dias de Aiu

Uma iAÍddçãd aa J-orjsaçiP de osteoclastos, dependente da dose, por neíc da foMo de foi observada tanto r>.-·r

A como pela actividade de FART (figuras 12 proteína de fusão de RDAO-Fc inibiu a fbmapb de osteoclastos soss uma 01¾ de cerco de 10-50 rg/mL*

Rxgnmlg 1§

Actividade biológica in vivo de RliS solúvel, recombínante

Ratos jovens BDF1 machos, de crescimento rápido, com 3-4 semanas, receberam doses variadas de proteína de fusão de RDAO-Fc por meio de uma única subcutânea diária em veículo (STF/ASB a 0,1 durante quatro dias. Fez-se um raio X dos ratos no dia 5. As doses da proteína de fusão de RDAO-Fc utilizadas foram de 0,5, I.e 5 mg/kg/dia. Para cada tratamento, todos os ratos nesse grupo e no grupo de ccntrolo que receberam STF/ASB a 0,1 %, foram radiografados num filme único. A região metafisial proximal da tíbia foi comparada entre pares de controlo e as tíbias foram tratadas e classificadas com um "+" se a tíbia tratada estava mais densa por avaliação visual do que o controlo, originando as 8 classificações mostradas a seguir. Foi necessária uma pontuação arbitrária de 5/8 pana uri resultado "positivo". (A dose está am mg/kg/dia). (n - 4).

Depois do sacrifício, retirou-se a tíbia direita de cada animal e mediu-se a densidade na metáfise da tíbia proximal por meio de tomografia computorizada quantitativa periférica iTCçp; (Stratec, Alemanha). Analisou-se duas secções transversais Se 0,5 « de osso, 1,5 mm e 2,0 ãim da extremidade proximal da tíbia (XMICE 5.2, Stratec, ÃisrPahhal, para determinar a densidade mineral fntâl do osso na metáfise. Utílizou-se um de súúnrugla úq tecido mole de 1..550 para definir a fronteira do osso metafisial . A administração de RDAO-Fc em ratos jovens en crescimento, inibiu a reabsorção do osso na placa proximal de crescimento da tíbia, produzindo uma região com uma densidaae +óssea aumentada, que era evidente quer visualmente, quer na radiografia. As alterações radiográficas foram evidentes com dose de 1,5 mg/kg/dia e aoses superiores em duas experiências (quadro 1) . A medição da densidade óssea por TCQp em amostras da segunda experiência numa região semeihacte da tíbia, confirmou o aumento da densidãde óssea dependente da dose nestes ratos (figura 13).

Quadro I

Inibição da reabsorção do osso pela proteína de fusão RDAO-Fc HA :.r íHHraía 1 1 Factor Dose 1 2 3 4 5 6 7 8 Resultado i \ · v: 4·· ··· r A Ã- T 4,; ;...... !.....................T7'" : ............ 1. A ’V '*· w Á' ·*· f A ________________________________________........ 3,5 - - ™ " ~ ... ... dngstxr.í·: 0/i :v: 1 ·.,· f .V S . ... ... V, ... ,v •Λ· Aegativo 0/1 _ Experiência 2 Factor Dose 1 2 3 4 5 6 7 8 Resultado a A Φ: A •t·· OoãitAvo S/S RDAC-Fc 1,5 4- + + A + + 4- + Positivo iv/ã 0 r-;i *'“........ Ά ;:í - ~ 4 “ — " V.·. ..................v. ν.-.ν.ν.ν. .v.v.v.v. v.·.·.·

OTAOEK DAS SEQUÊNCIAS

(í) REQUERENTE: Amgen Inc. POD TE 1 U0

OPOA : r;:;

MERO (A) ENDEREÇO: Amgen Inc. (B) RUA: One Amgen Center Drive (C) CIDADE: Thousand Oaks CD· ESTADO: Califórnia

(E) PAIS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 (A) TIPO DE MEIO: Fioppy aiçk

(3) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

00 SpUoOO: OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PaL.nntln Release #1.0, VO^MA #1 plD DADOS 30 PRESENTE PEDIDO DE PATENTE 00' INVENÇÃO:

