CN117230193A - 基于c-maf状态的乳腺癌治疗性治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于患有乳腺癌的受试者的c‑MAF表达水平和绝经状态为该受试者设计个体化疗法。在一些实施方案中，所述个体化疗法包括用于避免或预防骨退化的药剂。在一些实施方案中，所述用于避免或预防骨退化的药剂是唑来膦酸。

Description

基于C-MAF状态的乳腺癌治疗性治疗
本申请为分案，其母案申请的申请号为201780042410.4，申请日为2017年5月25日，发明名称为“基于C-MAF状态的乳腺癌治疗性治疗”。
序列表引用
与本申请一起提交的以电子方式递交的序列表("3190_015PC02_SeqListing.txt"，58,739个字节，2017年5月18日创建)的内容通过引用完整地结合在本文中。
发明背景
发明领域
本发明涉及对患有乳腺癌的受试者设计个体化疗法，其中所述个体化疗法基于所述受试者的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位和绝经状态进行选择。在一些实施方案中，所述个体化疗法包括用于避免或预防骨重建的药剂。在一些实施方案中，所述用于避免或预防骨重建的药剂是唑来膦酸(zoledronic acid)。
背景技术
乳腺癌是世界上第二大常见的癌症类型(10.4％；次于肺癌)以及是第五大常见的由癌症引起的死亡原因(排在肺癌、胃癌、肝癌和结肠癌之后)。在女性中，乳腺癌是最常见的由癌症引起的死亡原因。在2005年，乳腺癌在世界范围内引起502,000例死亡(占癌症引起的死亡的7％；几乎占所有死亡的1％)。自二十世纪七十年代以来，全世界病例的数量显著增加，这是一种部分由于西方世界的现代生活方式引起的现象。
按照TNM系统，乳腺癌分类为各期。(参见美国癌症分期联合委员会(AmericanJoint Committee on Cancer)，AJCC癌症分期手册，第6版，New York，NY:Springer，2002，其通过引用完全结合在本文中)。预后与分期分类的结果密切相关，并且分期分类也在临床试验和医疗实践中用于对患者分派各种治疗。用于分类为各期的信息如下所述：
TX：不能评定的原发性肿瘤。T0：没有肿瘤迹象。Tis：原位癌，无侵袭。T1：肿瘤为2cm以下。T2：肿瘤大于2cm但小于5cm。T3：肿瘤大于5cm。T4：在乳房或皮肤壁内发展的任何尺寸的肿瘤或炎性乳腺癌。
NX：附近的淋巴结不能评定。N0：癌症尚未扩散到区域淋巴结。N1：癌症已经扩散到1至3个腋窝淋巴结或扩散到一个内乳淋巴结。N2：癌症已经扩散到4至9个腋窝淋巴结或扩散到多个内乳淋巴结。N3：适用于下述之一：
癌症已经扩散到10个以上的腋窝淋巴结，或者癌症已经扩散到锁骨下淋巴结，或者癌症已经扩散到锁骨上淋巴结或癌症影响腋窝淋巴结并且已经扩散到内乳淋巴结，或者癌症影响4个以上腋窝淋巴结并且在内乳淋巴结中或在前哨淋巴结组织活检物中存在最低量的癌症。
MX：不能评定远端扩散(转移)的存在。M0：没有远端扩散。M1：已经产生向不包括锁骨上淋巴结的远端器官的扩散。
大部分患有实体瘤的患者在转移后死亡的事实意味着理解允许肿瘤转移的分子和细胞机制是至关重要的。最近的出版物已经证明怎样借助于复杂而所知甚少的机制引起转移以及不同的转移细胞型怎样具有趋向于特定器官的向性运动。这些组织特异性的转移细胞具有允许其定殖于特定器官的一系列活动性功能。
所有细胞在其表面上、在其细胞质内以及在细胞核中具有受体。某些化学信使，如激素，结合于所述受体，并且这在细胞内引起变化。存在三种重要的可能影响乳腺癌细胞的受体：雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)和HER2/neu。为了命名具有这些受体中的任一种的细胞，当受体存在时写上正号，并且当受体不存在时写上负号：ER阳性(ER+)，ER阴性(ER-)，PR阳性(PR+)，PR阴性(PR-)，HER2阳性(HER2+)和HER2阴性(HER2-)。受体状态已经成为所有乳腺癌的重要评估，原因在于其确定使用特定治疗(例如，他莫昔芬或曲妥珠单抗)的适用性。
无监督基因表达阵列谱已经通过鉴定固有亚型(如luminal A、luminal B、HER2+/ER-和基底样亚型)为乳腺癌的异质性提供了生物学证据。
三重阴性癌症定义为不表达雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和HER2的基因的肿瘤。这一亚组占所有类型乳腺癌的15％，并且在绝经期前非洲和非裔美国妇女中发生的乳腺癌中占较高百分数。三重阴性乳腺癌具有与雌激素受体阳性乳腺癌非常不同的复发模式：复发的风险在前3-5年要高得多，但是之后急剧下降并且基本上低于雌激素受体阳性乳腺癌的复发风险。
基底样亚型特征在于ER和HER2两种基因簇的低表达，因此在临床测试中是典型的ER-阴性、PR-阴性和HER2-阴性；出于这一原因，其通常称为“三重阴性”乳腺癌(BreastCancer Research 2007，9(Suppl 1):S13)。基底样癌症表达通常在正常乳腺的“基底”/肌上皮细胞中存在的基因，包括高分子量细胞角蛋白(5/6，14和17)、P-钙黏着蛋白、小窝蛋白1和2、巢蛋白、αB结晶和表皮生长因子受体(Reis-Fiho J.等人，http://www.uscap.org/ site～/98th/pdf/companion03h03.pdf)。
考虑到没有关于基底样乳腺癌的国际上接受的定义，并不惊讶关于三重阴性乳腺癌和基底样乳腺癌是否是同义的而存在大量的困惑。尽管一些组已经互换地使用这些术语，但是应该注意，并非所有的基底样癌症都缺少ER、PR和HER2，并且并非所有的三重阴性癌症都表现出基底样表型。绝大部分三重阴性癌症是基底样表型。类似地，绝大部分表达‘基底’标记的肿瘤是三重阴性的。然而，应该注意，存在显著数量的不表达基底标记的三重阴性癌症，和小但仍然显著的表达基因受体或HER2的基底样癌症亚组。Bertucci等人(IntJ Cancer.2008Jul 1；123(1):236-40)已经直接阐释了这个问题，并且验证了通过基因表达谱分析时并非所有的三重阴性肿瘤都分类为基底样癌症(即，仅有71％是基底样表型)以及并非所有通过表达阵列分类的基底样乳腺癌都表现出三重阴性表型(即77％)。
当用可能的辅助激素疗法(使用他莫昔芬或芳香酶抑制剂)、化学疗法和/或放射疗法使癌症局部化时，治疗乳腺癌的重要手段是手术。目前，手术后的治疗建议(辅助疗法)遵循某种模式。由于每两年在瑞士圣加仑召开世界会议讨论世界多中心研究的实际结果，该模式进行改变。类似地，所述模式也按照国立卫生研究院(National Institute ofHealth，NIH)的一致性标准进行检验。基于这些标准，大于85-90％的没有淋巴结内转移的患者将成为接受辅助系统性疗法的候选者。
目前，PCR测定，如癌型检测(Oncotype DX)，或微阵列测定，如MammaPrint，能够基于特定基因的表达预测乳腺癌复发的风险。在2007年2月，MammaPrint测定成为获得食品药物管理局官方授权的首个乳腺癌指征。
专利申请EP1961825-A1记载了预测发生乳腺癌向骨骼、肺部、肝脏或脑部转移的方法，所述方法包括相对于在对照样品中相对应的表达水平，确定肿瘤组织样品中一种或多种标记的表达水平，所述标记包括c-MAF。然而，该文献需要同时确定几种基因以能够确定乳腺癌患者的生存期，并且该基因特征预测无骨骼转移生存力的能力之间的相关性没有统计学显著性。
专利公布U.S.Publ.No.2011/0150979记载了一种用于预测基底样乳腺癌的预后的方法，所述方法包括检测FOXC1的水平。
专利公布U.S.Publ.No.2010/0210738涉及一种用于预测患有三重阴性乳腺癌的受试者中的癌症的方法，所述方法包括检测样品中一系列随机上调或下调的基因的表达水平。
专利公布U.S.Publ.No.2011/0130296涉及可用于三重阴性乳腺癌的诊断和预后的标记基因的鉴定。
有需要鉴别得益于特定治疗的乳腺癌患者亚组以及相反不能得益于特定治疗或潜在地受特定治疗损害的乳腺癌患者亚组。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及一种为患有乳腺癌的受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值没有升高，那么所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法。
在一些实施方案中，所述受试者是未到绝经后的。在另一些实施方案中，所述受试者是绝经后的。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于为患有乳腺癌的未到绝经后的受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值升高，那么所述受试者不适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于为患有乳腺癌的绝经后受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值升高，那么所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法。
在一些实施方案中，对所述受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法。在另一些实施方案中，不对所述受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法。
在某些实施方案中，所述旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法是选自由下述组成的组的旨在预防或抑制骨退化、改善无病生存期或整体生存期的药剂：双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH、PTHLH抑制剂(包括中和抗体和肽)、PRG类似物、雷尼酸锶、DKK-1抑制剂、双重MET和VEGFR2抑制剂、雌激素受体调节剂、降钙素、镭-223、CCR5拮抗剂、Src激酶抑制剂、COX-2抑制剂、mTor抑制剂和组织蛋白酶K抑制剂。在一些实施方案中，所述RANKL抑制剂选自由下述组成的组：RANKL特异性抗体、RANKL-特异性纳米抗体和骨保护素。在具体的实施方案中，所述RANKL特异性抗体是地舒单抗(denosumab)。在一些实施方案中，所述双膦酸盐是唑来膦酸。在另一些实施方案中，所述RANKL特异性纳米抗体是ALX-0141。在某些实施方案中，所述双重MET和VEGFR2抑制剂是卡博替尼(Cabozantinib)。
在一些实施方案中，c-MAF基因表达水平的定量包括对所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段进行定量，或对由所述基因编码的蛋白的水平进行定量。在具体的实施方案中，表达水平、拷贝数、扩增或增加通过定量聚合酶链式反应(PCR)或DNA或RNA阵列或核苷酸杂交技术进行定量。在多个实施方案中，蛋白的水平通过蛋白质印记(western blot)、ELISA、免疫组织化学或蛋白阵列进行定量。在某些实施方案中，使用抗体定量蛋白水平，所述抗体包含SEQ ID NO:21的重链CDR1，和/或SEQ ID NO:22的重链CDR2，和/或SEQ ID NO:23的重链CDR3；和/或包含轻链SEQ IDNO:18的CDR1，和/或SEQ ID NO:19的轻链CDR2和/或SEQ ID NO:20的轻链CDR3。在一些实施方案中，c-MAF基因的扩增或增加通过使用c-MAF基因特异性探针确定。在具体的实施方案中，所述c-MAF基因特异性探针是Vysis LSI/IGH MAF双色双融合探针。在另一些实施方案中，所述扩增或增加通过原位杂交或PCR确定。
在某些实施方案中，所述参比值是来自没有罹患转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌且在转移瘤样品中具有相对于对照样品没有升高的c-MAF表达水平的受试者中的骨转移的方法，所述方法包括施用能够预防或抑制骨重建、或改善无病生存期或整体生存期的药剂，其中所述能够避免或预防骨重建或改善无病生存期或整体生存期的药剂选自由下述组成的组：双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH、PTHLH抑制剂(包括中和抗体和肽)、PRG类似物、雷尼酸锶、DKK-1抑制剂、双重MET和VEGFR2抑制剂、雌激素受体调节剂、EGFR抑制剂、降钙素、镭-223、CCR5拮抗剂、Src激酶抑制剂、COX-2抑制剂、mTor抑制剂和组织蛋白酶K抑制剂。
在某些实施方案中，所述受试者是未到绝经后的。在另一些实施方案中，所述受试者是绝经后的。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌且在转移瘤样品中具有相对于对照样品升高的c-MAF表达水平的绝经后受试者中的骨转移的方法，所述方法包括施用能够预防或抑制骨重建或改善无病生存期或整体生存期的药剂，其中所述能够避免或预防骨重建的药剂选自由下述组成的组：双膦酸盐、RANKL抑制剂、PTH、PTHLH抑制剂(包括中和抗体和肽)、PRG类似物、雷尼酸锶、DKK-1抑制剂、双重MET和VEGFR2抑制剂、雌激素受体调节剂、EGFR抑制剂、降钙素、镭-223、CCR5拮抗剂、Src激酶抑制剂、COX-2抑制剂、mTor抑制剂和组织蛋白酶K抑制剂。
在具体的实施方案中，所述RANKL抑制剂选自下述的组：RANKL特异性抗体、RANKL特异性纳米抗体和骨保护素。在其他实施方案中，所述RANKL特异性抗体是地舒单抗。在另一些实施方案中，所述双膦酸盐是唑来膦酸。在另一些实施方案中，所述RANKL特异性纳米抗体是ALX-9141。在某些实施方案中，所述双重MET和VEGFR2抑制剂是卡博替尼。
在一个实施方案中，本发明涉及一种将患有乳腺癌的受试者分类成组群的方法，所述方法包括：a)确定所述受试者的乳腺瘤样品中c-MAF的表达水平、拷贝数、扩增或增加；b)将所述样品中c-MAF的表达水平、拷贝数、扩增或增加与预先确定的参比c-MAF表达水平相比较；并且c)基于所述样品中所述c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加和受试者是绝经后还是未到绝经后的状态将所述受试者分类成组群。
在某些实施方案中，基于受试者的c-MAF表达水平和/或她们的绝经后或未到绝经后的状态，对所述受试者实施不同的治疗。
在一些实施方案中，c-MAF表达水平的定量包括对所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段进行定量，或对由所述基因编码的蛋白水平进行定量。在具体的实施方案中，使用抗体定量蛋白水平，所述抗体包含SEQID NO:21的重链CDR1，和/或SEQ ID NO:22的重链CDR2，和/或SEQ ID NO:23的重链CDR3；和/或包含SEQ ID NO:18的轻链CDR1，和/或SEQ ID NO:19的轻链CDR2和/或SEQ ID NO:20的轻链CDR3。在某些实施方案中，所述扩增通过原位杂交或PCR确定。在其他实施方案中，所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH)。在另外的其他实施方案中，所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于(≥)2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或3.0。在具体的实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.2。在其他实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.3。在另外的其他实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.4。在某些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.5。在另一些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数小于(<)2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或3.0。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预测患有乳腺癌的患者的IDFS的体外方法，所述方法包括i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，并且ii)将在步骤i)中得到的所述表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值进行比较，其中相对于所述参比值所述基因升高的表达水平、拷贝数、扩增或增加指示差的IDFS。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预测患有乳腺癌的患者的IDFS的体外方法，所述方法包括相对于参比确定所述受试者样品中c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，其中相对于所述参比所述c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高指示差的IDFS。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预测患有乳腺癌的患者排除骨再发生的IDFS的体外方法，所述方法包括相对于参比确定所述受试者样品中c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，其中相对于所述参比c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高表示指示差的排除骨再发生的IDFS。
在一些实施方案中，所述能够预防或抑制骨重建的药剂是能够预防或抑制骨退化的药剂。
在一些实施方案中，对c-MAF表达水平的定量包括对所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段进行定量或对由所述基因编码的蛋白水平进行定量。在某些实施方案中，使用抗体定量蛋白水平，所述抗体包含SEQID NO:21的重链CDR1，和/或SEQ ID NO:22的重链CDR2，和/或SEQ ID NO:23的重链CDR3；和/或包含SEQ ID NO:18的轻链CDR1，和/或SEQ ID NO:19的轻链CDR2和/或SEQ ID NO:20的轻链CDR3。在另一些实施方案中，所述扩增通过原位杂交或PCR确定。在其他实施方案中，所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH)。在另外的其他实施方案中，所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于(≥)2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9或3.0。在某些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.2。在另一些实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.3。在其他实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.4。在另外的其他实施方案中，利用FISH测量的c-MAF拷贝数大于等于2.5。在一些实施方案中，所述拷贝数作为每个细胞的平均拷贝数而测定。
在一些实施方案中，所述乳腺癌为ER+乳腺癌。在具体的实施方案中，所述乳腺癌为ER-乳腺癌。在另一些实施方案中，所述乳腺癌为三重阴性乳腺癌。在不同的实施方案中，所述乳腺癌是基底样亚型。在一些实施方案中，所述乳腺癌是HER2+乳腺癌。
在一些实施方案中，c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加通过确定基因座16q23或16q22-q24的表达水平、拷贝数、扩增或增加而确定。
在一些实施方案中，所述治疗是mTOR抑制剂或CDK4/6抑制剂。在另一些实施方案中，所述治疗是超出护理标准的激素疗法。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌并且在转移瘤样品中具有相对于对照样品升高的c-MAF表达水平的受试者的方法，所述方法包括施用mTOR抑制剂或CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌并且在转移瘤样品中具有相对于对照样品升高的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加的受试者的方法，所述方法包括实施超出护理标准的激素疗法。在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌并且在转移瘤样品中不具有相对于对照样品升高的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加的受试者的方法，所述方法包括不施用mTOR抑制剂或CDK4/6抑制剂。在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌并且在转移瘤样品中不具有相对于对照样品升高的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加的受试者的方法，所述方法包括不施用超出护理标准的激素疗法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预测患者的无病生存状态的方法，所述方法包括相对于参比样品水平测量c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，并且使用所述c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加来预测所述患者的整体生存期。在一些实施方案中，c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于参比样品水平的升高预示比相对于参比样品水平在c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中没有升高的患者短的无病生存期。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于预测患者的整体生存状态的方法，所述方法包括相对于参比样品水平测量c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，并且使用所述c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加来预测所述患者的整体生存期。在另一个实施方案中，c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于参比样品水平的升高预示比相对于参比样品水平在c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中没有升高的患者短的整体生存期。
在多个实施方案中，患者的绝经状态也用于预测患者的生存状态。在一些实施方案中，所述受试者是未到绝经后的。在某些实施方案中，所述受试者是绝经前的。在具体的实施方案中，所述受试者是绝经后的。
附图简述
图1.测定参数概括。
图2.AZURE研究设计。
图3.AZURE样品的H&E分析。示出了可评价的和不可评价的样品。
图4A和图4B.MAF阳性率。
图5.MAF截点优化的FISH数据。切割点图上的突然增加(sharp spike)表示MAFFISH值确实是阈值事件。另外，预先确定的截点与优化的截点接近。
图6.基于MAF FISH值的骨再发生的风险。
图7.利用骨优化截点2.3通过MAF FISH值确定到骨再发生的时间。
图8.通过FISH确定IDFS百分数。利用最优截点2.2。
图9.通过FISH确定的整体生存期。利用最优截点2.2。
图10.仅在AZURE对照患者中通过FISH确定的到骨再发生的时间。利用骨优化截点2.3。
图11.仅在AZURE对照患者中通过FISH确定的IDFS。利用优化截点2.2。
图12.仅在AZURE对照患者中通过FISH确定的IDFS的时间(排除骨再发生)。利用优化截点2.2。
图13A和B.在对照组和唑来膦酸治疗组患者中到骨转移的时间。作为第一次事件的骨转移(A)和在随访过程中任意时间(B)的累积发生率。分析是为了进行治疗。HR-危害比。
图14.在AZURE对照患者和唑来膦酸治疗的患者中评估到作为第一次事件的骨转移的时间。利用骨优化截点2.3进行。
图15A和B.在对照组和用唑来膦酸治疗的患者之间的无病生存期(DFS)和无侵袭性疾病生存期(IDFS)。(A)无病生存期和(B)无侵袭性疾病生存期的卡普兰-迈耶曲线。分析是为了进行治疗。HR-危害比。
图16.在对照组与用唑来膦酸治疗的患者之间到远端复发的时间。
图17.依据治疗到骨转移事件的时间(任何时间)。在骨转移时(任何时间)使用死亡作为竞争事件。
图18.依据MAF拷贝数的到骨转移事件的时间(任何时间)(依据预先指定的MAF截点2.5)。
图19A和B.通过AZURE试验的绝经状态确定的IDFS。通过绝经状态确定的无侵袭性疾病生存期的卡普兰-迈耶曲线。(A)绝经前、围绝经期(perimenopause)和未知的绝经状态与(B)自绝经期起超过5年。通过绝经状态检测异质性(heterogeneity)χ2 1 4.71；p＝0.03。
