BR112015008255B1 - Métodos in vitro para diagnóstico ou prognóstico de metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata e método para classificar um indivíduo que sofre de câncer de próstata em uma coorte - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO, PROGNÓSTICO E TRATAMENTO DE METÁSTASE DE CÂNCER DE PRÓSTATA A presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de próstata que compreende determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra primária de tumor. Da mesma forma, a presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de próstata, assim como a um método para determinar a tendência de desenvolver metástase de osso com relação a metástase em outros órgãos, que compreende determinar o nível de expressão de c- MAF. Finalmente, a presente invenção se refere ao uso de um inibidor de c-MAF como alvo terapêutico para tratar o câncer de próstata.
Description
[001] O conteúdo da listagem de sequência submetido eletronicamente (“3190_0030001_SEQIDListing_ascii.txt”, 48,245 bytes, criado em 7 de Outubro de 2013) depositado com o pedido está incorporado aqui por referência em sua totali-dade.
[002]O presente pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) ao Pedido de Patente provisória U.S. No. de série 61/713,318, depositado em 12 de Outubro de 2012, e se encontra aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[003]A presente invenção se refere ao diagnóstico ou ao prognóstico de me- tástase em câncer de próstata com base em determinar se o gene c-MAF, dentro da região genômica 16q22-24, é amplificado em uma amostra primária de tumor. Da mesma forma, a presente invenção também se refere a um método para o diagnóstico ou o prognóstico de metástase em câncer de próstata, assim como a um método para projetar uma terapia customizada em um indivíduo com câncer de próstata, que compreende determinar o nível de expressão de gene c-MAF ou amplificação de 16q22- 24. Finalmente, a presente invenção se refere ao uso de um inibidor de c-MAF como um alvo terapêutico para o tratamento de metástase de câncer de próstata.
[004]Metástase, um complexo processo causado por interações elaboradas entre células de tumor e os tecidos normais circundantes em diferentes órgãos vitais, é responsável por 90 por cento de todas as mortes por câncer em pacientes com tumores sólidos. Os mecanismos moleculares e celulares que levam aos tumores primários a formarem metástases deve ser entendido de modo a melhor ir de encontro a esse grande problema prejudicial a vida. A identificação de genes e mecanismos de metástase é essencial para o entendimento da biologia básica dessa condição letal e de suas implicações na prática clínica.
[005]Câncer de próstata é uma forma de câncer que se desenvolve na prós-tata, uma glândula no sistema reprodutor masculino. A maior parte dos cânceres de próstata são de desenvolvimento lento; entretanto, há casos de cânceres de próstata agressivos. As células cancerígenas podem sofrer metástase (se espalhar) a partir da próstata para outras partes do corpo, particularmente os ossos e os nodos linfáticos. Câncer de próstata pode causar dor, dificuldade de urinar, problemas durante o ato sexual, ou disfunção erétil. Outros sintomas podem potencialmente se desenvolver durante os estágios tardios da doença.
[006]Os coeficientes de detecção de cânceres de próstata variam amplamente pelo mundo, com a South e East Asia detectando menos frequentemente do que na Europa, e especialmente nos Estados Unidos. câncer de próstata tende a se desenvolver em homens com a idade de cinquenta embora seja um dos tipos mais frequentes de câncer em homens, muitos nunca têm sintomas, não sofrem nenhuma terapia, e eventualmente morrem de outras causas. Cerca de dois terços dos casos são de desenvolvimento lento, e o outro terço mais agressivo e de desenvolvimento rápido.
[007]Muitos fatores, incluindo os fatores genéticos e dieta, estão implicados no desenvolvimento de câncer de próstata. A presença de câncer de próstata pode ser indicada por sintomas, exame físico, antígeno específico de próstata (PSA), ou biópsia. O teste de PSA aumenta a detecção do câncer, mas não reduz a mortalidade. Adicionalmente, a leitura do teste de próstata é controvérsia no momento e pode levar a consequências desnecessárias, e mesmo danosas em alguns pacientes. No entanto, a suspeita de câncer de próstata é tipicamente confirmada ao se realizar uma biópsia da próstata e examinar a mesma sob microscópio. Testes adicionais, tais como leituras de CT e cintilografias ósseas, podem ser realizados para determinar se o câncer de próstata se espalhou.
[008]Estratégias de gerenciamento para o câncer de próstata devem ser gui-adas pela severidade da doença. Muitos tumores de baixo risco podem ser seguidos com segurança com acompanhamento ativo. O tratamento curativo em geral envolve cirurgia, várias formas de terapia de radiação, ou, menos comum, criocirurgia; terapia hormonal e quimioterapia são em geral reservados para os casos de doença avan-çada (embora a terapia hormonal possa ser dada com radiação em alguns casos).
[009]A idade e a saúde subjacente do homem, a extensão da metástase, a aparência sob microscópio e a resposta do câncer ao tratamento inicial são importan-tes para determinar o resultado da doença. A decisão se tratar ou não câncer de prós-tata localizado (um tumor que é contido dentro da próstata) com intento curativo é um desafio para o paciente entre os benefícios esperados e os efeitos prejudiciais em termos de sobrevida do paciente e de qualidade de vida.
[010]As causas específicas de câncer de próstata permanecem desconheci-das. Antecedentes genéticos podem contribuir para o risco de câncer de próstata, conforme sugerido por associações com raça, família, e variantes específicas de gene. Nenhum gene isoladamente é responsável pelo câncer de próstata; muitos di-ferentes genes estiveram implicados. Mutações em BRCA1 e BRCA2, importantes fatores de risco para o câncer de ovário e o câncer de mama em mulheres, estiveram também implicados em câncer de próstata. Outros genes ligados incluem o gene He-reditário de câncer de próstata 1 (HPC1), o receptor androgênio, e o receptor de vita-mina D. TMa fusão do gene da família PRSS2-ETS, especificamente TMPRSS2-ERG ou TMPRSS2-ETV1/4 promove o desenvolvimento de células cancerígenas.
[011]A perda de genes de supressão do câncer, precocemente na carcinogê- nese prostática, foram localizadas nos cromossomos 8p, 10q, 13q,e 16q. Mutações P53 em câncer primário de próstata são relativamente baixos e são mais frequente-mente observados em conjuntos de metástases, uma vez que, as mutações p53 são um evento tardio na patologia de câncer de próstata. Outros supressores de tumor se pensa desempenharem um papel em câncer de próstata incluem PTEN (gene) e KAI1. Até 70 por cento dos homens com câncer de próstata perderam uma cópia do gene PTEN no momento do diagnóstico. A relativa frequência de perda de E-caderina e CD44 foi também observada.
[012]Câncer de próstata é classificado como um adenocarcinoma, ou câncer glandular, que se inicia quando as células glandulares da próstata secretam sêmen sofrem mutação para células cancerígenas. A região da glândula prostática onde o adenocarcinoma é mais comum é a zona periférica. Inicialmente, pequenos grumos de células cancerígenas permanecem confinados na até então glândula prostática normal, uma condição conhecida como carcinoma in situ ou neoplasia intraepitelial prostática (PIN). Embora não haja prova de que a PIN seja um câncer precursor, a mesma está proximamente associada com câncer. Com o tempo, as referidas células cancerígenas começam a multiplicar e espalhar ao tecido prostático circundante (o estroma) formando um tumor. Eventualmente, o tumor pode se desenvolver suficien-temente grande para invadir os órgãos próximos tais como as vesículas seminais ou o reto, ou as células tumorais podem desenvolver a capacidade de viajar pela corrente sanguínea e pelo sistema linfático. câncer de próstata é considerado um tumor maligno pelo fato de que o mesmo é uma massa de células que pode invadir outras partes do corpo. A referida invasão de outros órgãos é chamada de metástase. câncer de próstata mais comumente sofre metástases nos ossos, nodos linfáticos, e pode invadir o reto, bexiga e ureteres inferiores após a progressão local.
[013]RUNX2 é um fator de transcrição que evita que as células cancerígenas sofram apoptose desse modo contribuindo para o desenvolvimento de câncer de próstata.
[014]A cascata de sinalização PI3k/Akt funciona com o fator de desenvolvi-mento transformante beta / cascata de sinalização SMAD para garantir a sobrevivên-cia celular do câncer de próstata e a proteção contra apoptose. Admite-se a hipótese de que o inibidor de apoptose ligado a X (XIAP) promova a sobrevivência e desenvol-vimento de células de câncer de próstata e é um alvo de pesquisa pelo fato de que se esse inibidor puder ser eliminado então a cascata de apoptose pode realizar a sua própria função em evitar a proliferação das células cancerígenas. Cicotina-1 inibidor de macrófago (MIC-1) estimula a adesão focal de quinase (FAK) sinalizando um tra-jeto que leva à sobrevivência e ao desenvolvimento de células de câncer de próstata.
[015]O receptor de androgênio ajuda as células de câncer de próstata a so-breviver e é um alvo para muitos estudos de pesquisas anticâncer; até o momento, inibir o receptor do androgênio apenas provou ser eficaz em estudos com ratos. Antí- geno de membrana específico de próstata (PSMA) estimula o desenvolvimento de câncer de próstata ao aumentar os níveis de folato para as células cancerígenas usa-rem para sobreviver e se desenvolver; o PSMA aumenta os folatos disponíveis para uso ao hidrolisar folatos glutamatos.