(Α) ΝΟΜΕ: Winter, Robert B. DE ETIQUETA: Ά-451Β (2) INFORMAÇÃO PAPA. A SEQ ID N°. 1: (I) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2295 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples :;D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS ÍBÇ LOCALIZAÇÃO: 158..1105 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. I: CCACTACTCG « - ' CCGGCGAGGA CCTCTGTGAA CCGGTCGGGG 6 _________ ACTCCGGGCG CGGCGCC ATG CGC CGG GCC AGC CGA Arg Arg Ala Ser Arg 111 •õai Mil TAG la::· ::n 111· 111 GGC lç 1 Asp Tir Gli Lis Tir Leu Arg Ser Ser Glu Glu Met Glí Sei Gli Pro 51 10 GTC YCA 111' 271 Glí Vai Pro Pro Leu His Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala 25 GCC 30 35 319 p.Q ;·; -v iÔ.Ç Ala Aiâ Ser Ser Met Fen Leu Ala Leu Leu ,· · ·λ .· 95 Λ ........ 50 367 Leu GLi ll :U V 3 J, vai Cis Ser Ile A 1 a e Fen Leu Tir 55 ii éb 70 CGA GCG CAG GAT CCT Ôll. irá TC A GAA GAC :i ;l . •Λ Λ 1 Fen Arg Ala Gin Asp Pro Asn Arg Ile Ser Gr u Asp Ser Ire i O E0 85 TGC TTT TAT AGft cis MC GCA GGT TIG r s ç 463 cis Fen Tfr Aig 90 • í* C-;c·. Arg Leu Eis 95 Glu Asn Glí Leu uiU Acp

TCG ACT CTG GAG AC-T GAA GAC ACA CTA CCT GAC TCC TGC AGG AGG ATG 511 Ser Tre Leu Glu Ser Glu Asp Tre Leu Pro P.sp Ser cis Arg Arg Met 1C 5 110 115 AAA CAA GCC TTT CAG GGG GCC GTG CAG CTG CAC ATT GTG 559 L i s Gin Ala Ken Gin Gli ο'ίίΐ Gin LÍS 51 n Leu Gin His lie Vai 120 125 130 GGY CCA CAG CGC TTC TCA GGA GCT CCA GCT ATG ATG GAA GGC TCA TGG 607 •H i—j CD Pro Gin &·£§ Fen Ser Gll Alâ Pro Ala Met Met Glu Gli Ser Tre 135 140 145 150 TTG GAT GCC CAG : vT: isGC CCT GSS GCC CAG CCS. TTT GCA CAC 655 Leu Asp val Ala Gin Arg Cli :? Pro Glu A 1 a Pro Fen A 1 a His 15o 160 165 CTC C ATC ãat GCT GCC AGC ATC CCA TCG GGT TCC YÀT •sí'·'·'. GTC ACT 703 Leu Ire Xle Asn A i a A i a S e r Ile F r o Ser Gli S e r His LÍS Val Tre 170 175 180 CTG TCC TSG TAC CAC GAT CGA GGC TGG GCC AAb ATC TCT AAC AVG 751 Leu S e r Ser Trp Til Hrs Asp Arg Gli Trp A 1 a LÍS Ile S e r Asn Met 185 190 195 ACG TIA A£ íva:: GGA Í;£v\ CTA AGG STT c CAA GAT GGC TTC TAT TAC 7S9 Tre Leu Ser Asn Gll Lis Leu val Asn Gin Asp Gli Fen Tir TAT: 200 205 210 CTG TAC GCC AAC ATT TGC TTT CGG CAT CAT ::¾¾ RCA TCG ggA AGC YTA 847 Leu Ti r A i a Asn Ile C Í s Fen Arg His His Glu Tre Ser G 1 i Ser Val 215 220 225 230 CCT ACA GAC •V:Vt CTT CAG CTG ACG GTG TAT GTC GTT AAA ACC AGC ATC 895 Pro Tre Asp Tir Leu Gin Leu MCE Val T i r Vai Val LÍS Tre Ser Ile 235 240 245 AAA ATC CCA ACT TCT CAT ísÂY.v CTG ATG AAA GGA GGG ACC ACG AAA c 943 L i s lie Er o Ser Ser Kis Asn Leu Met L i s Gli Gin Ser Tre L i s Asn 250 255 260 TGG TCG GCC AAT TCT GAA TTC CAC TTT TAT TCC ATA MT GTT GGG GGA 991 Trp Ser Gli Asn Ser Glu Fen HÍS Fen T i r Ser Ile Asn Val Gli Gli 265 273 275 TTT TTC AAG CTC CGA GCT GGT GAA GAA ATT AGC ATT CAG GTG TCC AAC 1039 Fen Fen L i s Leu Arg A 1 a Gll Glu Glu Ile S e r Ile Gi n Val S e r Asn 280 285 290 CCT TGC CTG CTG GAT CCG GAT CAA GAT GCG ACG TAC TTT GGG GCT TTC 1087 Pro S e r Leu Leu Asp Pro Asp Gin A s p Ala Tre T i r Fen Gli Ala Fen 295 300 305 310 GTT CAG GAC ATA GAG TGAGACTCAT TTCGTGGMC ATTAGCATGG 1131 LÍS Vai Gin Asp Ile Asp 3 i 5 AAÍA Η1ΕΓ :;'í >:C ( CÍ-L-í:·. & p,; xiSM1 GTGTAAGACT