图20.在绝经后的患者中根据MAF拷贝数(依据预先指定的截点2.5的数据)到骨转移事件的时间(任何时间)。
图21.在未到绝经后的患者中根据MAF拷贝数(依据预先指定的截点2.5的数据)到骨转移事件的时间(任何时间)。
图22.排除绝经后妇女的骨转移，唑来膦酸治疗组和对照组的IDFS。
图23.排除未到绝经后的女性的骨转移，唑来膦酸治疗组和对照组的IDFS。
图24.治疗组的整体生存期(OS)。用唑来膦酸治疗MAF FISH阳性患者显著影响OS。
图25.在Azure对照组中关于无病生存期(DFS)的MAF FISH的预后值(prognosticvalue)。
图26.在Azure对照组中关于整体生存期(OS)的MAF FISH的预后值。
图27.关于唑来膦酸治疗对无病生存期(DFS)结果的影响的MAF FISH预测值。
图28.关于唑来膦酸治疗对绝经后患者的无病生存期(DFS)结果的影响的MAFFISH预测值。
图29.关于唑来膦酸治疗对未到绝经后患者的无病生存期(DFS)结果的影响的MAFFISH预测值。
图30.关于唑来膦酸治疗对OS结果的影响的MAF FISH预测值。
图31.关于唑来膦酸治疗对绝经后患者中OS结果的影响的MAF FISH预测值。
图32.关于唑来膦酸治疗对未到绝经后患者中OS结果的影响的MAF FISH预测值。
发明详述
通用术语和表达的定义
“和/或”用在本文中视为对两个指定的特征或组分中的任一个连同另一个或不连同另一个的特定公开。例如，‘A和/或B’应该视为对下述任一者的特定公开：(i)A，(ii)B以及(iii)A和B，正如同每一者在本文中单独列出。
c-MAF基因(v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物(禽类)，也称为MAF或MGC71685)是一种含有亮氨酸拉链的转录因子，其如同同型二聚体或异二聚体起作用。取决于DNA结合位点，所编码的蛋白可以是转录激活剂或阻抑剂。编码c-MAF的DNA序列以登记号NG_016440((SEQ ID NO:1)(编码))记载在NCBI数据库中。c-MAF的基因组序列为SEQ ID NO:13所示。本发明的方法可以使用所述编码序列或所述基因组DNA序列。由所述DNA序列转录两种信使RNA，其每一种产生两种c-MAF蛋白同种型(即α同种型和β同种型)中的一种。每种所述同种型的互补DNA序列分别以登记号NM_005360.4(SEQ ID NO:2)和NM_001031804.2(SEQ IDNO:3)记载在NCBI数据库中。c-MAF基因预测ER+乳腺癌的预后的用途可见于美国申请号13/878,114，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测三重阴性和ER+乳腺癌的预后的用途记载在美国申请号14/391,085中，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测甲状腺癌的预后的用途记载在美国临时申请号61/801,769中，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测肾细胞癌的预后的用途记载在美国临时申请号14/776,390中，所述申请通过引用完全结合在本文中。目的基因(包括c-MAF和c-MAF基因座)以及针对所述基因座的探针确定患有乳腺癌的个体的预后的用途记载在美国申请号14/776,412中，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测肺癌的预后的用途见于美国申请号14/405,724，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测前列腺癌的预后的用途见于美国申请号14/050,262和14/435,128，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF基因预测HER2+癌症的预后的用途见于美国申请号15/027,946，所述申请通过引用完全结合在本文中。c-MAF的下游基因预测癌症预后的用途见于美国申请号15/014,916和14/776,453，所述申请通过引用完全结合在本文中。
用于本文时，术语“基底样”、“基底样亚型”、“基底样亚型乳腺癌”等在本文中使用时是指一种特定亚型的乳腺癌，其特征在于两种阴性受体ER和HER2以及由下述组成的组中的至少一种阳性受体：CK5/6，CK14，CK17和EGFR。因此，本申请中引用且提及三重阴性乳腺癌(ER，HER-2，PgR)的所有句子也可以引用且也提及这样的基底样乳腺癌：其中ER和HER2是阴性的，并且其中CK5/6、CK14、CK17和EGFR中的至少一种是阳性的。或者，“基底样”也指以基于下述十种基因的上调和/或下调的基因表达谱为特征的乳腺癌：(1)叉头框CI(FOXC1)；(2)黑色素瘤抑制活性(Melanoma inhibitory activity，MIA)；(3)NDC80同系物，着丝粒复合物成分(kinetochore complex component，KNTC2)；(4)中心体蛋白55kDa(CEP55)；(5)Anillin，肌动蛋白结合蛋白(ANLN)；(6)母体胚胎亮氨酸拉链激酶(MELK)；(7)G蛋白偶联受体160(GPR160)；(8)跨膜蛋白45B(TMEM45B)；(9)雌激素受体1(ESR1)；(10)叉头框Al(FOXA1)。由于用于将乳腺癌肿瘤分类成基底样亚型的基因表达谱不包括雌激素受体、孕酮受体或Her2，因此三重阴性乳腺癌和非三重阴性乳腺癌都可以被分类成基底样亚型。
用于本文时，“三重阴性乳腺癌”是指这样的乳腺癌，其特征在于缺少可检测到的ER和PR表达(优选地，当通过M.Elizabeth H等人，Journal of Clinical Oncology，28(16):2784-2795，2010公开的方法进行ER和PR表达测量时)，并且肿瘤细胞不针对2型表皮生长因子受体(HER2或ErbB2，一种通常位于细胞表面的受体)扩增。如果使用标准免疫组织化学技术，少于5％的肿瘤细胞的细胞核针对ER和PR表达被染色，则认为所述肿瘤细胞对于ER和PR表达是阴性的。用在本文中时，如果在用HercepTestTM试剂盒(Code K5204，DakoNorth America，Inc.，Carpinteria，CA)检测(即，一种使用多克隆抗-HER2一抗的半定量免疫组织化学测定)时肿瘤细胞产生0或1+、或2+的检测结果得分，或者如果它们是HER2 FISH阴性的，则认为所述肿瘤细胞对于HER2过表达是阴性的。
用于本文时，“ER+乳腺癌”理解为肿瘤细胞表达雌激素受体(ER)的乳腺癌。这使得所述肿瘤对雌激素敏感，意味着雌激素使得该癌性乳腺瘤生长。相反，“ER-乳腺癌”理解为肿瘤细胞不表达雌激素受体(ER)的乳腺癌。其中ER+乳腺癌包括luminal A和B亚型。
用于本文时，“HER2+”是指这样的乳腺癌，其特征在于肿瘤细胞具有可检测到的2型表皮生长因子受体(HER2或ErbB2)的表达和/或HER2基因(即通常位于细胞表面上的受体)的扩增。用于本文时，如果在用HercepTestTM试剂盒(Code K5204，Dako North America，Inc.，Carpinteria，CA)检测(一种使用多克隆抗-HER2一抗的半定量免疫组织化学测定)时肿瘤细胞产生0或1+、或2+的检测结果得分，或如果它们是HER2 FISH阴性的，则认为所述肿瘤细胞对于HER2过表达是阴性的。
在本发明的上下文中，“绝经后的”受试者理解为已经经历绝经且已经经过连续六十个月没有月经的妇女。参见Coleman等人，Lancet Oncol2014；15:997-1006。在某些实施方案中，可以通过检测促卵泡激素(FSH)确定妇女的绝经后状态。
在本发明的上下文中，“未到绝经后的”受试者是尚未经历绝经且尚未经历连续六十个月没有月经的任何受试者。“未到绝经后的”受试者包括绝经前、围绝经期和未知绝经状态的妇女。
在本发明的上下文中，“转移”理解为癌症从其起始的器官到不同的器官的传播。其通常通过血液或淋巴系统发生。当癌细胞扩散并且形成新肿瘤时，后者称为继发瘤或转移瘤。形成继发瘤的癌细胞跟原始瘤的癌细胞相似。例如，如果乳腺癌扩散(转移到)骨，则继发瘤由恶性乳腺癌细胞形成。骨中的疾病是转移性乳腺癌，而非骨癌。在本发明方法的一个具体的实施方案中，转移是已经扩散(转移)到骨的乳腺癌。
在本发明的上下文中，“再发生(recurrence)”是指在没有检测到癌症的一段时间后乳腺癌恢复。乳腺癌可能在乳房或乳房周围的组织内局部再发生。乳腺癌也可能在附近淋巴结或不在周围区域内的淋巴结内再发生。当乳腺癌通过扩散到其他组织而再发生或经由血流传播而在骨或其他器官内再发生时，也称为转移。当用在本文中时，再发生也包括有再发生的风险。
在本发明的上下文中，“复发(relapse)”是指症状已经减少但是受试者并不是没有癌症的、然后癌症恢复的状况。乳腺癌可能在乳房或乳房周围的组织内复发。乳腺癌也可能在附近淋巴结或不在周围区域内的淋巴结内复发。当乳腺癌通过扩散到其他组织而复发或经由血流传播而在骨或其他器官内复发时，也称为转移。当用在本文中时，复发也包括有复发的风险。
用于本文时，术语“无病生存期”是指在癌症初步治疗结束后患者以没有所述癌症的任何迹象或症状生存的时间长度。在一些实施方案中，无病生存期称为DFS、无复发生存期或RFS。
用于本文时，术语“整体生存期”或“OS”是指从癌症确诊日期或癌症治疗开始时诊断患有所述疾病的患者仍然存活的时间长度。
用于本文时，术语“受试者”或“患者”是指分类为哺乳动物的所有动物，并且包括，但不限于，家畜和耕作动物、灵长类动物和人，例如，人类、非人灵长类动物、母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。优选地，所述受试者是任意年龄或种族的男人或妇女。
术语“差”或“好”用在本文中指临床结果时意指受试者将表现出有利的或不利的结果。如本领域技术人员应该理解的，此类可能性的评估，尽管优选对要诊断的100％受试者是正确的，可能不是对要诊断的100％受试者是正确的。然而，该术语要求统计学显著部分的受试者可能被鉴别为具有针对给定结果的倾向性。部分是否是统计学显著的可以由本领域技术人员使用多种公知的统计学评价工具容易地确定，所述公知的统计学评价工具例如确定置信区间、p-值确定、斯氏t检验、Mann-Whitney检验等。详情见于Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％至少约95％。p-值优选为0.05、0.01、0.005或0.0001或更小。更优选地，通过本发明的方法能够正确地鉴别群体中至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的受试者。
在本发明中，“肿瘤样品”理解为来源于原发性乳腺癌肿瘤的样品(例如，肿瘤组织、循环的肿瘤细胞、循环的肿瘤DNA)。所述样品可以通过常规方法，例如，组织活检，使用相关医学技术专业人员公知的方法得到。用于获得组织活检样品的方法包括将肿瘤分成大块或显微切割或本领域已知的其他细胞分离方法。肿瘤细胞可以另外通过藉由小号针头吸取的细胞学方法获得。为了简化样品保存和处理，样品可以固定在福尔马林中并且浸渍在石蜡中，或通过浸没在允许快速冷冻的高度致冷的介质中先冷冻然后浸渍在组织冷冻介质(如OCT化合物)中。
在本发明的上下文中，“c-MAF蛋白的功能等价变体”理解为：(i)c-MAF蛋白(SEQID NO:4或SEQ ID NO:5)的变体，其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代，其中所述取代的氨基酸残基可以是由遗传密码编码的氨基酸残基或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)包含一个或多个氨基酸的插入或缺失并且具有与c-MAF蛋白相同的功能(即，作用为结合DNA的转录因子)的变体。c-MAF蛋白的变体可以使用下述方法鉴定：如国际专利申请WO2005/046731(通过引用完全结合于此)所示的基于c-MAF促进体外细胞增殖的能力的方法、如WO2008098351(通过引用完全结合于此)所述的基于所谓的抑制剂在表达c-MAF的细胞中阻断受体基因在细胞周期蛋白D2启动子的控制下或在包含c-MAF反应区的启动子(MARE或c-MAF反应元件)的控制下的转录能力的能力的方法、或如US2009048117A(通过引用完全结合于此)所述的基于所谓的抑制剂在表达NFATc2和c-MAF的细胞中阻断响应PMA/离子霉素刺激在IL-4启动子控制下的受体基因表达的能力的方法。
本发明所述的变体优选与任一种c-MAF蛋白异构体的氨基酸序列(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％，至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列相似性。变体与之前定义的特定c-MAF蛋白序列之间的相似性程度使用本领域技术人员广泛知晓的算法和计算机方法来确定。两种氨基酸序列之间的相似性优选使用BLASTP算法[BLAST Manual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.，等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]来确定。
当用于本文时，“用于避免或预防骨重建的药剂”是指能够通过刺激成骨细胞增殖或抑制破骨细胞增殖或固定骨结构而预防、抑制、治疗、减少或阻止骨退化的任意分子。用于避免或预防骨重建的药剂包括用于避免或预防骨退化的药剂，并且包括用于避免或预防骨合成的药剂。
当用于本文时，“c-MAF抑制性药剂”是指能够通过防止所述基因的表达产物产生(中断c-MAF基因转录和/或阻断来自c-MAF基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制c-MAF蛋白活性这两种方法而完全或部分抑制c-MAF基因表达的任意分子。C-MAF基因抑制剂能够利用下述方法鉴定：如国际专利申请WO2005/046731(其完整内容通过引用结合于此)所示的基于所谓的抑制剂阻断c-MAF促进体外细胞增殖的能力的能力的方法，如WO2008098351(其完整内容通过引用结合于此)所述的基于所谓的抑制剂在表达c-MAF的细胞中阻断受体基因在细胞周期蛋白D2启动子的控制下或在包含c-MAF反应区的启动子(MARE或c-MAF反应元件)的控制下的转录能力的能力的方法，或如US2009048117A(其完整内容通过引用结合于此)所述的基于所谓的抑制剂在表达NFATc2和c-MAF的细胞中阻断响应PMA/离子霉素刺激在IL-4启动子控制下的受体基因表达的能力的方法。
当用于本文时，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)或“mTor”是指响应EC 2.7.11.1的那些蛋白。mTor酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并且调节细胞增殖、细胞运动性、细胞生长、细胞存活和转录。
当用于本文时，“mTor抑制剂”是指能够通过防止所述基因的表达产物产生(中断mTor基因转录和/或阻断来自mTor基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制mTor蛋白活性这两种方法而完全或部分抑制mTor基因表达的任意分子。包括具有双重或更多的靶标且其中具有mTor蛋白活性的抑制剂。
当用于本文时，“Src”是指对应于EC 2.7.10.2的那些蛋白。Src是一种非受体酪氨酸激酶和一种原癌基因。Src可能在细胞生长和胚胎发育中起作用。
当用于本文时，“Src抑制剂”是指能够通过防止所述基因的表达产物产生(中断Src基因转录和/或阻断来自Src基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制Src蛋白活性这两种方法而完全或部分抑制Src基因表达的任意分子。
当用于本文时，“前列腺素内过氧化物合酶2”、“环加氧酶2”或“COX-2”是指对应于EC 1.14.99.1的那些蛋白。COX-2负责将花生四烯酸转化为前列腺素内过氧化物H2。
当用于本文时，“COX-2抑制剂”是指能够通过防止所述基因的表达产物产生(中断COX-2基因转录和/或阻断来自COX-2基因表达的mRNA的翻译)和通过直接抑制COX-2蛋白活性这两种方法而完全或部分抑制COX-2基因表达的任意分子。
当用于本文时，“结果”或“临床结果”是指所导致的疾病病程和/或疾病进展，并且，例如，可以通过再发生、复发、转移、到转移的时间时期、转移的数量、转移部位的数量和/或由疾病导致的死亡来表征。例如，好的临床结果包括治愈、防止再发生、防止转移和/或在固定的时间时期内的生存期(没有再发生)，并且差的临床结果包括疾病进展、转移和/或在固定的时间时期内的死亡。
当用于本文时，“无侵袭性疾病生存期”或“IDFS”是指在癌症中，在初步癌症治疗结束后患者在没有侵袭与原始原发性肿瘤相同的乳房实质或其他组织的任意癌症迹象或症状下生存的时间长度。在一些实施方案中，IDFS包括：同侧侵袭性乳腺瘤再发生，局部或区域性侵袭性乳腺癌再发生，转移或远端再发生、归因于任意原因(包括乳腺癌)的死亡、对侧侵袭性乳腺癌和第二原发性侵袭性癌(非乳腺癌，但是排除基底细胞或鳞状皮肤癌)。参见Coleman等人，Lancet Oncol 2014；15:997-1006。
在本发明中，“患有乳腺癌的受试者中的转移的诊断”理解为通过研究其迹象，即，在本发明的情形中，通过相对于对照样品，在乳腺癌肿瘤组织中升高的c-MAF基因表达水平(即，过表达)，而鉴定疾病(转移)。
在本发明中，“预测患有乳腺癌的受试者中发展转移的趋势”理解为基于所述迹象知晓所述受试者所患有的乳腺癌在将来是否会转移。在本发明的上下文中，所述迹象是肿瘤组织中c-MAF基因的过表达。
在本发明的上下文中，应该理解，当受试者所患有的乳腺癌已经转移到身体的其他器官，在具体的实施方案中，转移到骨时，“所述受试者具有转移阳性诊断”。该术语类似地用于再发生和复发。
本领域技术人员应该理解，对原发瘤转移、复发或再发生的趋势的预测不旨在对所有待鉴定的受试者(即，对于100％的受试者)都是正确的。然而，该术语要求能够鉴定统计学显著部分的受试者(例如，组群研究中的某个组群)。本领域技术人员利用各种公知的统计学评价工具，例如确定置信区间、确定p值、斯氏T检验、Mann-Whitney检验等，能够以简单的方式确定某部分是否是统计学显著的。详情提供在Dowdy和Wearden，Statistics forResearch，John Wiley and Sons，New York 1983中。优选的置信区间为至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1，0.05，0.01，0.005或0.0001。更优选地，通过本发明的方法可以适当地鉴定群体中至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的受试者。
当用于本文时，“差的预后”表示预测受试者，例如，预测其在设定的时间期间不能存活和/或具有再发生、复发或远端转移或具有再发生、复发或远端转移的高风险。术语“高”是一个相对的术语，并且在本申请的情形中，是指相对于临床结果(再发生、远端转移等)“高”表达组的风险。对于异质癌症患者人群，“高”风险可以认为是比平均风险高的风险。在Paik等人(2004)的研究中，认为整体上“高”的再发生风险是高于15％。该风险也作为时间期间的函数而不同。时间期间可以是，例如，初始癌症诊断或作出预测后的五年、十年、十五年或甚至是二十年。
“参比值”用在本文中是指用于与对患者或从所述患者采集的样品进行实验室检验得到的值/数据参比的实验室值。参比值或参比水平可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的值；值的范围；平均值(an average value)；中位值，平均数值(a mean value)或与特定对照或基线值比较的值。参比值可以基于个体样品值，诸如，例如，从来自检测的受试者的样品但是在较早的时间点得到的值。参比值可以基于大量样品，诸如来自实足年龄相匹配的组的受试者的群体的样品，或基于包括或排除待测样品的样品集合。
术语“治疗”用在本文中是指任意类型的疗法，所述疗法的目的在于终止、防止、改善或降低对本文所述的临床病状的易感性。在一个实施方案中，术语治疗涉及对本文定义的病症或病状的预防性治疗(即，降低对临床病状的易感性)。因此，“治疗”及其等价的术语是指得到需要的药理学效果或生理学效果，涵盖对哺乳动物(包括人)中的病理学病状或病症的任何治疗。就完全或部分预防病症或其症状而言，效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈病症和/或归因于所述病症的副作用而言，可以是治疗性的。即，“治疗”包括：(1)在受试者中预防病症发生或再发生，(2)抑制病症，如阻止其发展，(3)终止或终断病症或至少与其相关的症状，从而使得宿主不再患有所述病症或其症状，诸如使所述病症或其症状消退，例如，通过恢复或修复失去的、缺少的或缺陷的功能，或刺激无效的过程，或者(4)减轻、缓和或改善病症或与病症相关的症状，其中改善以广泛意义使用，至少表示参数量级的减少，所述参数诸如炎症、疼痛或免疫缺陷。
当用于本文时，“样品”或“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。生物样品可以包含适于确定c-MAF基因表达水平的任意生物材料。样品可以从任何适宜的生物组织或流体分离，诸如，例如，从肿瘤组织、血液、血浆、血清、尿或脑脊液(CSF)分离。
当用于本文时，术语基因的“表达水平”用在本文中是指在受试者的样品中由所述基因产生的基因产物的可测量的量，其中所述基因产物可以是转录产物或翻译产物。因此，表示水平可以涉及核酸基因产物，如mRNA或cDNA，或多肽基因产物。表达水平源自受试者的样品和/或一种或多种参比样品，并且，例如，可以被从头(de novo)检测或对应于之前的确定。表达水平可以例如使用本领域技术人员已知的微阵列法、PCR法(诸如qPCR)和/或基于抗体的方法进行确定或测量。
“升高的表达水平”理解为其所指的表达水平为比参比样品或对照样品中的那些水平高的c-MAF基因水平。在不排除其他机制的条件下，这些升高的水平可以由基因或16q23或16q22-24染色体基因座扩增、拷贝增加或易位而引起。具体地，当从患者分离的样品中的表达水平相对于参比或对照是至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更多时，可以认为所述样品具有高c-MAF表达水平。在多个实施方案中，“升高的表达水平”是“高”表达水平。“没有升高”或“未升高”的表达水平是不包括在“升高的”表达水平定义内的任意值，包括等于参比水平或对照水平的值或相较于参比或对照水平降低的表达水平。
“降低的表达水平”理解为其所指的c-MAF基因水平小于参比样品或对照样品中的水平的表达水平。在不排除其他机制的条件下，该降低的水平可以由基因或16q23或16q22-24染色体基因座缺失引起。具体地，当从患者分离的样品中的表达水平相对于参比或对照为至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或甚至更少时，可以认为所述样品具有降低的c-MAF表达水平。在多个实施方案中，“降低的表达水平”是“低”表达水平。
当用于本文时，术语“基因拷贝数”是指细胞中核酸分子的拷贝数。基因拷贝数包括细胞中基因组(染色体)DNA的基因拷贝数。在正常的细胞(非肿瘤细胞)中，基因拷贝数通常是两个拷贝(在染色体对的每个成员中有一个拷贝)。基因拷贝数有时包括取自细胞群体样品的基因拷贝数的一半。
在本发明中，“升高的基因拷贝数”理解为大于参比样品或对照样品所具有的拷贝数的c-MAF基因拷贝数。在不排除其他机制的条件下，这些升高的基因拷贝数可以由基因或16q23或16q22-24染色体基因座扩增、拷贝增加或易位引起。具体而言，当拷贝数大于2个拷贝，例如，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝，甚至大于10个拷贝的c-MAF基因时，可以认为样品具有升高的c-MAF拷贝数。在多个实施方案中，基于计数的每个细胞的平均拷贝，确定“升高的基因拷贝数”。在多个实施方案中，当计数的每个细胞的平均拷贝数大于2个拷贝，例如，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝，甚至大于10个拷贝的c-MAF基因时，可以认为样品具有升高的c-MAF拷贝数。
在本发明中，“减少的基因拷贝数”理解为c-MAF基因拷贝数小于参比样品或对照样品所具有的拷贝数。在不排除其他机制的条件下，这些减少的基因拷贝数可以由基因或16q23或16q22-24染色体基因座缺失引起。具体而言，当拷贝数小于2个拷贝的c-MAF基因时，可以认为样品具有减少的c-MAF拷贝数。
在本发明中，“没有升高的基因拷贝数”理解为c-MAF基因拷贝数或平均c-MAF基因拷贝数小于参比样品或升高阳性的样品所具有的拷贝数。在不排除其他机制的条件下，没有升高的基因拷贝数由在基因或16q23或16q22-24染色体基因座扩增、拷贝增加或易位中没有增加引起。具体而言，当拷贝数小于2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9拷贝的c-MAF基因时，可以认为样品不具有升高的c-MAF拷贝数或c-MAF平均拷贝数。
术语“基因扩增”在本文中理解为在个体细胞或细胞系中形成基因的多个拷贝或基因片段的多个拷贝的过程。基因的拷贝不需要位于同一个染色体上。复制的区域通常称为“扩增子”。通常，产生的mRNA的量，即基因表达水平，还与特定基因的拷贝数成比例增加。
术语“增加(gain)”是指相较于正常的任何染色体拷贝数增加，即，在二倍体生物体中，细胞内某个基因有3个拷贝将是增加。在一些实施方案中，“增加”包括术语“拷贝增加”，并且与“拷贝数”同义使用。
