KR20010006405A - 오스테오프로테게린 결합 단백질 및 수용체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 용골세포에 포함되는 신규한 폴리펩티드, 오스테오프로테게린 결합 단백질을 오스테오프로테게린의 친화성을 기초로하여 확인했다. 또한 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 유사체나 유도체를 암호화하는 핵산 배열, 단백질 제조용 벡터와 숙주 세포, 오스테오프로테게린 결합 단백질의 제조 방법과 결합 검정을 기술하고, 골다공증, 관절염 또는 전이로 인한 골 손실, 칼슘과다 혈증과, 파제트 병과 같은 골질병 치료용 조성물과 방법을 기술한다. 수용체와, 이의 작용물질 및 길항물질을 사용하여 골질병을 치료한다.

Description

오스테오프로테게린 결합 단백질 및 수용체{OSTEOPROTEGERIN BINDING PROTEINS AND RECEPTORS}

생골 조직은 골의 침착과 흡수 사이에서 동적 평형을 나타낸다. 이러한 과정은 두 세포형 : 골의 유기 기질을 함유하는 분자를 분비하는 조골세포 ; 골 기질의 분해와 골염의 용해를 촉진하는 용골세포에 의하여 최초로 매개 된다. 생장하는 골을 갖는 어린 개체에 있어서, 골 침착율은 골 흡수율을 초과하는 반면에, 늙은 개체에서는, 흡수율이 침작을 초과할 수 있다. 후자 상태에서, 골의 파괴증가는 골질량과 강도 감소, 파손위험 증가와 골절의 완만 또는 불완전한 치료를 유도한다.

용골세포는 골수의 조혈 전구물질 세포로 부터 형성되는 큰 식세포성 다중 유핵 세포이다. 성숙한 기능의 용골세포의 생장과 형성은 잘 알려져 있지 않지만 용골세포는 여러가지 생장-촉진 인자에 노출에 대한 반응에서 단핵세포/대식세포계에 따라 성숙하는 것으로 생각된다. 골수 전구물질 세포의 예비 용골세포로의 초기 발육은 종양괴사 인자-α (TNF-α), 종양괴사 인자-β(TNF-β), 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-6(IL-6)과 백혈병 억제인자(LIF)와 같은 용해성 인자에 의하여 매개되는 것이다. 배양에서, 예비 용골세포는 첨가된 대식 세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)의 존재하에 형성된다. 이러한 인자는 주로 용골세포 발육의 초기 단계에 작용한다. 용골세포 형성의 말기 단계에서 폴리펩티드 인자의 관련은 광범위하게 보고되지 않았다. 그러나, 부갑상선 호르몬이 용골세포의 형성과 활성을 자극하고 칼소토닌이 더 적은 범위까지 반대 작용을 갖는 것은 보고되었다.

최근, 새로운 폴리펩티드 인자, 오스테오프로테게린(OPG)이 생체외 및 생체내에서 용골세포의 형성을 음성적으로 조절하는 것이 기술되었다(참조, 공동 소유 및 공동 출원의 1995. 12. 22일자 출원된 미국 출원 번호 08/577,788, 1996. 9. 3일자 출원된 08/706,945, 1996. 12. 20일자 출원된 08/771,777, 이는 참고적으로 여기에 혼입되어 있으며 ; PCT 출원 번호 WO 96/26271). OPG 는 OPG 폴리펩티드를 발현하는 전이 유전자 마우스의 골 밀도를 극적으로 증가시키고 난소 적출된 랫에 투여했을때 골 손실 범위를 감소시켰다. 생체외 용골세포 형성에서 OPG 활성을 분석하면, 단핵세포/대식세포 전구물질의 생장과 분화에 간섭하지 않지만 더 비슷하게 단핵세포/대식세포 전구물질로부터 용골세포의 분화를 차단하는 것을 나타낸다. 따라서, OPG 는 용골세포 형성의 범위를 조절하는 특이성을 갖는 것으로 나타났다.

OPG 는 다른 구조 및 기능적 특성을 갖는 두 폴리펩티드 영역을 갖는다. 전장 폴리펩티드의 잔기 22 - 194 에 미치는 아미노-말단 영역(N-말단 메티오닌은 잔기 1 로 표시한다)은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)계층 일원, 특히 TNFR-2 는, 시스테인 풍부영역 특성의 보존을 통하여 TNFR 계층의 다른 일원과 상등관계를 나타낸다. 잔기 194 - 401 에 미치는 카르복시 말단 영역은 어떠한 공지의 배열에 현저한 상등관계를 갖지 않는다. 많은 다른 TNFR 계통일원과 달리, OPG 는 유일하게 분비된 단백질을 나타내고 막 결합 형태로서 합성은 나타내지 않는다.

용골세포의 음성 조절체로서 이의 활성을 기초로 할때, OPG 는 용골세포 분화에 포함되는 폴리펩티드에 결합함으로써 성숙한 용골세포의 형성을 유도하는 하나 또는 그 이상 말단 단계를 차단하는것으로 예상된다.

그러므로 본 발명의 목적은 OPG 와 상호작용하는 폴리펩티드를 확인하는데 있다. 이 폴리펩티드는 용골세포 성숙의 역할을 하고 골질병 치료에 유용하다.

발명의 요약

종양 괴사 인자 계통의 새로운 일원은 친화성 프로브로서 재조합 OPG-Fc 융합 단백질을 사용하여 선별한 COS 세포에서 발현되는 마우스 cDNA 라이브러리에서 확인되었다. 새로운 폴리펩티드는 316 아미노산 길이인 것으로 예측되는 전이막 OPG 결합 단백질이고, 아미노 말단 세포질 영역, 전이막 영역과 카르복시 말단 세포외 영역을 갖는다. 본 발명의 OPG 결합 단백질은 막-결합되거나 용해 형태이다.

본 발멸은 OPG 결합 단백질을 암호화하는 핵산, 폴리펩티드를 발현하는 벡터와 숙주세포와 재조합 OPG 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 또한 OPG 결합 단백질에 특이하게 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

OPG 결합 단백질은 생물학적 시료의 OPG 수준을 측정하고, OPG 결합 단백질을 나타내는 세포와 조직을 확인하고, 새로운 OPG 와 OPG 결합 단백질 계통일원을 확인하는 검정에 사용할 수 있다. 또한 OPG 결합 단백질과 상호작용하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 화합물에는 핵산, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 소분자량의 유기 분자가 있고 OPG 결합 단백질 활성의 작용물질 아니면 길항물질로서 작용한다.

OPG 결합 단백질은 용골세포 분화에 포함되고 변환 용골세포 활성의 수준은 골 흡수를 조정한다. OPG 결합 단백질 작용물질과 길항 물질은 용골세포 형성과 골 흡수를 조정하고, 골다공증, 칼슘과다혈증, 관절염 전이로 인한 골손실, 부동화 또는 치근질환, 파제트병, 골화석증, 보철 분해 등과 같은 골 흡수 변환에 의하여 특징되는 골 질병을 치료하는데 사용할 수 있다. 또한 OPG 결합 단백질과 OPG 결합 단백질 작용물질 및 길항물질을 함유하는 약학적 조성물도 본 발명에 포함된다.

또한 OPG 결합 단백질의 수용체는 형광표지 OPG 결합 단백질에 결합하는 골수 세포로 구성된 마우스 cDNA 라이브러리에서 확인했다. 수용체를 사용하여 골질병을 치료하는데 사용되는 수용체와 상호작용하는 OPG 결합 단백질의 작용물질과 길항물질을 확인한다.

본 발명은 용골세포 분화에 포함되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 오스테오프로테게린 결합 단백질, 단백질을 암호화 하는 핵산, 단백질 제조용 발현 벡터와 숙주세포, 결합 검정에 관한 것이다. 또한 골다공증, 관절염으로 인한 골손실, 파제트병과 칼슘과다혈증과 같은 골질병의 치료용 조성물과 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 오스테오프로테게린 결합 단백질용 수용체와 수용체를 사용하여 골질병을 치료하는 방법과 조성물에 관한 것이다.

도 1. OPG 결합 단백질을 암호화하는 32D-F3 삽입물의 구조와 배열. 예상되는 전이막 영역과 아스파라긴-결합 탄수화물 쇄의 부위는 밑줄을 그었다.

도 2. pcDNA/32D-F3 으로 트랜스펙션된 COS-7 세포에서 OPG 결합 단백질 발현. 세포는 pcDNA/32D-F3 DNA 로 리포펙트되고, 염소 항-인체 IgG1 알카리성 포스파타아제 접합체(이차 단독), 인체 OPG[22 - 201]-Fc 플러스 이차(OPG-Fc), 아니면 키메라 ATAR 세포외 영역-Fc 융합 단백질(sATAR-Fc)에 결합하는 것으로 검정된다. ATAR 은 TNFR 상과의 새로운 일원이고, sATAR-Fc 융합 단백질은 32D 세포 표면 분자에 결합하는, 인체 IgG1 Fc 영역 결합과, TNFR 속 관련 단백질의 억제물로서 작용한다.

도 3. 인체 조직의 OPG 결합 단백질의 발현. 방사성표지 32D-F3 유도 교잡 프로브를 사용하여 인체 조직 mRNA(클론테크)의 노던 블롯 분석, 상대 분자량은 킬로 염기쌍(Kb)에서 좌측에 나타난다. 우측 화살표는 림프절 mRNA 에서 검출된 약 2.5 Kb 전사유전정보의 이동을 나타낸다. 또한 동일한 질량의 매우 엷은 띠가 태아 간에서 검출된다.

도 4. 인체 OPG 결합 단백질을 암호화하는 pcDNA/hu OPG bp 1.1 삽입물의 구조와 배열. 예상되는 전이막 영역과 아스파라긴-결합 탄수화물 쇄의 부위는 밑줄을 그었다.

도 5. 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]로 처리된 골수 대식세포와 ST2 세포 공동 배양물에서 나온 생체외 용골세포 발육의 자극. 배양물을 1.6 ~ 500 ng/㎖ 범위의 마우스 OPG 결합 단백질의 여러가지 농도로 처리했다. 8 - 10 일후, 배양물은 용해되었고, TRAP 활성은 용해 검정으로 측정했다. 더불어, 몇몇 배양물은 1, 10, 100, 500 과 1000 ng/㎖ 의 재조합 마우스 OPG[22 - 401]-Fc 단백질로 동시에 처리한다. 마우스 OPG 결합 단백질은 용골세포 형성에서 투약량-의존 자극을 유도하는 반면에, OPG[22-401]-Fc 는 용골세포 형성을 억제한다.

도 6. M-CSF 와 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 존재하에 골수 전구물질에서 나온 용골세포 발육의 자극. 마우스 골수를 수집하여, 250, 500, 1000 fk 2000 u/㎖ 의 M-CSF 의 존재하에 배양했다. 1.6 ~ 500 ng/㎖ 의 여러가지 농도의 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 동일한 배양물에 첨가했다. 용골세포 발육은 TRAR 용해 검정에 의하여 측정했다.

도 7. 생체외의 M-CSF 와 OPG 결합 단백질[158 - 316]흡수골의 존재하에 골수세포에서 유도된 용골세포. M-CSF, OPG 결합 단백질, 아니면 조합된 두 인자로 처리된 골수세포를 배양 웰에서 골 박편상에 배양하고, 성숙한 용골세포로 발육되도록 한다. 생성된 배양물을 톨루이딘 블루(좌측컬럼)로, 또는 조직화학적으로 채색하여 TRAP 효소 활성(우측 컬럼)을 검출한다. 두 인자를 받은 배양물에서, 골 표면에 청색 채색 막공의 존재에 의하여 판단되는 골을 침식할 수 있는 성숙한 용골세포를 형성했다. 이것은 다수의 큰, 다중유핵, TRAP 양성세포와 상관된다.

도 8. 첫번째 주사를 한후 51 시간에 OPG 결합 단백질을 주사한 마우스에서와 OPG 투여를 동시에 받은 마우스에서 전체 혈액 이온화 칼슘(i Ca)수준을 나타내는 그래프. OPG 결합 단백질은 상당하게 투약량에 의존하여 iCa 수준을 증가시켰다. OPG (1 ㎎/㎏/일)은 5 ㎍/일의 OPG 결합 단백질의 투약량으로 iCa 의 증가를 완전히 차단했고, 25 ㎍/일의 OPG 결합 단백질의 투약량으로 증가를 부분적으로 차단했다. (^★)는 부형제 처리 비교물과 다른것(P＜0.05). (#)는 OPG 결합 단백질만의 투약량을 받은 마우스의 수준과 현저히 다른 OPG 처리 iCa 수준(P＜0.05).

도 9. 3.5 일동안 0, 5, 25 또는 100 ㎍/일의 OPG 결합 단백질로 처리한 마우스의 좌측 대퇴골과 경골의 방사선그래프. 이는 이들 마우스의 근위 대퇴골 골단중절에서 가장 분명하게 나타난 골 밀도의 투약 의존감소를 뜻하고, 여기서 100 ㎍/일의 투약량으로 충분하게 한다.

도 10. 마우스 ODAR cDNA 배열과 단백질 배열 ~2.1 Kb cDNA 클론의 핵산 배열을 나타내고, 상술한 625 잔기 길이 개방 판독대의 번역을 나타낸다. 소수성 신호 펩티드는 밑줄을 그었고, 소수성 전이막 배열(잔기 214 - 234)은 굵은 글씨로 표시했다. 세포외 영역에서 시스테인 - 풍부 반복 모티프를 갖는 시스테인 잔기는 굵은 글씨로 표시했다.

도 11. OPG 결합 단백질이 트랜스펙션된 세포에 결합하는 ODAR-Fc 의 면역형광 채색. OPG 결합 단백질 발현 플라스미드로 트랜스펙트된 COS - 7 세포는 인체 IgG Fc(최상부 패널), ODAR-Fc(중간 패널) 또는 OPG-Fc(저부 패널)에 배양했다. FITC-표지 염소 항-인체 IgG Fc 항체를 이차 항체로서 사용했다. 양성 결합 세포는 공초점 현미경으로 검사했다.

도 12. 생체외 마우스 골수에서의 용골 세포 발생에 관한 ODAR-Fc 의 효과. 마우스 골수 배양물은 실시예 8 에서와 같이 확립하고, OPG 결합 단백질(5 ng/㎖)과 CSF-1(30 ng/㎖)에 노출 시킨다. 1500 ng/㎖ 내지 65 ng/㎖ 범위의 여러가지 농도의 ODAR-Fc 를 첨가한다. 용골세포는 배양물에서 5 일후 TRAP 용액 검정과 TRAP 세포 화학에 의하여 평가한다.

도 13. 여러가지 투약량의 ODAR-Fc 로 4 일동안 처리한 후 마우스의 골 무기질 밀도. 마우스에 인산염 완충 염수 부형제의 일일 피하 주사로 ODAR-Fc 를 투여했다. 무기질 밀도는 주변 정량 컴퓨터 단층찰영법(PQCT0)(XCT - 960 M, 놀랜드 메디칼 시스템스, Ft 아트킨선, 위스콘신)에 의하여 근위 대퇴골 골단중절 마우스에서 70 % EtOH 로 고정된 골에서 측정한다. 대퇴골의 근위 말단부에서 골의 두 0.5 ㎜ 단면, 1.5 ㎜ 와 2.0 ㎜ 를 분석하여(XMICE 5.2, 스트라테크, 독일) 골단중절에서 전체 골 광물질 밀도를 측정한다. 1500 의 연질 조직 분리 역치를 사용하여 골단중절 골의 한계선을 정의한다. ODAR-Fc 는 투약 의존 방법으로 근위 대퇴골 골단중절에서 골 광물질 밀도의 현저한 증가를 나타냈다.

그룹 n=4.