ATGGCCCACG GTGTATGMA CTCACAGCCC TCTCTCTTGA GCCTGTACAG

CGATGCTTAT

CCCCTGGACA

TATATTTCAG

(A) COMPRIMENTO: 316 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 2: ò:L;:::Ç. íO:n >V v· 01 Ala Ser Arg Asp Tir Gli Lis Tir Leu Arg Ser Ser Gin J. 3 10 15 Glu Met Ser Glí Pro Gli χίΑ í g : . . His Glu Gli Pro Leu ;Ç :V oi 2C 25 30 !'í y j\ Ser :õ Λ. Pro A 1 a M 0 Pro Pro Pro Ala Aia Ser Arg S e r 35 4 ;ί' 45 Met Fen S,'í Leu Gli Lsv: Gli Leu Gli Gin Vai Vai Cís Ger 50 55 63 Ç LO _v. *: ό.·Ό:'Ά Fen Leu Tir Fen .··: ·:··:’< Gin Met Asp Pro Asn Arg Ile 65 / 0: 75 80 Ser Τ.:!φ Ser Ire Cís Fen Tir Arg lie Leu Arg Leu His 1:: 85 90 95 Lsn .0. : ::· leu Gin Aso Ser Glu Ser CL u Asp Tre Leu .iro. 735 1 o 1 V lie VT<31 Glí ·.·: ·:·. :.·· Ϊ: -.· · ·.·.· O:'·.·.· v-. 130 LLi Ã Ò :'·.·· 145 ·.· 4- Gin -:00:.-. Asn Ala í\ .1 Ò:: S e r íle ?rc Ç OV.·: i 75 185

Ala Lis Ile Ser Asn Met Tre Leu Ser Asn i: 1X i./i S V.viG Asn 193 200 2C5 V ;i -· ; ·,· Lis:: Ala Asn Ile Cís Fen Li A Eis His 1 223 ·.··· ÃÇU.·:- ' ÕL X Aft;:·' Seí:. Fr::;- Tre V; VQ/V Tir Leu Gin Gsg w.s.r L>.·: 'i'G r 235 .1 ; ·.· .·>; ,'i·. iLe Pro Ser Ser His AS": Xi :0:0:1 U. Lis 11 1 L50 255 Άι • ’· i 3 Ser Tre Lis Asn Trp Ser Gli Asn G.-:-. G fen .CL Li. Fen Tír 2 60 265 * : * ·*: : > Si i Gen l:Í Leu Arg Ala L i ,--. 5 ·. . ·: Ile l)'ò 280 285 Sei lie biin %:1 Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Lifi ASO Ala 190 295 300 Tu* Fen Gli Alá Fen Li s: VÉ1 1 Gin Asp Ile Asp 305 310 315 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2274 pares de bases *B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) J NOME/CHAVE: CDS i LQCAU CM/ÃO: 185..1135 $CUlíM dá CLígUÈUíI/A.: SEQ ID N°. 3:

Met Arg Arg Ais. Ser Arg Χν.··: 1 5 ATG GGC GGC GGC CCC GGA Glu Met Gii 9 g Gii Pro Gli CCG CCG CCG CCT GCG CCG SAC • rí Pro Pro iro Pro Ai a Pro Eis 35 ATG TTC GTG GCC CTC CTG CGG CTG Yet Fen Ala Lei; Leu 11,1 Leu 55 55 GTC GCC CTG TTC ITC ϊ'ΑΤ TTC AGA Vai Ala Leu Fen Tir Fen AíiJ 65 7 0 TCA SM GAT GGC ACT CAC TGC AT? Ser Glu Asp Gli Tre Eis Cis Ile 80 85 AAT GCA GAT TTT GAC ACA Asn Ai a Asp Fen Gin Asp Tre Tre 100 ATA CGT GAT TCA LGT AGG AGA ATT Ile Pro Asp Ser Cis Arg Arg Ile 115 CA?'·. MM GAA TTA CAA CAT ATC GTT Gin Lis Glu Leu Gin His Ile Vai 130 v ·. MA GCG ATG GTG GAT GGC TCA TGG Lis Ala Met Vai Mg Gli Ser Trp 145 150 CTT GAA GCT CAG CCT TTT GCT CAT Leu Glu Ala Gin Pro Fen Ala His 160 165 CCA TCT GGT TCC CAT MA GTG ACT Pro Ser Gii Ser Hís Lis Vai Sei 180 GGT sss GCC ATC TCC AAC ATG Trp Ala Lis Ile Ser Asn Met 195 GTT AAT CAG GAT GGC TTT TAT TAG Vai Asn Gin Asp cl i Fen Tir Tir 210 215 CAT CA.T ΟΤΙ'. 7. ACT T Cri GGA lAi: CTA íiis His Glu TTE Ser :l.ii Leu L23 230 gtg GTC A.CT ACC AGC ATC Tir Tra 1,13 Tre Ser Ile 240 245 ATG AoC ACC A Aí 5 TAT Met Sii Ser Tre Lis rp Λ ... 1 .,· c. 260 np Tre Lis Tir reu Arg GI í Ser iC> 15 GCC CCG CAC GAG CCC CTG CAC Fro Eis Glu Gli Pro LGGv His 25 30 CAG CCC CCC GCC GCC TCC GUI TCC Gin Pro Fro AI. a Ala Ser Arg Ser 40 45 GGG CTG CAG GTT QTC AGC 11.1 M··· Sl.i Gin 60 Lâ.i Cis Ser GCG CAG ATG GAT CCT ALT AGA ATA Ala Gin 7'5 Pro Asn Arg lie TAT AGA ATT TTG AGA CTC CM' Li x! Arg Ile Leu Arg Leu His Glu 90 05 GTG GAG AGT CAA GAT ACA TTA Leu Glu Ser G ln Asp Tre Lis Leu 105 110 &&& CAG GCC X ::>G CM f>GA GCT GTG Lis Gin Ala Fen Gin Gii Ala Vai 120 125 GGA TCA CAG CAC ATC AGA SCA GAG Gli Ser Gin His Ile Arg A1g Giu 140 TTA GAT CTG GCC AAG AGG AGC AAG Leu Lei; Ala Lis Arg Ser Lis 155 CTC ACT ATT AAT GCC ACC GAC ATC Leu Tre Ile Asn Ala Tre Asp Ile 170 175 CTG TCC TCT TGG TAC CAT GAT CGG Leu Ser Ser Trp Tir Eis Asp Arg 185 LM ACT TTT AGC MT GSA CTA ATA Tre Fen Ser Asn G,;,Í iii.3 Leu? lie 200 205 CTG TAT GCC ATT TGC TTT CGA Leu Tir Ai a Asc Ile Cis Fen Arg 220 GCT ACA GAG TAT CTT CAA CTA ‘ΆΦΓ* AI G Li a Tre Giu Τ'Λ·';*1 Leu Gin Leu Met 235 LIIV ATC CCA AGT TCT MT ACC CTG lilS Ile Pro Ser Ser His I r θ Leu 256 255 TGG VjvXV GGG AAT TCT uAA TTC ΙΙΊΙ Gli Asn Ser Glu fr;- His 26b 'Pxl TAT MA ISII Fen λ Ser 11 e CM; Asn ALI AGC A'.M GAG Glu Ile Ser 290 Ile GAT GCA ACA TAG TTT Asp E13 Tre Fen ^ ’—i rd o > Gli reri i Fen GTC Vâ-L TCC Ass 295 Pro ΐ OL Ser GGG Gii GCT Ala TTT Feri L is Vai