“探针”用在本文中是指与目的特定核酸序列互补的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，探针可以特异性针对已经进行易位的染色体区域。在一些实施方案中，探针具有特定的标记或标签。在一些实施方案中，标签是荧光团。在一些实施方案中，探针是DNA原位杂交探针，其标记是基于铂与核酸和蛋白的稳定配位结合。在一些实施方案中，探针记载在美国专利号9,127,302和9,134,237中，所述专利通过引用完全结合在本文中，或者如Swennenhuis等人，“Construction of repeat-free fluorescence in situhybridization probes”Nucleic Acids Research40(3):e20(2012)中所述。
“标签”或“标记”用在本文中是指直接或间接与探针连接的任何物理分子，其允许所述探针或所探测的位置被显现、被标记或另外被捕获。
“易位”用在本文中是指染色体之间染色体物质不等量或等量的交换。在一些情形中，易位是在同一个染色体上。在一些情形中，易位是在不同的染色体之间。在多种类型的癌症中，包括乳腺癌和白血病，易位以高频率发生。易位可以是初次相互易位或更复杂的二次易位(secondary translocation)。存在一些涉及免疫球蛋白重链(IgH)基因座的初次易位，认为这样的初次易位组成多种癌症中的起始事件。(Eychène，A.，Rocques，N.，andPuoponnot，C.，A new MAFia in cancer.2008.Nature Reviews:Cancer.8:683-693.)
“多倍体”或“多倍性”用在本文中表示细胞包含多于两个拷贝的目的基因。在一些情形中，所述目的基因是MAF。在一些实施方案中，多倍性与目的基因表达的累积相关。在一些实施方案中，多倍性与基因组不稳定性相关。在一些实施方案中，基因组不稳定性可以导致染色体易位。
“全基因组测序”用在本文中是单次对生物体的完整基因组测序的过程。参见，例如，Ng.，P.C.和Kirkness，E.F.，Whole Genome Sequencing.2010.Methods in MolecularBiology.628:215-226。
“外显子组测序”用在本文中是对生物体DNA的完整编码区测序的过程。在外显子组测序时，mRNA被测序。基因组的不翻译区不包括在外显子组测序中。参见，例如，Choi，M.等人，Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNAsequencing.2009.PNAS.106(45):19096-19101。
当用于本文时，“结合成员”表示彼此结合的一对分子中的一个成员。结合对的各个成员可以是天然来源的或完全或部分合成产生的。一对分子中的一个成员在其表面上具有结合并且因此互补于该对分子中另一个成员的特定空间和极性结构的区域或洞穴。结合对类型的实例是抗原-抗体、受体-配体和酶-底物。在一些实施方案中，结合成员是抗体。在一些实施方案中，结合成员是与c-MAF抗原结合的抗体。
当用于本文时，“CDR区”或“CDR”旨在表示免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.USDepartment of Health and Human Services，Public Service，NIH，Washington中所定义。抗体通常包含3个重链CDR，称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，和3个轻链CDR，称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。术语CDR或CDRs用在本文中是用来表示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，其包含负责抗体以亲和力结合其所识别的抗原或表位的大部分氨基酸残基。在这六个CDR序列中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有最大尺度的可变性，即，较大的多样性，主要是由于本领域中已知为种系免疫球蛋白重链基因座的V、D和J基因区段的V(D)J重排的机制导致。HCDR3可以短至两个氨基酸或长至26个氨基酸，或可以具有在这两个端点值之间的任意长度。CDR长度也可以依据可以被特定基础构架容纳的长度而变化。在功能上，HCDR3可以在确定抗体的特异性方面起重要作用(Segal等人，(1974)Proc Natl Acad SciUSA.71(11):4298-302；Amit等人，(1986)Science 233(4765):747-53；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196(4):901-17；Chothia等人，(1989)Nature 342(6252):877-83；Caton等人，(1990)J.Immunol.144(5):1965-8；Sharon(1990a)PNAS USA.87(12):4814-7，Sharon(1990b)J.Immunol.144:4863-4869，Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版.US Department of Health and Human Services，Public Service，NIH，Washington)。
当用于本文时，“抗体”、“抗体分子”或“多种抗体”描述天然的、或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖包含抗体抗原结合位点的任意多肽或蛋白。此处必须理解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说，所述抗体不在其天然环境中，而是其已经能够通过纯化从天然来源分离或获得，或者另外通过遗传重组获得，或者通过化学合成获得，则其可以包含非天然按时。包含抗体抗原结合位点的抗体片段包括，但不限于，下述分子，诸如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fab’-SH，scFv，Fv，dAb和Fd。已经改造了包含一个或多个抗体抗原结合位点的多种其他的抗体分子，包括，例如，Fab2，Fab3，双链抗体，三链抗体，四链抗体，骆驼科抗体(camelbodies)，纳米抗体和微小抗体(minibodies)。抗体分子及其构建方法和用途记载在Hollinger&Hudson(2005)Nature Biot.23(9):1126-1136中。
当用于本文时，“抗体分子”应该解释为涵盖具有抗体抗原结合位点(具有需要的针对抗原的特异性和/或结合)的任意结合成员或物质。因此，该术语涵盖功能性抗体片段和衍生物，包括包含抗体抗原结合位点的任意多肽，不管其是天然的还是完全或部分合成的。因此包括融合到另一个多肽(例如，源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类)上的抗体抗原结合位点或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达，例如，记载在EP0120694A(Boss等人)和EP0125023A(Cabilly等人)中，它们完全结合在本文中。
当用于本文时，例如，本发明的结合成员的“功能性片段或变体”意指保留完整结合成员的至少一些功能(例如，特异性结合抗原如Maf的能力)的结合成员的片段或变体。
“肿瘤组织样品”理解为来源于乳腺癌肿瘤的组织样品，包括但不限于循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA。所述样品可以通过常规方法获得，例如，组织活检，使用相关医学技术专业人员公知的方法获得。
“溶骨性骨转移”是指这样的一种转移类型，其中由肿瘤细胞刺激破骨细胞活性导致在转移的附近处产生骨质吸收(进行性骨密度损失)，并且特征在于严重的疼痛、病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫和由神经压迫导致的其他综合征。
对患有乳腺肿瘤的患者设计个体化的本发明疗法的方法
本发明涉及鉴别得益于用特定药剂和/或疗法治疗的患有乳腺癌的受试者。在一些实施方案中，本发明涉及鉴别不能得益于用特定药剂和疗法治疗的患有乳腺癌的受试者。在一些实施方案中，所述受试者具有c-MAF的高表达水平、拷贝数、扩增、增加和/或易位。在某些实施方案中，所述受试者具有c-MAF的低表达水平、拷贝数、扩增、增加和/或易位。在具体的实施方案中，癌症是三重阴性乳腺癌。在另一些实施方案中，癌症是ER+乳腺癌。在其他实施方案中，癌症是ER-乳腺癌。在另一些实施方案中，癌症是HER2+乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是基底样乳腺癌。在一个实施方案中，受试者是绝经后的。在一个实施方案中，受试者是未到绝经后的。如美国申请号14/391,085、美国临时申请号61/801,769、美国临时申请号14/776,390、美国申请号14/776,412、美国申请号14/405,724、美国申请号14/050,262、美国申请号14/435,128、美国申请号15/027,946、美国申请号15/014,916和美国申请号14/776,453所述(通过引用这些分别完全结合在本文中)，c-MAF的水平可以用于诊断转移、复发或再发生，或用于预测肿瘤进行转移、复发或再发生的趋势。因此，如在本发明中所述，考虑到乳腺癌细胞中的c-MAF基因过表达与转移、复发或再发生的存在相关，c-MAF基因的表达水平允许对患有所述癌症的受试者做出最适合的疗法的决定。在一个实施方案中，本发明包括仅定量作为单一标记的c-MAF基因表达水平，即，所述方法不包括确定任意另外的标记的表达水平。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及为患有乳腺癌的受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：a)定量所述受试者的肿瘤样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，和b)将所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与对照样品中所述基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加相比较，其中基于所述受试者中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加确定疗法。在一些实施方案中，所述受试者具有高c-MAF基因表达水平。在另一些实施方案中，所述受试者具有低c-MAF基因表达水平。在某些实施方案中，对受试者施用避免和/或防止骨重建的药剂，包括避免或防止骨退化的药剂。在多个实施方案中，对受试者施用治疗癌症的药剂。在其他实施方案中，对受试者施用c-MAF抑制性药剂。在具体的实施方案中，避免和/或防止骨重建的药剂或c-MAF抑制性药剂是美国公开号2014/0057796和2015/0293100以及美国申请号15/027,946中公开的任意药剂，所述公开或申请通过引用完全结合在本文中。
在一个实施方案中，本发明涉及对患有乳腺癌的受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者的样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值进行比较，其中，如果相对于所述参比值，所述表达水平、拷贝数、扩增或增加没有升高，则所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建或改善无病生存期或整体生存期的疗法。在一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是绝经后的。在一个实施方案中，对受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建的药剂。在多个实施方案中，对受试者施用改善无病生存期或整体生存期的药剂。在其他实施方案中，对受试者施用c-MAF抑制剂药剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及对患有乳腺癌的未到绝经后的受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者的样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值进行比较，其中，如果相对于所述参比值，所述表达水平、拷贝数、扩增或增加升高，则所述受试者不适于接受旨在预防和/或治疗骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的疗法。在一些实施方案中，不对受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的药剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及为患有乳腺癌的绝经后受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者的样品中c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值进行比较，气质，如果相对于所述参比值，所述表达水平、拷贝数、扩增或增加升高，则所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的疗法。在一些实施方案中，对受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建的药剂和/或改善无病生存期或整体生存期的疗法。
在另一个实施方案中，本发明涉及为患有乳腺癌的绝经后受试者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者的样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在i)中得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值进行比较，其中，如果相对于所述参比值，所述表达水平、拷贝数、扩增或增加没有升高，则所述受试者不适于接受旨在预防和/或治疗骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的疗法。在一些实施方案中，不对受试者施用旨在预防和/或治疗骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的药剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗患有乳腺癌且与对照样品相比在转移瘤样品中c-MAF表达水平降低的受试者中的骨转移的方法，所述方法包括施用能够预防或抑制骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的药剂，其中能够避免或预防骨重建或改善无病生存期或整体生存期的药剂选自由下述组成的组：双膦酸盐，RANKL抑制剂，PTH，PTHLH抑制剂(包括中和抗体和肽)，PRG类似物，雷尼酸锶，DKK-1抑制剂，双重MET和VEGFR2抑制剂，雌激素受体调节剂，EGFR抑制剂，降钙素，镭-223，CCR5拮抗剂，Src激酶抑制剂，COX-2抑制剂，mTor抑制剂，和组织蛋白酶K抑制剂。在一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是绝经后的。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患有乳腺癌且相对于对照样品在转移瘤样品中的c-MAF水平升高的绝经后受试者中的骨转移的方法，所述方法包括施用能够预防或抑制骨重建的药剂和/或改善无病生存期或整体生存期的药剂，其中能够避免或预防骨重建和/或改善无病生存期或整体生存期的药剂选自由下述组成的组：双膦酸盐，RANKL抑制剂，PTH，PTHLH抑制剂(包括中和抗体和肽)，PRG类似物，雷尼酸锶，DKK-1抑制剂，双重MET和VEGFR2抑制剂，雌激素受体调节剂，EGFR抑制剂，降钙素，镭-223，CCR5拮抗剂，Src激酶抑制剂，COX-2抑制剂，mTor抑制剂，和组织蛋白酶K抑制剂。
在某些实施方案中，对受试者施用避免和/或预防骨重建的药剂，包括避免或预防骨退化的药剂。在多个实施方案中，对受试者施用避免或预防骨退化的药剂。
当已经测量样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加并且已经将其与对照样品相比较时，所述基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加与受试者的绝经期状态联合表示所述受试者是否适于接受旨在预防(如果所述受试者尚未经历转移)和/或治疗转移(如果所述受试者已经经历了转移)、复发或再发生的疗法和/或旨在避免或预防骨重建的疗法或药剂。
在一些实施方案中，认为利用FISH测量的大于等于(≥)2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0的每个细胞的MAF拷贝数或MAF的平均拷贝数是高值。在多个实施方案中，MAF FISH值大于等于(≥)2.2。在某些实施方案中，MAF FISH值大于等于(≥)2.3。在另一些实施方案中，MAF FISH值大于等于(≥)2.4。在其他实施方案中，MAF FISH值大于等于(≥)2.5。在另一些实施方案中，使用FISH测量的c-MAF的拷贝数小于(<)2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9个c-MAF基因拷贝。
在具体的实施方案中，受试者具有转移或进行转移的预测。在一些实施方案中，转移是骨转移。在另一个实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
在一些实施方案中，所述方法在第一步中包括定量患有乳腺癌的受试者中的肿瘤样品中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、增加或扩增。
在一些实施方案中，所述样品是受试者的原发肿瘤组织样品。在第二步中，将在受试者的肿瘤样品中得到的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加与对照样品中所述基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加相比较。c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的确定必须与对照样品或参比样品的值相关。取决于待分析的肿瘤的类型，对照样品的确切性质可能不同。因此，在一些实施方案中，参比样品是患有尚未转移、复发或再发生的乳腺癌或患有对应于在患有没有转移、复发或再发生的乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的中位值的乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。
在一个实施方案中，本发明的方法在第二步中包括将在来自受试者的肿瘤样品(包括，但不限于，原发肿瘤组织活检物、循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA)中得到的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加与对照样品中所述基因的表达水平相比较。
c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的确定必须与对照样品或参比样品的值相关。取决于待分析的肿瘤的类型，对照样品的确切性质可能不同。因此，当要评价诊断时，则所述参比样品是来自患有尚未转移的乳腺癌或患有对应于在患有没有转移的乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因表达水平的中位值的乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。
所述参比样品通常通过组合来自受试者群体的等量多份样品而得到。通常，典型的参比样品从临床上有完善记录并且充分表征不存在转移的受试者获得。在此类样品中，可以确定生物标记(c-MAF基因)的正常浓度(参比浓度)，例如，通过提供参比人群的平均浓度而确定。当确定标记的参比浓度时，要考虑多个考虑因素。此类考虑因素特别为患者的年龄、体重、性别、一般身体状况等。例如，按照前述考虑因素(例如，按照不同的年龄组别)分类的至少约2名、至少约10名、至少约20名、至少约25名、至少约50名、至少约75名、至少约100名、至少约250名、至少约500名至超过1000名受试者的组的同等量被视为参比组。参比水平所来源的样品集合优选地由患有与研究的患者对象相同类型的癌症(例如，乳腺癌)的受试者形成。类似地，利用接受操作曲线(receiving operating curve，ROC)并且对所有敏感性和特异性对测量曲线下面积从而确定哪一对提供最佳值和相应的参比值是什么，可以确定患者组群内的参比值。ROC是标准统计学概念。记载可见于Stuart G.Baker“TheCentral Role of Receiver Operating Characteristic(ROC)curves in EvaluatingTests for the Early Detection of Cancer”Journal of The National CancerInstitute(2003)Vol 95，No.7，511-515。
一旦已经确定该中位值或参比值，可以将该标记在来自患者的肿瘤组织中表达的水平与该中位值进行比较，由此例如可以分配为“升高的”表达水平。由于受试者之间的差异性(例如，涉及年龄、种族等多个方面)，很难(如果不是很难，也是事实上不可能地)确定c-MAF表达的绝对参比值。因此，在具体的实施方案中，通过常规方式计算百分位数来确定关于c-MAF表达的“升高的”或“降低的”表达的参比值，所述常规方式包括通过上述方法中的任一种在分离自其疾病得到充分记录的受试者的一种或几种样品中进行c-MAF表达水平的测定。然后，“降低的”c-MAF水平可以优选地分配到这样的样品：其中c-MAF表达水平等于或低于正常人群中的50％，包括，例如，等于或低于正常人群中的60％、等于或低于正常人群中的70％、等于或低于正常人群中的80％、等于或低于正常人群中的90％以及等于或低于正常人群中的95％的表达水平。然后，“升高的”c-MAF基因表达水平可以优选地分配到这样的样品：其中所述c-MAF基因表达水平等于或大于正常人群中的50％，包括，例如，等于或大于正常人群中的60％、等于或大于正常人群中的70％、等于或大于正常人群中的80％、等于或大于正常人群中的90％以及等于或大于正常人群中的95％的表达水平。
在一个具体的实施方案中，c-MAF基因的扩增或增加程度可以通过确定含有所述基因的染色体区的扩增或增加而确定。优选地，其扩增或增加指示存在c-MAF基因的扩增或增加的染色体区为包括c-MAF基因的基因座16q22-q24。所述基因座16q22-q24位于16号染色体上，在所述染色体的长臂上，并且在区带(band)22至区带24的范围内。该区域在NCBI数据库中对应毗连群NT_010498.15和NT_010542.15。在另一个优选的实施方案中，c-MAF基因扩增或增加的程度可以通过使用特异性针对所述基因的探针来确定。
在一些实施方案中，扩增或增加是在16q23基因座处的区域内。在一些实施方案中，扩增或增加是在Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp(从着丝粒到端粒)的染色体区域的任意部分中。在一些实施方案中，扩增或增加是在Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp的基因组区域内，但是排除DNA重复元件。在一些实施方案中，使用特异性针对所述区域的探针测量扩增或增加。
在一个实施方案中，当c-MAF基因拷贝数高于参比样品或对照样品所具有的拷贝数时，c-MAF基因相对于参比基因拷贝数是扩增的。在一个实施方案中，如果相对于对照样品，测试样品中c-MAF基因的基因组拷贝数或平均基因组拷贝数增加至少约2倍(即，6个拷贝)、3倍(即，8个拷贝)、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍，则认为c-MAF基因得到“扩增”。在另一个实施方案中，如果每个细胞c-MAF基因的基因组拷贝数或平均基因组拷贝数为至少约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个等，则认为c-MAF基因得到“扩增”。
在一些实施方案中，当测量拷贝数时，对照样品是指尚未经历转移的患有乳腺癌的受试者或对应于在没有转移的患有乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因拷贝数的中位值的患有乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。所述参照样品通常通过将等量的来自受试者群体的样品组合而得到。如果相对于对照样品中所述基因的拷贝数，c-MAF基因拷贝数增加，那么受试者具有阳性转移诊断或更大的发展转移的趋势。在另一个实施方案中，参比基因拷贝数是来自尚未经历骨转移的受试者的乳腺癌样品中该基因的拷贝数。
在另一个实施方案中，扩增或增加通过原位杂交或PCR的方式确定。
在另一个实施方案中且如本发明所述，假定chr16q22-24，包括c-MAF基因，在乳腺癌细胞中扩增，与转移的存在、复发或再发生相关，则chr16q22-24，包括c-MAF基因的扩增或增加允许就对患有所述癌症的受试者的最适疗法做出决定。