본 발명은 OPG 와 특이하게 결합하고 용골세포 분화에 포함되는 OPG 결합 단백질 이라 칭하는 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드의 마우스의 형태를 암호화하는 cDNA 클론은 마우스 골수단구성 세포선 32 - D 에서 제조되고 COS 세포로 트랜스펙트된 라이브러리에서 확인 했다. 트랜스펙탄트를 선별하여 이들의 능력이 OPG[22 - 201]-Fc 융합 폴리펩티드에 결합되도록 한다(실시예 1). 핵산 배열은 OPG 결합 단백질이 TNF 계통의 새로운 일원이고 1996. 6. 7일자 제출된 공동 소유되고 공동 출원한 미국 특허 출원 번호 08/660,562 에 이미 기재되어 있는 폴리펩티드, AGP-1 에 가장 밀접하게 관련되어 있음을 나타낸다(AGP-1 로 확인되고 TRAIL 로 표시되는 폴리펩티드는 윌리등이, Immunity 로, 673 - 682 (1995)에 기재했다). OPG 결합 단백질은 아미노 말단에서 세포질영역, 전이막 영역과 카르복시 말단 세포외 영역(도 1)을 갖는 형 Ⅱ 전이막 단백질인 것으로 예상된다. 아미노 말단 세포질 영역은 잔기 1 - 48 에 미치고, 전이막 영역은 잔기 49 - 69 에 미치며 세포외 영역은 도 1 에 도시된 잔기 70 - 316 에 미친다(SEQ ID NO : ). 막-결합 단백질은 OPG(도 2)에 특이하게 결합한다. 따라서 OPG 결합 단백질과 OPG 는 다른 OPG 결합 단백질의 자연-발생 수용체가 존재할 가능성이 있어도 수용체-리간드 쌍의 많은 특성을 공유한다.

인체 OPG 결합 단백질을 암호화하는 DNA 클론은 림프절 cDNA 라이브러리와 단리된다. 인체 배열(도 4)은 마우스 배열과 동일하다. 정제된 용해성 마우스 OPG 결합 단백질은 생체외의 용골세포 형성을 자극하고 생체내의 칼슘과다혈증과 골 흡수를 유도한다.

OPG 결합 단백질은 포유류 OPG 결합 단백질, 또는 이의 단편, 유사체나 유도체의 아미노산 배열을 갖고 최소한의 결합 OPG 활성을 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 바람직한 구성으로는, OPG 결합 단백질은 마우스 또는 인체이 공급원인 것이다. 다른 구성에서는, OPG 결합 단백질이 한가지 형태로, 세포질 및 전이막 영역과 분리한 단리된 세포외 영역을 갖는 용해성 단백질인 것이다. OPG 결합 단백질은 용골 세포 분화와 골 흡수 속도 및 범위에 포함되고, 용골세포 형성을 자극하고 골 흡수를 자극함을 알았다.

핵산

본 발명은 OPG 결합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 여기에 사용된, 핵산이란 용어는 cDNA, 게놈 DNA, 전체 또는 부분합성 DNA 와 RNA 을 뜻한다. 본 발명의 핵산은 다음 그룹 :

a) 도 1 (SEQ ID NO : )에 표시되고 도 4 (SEQ ID NO : )에 표시된 핵산 ;

b) 도 1 (SEQ ID NO : )과 도 4 (SEQ ID NO : )에 표시된 핵산의 폴리펩티드 암호화 영역에 교잡하고 매우 엄중한 조건하에서 핵산과 교잡하는 상태를 유지하는 핵산 ;

c) (a) 또는 (b)의 핵산과 동의적인 핵산에서 선택한다.

핵산 교잡은 대표적으로 제일 교잡 단계에서 단선에서 나오는 핵산 이중분자를 형성시킨 다음, 원하는 동종성을 갖는 핵산 이중분자를 선택적으로 보유하도록 더 엄중한 조건하에서 제이 교잡 단계를 행하는 것으로 이루어지는 다-단계 공정을 포함한다. 제일 교잡 단계의 조건은 이들이 제이 교잡 단계보다 더 크게 엄중하지 않으면, 일반적으로 중요하지 않다. 일반적으로, 제이 교잡은 높은 엄중한 조건하에서 행하고, 여기서 "높은 엄중한" 조건이란 도 1 (SEQ. ID. NO : )과 도 4 (SEQ ID NO : )에 해당하는 상보적 가닥의 부분 또는 전부의 완전한 잡종의 융점(Tm) 이하인 약 12 - 20 ℃ 의 온도와 염의 조건을 뜻한다. 한 구성에서, "높은 엄중한" 조건이란 약 65 ℃ 와 약 1 M 이하의 Na⁺의 조건을 뜻한다. 염 농도, 배양 온도와/또는 길이는 본 발명에 따른 교잡 핵산 분자를 얻기 위하여 제일 또는 제이 교잡 단계를 변경할 수 있음을 이해 할 것이다. 핵산 교잡과 핵산 잡종의 Tm 계산의 조건은 삼브룩 등. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕(1989)에 기재되어 있다.

본 발명의 핵산은 도 1 (SEQ ID NO : )와 도 4 (SEQ ID NO : )에 표시된 OPG 결합 단백질의 폴리펩티드 암호화 영역의 부분 또는 전부를 교잡화할 수 있으며 ; 그러므로 여기에 표시된 핵산 서열을 단절 또는 연장할 수 있다. 단절 또는 연장된 핵산은 이들이 최소한 결합 OPG 성질을 보유하면 본 발명에 포함된다. 한 구성에서, 핵산은 최소한 약 10 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 구성에서, 핵산은 최소한 약 20 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다. 또 다른 구성에서 핵산은 최소한 약 50 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다. 또한 교잡 핵산은 OPG 결합 단백질 암호화 영역의 5' 와/또는 3' 에 위치하는 이 암호화 배열을 포함할 수 있다. 비암호화 배열에는 프로모터, 증강제 영역, 번역 개시 부위, 전사 말단 부위 등과 같은, OPG 결합 단백질의 발현에 포함되는 조절 영역이 있다.

바람직한 구성으로, 본 발명의 핵산은 마우스 또는 인체 OPG 결합 단백질을 암호화한다. 핵산은 기능적 전이막 영역이 부족한 OPG 결합 단백질의 막 결합 형태 또는 용해 형태를 암호화할 수 있다. 마우스 OPG 결합 단백질의 예상되는 전이막 영역에는 도 1 (SEQ ID NO : )에 표시된 아미노산 잔기 49 - 69 가 있다. 인체 OPG 결합 단백질의 예상되는 전이막 영역에는 도 4 (SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 49 - 69 가 있다. 이 영역에서 소수성 아미노산 잔기를 중성 또는 친수성 아미노산 잔기로 대치하는 치환기는 막 결합을 분열시키고 용해성 OPG 결합 단백질을 가져오는 것으로 기대된다. 더불어, 전이막 영역의 부분 또는 전부의 삭제는 OPG 결합 단백질의 용해 형태를 생성시키는 것으로 기대된다. 도 1 (SEQ ID NO : )에 표시된 아미노산 잔기 70 ~ 316 또는 이의 단편과 유사체를 암호화하는 핵산은 용해성 OPG 결합 단백질을 포함한다.

또한 단절 형태의 용해성 인체 OPG 결합 단백질을 암호화하는 핵산도 포함된다. 용해 형태는 도 4 (SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 69 - 317 과 이의 단절이 있다. 한 구성에서, N-말단 단절은 잔기, 70 - 317, 71 - 317, 72 - 317 등에서 폴리펩티드를 발생시킨다. 다른 구성에서, 핵산은 잔기 69 - 317 과 이의 N-말단 단절을 OPGbp [158 - 317]이하 또는 OPGbp [166 - 317]이하로 함유하는 용해성 OPGbp 를 암호화한다.

인체 OPG 결합 단백질을 암호화하는 플라스미드 phuOPGbp 1.1 을 함유하는 E. coli 균주 DH10 은 1997. 6. 13일자로 미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 제 98457 호로 기탁하였다.

본 발명의 핵산 배열은 생물학적 시료에서 OPG 결합 단백질을 암호화하는 배열을 검출하는데 사용한다. 특히 배열을 사용하여 관련된 OPG 결합 단백질 배열, 특히 다른 종에서 나온것의 cDNA 와 게놈 라이브러리를 선별한다. 또한 핵산은 항-민감성방법 또는 생체내 유전자 발현에 의하여 OPG 결합 단백질의 수준을 조정하는데 유용하다. OPG 결합 단백질을 발현하는 전이유전자 동물의 발육은 폴리펩티드의 제조와 생체내 생물학적 활성을 연구하는데 유용하다.

벡터와 숙주세포

본 발명의 핵산은 DNA 배열과 결합하여 생물학적 활성 OPG 결합 단백질을 발현한다. 발현에 요구되는 배열은 본 분야의 전문가에게 알려져 있고 RNA 합성의 개시용 프로모터와 증강인자배열, 전사 말단부위, 단백질 합성 개시용 리보솜 결합부위와 분비용 선도배열이 있다. OPG 결합 단백질의 발현과 분비를 선도하는 배열은 동일하며, 즉 배열은 OPG 결합 단백질 발현과 분비에 포함되는 게놈에서 이들 배열과 동일하거나 유사하며, 또는 이들은 이종일 수 있다. 여러가지 플라스미드 벡터는 숙주 세포에서 OPG 결합 단백질을 발현하는데 이용할 수 있다(참조, 예를들면, Methods in Enzymology V. 185, 괴델, 디.브이.편집, 아카데믹 프레스(1990)). 포유류 숙주세포의 발현에 있어서, 바람직한 구성에는 PCT 출원번호 90/14363 에 기재된 플라스미드 pDSRα 가 있다. 박테리아 숙주 세포의 발현에 있어서, 바람직한 구성에는 룩스 프로모터를 함유하는 플라스미드가 있다(참조, 1995, 12, 22일자 출원된 공동 소유 및 공동 출원 미국 특허 출원 번호 08/557,778). 더불어, 벡터는 전이 유전자 동물에서 OPG 결합 단백질의 조직-특이성 발현을 하는데 이용할 수 있다. 또한 레드로바이러스 및 아데노바이러스-주재 유전자 전이 벡터도 생체내 치료를 위한 인체 세포의 OPG 결합 단백질을 발현하는데 사용할 수 있다(참조, PCT 출원 번호 86/00922).

또한 OPG 결합 단백질을 발현하는 원핵 및 진핵 숙주 세포는 본 발명에 의하여 제공된다. 숙주세포에는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포가 있다. OPG 결합 단백질은 마우스 또는 염소와 같은 전이 유전자 동물에서 생성될 수 있다. 본 발명의 핵산을 함유하는 플라스미드와 벡터는 본 분야의 전문가에게 알려져 있는 트랜스펙션 또는 형질전환 방법을 사용하여 적당한 숙주세포에 주입한다. 숙주세포는 도 1 에 도시된 OPG 결합 단백질 또는 세포외 영역 또는 세포질 영역과 같은 이의 부분을 암호화하는 DNA 배열을 함유한다. OPG 결합 단백질을 암호화하는 핵산은 주어진 숙주로 최적의 발현을 하도록 하는 코돈의 치환에 의하여 수정될 수 있다. 최소한 몇몇 코돈은 아미노산 배열을 변경시키지 않고 높게 발현되는 유전자에서 자주 발견되는 바람직한 코돈이라 불리우는 것이다. 그러나, 발현을 최적화하는 코돈 변경은 바람직한 코돈의 주입에 한정되는 것은 아님을 이해할 것이다. OPG 결합 단백질 발현을 위한 바람직한 포유류 숙주 세포의 예를들면 COS, CHOd-, 293 과 3T3 세포가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 박테리아 숙주 세포에는 E. coli 가 있다.

폴리펩티드

또한 본 발명은 외인성 DNA 배열의 원핵 또는 진핵 발현의 생성물로서 OPG 결합 단백질을 제공하고, 즉 OPG 결합 단백질은 재조합 OPG 결합 단백질이다. 외인성 DNA 배열에는 cDNA, 게놈 DNA 와 합성 DNA 배열이 있다. OPG 결합 단백질은 박테리아, 효모, 식물 곤충 또는 포유류 세포 발현의 생성물, 또는 세포-유리 번역계의 생성물이다. 박테리아 세포에서 생성된 OPG 결합 단백질은 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다. 또한 본 발명은 OPG 결합 단백질을 암호화하는 핵산으로 형질전환 되거나 트랜스펙트된 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 생장시키고 핵산의 폴리펩티드 발현 생성물을 단리시켜서 하는 OPG 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

포유류 OPG 결합 단백질이고 또는 이의 단편, 유사체 또는 유도체인 폴리펩티드는 본 발명에 포합된다. 바람직한 구성으로는, OPG 결합 단백질이 인체 OPG 결합 단백질인 것이다. OPG 결합 단백질의 단편은 생성한 폴리펩티드가 최소한 결합 OPG 의 성질을 갖도록 하나 또는 그 이상의 아미노산 삭제를 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 이 단편은 아미노 말단 단부, 카르복시 말단 단부와, 폴리펩티드의 내부 영역에서 시작하는 삭제를 갖는다. OPG 결합 단백질의 단편은 최소한 약 10 아미노산, 최소한 약 20 아미노산, 또는 최소한 약 50 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구성으로는, OPG 결합 단백질이 전이막 영역(도 1 에 표시된 아미노산 잔기 49 - 69)에서 나온 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 선택적으로 전이막 영역(도 1 에 표시된 아미노산 잔기 1 - 49)까지 와/또는 이를 포함하는 아미노-말단에서 나온 하나 또는 그이상의 아미노산의 삭제를 갖는 것이다. 다른 구성으로, OPG 결합 단백질은 예를들어, 아미노산 잔기 69 - 316 또는 70 - 316 이나, 이의 N-말단 또는 C-말단 단절 형태를 갖는 용해성 단백질인 것이고, 이는 OPG 결합 활성을 갖는다. 또한 OPG 결합 단백질은 도 4 에 표시된 잔기 67 - 317 와 이의 N-말단 단절 형태, 예를들어, 70 - 517, 71 - 517, 71 - 317, 72 - 317 등을 함유하는 도 4 에 표시된 인체 용해성 단백질이다. 바람직한 구성으로는, 용해성 인체 OPG 결합 단백질이 OPGbp[158 - 317] 이하 또는 선택적으로 OPG[166 - 317] 이하의 잔기 67 - 317 과 이의 N-말단 단절을 갖는 것이다.

OPG 결합 단백질의 유사체는 생성된 폴리펩티드가 최소한의 결합 OPG 성질을 갖도록 하나 또는 그이상의 아미노산의 치환 또는 부가를 갖는 폴리펩티드를 뜻한다. 이 유사체는 폴리펩티드에 따라 어떠한 위치에서 치환 또는 부가를 갖는다. 바람직한 유사체로는 용해성 OPG 결합 단백질의 유사체가 있다. 단편 또는 유사체는 대립 변이체 또는 mRNA 접합 변이체의 폴리펩티드 생성물과 같이, 자연적으로 발생하거나 또는 이들은 핵산을 조작하고 합성하는 본 분야의 전문가가 이용할 수 있는 방법을 사용하여 구성할 수 있다. 폴리펩티드는 아미노 말단 메티오닌 잔기를 갖거나 또는 갖지 않을 수 있다.

또한, 본 발명에는 후-번역 변이(예를들어, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 부가, N-말단 또는 C-말단 단부의 처리), 아미노산 골격에 화학적 부분의 부착, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 화학적 변이와, 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가를 받은 폴리펩티드인 OPG 결합 단백질의 유도체가 포함된다. 특히, 증가된 안정성, 더긴 주기 시간, 또는 감소된 면역원성과 같은 부가적 이점을 제공하는 OPG 결합 단백질의 화학적 변이 유도체가 기대된다. 특별한 용도로는 폴리에틸렌 글리콜과 이의 유도체와 같은 수용성 중합체로 변이시키는 것이다(참조, 예를들어 미국 특허 번호 4,179,337). 유도하기위한 화학적 부분은 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등과 같은 수용성 중합체에서 선택한다. 폴리펩티드는 분자내의 임의 위치, 또는 분자내의 예측된 위치에서 변이되고, 하나, 둘, 셋 또는 그이상의 부착된 화학 부분을 포함한다. 또한 폴리펩티드는 아미노 말단에서 또는 폴리펩티드내에서 선택된 라이신 또는 아르기닌 잔기에서와 같이 폴리펩티드의 예측된 위치에서 변이될 수 있다. 제공되는 다른 화학적 변이물에는 단백질이 검출과 단리되도록 하는 효소, 형광, 동위 또는 친화성 표지와 같은, 검출성 표지를 포함한다.