[016]O único teste que pode amplamente confirmar o diagnóstico de câncer de próstata é a biópsia, a remoção de pequenas peças da próstata para exame mi-croscópico. Entretanto, antes da biópsia, um teste menos invasivo pode ser condu-zido.
[017] Há também diversos outros testes que podem ser usados para se coletar mais informação sobre a próstata e o trato urinário. O exame retal digital (DRE) pode permitir que o médico detecte anormalidades na próstata. A cistoscopia mostra o trato urinário a partir de dentro da bexiga, usando um tubo delgado flexível com câmera inserido dentro da uretra. A ultrassonografia transretal cria uma foto da próstata usando ondas de som a partir da sonda no reto.
[018]Ultrassom (US) e Imagem de Ressonância Magnética (MRI) são os dois principais métodos de imagem usados para a detecção de câncer de próstata.
[019]Uma micrografia que mostra um câncer de próstata (adenocarcinoma convencional) com invasão perineural. Coloração H&E.
[020]Se há uma suspeita de câncer, uma biópsia é oferecida de imediato. Durante a biópsia um urologista ou radiologista obtém amostras de tecido a partir da próstata por meio do reto. Uma pistola de biópsia insere e remove agulhas de núcleo oco especiais (em geral de três a seis em cada lado da próstata) em menos do que um segundo. Biopsias de próstata são realizadas de modo rotineiro em base de paci-ente externo e raramente requer hospitalização. Cinquenta por cento dos homens re-portam desconforto durante a biópsia da próstata.
[021]As amostras de tecido são então examinadas sob microscópio para de-terminar se células cancerígenas estão presentes, e para se avaliar as características microscópicas (ou pontuação de Gleason) de qualquer câncer encontrado. Antígeno de membrana específico de próstata é uma carboxipeptidase de transmembrana e exibe atividade de folato hidrolase. A referida proteína é superexpressa em tecidos de câncer de próstata e está associada com uma pontuação de Gleason mais elevada.
[022]Amostras de tecido podem ser coradas para a presença de PSA e de outros marcadores de tumor de modo a determinar a origem das células malignas que sofreram metástase.
[023]Carcinoma de pequenas células é um tipo muito raro (1%) de câncer de próstata que não pode ser diagnosticado usando o PSA. Desde 2009 os pesquisado-res estão tentando determinar o melhor modo de ler esse tipo de câncer de próstata pelo fato de que o mesmo é um tipo de câncer de próstata relativamente desconhecido e raro mas muito sério e de rápida disseminação para outras partes do corpo. Possíveis métodos incluem métodos de separação cromatográfica por espectrometria de massa, ou captura de proteína por imunotestes ou anticorpos imunizados. O método de teste irá envolver quantificar a quantidade do biomarcador PCI, com referência a Pontuação de Gleason. Esse teste não só é rápido, mas também é sensível. Ele pode detectar pacientes na zona cinza de diagnóstico, particularmente os com uma relação de Antígeno Específico de Próstata total para soro livre de 10-20%.
[024]A expressão de Ki-67 por imunohistoquímica pode ser um significante preditor de resultado do paciente para homem com câncer de próstata.
[025]Uma parte importante de se avaliar o câncer de próstata é determinar o estágio, ou o quão longe o câncer se disseminou. Conhecendo o estágio ajuda a de-finir o prognóstico e é útil quando se seleciona terapias. O sistema mais comum é o sistema TNM de quatro estágios (abreviado a partir de Tumor/Nodos/Metástases). Os seus componentes incluem o tamanho do tumor, o número de nodos linfáticos envolvidos, e a presença de quaisquer outras metástases.
[026]A distinção mais importante produzida por qualquer sistema de estágio é se o câncer está ainda ou não confinado à próstata. No sistema TNM, canceres clínicos T1 e T2 são observados apenas na próstata, enquanto os canceres T3 e T4 se disseminaram para qualquer lugar. Diversos testes podem ser usados para se observar por evidências de disseminação. Os referidos incluem tomografia computadorizada para avaliar a disseminação dentro da pélvis, cintilografia óssea para se pesquisar por disseminação nos ossos, e Imagem de Ressonância Magnética endo- retal para se avaliar proximamente a cápsula prostática e as vesículas seminais. Cin- tilografia óssea deve revelar a aparência osteoblástica em virtude de uma maior den-sidade óssea nas áreas de metástase nos ossos — diferente do que é observado em muitos outros cânceres que sofreram metástase.
[027]Após a biópsia da próstata, um patologista observa as amostras sob um microscópio. Se câncer estiver presente, o patologista reporta a categoria do tumor. A categoria relata o quanto o tecido tumoral difere a partir do tecido normal da próstata e sugere o quão rápido o tumor é provável de se desenvolver. O sistema de Gleason é usado para categorizar os tumores de próstata a partir de 2 a 10, onde a Pontuação de Gleason de 10 indica as maiores anormalidades. O patologista atribui um número a partir de 1 a 5 para o padrão mais comum observado sob o microscópio, então realiza a mesma coisa para o segundo padrão mais comum. A soma dos referidos dois números é a Pontuação de Gleason. O estágio de Whitmore-Jewett é outro mé-todo algumas vezes usado.
[028]A leitura do câncer de próstata é uma tentativa de se encontrar cânceres não suspeitos, e pode levar a testes de acompanhamento mais específicos tais como a biópsia, com amostras de células obtidas para estudo mais próximo. As opções in-cluem o exame retal digital (DRE) e um teste no sangue para antígeno específico de próstata (PSA). A referida leitura é controvérsia e, em alguns pacientes, pode levar a consequências desnecessárias, e até danosas. Uma análise de 2010 concluiu que a leitura de rotina seja com um DRE ou PSA não é suportada pelas evidências de que não há benefício de mortalidade a partir da leitura. Mais recentemente, a United States Preventive Services Task Force (USPSTF) se colocou contra o teste de PSA para a leitura de câncer de próstata em homens saudáveis. Essa recomendação da USPSTF, sancionada em Outubro de 2011, é com base em estudos de “revisão de evidências” que concluíram que “Antígeno específico de próstata - com base na leitura resulta em pequena ou nenhuma redução em câncer de próstata - específico para mortalidade e está associado com danos relacionados a avaliação subsequente e tratamentos, al-guns dos quais podem ser desnecessários.
[029]Testes modernos de leitura observaram cânceres que podem nunca ter se desenvolvido em doença séria, e que “a relativa redução de risco por remoção cirúrgica da próstata ou tratamento da mesma com radiação pode não superaros efei-tos colaterais substanciais dos referidos tratamentos”, uma opinião também comparti-lhada por CDC.
[030]Se o câncer tiver uma disseminação além da próstata, as opções de tra-tamento mudam significantemente, de modo que a maior parte dos médicos que tra-tam câncer de próstata usam uma variedade de nomogramas para prever a probabi-lidade de disseminação. Tratamento por espera vigilante / vigilância ativa, terapia de radiação de feixe externo, braquiterapia, criocirurgia, HIFU, e cirurgia, são, em geral, oferecidos aos homens cujo câncer permanece dentro da próstata. Terapia hormonal e quimioterapia são com frequência reservados para a doença que tem disseminação além da próstata. Entretanto, há exceções: terapia de radiação pode ser usada para alguns tumores avançados, e terapia hormonal é usada para alguns estágios precoces de tumores. Crioterapia (o processo de congelamento do tumor), terapia hormonal, e quimioterapia podem também ser oferecidos se o tratamento inicial falhar e o câncer progredir.
[031]Se a doença tiver alcançado estágio clínico T3 ou T4, a mesma é classi-ficada como câncer de próstata avançado. câncer de próstata avançado com metás- tase nos ossos ou metástase de linfo nodo é mais provável de causar os sintomas de câncer de próstata do que um estágio precoce da doença. Os médicos em geral che-cam por metástase nos ossos e metástase de linfo nodo que são denotados respectivamente por M e N em estágio clínico.
[032]Em estágio clínico T3, o tumor se estendeu além da cápsula prostática, possivelmente dentro das vesículas seminais, e é especificamente chamado de ex-tensão extra prostática. Extra prostática quer dizer “independente da glândula prostá- tica” em estágio clínico T4, a doença invade os órgãos circundantes (diferente das vesículas seminais) tal como o colo da bexiga, esfíncter externo, ou reto.
[033]Metástase é mais provável ocorrer durante o câncer de próstata avan-çado. A doença metastática se refere a câncer de próstata que deixou a glândula prostática e os seus órgãos vizinhos. A metástase de câncer de próstata avançada em ossos e metástase em linfo nodo, que pode ser local ou distante, estão ambas associadas com câncer de próstata avançado. Metástases podem envolver sintomas que não estão no Guia de tratamento para o câncer de próstata.
[034]O corpo produz um fluido chamado linfa que contém células sanguíneas vermelhas e circula através do sistema linfático. Nodos linfáticos são pequenos órgãos ovais ou circulares que filtram o referido fluido. Células cancerosas que circulam através do corpo podem se tornar aprisionadas nos nodos linfáticos. Uma vez capturadas, as células cancerosas podem começar o seu ciclo de divisão não saudável e resultar em metástase de linfo nodo.
[035]Há dois tipos de metástase de linfo nodo: local e distante. Metástase de linfo nodo local é designada por estágio clínico N1. Dois nodos linfáticos se encontram em cada lado da bexiga. Pelo fato dos referidos nodos estarem próximos da glândula prostática, metástase é considerada local. Se as células cancerosas começam a crescer em qualquer outro linfo nodo, a metástase é considerada distante. Metástase de linfo nodo distante é denotada por estágio clínico M1a.