c-MAF基因扩增的确定需要与对照样品或参比样品的值相关，所述对照样品或参比样品的值对应于在没有经历转移的患有乳腺癌的受试者或对应于在没有转移的患有乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因扩增的中位值的患有乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品中测量的c-MAF基因扩增水平。所述参比样品通常通过将等量的来自受试者群体的样品组合而得到。
通常，典型的参比样品从在临床上有充分记录并且充分表征了不存在转移的受试者获得。参比水平所源于的样品集合优选由作为研究的患者对象的患有相同类型癌症的受试者组成。一旦已确定中位值，则患者肿瘤组织中c-MAF的扩增水平可以与该中位值进行比较，并且因此，如果存在扩增，则该受试者具有阳性转移诊断或更大的发展转移的趋势。
在另一方面，本发明涉及用于为患有乳腺癌的患者设计个体化疗法的体外方法，所述方法包括确定所述受试者的样品中c-MAF基因是否易位。
在一些实施方案中，所易位的基因来自16q23基因座的区域。在一些实施方案中，所易位的基因来自Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp(从着丝粒到端粒)的染色体区域的任意部分。在一些实施方案中，所易位的基因来自Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp的基因组区域，但是排除DNA重复元件。在一些实施方案中，使用特异性针对所述区域的探针测量易位。
在一个具体的实施方案中，c-MAF基因的易位可以通过确定包含所述基因的染色体区域的易位而确定。在一个实施方案中，易位是t(14,16)易位。在另一个实施方案中，易位的染色体区域来自基因座16q22-q24。基因座16q22-q24位于16号染色体中，在所述染色体的长臂中并且在分带22至分带24的范围内。该区域对应NCBI数据库中的contigs NT_010498.15和NT_010542.15。在一个实施方案中，c-MAF基因易位到基因座14q32的14号染色体，导致易位t(14,16)(q32,q23)。该易位使MAF基因挨着IgH基因座中的强增强子，在一些情形中，这导致MAF的过表达。(Eychène，A.，Rocques，N.，和Puoponnot，C.，A new MAFia incancer.2008.Nature Reviews:Cancer.8:683-693.)
在一个实施方案中，c-MAF基因的易位可以通过使用特异性针对所述易位的探针确定。
本发明的一个实施方案包括其中第一步是确定受试者的样品中c-MAF基因是否易位的方法。在一个实施方案中，所述样品是肿瘤组织样品。
在一个具体的实施方案中，本发明预测患有乳腺癌的患者发展骨转移的趋势的方法包括确定c-MAF基因易位的所述受试者样品中c-MAF基因的拷贝数，并且将所述拷贝数与对照样品或参比样品的拷贝数比较，其中，如果c-MAF拷贝数大于对照样品的c-MAF拷贝数，则所述受试者具有更大的发展骨转移的趋势。
在一些实施方案中，在确定c-MAF基因易位后，确定c-MAF基因的增加和拷贝数。在一些实施方案中，使用探针来确定细胞对于c-MAF基因是否是多倍体的。在一些实施方案中，多倍体性的确定通过确定是否存在多于2种来自目的基因的信号而进行。在一些实施方案中，多倍体性通过测量来自特异性针对目的基因的探针的信号并将其与着丝粒探针或其他探针比较而确定。
使用c-MAF预测生存期(包括IDFS)的方法
本发明涉及预测患有乳腺癌的受试者的IDFS。在某些实施方案中，受试者具有高的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加。在另一些实施方案中，受试者具有低的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增或增加。在一些实施方案中，癌症是三重阴性乳腺癌。在另一些实施方案中，癌症是ER+乳腺癌。在其他实施方案中，癌症是ER-乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是基底样乳腺癌。在其他实施方案中，癌症是HER2+乳腺癌。在一些实施方案中，受试者是绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。
在一些实施方案中，本发明涉及用于预测患有乳腺癌的患者的IDFS的体外方法，所述方法包括：i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和ii)将在步骤i)中得到的所述表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中，相对于所述参比值升高的所述基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加指示差的IDFS预后。
在一个实施方案中，本发明涉及用于预测患有乳腺癌的患者的IDFS的体外方法，所述方法包括相对于参比确定所述受试者样品中c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，其中相对于所述参比，c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高指示差的IDFS预后。
在其他实施方案中，本发明涉及用于预测患有乳腺癌的患者的IDFS(排除骨再发生)的体外方法，所述方法包括相对于参比确定所述受试者的样品中c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加，其中相对所述参比c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高指示差的排除骨再发生的IDFS预后。
在一些实施方案中，认为使用FISH测量的大于等于2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0的MAF拷贝数或每个细胞的MAF平均拷贝数是高值。在某些实施方案中，MAF FISH值大于等于2.2。在另一些实施方案中，MAF FISH值大于等于2.3。在其他实施方案中，MAF FISH值大于等于2.4。在其他实施方案中，MAF FISH值大于等于2.5。
在一些实施方案中，受试者的c-MAF状态预测所述受试者的整体生存期或无病生存期的持续时间。在某些实施方案中，在本发明实施方案中的任一个中，c-MAF状态包括16q23或16q22-24染色体基因座扩增、其拷贝增加或易位或缺乏、或16q23或16q22-24染色体基因座缺失。在具体的实施方案中，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者具有的无病生存期短于相对于参比没有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者。在多个实施方案中，与相对于参比没有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的无病生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者的无病生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。在某些实施方案中，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者具有的整体生存期短于相对于参比没有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者。在多个实施方案中，与相对于参比没有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的无病生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者的整体生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。在多个实施方案中，受试者是绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在一些实施方案中，受试者是绝经前的。
在多个实施方案中，在用骨改良剂(bone modifying agent)和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的无病生存期长于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者的无病生存期。在多个实施方案中，与相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的无病生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有升高的受试者在用唑来膦酸治疗后的无病生存期长至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多。在多个实施方案中，在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的整体生存期长于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者的整体生存期。在多个实施方案中，与相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用唑来膦酸治疗后的整体生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有升高的受试者在用唑来膦酸治疗后的身体生存期长至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多。在多个实施方案中，受试者是绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在一些实施方案中，受试者是绝经前的。
在多个实施方案中，在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的无病生存期短于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有升高的受试者的无病生存期。在多个实施方案中，与相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的无病生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的无病生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。在多个实施方案中，在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的整体生存期短于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有升高的受试者的整体生存期。在多个实施方案中，与相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后的整体生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后的身体生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。在多个实施方案中，受试者是绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在一些实施方案中，受试者是绝经前的。
在多个实施方案中，在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的未到绝经后的受试者的无病生存期短于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有升高的受试者的无病生存期。在多个实施方案中，与相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的无病生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的未到绝经后的受试在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后的无病生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。
在多个实施方案中，在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即，唑来膦酸)治疗后，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者的整体生存期短于相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中不具有增加的受试者的无病生存期。在多个实施方案中，与相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的整体生存期相比，相对于参比在她们的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加中具有升高的受试者在用骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂(即唑来膦酸)治疗后的整体生存期少至少约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、18个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多。在多个实施方案中，受试者是绝经后的。在另一些实施方案中，受试者是未到绝经后的。在一些实施方案中，受试者是绝经前的。
在多个实施方案中，MAF对受试者的OS或DFS的预测力是基于受试者的绝经状态。在一些实施方案中，在绝经后、未知的和围绝经期受试者中，MAF预测有更短的DFS或最坏的OS的风险。在另一些实施方案中，在绝经前受试者中，MAF阳性受试者是具有较少风险的那些，并且更可能具有更长的DFS和更好的OS。
在多个实施方案中，受试者的MAF状态预测受试者应该接受的治疗。在多个实施方案中，在本文实施方案中任一个中的c-MAF状态包括16q23或16q22-24染色体基因座扩增、其拷贝增加或易位或缺乏、或16q23或16q22-24染色体基因座缺失。在多个实施方案中，可以对相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的绝经后患者(并且因此有差的DFS或OS结果的高风险)实施本文公开的任意治疗。在一些实施方案中，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的绝经后患者(并且因此有差的DFS或OS结果的高风险)可以通过延长她们的基因治疗超过使用作为护理标准的激素治疗所规定的五年时间进行治疗。在某些实施方案中，激素治疗是他莫昔芬和/或芳香酶抑制剂。不应该对相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的患者实施本文公开的治疗。
在具体的实施方案中，受试者具有转移或具有经历转移的预后。在一些实施方案中，转移是骨转移。在其他实施方案中，骨转移是溶骨性转移。
在一些实施方案中，样品是受试者的原发瘤组织样品。在第二步，将在受试者的肿瘤样品中得到的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加与对照样品中所述基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加进行比较。确定c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加必须与对照样品或参比样品的值相关。取决于待分析的肿瘤的类型，对照样品的确切性质可以不同。因此，在一些实施方案中，参比样品是患有尚未转移、复发或再发生的乳腺癌的受试者或患有对应于在患有没有转移、复发或再发生的乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的中位值的乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。
在一个实施方案中，本发明的方法在第二步包括将来自受试者的肿瘤样品(包括，但不限于，原发瘤组织活检物、循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA)中得到的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加与对照样品中所述基因的表达水平进行比较。
当已经测量了在来自患有乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品、循环肿瘤细胞或循环肿瘤DNA中的c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加并与对照样品比较后，如果所述基因的表达水平相对于其在对照样品中的表达水平升高，那么可以推出所述受试者具有阳性转移诊断或更大的发展转移的趋势。
确定c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加必须与对照样品或参比样品的值相关。取决于待分析的肿瘤类型，对照样品的确切性质可能不同。因此，当要评价诊断时，则所述参比样品是来自患有尚未转移的乳腺癌或患有对应于在患有没有转移的乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因表达水平的中位值的乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。
所述参比样品通常通过组合来自受试者群体的等量多份样品而得到。通常，典型的参比样品从临床上有完善记录并且充分表征不存在转移的受试者获得。在此类样品中，可以确定生物标记(c-MAF基因)的正常浓度(参比浓度)，例如，通过提供参比人群的平均浓度而确定。当确定标记的参比浓度时，要考虑多个考虑因素。此类考虑因素特别为患者的年龄、体重、性别、一般身体状况等。例如，按照前述考虑因素(例如，按照不同的年龄组别)分类的至少约2名、至少约10名、至少约20名、至少约25名、至少约50名、至少约75名、至少约100名、至少约250名、至少约500名至超过1000名受试者的组的同等量被视为参比组。参比水平所来源的样品集合优选地由患有与研究的患者对象相同类型的癌症(例如，乳腺癌)的受试者形成。类似地，利用接受操作曲线(ROC)并且对所有敏感性和特异性对测量曲线下面积从而确定哪一对提供最佳值和相应的参比值是什么，可以确定患者组群内的参比值。ROC是标准统计学概念。记载可见于Stuart G.Baker“The Central Role of ReceiverOperating Characteristic(ROC)curves in Evaluating Tests for the EarlyDetection of Cancer”Journal of The National Cancer Institute(2003)Vol 95，No.7，511-515。
一旦已经确定该中位值或参比值，可以将该标记在来自患者的肿瘤组织中表达的水平与该中位值进行比较，由此例如可以分配为“升高的”表达水平。由于受试者之间的差异性(例如，关于年龄、种族等多个方面)，很难(如果不是很难，也是事实上不可能地)确定c-MAF表达的绝对参比值。因此，在具体的实施方案中，通过常规方式计算百分位数来确定关于c-MAF表达的“升高的”或“降低的”表达的参比值，所述常规方式包括通过上述方法中的任一种在分离自其疾病得到充分记录的受试者的一种或几种样品中进行c-MAF表达水平的测定。然后，“降低的”c-MAF水平可以优选地分配到这样的样品：其中c-MAF表达水平等于或低于正常人群中的50％，包括，例如，等于或低于正常人群中的60％、等于或低于正常人群中的70％、等于或低于正常人群中的80％、等于或低于正常人群中的90％以及等于或低于正常人群中的95％的表达水平。然后，“升高的”c-MAF基因表达水平可以优选地分配到这样的样品：其中所述c-MAF基因表达水平等于或大于正常人群中的50％，包括，例如，等于或大于正常人群中的60％、等于或大于正常人群中的70％、等于或大于正常人群中的80％、等于或大于正常人群中的90％以及等于或大于正常人群中的95％的表达水平。
在一个具体的实施方案中，c-MAF基因的扩增或增加程度可以通过确定含有所述基因的染色体区的扩增或增加而确定。优选地，其扩增或增加指示存在c-MAF基因的扩增或增加的染色体区为包括c-MAF基因的基因座16q22-q24。所述基因座16q22-q24位于16号染色体上，在所述染色体的长臂上，并且在区带(band)22至区带24的范围内。该区域在NCBI数据库中对应毗连群NT_010498.15和NT_010542.15。在一个实施方案中，c-MAF基因扩增或增加的程度可以通过使用特异性针对所述基因的探针来确定。
当测量拷贝数时，对照样品是指尚未经历转移的患有乳腺癌的受试者或对应于在没有转移的患有乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因拷贝数的中位值的患有乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品。所述参照样品通常通过将等量的来自受试者群体的样品组合而得到。如果相对于对照样品中所述基因的拷贝数，c-MAF基因拷贝数增加，那么受试者具有阳性转移诊断或更大的发展转移的趋势。在多个实施方案中，作为每个细胞的平均拷贝数来确定拷贝数。
在一些实施方案中，扩增或增加是在16q23基因座区域内。在一些实施方案中，扩增或增加是Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp(从着丝粒到端粒)的染色体区域的任意部分中。在一些实施方案中，扩增或增加是在Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp的基因组区域内，但是排除DNA重复元件。在一些实施方案中，使用特异性针对所述区域的探针测量扩增或增加。
在一个实施方案中，当c-MAF基因拷贝数高于参比样品或对照样品所具有的拷贝数时，c-MAF基因相对于参比基因拷贝数是扩增的。在一个实例中，如果相对于对照样品，测试样品中c-MAF基因的基因组拷贝数或平均基因组拷贝数增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍，则认为c-MAF基因得到“扩增”。在另一个实例中，如果每个细胞c-MAF基因的基因组拷贝数或平均基因组拷贝数为至少约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个等，则认为c-MAF基因得到“扩增”。
在另一个实施方案中，参比基因拷贝数是来自尚未经历骨转移的受试者的乳腺癌样品中的基因拷贝数。
在另一个实施方案中，通过原位杂交或PCR来确定扩增或增加。
在另一个实施方案中并且如本发明所述，假定乳腺癌细胞中chr16q22-24(包括c-MAF基因)得到扩增与存在转移、复发或再发生相关，则chr16q22-24(包括c-MAF基因)的扩增或增加允许就对患有所述癌症的受试者的最适疗法做出决定。
c-MAF基因扩增的确定需要与对照样品或参比样品的值相关，所述对照样品或参比样品的值对应于在没有经历转移的患有乳腺癌的受试者或对应于在没有转移的患有乳腺癌的受试者的组织活检样品的肿瘤组织集合中测量的c-MAF基因扩增的中位值的患有乳腺癌的受试者的肿瘤组织样品中测量的c-MAF基因扩增水平。所述参比样品通常通过将等量的来自受试者群体的样品组合而得到。
通常，典型的参比样品从在临床上有充分记录并且充分表征了不存在转移的受试者获得。参比水平所源于的样品集合优选由作为研究的患者对象的患有相同类型癌症的受试者组成。一旦已确定中位值，则患者肿瘤组织中c-MAF的扩增水平可以与该中位值进行比较，并且因此，如果存在扩增，则该受试者具有阳性转移诊断或更大的发展转移的趋势。
在另一方面，本发明涉及确定c-MAF基因是否在所述受试者的样品中易位。
在一些实施方案中，易位的基因来自16q23基因座的区域。在一些实施方案中，易位的基因来自Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp(从着丝粒到端粒)的染色体区域的任意部分。在一些实施方案中，所易位的基因来自Chr.16-79,392,959bp至79,663,806bp的基因组区域，但是排除DNA重复元件。在一些实施方案中，使用特异性针对所述区域的探针测量易位。
在具体的实施方案中，c-MAF基因的易位可以通过确定含有所述基因的染色体区域的易位而确定。在一个实施方案中，所述易位是t(14,16)易位。在另一个实施方案中，易位的染色体区域是来自基因座16q22-q24。基因座16q22-q24位于染色体16中，在该染色体的长臂中并且在分带22至分带24的范围内。该区域对应于NCBI数据库中的重叠群(contig)NT_010498.15和NT_010542.15。在一个实施方案中，c-MAF基因易位到位于基因座14q32的染色体14，导致易位t(14,16)(q32,q23)。该易位使MAF基因的位置紧挨着IgH基因座中的强增强子，在一些情形中，所述强增强子导致MAF的过表达。(Eychène，A.，Rocques，N.，和Puoponnot，C.，A new MAFia in cancer.2008.Nature Reviews:Cancer.8:683-693.)