또한, 이종 아미노산 배열에 융합되는 OPG 결합 단백질 아미노산 배열의 부분 또는 전부를 함유하는 OPG 결합 단백질 키메라도 포함된다. 이종 배열은 생성된 융합 단백질이 최소한의 결합 OPG 활성을 보유하도록 하는 배열이다. 바람직한 구성으로는, OPG 결합 단백질의 카르복시 말단 세포외 영역을 이종 배열에 융합시키는 것이다. 이와같은 배열에는 선택적으로 세포내 신호표시 결과를 허용하는 이종 세포질 영역, IgG 의 Fc 영역과 같은 올리고머화를 촉진하는 배열, 폴리펩티드용 표지를 제공하는 효소 배열과 항원-항체 인지와 같은 친화성 프로브를 제공하는 배열이 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 OPG 결합 단백질을 발현하는 조직과 세포선에서 단리되고 정제되며, 여액에서 아니면 조절된 생장 배지에서 추출되고, OPG 결합 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서 추출된다. OPG 결합 단백질은 마우스 골수단구성 세포선 32 - D (ATCC 수탁 번호 CRL - 11346)에서 얻는다. 인체 OPG 결합 단백질, 또는 동일하게 암호화한 핵산은 인체 림프절 또는 태아 간 조직에서 단리한다. 단리된 OPG 결합 단백질은 인체 단백질과 다른 세포 성분과의 결합에서 유리시킨다.

천연급원(예를들어, 정상적으로 OPG 결합 단백질을 발현하는 조직과 세포선)에서와 트랜스펙트된 숙주세포에서 OPG 결합 단백질의 정제 방법은 본 발명에 포함된다. 정제 방법은 정제된 단백질을 얻기위하여 적당한 순서의 하나 또는 그이상의 표준 단백질 정제 단계를 사용한다. 크로마토그래피 단계에는 이온 교환, 겔 여과, 소수성 상호작용, 역상, 색 초점조정, 항-OPG 결합 단백질 항체 또는 바이오틴-스트렙타비딘 친화성 복합물을 사용하는 친화성 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다.

항체

본 발명의 폴리펩티드와 특이하게 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 항체는 전-장 OPG 결합 단백질, 용해 형태의 OPG 결합 단백질, 또는 이들의 단편과의 면역에 의하여 생성된다. 본 발명의 항체는 경쇄와 중쇄상의 마우스 불변 영역을 인체 배열로 대치한 키메라 항체 또는 상보성 결정 영역만이 마우스 공급원인 CDR-이식 항체와 같은, 다클론이나 단클론 항체이거나, 또는 재조합 항체이다. 또한, 본 발명의 항체는 예를들어 인체 항체를 생성시킬 수 있는 전이 유전자 동물의 면역에 의하여 제조되는 인체 항체이다(참조, 예를들어, PCT 출원번호 WO93/12227). 항체는 생물학적 시료에서 OPG 결합 단백질을 검출함으로써, 단백질을 생성하는 세포 또는 조직을 확인하는데 유용하다. 더불어, OPG 결합 단백질에 결합하고 다른 결합 화합물과의 상호작용을 차단하는 항체는 용골세포 분화와 골 흡수를 조정하는데 치료적으로 사용한다.

OPG 결합 단백질에 대한 항체는 골다공증과 파제트병과 같은 골질병을 치료하는데 유용하다. 항체는 OPG 없이 또는 이의 존재하에 OPG 결합 단백질에 결합하는 시험을 행할 수 있고 이들의 능력이 리간드(OPG 결합 단백질)매개 용골세포 형성 과/또는 골 흡수를 억제하는 검사를 할 수 있다. 또한 펩티드 그자체는 리간드 : 수용체 상호작용의 길항물질로서 작용하고 리간드-매개 용골세포 형성을 억제하고, OPG 결합 단백질의 펩티드는 이러한 목적을 위하여 조사하게 된다.

조성물

또한, 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 와/또는 보조제와 함께 치료학적 유효량의 OPG 결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 치료학적 유효량의 OPG 결합 단백질 작용물질 또는 길항물질을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. "치료학적 유효량" 이란 용어는 투여 방법과 특이한 조건에 대하여 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미한다. 조성물은 액체 또는 동결건조 형태이고 여러가지 pH 값과 이온 강도를 갖는 희석제(트리스, 초산염 또는 인산염 완충제), 트윈 또는 폴리솔베이트와 같은 가용화제, 인체 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알코올과 같은 방부제와, 아스코르브산 또는 메타이아황산 나트륨과 같은 산화방지제를 함유한다. 특수한 조성물의 선택은 치료되는 조건, 투여 방법과 원하는 약동학적 파라미터를 포함하여 여러가지 인자에 따라서 선택한다. 약학적 조성물에 적합한 성분을 더 광범위하게 조사하면 Remington's pharmaceutical Sciences, 제 18 판, 에이. 알. 겐나로. 편찬, 맥, 이스톤, 펜실바니아(1980)에서 볼 수 있다.

바람직한 구성에서는, 용해성 OPG 결합 단백질을 함유하는 조성물을 제공한다. 또한 용해성, 안정성, 플라스마 반감기와 생체이용성을 증가 시키기 위하여 수용성 중합체로 변이시킨 용해성 OPG 결합 단백질을 함유하는 조성물도 포함된다. 또한 조성물에는 연장된 기간 이상으로 방출을 조절하기 위하여 리포솜, 마이크로에멀션, 미셀 또는 소수포에 용해성 OPG 결합 단백질을 혼합시킨다. 용해성 OPG 결합 단백질은 폐 투여에 적합한 미립자로 제제한다.

본 발명의 조성물은 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의하여, 또는 경구, 코, 폐 또는 직장 투여에 의하여 투여할 수 있다. 최종적으로 선택한 투여 방법은 여러가지 인자에 따르고 본 분야의 전문가에 의하여 확인될 수 있다.

또한 본 발명은 약학적으로 수용할 수 있는 보조제와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 핵산을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 핵산 조성물은 항-민감성 치료 섭생의 부분으로 세포와 조직에 OPG 결합 단백질의 암호화 영역 과/또는 근접유전자 영역의 부분 또는 전부를 방출하는데 적합하다

사용방법

OPG 결합 단백질은 OPG 를 검출하고 OPG 와의 상호작용의 특징을 나타내는 여러가지 검정에 사용될 수 있다. 일반적으로 검정은 OPG 를 OPG 결합 단백질에 결합시키는 조건하에서 OPG 를 함유하는 생물학적 시료로 OPG 결합 단백질을 배양하고, 결합 범위를 측정하는 것으로 이루어진다. OPG 는 정제할 수 있고 몸체 유체 또는 배지에서와 같은 혼합물에 존재한다. 검정은 정서적 또는 정량적인 것으로 나타내고, 후자는 OPG 결합 단백질에 OPG 의 결합 파라미터(친화성 항수와 동력학)를 측정하고 혼합물에서 생물적 활성 OPG 의 수준 양을 측정하는데 유용하다. 또한, 검정으로 OPG 를 OPG 결합 단백질의 단편, 유사체와 유도체에 결합시키는 것을 평가하고 새로운 OPG 와 OPG 결합 단백질 계통 일원을 확인하는데 사용한다.

OPG 의 OPG 결합 단백질에 결합은 세포-주재 결합 검정, 막 결합 검정, 용액-상 검정과 면역 검정을 포함한, 몇가지 형식으로 행할 수 있다. 미량 수준의 표지된 OPG 를 특별한 기간 동안 OPC 결합 단백질 시료로 배양한 다음 여과, 전기화학 발광법(ECL, IGEN 에 의한 ORIGEN 시스템), 세포-주재 또는 면역 검정법에 의하여 결합된 OPG 를 측정한다. 또한 방사성(SPA ; 아머삼)과 시간 분석형 형과(HTRF, 팩카아드)용 동종 검정법으로 행할 수 있다. 결합은 방사성 동위 원소(125I, 35 S, 3H), 형광 염료(플루오레신), 란탄족(Eu3⁺) 칼레이트 또는 크립테이트, 오르비 피리딜-루테늄(Ru2⁺) 착물로 OPG 또는 항-OPG 항체를 표지하여 검출한다. 표지된 프로브는 사용되는 검출 시스템에 따라 선택함을 이해할 것이다. 또한, OPG 는 비표지된 에피토프 태그(예를들어, 바이오틴, 펩티드, His₆, myc)로 변이되고 상술한 바와같은 검출할 수 있는 표지를 갖는 스트렙타비딘, 항-펩티드 또는 항-단백질 항체와 같은 단백질에 결합된다.

다른 방법으로는, 면역검정으로 OPG 결합 단백질에 다클론 또는 단클론 항체를 사용하여 OPG 결합 단백질을 직접 검정할 수 있다. 상술한 에피토프 태그를 함유하는 특별한 형태의 OPG 결합 단백질을 용액과 면역 검정에 사용할 수 있다.

또한 OPG 결합 단백질과 상호 작용하는 화합물을 확인하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 방법은 화합물을 OPG 결합 단백질에 결합 하게하는 조건하에서 화합물로 OPG 결합 단백질을 배양하고 결합 범위를 측정하는 것으로 이루어진다. 화합물은 실질적으로 정제할 수 있고 초기 혼합물에 존재한다. 결합 화합물에는 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소분자량의 유기 화합물이 있다. 화합물은 이들이 작용물질 또는 길항물질로서 작용하는 여부를 결정하기위하여 OPG 결합 단백질 활성을 증가 또는 감소시키는 이들의 능력에 의하여 다른 특징을 나타낼 수 있다.

OPG 결합 단백질은 또한 효모 두-잡종 스크린 과정에 의해 세포질 영역과 상호 작용하는 세포내 단백질을 입증하는데 유용하다. 예를들어, 효모 GAL 4 - DNA 결합 영역에 융합되는 OPG 결합 단백질의 N-말단 50 아미노산을 암호화하는 DNA 를 함유하는 잡종 구조는 두-잡종 유인 플라스미드로서 사용할 수 있다. 선별로 나온 양성 클론은 단백질의 상호 작용을 확인하는 다른 특징을 나타낸다. 이러한 정보는 OPG 결합 단백질과 결합된 세포내 신호표시 메카니즘을 명료하게하고 골 흡수를 조장하는 새로운 약제의 세포내 표적을 제공한다.

OPG 결합 단백질을 사용하여 과대한 골밀도에 의한 특징을 나타내는 증상을 치료한다. 가장 보편적인 증상은 골질량 상승으로 유전자 결함을 가져오고 통상 첫번째 몇 년의 수명에 사망하는 골다공증이 있다. 골다공증은 용해성 OPG 결합 단백질을 투여하여 치료하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 OPG 결합 단백질의 조절 인자(작용물질과 길항물질)와 이를 얻는 방법도 포함한다. OPG 결합 단백질 조절인자는 OPG 또는 몇몇 다른 상호작용 분자를 결합시키고 또는 용골 세포 성장을 조절하는 능력과 같은, OPG 결합 단백질에 결합된 최소한 하나의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 대표적으로, 작용물질 또는 길항 물질이 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소분자량 분자와 같은, 공동-인자일 수 있고, 이는 OPG 결합 단백질과 상호작용하여 이의 활성을 조절한다. 우수한 플리펩티드 길항 물질에는 용해 또는 막-결합 형태의 OPG 결합 단백질과, OPG 결합 단백질의 세포외 영역의 부분 또는 전부를 함유하는 용해 형태의 OPG 결합 단백질과 반응하는 항체가 있다. OPG 결합 단백질 발현을 조절하는 분자에는 대표적으로 OPG 결합 단백질을 암호화하는 핵산에 상보성을 갖고 발현의 항-민감성 조절인자로서 작용하는 핵산이 있다.

OPG 결합 단백질은 성숙한 용골세포의 조절 형성에, 골 흡수에 내포되는 일차 세포형을 포함한다. 골 흡수율의 증가(골 형성율 이상)는 총괄적으로 골감소증이라 칭하는 여러가지 골질환을 유도할 수 있으며, 이것에는 골다공증, 골수염, 칼슘과다혈증, 외과적 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생하는 골감소증, 파제트병, 골 괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화, 보철 분해, 골용해 전이가 있다. 역으로 골 흡수율의 감소는 골화석증, 과도한 골 밀도에 의하여 표시되는 증상을 유도할 수 있다. OPG 결합 단백질의 작용물질과 길항물질은 용골세포 형성을 조절하고 골질환으로 고통을 받고 있는 환자에게 투여할 수 있다. 골 감소증을 치료하는데 유용한 OPG 결합 단백질의 작용물질과 길항물질은 단독으로 또는 BMP-1 내지 BMP-12 로 표시되는 골 형태형성인자, 형질변환 생장인자-β 와 TGF-β 계통일원, 아섬유세포 생장인자 FGF-1 내지 FCF-10, 인터루킨-1 억제제, TNFα 억제제, 부갑상선 호르몬, E 시리즈 전립선, 비스포스폰산염, 플루오르화물과 칼슘과 같은 골-증강 광물질을 포함한 치료학적 유효량의 골 생장 촉진제와 조합하여 투여할 수 있다. OPG 결합 단백질의 길항물질은 골 감소증을 치료하는데 특히 유용하다.

오스테오프로테게린 결합 단백질용 수용체

또한 본 발명은 OPG 결합 단백질과 상호작용하는 수용체를 제공한다. 특히, 본 발명은 용골세포 분화와 활성화 수용체(ODAR)를 제공한다. ODAR 은 CD40, TNF 수용체 계통일원과 가장 높은 상동 정도를 나타내는 전이막 폴리펩티드이다. 마우스 ODAR 과 암호화된 폴리펩티드의 핵산 배열은 도 10 에 표시했다. 마우스 ODAR 의 인체 동족체는 도 10 의 핵산 배열로 인체 DNA 또는 게놈 라이브러리를 교잡선별하여 쉽게 단리할 수 있다. 인체 ODAR 을 클론화하는 과정은 인체 OPG 결합 단백질을 클론화하는 실시예 5 에 기재된 것과 비슷하다. 도 10 에 표시된 폴리펩티드의 인체 동족체는 앤더선 등(Nature 390, 175 - 179(1997))에 표시되어 있고 여기서는 RANK 라 칭한다. RANK 는 TNF 수용체 계통 일원과 동종성을 갖는 형 I 전이막 단백질로서 특징을 나타내고 수지상 세포 기능에 포함된다.

ODAR 과 OPG 결합 단백질의 상호작용에 대한 증거는 실시예 13 에 표시되어 있다. 용해 형태의 ODAR (ODAR-Fc 융합 단백질)은 생체외의 용골세포 발육(도 12)을 예방하고 피하주사후 정상 마우스의 골 밀도를 증가시킨다(도 13). 그 결과는 용골세포 발육을 촉진하기 위하여 ODAR 과 상호작용하고 활성화하는 OPG 결합 단백질과 일치한다.

용골세포 발육과 골 흡수율과 범위는 OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용에 의하여 조절된다. OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용을 감소시키거나 차단하는 화합물은 OPG 결합 단백질 활성의 우수한 길항물질이고 골 흡수 감소를 유도하는 용골세포 발육을 분열시킨다. 또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호 작용을 증가시키는 화합물은 용골세포 발육을 촉진하고 골 흡수를 증강시키는 우수한 작용물질이다.