Lis TTA CGS Ser 285 Gli im Leu CTG GAT Pro GAT Asp uGA Arg Asp AT/; Ile Asp

•ϊ r·:

É: (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°. 4: i. i) CARACT EEISTIOE.E EA. 0 Ey (A) COMPRIMENTO: 317 aminoácidos (R) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear I:TEO DE MOLÉCULA: proteína DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 4:

Fen rir 0 iò:i: Arg Ala Gin Met Asp Pro Asn Asg ile Ser 7 0 75 ·:: r\ S:Sp Glí Tre Cis Tir Org Ovn feo Li® Glu Asn Ala Síf"; Asd Tre Tre Leu Glu Ser Gin Asp Tre Lis Leu Ile 1C5 110 ílr;·' Asp Ser ÉpÇ Ile Lis Gin :Í,L;Á: Fen Gin Glí Ala V a. 1 Gin 115 i z u 125 Lis Glu ϊ> Gin His ϋθ Vai Gli Ser His Ile Arg Ala Glu Lis 130 135 14 0 Ala ’v .É: : Gii Ser Trp Leu :1,:¾ Leu Ala Lis A Ser Lis Leu 145 1 O U 155 163 ('} i :Ç: Av:S Fen Ala His Leu Tre 11 e A s π Ala Tre Asp Ile Pro 165 175 Tw?:· S e r His Lis Vai Ser Leu Ser Ser Trp Tir His Asp Ar g Gli 180 185 190 ?;:» 1:0» 1 lá Ser Asn Meu Tre Fen Ser Asn Gl x LXS Leu Ile 200 2C5 Asa Gin ÂSS· Gli Fen Tir Tir Leu Tir Ala Asn Ile Cis Fen Arg His 210 215 L20 His Glu Tre Ser Gli Asp Leu Ala Tre Glu Tir Leu Gin Leu Met Val 225 230 235 24C Π Tre Lis Tre Ser Ile Lis Ile Pro L&r His ÍSsi: 245 250 255 Lis 01: Gli Ser Tre Lis Tir Srp Ser Gli AúL Ser Glu Fen His ÍUAi. 260 265 270 no y' Ser Ile 17^1 Gli Gli Fen Fen Lis Leu Ser Gli Glu Glu 275 280 285 Ϊ ; ÇOiçu Ile SGa: Vai Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gi n Asn oo; 295 300 Tir Fen Gii Ala Fen Lis Vai Arg Asp Ile Asp 510 515 INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 5: Çy COMPRIMENTO: 52 pares de bases UA TIPO: ácido nucleíco (u ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (íi) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 5 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°. 6:

(A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TCPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°, 6 TACGCACTCC GCGGTTAGTC miOríOTOS ACTTTGA (2) INFORMAÇÃO PABá A SEQ ID N°. 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (B) TIPO: á el.de> nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 8: (i) CARACTERíSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico ; ;p- '> ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO OE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 8 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (Dj TOPOLOGIA: linear (xi) PESCROÇlA;: DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 9 (2) INFORMAÇÃO » A SEQ ID N°, 10: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (C) TOPCLOGIA: linear (ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genóiníco) (xi) ‘ DA AEAOtAÇIA; SEQ 10 N°. 10