在一个实施方案中，c-MAF基因的易位可以通过使用特异性针对所述易位的探针来确定。
本发明的一个实施方案包括第一步确定受试者的样品中c-MAF基因是否易位的方法。在一个实施方案中，所述样品是肿瘤组织样品。
在具体的实施方案中，本发明用于预测患有乳腺癌的受试者发展骨转移的趋势的方法包括确定所述受试者的样品(其中c-MAF基因易位)中c-MAF基因的拷贝数，并将所述拷贝数与对照或参比样品的拷贝数比较，其中如果所述c-MAF拷贝数大于对照样品的c-MAF拷贝数，那么所述受试者具有更大的发展骨转移的趋势。
用于确定c-MAF基因或染色体区域16q22-q24是否易位的方法在本领域中是广为人知的，并且包括之前记载用于c-MAF扩增的那些方法。所述方法包括，但不限于，原位杂交(ISH)(如荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH))、基因组比较杂交或聚合酶链式反应(如实时定量PCR)。对于任意ISH方法，扩增、增加、拷贝数或易位可以通过计数染色体中或细胞核中的荧光点、着色点或银染点的数量而确定。在另一些实施方案中，拷贝数改变和易位的检测可以通过使用全基因组测序、外显子组测序或使用任意PCR衍生的技术进行检测。例如，可以对基因组DNA的样品进行PCR，从而检测易位。在一个实施方案中，使用定量PCR。在一个实施方案中，使用特异性针对c-MAF基因的引物和特异性针对IGH启动子区域的引物进行PCR；如果生成产物，则已经发生易位。
在一些实施方案中，在确定了c-MAF基因的易位之后确定c-MAF基因的扩增、增加和拷贝数。在一些实施方案中，使用探针确定细胞对于c-MAF基因是否是多倍体。在一些实施方案中，确定多倍体性通过确定是否存在2个来自目的基因的信号进行。在一些实施方案中，通过测量来自特异性针对目的基因的探针的信号并将其与着丝粒探针或其他探针进行比较而确定多倍体性。
用于测量c-MAF表达、拷贝数、扩增、增加和易位的方法
在一些实施方案中，使用本领域已知的或本文所述的任意方法测量c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位。
c-MAF蛋白表达水平可以通过允许检测并定量来自受试者的样品中的所述蛋白的任何常规方法进行定量。通过非限制性举例说明，例如，可以使用具有c-MAF结合能力的抗体(或其包含抗原决定簇的片段)以及随后定量所形成的复合物来定量所述蛋白水平。这些测定中所用的抗体可以被标记或可以不被标记。可以使用的标记的示例性实例包括放射性同位素、酶、荧光团、化学发光剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、颗粒、染料等。有宽泛的已知的测定可以用于本发明，它们使用未标记的抗体(一级抗体)和标记的抗体(二级抗体)；这些技术包括蛋白质印迹或蛋白质转移、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射性免疫测定)、竞争性EIA(竞争性酶免疫测定)、DAS-ELISA(双链抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于包括特异性抗体的蛋白微阵列或生物芯片的应用的技术或基于胶体沉淀的采用诸如浸渍片形式的测定。用于检测并定量所述c-MAF蛋白的其他方式包括亲和力层析技术、配体结合测定等。当使用免疫学方法时，已知以高亲和力结合c-MAF蛋白的任意抗体或试剂可以用来检测c-MAF蛋白的量。这包括，但不限于，使用抗体，例如，多克隆血清、杂交瘤上清或多克隆抗体、抗体片段、Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、人源化双链抗体、三链抗体、四链抗体、纳米抗体、α抗体、订书肽(stapled peptides)和环肽。市场上存在可以用于本发明的情形的商购抗-c-MAF蛋白抗体，诸如例如抗体ab427、ab55502、ab55502、ab72584、ab76817、ab77071(Abcam plc，330Science Park，Cambridge CB4 0FL，United Kingdom)、AbD Serotec的O75444单克隆抗体(小鼠抗人MAF不含叠氮化合物的单克隆抗体，未缀合的克隆6b8)等。存在多价提供抗c-MAF抗体的商业公司，诸如Abnova Corporation、BethylLaboratories、Bioworld Technology、GeneTex等。
在一些实施方案中，通过抗原结合成员或其片段检测c-MAF蛋白水平。在一些实施方案中，所述结合成员是抗原结合分子或其结合人c-MAF的片段，其中所述抗体结合分子或其片段包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的重链CDR1，和/或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的重链CDR2，和/或与SEQID NO:23的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的重链CDR3；和/或包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的轻链CDR1，和/或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的轻链CDR2和/或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％相同的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含具有与SEQ ID NO:15的氨基酸至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99％或至少约100％相同的序列的VH结构域。
在一些实施方案中，抗原结合分子或其片段包含具有与SEQ ID NO:17的氨基酸至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99％或至少约100％相同的序列的VL结构域。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99％或至少约100％相同的重链序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其片段包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约99％或至少约100％相同的轻链序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合分子或其片段是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是兔抗体、小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一个方面中，本发明涉及特异性结合由SEQ ID NO:24编码的表位的结合成员、功能性片段、抗体或其变体。在一些实施方案中，所述抗体是国际申请号PCT/IB2015/059562中所述的任意抗体，所述国际申请通过引用完全结合在本文中。
在具体的实施方案中，c-MAF蛋白水平通过蛋白质印迹、免疫组织化学、ELISA或蛋白阵列进行定量。
如本领域技术人员所理解的，基因表达水平可以通过测量所述基因的信使RNA水平或所述基因编码的蛋白的水平进行定量。在一些实施方案中，基因表达水平通过本领域已知的任何方式进行定量。
为此目的，可以处理生物学样品，以物理或机械破坏组织或细胞结构，将细胞内成分释放到水溶液或有机溶液中，从而制备核酸。通过本领域技术人员已知的商业可获得的方法来提取核酸(Sambroock，J.，等人，“Molecular cloning:a Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，Vol.1-3.)。
因此，c-MAF基因表达水平可以由所述基因转录产生的RNA(信使RNA或mRNA)进行定量，或者，备选地，由所述基因的互补DNA(cDNA)进行定量。因此，在本发明的一个具体的实施方案中，c-MAF基因表达水平的定量包括定量c-MAF基因的信使RNA或所述mRNA的片段、c-MAF基因的互补DNA或所述cDNA的片段或它们的混合物。
实质上，在本发明的范围之内可以使用任何常规方法来检测并定量c-MAF基因编码的mRNA水平或其相对应的cDNA水平。通过非限制性举例说明，由所述基因编码的mRNA水平可以用常规方法进行定量，所述常规方法例如包括mRNA扩增和所述mRNA扩增产物的定量的方法，诸如电泳和染色，或备选地，通过Southern印迹并使用适当的探针，Northern印迹并使用目的基因(C-MAF)的mRNA或其相对应的cDNA的特异性探针，用S1核酸酶绘图、RT-PCR、杂交、微阵列等，优选通过使用适当的标记的实时定量PCR。类似地，与c-MAF基因编码的mRNA相对应的cDNA水平也可以通过使用常规技术进行定量；在这一情形中，本发明的方法包括下述步骤：通过相对应的mRNA的反转录(RT)合成相对应的cDNA，然后扩增并定量所述cDNA扩增产物。用于定量表达水平的常规方法可见于，例如，Sambrook等人，2001(同前引用)。这些方法在本领域中是已知的，并且本领域技术人员熟悉每种技术所需要的标准化。例如，使用多路PCR生成的表达测量物应该通过将被测量的基因的表达与所谓的“看家”基因或其他对照基因进行比较而标准化，所述“看家”基因的表达应该在所有样品中是恒定的，由此提供与之比较的基线表达，所述其他对照基因已知其表达受癌症调节。
在具体的实施方案中，c-MAF基因表达水平通过定量聚合酶链式反应(PCR)或DNA、RNA阵列或核苷酸杂交技术定量。
另外，c-MAF基因表达水平也可以通过定量由所述基因编码的蛋白(即，c-MAF蛋白(c-MAF)[NCBI，登记号O75444])或c-MAF蛋白的任意功能等价变体的表达水平而定量。存在两种c-MAF蛋白同种型，即由403个氨基酸(SEQ ID NO:4)组成的α同种型(NCBI，NP_005351.2)和由373个氨基酸(SEQ ID NO:5)组成的β同种型(NP_001026974.1)。c-MAF基因表达水平可以通过定量任一种c-MAF蛋白同种型的表达水平而进行定量。因此，在具体的实施方案中，由c-MAF基因编码的蛋白的水平的定量包括c-MAF蛋白的定量。
用于确定c-MAF基因或染色体区域16q22-q24是否得到扩增的方法在本领域中广为人知的。所述方法包括，但不限于，原位杂交(ISH)(如荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH))、基因组比较杂交或聚合酶链式反应(如实时定量PCR)。对于任何ISH方法，扩增、增加或拷贝数可以通过计数染色体或细胞核中荧光点、着色点或银染点的数量而确定。
荧光原位杂交(FISH)是一种细胞生成计数，其用于检测并定位染色体中特定DNA序列的存在或不存在。FISH使用仅与染色体的一些部分结合的荧光探针，所述荧光探针与所述部分表现出高序列相似度。在典型的FISH方法中，DNA探针用荧光分子或半抗原标记，通常以荧光-dUTP、洋地黄毒苷-dUTP、生物素-dUTP或半抗原-dUTP的形式，它们利用酶反应(如切口平移或PCR)结合在DNA中。将含有遗传物质(染色体)的样品置于玻璃载玻片上，并且通过甲酰胺处理变性。然后，将标记的探针与含有遗传物质的样品在适当条件下杂交，所述适当条件由本领域技术人员确定。杂交后，直接(在用氟标记的探针的情形)或间接(使用荧光标记的抗体来检测半抗原)显现所述样品。
在CISH的情形中，探针用洋地黄毒苷、生物素或荧光素标记，并且在适当条件下与含有所述遗传物质的样品杂交。
用于确定c-MAF基因或染色体区域16q22-q24是否易位的方法在本领域内广为人知，并且包括之前记载用于c-MAF扩增的那些方法。所述方法包括，但不限于，原位杂交(ISH)(如荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH))、基因组比较杂交或聚合酶链式反应(如实时定量PCR)。对于任意ISH方法，扩增、增加、拷贝数或易位可以通过计数染色体中或细胞核中的荧光点、着色点或银染点的数量而确定。在另一些实施方案中，拷贝数改变和易位的检测可以通过使用全基因组测序、外显子组测序或使用任意PCR衍生的技术进行检测。例如，可以对基因组DNA的样品进行PCR，从而检测易位。在一个实施方案中，使用定量PCR。在一个实施方案中，使用特异性针对c-MAF基因的引物和特异性针对IGH启动子区域的引物进行PCR；如果生成产物，则已经发生易位。
可以使用能够结合DNA的任何标志或标记分子来标记用于本发明的方法中的探针，由此允许核酸分子的检测。用于标记的标记的实例包括，尽管不限于，放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶以及它们的组合。用于标记的方法和选择适当的标记用于不同目的的指导例如可见于Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1989)和Ausubel等人(In CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，1998)。
在一些实施方案中，本发明的探针是双色探针。在一些实施方案中，本发明的探针是双融合探针。在一些实施方案中，本发明的探针是双色双融合探针。在一些实施方案中，使用两种独立的探针。
在另一个实施方案中，使用下述探针中的一种来测量c-MAF基因(包括c-MAF基因的翻译)：Vysis LSI IGH/MAF双色双融合探针(http://www.abbottmolecular.com/us/products/analyte-specific-reagent/fish/vysis-lsi-igh-maf-dual-color-dual-fusion-probe.html；最近一次访问于11/5/2012)，其包含针对14q32和16q23的探针；Kreatech诊断MAF/IGH gt(14；16)融合探针(https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/img_uploads/kreatech/ifu/PI-KI-10610_D2.1.pdf；last accessed 05/18/2017)，Abnova MAF FISH探针(http://www.abnova.com/products/products_detail.asp？Catalog_id＝FA0375；最近一次访问于11/5/2012)，Cancer Genetics Italia IGH/MAF双色双融合易位探针(http://www.cancergeneticsitalia.com/dna-fish-probe/ighmaf/；最近一次访问于11/5/2012)，Creative Bioarray IGH/MAF-t(14；16)(q32；q23)FISH探针(http://www.creative-bioarray.com/products.asp？cid＝35&page＝10；最近一次访问于11/5/2012)，通过FISH的Arup Laboratories多发性骨髓瘤组(http://www.aruplab.com/files/technical-bulletins/Multiple％20Myeloma％20％28MM％29％20by％20FISH.pdf；最近一次访问于11/5/2012)，特异性针对16q23或14q32的Agilent探针(http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx？chr＝16&start＝79483700&end＝79754340；最近一次访问于11/5/2012；http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx？Pageid＝3000&ProductID＝637；最近一次访问于11/5/2012)，特异性针对16q23或14q32的Dako探针(http://www.dako.com/us/ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm？setCountry＝true&purl＝ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm？undefined&submit＝Accept％20country；最近一次访问于11/5/2012)，Cytocell IGH/MAF易位，双融合探针(http://www.zentech.be/uploads/docs/products_info/prenatalogy/cytocell％202012-2013％20catalogue％5B3％5D.pdf；最近一次访问于11/5/2012)，Metasystems XL IGH/MAF易位-双融合探针(http://www.metasystems-international.com/index.php？option＝com_joodb&view＝article&joobase＝5&id＝12％3Ad-5029-100-og&Itemid＝272；最近一次访问于11/5/2012)，ZeissFISH探针XL，100μl，IGH/MAFB(https://www.micro-shop.zeiss.com/？s＝440675675dedc6&l＝en&p＝uk&f＝r&i＝5000&o＝&h＝25&n＝1&sd＝000000-0528-231-uk；最近一次访问于11/5/2012)或Genycell Biotech IGH/MAF双融合探针(http://www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝1&ved＝0CCQQFjAA&url＝http％3A％2F％2Fwww.genycell.es％2Fimages％2Fproductos％2Fbrochures％2Flphmie6__86.ppt&ei＝MhGYUOi3GKWH0QGlt4DoDw&usg＝AFQjCNEqQMbT8vQGjJbi9riEf3lVgoFTFQ&sig2＝V5IS8juEMVHB18Mv2Xx_Ww；最近一次访问于11/5/2012)。
在一些实施方案中，探针上的标记是荧光团。在一些实施方案中，探针上的荧光团是橙色的。在一些实施方案中，探针上的荧光团是绿色的。在一些实施方案中，探针上的荧光团是红色的。在一些情形中，探针上的荧光团是黄色的。在一些实施方案中，一种探针用红色荧光团标记，并且一种用绿色荧光碳标记。在一些实施方案中，一种探针用绿色荧光团标记并且另一个用橙色荧光团标记。在一些情形中，探针上的荧光团是黄色的。例如，如果用红色荧光团标记MAF-特异性探针，并且IGH-特异性探针用绿色荧光团标记，如果观察到白色，则其表明信号重合并且发生了易位。
在一些实施方案中，荧光团是SpectrumOrange。在一些实施方案中，荧光团是SpectrumGreen。在一些实施方案中，荧光团是DAPI。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright405。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright415。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright495。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright505。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright550。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright547。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright570。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright590。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright647。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright495/550。在一些实施方案中，荧光团是PlatinumBright415/495/550。在一些实施方案中，荧光团是DAPI/PlatinumBright495/550。在一些实施方案中，荧光团是FITC。在一些实施方案中，荧光团是Texas Red。在一些实施方案中，荧光团是DEAC。在一些实施方案中，荧光团是R6G。在一些实施方案中，荧光团是Cy5。在一些实施方案中，荧光团是FITC、Texas Red和DAPI。在一些实施方案中，使用DAPI复染来显现易位、扩增、增加或拷贝数改变。
用于治疗或预防乳腺癌的方法中的药剂和疗法
在一些实施方案中，本文所述的本发明的方法包括用避免或预防骨重建的药剂治疗受试者。当用于本文时，“避免或预防骨重建的药剂”是指任何能够通过刺激成骨细胞增殖或抑制破骨细胞增殖而治疗或终止骨退化的分子，包括避免或预防骨退化的药剂。在多个实施方案中，避免或预防骨重建的药剂是骨改良剂和/或避免或预防骨退化的药剂。用于避免和/或预防骨退化的药剂的示例性实例包括，但是不限于：
-副甲状腺激素(PTH)和副甲状腺样激素(PTHLH)抑制剂(包括封闭抗体)或其重组形式(对应于PTH的氨基酸7-34的特立帕肽(teriparatide))。该激素通过刺激成骨细胞并增加其活性而起作用。
-雷尼酸锶：是一种替代的口服治疗，并且形成因刺激成骨细胞增殖并抑制破骨细胞增殖而被称为“双重作用骨剂”(DABA)的药物组的一部分。
-“雌激素受体调节剂”(SERM)是指干扰或抑制雌激素与受体结合(而不考虑机制)的化合物。雌激素受体调节剂的实例特别包括雌激素类孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、艾多昔芬、L Y353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群(fluvestrant)，4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸4,4’二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙和SH646。
-降钙素：通过降钙素受体直接抑制破骨细胞活性。已经鉴定降钙素受体位于破骨细胞的表面。
-双膦酸盐：是一组用于预防和治疗具有骨质吸收和重吸收的疾病(如骨质疏松症)和具有与乳腺癌相关的骨转移的癌症的医药产品，后者具有或不具有高钙血症。可以用在通过本发明的第五方法设计的疗法中的双膦酸盐的实例包括，但不限于，含氮双膦酸盐(如帕米磷酸二钠(pamidronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpadronate)、阿屈膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、伊卡膦酸盐(incadronate)、唑来膦酸盐(zoledronate)或唑来膦酸等)和不含氮双膦酸盐(如依替膦酸盐(etidronate)，氯膦酸盐(clodronate)，替鲁膦酸盐(tiludronate)等)。