정제된 단백질을 사용하여 OPG 결합 단백질과 생체외 ODAR 의 상호 작용을 측정하기 위하여 여러가지 검정법을 사용한다. 이러한 검정법을 사용하여 OPG 결합 단백질에 의하여 ODAR 에 결합하는 속도 또는 범위를 증가시키거나 감소시키는 능력을 갖는 화합물을 선별한다. 검정의 한 형으로, 마이크로타이터 플레이트의 웰의 저부에 ODAR 단백질을 부착시켜서 부동화할 수 있다. 방사성 표지된 OPG 결합 단백질(예를들면, 요오드화 OPG 결합 단백질)과 시험 화합물은 한번에 하나씩(어느쪽 순서에 따라)아니면 동시에 웰에 첨가할 수 있다. 배양후, 웰을 세척하고 방사성용 섬광 계수기를 사용하여 계산하고 시험 화합물의 존재하에 OPG 결합 단백질에 의하여 ODAR 에 결합하는 범위를 측정한다. 대표적으로, 화합물을 농도범위 이상으로 시험하고, 시험 검정의 하나 또는 그 이상의 요소가 없는 일련의 비교 웰을 결과의 정확도를 평가하는데 사용할 수 있다. 이러한 방법에 대한 선택은 단백질의 "위치" 를 역전시키는 것, 즉, 마이크로타이터 플레이트 웰로 OPG 결합 단백질을 부동화하고, 시험 화합물과 방사성표지된 ODAR 로 배양하고, ODAR 의 범위를 측정하는 것을 포함한다(참조, 예를들어, Current Protocols in Molecular Biology 의 18 장, 오스벨 등, 편찬, 죤 윌리 앤드 선스, 뉴욕, 뉴욕주[1995]).

방사성 표지에 대한 선택으로서, OPG 결합 단백질 또는 ODAR 을 바이오틴에 접합시키고 바이오틴화 단백질의 존재는 색측정으로 검출할 수 있는, 고추냉이 과산화효소[HRP] 또는 알칼리성 포스파타아제[AP]와 같은 효소에 결합되는 스트렙타비딘을 사용하여, 또는 스트렙타비딘을 형광 표지하여 검출할 수 있다. 바이오틴에 접합하는 OPG 결합 단백질 또는 ODAR 로 조작되는 항체를 사용하고 AP 또는 HRP 에 결합된 효소-결합 스트렙타비딘으로 배양한 후 검출할 수 있다.

또한 OPG 결합 단백질과 ODAR 은 아가로스 비드, 아크릴 비드 또는 다른형의 이러한 비활성 기질에 부착시켜서 부동화할 수 있다. 기질-단백질 복합물은 상보성 단백질 시험 화합물을 함유하는 용액에 넣을 수 있고 ; 배양후, 비드를 원심분리로 침전 시킬 수 있고, OPG 결합 단백질과 ODAR 사이의 결합량은 상술한 방법을 사용하여 부과할 수 있다. 선택적으로, 기질-단백질 복합물은 컬럼에서 부동화하고 시험 분자와 상보성 단백질은 컬럼위로 통과한다. 다음, OPG 결합 단백질과 ODAR 사이의 복합물 형성은 상기 열거한 방법, 즉, 방사성 표지, 항체 결합 등을 사용하여 평가할 수 있다.

ODAR/OPG 결합 단백질 복합물의 형성을 증가 또는 감소시키는 화합물을 확인하는데 유용한 다른 형의 생체외 검정법은 비아코어(Biacore) 검정 시스템(파마시아, 피스케타웨이, 뉴저지)과 같은 표면 세포질 공명 검출기 시스템이 있다. 비아크레(Biacre) 시스템은 제조자의 계획안을 사용하여 행한다. 이러한 검정에는 검출기에 위치하는 덱스트란-피복 센서 칩에 OPG 결합 단백질 아니면 ODAR 의 공유 결합이 필수적으로 포함된다. 시험 화합물과 다른 상보성 단백질은 센서 칩을 함유하는 챔버에 동시에 아니면 계속적으로 주사할 수 있고 결합을 평가할 수 있는 상보성 단백질의 양은 센서 칩의 덱스트란-피복면과 물리적으로 결합된 분자량의 변화에 기초를 두고 ; 분자량 변화는 검출기 시스템에 의하여 측정할 수 있다.

몇몇 경우에, ODAR/OPG 결합 단백질 복합물의 형성을 증가시키거나 또는 감소시키는데 사용하기 위하여 둘 또는 그이상의 시험 화합물을 함께 평가하는 것이 좋다. 이들 경우에, 상기 열거한 검정은 이러한 부가적 시험 화합물을 동시에 아니면 계속적으로, 첫번째 시험 화합물에 첨가하여 쉽게 변경할 수 있다. 검정의 나머지 단계는 상기에서 열거한 바와 같다.

상술한 바와 같은 생체외 검정을 유리하게 사용하여 ODAR 와 OPG 결합 단백질에 의한 복합물 형성에 작용하는 큰 수의 화합물을 쉽게 선별할 수 있다. 검정을 자동화하여 파아지 표시, 합성 펩티드와 화학 합성 라이브러리에 발생된 화합물을 선별한다.

또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 복합물 형성을 증가시키거나 감소시키는 화합물은 ODAR-함유 세포와 세포선을 사용하여 세포 배양물에서 선별할 수 있다. 세포와 세포선은 포위 동물에서 얻을 수 있지만, 인체 또는 다른 영장류, 개 또는 설치류 급원에서 얻는것이 바람직하다. 용골세포와 같은 ODAR 함유 세포는 공식적으로 이용할 수 있는 공정을 친화성 크로마토그래피에 의하여 다른 세포형으로 풍부하게 할 수 있다. OPG 결합 단백질의 ODAR-함유 세포에 부착은 시험 화합물의 존재하에 또는 없이 평가되고, 결합 범위는 예를들어 OPG 결합 단백질에 바이오틴화 항체를 사용하여 유동 세포 계수에 의하여 측정할 수 있다. 또한, 마우스 또는 인체 용골세포 배양물은 실시예 8 에 기재된 바와같이 확립하고 시험 화합물은 그들의 능력이 CSF-1 과 OPG 결합 단백질의 첨가에 의하여 자극을 받는 용골 세포 발육을 차단하는 것으로 평가될 수 있다. 세포 배양물 검정을 유리하게 사용하여 상술한 단백질 결합 검정에서 양성을 나타내는 화합물을 더 평가할 수 있다.

또한, OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용을 증가시키거나 감소시키는 화합물은 화합물을 마우스에 투여한 다음 골 주사 밀도 측정법 또는 방사선 사진법을 사용하여 골 밀도를 측정하여 생체내 활성을 평가한다. 골 밀도를 측정하는 방법은 PCT 공보 WO97/23614 와 실시예 13 에 기재되어 있다.

본 발명은 OPG 결합 단백질과 ODAR 의 상호작용을 감소시키거나 차단하고 용골세포 형성의 길항 물질인 화합물을 제공한다. 일반적으로 이와같은 화합물은 두 그룹에 속한다. 한 그룹은 OPG 결합 단백질에서 유도되거나 또는 OPG 결합 단백질과 상호작용하는 화합물이고, 이들은 상기에서 설명하였다. 둘째 그룹은 ODAR 에서 유도되거나 또는 ODAR 과 상호작용하는 화합물이다. ODAR 의 길항물질인 화합물의 예를들면 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소분자량의 유기 화합물이 있다.

ODAR 의 길항물질은 ODAR 세포외 영역에서 OPG bp 의 하나 또는 그이상의 결합 부위에 또는 이에 인접하여 결합하고 복합물 형성을 감소시키거나 또는 완전히 차단하는 화합물이다. OPG 결합 단백질과 복합물 형성에 포함되는 ODAR 상의 이들 영역은 반너 등(Cell 73, 431 - 445(1993))에 기재되어 있는 동종성 TNFβ/TNF-R55 복합물의 구조로 상사에 의하여 확인될 수 있다. 예를들면, TNFβ/TNF-R55 복합물의 구조를 사용하여 복합물 형성에 포함된 OPG 결합 단백질과 ODAR 의 영역을 확인할 수 있다. 화합물은 복합물 형성에 포함되는 영역에 바람직하게 결합하고 길항물질로서 작용하는것으로 설계되어 있다. 실시예 11 에 열거한 한가지 방법에서, 펩티드 항원은 길항물질로서 작용하는 OPG 결합 단백질로 항체를 상승시키는데 사용하는 것으로 설계되어 있다. 이러한 항체는 OPG 결합 단백질에 결합하고 ODAR 과의 복합물 형성을 차단하는 것으로 기대된다. 유사한 방법으로, ODAR 구조에 기초를 둔 펩티드 항원을 사용하여 길항물질로서 작용하는 항-ODAR 항체를 상승시킨다.

또한 ODAR 의 길항물질은 OPG bp 의 결합 부위와 다른 위치에서 ODAR 에 결합하고 OPG 결합 단백질과 감소적 또는 비생산적 복합물 형성을 가져오는 ODAR 폴리펩티드의 형태 변화를 유도한다.

한 구성에 있어, 길항물질은 기능적 전이막 영역이 부족한 용해형태의 ODAR 이다. 용해 형태의 ODAR 은 전이막 영역(도 10 에 표시된 아미노산 214 - 234)에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 삭제한다. 용해성 ODAR 폴리펩티드는 세포외 영역의 부분 또는 전부를 갖고 OPG 결합 단백질을 결합시킬 수 있다. 임의적으로, 용해성 ODAR 은 키메라 단백질의 부분이고, 여기서 ODAR 의 세포외 영역의 부분 또는 전부는 이종성 아미노산 배열에 융합된다. 이종성 아미노산 배열은 인체 IgG 에서 나온 Fc 영역이다.

ODAR 의 조절인자(작용물질과 길항물질)를 사용하여, 골다공증, 골수염, 악성 칼슘과다혈증, 외과 또는 스테로이드 투여에 의하여 발생한 골감소증, 파제트병, 골괴사증, 류머티즘성 관절염으로 인한 골손실, 치주골 손실, 부동화, 보철 분해와 골용해 전이를 포함한, 골감소증을 예방 또는 치료한다. 골감소증의 치료에 사용되는 ODAR 의 작용물질과 길항물질은 단독으로 투여되거나 또는 BMP - 1 내지 BMP - 12 로 표시되는 골 형태 형성 인자, 형질전환 생장 인자-β 와 TGF-β 계통일원, 섬유아세포 생장 인자 FGF - 1 내지 FGF 10, 인터루킨 - 1 억제제, TNFα 억제제, 부갑상선 호르몬, E 시리즈 전립선, 비스포스폰산염, 에스트로겐, SERMs 와 플루오르화물 및 칼슘과 같은 골-증강 광물질 포함한, 치료학적 유효량의 골 생장 촉진제와 조합하여 투여할 수 있다. ODAR 의 길항물질은 골 감소증을 치료하는데 특히 유용하다.

다음 실시예는 본 발명을 더 충분하게 예시한 것이나, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

OPG 결합 단백질의 세포선 급원의 확인

오스테오프로테게린(OPG)은 생체외 및 생체내의 용골세포 형성을 음성적으로 조절한다. OPG 는 TNFR-관련 단백질이기 때문에, 이의 효력을 조정하면서, TNF-관련 계통일원과 상호작용한다. 하나의 예외로, TNF 상과의 공지된 모든 일원은 세포 표면에서 발현되는 형 Ⅱ 전이막 단백질이다. OPG 결합 단백질의 급원을 확인하기 위하여, 재조합 OPG-Fc 융합 단백질을 면역프로브로 사용하여 여러가지 세포선과 일차 조혈 세포의 표면에 위치하는 OPG 결합 단백질을 선별한다.

생체외의 유착 배양물로서 생장하는 세포선을 다음 방법을 사용하여 처리한다 : 세포를 24 웰 조직 배양판(팔콘)에서 배양한 다음, 약 80 % 유착으로 생장하게 한다. 생장 배지를 제거한 다음, 1 % 태아 소 혈청(FCS)을 함유하는 인산염 완충염수(PBS)(기브코)로 유착 배양물을 세척한다. 재조합 마우스 OPG[22 - 194]-Fc 와 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질(참조, 1996. 9. 3자 출원된 미국 출원 번호 08/706,945)을, 1 % FCS 를 함유하는 PBS, 5 ug/㎖ 로 개별적으로 희석한 다음, 배양물에 첨가하고 0 ℃ 에서 45 분동안 배양한다. OPG-Fc 융합 단백질 용액을 버리고 세포를 상술한 PBS-FCS 용액으로 세척한다. 다음 배양물을 PBS-FCS 로 희석된 피코에리드린-접합 염소 F(ab') 항-인체 IgG 이차 항체(남부 생물공학 협회 Cat. # 2043 - 09)에 노출시킨다. 0 ℃ 에서 30 - 45 분 배양시킨 후, 용액을 버리고 배양물을 상술한 바와같이 세척한다. 세포를 면역형광 현미경법으로 분석하여 세포표면 OPG 결합 단백질을 발현하는 세포선을 검출한다.

현탁 세포 배양물을 다음 변이와 유사한 방법으로 분석한다 : 희석제와 1 % FCS 를 함유하는 칼슘-과 마그네슘-유리 인산염 완충 염수로 구성된 세척 완충제 생장 배지의 지수복제 배양물에서 세포를 수집하고, 원심분리하여 펠릿으로 만든다음, 96 웰 마이크로타이터 조직 배양판(팔콘)에 1×10⁷세포/㎖ 로 재현탁시킨다. 세포를 재조합 OPG-Fc 융합 단백질에 계속하여 노출시킨다음, 상술한 이차 항체에 노출시키고, 세포를 각 단계 사이에서 원심분리하여 세척한다. 벡톤 딕킨선 FACscan 을 사용하여 형광 활성화 세포 선별(FACS)로 세포를 분석한다.

이 방법을 사용하면, 마우스 OPG[22 - 194]-Fc 와 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질로 검출할 수 있는 표면 분자를 발현하는 마우스 골수[단구성 세포선 32D(1993년 5월 13일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁함, ATCC 수탁번호 CRL - 11346)]를 알 수 있다. 이차 항체는 단독으로 32D 세포의 표면에 결합하지도 않고 인체 IgG1 Fc 를 정제하지도 않으며, OPG-Fc 융합 단백질의 결합이 OPG 부분에 기인함을 나타낸다. 이 결합은 재조합 마우스 또는 인체 OPG[22 - 401] 단백질을 첨가하여 투약량 의존 방법과 겨룰 수 있다. 따라서, 생물학적 활성에 요구되는 OPG 영역은 32D-유도 표면 분자에 특이하게 결합할 수 있다.

실시예 2

마우스 OPG 결합 단백질의 발현 클로닝

cDNA 라이브러리를 32D mRNA 로 제조하여 포유류 발현 벡터 pcDNA 3.1⁽⁺⁾(인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)에 결찰시킨다. 재조합 인터루킨 - 3 의 존재하에 유지되는 지수 생장 32D 세포를 수집하고, 전체 세포 RNA 를 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출물(홈진스키와 사키. Anal. Biochem. 162, 156 - 159 (1987))로 정제한다. 폴리 (A⁺)mRNA 분획을 흡수에 의하여 전체 RNA 제제로 부터 얻고 제조자가 권고한 방법을 사용하여 다이나비드 올리고(dT) 25 (다이날 코포레이션)로부터 용리시킨다. 제조자가 권한 방법을 사용한 수퍼스크립트 플라스미드 시스템(기브코 BRL, 가이더스부르그, 매릴랜드)을 사용하여, 지향성 올리고-dT 주입 cDNA 라이브러리를 제조한다. 생성한 cDNA 를 Sa1 I 와 Not I 제한 엔도뉴클레아제로 완전히 절단시킨 다음, 크기 배제 겔 크로마토그래피로 분별한다. 최고 분자량 분획을 선택한 다음, 플라스미드 벡터 pcDNA 3.1⁽⁺⁾(인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)의 폴리커 영역에 결찰시킨다. 이 벡터는 다중 클로닝 부위의 CMV 프로모터 상류를 함유하고, 진핵 세포에서 높은 수준의 발현을 조작한다. 라이브러리를 유능한 E. coli(ElectroMAX DH 10B, 기브코, 뉴욕)에 에텍트로포레이트한 다음, 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 한천에서 적정한다. 라이브러리를 약 1000 클론/푸울을 함유하는 분리 푸울에 배열한 다음, 37 ℃ 에서 16 - 20 시간동안 각 푸울의 1.0 ㎖ 배양물을 생장시킨다. 각 배양물에서 나온 플라스미드 DNA 를, 제조자가 권한 방법에 따라 퀴아겐 퀴아웰 96 울트라 플라스미드 키트(카탈로그 #16191)를 사용하여 제조한다.