[036]Metástase de câncer de próstata em osso os principais casos de câncer nos ossos são relativamente raros. Pacientes que desenvolvem câncer nos ossos são mais prováveis de desenvolver a doença como um resultado de metástase de câncer de próstata avançada. Em câncer de próstata, a extensão que leva a doença nos os-sos é designada por a estágio clínico M1b. Se a pessoa desenvolve doença nos ossos como um resultado de câncer de próstata, ela agora não tem câncer nos ossos. Pelo fato do câncer ser classificado de acordo com onde o mesmo se originou, ela tem câncer de próstata com metástase nos ossos.
[037]Metástases esquelética ocorre em mais do que 80% de câncer de prós-tata em estágio avançado e ela confere um alto nível de morbidade, uma taxa de sobrevivência de 5 anos de 25% e sobrevivência média de aproximadamente 40 me-ses. Das estimadas um milhão de mortes anuais associadas com doença metastática nos ossos em USA, EU e Japão, aproximadamente 20% são casos de câncer de próstata em estágio avançado. O tratamento natural do câncer de próstata metastático é amplamente sensível a terapia de privação de androgênio, mas a progressão para o câncer de próstata resistente a castração ocorre 18-20 meses após o início do trata-mento. Doença metastática nos ossos causa alguns dos sintomas mais estressantes de câncer em estágio avançado; a estimativa indica que a dor no tratamento de osso é requerida em aproximadamente 30% dos homens com câncer de próstata resistente a castração e associada com doença metastática nos ossos; com 22% necessitando de tratamento para fraturas esqueléticas singulares ou múltiplas patológicas; 7% para compressão da coluna vertebral; 3-4% para hemiparesia ou paresia. Primeiramente a intervenção terapêutica no diagnóstico de metástase de doença nos ossos em geral irá envolver quimioterapia sistêmica, terapia hormonal e bisfosfonatos ou Denosumab, que são em sua maioria opções paliativas com a intensão de reduzir a dor.
[038]Em osso esquelético saudável, um equilíbrio igual de formação de matriz de osso novo e reabsorção de matriz de osso velho é alcançado por meio da atividade coordenada de osteoclastos de degradação óssea e de osteoblastos de formação e osso. Durante a doença de metástase nos ossos, o equilíbrio normal de reabsorção e de formação de osso é corrompido pelas interações homotípicas e heterotípicas de célula a célula que ocorrem entre as células tumorais invasivas, osteoblastos e oste- oclastos. A maioria dos pacientes com tumores secundários nos ossos - incluindo os associados com câncer de próstata resistente a castração - presentes com lesões osteolíticas. Portanto, a maioria das estratégias de tratamento em uso atualmente ou sob avaliação em doença metastática nos ossos foi projetada para proteger a matriz do osso a partir da aumentada atividade de degradação óssea dos osteoclastos. Uma complicação adicional que se apresenta em mais do que 80% dos homens com câncer de próstata resistente a castração e doença de metástase nos ossos são lesões oste- oescleróticas - também conhecida como lesões de formação do osso ou lesões os- teoblásticas - ou uma combinação de ambas, lesões osteolíticas e lesões osteoescle- róticas - também referidas como lesões mistas. Lesões osteoescleróticas são tipificadas por depósitos de osso com múltiplas camadas de fibrilas de colágeno do tipo I pobremente organizadas que têm uma aparência tecida e reduzida resistência mecânica.
[039]Células de câncer de próstata preservam, entre cada subtipo, mudanças de transcrição induzidas por aberração de genoma com alta fidelidade. Os genes do-minantes resultantes revelam eventos moleculares que prevêm o resultado metastá- tico apesar da existência de substancial heterogeneidade genômica, de transcrição, translacional, e biológica no sistema geral. Entretanto, é desconhecido se o histórico de desenvolvimento de um câncer pode resultar em mediadores diferentes ou comuns de metástase específica de campo. Fatores predisponentes relacionados à célula de origem podem engendrar diferentes barreiras de limite de taxa durante a progressão metastática. Aqui, foi proposto o uso de um novo biomarcador como um fator de prognóstico em tumores primários que prevêm futuros eventos de metástase nos ossos. Adicionalmente, foi também proposto o uso do referido gene como um alvo terapêutico potencial para evitar, parar e curar as metástases nos ossos derivados do câncer de próstata.
[040]Os presentes inventores determinaram que identificar o equilíbrio de si-nais que afetam células disseminadas de metástase nos ossos em decorrência do câncer de próstata proporciona uma informação valiosa para estabelecer o prognós-tico de, e para a intervenção terapêutica preventiva contra, doença. Com base no nível de expressão de c-MAF e amplificação genômica de 16q22-24 genuíno ER+ de me- tástase nos ossos decorrente de câncer de mama, incluindo gene MAF, contribuição de metástase nos ossos, e particularmente metástase osteolítica de osso, os presentes inventores identificaram que 16q22-24, incluindo o gene MAF, é também responsável por acionar as lesões metastáticas em osso por câncer de próstata, em particular metástase nos ossos osteolíticas por câncer de próstata.
[041]Os presentes inventores identificaram - c-MAF como marcador associ-ado com uma maior tendência de câncer de próstata em causar metástase e, particu-larmente, metástase nos ossos. A referida super expressão parece ser em virtude de uma amplificação do locus 16q22-q24 no qual o gene c-MAF está localizado.
[042]Os níveis de expressão de c-MAF foram estudados em uma microestru- tura de tecido composta de biópsias de tumor primário da próstata incluindo 5 tumores que desenvolveram metástase no osso em qualquer tempo, 3 que desenvolveram metástase em outros campos exceto osso e um mínimo acompanhamento clínico de 5 anos e 29 tumores primários de próstata que nunca desenvolveram metástase com um acompanhamento clínico mínimo de 5 anos, a expressão da proteína c-MAF em células tumorais e biópsia se correlaciona positivamente com diferentes parâmetros clínicos, incluindo metástase e metástase nos ossos. Adicionalmente, os inventores associaram a amplificação do locus genômico 16q22-q24, incluindo o gene c-MAF, com a presença de metástase em indivíduos com câncer de próstata e, em particular, em câncer de próstata que formou metástase nos ossos.
[043]Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um mé-todo in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata e/ou o prognóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata que compreende (i)quantificar o gene c-MAF ou nível de expressão da proteína ou ganho de número de cópia em uma amostra de tumor do referido indivíduo e (ii)comparar o nível de expressão ou número de cópia anteriormente obtido com o nível de expressão ou cópias do referido gene em uma amostra de controle, em que se os níveis de expressão do referido gene são aumentados com re-lação aos níveis de expressão do referido gene na amostra de controle, então o refe-rido indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[044]Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia customizada para um indivíduo com câncer de próstata que compreende (i)quantificar o gene c-MAF ou nível de expressão da proteína em uma amos-tra de tumor do referido indivíduo e (ii)comparar o nível de expressão anteriormente obtido com o nível de expres-são do referido gene em uma amostra de controle, em que se os níveis de expressão estão aumentados com relação aos níveis de expressão do referido gene na amostra de controle, então o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar uma/ou tratar a metástase. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é então administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos, e em que se o nível de expressão é aumentado com relação ao referido valor de referência, então o referido indivíduo não é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar, inibir e/ou tratar a metástase nos ossos. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo então não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos.
[045]Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia customizada para um indivíduo com câncer de próstata com metástase nos ossos que compreende (iii)quantificar o gene c-MAF ou nível de expressão da proteína em uma amostra de tumor metastática em osso do referido indivíduo e (iv)comparar o nível de expressão obtido na etapa (i) com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle, em que se o gene c-MAF ou nível de expressão das proteínas são aumenta-dos com relação aos níveis de expressão do referido gene ou proteína na amostra de controle, então o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar a degradação óssea. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é então administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos, e em que se o gene c-MAF ou os níveis de expressão de proteína são aumen-tados com relação ao referido valor de referência, então o referido indivíduo não é susceptível para receber a terapia para evitar a degradação óssea. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo então não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos.
[046]Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata que compreende determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra de tecido tumoral do referido indivíduo; em que se o referido gene é amplificado ou translocado com relação a uma amostra de controle, então o referido indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de de-senvolver metástase. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é en-tão administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita ou inibe a metás- tase nos ossos.
[047]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para a previsão do resultado clínico de um paciente que sofre de câncer de próstata, que compreende determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra do re-ferido indivíduo com relação a um número de cópia do gene de referência em que uma amplificação do gene c-MAF com relação ao referido número de cópia do gene de referência é indicativo de um pobre resultado clínico. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é então administrado com pelo menos um fármaco tera-pêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos. Se a referida amplificação não é observada então o indivíduo não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos. Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método in vitro para a previsão do resultado clínico de um paciente que sofre de câncer de próstata que compreende determinar se o gene c-MAF é translocado em uma amostra do referido indivíduo em que a transloca- ção do gene c-MAF (i.e. t(14,16)) é indicativo de um pobre resultado clínico.
[048]Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um agente de inibição de c-MAF na preparação de um produto medicinal para tratar e/ou evitar metástase de câncer de próstata, em particular metástase nos ossos.