-“组织蛋白酶K抑制剂”是指干扰组织蛋白酶K半胱氨酸蛋白酶活性的化合物。组织蛋白酶K抑制剂的非限制性实例包括4-氨基-嘧啶-2-腈衍生物(记载在诺华制药GMBH(Novartis Pharma GMBH)名下的国际专利申请WO 03/020278中)、记载在公布WO 03/020721(诺华制药GMBH)和公布WO 04/000843(阿斯利康有限公司(ASTRAZENECA AB))中的吡咯并-嘧啶类以及记载在艾斯制药(Axys Pharmaceuticals)的公布PCT WO 00/55126、默克福斯特加拿大公司(Merck Frosst Canada&Co.)和艾斯制药的WO 01/49288中的抑制剂。
-“DKK-1(Dickkopf-1)抑制剂”用在本文中是指任何能够降低DKK-1活性的化合物。DKK-1是一种可溶性Wnt途径拮抗剂，其主要在成体骨骼中表达并且在患有骨溶解性病损的骨髓瘤患者中上调。靶向DKK-1的药剂可以在多发性骨髓瘤患者中预防溶骨性骨病方面起作用。诺华(Novartis)的BHQ880是首创新药，完全人的抗-DKK-1中和抗体。临床前研究支持BHQ880促进骨形成并由此抑制肿瘤诱导的溶骨性疾病的假说(Ettenberg S.等人，American Association for Cancer Research Annual Meeting.April 12-16，2008；SanDiego，Calif.Abstract)。
-“双重MET和VEGFR2抑制剂”用在本文中是指设计阻断MET驱动的肿瘤逃逸的MET和VEGF途径的有效双重抑制剂的任何化合物。MET不仅在肿瘤细胞和内皮细胞中表达，而且在成骨细胞(骨形成细胞)和破骨细胞(去骨细胞)中表达。HGF与所有这些细胞类型上的MET结合，赋予MET途径在多个自分泌和旁分泌环路中的重要作用。肿瘤细胞中MET的激活似乎在建立转移的骨损伤方面是重要的。同时，在成骨细胞和破骨细胞中激活MET途径可以导致骨转移的病理学特征，包括异常的骨生长(即，成骨损伤(blastic lesion))或破坏(即，溶骨损伤)。因此，靶向MET途径可以是预防转移性骨损伤的建立和进展的可行性策略。之前称为XL184(CAS 849217-68-1)的卡博替尼(Cabozantinib)(Exelixis，Inc)是一种设计阻断MET驱动的肿瘤逃逸的有效的MET和VEGF途径双重抑制剂。在多个临床前研究中，已经表明卡博替尼杀死肿瘤细胞，减少转移，并且抑制血管形成(支持肿瘤生长所需要的新血管的形成)。另一种适当的双重抑制剂为E7050(N-[2-氟-4-({2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基]羰基氨基吡啶-4-基}氧基)苯基]-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1,1-二甲酰胺(2R,3R)-酒石酸酯)(CAS 928037-13-2)或Foretinib(也称为GSK1363089，XL880，CAS 849217-64-7)。
-“RANKL抑制剂”用在本文中是指任何能够降低RANK活性的化合物。RANKL存在于间质和T淋巴细胞的成骨细胞膜表面上，并且这些T淋巴细胞仅是具有已证明的分泌RANKL的能力的那些T淋巴细胞。其主要功能是激活成骨细胞，即参与骨质吸收的细胞。RANKL抑制剂可以通过阻断RANKL与其受体(RANK)的结合、阻断RANK-介导的信号传导或通过阻断RANKL的转录或翻译而减少RANKL的表达而起作用。适用于本发明的RANKL拮抗剂或抑制剂包括，但不限于：
ο适当的RANK蛋白，其能够结合RANKL并且其包含RANK蛋白的完整细胞外结构域或片段。可溶性RANK可以包含信号肽和鼠或人RANK多肽的细胞外结构域，或备选地，可以使用该蛋白去除了信号肽的成熟形式。
ο具有RANKL-结合能力的骨保护素或其变体。
οRANKL-特异性反义分子。
ο能够加工RANKL转录产物的核酶。
ο特异性抗-RANKL抗体。“抗-RANKL抗体或针对RANKL的抗体”在本文理解为所有能够特异性结合核因子κB(RANKL)的激活受体的配体、从而抑制一个或多个RANKL功能的抗体。所述抗体可以使用本领域技术人员已知的任一种方法制备。因此，通过用要被抑制的蛋白免疫动物而制备多克隆抗体。使用Kohler，Milstein等人(Nature，1975，256:495)所述的方法制备单克隆抗体。在本发明的情形中适合的抗体包括包含可变抗原结合区和恒定区的完整抗体、片段“Fab”、“F(ab’)2”和“Fab`”、Fv、scFv、双链抗体和双特异性抗体。
ο特异性的抗-RANKL纳米抗体。纳米抗体是包含天然存在的重链抗体的独特结构和功能特点的抗体衍生的治疗性蛋白。纳米抗体技术最初在骆驼科动物(骆驼和羊驼)具有缺少轻链的完全功能性抗体的发现之后发展起来的。纳米抗体的一般结构为：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ο其中FR1-FR4为构架区1-4，CDR1-CDR3为互补决定区1-3,。这些重链抗体包含单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，所克隆的和分离的VHH结构域是具有初始重链抗体的完全抗原结合能力的十分稳定的多肽。这些新发现的具有其特有的结构和功能特性的VHH结构域形成新一代治疗性抗体的基础，Ablynx将所述抗体命名为纳米抗体。
在一个实施方案中，RANKL抑制剂选自由下述组成的组：RANKL特异性抗体、RANKL特异性纳米抗体和骨保护素。在一个具体实施方案中，抗-RANKL抗体是单克隆抗体。在更具体的实施方案中，抗-RANKL抗体是地舒单抗(Pageau，Steven C.(2009).mAbs 1(3):210-215，CAS number 615258-40-7)(其全部内容通过引用结合在本文中)。地舒单抗是完全人单克隆抗体，其结合RANKL并且防止其激活(其不结合RANK受体)。美国专利号6,740,522；7,411,050；7,097,834；7,364,736涵盖了地舒单抗的多个方面(每个专利的全部内容通过引用完全结合在本文中)。在另一个实施方案中，RANKL抑制剂是与地舒单抗结合相同表位的抗体、抗体片段或融合构建体。
在一个实施方案中，抗-RANKL纳米抗体是记载在WO2008142164中的纳米抗体中的任一种(WO2008142164的内容通过引用结合在本申请中)。在一个实施方案中，抗-RANKL抗体是ALX-0141(Ablynx)。ALX-0141已设计用于抑制与绝经后骨质疏松症、类风湿性关节炎、癌症和某些药物疗法相关的绝经后骨质疏松相关的骨质流失。
在一个实施方案中，预防骨退化的要忘记选自包含下述的组：双膦酸盐，RANKL抑制剂，PTH和PTHLH抑制剂或PRG类似物，雷尼酸锶，DKK-1抑制剂，双重MET和VEGFR2抑制剂，雌激素受体调节剂，镭-223，降钙素，和组织蛋白酶K抑制剂。在一个实施方案中，预防骨退化的药剂为双膦酸盐。在一个实施方案中，所述双膦酸盐为唑来膦酸。
在一个实施方案中，施用CCR5拮抗剂来预防或抑制原发性乳腺癌肿瘤向骨骼的转移或复发或再发生。在一个实施方案中，所述CCR5拮抗剂为大分子。在另一个实施方案中，所述CCR5拮抗剂为小分子。在一些实施方案中，所述CCR5拮抗剂为马拉韦罗(Maraviroc)。在一些实施方案中，所述CCR5拮抗剂为维立韦罗(Vicriviroc)。在一些方面中，所述CCR5拮抗剂为阿拉韦罗(Aplaviroc)。在一些方面中，所述CCR5拮抗剂为螺哌啶CCR5拮抗剂。(Rotstein D.M.等人，2009.Spiropiperidine CCR5 antagonists.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters.19(18):5401-5406)。在一些实施方案中，所述CCR5拮抗剂为INCB009471(Kuritzkes，D.R.2009.HIV-1entry inhibitors:an overview.Curr.Opin.HIVAIDS.4(2):82-7)。
在一个实施方案中，所述双重MET和VEGFR2抑制剂选自由以下组成的组：卡博替尼、Foretinib和E7050。
在多个实施方案中，MAF的状态预示受试者应该接受的治疗。在多个实施方案中，在本文任一个实施方案中的c-MAF状态包括16q23或16q22-24染色体基因座扩增、其拷贝增加或易位或缺乏，或者16q23或16q22-24染色体基因座缺失。在多个实施方案中，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的绝经后患者(并且因此有差的DFS或OS结果的高风险)可以施用本文公开的任意治疗。在一些实施方案中，相对于参比具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的绝经后患者(并且因此有差的DFS或OS结果的高风险)可以通过延长她们的激素治疗超过五年的时间(使用激素治疗作为护理标准所指定的时间)而进行治疗。在某些实施方案中，所述激素治疗是他莫昔芬和/或芳香酶抑制剂。相对于参比不具有c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的升高的患者不应该施用本文公开的治疗。
在另一个方面，所述治疗为mTor抑制剂。在一些方面中，mTor抑制剂是双重mTor/PI3激酶抑制剂。在一些方面中，使用mTor抑制剂来预防或抑制转移、复发或再发生。在一些方面中，mTor抑制剂选自由以下组成的组：ABI009(西罗莫司)，雷帕霉素(西罗莫司)，Abraxane(紫杉醇)，Absorb(依维莫司)，Afinitor(依维莫司)，Afinitor与格列卫(Gleevec)，AS703026(pimasertib)，Axxess(佐他莫司)，AZD2014，BEZ235，Biofreedom(佐他莫司)，BioMatrix(佐他莫司)，BioMatrix flex(佐他莫司)，CC115，CC223，组合生物改造的西罗莫司洗脱支架(Combo Bio-engineered Sirolimus Eluting Stent)ORBUSNEICH(西罗莫司)，Curaxin CBLC102(米帕林)，DE109(西罗莫司)，DS3078，Endeavor DES(唑罗莫司)，Endeavor Resolute(唑罗莫司)，弗隆(Femara)(来曲唑)，Hocena(安卓奎诺尔)，INK128，Inspiron(西罗莫司)，IPI504(瑞他霉素盐酸盐(retaspimycin hydrochloride))，KRN951(tivozanib)，ME344，MGA031(替利珠单抗)，MiStent SES(西罗莫司)，MKC1，Nobori(佐他莫司)，OSI027，OVI123(蛹虫草菌素(cordycepin))，Palomid 529，PF04691502，Promus Element(依维莫司)，PWT33597，雷帕鸣(西罗莫司)，Resolute DES(唑罗莫司)，RG7422，SAR245409，SF1126，SGN75(vorsetuzumab mafodotin)，Synergy(依维莫司)，Taltorvic(ridaforolimus)，Tarceva(埃罗替尼)，Torisel(temsirolimus)，Xience Prime(依维莫司)，Xience V(依维莫司)，Zomaxx(唑罗莫司)，Zortress(依维莫司)，佐他莫司洗脱外周支架(唑罗莫司Eluting Peripheral Stent)MEDTRONIC(唑罗莫司)，AP23841，AP24170，ARmTOR26，BN107，BN108，Canstatin GENZYME(canstatin)，CU906，EC0371，EC0565，KI1004，LOR220，NV128，雷帕霉素ONCOIMMUNE(西罗莫司)，SB2602，西罗莫司PNPSAMYANG BIOPHARMACEUTICALS(西罗莫司)，TOP216，VLI27，VS5584，WYE125132，XL388，Advacan(依维莫司)，AZD8055，Cypher Select Plus西罗莫司洗脱冠状动脉支架(西罗莫司)，Cypher西罗莫司洗脱冠状动脉支架(西罗莫司)，Drug Coated Balloon(西罗莫司)，E-Magic Plus(西罗莫司)，Emtor(西罗莫司)，Esprit(everolimus)，Evertor(everolimus)，HBF0079，LCP-Siro(西罗莫司)，Limus CLARIS(西罗莫司)，mTOR Inhibitor CELLZOME，Nevo Sirolimus eluting Coronary Stent(西罗莫司)，nPT-mTOR，Rapacan(西罗莫司)，Renacept(西罗莫司)，ReZolve(西罗莫司)，Rocas(西罗莫司)，SF1126，Sirolim(西罗莫司)，西罗莫司NORTH CHINA(西罗莫司)，西罗莫司RANBAXY(西罗莫司)，西罗莫司WATSON(西罗莫司)Siropan(西罗莫司)，Sirova(西罗莫司)，Supralimus(西罗莫司)，Supralimus-Core(西罗莫司)，Tacrolimus WATSON(他克莫司)，TAFA93，Temsirolimus ACCORD(替西罗莫司(temsirolimus))，Temsirolimus SANDOZ(替西罗莫司)，TOP216，Xience Prime(依维莫司)，Xience V(依维莫司)。在一个具体的方面中，所述mTor抑制剂为Afinitor(依维莫司)(http://www.afinitor.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&Nova Id＝4029462064338207963；最近一次访问于11/28/2012)。在另一个方面中，mTor抑制剂可以通过本领域已知的方法鉴定。(参见，例如，Zhou，H.等人Updates of mTorinhibitors.2010.Anticancer Agents Med.Chem.10(7):571-81，其通过引用完全结合在本文中)。在另一个方面中，mTor抑制剂可以通过本领域已知的方法鉴定。(参见，例如，Zhou，H.等人Updates of mTor inhibitors.2010.Anticancer Agents Med.Chem.10(7):571-81，其通过引用完全结合在本文中)。在一些方面中，使用mTor抑制剂来治疗或预防或抑制对激素受体为阳性的患者中的转移。(参见，例如，Baselga，J.，el al.，Everolimus inPostmenopausal Hormone-Receptor Positive Advanced BreastCancer.2012.N.Engl.J.Med.366(6):520-529)。在一些方面中，使用mTor抑制剂来治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面中，mTor抑制剂与第二治疗联合使用。在一些方面中，第二治疗为本文所述的任一种治疗。
在另一方面中，治疗是Src激酶抑制剂。在一些方面中，使用Src抑制剂来预防或抑制转移、复发或再发生。在一些方面中，Src激酶抑制剂选自下组：AZD0530(沙拉替尼)，Bosulif(波舒替尼)，ENMD981693，KD020，KX01，Sprycel(达沙替尼)，Yervoy(伊匹木单抗)，AP23464，AP23485，AP23588，AZD0424，c-Src激酶抑制剂KISSEI，CU201，KX2361，SKS927，SRN004，SUNK706，TG100435，TG100948，AP23451，Dasatinib HETERO(达沙替尼)，DasatinibVALEANT(达沙替尼)，Fontrax(达沙替尼)，Src激酶抑制剂KINEX，VX680,(乳酸陶扎色替(tozasertib lactate))，XL228，和SUNK706。在一些实施方案中，Src激酶抑制剂是达沙替尼。在另一方面中，Src激酶抑制剂可以通过本领域已知的方法(参见，例如，Sen，B.和Johnson，F.M.Regulation of Src Family Kinases in Human Cancers.2011.J.SignalTransduction.2011:14页，其通过引用结合在本文中)来鉴定。在一些方面中，使用Src激酶抑制剂来治疗或预防或抑制对SRC-响应性特征(SRS)为阳性的患者中的转移、复发或再发生。在一些实施方案中，患者为SRS+和ER-。(参见，例如，Zhang，CH.-F，等人，Latent BoneMetastasis in Breast Cancer Tied to Src-Dependent survivalsignals.2009.Cancer Cell.16:67-78，其通过引用结合在本文中)。在一些方面中，使用Src激酶抑制剂来治疗或预防或抑制患有晚期乳腺癌的患者中的转移。在一些方面中，Src激酶抑制剂与第二治疗联合使用。在一些方面中，所述第二治疗为本文所述的任一种治疗。
在另一方面，所述治疗为COX-2抑制剂。在一些方面中，使用COX-2抑制剂来预防或抑制转移、复发或再发生。在一些方面中，COX-2抑制剂选自以下的组：ABT963，Acetaminophen ER JOHNSON(醋氨酚)，Acular X(酮咯酸氨丁三醇)，BAY1019036(阿司匹林)，BAY987111(苯海拉明，萘普生钠)，BAYl1902(吡罗昔康)，BCIBUCH001(布洛芬)，Capoxigem(阿利考昔)，CS502，CS670(培比洛芬)，Diclofenac HPBCD(双氯芬酸)，Diractin(酮洛芬)，GW406381，HCT1026(硝基氟吡洛芬)，Hyanalgese-D(双氯芬酸)，HydrocoDex(醋氨酚、右美沙芬、氢可酮)，Ibuprofen Sodium PFIZER(布洛芬钠)，Ibuprofen withAcetaminophen PFIZER(醋氨酚、布洛芬)，Impracor(ketoprofen)，IP880(双氯芬酸)，IP940(吲哚美辛)，ISV205(双氯芬酸钠)，JNS013(醋氨酚、盐酸曲马多)，Ketoprofen TDS(酮洛芬)，LTNS001(naproxen etemesil)，Mesalamine SALIX(氨水杨酸)，MesalamineSOFAR(氨水杨酸)，Mesalazine(氨水杨酸)，ML3000(利考非隆)，MRX7EAT(依托度酸)，Naproxen IROKO(萘普生)，NCX4016(硝基阿司匹林)，NCX701(硝基醋氨酚)，Nuprin SCOLR(布洛芬)，OMS103HP(盐酸阿米替林、酮洛芬、盐酸羟甲唑啉)，Oralease(双氯芬酸)，OxycoDex(右美沙芬、氧可酮)，P54，PercoDex(醋氨酚、右美沙芬、氧可酮)，PL3100(萘普生、磷酯酰胆碱)，PSD508，R-Ketoprofen(酮洛芬)，Remura(溴芬酸钠)，ROX828(酮咯酸氨丁三醇)，RP19583(酮洛芬赖氨酸)，RQ00317076，SDX101(R-依托度酸)，TDS943(双氯芬酸钠)，TDT070(酮洛芬)，TPR100，TQ1011(酮洛芬)，TT063(S-氟比洛芬)，UR8880(西米考昔)，V0498TA01A(布洛芬)，VT122(依托度酸、普萘洛尔)，XP20B(醋氨酚、右丙氧芬)，XP21B(双氯芬酸钾)，XP21L(双氯芬酸钾)，Zoenasa(乙酰半胱氨酸、氨水杨酸)，Acephen，ActifedPlus，Actifed-P，Acular，Acular LS，Acular PF，Acular X，Acuvail，Advil，AdvilAllergy Sinus,Advil Cold and Sinus,Advil Congestion Relief,Advil PM，Advil PMCapsule，Air Salonpas，Airtal，Alcohol-Free NyQuil Cold&Flu Relief，Aleve，AleveABDI IBRAHIM，Aleve-D，Alka-Seltzer,Alka-Seltzer BAYER，Alka-Seltzer ExtraStrength，Alka-Seltzer Lemon-Lime，Alka-Seltzer Original，Alka-Seltzer Plus，Alka-Seltzer plus Cold and Cough，Alka-Seltzer plus Cold and Cough Formula，Alka-Seltzer Plus Day and Night Cold Formula,，Alka-Seltzer Plus Day Non-Drowsy Cold Formula，Alka-Seltzer Plus Flu Formula，Alka-Seltzer Plus NightCold Formula，Alka-Seltzer Plus Sinus Formula，Alka-Seltzer Plus SparklingOriginal Cold Formula，Alka-Seltzer PM，Alka-Seltzer Wake-Up Call，Anacin，Anaprox，Anaprox MINERVA，Ansaid，Apitoxin，Apranax，Apranax abdi，Arcoxia，Arthritis Formula Bengay，Arthrotec，Asacol，Asacol HD，Asacol MEDUNAARZNEIMITTEL，Asacol ORIFARM，Aspirin BAYER，Aspirin Complex，Aspirin Migran，AZD3582，Azulfidine，Baralgan M，BAY1019036，BAY987111，BAYl1902，BCIBUCH001，Benadryl Allergy，Benadryl Day and Night，Benylin 4Flu，Benylin Cold and Flu，Benylin Cold and Flu Day and Night，Benylin Cold and Sinus Day and Night，Benylin Cold and Sinus Plus，Benylin Day and Night Cold and Flu Relief，Benylin1 All-In-One，Brexin，Brexin ANGELINI，Bromday，Bufferin，Buscopan Plus，Caldolor，Calmatel，Cambia，Canasa，Capoxigem，Cataflam，Celebrex，Celebrex ORIFARM，Children’s Advil Allergy Sinus，Children’sTylenol，Children’s Tylenol Cough andRunny Nose，Children’s Tylenolplus cold，Children’s Tylenol plus Cold andCough，Children’s Tylenolplus cold and stuffy nose，Children’s Tylenol plusFlu，Children’sTylenol plus cold&allergy，Children’s Tylenol plus Cough&RunnyNose，Children’s Tylenol plus Cough&Sore Throat，Children’s Tylenolplusmulti symptom cold，Clinoril，Codral Cold and Flu，Codral Dayand Night DayTablets，Codral Day and