32D cDNA 발현 라이브러리의 배열 푸울을 COS - 7 배양물에 개별적으로 리포펙트한 다음, 세포 표면 OPG 결합 단백질의 포착에 배열한다. 이를 위하여, COS - 7 세포를 6 - 웰 조직 배양판(코스탈)에서 ㎖ 당 1×10⁶의 밀도를 배양한 다음 10 % FCS 를 함유하는 DMEM(기브코)에서 하룻밤 배양한다. 각 푸울에서 나온 약 2 ㎍ 의 플라스미드 DNA 을 0.5 ㎖ 의 혈청-유리 DMEM 으로 희석한 다음, 0.2 ㎛ 스핀-X 컬럼(코스탈)을 통하여 원심분리하여 살균한다. 동시에, 10 ㎕ 의 리포펙타민(라이프 테크놀로지스 Cat # 18324 - 012)을 0.5 ㎖ 의 혈청-유리 DMEM 을 함유하는 분리관에 가한다. DNA 와 리포펙타민 용액을 혼합하고, 30 분 동안 RT 에서 배양한다. COS - 7 세포 배양물을 혈청-유리 DMEM 으로 세척한 다음, DNA-리포펙타민 복합물을 37 ℃ 에서 2 - 5 시간동안 배양물에 노출시킨다. 이기간 후, 배지를 제거하고, 10 % FCS 를 함유하는 DMEM 으로 대치한다. 다음 세포를 37 ℃ 에서 48 시간동안 배양한다. OPG 결합 단백질을 발현하는 배양물을 검출하기 위하여, 생장 배지를 제거하고, 세포를 PBS-FCS 용액으로 세척한다. 0.5㎍/㎖ 의 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질을 함유하는 1.0 ㎖ 체적의 PBS-FCS 를 각 웰에 가하고 1 시간동안 RT 에서 배양한다. 세포를 PBS-FCS 용액으로 3 회 세척한 다음 5 분동안 RT 하에 PBS 에서 2 % 파라포름알데히드와 0.2 글루타르알데히드를 함유하는 PBC 에 고착시킨다. 배양물을 PBS-FCS 로 일회 세척한 다음, 65 ℃ 에서 1 시간동안 배양물을 PBS-FCS 용액에 침지시킨다. 배양물을 냉각 시키고, PBS-FCS 용액을 흡인한다. 배양물을 30 분동안 RT 에서 알칼리-포스파타아제 접합 염소 항-인체 IgG(Fc 특이성) 항체(시그마 제품 # A-9544)로 배양한 다음, 20 mM Tris-Cl (pH 7.6)과, 137 mM NaCl 로 3 회 세척한다. 이들 단계에서 형성된 면역 복합물을 제조자가 권한 방법에 따라 파스트 레드 TR/AS-MX 기질 키트(피어서, cat. # 34034)를 사용하여 알칼리 포스파타아제 활성을 검정하여 검출한다.

이 방법을 사용하여, 전체 약 300,000 의 독립 32D cDNA 클론을 선별하면, 각 1000 클론의 300 트랜스펙트된 푸울로 나타난다. 단일 웰은 OPG-Fc 융합 단백질에 의하여 특이하게 장식된 능력을 획득한 세포를 함유하는 것으로 확인되었다. 이 푸울을 순차적 범위의 친계 선발에 의하여 분획구분하면, 단일 플라스미드 클론 32D-F3(도 1)을 얻는다. 32D-F3 플라스미드 DNA 을 COS - 7 세포에 트랜스펙트한 다음, 이를 FITC-접합 염소 항-인체 IgG 이차 항체 단독, 인체 OPG[22 - 201]-Fc 융합 단백질 플러스 이차 항체로 아니면, ATAR-Fc 융합 단백질(HVEM 으로 알려진 ATAR ; 몬트고메리 등, Cell 87, 427 - 436 (1996))(도 2)로 번역 채색한다. 이차 항체 단독은 COS - 7/32D-F3 세포에 결합하지 않고, ATAR-Fc 융합 단백질에도 결합하지 않는다. COS - 7/32D-F3 세포에 OPG Fc 융합 단백질만이 결합하고, 32D-F3 는 발현 세포의 표면상에 나타나는 OPG 결합 단백질을 암호화 하는것을 나타낸다.

실시예 3

OPG 결합 단백질 배열

상기에서 단리한 32D-F3 클론은 약 2.3 kb cDNA 삽입물(도 1)을 함유하고, 이를 제조자가 권한 방법에 따라 시발체-조정 Tag 염료-종결인자 반응물(어플라이드 바이오시스템)을 사용하여 어플라이드 바이오시스템 373A 자동화 DNA 배열상에 양 방향으로 배열한다. 생성된 누클레오티드 배열을 FASTA 프로그램(GCG, 위스콘신 대학)을 사용하여 DNA 배열 데이타베이스와 비교하고, "여섯-방법 개방 판독대" 응용법(프레임스)(GCG, 위스콘신 대학)을 사용하여 장기 개방 판독대(LORF's)의 존재를 분석한다. 메티오닌에서 시작하는 316 아미노산(aa) 잔기의 LORF 를 적당한 방향에서 검출하고, 약 150 bp 의 5' 비번역 영역으로 선행시킨다. 5' 비번역 영역은 예상되는 개시 코돈의 인-프레임 정지 코돈 상류를 함유한다. 이것은 32D-F3 플라스미드가 포유류 세포에서 316 aa 유전자 생성의 발현을 조작하기 위하여 CMV 프로모터 영역을 실용화하는 이의 능력과 일치함을 나타낸다.

예상되는 OPG 결합 단백질 서열을 FASTA 프로그램(펄선, Meth. Enzynol. 183, 63 - 98(1990))의 변이된 번역을 사용하여 공지된 단백질 배열의 현존 데이타베이스와 비교한다. 뤼에티 등, Protein Sci. 3, 139 - 146 (1994)에 의하여 변이되는, (그리브스코브등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355 - 4359 (1987)의 배열 프로필 방법을 사용하여 종양 괴사 인자(TNF) 상과의 모든 공지된 일원에 보존되어 있는 특이적 모티프의 존재에 대하여 아미노산 배열을 분석한다. OPG 결합 단백질을 통하여 TNF 상과의 몇몇 일원에 상당한 상동 관계가 있음을 나타낸다. 마우스 OPG 결합 단백질이 두 TRAIL 과 CD40 리간드의 마우스와 인체 동종체에 가장 가깝게 관계됨을 나타낸다. OPG 결합 단백질 배열을 더 분석하면, 19.46 의 아주 높은 Z 스코어로, TNF 상과에 대한 강한 조화를 나타낸다.

OPG 결합 단백질 아미노산 배열은 M49 에서 시작하여 L69 로 연장하는 예상되는 소수성 전이막 영역을 함유한다. 메티오닌 개시 코돈과 관계되는 이 배열을 기초로하면 OPG 결합 단백질은 짧은 N-말단 세포내 영역과, 더 긴 C-말단 세포외 영역(도 4)을 갖는 형 Ⅱ 전이막 단백질인 것이 예상된다. 이것은 림포톡신알파(다가타와 콜스테인, Science 267, 1449 - 1456(1995))를 제외하고, 모든 공지의 TNF 계통 일원과 유사하다.

실시예 4

인체 OPG 결합 단백질 mRNA 의 발현

다중 인체 조직 노던 블롯(클론테크, 팔로알토, 캘리포니아)을³²P-dCTP 표지 32D-F3 제한 단편으로 탐침하여 인체 전사의 크기를 검출하고 발현 모양을 측정한다. 노던 블롯을 42 ℃ 에서 2 - 4 시간동안 5X SSPE, 50 % 포름아미드, 5X 덴하르트(Denhardt) 용액, 0.5 % SDS 와 100 ㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA 로 예비 교잡한다. 블롯을 42 ℃ 에서 18 - 24 시간동안 5X SSPE, 50 % 포름아미드, 2X 덴하르트 용액, 0.1 % SDS, 100 ㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA 와, 5 ng/㎖ 의 표지 프로브로 교잡한 다음, 블롯을 RT 에서 10 분동안 2X SSC 로 세척하고, 50 ℃ 에서 10 분동안 1X SSC 로 세척한 다음, 10 - 15 분동안 0.5X SSC 로 세척한다.

엄중한 조건하에서 마우스 DNA 에서 유도된 프로브와 교잡을 사용하여, 약 2.5 kb 의 상대 분자량을 갖는 우세한 mRNA 종을 림프절(도 3)에서 검출한다. 또한 태아 간 mRNA 의 동일한 상대 분자량에서 약한 신호를 검출한다. 검사된 다른 조직에서 OPG 결합 단백질 전사가 검출되지 않았다. 데이터로 OPG 결합 단백질 mRNA 의 발현이 인체 조직에서 극히 제한됨을 알 수 있다. 또한 데이터는 단리된 cDNA 클론이 재래 전사 크기에 매우 가깝고, 예상하는 32D-F3 가 전장 클론임을 나타낸다.

실시예 5

인체 OPG 결합 단백질의 분자 클로닝

OPG 결합 단백질의 인체 동종체는 인체 말초 림프절에서 약 2.5 kb mRNA 로서 발현되고 엄중한 교잡 조건하에서 마우스 cDNA 프로브로 교잡하여 검출한다. 인체 OPG 결합 단백질을 암호화하는 DNA 를 재조합 박테리오파아지 플라그, 아니면 형질전환된 박테리아콜로니, 교잡방법(삼보룩등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 콜드 스프링 하아버 프레스, 뉴욕(1989))에 의하여, 인체 림프절 cDNA 라이브러리를 선별하여 얻는다. 여기서 파아지 또는 플라스미드 cDNA 라이브러리를 마우스 OPG 결합 단백질 클론 32D-F3 에서 유도된 방사성-표지 프로브를 사용하여 선별한다. 프로브를 사용하여 배양된 라이브러리에서 제거된 니트로셀룰로오스 필터를 선별한다. 이들 필터를 실시예 4 에 명시된 조건을 사용하여 예비 교잡한 다음 교잡하면, 최종적으로 인체 OPG 결합 단백질 DNA 의 정제된 클론을 얻는다. 인체 OPG 결합 단백질 클론에서 얻은 삽입물을 실시예 3 에 기재된 바와같이 배열하고 분석한다.

1995. 12. 22일자 출원된 미국 특허 출원 번호 08/577,788 에 기재된 OPG-bp 전사의 존재에 대하여 인체 림프절 폴리 A+ RNA (클로테크, 인코포레이티드, 팔로 알토, 캘리포니아)을 분석한다. 엄중한 조건하에 32P-표지 마우스 OPG-bp 프로브로 이 RNA 시료의 노던 블롯을 탐침하면 인체 OPG-bp 전사를 나타낸다. 올리고 dT-시발 cDNA 라이브러리를 실시예 2 에 기재된 수퍼스크립트 키드(기브코 라이프 테크놀로지스, 가이더스버그, 매릴랜드)를 사용하여 림프절 mRNA 에서 합성한다. 생성한 cDNA 의 크기를 선택하고 고분자 분획을 플라스미드 벡터 pcDNA 3.1(+)(인비트로겐, 샌디에고, 캘리포니아)에 결찰시킨다. 전기수용능 E. coli DH10 (기브코 라이프 테크놀로지스, 가이더스버그, 매릴랜드)을 형질전환하고, 1×10⁶암피실린 내성 형질전환체를 32P-표지 마우스 OPG 결합 단백질 프로브를 사용하여 콜로니 교잡에 의하여 선별한다.

추정한 인체 OPG 결합 단백질 cDNA 의 플라스미드 클론을 단리하면, 2.3 kp 삽입물에 phu OPGbp - 1.1 을 함유했다. 생성한 phu PG bp - 1.1 삽입물의 누클레오티드 배열은 마우스 OPG 결합 단백질 cDNA 배열과 약 80 - 85 % 동종성을 가졌다. 삽입 DNA 배열을 번역하면 317 aa 폴리펩티드(도 4)를 암호화하는 것으로 예상되는 긴 개방 판독대의 존재를 나타낸다. 마우스와 인체 OPG-bp 폴리펩티드를 비교하면 이들은 ~87 % 는 동일하고, 이 단백질은 진화하는 동안 높게 보존됨을 나타낸다.

인체 OPG 결합 단백질 DNA 와 단백질 배열은 젠뱅크에는 존재하지 않고, 동종성 EST 배열이 없다. 마우스 동족체에 있어서, 인체 OPG 결합 단백질은 시토킨의 TNTα 상과의 모든 일원에 대하여 강한 배열의 유사성을 나타낸다.

실시예 6

OPG 결합 단백질의 클로닝과 박테리아 발현

하기에 기재한 시발체 쌍과 주형을 사용한 PCR 증폭을 사용하여 여러가지 형태의 마우스 OPG 결합 단백질을 발생시킨다. 각 쌍중 한 시발체는 유전자의 카르복시 말단에 따른 유일한 XhoI 또는 Soc Ⅱ 부위와 TAA 정지 코돈에 도입한다. 각 쌍중 다른 시발체는 유일한 NdeI 부위, N-말단 메티오닌과, 유전자의 아미노 말단 부분의 최적의 코돈에 도입한다. PCR 생성물을 정제하고, 제한 절단시키고, 벡터 pAMG 21 (ATCC 수탁번호 98113)의 유일한 NdeI 와 XhoI 또는 SacⅡ 부위에 삽입하고 원영양성 E. coli 393 또는 2596 으로 형질전환 시킨다. 또한 통상적으로 사용되는 다른 E. coli 발현 벡터와 숙주세포도 발현에 적합하다. 형질전환 후, 클론을 선택하고, 플라스미드 DNA 을 단리하고 OPG 결합 단백질 삽입물의 배열을 확인한다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [75 - 316]

이 구조는 242 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met(75)-ASP-Pro-Asn-Arg----Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고 올리고누클레오티드 # 1581 - 72 와 # 1581 - 76 은 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [95 - 316]

이 구조는 223 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-His(95)-Glu-Asn-Ala-Gly------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용된 주형은 pcDNA/32D-F3 이고 올리고누클레오티드 # 1591 - 90 과 # 1591 - 95 는 PCR 에 사용되고 이 유전자를 클론화하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [107 - 316]

이 구조는 211 아미노산 길이가 되게 계획되었고 다음 N-말단과 C-말단 잔기, NH₂-Met-Ser(107)-Glu-Asp-Thr-Leu-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용된 주형은 pcDNA/32D-F3 이고 올리고누클레오티드 # 1591 - 93 과 # 1591 - 95 는 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [118-316]

이 구조는 199 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C- 말단잔기, NH₂-Met(118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1591 - 94 와 # 1591 - 95 는 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [128 - 316]

이 구조는 190 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-Lys(128)-Glu-Leu-Gln-His-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1591 - 91 과 # 1591 - 95 는 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [137 - 316]

이 구조는 181 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-Gln(317)-Arg-Phe-Ser-Gly-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNA/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1591 - 92 와 # 1591 - 95 는 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [146 - 316]

이 구조는 171 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met(146)-Glu-Gly-Ser-Trp-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 상술한 pAMG 21-마우스 OPG 결합 단백질이고, 올리고누클레오티드 # 1600 - 98 과 # 1581-76 은 PCR 에 사용되고 이유전자 구조를 클론화하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [156 - 316]

이 구조는 162 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-Arg(156)-Gly-Lys-Pro-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 하기 pANG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]이고, 올리고누클레오티드 # 1619 - 86 과 # 1581 - 76 은 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]

이 구조는 160 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-Lys(158)-Pro-Glu-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNG/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1581 - 73 과 # 1581 - 76 은 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [166 - 316]

이 구조는 152 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNG/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1581 - 75 와 # 1581 - 76 은 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [168 - 316]

이 구조는 150 아미노산 길이가 되게 계획되었고, 다음 N-말단과 C-말단잔기, NH₂-Met-Thr(168)-Ile-Asn-Ala-------Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH 를 갖는다. PCR 에 사용되는 주형은 pcDNG/32D-F3 이고, 올리고누클레오티드 # 1581 - 74 와 # 1581 - 76 은 PCR 에 사용되고 이 유전자 구조를 클론화 하는 시발체 쌍이다.