[049]Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um agente capaz de impedir ou evitar degradação óssea na preparação de um produto medicinal para o tratamento de metástase nos ossos em um indivíduo que sofre de câncer de próstata e tendo níveis elevados de c-MAF em uma amostra metastática de tecido tumoral com relação a uma amostra de controle.
[050]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a previsão de metástase nos ossos de um câncer de próstata em um indivíduo que sofre do referido câncer, o kit compreendendo: a) meios para determinar a translocação do gene c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; e b) meios para comparar a transloca- ção de c-MAF na referida amostra para a amostra c-MAF de referência. A presente invenção também se refere ao uso do referido kit para prever metástase nos ossos de um câncer de próstata em um indivíduo que sofre do referido câncer. Em uma modalidade, o indivíduo é então administrado ou excluído de pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos com base nos resultados do uso do kit.
[051]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a previsão de metástase nos ossos de um câncer de próstata em um indivíduo que sofre do referido câncer, o kit compreendendo: a) meios para quantificar a amplificação de gene c-MAF, amplificação ou translocação do locus 16q23 ou 16q22-24 em uma amostra do referido indivíduo; e b) meios para comparar o nível de gene c-MAF amplificado, amplificação ou translocação do locus 16q23 ou 16q22-24 na referida amostra de referência.
[052]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a previsão do resultado clínico de um indivíduo que sofre a partir de metástase nos ossos em decorrência de um câncer de próstata, o kit compreendendo: a) meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; e b) meios para comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de expressão de referência de c-MAF. A presente invenção também se refere ao uso do referido kit para prever o resultado clínico de um indivíduo que sofre de metástase nos ossos em decorrência de um câncer de próstata. Em uma modalidade, o indivíduo é então administrado ou excluído de pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos com base nos resultados do uso do kit.
[053]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para determinar a terapia para um indivíduo que sofre de câncer de próstata, o kit compreendendo: a) meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; b) meios para comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de expressão de referência de c-MAF; e c) meios para determinar a terapia para evitar e/ou reduzir metástase nos ossos no referido indivíduo com base na comparação do nível quantificado de expressão ao nível de expressão de referência. A presente invenção também se refere ao uso do referido kit para determinar a terapia para um indivíduo que sofre de câncer de próstata. Em uma modalidade, o indivíduo é então administrado ou excluído de pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos com base nos resultados do uso do kit.
[054]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit compreen-dendo: i) um reagente para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amos-tra de um indivíduo que sofre de câncer de próstata, e ii) um ou mais índices de nível de expressão de gene c-MAF que foram predeterminados para se correlacionar com o risco de metástase nos ossos. A presente invenção também se refere ao uso do referido kit para prever metástase nos ossos de um câncer de próstata em um indiví-duo que sofre do referido câncer. Em uma modalidade, o indivíduo é então adminis-trado ou excluído de pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos com base nos resultados do uso do kit.
[055]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para a tipagem da amostra de um indivíduo que sofre de câncer de próstata, o método compreendendo: a) proporcionar a amostra do referido indivíduo; b) quantificar o nível de expressão de c-MAF na referida amostra; c) realizar a tipagem da referida amostra por comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF a um nível de referência predeterminado de expressão de c- MAF; em que a referida realização da tipagem proporciona informação de prognós-tico relacionada ao risco de metástase nos ossos no referido indivíduo. Em uma mo-dalidade, o indivíduo é administrado ou excluído de pelo menos um agente terapêutico com base na informação de prognóstico proporcionado por realizar a tipagem.
[056]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para evitar ou reduzir o risco de metástase nos ossos em um indivíduo que sofre de câncer de próstata, o referido método compreendendo administrar ao referido indivíduo um agente que evita ou reduz a metástase nos ossos, em que o referido agente é administrado de acordo com um regime de tratamento determinado a partir da quantificação do nível de expressão de c-MAF no referido indivíduo.
[057]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método de classi-ficar um indivíduo que sofre de câncer de próstata em uma coorte, compreendendo: a) determinar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; b) comparar o nível de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de refe-rência predeterminado de expressão de c-MAF; e c) classificar o referido indivíduo em uma coorte com base no referido nível de expressão de c-MAF na amostra. Em um aspecto particular, a coorte é usada para a condução de um teste clínico.
[058]Os inventores mostraram que o gene c-MAF e proteína são superexpres- sos em metástase de câncer de próstata, e que os níveis de expressão de c-MAF em tumores primários de próstata estão correlacionados a diferentes parâmetros clínicos de câncer de próstata, particularmente com probabilidade de recorrência e de metás- tase. Assim, a superexpressão de c-MAF é associada com o início e o alto risco de metástase de tumor de próstata, particularmente em osso. Portanto, c-MAF pode ser usada como um marcador para o diagnóstico e/ou o prognóstico de metástase, em particular metástase nos ossos, em um indivíduo com câncer de próstata.
[059]Assim em um aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata que compreende (v)quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tumor (e.g., tecido tumoral de próstata, célula de tumor de próstata circulante, DNA de tumor de próstata circulante) a partir do referido indivíduo e (vi)comparar o nível de expressão anteriormente obtido com o nível de ex-pressão do referido gene em uma amostra de controle, em que se o nível de expressão do referido gene é aumentado com relação ao nível de expressão do referido gene na amostra de controle, então o referido indi-víduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desen-volver metástase, em um campo preferido de metástase nos ossos.
[060]O gene c-MAF (v-maf oncogene homólogo de fibrosarcoma musculoa- poneurótico (aves) também conhecido como MAF ou MGC71685) é um fator de transcrição contendo um zipper de leucina que atua como um homodímero ou um hetero- dímero. Dependendo do campo de ligação a DNA, a proteína codificada pode ser um ativador ou repressor de transcrição. A sequência de DNA que codifica c-MAF é descrita no banco de dados de NCBI sob o número de acesso NG_016440 (SEQ ID NO: 1)(codificação)). A sequência genômica de c-MAF é determinada em SEQ ID NO:13. Os métodos da presente invenção podem utilizar seja a sequência de codificação ou a sequência genômica de DNA. Dois RNAs mensageiros são transcritos a partir da referida sequência de DNA, cada um dos quais acarretará em uma das duas isoformas de proteína de c-MAF, a isoforma α e a isoforma β. As sequências de DNA complementar para cada uma das referidas isoforma são descritas, respectivamente, no banco de dados de NCBI sob os números de acesso NM_005360.4 (SEQ ID NO: 2) e NM_001031804.2 (SEQ ID NO: 3). O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico de triplo-negativo e câncer de mama ER+ é descrito no Pedido Internacional No. PCT/IB2013/001204, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico de câncer de tireoide é descrito em Pedido provisório US No. 61/801,769, que é aqui incorporado por referência em sua totali-dade. O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico de carcinoma de célula renal é descrito no Pedido provisório US No. 61/801,642, que é aqui incorporado por refe-rência em sua totalidade. O uso de um gene de interesse, incluindo c-MAF e o locus do gene c-MAF, para determinar o prognóstico de um indivíduo que sofre câncer de mama é descrito no Pedido provisório US No. 61/801,718, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico de câncer de pulmão é encontrado no Pedido Internacional No. PCT/US2013/044584, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[061]No contexto da presente invenção, “metástase” é entendido como a pro-pagação de um câncer a partir do órgão onde o mesmo iniciou para um diferente órgão. A mesma em geral ocorre através do sangue ou sistema linfático. Quando a disseminação das células cancerígenas forma um novo tumor, o último é chamado de um tumor secundário ou metastático. As células cancerígenas que formam o tumor secundário são tais como aquelas do tumor original. Se um câncer de próstata, por exemplo, se dissemina (sofre metástases) para o osso, o tumor secundário é formado de células malignas de câncer de próstata. A doença no osso é câncer de próstata metastático e não câncer nos ossos. Em uma modalidade particular do método da presente invenção, a metástase é câncer de próstata que se disseminou (sofreu me- tástase) para o osso.
[062]Na presente invenção, “diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata” é entendido como identificar a doença (metástase) por meio de estudar os seus sinais, i.e., no contexto da presente invenção por meio do maior nível de expressão de gene c-MAFs (i.e., superexpressão) no tecido tumoral do câncer de próstata com relação a uma amostra de controle.
[063]Na presente invenção “prognóstico da tendência de desenvolver metás- tase em um indivíduo com câncer de próstata” é entendido como saber com base nos sinais se o câncer de próstata que o referido indivíduo tem irá sofrer metástase no futuro. No contexto da presente invenção, o sinal é a superexpressão do gene de c- MAF em tecido tumoral.
[064]O método da presente invenção compreende em uma primeira etapa quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido tumoral a partir de um indivíduo.
[065]Em uma modalidade preferida, o primeiro método da presente invenção compreende quantificar apenas o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, i.e., o método não envolve determinar o nível de expressão de qualquer marcador adicional.
[066]Como usado aqui, o termo “indivíduo” ou “paciente” se refere a todos os animais classificados como mamíferos e incluem mas não são limitados a animais domésticos e de fazenda, primatas e humanos, por exemplo, seres humanos, prima-tas não humanos, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, ou roedores. Preferivelmente, o indivíduo é um homem ou mulher humana de qualquer idade ou raça.