Xi:iFC;.KAÃg,EO FADE. A FE;Ç> Fp QA .. Π: í i. QMRQQPíAPlPT (IPAP DA PBCplTPQlA ί (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIFO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear íii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 11

(A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (O) SlCFPTTQPA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Nu. 12 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 13: (i) DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 13 A.TTTGATTCT AGAAGGAGGA ATAACATATG AàOOOOlAA MGCACATTGT G (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°. 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear fi:U -ΠΙΟ:} DL MOLfDlÇlOO· all <

Del5 DLDCR:Dp.O DA DLyUÊHDIA;: SEQ ID Νσ. 14 (2) PARA A SEQ ID N°. 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 51 pares de bases (3) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 15 ATTTGATTCT ATAACATATG CAGCGTTTCT CTGGTGCTCC A (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 16 (A) CíMPRIMEMTCd 40 pares de bases linear ;· : “5 :S' !\·: ι.Λ X ;Λ Χΐ ,’Λ·. . :x; %. w ;·ν, x !-·· . í ' X:· X- . >:·>: 0 0- X1· ν.ν’ Χν U y·' X·’· v,.' ΐΧ; Λν;.' •·ν >& .··; 0 y.vj X y.‘.y •/‘Λ 1 Sv X;· XX, ,/v. Λ'Λ·.· •Λ'Λ1 ί·Ρ '•ν; ϋ Η) "y :0 .ί·> ;····' V v X: P P ,x: . 'v.v ·;·ν,·, :· ΐ :;·ί· ί X; .'/· •'ί Μ Η vXv ‘ V V y '···' V-.v· Ix <n- P; >yj '•'X '\·,·Υ ;·.«·; Λ· , Λ ·,ν ·: $ 0 0 ‘{ Λ. V 0 I ”í ..,¾. ί ' ;:'v Ρ 0 Χ0 \·ν 0·, X * 0 X li . Λ 3 y.;\ 0 ν V ί 0 1 d y\ H 0 'H' n *4' : λ'λ ' * 0X d >'-Í . η Χί • V Η Χί Η ί"! νϊ X0 ¥ $ . y-: Η iv· .¾ í d, · $ ',’Λ· u d Λγ,| Χν χν; Τ·:' S 0 Η |v 'S H 1 ' ν,'Λ '.•V 1 y.·' "ν' !y\ X; I i AV. ,χ > \v XX | 'V· 0 y Χΐ· $ d :0 /vi’ /ν’ ;Γ*· Í.Á ίΧ: 0 . ,’.V :í.v 'È ::X P :)> 0 Λ.Λ ’w : ι·ί 'i λΚ 0 '.X' 0 X;V ΛΥΛ X‘ Γ: ' si *·: > H >>> λ-Í !v Vm' r: '''} Η J'·) d 0 V p x·· V..' Ç: :-:x I H v. X $ S x, :Υ\ # I: Η 0 1 Χί §' ;Χ, 0 χ: . V·) ;···, 0 V . X; Ííi 0 P \·>ν d P y xS M x pi- H 0 % Ρ X ' * d % ,ρ Χ.ν! ω ϊ :¾ y,;y í": •V’·. .· V X· d ν*Λ .v;; w: W χ:· S»' d λ·-:: Ρί Η ρ X 0 .V <>·· v·, X /·>, p 0 P X 0 ϋ 0 νν'· Q Ví ;Χ·ν li ;ν’Ί X X 0’ Η XX c: ,v ή .*/1 pv) . ;*:·' . | s í·0· Λ' d :·0 •ΥΛ wí X' :s X X f Λ'·Λ v ív "V ΛΝ, yv :v:· ' Η X. ·0χ Π •0" ζ 0 yi \ Λ.Λ yvi' V·.1' • Λ 0 &: λ·'·> r\ 1' Λ.ν P ϊ,,ί \ ’·;1 vi .·>0 0 ϋ XX v·:* <·;% P o d Sí X t d. , V Ρ; ::::::: . ν,;0 ν'.ν d Η 2 0 'Η; H x vyy Ô .X X X; ::νί 0 0 *«' t 0 .VV «V, d Sv· ( ί-ν· i: xi ΧνΛ II Λ-*. .,0, . \vy P X n íP> p d S Γ’· X # iQ 'iS é d X φ P': ν·ί -·>\ ψ •ίϊ ί,,: '· :> '·! !: αι (D x xx vx X :X P φ iisí P' 1 J Ί 0 d W 3 # Xv ;P. ;,Ví' 0 Ο 0' p: & X -A· > P =Χ ,χ;·,. 0··' 0 .0 X :;y‘ ••v .p-·· d f k'V H 'Í-V. Γ' Λ\ ·' t-i Ú: 0 d X: $ W ' X 0’ H d γ.>ν ‘X·,·! 1 P X è \ν. :·:χ 0 v;v p ç § Ρ (2) INFORMAÇÃO RAIS A SEQ ID N°. 20: (i) ......ΓΟΟ: DA SEQUÊNCIA: (Ã COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (Cj ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 20 TACGCACTCC GCGGTTAGTC TATGTCCTGA ACTTTGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (íl) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 21 bases (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares d* {Β) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (li) TlRCi DE MOLÉCULA: ADN (genómíco) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 23:

(A) COMERIMENTO: 65 pares de bases (E) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (2) A SEQ ID N°. 24: ITlRACOdlRtUTIiOlS DA SEQUÊNCIA: (h) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (3) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (íí) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 24: SAB.A A .SEQ IP P*, 2s ΟΑ.Αΐ,'ύ - ; :··;·'..... IA í (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear XI DO PP ίΡΡΟΡΟΑΡΑη AON {q-çn v : ;Ç;, (xí) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 25: GTTCTCCTCA TATGACTAIT AACGCTGCAT CIATCCCATC GGGTTCCCAT M (2) INFORMAÇÃO SARA A SEQ ID N°. 26: (i) CAFACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3 7 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (3) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear 101¾ M; HOLÇOOLa:: ADN íuoruioTcei 30

TGTACTTTCG AGCGCAGATG (2) INFORMAÇÃO MRâ A SEQ ID N°. 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 28 (A; COMPRIMENTO: 46 pares de bases (R: TIPC: ácido nucleíco (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (E) TOPOLOGIA: linear (íi) TIPO DS MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESÓLIÇAO CA . ------; ÇEQ ID N°. 2 9

CETCTCTCGL GTGGAGAACC GCCCAGCC ATTTGC (2) INFORMAÇÃO ΨΜ& A SEQ IO N°. 30: Λ" ,;.v *lv Λ* • o ,i ibÃ (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases; (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPGLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 30 CCTCTGCGGC CGCGTCTATG bLSTSMSTõ TG (2) IlbrORNAÇÃO DA SEQ ID N°. 31: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (Bb TIFO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

AGCTTCCACC MwAAWA;? GGCTGTGCTG CGCACTCCTG GTGCTCGTGG ACATCA (2) lAFDEMAÇÂ-O PARA A ÇEQ ID N°. 32: shí COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C: ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) ΙαϊΟΟαΤΟΑΟ DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 32: TCGATGATGT CCAGGAGCAC CAGGAGTGCG AYTTGTTCAT GGTGGA 56 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: ià) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (E) TIFO: aminoácído (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: Linear cii · TIFO DE ÍAU3ÉCULA: proteína ÍXI) OB:oÇFC:p.O DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 33:

Ser

si:: Ate A.l .* Gaí.- lie Pro A:·:.:; Glí: Ser Eis Lis Vai Ire Leu I

5 iO (2) TMMOTiTMCiMi PARA ASEQIDN0. 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (AS COMPRIMENTO: 28 aminoácidos (B} tipo: amir^ásíds ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DÊOCRIÇAO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 34:

Ala Aia Ser Ile Pr o Ser Gli Ser Hís Lis Vai Tre Leu Ser e 10 15 Tír His Asp Arg Glí r Ala LIs TB: Ser Cis 2C 25 BL ICÃO PARA A SEQ ID N° . 35: U'I i~1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (E) TIPO: aminoácido iCi ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ií) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

Ui COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico ÍC) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear

Lil; TIPO DE UUÉCLUiU ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO CA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 36 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 37 -ç LO < m COMPRIMENTO: 72 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN ígenómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. SE: [M CCMPRIMENTO: 72 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples ÍPS TOPOLOGLA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 39: AGCTTCTGGG LTGTCGATTC ARiCCLãilICC AGGAGCACCA (IGAíLIÇÇCC (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°. 40: I Ç ·; ;'-· 0' yv íl ,;':vvp: '·''· n; T ··"*:·'. -ι-γ > xpx;·: ,··- g; x. > :O.i VAIA·, á Ê-: C\ A. -.0' Ã 'v: .11 ;Q:: >.0.0:1 Q0'.ÇvQy'v:: ÃvÃí':-. .LÃ'· > (A) COMPRIMENTO: 3 aminoácidcs (B) TIPO: aminoácído (C; ÊSTÃUTUEÃ HELICOIDAL: simples D) TOPOLOGIA: linear

V I ΤΓΘ LeU 0.::.¾ Vaí fie PrO 1 5

Lisboa, 6 de Agosto de 2007

Claims

!1I¥IM£!ÇÔÍ§ 1. Utilização de um anticorpo, como modulador da proteína de à osteoprotegerina (pl de 09$$., caracterizada pelo facto de se destinar para a de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de aoenças ósseas, em que o anticorpo ou um seu fragmento é um antagonista que se liga à pl de OPG das figuras 4 ,&-"F (SEQ ID N°. 4).
2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento.
3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser um anticorpo recombinante ou um seu fragmento. 4· Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto do anticorpo ser um anticorpo quimérico ou um anticorpo enxertado em RDC (região de complementaridade). ^· Utilização, de accrdo com a reivindicação 1, caracterizada peio facto de o anticorpo ser um anticorpo humano ou um ae-s fragmento. Utilização, ;|ç acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser preparado por imunização de um animal transgénico capaz de produzir anticorpos humanos. v Otilitiiçaoí dí,: acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fMCtò de o anticorpo ou um seu fragmento se 1 ligar a um epitopo no domínio extracelular de pl de OPG ou de se ligar a um epitopo num fragmento do domínio extracelular de pl de OPG.
8. Sli.líssglpj, de acordo com a reivindicação X, caracteri-zada pelo facto de o anticorpo ©« um seu fragmento se ligar a forma associada à membrana de pl de OPG.
9. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo facto de o anticorpo ou um seu fragmento se ligar a uma forma solúvel da pl de OPG.
10. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo facto de o anticorpo ou um seu fragmento compreender ainda um diluente, veículo, sclubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
11. Utilização, de acordo com a reivindicação 9, caracteri-zada pelo facto de a forma solúvel da pl de OPG compreender os resíduos de aminoácidos 69-317 das figuras 4 A-F (SEQ ID NO: 4) ou um seu fragmento. 1%. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo facto de o anticorpo ou um seu fragmento ser administrado com um cu mais de um dos factores morfogé-nicos dos ossos, seleccionado entre BMP-1 a BMP-12, factores do crescimento da transformação beta, um membro da família do factor beta dc crescimento de transformação, um factor do crescimento 3s fíbrebiasto seleccionado entre FCF-1 a E’CF-10, uife iníbídor de interleucina I, um iníbídor de FNT alia, ram hormona da paratíróíde, uma prostaglandína da ibíiip E, um bífosfonato ou um mineral que potência os ossos, Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zada pelo facto de a doença óssea se seieccionar no grupo que consiste em osreoporose, osteomíelite, hiper-calcémia, osteopenia associada com cirurgia, administração de esteróides imobilização, doença de Faget, osteonecrose, perda óssea devida a artrite reumatóide, perda óssea periodontal, perda prDrótioã e metástases osteolíticas. Lisboa,6 de Agosto de 2007