상기 구조들은 예를 든 것이고, 본 분야의 전문가는 여기에 존재하는 일반적 방법론을 사용하여 다른 형태의 OPG 결합 단백질을 쉽게 얻을 수 있다.

재조합 박테리아 구조 pAMG 21 - 마우스 OPG 결합 단백질 [75 - 316], [95 - 316], [107 - 316], [118 - 316], [128 - 316], [137 - 316] 과 [158 - 316]을 클론화하고, DNA 배열을 확인하고, 유도에 따른 재조합 유전자 생성 발현의 수준을 검사한다. 모든 구조는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 초기 여액의 쿠마시 채색에 의해 쉽게 볼 수 있는 재조합 유전자 생성물의 수준을 일으킨다. 형질전환된 E. coli. 393 또는 2596 의 생장, OPG 결합 단백질 발현의 유도와 OPG 결합 단백질을 함유하는 세포 함유물 몸체의 단리는 PCT WO 97/23614 에 기재되어 있는 방법에 따라 행한다. 세포 함유물 몸체로 부터 OPG 결합 단백질의 정제에는 본 분야의 전문가가 이용할 수 있는 방법을 사용하여 OPG 결합 단백질을 용해시키고 원형 회복하는것이 필요하다. 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]은 대부분 불용으로 생성되는 것을 알 수 있지만, 그러나 약 40 % 는 용해성 분획임을 알 수 있다. 재조합 단백질은 하기에 기재된 바와 같이 용해성 분획에서 정제하고 이의 생체 활성을 검사한다.

실시예 7

재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]의 정제

냉동 박테리아 세포 잠복 발현 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]을 융해하고 20 mM 트리스-HCl pH 7.0, 10 mM EDTA 에 재현탁시킨다. 세포 현탁액(20 % w/v)을 미세 유동제에 3 회 통과시켜서 균일화한 다음, 용균된 세포 현탁액을 45 분동안 10,000 rpm 의 JA 14 회전기에서 원심분리한다.

SDS-PAGE 분석하면 두 세포함유물 몸체와 상청액에 존재하는 약 18 kd 분자량의 띠가 나타난다. 용해성 분획을 10 mM MES pH 6.0 으로 평형이 유지되는 파마시아 SP 세파로오스 4 FF 컬럼에 사용한다. OPG 결합 단백질을 MES pH 6.0 에서 0 - 0.4 M NaCl 의 20 컬럼 체적 기울기로 용출한다. OPG 결합 단백질을 함유하는 분획을 20mM MES pH 6.0 으로 평형이 유지되는 ABX 베커본드 컬럼에 사용한다. 다음 OPG 결합 단백질을 MES pH 6.0 에서 0 - 0.5 M NaCl 의 15 CV 기울기로 용출한다. 최종 생성물은 SDS-PAGE 에 의하여 95 % 이상의 균질성을 갖는다. N-말단 배열은 잔기 158 에서(개시제 메티오닌으로)시작하는 폴리펩티드에서 예상되는 것과 동일한 다음의 배열 : Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His 를 나타낸다. SDS-PAGE 에서 단백질의 상대 분자량은 환원으로 변하지 않는다.

실시예 8

재조합 용해성 OPG 결합 단백질의 생체외 생체 활성

재조합 OPG 단백질을 미리 나타나게 하여 미국 특허 출원 번호 08/577,788 에 기재되어 있는 용골세포 형성 검정으로 골수와 비장 전구물질에서 나온 비타민 D3-의존형 용골세포 형성을 차단한다. OPG 결합 단백질은 OPG 에 결합하고, 리간드의 TNF 계통의 새로운 일원이기 때문에, 이는 OPG 생체 활성의 우수한 표적이다. 최소의 코어 TNFα-유사 영역을 나타내는, 재조합 용해성 OPG 결합 단백질(158 - 316)을 이의 능력이 용골세포 전구물질로 부터 용골세포 분화를 조절하는 것에 대하여 시험한다. 골수세포를 어른 마우스 대퇴골에서 단리하고, M-CSF 로 처리한다. 비-유착 분획을 두 비타민 D3 및 덱사메타손의 존재와 비 존재하에 ST2 세포로 공동 배양한다. 이미 나타난 바와 같이, 용골세포는 간질 세포(ST2), 비타민 D3 와 덱사메타손을 함유하는 공동-배양물에서만 발육한다. 재조합 용해성 OPG 결합 단백질을 0.16 - 500 ng/ml 의 여러가지 농도 범위로 첨가하고, 용골세포 발육을 TRAP 용액검정 및 가시적 관찰에 의하여 측정한다. OPG 결합 단백질은 1 - 2 ng/ml 범위에서 반정도-최대 효과를 갖는, 투약량 의존형 방법에서 용골세포 분화와 발육을 강하게 자극하고, 이는 생체외 용골세포 형성(도 5)의 우수한 유도물질로서 작용하는 것으로 생각된다. OPG 결합 단백질의 작용은 재조합 OPG(도 6)에 의하여 차단된다.

OPG 결합 단백질이 간질로 대치 될 수 있고 스테로이드를 첨가할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 용골세포 전구 물질의 생장을 촉진하는 여러가지 농도로 M-CSF 를 사용하여 배양물을 설정하고 또한 여러가지 양의 OPG 결합 단백질을 첨가한다. 도 6 에 표시된 바와 같이, OPG 결합 단백질 투약량은 의존적으로 TRAP 활성을 자극하고, 자극의 크기는 이들 두 인자가 함께 용골세포 발육의 중심에 있는 것으로 예상하여, 첨가되는 M-CSF 의 수준에 따른다. 이러한 최종 관찰의 생물학적 적합성을 확인하기 위하여, 배양물을 소 피질성 골 조각에 설정하고 M-CSF 와 OPG 결합 단백질 단독 아니면 함께의 효과를 시험한다. 도 7 에 표시된 바와 같이, M-CSF 의 존재하에 OPG 결합 단백질은 막공에서 나온 골 표면을 침식하는 큰 TRAP 양성 용골세포의 형성을 자극한다. 따라서, OPG 결합 단백질은 용골세포 형성 자극(분화)인자로서 작용한다. 이것은 OPG 가 OPG 결합 단백질을 격리하여 용골세포 발육을 차단하는 것으로 예상한다.

실시예 9

재조합 용해성 OPG 결합 단백질의 생체내 활성

생체외 연구를 기초로 할때, E. coli. 에 생성된 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316] 은 골수 전구물질로 부터의 용골세포 발육의 우수한 유도물질이다. 생체내 이의 효과를 측정하기 위하여 4 - 5 주 나이의 숫컷 BDF 1 마우스(찰스 리버 레버러토리스)에 3 일동안 하루에 2 회 및 4 일째(0. 1. 2 및 3 일)의 아침에 OPG 결합 단백질을 피하주사한다.

5 개 그룹의 마우스(n=4)에 매일 담체만 투여하거나, 또는 1, 5, 25 또는 100 ㎕/일 의 OPG 결합 단백질[158-316]을 투여한다. 다른 5 개 그룹의 마우스(n=4)에 상기 투약량의 담체 또는 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 투여하고, 매일 단일 피하주사로 1 mg/kg/일(약 20 ㎍/일)의 인체 Fc-OPG[22 - 194] 를 더 투여한다. 전체 혈액 이온화 칼슘을 0 일에 측정하고, 1, 2 및 3 일에는 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 첫번째 주사 후 3-4 시간 후에 측정하였다. 3 일에 최종 주사한 후 네 시간안에 마우스는 희생되었고 이의 방사선 사진을 취했다.

OPG 결합 단백질[158 - 316]의 재조합체는 5 ㎍/일 과 그 이상(도 8)의 투약량으로 치료한 2 일후 혈액 이온화 칼슘의 현저한 증가를 가져왔다. 칼슘 과다 혈증의 피해도는 증가된 골 흡수에서 나온 용골세포 활성의 우세한 유도를 나타낸다. 동시 OPG 투여는 100 ㎍/일 이 아닌, 5 와 25 ㎍/일 의 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 투약량으로 칼슘 과다 혈증을 제한했다. 이들 동일한 동물을 방사선 사진법으로 분석하여 X-선에 의하여 볼 수 있는 골 광물질 밀도에 어떠한 효과가 있는지를 측정한다(도 9). 3 일 동안 주사한 OPG 결합 단백질[158 - 316]의 재조합체는 투약량-의존형 방법에서 마우스의 근위 하퇴골의 골 밀도를 감소시켰다. 골 밀도의 감소는 특히 100 ㎍/일 을 투여한 마우스에서 일어 났으며, 이들 동물의 심한 칼슘 과다 혈증은 증가된 골 흡수에서와 골격에서 나온 칼슘 방출에서 일어나는 것을 확인했다. 이들 데이타는 OPG 결합 단백질[158 - 316]이 생체내에서 작용하여 전신 칼슘과다 혈증을 유도하는 골 흡수를 촉진하고, 재조합 OPG 가 이러한 작용을 제거함을 분명하게 나타낸다.

실시예 10

포유류 세포에서 용해성 OPG 결합 단백질의 클로닝과 발현

마우스와 인체 OPG 결합 단백질의 전장 클론은 실시예 2 에서 이미 기술한 바와 같이 포유류 세포에서 발현될 수 있다. cDNA 클론을 변이시켜 포유류 세포에서 발현될 때 분비 형태의 단백질을 암호화 할 수 있다. 전이막 전체 영역을 포함하여, 단백질의 일차 69 아미노산을 통하여 거의 확장하고, 개시 코돈을 암호화하는 cDNA 의 장연 5' 말단을 신호 펩티드 선도 배열로 대치할 수 있다. 예를 들면, 개시 코돈과 알려진 유전자의 신호 펩티드를 암호화한 DNA 배열은 영역이 아미노산 잔기 68 을 암호화한 후 어디서나 시작하는 OPG 결합 단백질 cDNA 배열에 접합될 수 있다. 생성된 재조합 클론은 포유류 세포에서 분비형태의 OPG 결합 단백질을 생성시키고, 글리코실화와 같은, OPG 결합 단백질의 C-말단 세포외 영역에서 정상적으로 일어나는 후 번역 변이를 받는 것으로 예상된다. 이 전략을 사용하여 5' 말단에서 마우스 OPG 신호 펩티드를 갖고, 3' 말단에서 인체 IgG1 Fc 영역을 갖는 분비 형태의 OPG 결합 단백질을 구성한다. 1995. 12. 22 일자 출원된 미국 특허 출원 번호 08/577,788 에 기재된 플라스미드 벡터 pCEP4/muOPG[22 - 401]-Fc 를 NotI 로 절단시켜 OPG 의 3' 단부와 Fc 유전자 사이에서 분열시킨다. 선형화 DNA 를 XmnI 로 부분적으로 절단시켜서 둔단을 이탈한 OPG 의 잔기 23 과 24 사이에서만 분열시킨 다음, 제한 절단물을 CIP 로 탈인산화 시키고 이 소화의 벡터 부분(OPG 와 Fc 의 잔기 1 - 23 를 포함) 을 겔 정제한다.

다음 올리고누클테오티드를 시발체로 사용한 플라스미드 주형에서 나온 Pfu 폴리메라아제(스트라타겐, 샌 디에고, 캘리포니아)를 사용하여 아미노산 잔기 69 - 316 을 암호화한 마우스 OPG 결합 단백질 cDNA 를 PCR 증폭시킨다 :

1602 - 61 올리고누클레오티드는 유전자의 5' 말단을 증폭하고 인공 StuI 부위를 함유한다. 1602 - 59 시발체는 유전자의 3' 말단을 증폭하고 인공 NotI 부위를 함유한다. 얻은 PCR 생성물을 NotI 와 StuI 로 절단한 다음 겔 정제한다. 정제된 PCR 생성물을 벡터에 결찰시킨 다음, 전기 수용능 E. coli. DH10B 세포를 형질전환 하는데 사용한다. 얻은 클론을 배열하여 증폭된 배열과 제한 부위 접합의 보존성을 확인한다. 이 플라스미드를 사용하여 인체 293 섬유아세포를 트랜스펙트한 다음, 1995. 12. 22 일자 출원된, 미국 특허 출원 번호 08/577,788 에 이미 기재된 배지로부터 OPG 결합 단백질-Fc 융합 단백질을 수집한다.

유사한 전략을 사용하여, 발현 벡터를 인체 IgG1 Fc 영역에 융합되는 N-말단 단절을 발현할 수 있는 것으로 설계한다. 이러한 구조는 마우스 OPG 결합 단백질 잔기 158 - 316 의 골격내에 융합된 다음 인체 IgGI Fc 영역의 골격내에 융합되는 마우스 OPG 신호 펩티드(아미노산 잔기 1 - 21)를 구성한다. 이것을 행하기 위하여, 플라스미드 벡터 pCEP 4/마우스 OPG [22 - 401] (1995, 12. 22 일자 출원된 미국 특허 출원 번호 08/577,788)을 HindⅢ 와 NotI 으로 절단시켜서 전체 OPG 판독대를 제거한다. 다음 시발체를 사용한 플라스미드 주형 pCDNA/32D-F3 를 사용하여 마우스 OPG 결합 단백질, 잔기 158-316 을 PCR 증폭한다 :

1616 - 44 는 인공 XhoI 부위를 갖는 muOPG 신호 펩티드의 잔기 16-21 을 함유함을 물론 잔기 158 에서 시작하는 OPG 결합 단백질을 증폭한다. 1602 - 59 는 유전자의 3' 말단을 증폭하고 골격내 NotI 부위를 첨가한다. PCR 생성물을 NotI 와 XhoI 를 절단시킨 다음 겔 정제한다.

다음 상보성 시발체를 서로 강화시켜서 마우스 OPG 신호 펩티드를 암호화하는 적응인자와 번역 개시 부위를 둘러싸는 코자크 배열을 형성 시킨다 :

이들 시발체를 강화하면, 5' 말단에서 HindⅢ 와 3' 말단에서 XhoI 와 양립할 수 있는 5' 돌출부가 발생한다. 상기에서 얻은 절단된 벡터, 강화된 올리고와 절단된 PCR 단편을 DH10B 세포에 함께 결찰하고 전기영동 시킨다. 생성한 클론을 배열하여 신호 펩티드, 자기 158-316 을 암호화 하는 OPG 결합 단백질 단편과 IgG1 Fc 영역사이의 접합의 확실한 재구성을 확인한다. 재조합 플라스미드를 정제하고, 인체 293 섬유아세포에 트랜스펙트하고, 상술한 바와 같은 조절된 배지 생성물로서 발현한다.

전장 마우스와 인체 cDNAs 를 pCEP4 발현 벡터(인비트로겐, 샌 디에고, 켈리포니아)로 클론화한 다음, 실시예 1 에 기재된 인체 293 섬유아세포의 배양물로 트랜스펙트한다. 세포 배양물을 상술한 하이그로마이신으로 선택하고 혈청-유리 조절 배지를 제조한다. 조절된 배지를 마우스 및 인체 재조합 OPG 의 컬럼에 노출시키고, 탈립성 형태의 마우스 및 인체 재조합 OPG bp 를 친화력으로 정제한다. 정제된 용해성 OPG 결합 단백질의 N-말단 배열 분석은 마우스 단백질이 페닐알라닌 139 전에 우선적으로 분열되고, 인체 단백질은 동종성 잔기, 이소류신 140 전에 무선적으로 분열됨을 나타낸다. 더불어, 인체 단백질은 글리신 145 전에 우선적으로 분열된다. 이것으로 자연 발생 용해 형태의 인체 OPG 결합 단백질이 위치 140 에서 이소류신 아니면 위치 145 에서 글리신으로 아미노 말단 잔기를 갖는 것을 예상한다.