[067]Os termos “pobre” ou “bom”, como usados aqui se referem a um resul-tado clínico, significam que o indivíduo mostrará um resultado favorável ou desfavo-rável. Como será entendido por aqueles versados na técnica, uma referida avaliação de probabilidade, embora preferida ser, pode não ser correta em 100% dos indivíduos a serem diagnosticados. O termo, entretanto, requer que uma porção estatisticamente significante de indivíduos possa ser identificada como tendo uma predisposição para um determinado resultado. Se uma porção é estatisticamente significante pode ser determinado prontamente por aqueles versados na técnica usando várias ferramentas de avaliação estatística bem conhecidas, e.g., determinação de intervalos de confiança, determinação de valor p, teste de Student, teste de Mann-Whitney, etc. os detalhes são encontrados em Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Intervalos de confiança preferidos são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% pelo menos cerca de 95%. Os valores p são, preferivelmente, 0,05, 0,01, 0,005, ou 0,0001 ou menos. Mais preferivelmente, pelo menos cerca de 60 por cento, pelo menos cerca de 70 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento ou pelo menos cerca de 90 por cento dos indivíduos de uma população podem ser adequadamente identificados pelo método da presente invenção.
[068]Na presente invenção “amostra de tumor” é entendido como uma amos-tra (e.g., tecido tumoral, célula de tumor circulante, DNA de tumor circulante) originário a partir de câncer primário de tumor de próstata. A referida amostra pode ser obtida por métodos convencionais, por exemplo, biópsia, usando métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica médica relacionada. Os métodos para obter uma amostra para biópsia incluem dividir um tumor em grandes peças, ou microdissecção, ou outros métodos de separação celular conhecidos na técnica. As células tumorais podem adicionalmente ser obtidas por meio de citologia através de aspiração com uma agulha de pequeno calibre. Para simplificar a preservação e a manipulação da amostra, as amostras podem ser fixadas em formalina e embebidas em parafina ou primeiro congeladas e então embebidas em um meio de congelamento de tecido tal como composto OCT por meio de imersão em um meio altamente criogênico que permite o rápido congelamento.
[069]Como entendido por aqueles versados na técnica, os níveis de expres-são de gene podem ser quantificados por se medir os níveis do RNA mensageiro do referido gene ou da proteína codificada pelo referido gene.
[070]Para esse fim, a amostra biológica pode ser tratada para fisicamente ou mecanicamente romper o tecido ou estrutura celular, liberando os componentes intracelulares em uma solução aquosa ou orgânica para preparar ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos são extraídos por meio de métodos comercialmente disponíveis conhecidos daqueles versados na técnica (Sambroock, J., et al., “Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Resfriado Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.)
[071]Assim, o nível de expressão de gene c-MAF pode ser quantificado a par-tir do RNA resultante a partir da transcrição do referido gene (RNA ou mRNA mensa-geiro) ou, alternativamente, a partir do DNA complementar (cDNA) do referido gene. Portanto, em uma modalidade particular da presente invenção, a quantificação dos níveis de expressão de gene c-MAF compreende a quantificação do RNA mensageiro do gene c-MAF ou um fragmento do referido mRNA, DNA complementar do gene c- MAF ou um fragmento do referido cDNA ou a mistura do mesmo.
[072]De fato, qualquer método convencional pode ser usado dentro do âmbito da presente invenção para detectar e quantificar os níveis de mRNA codificado pelo gene c-MAF ou do cDNA correspondente do mesmo. Por meio de ilustração não limi- tante, os níveis de mRNA codificado pelo referido gene podem ser quantificados usando métodos convencionais, por exemplo, métodos compreendendo amplificação de mRNA e a quantificação da referida amplificação do produto mRNA, tal como eletroforese e coloração, ou alternativamente, por Southern blot e usando sondas adequadas, Northern blot e usando sondas específicas do mRNA do gene de interesse (c-MAF) ou do cDNA correspondente do mesmo, mapeamento com S1 nuclease, RT- PCR, hibridização, microestruturas, etc., preferivelmente por meio de PCR quantitativa de tempo real usando um marcador adequado. Da mesma forma, os níveis de cDNA correspondendo ao referido mRNA codificado pelo gene c-MAF podem também ser quantificados por meio de usar técnicas convencionais; nesse caso, o método da presente invenção inclui uma etapa para sintetizar o cDNA correspondente por meio de transcrição reversa (RT) do mRNA correspondente seguido por amplificação e quantificação do referido produto de amplificação de cDNA. Métodos convencionais para quantificar níveis de expressão podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001. (citado ad supra). Os referidos métodos são conhecidos na técnica e a aqueles versados na técnica podem ser familiares com as normalizações necessárias para cada técnica. Por exemplo, as medições de expressão geradas usando PCR multiplex devem ser normalizadas por comparar a expressão dos genes sendo medidos para os assim chamados genes “housekeeping”, a expressão do qual deve ser constante em todas as amostras, assim proporcionando uma expressão de linha basal para comparar contra ou outros genes de controle cuja expressão é conhecida por ser modulada com câncer.
[073]Em uma modalidade particular, os níveis de expressão de gene c-MAF é quantificado por meio de reação de cadeia de polimerase quantitativa (PCR) ou um DNA, estrutura de RNA, ou técnica de hibridização de nucleotídeo.
[074]Adicionalmente, o nível de expressão de gene c-MAF pode também ser quantificado por meio de quantificar os níveis de expressão da proteína codificada pelo referido gene, i.e., a proteína c-MAF (c-MAF) [NCBI, número de acesso O75444], ou qualquer variante equivalente funcional da proteína c-MAF. Há duas isoformas de proteína de c-MAF, a isoforma α (NCBI, NP_005351.2) produzida de 403 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) e a isoforma β (NP_001026974.1) produzida de 373 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). O nível de expressão de gene c-MAF pode ser quantificado por meio de quantificar os níveis de expressão de qualquer das isoformas de proteína de c- MAF. Assim, em uma modalidade particular, a quantificação dos níveis da proteína codificada pelo gene c-MAF compreende a quantificação da proteína c-MAF.
[075]No contexto da presente invenção, “variante equivalente funcional de uma proteína c-MAF” é entendido como (i) variantes da proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) nas quais um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituí-dos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado), em que o referido resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) variantes compreendendo uma inserção ou uma deleção de um ou mais aminoácidos e tendo a mesma função que a proteína c-MAF, i.e., para agir como um Fator de transcrição de ligação a DNA. Variantes da proteína c-MAF podem ser identificadas usando métodos com base na capacidade de c-MAF para promover a proliferação celular in vitro como mostrado no pedido de patente internacional WO 2005/046731(aqui incorporada por referência em sua totalidade), com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle de promotor D2 de ciclina ou de um promotor contendo a região responsiva a c-MAF (elemento responsivo a MARE ou c-MAF) em células que expressam c-MAF como descrito em WO 2008098351 (aqui incorporada por referência em sua totalidade), ou com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear expressão do gene repórter sob o controle do promotor IL-4 em resposta a estimulação com PMA/ionomicina em células que expressam NFATc2 e c-MAF como descrito em US 2009048117A (aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[076]As variantes de acordo com a presente invenção preferivelmente têm si-milaridade de sequência com a sequência de aminoácido de qualquer das isoformas de proteína de c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) de cerca de pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, cerca de pelo menos 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, cerca de pelo menos 98% ou cerca de pelo menos 99%. O grau de similaridade entre as variantes e as sequências específicas de proteína c-MAF definida anteriormente é determinado usando algorit-mos e processos de computador que são amplamente conhecidos daqueles versados na técnica. A similaridade entre as duas sequências de aminoácidos é preferivelmente determinada usando o algoritmo de BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
[077]O nível de expressão da proteína c-MAF pode ser quantificado por qualquer método convencional que permita detectar e quantificar a referida proteína em uma amostra a partir de um indivíduo. Por meio de ilustração não limitante, os referidos níveis de proteína podem ser quantificados, por exemplo, por usar anticorpos com capacidade de ligação a c-MAF (ou um fragmento do mesmo contendo um determinante antigênico) e a subsequente quantificação dos complexos formados. Os anticorpos usados nos referidos testes podem ou não ser marcados. Exemplos ilustrativos de marcadores que podem ser usados incluem isótopos radioativos, enzimas, fluoró- foros, reagentes de quimioluminescência, substratos de enzima ou cofatores, inibidores de enzima, partículas, corantes, etc. Há uma grande variedade de testes conhecidos que pode ser usada na presente invenção que usa anticorpos não marcados (anticorpo primário) e anticorpos marcados (anticorpo secundário); as referidas técnicas incluem Western-blot ou transferência Western, ELISA (teste de imunoabsorção ligado a enzima), RIA (radioimunoteste), EIA competitiva (imunoteste de enzima competitiva), DAS-ELISA (anticorpo duplo em ELISA sanduíche), técnicas imunocitoquí- mica e imunohistoquímica, técnicas com base no uso de microestruturas de proteína ou biochipes incluindo anticorpos específicos ou testes com base em precipitação co- loidal em formatos tais como sondas de imersão. Outros modos para detectar e quan-tificar a referida proteína c-MAF incluem técnicas de cromatografia de afinidade, testes de ligação a ligante, etc. Quando um método imunológico é usado, qualquer anticorpo ou reagente que é conhecido por se ligar à proteína c-MAF com uma alta afinidade pode ser usado para detectar a quantidade do mesmo. Isso pode incluir, mas não é limitado a, o uso de um anticorpo, por exemplo, soro policlonal, sobrenadantes de hibridomas ou anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, Fv, Fab, Fab’ e F(ab’)2, scFv, diacorpos humanizados, triacorpos, tetracorpos, anticorpos, nanocor- pos, alfacorpos, peptídeos de comprimento cortado, e ciclopeptídeos. Há anticorpos comerciais de proteína anti-c-MAF no mercado que podem ser usados no contexto da presente invenção, tal como, por exemplo, anticorpos ab427, ab55502, ab55502, ab72584, ab76817, ab77071 (Abcam plc, 330 Science Park, Cambridge CB4 0FL, United Kingdom), o anticorpo monoclonal O75444 (Anticorpo monoclonal livre de azida anti-MAF humano de camundongo, não conjugado, Clone 6b8) de AbD Serotec, etc. Há muitas empresas comerciais que oferecem anticorpos anti-c-MAF, tal como Abnova Corporation, Betil Laboratories, Bioworld Technology, GeneTex, etc.