Night Night Tablets，CodralNightime，Colazal，Combunox，Contac Cold plus Flu，Contac Cold plusFlu Non-Drowsy，Coricidin D，Coricidin HBPCold and Flu，CoricidinHBP Day and Night Multi-Symptom Cold，Coricidin HBPMaximumStrength Flu，Coricidin HBP Nighttime Multi-Symptom Cold，CoricidinIIExtra Strength Cold and Flu，CS502，CS670，Daypro，Daypro Alta，DDS06C，DemazinCold and Flu，Demazin Cough，Cold and Flu，Demazin day/night Cold and Flu，Demazin PE Cold and Flu，DemazinPE day/night Cold and Flu，Diclofenac HPBCD，Dimetapp Day Relief，Dimetapp Multi-Symptom Cold and Flu，Dimetapp NightRelief，Dimetapp Pain and Fever Relief，Dimetapp PE Sinus Pain，DimetappPE SinusPain plus Allergy，Dipentum，Diractin，Disprin Cold‘n’Fever，Disprin Extra，Disprin Forte.Disprin Plus，Dristan Cold，DristanJunior，Drixoral Plus，Duexis，Dynastat，Efferalgan，Efferalgan PlusVitamin C，Efferalgan Vitamin C，ElixsureIB，Excedrin Back andBody，Excedrin Migraine，Excedrin PM，Excedrin SinusHeadache，Excedrin Tension Headache，Falcol，Fansamac，Feldene，FeverAll，Fiorinal，Fiorinal with Codeine，Flanax，Flector Patch，Flucam，Fortagesic，Gerbin，Giazo，Gladio，Goody’s Back and Body Pain，Goody’s Cool Orange，Goody’s Extra Strength，Goody’s PM，Greaseless Bengay，GW406381，HCT1026，He Xing Yi，Hyanalgese-D，HydrocoDex，Ibuprofen Sodium PFIZER，Ibuprofen with，Acetaminophen PFIZER，IcyHot SANOFI AVENTIS，Impracor，Indocin，Indomethacin APP PHARMA，IndomethacinMYLAN，Infants’Tylenol，IP880，IP940，Iremod，ISV205，JNS013，Jr.Tylenol，Junifen，Junior Strength Advil，Junior Strength Motrin，Ketoprofen TDS，Lemsip Max，LemsipMax All in One，Lemsip Max All Night，Lemsip Max Cold and Flu，Lialda，ListerineMouth Wash，Lloyds Cream，Lodine，Lorfit P，Loxonin，LTNS001，Mersyndol，MesalamineSALIX，Mesalamine SOFAR，Mesalazine，Mesasal GLAXO，Mesasal SANOFI，Mesulid，MetsalHeat Rub，Midol Complete，Midol Extended Relief，Midol Liquid Gels，Midol PM，Midol Teen Formula，Migranin COATED TABLETS，ML3000，Mobic，Mohrus，Motrin，MotrinCold and Sinus Pain，Motrin PM，Movalis ASPEN，MRX7EAT，Nalfon，Nalfon PEDINOL，Naprelan，Naprosyn，Naprosyn RPG LIFE SCIENCE，Naproxen IROKO，NCX4016，NCX701，NeoProfen LUNDBECK，Nevanac，Nexcede，Niflan，Norgesic MEDICIS，Novalgin，NuprinSCOLR，Nurofen，Nurofen Cold and Flu，Nurofen Max Strength Migraine，NurofenPlus，Nuromol，NyQuil with Vitamin C，Ocufen，OMS103HP，Oralease，Orudis ABBOTTJAPAN，Oruvail，Osteluc，OxycoDex，P54，Panadol，Panadol Actifast，Paradine，Paramax，Parfenac，Pedea，Pennsaid，Pentasa，Pentasa ORIFARM，Peon，Percodan，Percodan-Demi，PercoDex，Percogesic，Perfalgan，PL2200，PL3100，Ponstel，Prexige，Prolensa，PSD508，R-Ketoprofen，Rantudil，Relafen，Remura，Robaxisal，Rotec，Rowasa，ROX828，RP19583，RQ00317076，Rubor，Salofalk，Salonpas，Saridon，SDX101，Seltouch，sfRowasa，Shinbaro，Sinumax，Sinutab，Sinutab，窦，Spalt，Sprix，Strefen，Sudafed Cold and Cough，SudafedHead Cold and Sinus，Sudafed PE Cold plus Cough，Sudafed PE Pressure plus Pain，Sudafed PE，Severe Cold，Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Day Tablets，Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Night Tablets，Sudafed PE Sinus plusAnti-inflammatory Pain Relief，Sudafed Sinus Advance，Surgam，Synalgos-DC，Synflex，Tavist allergy/sinus/headache，TDS943，TDT070，Theraflu Cold and SoreThroat，Theraflu Daytime Severe Cold and Cough，Theraflu Daytime WarmingRelief,Theraflu Warming Relief Caplets Daytime Multi-Symptom Cold，TherafluWarming Relief Cold and Chest Congestion，Thomapyrin，Thomapyrin C，ThomapyrinEffervescent，Thomapyrin Medium，Tilcotil，Tispol，Tolectin，Toradol，TPR100，TQ1011，Trauma-Salbe，Trauma-Salbe Kwizda，Treo，Treximet，Trovex，TT063，Tylenol，Tylenol Allergy Multi-Symptom，Tylenol Back Pain，Tylenol Cold&Cough Daytime，Tylenol Cold&Cough Nighttime，Tylenol Cold and Sinus Daytime，Tylenol Cold andSinus Nighttime，Tylenol Cold Head Congestion Severe，Tylenol Cold MultiSymptom Daytime，Tylenol Cold Multi Symptom Nighttime Liquid，Tylenol ColdMulti Symptom Severe，Tylenol Cold Non-Drowsiness Formula，Tylenol Cold SevereCongestion Daytime，Tylenol Complete Cold，Cough and Flu Night time，Tylenol FluNighttime，Tylenol Menstrual，Tylenol PM，Tylenol Sinus Congestion&Pain Daytime，Tylenol Sinus Congestion&Pain Nighttime，Tylenol Sinus Congestion&Pain Severe，Tylenol Sinus Severe Congestion Daytime，Tylenol Ultra Relief，Tylenol withCaffeine and Codeine phosphate，Tylenol with Codeine phosphate，Ultra StrengthBengay Cream，Ultracet，UR8880，V0498TA01A，Vicks NyQuil Cold and Flu Relief，Vicoprofen，Vimovo，Voltaren Emulgel，Voltaren GEL，Voltaren NOVARTIS CONSUMERHEALTH GMBH，Voltaren XR，VT122，Xefo，Xefo Rapid，Xefocam，Xibrom，XL3，Xodol，XP20B，XP21B，XP21L，Zipsor和Zoenasa。在另一个方面，COX-2抑制剂可通过本领域已知的方法(参见，例如，Dannhardt，G.和Kiefer，W.Cyclooxygenase inhibitors-current status andfuture prospects.2001.Eur.J.Med.Chem.36:109-126，将其通过引用并入本文)来鉴定。在一些方面，COX-2抑制剂用于治疗或预防或抑制晚期乳腺癌患者中的转移。在一些方面，将COX-2抑制剂与第二治疗组合使用。在一些方面，第二治疗是本文中描述的任何治疗。在一些方面，将COX-2抑制剂与第二治疗组合使用，所述第二治疗选自以下组成的组：地舒单抗，Zometa(http://www.us.zometa.com/index.jsp？usertrack.filter_applied＝true&NovaId＝2935376934467633633；最近一次访问于12/2/2012)，Carbozantinib或卡博替尼，阻断PTHLH(甲状旁腺激素样激素)或PTHrP(甲状旁腺激素相关蛋白)的抗体或肽。
在一个实施方案中，治疗是镭223。在一个实施方案中，镭223疗法是Alpharadin(aka,Xofigo)(二氯化镭223)。Alpharadin使用来自镭-223衰变的α辐射来杀死癌细胞。镭-223通过其作为钙模拟物的性质天然地自我靶向骨转移。α辐射具有2-10个细胞的极短的射程(当与基于β或γ辐射的目前放射疗法相比较时)，从而引起更少的对周围健康组织(特别是骨髓)的损伤。由于与钙相似的性质，镭-223被吸至其中使用钙来在体内构建骨的地方，包括更快的异常骨生长的部位。镭-223在注射后于血流中被运送至异常骨生长的部位。癌症在体内开始的地方称为原发性肿瘤。这些细胞中的一些可脱离并且于血流中被运送至身体的另一个部位。随后癌细胞可定居在身体的该部分，并形成新的肿瘤。如果这发生，其称为继发性癌症或转移。利用镭-223的目的是选择性靶向该继发性癌症。骨中未被吸收的任何镭-223快速经过肠并被排泄掉。
在一些实施方案中，治疗是CDK4/6抑制剂。在具体的实施方案中，CDK4/6抑制剂选自任意已知的CDK4/6抑制剂。在其他实施方案中，CDK4/6抑制剂是帕博西尼(Palbociclib)(PD-0332991)，Ribociclib(LEE011)，或Abemaciclib(LY2835219)。CDK4/6抑制剂的使用记述在Finn等人Breast Cancer Research 18:17(2016)中。
或者，可进行联合治疗，其中将超过一种来自上述试剂的试剂组合以治疗和/或预防转移、复发或再发生，或可将所述试剂与其它补充剂例如钙或维生素D或与激素治疗组合。
在多个实施方案中，处于高DFS或差OS结果的风险的MAF阳性绝经后患者以使用任何改善该患者的结果的疗法的辅助设置进行治疗。这些疗法包括本文公开的任意疗法，包括用于避免或预防骨重建的药剂、改善无病生存期或整体生存期的药剂、c-MAF抑制性药剂、化学疗法、激素疗法、m-Tor抑制剂、CDK4/6抑制剂、镭-223、CCR5拮抗剂、Src激酶抑制剂或COX-2抑制剂和它们的组合。非MAF阳性的患者不应该施用此类药剂或疗法。
当癌症已转移时，可使用全身性治疗，包括但不限于化学疗法、激素治疗、免疫疗法或其组合。此外，可使用放射疗法和/或手术。治疗的选择通常取决于原发性癌症的类型、尺寸、转移的位置、患者的年龄、一般健康状况和先前使用的治疗的类型。
全身性治疗是到达整个身体的那些治疗：
—化学疗法是使用药物破坏癌细胞。通常通过口服或静脉内途径施用药物。在另一些实施方案中，治疗是化学疗法。在一些实施方案中，化学疗法是本领域已知的任意化学疗法。在具体的实施方案中，化学疗法是辅助化学疗法。在某些实施方案中，化学疗法是紫杉烷。在其他实施方案中，紫杉烷是紫杉醇(Taxol)，多西他赛(Taxotere)或卡巴他赛。药物通常通过口服或静脉内途径施用。有时，将化学疗法与放射治疗一起使用。激素疗法基于一些激素促进癌症生长的事实。例如，妇女中由卵巢产生的雌激素有时促进乳腺癌生长。存在几种用于终止这些激素的产生的方法。一种方式是除去产生它们的器官：在妇女的情况下是除去卵巢，在男人的情况下是除去睾丸。更常见地，可使用防止这些器官产生激素或阻止激素作用于癌细胞的药剂。在多个实施方案中，治疗是激素疗法。在某些实施方案中，激素疗法是他莫昔芬和/或芳香酶抑制剂。
—免疫疗法是帮助患者的免疫系统本身抵抗癌症的治疗。存在几种类型的用于治疗转移患者的免疫疗法。这些免疫疗法包括但不限于细胞因子、单克隆抗体和抗肿瘤疫苗。
用于避免或预防骨重建的药剂通常与药用载体组合施用。
术语“载体”是指籍以施用活性成分的稀释剂或赋形剂。这样的药物载体可以是无菌液体例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液，特别地对于可注射溶液，优选用作载体。适当的药物载体描述于E.W.Martin,1995的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。优选地，本发明的载体通过州或联邦政府管理机构批准或列入美国药典或通常承认其在动物，更具体地在人类中的用途的其它药典。
用于生产本发明的药物组合物的期望的药物剂型所必需的载体和辅助物质，除其它因素外，将取决于选择的药物剂型。按照本领域普通技术人员已知的常规方法生产药物组合物的所述药物剂型。施用待使用的活性成分、赋形剂的不同方法和用于产生它们的工艺的综述可见于“Tratado de Farmacia Galénica”，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.1993年版。药物组合物的实例包括用于口服、局部或胃肠外施用的任何固体组合物(片剂、丸剂、胶囊剂、粒剂等)或液体组合物(溶液、混悬液或乳剂)。此外，如认为有必要，药物组合物可包含稳定剂、混悬剂、防腐剂、表面活性剂等。
对于在药物中的使用，骨重塑剂可以以前药、盐、溶剂化物或包合物(clathrate)的形式(分离地或与另外的活性剂组合地)存在，并且可将其与药学上可接受的赋形剂一起配制。对于其在本发明中的用途是优选的赋形剂包括糖、淀粉、纤维素、橡胶和蛋白质。在具体的实施方案中，可以以固体药物剂型(例如片剂、胶囊剂、丸剂、粒剂、栓剂、可被重建以提供液体形式的无菌晶体或无定形固体等)、液体药物剂型(例如溶液、混悬液、乳液剂、酏剂、洗剂、软膏剂等)或半固体药物剂型(凝胶、软膏剂、乳膏剂等)配制本发明的药物组合物。本发明的药物组合物可通过任何途径来施用，包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌内途径、动脉内途径、髓腔内(intramedularry)途径、鞘内途径、心室内途径、经皮途径、皮下途径、腹膜内途径、鼻内途径、经肠途径、局部途径、舌下途径或直肠途径。用于施用活性剂的不同方式、待使用的赋形剂以及其生产工艺的综述可见于Tratado de Farmacia Galénica，C.FaulíiTrillo，Luzán 5，S.A.，1993年版和Remington’s PharmaceuticalSciences(A.R.Gennaro，Ed.)，第20版，Williams&Wilkins PA，USA(2000)。药学上可接受的载体的实例在现有技术水平上是已知的，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、不同类型的湿润剂、无菌溶液等。包含所述载体的组合物可通过现有技术水平上已知的常规工艺来配制。
可以以小于10mg/千克体重，优选小于至少约50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/kg体重的剂量施用避免和预防骨重建的药剂或包含其的药物组合物。可通过注射、吸入或表面施用来施用单位剂量。在具体的实施方案中，药剂以其核准的剂量施用。
剂量取决于待治疗的病况的严重度和反应，其可在数天至数月之间变化或直至病况消退。可通过定期测量患者身体中的药剂浓度来确定最佳剂量。可从通过先前的体外测定或在动物模型中进行的体内测定获得的EC50值确定最佳剂量。可以以每日一次或少于每日一次，优选少于每2、4、8或30日一次的频率施用单位剂量。或者，可能施用起始剂量，随后施用一次或数次通常少于起始剂量的维持剂量。维持方案可包括利用范围为0.01μg-1.4mg/kg体重/日的剂量，例如10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重/日的剂量治疗患者。优选以每5、10或30天一次的频率施用维持剂量。治疗必须持续一段时间，该时间将根据患者所患病症的类型、其严重度和患者的病况而变化。治疗后，必需监控患者的进展以确定应当增加剂量(如果疾病对治疗无反应的话)还是减少剂量(如果观察到疾病的改善或者观察到不想要的副作用)。
本发明的试剂盒
在另一方面中，本发明涉及用于为患有乳腺癌的受试者确定疗法的试剂，所述试剂盒包括：a)用于定量所述受试者的样品的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位的装置；和b)用于将所述样品的定量的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位与参比c-MAF表达水平比较的装置；和c)用于基于所定量的表达水平与所述参比表达水平的比较为所述受试者确定疗法或排除考虑的疗法的工具。
先前已详细地描述了用于定量所述受试者的样品中c-MAF表达水平(包括16q23和16q22-24基因座的扩增、增加和/或易位)的装置。在一些实施方案中，用于定量c-MAF表达的工具为本文所述的任意抗体、抗原结合分子或片段。在一些实施方案中，抗体是国际申请号PCT/IB2015/059562中所述的任意抗体，该国际申请通过引用完全结合在本文中。
在优选的实施方案中，用于定量表达的工具包括一组特异性结合和/或扩增c-MAF基因的探针和/或引物。
本发明的方法的所有具体实施方案适用于本发明的试剂盒以及其用途。
用于分类患有乳腺癌的受试者的方法
在另一方面，本发明涉及用于将患有乳腺癌的受试者分类成组群的方法，所述方法包括：a)测定所述受试者的样品的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位；b)将所述样品的c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位与c-MAF表达的预先确定的c-MAF表达的参比水平相比较；和c)基于样品的所述c-MAF表达水平、拷贝数、扩增、增加或易位将所述受试者分类至组群。
在一些实施方案中，利用c-MAF基因表达水平基于患者的c-MAF表达水平将患者分成各个治疗组。在多个实施方案中，具有高c-MAF表达水平的患者接受与具有低c-MAF表达水平的患者不同的治疗。在多个实施方案中，基于患者的绝经状态将患者进一步分组。在多个实施方案中，基于患者是绝经后的还是未到绝经后的对患者分组。在某些实施方案中，基于受试者的c-MAF表达水平和/或她们的绝经后状态或未到绝经后的状态，对受试者实施不同的治疗。在一些实施方案中，对分组的患者施用避免或预防骨重建的药剂。在多个实施方案中，避免或预防骨重建的药剂是避免或预防骨退化的药剂。在其他实施方案中，避免或预防骨退化的药剂是唑来膦酸。在另一些实施方案中，利用c-MAF基因表达水平来选择治疗的患者。在一些实施方案中，将患者分组进行临床试验。
先前已详细地描述了用于定量所述受试者的样品中c-MAF表达水平(包括16q23和16q22-24基因座的扩增、增加和/或易位)的装置。
在另一个优选的实施方案中，所述组群用于进行临床试验。
在一个优选的实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
下述实施例举例说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1：验证c-MAF为转移标记。
分析验证用于检测AZURE样品中的c-MAF的IHC和FISH测定。该测定验证参数的概述可见于图1。
基于KREATECH所有的FISH技术，由Kreatech for Inbiomotion制作MAF FISH测定。探针组包含两种探针：MAF 16q23探针加作为染色体16着丝粒区域的对照的D16Z3探针。使用16q23/D16Z3探针(Inbiomotion)和Kreatech的Poseidon组织消化试剂盒验证所述测定。评分标准在事实表中定义如下：每名患者两个FISH评价结果，并且选择最高值。评分算法如下：计数20个细胞用于靶标和着丝粒扩增，如果基因计数大于2且小于等于3，那么计数50个细胞。
MAF IHC测定是基于重组单克隆抗体(记载在国际申请号PCT/IB2015/059562中，所述国际申请通过引用完全结合在本文中)。基于IHC选择抗体。利用Inbiomotion提供的DAKO AS LINK平台和对对照样本的方案，使用MAF RecMab(Inbiomotion)验证所述测定。评分标准如前在事实表中定义，并且每名患者有单个IHC HScore。评分算法为H-评分。
AZURE临床试验(Coleman等人N Eng J Med 2011；365:1396-1405和AZURE当前对照试验号，ISRCTN79831382以及ClinicalTrials.gov标识符NCT00072020)研究设计(患者用于验证MAF)的概述提供在图2中。利用在规则允许的条件下前瞻性采集的患者样品，在AZURE试验的回顾性分析中验证MAF。在招募的3360名患者中，有1,769名捐赠了肿瘤组织(52.4％)。有13个TMA(组织微阵列)(每个150名患者)(1,769名患者)。使用不同的组织评分(6,326(4x患者))，每个TMA有4个复制品。一个TMA仅有一个复制品，两个TMA有三个复制品。基于H&E分析(苏木精和曙红)(图3)(6,326)：3978个评分是可评价的(63％)，2348个是不能评价的。