실시예 11

OPG 결합 단백질의 펩티드와 단백질로 다클론성 및 단클론성 항체의 제조

OPG 결합 단백질의 특이적 영역에 대한 항체는 OPG 결합 단백질로 부터 펩티드를 면역화 하여 얻을 수 있다. 이러한 펩티드는 단독으로 사용하거나, 또는 접합 형태의 펩티드를 면역화에 사용할 수 있다.

성숙한 TNFα 의 결정구조는 [이. 와이. 존스, 디. 아이. 스투아트와, 엔. 피. 시. 워커(1990). J. Cell Sci. Suppl. 13, 11 - 18] 에 기재되어 있고, 단량체는 젤리로울 위상과 역평행 β-주름진 시트 샌드위치를 형성한다. 열개의 역평행 β-가닥이 이 결정 구조에서 관찰되고, 가닥 B' BIDG 와 다른 가락 C'CHF [이. 와이. 존스 등, 같은책]를 구성하는 하나의 베타 시트와 베타 샌드위치를 형성한다. 두 루프의 성숙한 TNFα 를 돌연변이 유발 연구와 관련시켜서 수용체와 접촉 하도록 하고, 이들은 베타 가닥 B ＆ B′ 사이에서 형성된 루프와 베타 가닥 E ＆ F 사이의 루프[시. 알. 고. 시-에스. 로와, 에이. 지. 포터(1991) Protein Engineering 4, 785 - 791]이다. TNFβ 와 55 Kd TNF 수용체(TNF-55)의 세포외 영역 사이에서 형성된 복합물의 결정 구조는 분해되고 수용체-리간드 접촉은[디. 더블유. 베너. 에이. 디'알시, 더블유. 제인스, 알. 겐츠, 에이치-제이. 쇼엔펄드, 시. 브로거, 에이치. 로에트숴와, 더블유. 레스로우어(1993) Cell 73, 431 - 445]에 기재되어 있다. 상술한 돌연변이 유발[시. 알. 고 등, 같은 책]에 따라서 리간드의 해당하는 루프 B B' 와 EF는 TNFb : TNF-R 55 복합물의 분해된 결정 구조의 수용체와 대부분의 접촉물을 이루는 것을 알 수 있다. 마우스 OPG 결합 단백질의 아미노산 배열을 TNFα 와 TNFβ 의 아미노산 배열과 비교한다. BB'와 EF 루프에 해당하는 마우스 OPG 결합 단백질의 영역은 이러한 비교를 기초로 할 때 예측되고 펩티드를 설계하여 하기에 기재했다.

A. 항원 : 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316]을 하기 동물의 면역화용 항원(ag)으로 사용하고, 혈청은 하기 방법을 사용하여 검사한다. 마우스 OPG 결합 단백질의 추정 BB' 와 EF 루프에 대한 펩티드를 합성하고 면역화에 사용한다 ; 이들 펩티드는 다음과 같다 :

BB' 루프펩티드 : NH₂--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKIS--COOH

BB' 루프-Cys 펩티드 : NH₂--NAASIPSGSHKVTLSSWYHDRGWAKISC--COOH

EF 루프펩티드 : NH₂--VYVVKTSIKIPSSHNLM--COOH

EF 루프-Cys 펩티드 : NH₂-VYVVKTSIKIPSSHNLMC--COOH

카르복시-말단 시스테인 잔기를 갖는 펩티드를 하기 섹션 B 에 기재된 방법을 사용하는 접합에 사용하고, 면역화에 사용한다.

B. 키홀 림페트 헤모시아닌 또는 소 혈청 알부민 접합 : 선택된 펩티드 또는 단백질 단편을 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)에 접합시켜서 이들의 동물 면역원성을 증가시킨다. 또한 소 혈청 알부민(BSA) 접합 펩티드 또는 단백질 단편을 EIA 규정 원안에 이용한다. 임젝트 말레이미드 활성화 KLH 또는 BSA(피어서 케미칼 캄파니, 록포오드, 일리노이스)를 10 mg/ml 의 최종 농도로 dH₂O 에서 재구성한다. 펩티드 또는 단백질 단편을 인산염 완충제에 용해시킨 다음 등가 질량(g/g)의 KLH 또는 BSA 와 혼합한다. 가볍게 교반하면서 실온에서 2 시간 동안 반응시켜서 접합시킨다. 용액을 탈염 컬럼위를 통과시키거나 하룻밤 PBS 에 대하여 투석한다. 펩티드 접합물을 면역화에서 또는 EIAs 에서 사용할때 까지 20 ℃ 에서 저장한다.

C. 면역 : Balb/c 마우스, (찰스 리버스 레버러토리스, 윌밍톤, 메릴랜드)Lou 쥐, 또는 뉴질랜드 흰 토끼를 완전 프로인드 보조제(CFA, 50 % vol/vol ; 디프코 레버러토리스, 디트로이트, 미시간)로 유화된 ag(각각 50 ㎍, 150 ㎍ 과 100 ㎍)로 피하주사(SQI)한다. 토끼에게 불완전 프로인드 보조제(ICFA ; 디프코 레버러토리스, 디트로이트, 미시간)로 유사한 모양으로 제조된 항원으로 2 주 간격으로 두 세 차례 추가항원자극을 시킨다. 쥐와 마우스를 약 4 주마다 추가원항자극 시킨다. 두번째 추가원항자극 다음 칠일에, 시럼 채혈을 행하고 혈청 항체 역가를 측정한다. 역가가 토끼에 전개되었을때, 50 ㎖ 의 주 생성 채혈을 6 주 연속 취한다. 마우스와 쥐는 혈청 역가 수준을 기초로 한, 하이브리도마 생성으로 선택하며 ; 5000 이상의 반정도-최대 역가를 사용한다. 이러한 원안을 조정하여 본 분야의 전문가는 사용할 수 있으며 ; 예를 들면, 현재, 여러가지 형의 면역 조절 인자를 이용하고, 이 원안에 혼입될 수 있다.

D. 효소-결합 면역흡수 검정(EIA) : ElAs 를 행하여 개개 동물의 혈청 항체(ab)역가를 측정한 다음, 우수한 하이브리도마를 선별한다. 평저면, 높은-결합의 96-웰 미세적정 EIA/RlA 판(코스타르 코포레이션, 켐브리지 메릴랜드)을 pH 9.2 의 탄산염-중탄산염(0.015 M Na₂CO₃, 0.035 M NaHCO₃)에서 ㎖ 당 5 ㎍ 으로 정제된 재조합 단백질 또는 단백질 단(항원, ag)으로 피복한다. 필요하면, 단백질 단편을 소 혈청 알부민(BSA)에 접합시킨다. 50 ㎕ 의 ag 를 각 웰에 첨가한다. 판을 초산염 필름(ICN 바이오케미칼스 인코포레이티드, 코스타 메사, 캘리포니아)으로 덮고, 4 ℃ 에서 2 시간 또는 하룻밤 동안 흔들리는 플랫폼에서 실온(rt)하에 배양한다. 1 부의 탈염수(dH₂O)와 1 부의 BSA 희석제/차단용 농축물(키르케가아드 애드 페리 레버러토리스, 인코포레이티드, 가이더스버그, 메릴랜드)을 혼합하여 제조한 5 % BSA 용액을 웰당 250 ㎕ 로 실온에서 30 분 동안 판을 차단한다. 차단용액을 버리고, 50 ㎕ 의 혈청 2-배 희석물(1 : 100 내지 1 : 12,800) 또는 하이브리도마 조직 배양 상청액을 각 웰에 첨가한다. 혈청 희석제는 1 % BSA(둘베코의 인산염 완충 염수, D-PBS 로 1 : 10 으로 희석된 10 % BSA 희석제/차단 농축액 ; 기브코 BRL, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)이고 반면에 하이브리도마 상청액은 희석하지 않고 시험 한다. 하이브리도마 선별의 경우, 한 웰은 접합 비교물로서 유지하고, 두번째 웰은 양성 ab 비교물로서 유지한다. 판을 다시 실온에서 1 시간 동안 흔들면서 배양한 다음, dH₂0 에서 세척 용액 20×농축물(키르케가아드 앤드 페리 레버러토티스, 인코포레이티드, 가이더스버그, 메릴랜드)의 1×제제를 사용하여 4 회 세척한다. 다음 1 % BSA 로 희석된 고추냉이 과산화효소 접합 이차 ab (보에링거 맨헤임 바이오케미칼스, 인디아나폴리스, 인디애나)를 36 분동안 각 웰에서 배양한다. 판을 얼룩이 건조하기전에 세척하고 ABTS 과산화효소 단일 성분 기질(키르케가아드 앤드 페리 레버러토리스, 인코포레이티드, 가이더스버그, 메릴랜드)을 첨가한다. 마이크로플레이트 EL 310 판독기(바이오-테크 인스트루먼츠, 인코포레이티드, 위누스커, 버몬트)를 사용하여 각 웰에 대하여 405 nm 에서 흡수도를 판득한다. 405 에서 흡광도 대 혈청 희석의 log₁₀을 계산하여 반정도-최대 역가의 혈청 항체를 계산한 다음, 이 혈청에 의하여 얻은 최대 흡광도의 50 % 포인트에서 외삽한다. 상기 배경에서 흡광도 스코어가 5 배 이상이면 하이브리도마를 양성으로 선택한다. 이 원안을 조정하여 사용하고 ; 예를 들어, 접합된 이차 항체는 특이성 또는 비-교차-반응성으로 선택한다

E. 세포 융합 :

하이브리도마 제조를 위하여 선택한 동물에 50 ~ 100 μg 의 PBS 에서의 ag 를 정맥내 주사한다. 4 일후, 동물을 이산화탄소로 희생시키고, 200μ/㎖ 페닐실린 G, 200 μ/㎎ 스트렙토마이신 황산염, 4 mM 글루타민(2 × P/S/G DMEM)을 함유하는 35 ㎖ 의 둘베코스 변이 이글 배지로 살균 조건하에 이의 비장을 수집한다. 비장에서 여분의 지방을 제거한 다음, 4 접시의 깨끗한 2 × P/S/G DMEM 으로 행군다. 다음 10 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 함유하는 살균한 스토머커 백(테크마, 신시나티, 오하이오)에 옮기고 스토머커 래브 블렌더 80 (시워드 레버러토리 UAC 하우스 ; 런던, 영국)을 갖는 단일 세포 현탁액으로 분열시킨다. 세포가 비장 피막으로 부터 배지로 방출될때, 이들을 백에서 제거하고, 살균한 50 ㎖ 원뿔형 원심분리관(벡톤 디킨슨 앤드 캄파니, 링컨파크, 뉴저지)으로 옮긴다. 백에 새로운 배지를 첨가하고 비장의 전 세포 함유물이 방출될때 까지 공정을 계속한다. 이러한 비장세포를 10 분 동안 225 × g 로 원심분리에 의하여 3 회 세척한다.

동시에, 완전한 배지(DMEM, 10 % 비활성화 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨과 10 mM 헤페스 완충제 ; 기브코 레버러토리스, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)에서 생장한 각 마우스 또는 쥐 비장세포 융합물의 골수세포, Sp 2/0-Ag 14, 또는 Y3-Ag 1. 2. 3 의 로그기 배양물을 비슷한 모양으로 세척한다. 비장 세포를 골수 세포와 조합하고 다시 한번 펠릿으로 한다. 배지를 세포 펠릿에서 흡인하고 2 ㎖ 의 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG 1500 ; 보에링거 만헤임 바이오케미칼스, 인디아나폴리스, 인디애나)을 1 분이상 과정에서 세포에 가볍게 혼합한다. 다음 동일한 체적의 2 × P/S/G DMEM 을 서서히 가한다. 세포를 2 분동안 37 ℃ 에서 융합시킨 다음, 부가적으로 6 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 가한다. 세포를 다시 3 분동안 37 ℃ 에서 정치시킨다. 끝으로, 35 ㎖ 의 2 × P/S/G DMEM 을 세포 현탁액에 첨가하고, 세포를 원심분리에 의하여 펠릿으로 한다. 배지를 펠릿에서 흡인하고 세포를 완전한 배지에 가볍게 재 현탁 시킨다. 세포를 5 ㎖ 피펫으로 한 방울씩 96-웰 평-저면 조직 배양판(벡톤 디킨슨 래브웨어 ; 링컨 파크, 뉴저지)위에 살포한다. 판을 37 ℃, 5 % CO₂에서 가습 조건하에 하룻밤 배양한다. 다음날, 동일 체적의 선발 배지를 각 웰에 가한다. 선발 배지는 완전한 배지로 0.1 mM 히폭산틴, 4 × 10^-4mM 아미노프테린과 1.6 × 10^-2mM 티미딘으로 구성된다. 융합판을 7 일동안 배양한 후, 다음 3 일동안 두 배지를 바꾸고 ; 각 유체 변형후 HAT 선발 배지를 사용한다. 각 잡종-함유 웰로부터 최종 유체 변경후 3 ~ 4 일에 조직 배양 상청액을 취하고 EIA 로 특이한 항체 반응성을 시험한다. 이 원안은 후드신과 헤이의 "Practical Immunology, 제 2 판", 블렉웰 사이언티픽 페블리케이션스에 의하여 수정되었다.

실시예 12

혈액 생성 전구물질 세포로 발현되는 OPG 결합 단백질 수용체의 클로닝

생물학적 활성 재조합 마우스 OPG 결합 단백질 [158 - 316] 을 플루오레신-이소티오시아네이트(FITC)에 접합하여 형광 프로브를 생성시킨다. 4 ℃ 에서 12 시간동안 1 : 6 몰비의 6-플루오레신-5-(와 6) 카르복시아미도 헥산산 석신이미딜 에스테르(분자 프로브, 유진, 오리건)로 재조합 마우스 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 배양하여 형광 표지를 행한다.

FITC-표지 OPG 결합 단백질[158 - 316]을 겔 여과 크로마토그래피하여 더 정제한다. 마우스 골수세포를 단리하고 실시예 10 에 기재된 CSF-1 과 OPG 결합 단백질 [158 - 316] 의 존재하에 배양물에서 배양한다. 마우스 골수 세포를 CSF-1(30 ng/㎖)과 OPG 결합 단백질 [158 - 316] (20 ng/㎖)에서 하룻밤 배양한다. 비-유착 세포를 먼저 제거하고 얼음에 저장하고 세포 해리 완충제(시그마 케미칼스, 세인트 루이스, 미주리)로 배양하여 남은 유착 세포를 제거하고, 비-유착 개체군에 푸울한 다음, 상술한 바와 같이 FITC-OPG 결합 단백질로 얼룩지게 한다. 세척하고 0.5 % BSA 를 갖는 PBS 에 현탁시킨후, 세포를 FITC-OPG 결합 단백질에 노출시키고, 세척한 다음, FACS 에 의하여 분류한다. FITC-OPG 결합 단백질로 얼룩지게 한 양성의 세포 개체군을 수집하고 실시예 2 에 기재된 바와같이 mRNA 을 단리한다. 이 mRNA 제제를 사용하여 실시예 2 에 기재된 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제조한다.

이 급원에서 생성된 cDNA 라이브러리를 PCT 공고번호 WO 97/23614 와 시모넷 등(cell 89, 309 - 319(1997))에 이미 기재되어 있는 무작위 EST 배열 분석에 사용한다. 이 방법을 사용하여 새로운 TNFR-관련 단백질을 암호화하는 ~2.1 Kb cDNA 을 검출한다. 마우스 ODAR cDNA 긴 개방 판독대는 625 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하고 TNFR-관련 단백질의 검증 특징 : N-말단에서 소수성 신호 펩티드, 네 종열 시스테인-풍부 반복 배열, 소수성 전이막 영역과 세포질 신호표지 영역을 함유한다. 이 단백질과 다른 TNF 수용체 계통의 일원과의 동종성과 FITC-표지 OPG 결합 단백질에 결합하는 골수 세포에서 이의 발현은 TNF-관련 OPG 결합 단백질의 우수한 수용체인 것으로 예상하게 한다. 이 단백질은 ODAR 또는 용골세포 분화와 활성화 수용체로 표시된다. 핵산 배열과 마우스 ODAR 의 예상되는 아미노산 배열은 도 10 에 표시했다.