[078]Em uma modalidade particular, os níveis de proteína c-MAF são quanti-ficados por meio de western blot, imunohistoquímica, ELISA ou uma estrutura de pro-teína.
[079]O primeiro método da presente invenção compreende em uma segunda etapa comparar o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor (incluindo mas não limitado a biópsia de tumor primário, células tumorais circulantes e DNA de tumor circulante) a partir do indivíduo com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle.
[080]Uma vez que o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tecido tumoral, a célula de tumor circulante ou DNA de tumor circulante a partir de um indivíduo com câncer de próstata tiverem sido medidos e comparados com a amostra de controle, se o nível de expressão do referido gene é aumentado com relação ao seu nível de expressão na amostra de controle, então pode ser concluído que o referido indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[081]A determinação do nível de expressão de gene c-MAF deve estar correlacionada com valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim, no caso de que um diagnóstico deve ser avaliado, então a amostra de referência é a amostra de tecido tumoral a partir de um indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde um valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medidos em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreram metás- tase.
[082]A referida amostra de referência é tipicamente obtida por combinar quantidades iguais de amostras a partir de uma população de indivíduos. Em geral, as típicas amostras de referência serão obtidas a partir de indivíduos que são clinica-mente bem documentadas e em quem a ausência de metástase é bem caracterizada. Nas referidas amostras, as concentrações normais (concentração de referência) do biomarcador (gene c-MAF) podem ser determinadas, por exemplo, por proporcionar a concentração média sobre a população de referência. Várias considerações são levadas em conta quando se determina a concentração de referência do marcador. Entre as referidas considerações estão a idade, o peso, sexo, condição física geral do paciente e semelhante. Por exemplo, quantidades iguais de um grupo de pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 100 a preferivelmente mais do que 1000 indivíduos, preferivelmente classificados de acordo com as considerações anteriores, por exemplo, de acordo com várias categorias de idade, são tidas como o grupo de referência. A coleta de amostra a partir da qual o nível de referência é derivado preferivelmente será formado por indivíduos que sofrem a partir do mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo (e.g., câncer de próstata). Similarmente, o valor de referência dentro de uma coorte de pacientes pode ser estabelecido usando uma curva de operação de recebimento (ROC) e medir a área sob a curva para todos os pares de sensibilidade e especificidade para determinar qual par proporciona os melhores valores e qual é o valor de referência correspondente. ROC é um conceito estatístico padrão. Uma descrição pode ser encontrada em Stuart G. Baker “The Central Role of Receiver Operating Characteristic (ROC) curves in Evalu-ating Testes for the Early Detection of cancer” Journal of The National Cancer Institute (2003) Vol 95, No. 7, 511-515.
[083]Uma vez que a média ou o valor de referência tenha sido estabelecido, o nível do referido marcador expresso em tecidos tumorais de pacientes com o refe-rido valor médio pode ser comparado e assim ser atribuído ao nível “aumentado” de expressão. Em virtude da variabilidade entre indivíduos (por exemplo, aspectos refe-rentes a idade, raça, etc.) é muito difícil (se não de fato impossível) se estabelecer valores absolutos de referências de expressão de c-MAF. Assim, em modalidades particulares os valores de referência para a expressão “aumentada” ou “reduzida” da expressão de c-MAF são determinados ao se calcular o percentual por meios convencionais que envolvem a realização de testes em uma ou diversas amostras isoladas a partir de indivíduos cuja doença é bem documentada por qualquer dos métodos mencionados acima para os níveis de expressão de c-MAF. Os níveis “reduzidos” de c- MAF podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão de c-MAF são iguais a ou mais baixo do que 50 por cento na população normal incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais a ou mais baixo do que the 60 por cento na população normal, igual a ou mais baixo do que the 70 por cento na população normal, igual a ou mais baixo do que os 80 por cento na população normal, igual a ou mais baixo do que the 90 por cento na população normal, e igual a ou mais baixo do que the 95 por cento na população normal. Os níveis de expressão de gene c-MAF “aumentados” podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão de gene c-MAF são iguais a ou maiores do que the 50 por cento na população normal incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais a ou maiores do que os 60 por cento na população normal, igual a ou maiores do que os 70 por cento na população normal, igual a ou maiores do que os 80 por cento na população normal, igual a ou maiores do que os 90 por cento na população normal, e igual a ou maiores do que os 95 por cento na população normal.
[084]Na presente invenção “níveis de expressão aumentados” ou “nível de expressão aumentado” é entendido como o nível de expressão quando o mesmo se refere aos níveis do gene c-MAF maiores do que os na amostra de referência ou amostra de controle. Particularmente, a amostra pode ser considerada ter alto nível de expressão de c-MAFs quando os níveis de expressão na amostra de referência são pelo menos cerca de 1,1 vezes, 1,5 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mesmo mais com relação à amostra isolada a partir do paciente.
[085]No contexto da presente invenção, é entendido que “um indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase” quando o câncer de próstata sofrido pelo referido indivíduo sofreu metástase para outros órgãos do corpo, em uma modalidade particular, para o osso.
[086]Em ainda outra modalidade, a metástase para o osso é uma metástase osteolítica de osso. Como usado aqui, a expressão “metástase osteolítica óssea” se refere a um tipo de metástase no qual a reabsorção do osso (perda progressiva da densidade óssea) é produzida na proximidade da metástase que resulta a partir de uma estimulação da atividade de osteoclasto pelas células tumorais e é caracterizada por severa dor, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndromes que resultam a partir de compressão do nervo.
[087]Por outro lado, é entendido na presente invenção que “um indivíduo tem uma maior tendência de desenvolver metástase” quando as probabilidades de que o câncer de próstata sofrido pelo indivíduo sofrerá metástase no futuro são altas.
[088]Aqueles versados na técnica entenderão que a previsão da tendência para um tumor primário de próstata de sofrer metástase não é pretendido que seja correta para todos os indivíduos a serem identificados (i.e., para 100% dos indivíduos). No entanto, o termo requer permitir a identificação de uma parte estatisticamente sig- nificante dos indivíduos (por exemplo, uma coorte em um estudo de coorte). Se a parte é estatisticamente significante pode ser determinada em um modo simples por aqueles versados na técnica usando várias ferramentas de avaliação estatística bem conhecidas, por exemplo, a determinação de intervalos de confiança, determinação de valores p, Teste T de Student, Mann-Whitney test, etc. Os detalhes são proporcionados em Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, New York 1983. Os intervalos de confiança preferidos são pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Os valores p são preferivelmente 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001. Mais preferivelmente, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% dos indivíduos de uma população podem ser adequadamente identificados pelo método da presente invenção.
[089]Como usado aqui, “agente para impedir ou evitar degradação óssea” se refere a qualquer molécula capaz de evitar, inibir, tratar, reduzir, ou parar a degrada-ção óssea seja por estimular a proliferação de osteoblasto ou inibir a proliferação de osteoclasto ou fixar a estrutura do osso.
[090]Como usado aqui, um “agente de inibição de c-MAF” se refere a qualquer molécula capaz de completamente ou parcialmente inibir the a expressão de gene c- MAF, tanto por evitar que a produto de expressão do referido gene seja produzida (interrompendo a transcrição do gene c-MAF e/ou bloqueando a tradução do mRNA que vem da a expressão de gene c-MAF) como por diretamente inibir a atividade da proteína c-MAF. os inibidores da expressão de gene c-MAF podem ser identificados usando métodos com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a capacidade de c-MAF de promover a proliferação celular in vitro, tal como mostrado no pedido de patente internacional WO 2005/046731 (os conteúdos totais da qual se encontram aqui incorporados por referência), com base na capacidade do assim cha-mado inibidor para bloquear a capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle do promotor D2 de ciclina ou de um promotor contendo a região de resposta de c-MAF (MARE ou elemento que responde a c-MAF) em células que expressam c- MAF tal como descrito em WO 2008098351 (os conteúdos totais da qual se encontram aqui incorporados por referência) ou com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a expressão de um gene repórter sob o controle do promotor IL-4 em resposta à estimulação com PMA/ionomicina em células que expressam NFATc2 e c-MAF tal como descrito em US 2009048117A (os conteúdos totais da qual se encontram aqui incorporados por referência).
[091]Como usado aqui, Alvo mamífero de rapamicina (mTOR) ou “mTor” se refere ás proteínas que correspondem a EC 2.7.11,1. As enzimas mTor são as prote-ínas quinases serina/treonina e regulam a proliferação celular, motilidade celular, de-senvolvimento celular, sobrevivência celular, e transcrição.