对于FISH测定，存在2,067个FISH可评价的评分(56％)。有865名患者(49％)具有两个FISH可评价的评分(AZURE患者中的26％)和1,202名患者具有单一FISH评分(68％)。在4个复制品中的任一个中有567名患者不能通过FISH评价(32％)。
对IHC测定，进行病理学家评估和VisoPharm计算机辅助的评估。对于病理学家评估，评价2,232个评分(对于HScore，59％是可评价的)。有1390名患者具有IHC HScore(74％)，占总AZURE患者的39％。在四个复制品中的任一个中，有460名患者不能通过IHC评价。在VisioPharm计算机辅助的IHC染色评估中，对由病理学家评分为HScore的1309名中的1299名IHC患者进行评估并且评估每个细胞核的平均染色。MAF阳性率可见于图4A和4B。
截点优化的FISH数据可见于图5，并且按照Vipery等人JCO 2014DOI:10.1200/JCO.2013.53.3604所述进行计算。
关于分子变量，对于FISH：MAF拷贝数：数字变量和分类变量(+/-截点>＝2.5)；扩增的细胞核MAF的％(MAF CN>2)：数字+分类(截点TBD)。对于IHC分析：IHC H-评分：数字+分类(截点>＝200)，IHC OD：数字+分类(截点tBD)。分析下述临床变量：无病生存期(DFS)，无侵袭性疾病生存期(IDFS)，整体生存期(OS)，在骨中的第一次再发生，在任意时间的骨再发生，到骨中第一次DFS事件的时间，到不是在骨中的第一次DFS事件的时间，对唑来膦酸治疗的响应。
在分析MAF FISH预后值时，将来自对照组和治疗组的患者合并用于初始分析。当显示时，使用每个待分析变量的最优截点。在骨转移的时间，即，任何时间，使用死亡作为竞争事件。分析下述临床变量：到骨转移的时间(任意时间)，到骨转移的时间(作为第一次事件)，IDFS(包括身体同侧侵袭性乳腺肿瘤再发生，区域性侵袭性乳腺癌再发生，转移疾病-乳腺癌，归因于任意原因包括乳腺癌的死亡，身体对侧侵袭性乳腺癌，第二原发性非乳腺侵袭性癌)和整体生存期。
图6显示当分析所有患者(在骨转移的时间(任意时间)使用死亡作为竞争事件)时，在MAF FISH阳性患者中骨转移的风险高40％(>＝2.3)(p＝0.007)。图7显示在MAF FISH阳性患者中对于作为第一转移部位的骨有42％更高的风险(>＝2.3)(p＝0.02，多变量分析)。如图8可见，在MAF FISH阳性患者中，IDFS的风险高38％(>＝2.2)(p＝0.0002，多变量分子)(存在两年的非常早期的分离，然后曲线平行)。图9显示在MAF FISH阳性患者中，整体生存期低33％(>＝2.2)(p＝0.02，多变量分析)。
如图10可见，在对照组的MAF FISH阳性患者中，作为第一次再发生，存在更短的到骨的时间(>＝2.3)，在多变量分析中具有显著差异(HR＝0.47，p＝0.013)。
如图11可见，与未治疗的MAF非阳性患者相比，在未治疗的MAF阳性患者中，存在更短的再发生的时间(>＝2.2)(HR＝0.72，p＝0.08，多变量分析)。图12显示仅在AZURE对照患者中通过FISH确定的到IDFS的时间(排除骨再发生)。使用优化的截点2.2。
总之，按照患者的MAF FISH水平对其分组的预先确定的截点与优化的基于计算机确定的截点非常接近。阈值效应允许描绘适当(相关)治疗(或避免治疗)的清楚的组。基于对照组MAF FISH阳性患者的预后，我们观察到作为第一次转移更短的到骨的时间(HR＝0.53，多变量p＝0.03)和更短的到再发生(侵袭性疾病)的时间的趋势(HR＝0.72，p＝0.08)。
实施例2：按照MAF FISH分组评价唑来膦酸治疗效果。
评价来自实施例1所述的AZURE研究的对照组和唑来膦酸治疗组，来确定唑来膦酸治疗对MAF-分组的患者的效果。
图13(Coleman等人Lancet Oncol 2014；15:997-1006，图3)显示了在Azure试验的对照组和唑来膦酸治疗组中的患者到骨转移的施加。图14显示了对到作为第一次事件的骨转移的时间的评估。如图14可见，在对照组的MAF FISH阳性(>＝2.3)患者中，作为第一次再发生的到骨的时间更短，在多变量分析中具有显著差异(HR＝0.47，p＝0.013，多变量分析)。唑来膦酸治疗减少MAF阳性患者与非阳性患者之间作为第一再发生部位的骨发病率的差异，并且与用唑来膦酸治疗的MAF非阳性患者相比，在MAF阳性患者中在任意时间的骨转移风险中没有显著差异。
图15(Coleman et al Lancet Oncol 2014；15:997-1006，图2)显示在AZURE试验的对照组与唑来膦酸治疗的患者之间无病生存期(DFS)和无侵袭性疾病生存期(IDFS)的分析。
图16显示对照组和唑来膦酸治疗的患者之间到远端再发生的时间。在未治疗MAFIA阳性患者中存在更短的到远端再发生的时间的趋势(>＝2.2)(HR＝0.72，p＝0.08，多变量分析)。在唑来膦酸治疗组中的MAF阳性患者中存在显著更短的到再发生(侵袭性疾病)的时间(HR＝0.52，p<0.001，多变量分析)。与未治疗的MAF阳性患者相比，用唑来膦酸治疗恶化了IDFS。
图17显示依据治疗到骨转移事件的时间(任何时间)。在到骨转移的时间(任何时间)使用死亡作为竞争事件。在对照组的MAF FISH阳性患者(>＝2.3)中存在非显著性增加的骨转移风险(HR＝0.72，p＝0.18)。与MAF FISH阳性患者相比，在MAF FISH非阳性患者(<2.3)中在任何时间，唑来膦酸治疗显著降低骨转移的风险(HR＝0.52，p＝0.01)。
图18显示按照MAF拷贝数(按照预先指定的MAF截点2.5)到骨转移事件的时间(任何时间)。在到骨转移的时间(任何时间)使用死亡作为竞争事件。唑来膦酸治疗显著降低MAF FISH非阳性患者中骨转移的风险(HR＝0.65，p＝0.03)。唑来膦酸治疗在MAF阳性患者中表现出增加的骨转移风险的趋势。差异是非显著的(HR＝1.54，p＝0.22)。
图19显示当患者没有按照MAF分组时通过AZURE试验的绝经状态确定的IDFS(Coleman等人Lancet Oncol 2014；15:997-1006，图5)。
图20显示在绝经后患者中按照MAF拷贝数(按照预先指定的截点2.5的数据)使用死亡作为竞争事件确定的到骨转移事件的时间(任何时间)。MAF阳性绝经后患者(>2.5)中的治疗结果显示出减少骨转移事件数量的趋势(HR＝0.46，p＝0.26，具有有限量的事件)。用唑来膦酸治疗的MAF非阳性绝经后患者中的治疗结果的有效性低于MAF阳性绝经后患者(HR＝0.63vs HR＝0.46，具有有限量的事件)，这表明唑来膦酸治疗在MAF阳性绝经后患者中预防骨转移的明显的益处。
图21显示在未到绝经后的患者中按照MAF拷贝数(按照预先指定的截点2.5的数据)到骨转移事件的时间(任何时间)。在MAF阳性的未到绝经后的患者中存在显著恶化的唑来膦酸治疗结果，这引起骨转移事件的增加(HR＝2.44，p＝0.045)。在MAF非阳性的未到绝经后的患者中存在更好的唑来膦酸治疗结果的趋势(HR＝0.66，p＝0.08)。
图22显示唑来膦酸治疗组和对照组(排除了绝经后妇女的骨转移)的IDFS。如图22所示，使用唑来膦酸治疗绝经后患者显著改善MAF FISH阳性患者(>＝2.2)的IDFS(排除骨)，这减少了侵袭性疾病事件的数量，并且在MAF非阳性患者的IDFS(排除骨)中没有差异性。
图23显示唑来膦酸治疗组和对照组(排除未到绝经后妇女的骨转移)的IDFS。如图23所示，使用唑来膦酸治疗未到绝经后的妇女显著恶化MAF FISH阳性患者(>＝2.2)的IDFS(排除骨)，并且在MAF FISH非阳性患者的IDFS(排除骨)中没有观察到差异。
图24显示治疗组的整体生存期(OS)。使用唑来膦酸治疗MAF FISH阳性患者显著影响OS。
图25显示在AZURE对照组中无病生存期(DFS)的预后。如图25可以看出，在未治疗的MAF阳性绝经后患者中有显著更低的无病生存期。关于无病生存期：在多变量分析中(在对照患者中)FISH状态和绝经状态相互作用协变量的显著性；Chi2＝6.23，p-值＝0.013。图26显示AZURE对照组患者中整体生存期的预后。在未治疗的MAF阳性绝经后患者中存在更短的OS的趋势。关于OS：在多变量分析中(在对照患者中)FISH状态和绝经状态相互作用协变量的显著性；Chi2＝3.62，p-值＝0.057。图27显示按照MAF FISH值唑来膦酸治疗对DFS的影响。如图27可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF FISH阳性与阴性患者之间产生差异性的DFS结果，并且这些差异在绝经后和未到绝经后的妇女中发生。
图28显示按照MAF FISH值唑来膦酸治疗对绝经后患者的DFS的影响。如图28可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF阴性绝经后患者中产生更好的DFS结果(HR＝0.56，(95％ CI.，0.33-0.95)。图29显示唑来膦酸治疗对未到绝经后妇女的DFS的影响。如图29可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF阳性的未到绝经后的患者中产生最差的DFS结果。图30显示按照MAFFISH值唑来膦酸治疗对整体生存期的影响。如图30可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF阳性患者中产生显著更短的整体生存期。这些差异在绝经后和未到绝经后的妇女中发生。图31显示按照MAF FISH水平唑来膦酸治疗对绝经后患者中的整体生存期的影响。如图31可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF阴性绝经后患者中显示出更好的整体生存期结果的趋势。HR＝0.56，(95％ CI.，0.31-1.01)，但是在唑来膦酸FISH阳性患者中显示出更大的作用。图32显示按照MAF FISH值唑来膦酸治疗对未到绝经后妇女的整体生存期的影响。如图32可以看出的，唑来膦酸治疗在MAF阳性的未到绝经后的患者中产生最坏的整体生存期结果。
表1显示了目的基因(GOI)MAF的预测值对按照绝经状态分组的患者的DFS和OS的风险的总结。
表1.基于绝经状态的MAF的预测力的危害比
可以看出，在绝经后、未知的和绝经前患者中，MAF预测更短的DFS或最差的OS的风险。然而，在绝经前妇女中，MAF阳性患者是那些处于较小的风险并且更可能具有更久的DFS和更好的OS的患者。
总之，在MAF FISH阳性患者相比于对照组的非阳性患者中，在再发生的第一个部位存在显著增加的骨转移风险。(HR＝0.47，p＝0.013，截点＝2.3)，并且这种差异在用唑来膦酸治疗时减小。另外，唑来膦酸治疗在MAF FISH非阳性患者中在任何时间显著降低骨转移风险HR＝0.65，p＝0.03，截点＝2.5)。唑来膦酸治疗在MAF阳性患者中在任何时间显示出增加的骨转移风险。差异是非显著的(HR＝1.54，p＝0.22，截点＝2.5)。这种作用由绝经状态推动，并且在绝经后组中显示出最大的作用。唑来膦酸显著改善MAF FISH阳性绝经后患者的结果。然而，唑来膦酸恶化MAF FISH阳性的未到绝经后患者的结果。当使用唑来膦酸治疗时，作用依赖于侵袭性疾病的增加(减少的IDFS)(表明在未到绝经后患者中预防到骨的转移可能促进到其他部位的转移，并且最终导致作为继发性事件的到骨的转移)。
没有用唑来膦酸治疗的MAF FISH阳性患者具有更高的骨转移和侵袭性疾病(缩短的IDFS，包括和排除骨事件)的风险。在用唑来膦酸治疗的患者中，在任何时间的骨转移、IDFS(包括排除的骨事件)和整体生存期方面，与未治疗的患者相比，MAF阳性患者具有更差的结果。关于在任意时间风险的骨转移，与未治疗的患者相比，用唑来膦酸治疗的MAF阴性患者具有更好的结果。关于绝经后的妇女，用唑来膦酸治疗的MAF阳性患者具有更好的IDFS(排除骨)结果。在未到绝经后的妇女中，用唑来膦酸治疗的MAF阳性患者具有更差的IDFS(排除骨)结果。
实施方案：
1.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是未到绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值没有升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg体重的剂量施用。
2.根据实施方案1所述的用途，其中所述唑来膦酸以小于约0.05mg/kg体重或小于约0.1mg/kg体重的剂量施用。
3.根据实施方案1所述的用途，其中所述c-MAF基因表达水平的定量包括定量所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段，或者定量由所述基因编码的蛋白的水平。
4.根据实施方案3所述的用途，其中所述蛋白的水平通过蛋白印迹、ELISA、免疫组织化学或蛋白阵列定量。
5.根据实施方案4所述的用途，其中所述蛋白的水平使用包含SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:22的重链CDR2、SEQ ID NO:23的重链CDR3、包含SEQ ID NO:18的轻链CDR1、SEQ ID NO:19的轻链CDR2和SEQ ID NO:20的轻链CDR3的抗体定量。
6.根据实施方案1所述的用途，其中所述表达水平、拷贝数、扩增或增加通过定量聚合酶链式反应(PCR)或DNA或RNA阵列、FISH或核苷酸杂交技术定量。
7.根据实施方案1所述的用途，其中所述c-MAF基因的扩增或增加通过使用c-MAF基因特异性探针确定。
8.根据实施方案1所述的用途，其中所述c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加通过确定基因座16q23或16q22-q24的表达水平、拷贝数、扩增或增加而确定。
9.根据实施方案1所述的用途，其中使用FISH测量的c-MAF拷贝数≥2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
10.根据实施方案1所述的用途，其中使用FISH测量的c-MAF拷贝数<2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
11.根据实施方案1所述的用途，其中所述拷贝数作为每个细胞的平均拷贝数确定。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的用途，其中所述乳腺癌是基底样亚型的ER+乳腺癌、ER-乳腺癌、三重阴性乳腺癌或HER2+乳腺癌。
13.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值没有升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg受试者体重的剂量施用。
14.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有没有转移的乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg受试者体重的剂量施用。
15.根据实施方案13或14中任一项所述的用途，其中所述乳腺癌是基底样亚型的ER+乳腺癌、ER-乳腺癌、三重阴性乳腺癌或HER2+乳腺癌。
16.根据实施方案13或14中任一项所述的用途，其中所述c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的定量包括定量所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段，或者定量由所述基因编码的蛋白的水平。
17.根据实施方案13或14中任一项所述的用途，其中所述扩增通过原位杂交或PCR确定。
18.根据实施方案17所述的用途，其中所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH)。
19.根据实施方案13或14中任一项所述的用途，其中所述蛋白的水平使用包含SEQID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:22的重链CDR2、SEQ ID NO:23的重链CDR3、包含SEQ IDNO:18的轻链CDR1、SEQ ID NO:19的轻链CDR2和SEQ ID NO:20的轻链CDR3的抗体定量。
20.根据实施方案13或14中任一项所述的用途，所述唑来膦酸以小于约0.05mg唑来膦酸/kg受试者体重的剂量施用。
21.根据实施方案1、13和14中任一项所述的用途，其中唑来膦酸用于静脉内施用。
22.根据实施方案1、13和14中任一项所述的用途，其中唑来膦酸每30天一次施用。
本文所引用的所有公开、专利、专利申请、互联网网址和包括多核苷酸和多肽序列的登记号/数据库序列通过引用结合在本文中，如同每份公布、专利、专利申请、互联网网址或登记号/数据库序列通过引用专门且独立表示这样结合一样的程度用于所有的目的。

Claims (22)

1.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是未到绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值没有升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg体重的剂量施用。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述唑来膦酸以小于约0.05mg/kg体重或小于约0.1mg/kg体重的剂量施用。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述c-MAF基因表达水平的定量包括定量所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段，或者定量由所述基因编码的蛋白的水平。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述蛋白的水平通过蛋白印迹、ELISA、免疫组织化学或蛋白阵列定量。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述蛋白的水平使用包含SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:22的重链CDR2、SEQ ID NO:23的重链CDR3、包含SEQ ID NO:18的轻链CDR1、SEQ ID NO:19的轻链CDR2和SEQ ID NO:20的轻链CDR3的抗体定量。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述表达水平、拷贝数、扩增或增加通过定量聚合酶链式反应(PCR)或DNA或RNA阵列、FISH或核苷酸杂交技术定量。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述c-MAF基因的扩增或增加通过使用c-MAF基因特异性探针确定。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加通过确定基因座16q23或16q22-q24的表达水平、拷贝数、扩增或增加而确定。
9.根据权利要求1所述的用途，其中使用FISH测量的c-MAF拷贝数≥2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
10.根据权利要求1所述的用途，其中使用FISH测量的c-MAF拷贝数<2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述拷贝数作为每个细胞的平均拷贝数确定。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的用途，其中所述乳腺癌是基底样亚型的ER+乳腺癌、ER-乳腺癌、三重阴性乳腺癌或HER2+乳腺癌。
13.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值没有升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg受试者体重的剂量施用。
14.用于定量受试者肿瘤样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加的物质在制备制剂中的用途，所述制剂用于体外鉴别患有没有转移的乳腺癌的受试者，所述受试者适于接受旨在预防和/或治疗骨重建、改善无病生存期或整体生存期的疗法，其中所述受试者是绝经后的，其中所述鉴别包括：
i)定量所述受试者样品中c-MAF基因的表达水平、拷贝数、扩增或增加，和
ii)将在i)中所得到的表达水平、拷贝数、扩增或增加与参比值比较，其中所述参比值是来自尚未经历转移的受试者的乳腺癌肿瘤组织样品的值，
其中如果所述表达水平、拷贝数、扩增或增加相对于所述参比值升高，那么所述受试者适于接受唑来膦酸的治疗，其中所述唑来膦酸以小于约0.5、约0.1、约0.05、约0.01、约0.005、约0.001、约0.0005、约0.0001、约0.00005或约0.00001mg/kg受试者体重的剂量施用。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，其中所述乳腺癌是基底样亚型的ER+乳腺癌、ER-乳腺癌、三重阴性乳腺癌或HER2+乳腺癌。
16.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，其中所述c-MAF基因表达水平、拷贝数、扩增或增加的定量包括定量所述基因的信使RNA(mRNA)或所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)或所述cDNA的片段，或者定量由所述基因编码的蛋白的水平。
17.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，其中所述扩增通过原位杂交或PCR确定。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述原位杂交是荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)或银染原位杂交(SISH)。
19.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，其中所述蛋白的水平使用包含SEQ IDNO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:22的重链CDR2、SEQ ID NO:23的重链CDR3、包含SEQ ID NO:18的轻链CDR1、SEQ ID NO:19的轻链CDR2和SEQ ID NO:20的轻链CDR3的抗体定量。
20.根据权利要求13或14中任一项所述的用途，所述唑来膦酸以小于约0.05mg唑来膦酸/kg受试者体重的剂量施用。
21.根据权利要求1、13和14中任一项所述的用途，其中唑来膦酸用于静脉内施用。
22.根据权利要求1、13和14中任一项所述的用途，其中唑来膦酸每30天一次施用。
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