공식적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로 최근 배열을 분석하면, 이 단백질은 RANK(앤더선 등, Nature 390, 175 - 179 (1997))로서 알려져 있는 인체 TNFR-관련 단백질의 마우스 동족체임을 나타낸다.

실시예 13

포유류 세포에서 재조합 ODAR 단백질의 제조

상기 WO 97/23614 와 시모넷 등에서 이미 기재되어 있는 Fc 융합 단백질의 구성과 발현 방법을 사용하여 인체 IgG 의 Fc 영역에 융합되는 용해성 ODAR 세포외 영역을 제조한다. 포유류 세포에서 용해성 ODAR 단백질을 발생시키기 위하여, 마우스 ODAR cDNA 암호화 세포외 영역(아미노산 27 - 211)을 다음 올리고누클레오티드 시발체로 PCR 증폭시킨다 :

20 mM 트리스-HCl pH 8.8, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1 % 트립톤-X 100, 10 μM 의 각 dNTP, 1 μM 의 각 시발체와 10 ng 의 ODAR cDNA 주형에서 1 유니트의 통기공 DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스)로 50 ㎕ 의 체적으로 PCR 반응을 행한다. 전체 16 주기로하여, 30 초 동안 94 ℃, 30 초 동안 55 ℃ 와 1 분 동안 72 ℃ 에서 반응을 행한다.

PCR 단편을 전기영동에 의하여 단리한다. PCR 단편은 5' 말단에서 Hind Ⅲ 제한 부위와 3' 말단에서 NotI 제한 부위를 일으킨다. 상기 WO 97/23614 와 시모넷 등에 이미 기재되어 있는 인체 IgG-γ1 중쇄 배열전에 변이된 pCEP4-Fc 벡터로 골격내에 HindⅢ-Not I 소화 PCR 단편을 서브클론화 한다. ODAR 세포외 영역과 IgG Fc 영역사이의 접합을 거치는 두 부적절한 아미노산을 암호화 하는 링커를 주입한다.

구조물을 NheI, HindⅢ 로 절단한 다음 OPG 신호 펩티드를 암호화 하는 다음의 어닐링된 올리고누클레오티드 쌍(아미노산 1 - 21)을 골격내에 삽입한다 :

두 부적절한 아미노산을 암호화하는 링커를 OPG 신호 펩티드와 ODAR 배열 사이에 삽입한다. 최종 계획된 구조(ODAR-Fc/pCEP4) 는 아미노 말단에서 부터 카르복시 말단까지 : POG 신호펩티드 (아미노산1-21)-링커

(LysLeu)-ODAR(아미노산 27 - 211)-링커(AlaAla)-인체 IgG Fc 를 함유하는 융합 단백질을 암호화 한다.

오우서벨 등, Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9. 1. 1. 9. 1. 3, (1994)에 기재된 인산 칼슘 방법에 의하여 구조물을 293-EBNA-1 세포로 트랜스펙트한다. 트랜스텍트된 세포를 200 ㎕/㎖ 하이그로마이신(기브코 BRL) 에서 선택한 다음 생성한 약제-내성 부피 배양물을 푸울하고 합류로 생장시킨다. 세포를 PBS 로 한 번 세척한 다음, 72 시간 동안 혈청-유리 배지에서 배양한다. 조절된 배지를 수집한다. 배지에서 ODAR-Fc 융합 단백질을 항-인체 IgG Fc 항체로 웨스턴 블롯 분석하여 검출한다.

제조자가 권한 방법을 사용하여 단백질-A 컬럼 크로마토그래피(피어서)에 의하여 Fc 융합 단백질을 정제한다. 50 몰의 정제된 단백질을 머츄다이라 등(J. Biol. Chem. 262, 10 - 35(1987))에 의하여 기술된 자동화 에드맨 분해에 의한 N-말단 배열을 갖게한다. 아미노산 배열은 10 주기후 다음과 같이 판독된다 :

NH₂-K L V T L Q V T P-CO₂H

OPG 결합 단백질을 갖는 ODAR-Fc 의 결합 활성은 실시예 2 에 기재된 트랜스펙트된 COS-7 세포 배양물의 면역 형광 채색에 의하여 검사한다. 스마우스질을 암호화 하는

DNA 를 함유하는 1 ㎍ 의 발현 벡터로 COS-7 세포를 리포펙트한다. 48 시간 배양한 후, 1 시간 동안 4 ℃ 에서 10 ㎎/㎕ 의 인체 IgG Fc, ODAR-Fc, 또는 OPG-Fc 단백질을 함유하는 PBS-FBS 용액으로 세포를 배양한 다음, 세포를 PBS 로 2 회 세척한 후, 다른 시간동안 20 ㎍/㎖ FITC-표지 염소 항-인체 IgG(사우던 바이오테크 어소시에이트스)를 함유하는 PBS-FBS 용액에서 배양한다. PBS 로 세척한 후, 공초점 현미경(ACAS, 울티마, 인사이트 바이오케미칼 이메이징, 인코포레이티드, 오케모스, 미시간)으로 세포를 검사한다. OPGL 트랜스펙트 COS-7 세포(도 7)에 두 ODAR-Fc 와 OPG-Fc 가 결합한다.

실시예 14

재조합 용해성 ODAR 의 생체외 생물학적 활성

OPG 결합 단백질에 의하여 용골세포 형성의 자극을 억제하는 ODAR 의 능력을 CSF-1(30 ng/㎖)과 OPG 결합 단백질(5 ng/㎖)의 존재하에 마우스 골수 배양물로 평가한다. 용골세포 발육을 연구하는 마우스 골수 배양물의 사용 방법은 WO 97/23614 와 실시예 8 에 기재되어 있다. 실시예 12 에 기재된 바와 같이 제조된 ODAR-Fc 융합 단백질을 65 ~ 1500 ng/㎖ 의 농도로 첨가한다. 타르타르산염 내성 알카리 포스포타아제(TRAP)세포 화학에 의하여 용골세포 형성을 평가하고 배양 5 일후 TRAP 용액을 검정한다. 세포 화학과 TRAP 활성에 의해 관찰되는 ODAR-Fc 융합 단백질에 의해 용골세포 형성 억제가 좌우된다(도 12). ODAR-Fc 융합 단백질은 약 10 - 50 ng/㎖ 의 ED₅₀에서 용골세포 형성을 억제한다.

실시예 15

재조합 용해성 ODAR 의 생체내 생물학적 활성

3 ~ 4 주 나이의 빠르게 생장하는 어린 숫컷 BDF1 마우스에 4 일동안 담체(PBS/0.1 % BSA)하에 매일 일회 피하주사에 의하여 여러가지 투약량의 ODAR-Fc 융합 단백질을 투여한다. 마우스의 X-선 사진을 5 일에 찍는다. 사용되는 ODAR-Fc 융합 단백질의 투약량은 0.5, 1.5 와 5 ㎎/㎏/일 이다. 이 마우스 그룹과 PBS/0.1 % BSA 를 투여한 비교그룹 모두를 일회용 필름으로 X-선 찰영한다. 비교물의 쌍과 처리된 하퇴골 사이에서 근위 하퇴골 골단중절을 비교하여 처리된 하퇴골이 가시적 평가에 의하여 하기에 표시된 8 스코어를 나타내는 비교물보다 더 조밀하면 "+" 로 표시한다. "양성" 결과에 있어서는 5/8 의 임의 스코어가 요구된다(투약량은 ㎎/㎏/일 로 한다). (n=4)

희생 시킨후 우측 하퇴골을 각 동물에서 제거하고 근위 하퇴골 골단중절에서 골 밀도를 주변 정량 컴퓨터 단층 촬영법(PQCT) (스트라텍, 독일)에 의하여 측정한다. 하퇴골의 근위 단부에서 나온 골, 1.5 mm 와 2.0 mm 의 두 0.5 mm 단면을 분석하여(XMICE 5.2, 스트라텍, 독일)에 골단중절에서의 전체 골 광물질 밀도를 측정한다. 1500 의 연조직 분리 한계치를 사용하여 골단중절 골의 한계선을 정의한다.

어린 생장 마우스에 ODAR-Fc 를 투여하면 방사선 사진에서 가시적으로 분명하게 볼 수 있는 증가된 골 밀도의 영역을 생성시키는 근위 하퇴골 생장 판에서 골 흡수를 억제한다. 방사선 사진의 변화는 두 실험(표 1)에 있어 1.5 ㎎/㎏/일 과 그 이상에서 볼 수 있다. 하퇴골의 유사한 영역의 이차 실험에서 시료의 PQCT 에 의하여 골 밀도를 측정하면 이들 마우스의 골 밀도 증가(도 13)는 투약량에 따름을 확인했다.

ODAR-Fc 융합 단백질에 의한 골 흡수의 억제

실험 # 1

실험 # 2

본 발명을 바람직한 구성에 의하여 설명했으며, 본 분야의 전문가는 수정 및 변경을 할 수 있음을 이해 할 것이다. 그러므로 첨부된 특허 청구의 범위에는 청구된 본 발명의 범위내에 있는 이러한 모든 동등한 변경을 포함하는 것이다.

Claims (42)

1. 다음 중에서 선택한 오스테오프로테게린 결합 단백질을 암호화하는 단리한 핵산 :

   a) 도 1 (SEQ ID NO : ) 및 도 4(SEQ ID NO : )와 같은 핵산 배열 ;

   b) 도 1 (SEQ ID NO : ) 및 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 폴리펩티드 암호화 영역에 교잡하고 매우 엄중한 조건하에서 교잡 상태를 유지하는 핵산 ;

   c) (a) 또는 (b)의 핵산과 동의적인 핵산.
2. 제 1 항에 있어서, 핵산은 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 임을 특징으로 하는 핵산.
3. 제 1 항의 핵산에 의하여 암호화된 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, E. coli 발현에 바람직한 하나 또는 그 이상의 코돈을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
5. 제 1 항에 있어서, 핵산에 부착되는 검출 표지를 가짐을 특징으로 하는 핵산.
6. 도 1 (SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 1 - 316과 잔기 70 - 316 의 아미노산 배열을 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
7. 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 1 - 317 과 잔기 69 - 317 의 아미노산 배열을 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
8. 용해성 오스테오프로테게린 결합 단백질을 암호화하는 핵산.
9. 제 8 항에 있어서, 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 69 - 317 을 함유하는 폴리펩티드와 이의 절단물을 암호화함을 특징으로 하는 핵산.
10. 제 1 항 및 제 9 항의 핵산을 함유하는 발현 벡터.
11. 제 10 항에 있어서, 핵산이 도 1(SEQ ID NO : )과 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 폴리펩티드 암호화 영역을 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
12. 제 10 항의 발현 벡터로 형질전환시키거나 트랜스펙트한 숙주 세포.
13. 제 12 항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
14. 제 13 항에 있어서, E. coli 임을 특징으로 하는 숙주 세포.
15. 다음을 포함하는 오스테오프로테게린 결합 단백질의 제조방법 :

    제 1 항의 핵산으로 형질전환시키거나 트랜스펙트한 숙주 세포를 적당한 영양원 조건하에서 생장시키고 ;

    핵산 발현의 폴리펩티드 생성물을 단리한다.
16. 제 15 항의 제조방법에 의하여 제조된 폴리펩티드.
17. 정제되고 단리된 오스테오프로테게린 결합 단백질, 이의 단편, 유사체 또는 유도체.
18. 제 17 항에 있어서, 인체 오스테오프로테게린임을 특징으로 하는 단백질.
19. 제 17 항에 있어서, 도 1(SEQ ID NO : ) 및 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 아미노산 배열을 가짐을 특징으로 하는 단백질.
20. 제 17 항에 있어서, 수용성 중합체로 공유결합적으로 변이시킴을 특징으로 하는 단백질.
21. 제 20 항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 단백질.
22. 제 17 항에 있어서, 용해성 오스테오프로테게린 결합 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
23. 제 22 항에 있어서, 도 1(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 70 ~ 316 모두를 포함하는 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 단백질 또는 이의 단편, 유사체 또는 유도체.
24. 제 22 항에 있어서, 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 69 - 317 모두를 포함하는 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 단백질과 이의 절단물.
25. 오스테오프로테게린 결합 단백질에 특이하게 결합한 항체 또는 이의 단편.
26. 제 25 항에 있어서, 단클론 항체임을 특징으로 하는 항체.
27. 다음을 포함하는, 생물학 시료에서 오스테오프로테게린 결합 단백질의 존재를 검출하는 방법 :

    항체가 오스테오프로테게린 결합 단백질에 결합하게 하는 조건하에서 제 25 항의 항체와 함께 시료를 항온시키고 :

    결합된 항체를 검출한다.
28. 다음을 포함하는, 생물학 시료에서 오스테오프로테게린의 존재를 검출하는 방법 :

    단백질이 오스테오프로테게린에 결합하게 하는 조건하에서 오스테오프로테게린 결합 단백질과 함께 시료를 항온시키고 ;

    결합된 오스테오프로테게린 결합 단백질을 측정한다.
29. 다음을 포함하는, 오스테오프로테게린 결합 단백질에 결합하는 후보 화합물의 능력을 평가하는 방법 :

    결합을 허용하는 조건하에서 후보 화합물과 오스테오프로테게린 결합 단백질을 항온시키고 ;

    결합된 화합물을 측정한다.
30. 제 29 항에 있어서, 화합물이 오스테오프로테게린 결합 단백질의 작용물질 또는 길항물질임을 특징으로 하는 평가방법.
31. 도 1(SEQ ID NO : )과 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 핵산에 상보적인 핵산을 동물에 투여함을 포함하는, 동물에서 오스테오프로테게린 결합 단백질의 발현을 조절하는 방법.
32. 약학적으로 수용할 수 있는 담체, 보조제, 가용제, 안정화제 또는 산화방지제 중 하나 또는 그 이상에 치료학적 유효량의 오스테오프로테게린을 함유하는 약학적 조성물.
33. 제 32 항에 있어서, 오스테오프로테게린 결합 단백질이 인체 오스테오프로테게린 결합 단백질임을 특징으로 하는 조성물.
34. 치료학적 유효량의 오스테오프로테게린 결합 단백질의 조절인자를 투여함을 포함하는 포유류 골질병의 예방 또는 치료방법.
35. 제 34 항에 있어서, 조절인자가 용해 형태의 오스테오프로테게린 결합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 조절인자가 오스테오프로테게린 결합 단백질에 특이하게 결합하는 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 방법.
37. 제 22 항에 있어서, 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 140~316 모두를 포함하는 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 단백질 또는 이의 단편, 유사체 또는 유도체.
38. 제 22 항에 있어서, 도 4(SEQ ID NO : )에 표시된 잔기 145-316 모두를 포함하는 아미노산 배열을 함유하는 단백질 또는 이의 단편, 유사체 또는 유도체.
39. 치료학적 유효량의 용골세포 분화 및 활성화 수용체의 조절인자를 투여함을 포함하는 포유류 골질병의 예방 또는 치료방법.
40. 제 39 항에 있어서, 조절인자가 용해 형태의 용골세포 분화 및 활성화 수용체임을 특징으로 하는 방법.
41. 제 39 항에 있어서, 조절인자가 용골세포 분화 및 활성화 인자에 특이하게 결합하는 항체 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 방법.
42. 다음을 포함하는, ODAR 에 오스테오프로테게린 결합 단백질의 결합 증가 또는 감소에 대한 시험 화합물의 능력을 평가하는 방법 :

    오스테오프로테게린 결합 단백질이 ODAR 에 결합하게 하는 조건하에 오스테오프로테게린 결합 단백질, ODAR 과 임의의 시험 화합물을 배양하고 ;

    시험 화합물의 존재와 부재시에 ODAR 에 대한 오스테오프로테게린 결합 단백질의 결합을 측정한다.