[092]Como usado aqui, um “inibidor de mTor” se refere a qualquer molécula capaz de completamente ou parcialmente inibir a expressão do gene mTor, não só por evitar que a produto de expressão do referido gene seja produzida (interrompendo a transcrição do gene mTor e/ou bloqueando a tradução do mRNA proveniente da expressão do gene mTor) e por diretamente inibir a atividade da proteína mTor. Incluindo inibidores que tenham dois ou mais alvos e entre os mesmos a atividade da proteína mTor.
[093]Como usado aqui, “Src” se refere às proteínas que correspondem a EC 2.7.10.2. Src é um não receptor de tirosina quinase e a proto-oncogene. Src pode desempenhar um papel em desenvolvimento celular e desenvolvimento embriônico.
[094]Como usado aqui, um “inibidor Src” se refere a qualquer molécula capaz de completamente ou parcialmente inibir a expressão do gene Src, não só por evitar que a produto de expressão do referido gene seja produzida (interrompendo a transcrição do gene Src e/ou bloqueando a tradução do mRNA proveniente da expressão do gene Src) e por diretamente inibir a atividade da proteína Src.
[095]Como usado aqui, “Prostaglandina-endoperóxido sintase 2”, “ciclooxige- nase-2” ou “COX-2” se refere às proteínas que correspondem a EC 1,14.99.1. COX-2 é responsável por converter ácido araquidônico em prostaglandina endoperóxido H2.
[096]Como usado aqui, a “inibidor de COX-2” se refere a qualquer molécula capaz de completamente ou parcialmente inibir a expressão do gene COX-2, não só por evitar que a produto de expressão do referido gene seja produzida (interrompendo a transcrição o gene COX-2 e/ou bloqueando a tradução do mRNA proveniente da expressão do gene COX-2) e por diretamente inibir a atividade da proteína COX-2.
[097]Como usado aqui “resultado” ou “resultado clínico” se refere ao curso resultante da doença e/ou a progressão da doença e pode ser caracterizada por exemplo, por recorrência, período de tempo até a recorrência, metástase, período de tempo até a metástase, número de metástases, número de campos de metástase e/ou morte em virtude de doença. Por exemplo, a bom resultado clínico inclui cura, prevenção de recorrência, prevenção de metástase e/ou sobrevivência dentro de um período de tempo fixo (sem recorrência), e um pobre resultado clínico inclui progressão da doença, metástase e/ou morte dentro de um período de tempo fixo.
[098]“Prever”, como usado aqui, se refere à determinação de probabilidade de que o indivíduo que sofre de câncer de pulmão irá desenvolver metástase a um órgão distante. Como usado aqui, “bom prognóstico” indica que é esperado que o indivíduo (e.g. previsão) sobreviva e/ou não tenha, ou está em baixo risco de ter, recorrência ou metástases distantes dentro de um conjunto período de tempo. O termo “baixo” é um termo relativo e, no contexto do presente pedido, se refere ao grupo de risco de “baixa” expressão com relação ao resultado clínico (recorrência, metástases distantes, etc.). um “baixo” risco pode ser considerado como um risco mais baixo do que a média de risco para uma população heterogênea de pacientes com câncer. No estudo de Paik et al. (2004), um risco de recorrência geral “baixo” foi considerado ser mais baixo do que 15 por cento. O risco também pode variar em função do período de tempo. O período de tempo pode ser, por exemplo, cinco anos, dez anos, quinze anos ou mesmo vinte anos após o diagnóstico inicial de câncer ou após o prognóstico ser feito.
[099]Como usado aqui, “pobre prognóstico” indica que o indivíduo é esperado e.g. previsto a não sobreviver e/ou ter, ou está em alto risco de ter, recorrência ou metástases distantes dentro de um conjunto período de tempo. O termo “alto” é um termo relativo e, no contexto do presente pedido, se refere ao risco de “alto” do grupo de expressão com relação ao resultado clínico (recorrência, metástases distantes, etc.). um “alto” risco pode ser considerado como um risco maior do que o risco médio para a população heterogênea de pacientes com câncer. No estudo de Paik et al. (2004), um “alto” risco de recorrência foi considerado ser maior do que 15 por cento. O risco também irá variar em função do período de tempo. O período de tempo pode ser, por exemplo, cinco anos, dez anos, quinze anos ou mesmo vinte anos de diagnóstico inicial de câncer ou após o prognóstico ser realizado.
[0100]“Valor de referência”, como usado aqui, se refere a um valor de labora-tório usado como uma referência para valores/dados obtidos por exames de laborató-rio de pacientes ou amostras coletadas dos pacientes. O valor de referência ou nível de referência pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tem um limite superior e/ou inferior; uma faixa de valores; um valor mediano; um valor médio, um valor intermediário, ou um valor em comparação a um controle particular ou valor de linha basal. Um valor de referência pode ser com base em um valor de amostra do indivíduo, tal como, por exemplo, um valor obtido a partir de uma amostra do indivíduo sendo testado, mas em um ponto mais cedo no tempo. O valor de referência pode ser com base em um grande número de amostras, tal como a partir de uma população de indivíduos de grupo de idade cronológica correspondida, ou com base em um grupo de amostras incluindo ou excluindo a amostra a ser testada.
[0101]O termo “tratamento”, como usado aqui, se refere a qualquer tipo de terapia, que tem o objetivo de terminar, evitar, melhorar ou reduzir a susceptibilidade a uma condição clínica como descrito aqui. Em uma modalidade preferida, o termo tratamento se refere um tratamento profilático (i.e. uma terapia para reduzir a suscep-tibilidade a uma condição clínica), de uma desordem ou uma condição como definida aqui. Assim, “tratamento”, “tratar”, e seus termos equivalentes se referem a obter um efeito farmacológico ou fisiológico desejado, que cobre qualquer tratamento de uma condição ou desordem patológica em um mamífero, incluindo um ser humano. O efeito pode ser profilático em termos de completamente ou parcialmente evitar uma desordem ou sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma desordem e/ou efeito adverso atribuível a desordem. Ou seja, “tratamento” inclui (1) evitar que a desordem ocorra ou recorra em um indivíduo, (2) inibir a desordem, tal como parar o seu desenvolvimento, (3) parar ou terminar a desordem ou pelo menos os sintomas associados com a mesma, de modo que o hospedeiro não sofra mais da desordem ou de seus sintomas, tal como causar a regressão de uma desordem ou seus sintomas, por exemplo, por restaurar ou reparar uma função perdida, que falta ou defeituosa, ou estimular um processo ineficiente, ou (4) aliviar, suavizar, ou melhorar a desordem, ou sintomas associados com a mesma, onde melhorar é usado em um sentido amplo para se referir a pelo menos uma redução na magnitude de um parâmetro, tal como inflamação, dor, ou deficiência imune.
[0102]Como usado aqui, “amostra” ou “amostra biológica” quer dizer um ma-terial biológico isolado de um indivíduo. A amostra biológica pode conter qualquer material biológico adequado para determinar o nível de expressão do gene c-MAF. A amostra pode ser isolada a partir de qualquer tecido adequado ou fluido biológico adequado tal como, por exemplo, tecido tumoral, sangue, plasma sanguíneo, soro, urina ou fluido cérebro espinhal (CSF).
[0103]Como usado aqui, o termo “nível de expressão” de um gene como usado aqui se refere a quantidade mensurável de produto de gene produzido pelo gene em uma amostra do indivíduo, em que o produto de gene pode ser um produto de transcrição ou um produto de tradução. Assim sendo, o nível de expressão pode pertencer a um produto de gene de ácido nucleico tal como mRNA ou cDNA ou um produto de gene de polipeptídeo. O nível de expressão é derivado a partir da amostra de um indivíduo e/ou da amostra de referência ou amostras, e pode, por exemplo, ser detectado de novo ou corresponder à determinação anterior. O nível de expressão pode ser determinado ou medido, por exemplo, usando métodos de microestrutura, métodos de PCR (tal como qPCR), e/ou métodos com base em anticorpo, como é conhecido daqueles versados na técnica.
[0104]Como usado aqui, o termo “número de cópia de gene” se refere ao nú-mero de cópia de uma molécula de ácido nucleico em uma célula. O número de cópia de gene inclui o número de cópia de gene no DNA genômico (cromossomal) de uma célula. Em uma célula normal (célula não tumoral), o número de cópia de gene é normalmente duas cópias (uma cópia em cada membro do par do cromossomo). O número de cópia de gene algumas vezes inclui metade do número de cópia de gene obtido a partir de amostras de uma população de células.
[0105]“Nível de expressão aumentado” é entendido como o nível de expres-são quando se refere aos níveis do gene c-MAF maiores do que os na amostra de referência ou na amostra de controle. Os referidos níveis aumentados podem ser causados sem excluir outros mecanismos por um gene ou amplificação ou translocação do locus cromossomal 16q23 ou 16q22-24. Particularmente, a amostra pode ser considerada ter um alto nível de expressão de c-MAF quando o nível de expressão na amostra isolada a partir do paciente é pelo menos cerca de 1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mesmo mais com relação a referência ou o controle.
[0106]“Sonda”, como usado aqui, se refere a uma sequência de oligonucleo- tídeo que é complementar a uma específica sequência de ácido nucleico de interesse. Em algumas modalidades, as sondas podem ser específicas para regiões de cromossomos que são conhecidas por sofrer translocações. Em algumas modalidades, as sondas têm uma marca ou marcação específica. Em algumas modalidades, a marcação é um fluoróforo. Em algumas modalidades, a sonda é uma sonda de hibridização de DNA in situ cuja marcação é com base na ligação coordenada estável de platina a ácidos nucleicos e proteínas. Em algumas modalidades, a sonda é descrita em Pedido de Patente US 12/067532 e Pedido de Patente US 12/181,399, que estão incorporados por referência em suas totalidades, ou como descrito em Swennenhuis et al. “Construction of repeat-free fluorescência hybridization in situ probes” Nucleic Acids Research 40(3):e20 (2012).
[0107]“Tag” ou “marcação”, como usado aqui, se refere a qualquer molécula física que está diretamente ou indiretamente associada com a sonda, permitindo que a sonda ou o local do sondado seja visualizado, marcado, ou de outro modo captu-rado.
[0108]“Translocação”, como usado aqui, se refere a troca de material cromos- somal em quantidades iguais ou desiguais entre cromossomos. Em alguns casos, a translocação é no mesmo cromossomo. Em alguns casos, a translocação é entre di-ferentes cromossomos. Translocações ocorrem em uma alta frequência em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama e leucemia. Translocações podem ser ou translocações recíprocas primárias ou as translocações secundárias mais complexas. Há diversas translocações primárias que envolvem o locus (IgH) da imunoglobulina de cadeia pesada que se acredita que constituam o evento inicial em muitos cânceres. (Eychène, A., Rocques, N., e Puoponnot, C., A new MAFia in cancer. 2008. Nature Reviews: cancer. 8: 683-693.)
[0109]“Poliplóide” ou “poliplóideia”, como usado aqui, indica que a célula contém mais do que duas cópias de um gene de interesse. Em alguns casos, o gene de interesse é MAF. Em algumas modalidades, poliplóideia é associada com um acúmulo de expressão do gene de interesse. Em algumas modalidades, poliplóideia é associada com instabilidade genômica. Em algumas modalidades, a instabilidade genômica pode levar a translocações de cromossomo.
[0110]“Sequenciamento de genoma total”, como usado aqui, é um processo pelo qual todo o genoma de um organismo é sequenciado em uma única vez. Vide, e.g., Ng., P.C. and Kirkness, E.F., Whole genoma sequencing. 2010. Methods in Mo-lecular Biology. 628: 215-226.
[0111]“Sequenciamento de exoma”, como usado aqui, é um processo pelo qual toda a região de codificação do DNA de um organismo é sequenciada. Em se- quenciamento de exoma, o mRNA é sequenciado. As regiões não traduzidas do ge- noma não são incluídas no sequenciamento de exoma. Vide, e.g., Choi, M. Et al., Genetic diagnostic by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. 2009. PNAS. 106(45): 19096-19101.
[0112]“Amostra de tecido tumoral” é entendido como the amostra de tecido originário do tumor de câncer de próstata, incluindo, mas não limitado a células tumo- rais circulantes e DNA de tumor circulante. A referida amostra pode ser obtida por métodos convencionais, por exemplo, biópsia, usando métodos bem conhecidos daqueles versados nas técnicas médicas relacionadas.
[0113]“Metástase osteolítica óssea” se refere a um tipo de metástase na qual a reabsorção do osso (perda progressiva da densidade óssea) é produzida na proxi-midade da metástase que resulta a partir da estimulação da atividade de osteoclasto pelas células tumorais e é caracterizada por severa dor, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndromes que resultam da compressão do nervo.
[0114]Como é conhecido no estado da técnica, o tratamento a ser adminis-trado a um indivíduo que sofre de câncer depende se o último é um tumor maligno, i.e., se tem altas probabilidades de sofrer metástase, ou se o último é um tumor be-nigno. No primeiro caso, o tratamento de escolha é um tratamento sistêmico tal como quimioterapia e no segundo caso, o tratamento de escolha é um tratamento localizado tal como radioterapia.
[0115]Portanto, como descrito na presente invenção, considerando que a su- perexpressão do gene de c-MAF em células de câncer de próstata está relacionada à presença de metástase, os níveis de expressão de gene c-MAF permitem tomar deci-sões em termos da terapia mais adequada para o indivíduo que sofre do referido cân-cer.
[0116]Assim, em outro aspecto a presente invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia customizada para um indivíduo com câncer de próstata, que compreende (vii)quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tumor do referido indivíduo e (viii)comparar o nível de expressão anteriormente obtido com o nível de ex-pressão do referido gene em uma amostra de controle, em que se o nível de expressão é aumentado com relação aos níveis de ex-pressão do referido gene na amostra de controle, então o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar e/ou tratar a metástase. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é então administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos. em que se o nível de expressão de gene c-MAF não é aumentado com relação ao referido valor de referência, então o referido indivíduo não é susceptível para receber a terapia para evitar a degradação óssea. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo então não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos.
[0117]Em uma modalidade particular, a metástase é a metástase nos ossos. Em uma modalidade mais preferida, a metástase nos ossos é metástase osteolítica.
[0118]Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de próstata”, “amostra de tumor”, “metástase”, “determinação de níveis de expressão”, “gene c-MAF”, “níveis de expressão aumentados” e “amostra de controle” foram descritos em detalhes em re-lação ao primeiro método da presente invenção e são igualmente aplicáveis a o se-gundo e terceiro método da presente invenção.
[0119]O segundo método da presente invenção compreende em uma primeira etapa quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tumor em um indivíduo que sofre de câncer de próstata.
[0120]Em uma modalidade preferida, o segundo método da presente invenção compreende quantificar apenas o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, i.e., o método não envolve determinar o nível de expressão de qualquer marcador adicional.
[0121]No caso do segundo método da presente invenção a amostra é uma amostra primária de tecido tumoral do indivíduo. Em uma segunda etapa, o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor do indivíduo é comparado com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão de gene c-MAF deve ser relacionada a valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim preferivelmente a amostra de referência é a amostra de tecido tumoral de um indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medidos em a coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreram metástase.
[0122]Em ainda outra modalidade, um nível de expressão de c-MAF que está acima da média indica maior risco de metástase nos ossos, o risco sendo proporcional aos níveis de expressão de c-MAF, Assim, o risco de metástase nos ossos em um indivíduo que sofre câncer de pulmão é dependente da dose.
[0123]Uma vez que o nível de expressão de gene c-MAF na amostra tenha sido medido e comparado com a amostra de controle, se o nível de expressão do referido gene está aumentado com relação aos níveis de expressão na amostra de controle, então pode ser concluído que o referido indivíduo é susceptível para receber terapia com o objetivo de evitar (se o indivíduo ainda não sofreu metástase) e/ou tratar metástase (se o indivíduo já experimentou metástase). Se a referida maior expressão não é observada então o indivíduo não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos.
[0124]Como usado aqui, um “agente para impedir ou evitar degradação ós-sea” se refere a qualquer molécula capaz de tratar ou parar degradação óssea seja por estimular a proliferação de osteoblasto ou inibir a proliferação de osteoclasto. Exemplos ilustrativos de agentes usados para impedir e/ou evitar a degradação óssea incluem, embora não sejam limitados a: - Inibidores de hormônio de paratireoide (PTH) e Hormônio similar a paratire- oide (PTHLH) (incluindo anticorpos de bloqueio) ou formas recombinantes do mesmo (teriparatide que corresponde aos aminoácidos 7-34 de PTH). O referido hormônio age ao estimular os osteoclastos e aumentando a sua atividade. - Ranelato de estrôncio: é um tratamento alternativo oral, e forma parte do grupo de fármacos chamados “agentes de ação duplo nos ossos” (DABAs) pelo fato de que estimulam a proliferação de osteoblasto e inibem a proliferação de osteoclasto. - “Moduladores receptores de estrogênio” (SERM) se refere a compostos que interferem ou inibem a ligação de estrogênios ao receptor, independente do meca-nismo. Exemplos de moduladores receptores de estrogênio incluem, entre outros, es- trogênios progestagen, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, TSE-424, tamo- xifeno, idoxifeno, L Y353381, LY117081, toremifeno, fluvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-1- oxopropoxi-4-metil-2-[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-1-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-di- metilpropanoato 4,4’dihidroxibenzofenona-2,4-dinitrofenil-hidrazona e SH646. -Calcitonina: diretamente inibe a atividade de osteoclasto através de the re-ceptor de calcitonina. Os receptores de calcitonina foram identificados na superfície dos osteoclastos. -Bisfosfonatos: são um grupo de produtos medicinais usado para a prevenção e o tratamento de doenças com reabsorção do osso e reabsorção tal como osteopo- rose e câncer com metástase nos ossos, o último sendo com ou sem hipercalcemia, associado a câncer de mama e câncer de próstata. Exemplos de bisfosfonatos que podem ser usados em terapia designada por meio do quinto método da presente invenção incluem, embora não limitados a, bisfosfonatos nitrogenados (tal como pami- dronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronato, incadronato, zoledronato ou ácido zoledrônico, etc.) e bisfosfonatos não nitrogenosos (tal como etidronato, clodronato, tiludronato, etc.). -“Inibidor de catepsina Kes” se refere a compostos que interferem na atividade da protease de cisteína catepsina K. Exemplos não limitantes de inibidor de catepsina Kes incluem derivados de 4-amino-pirimidina-2-carbonitrila (descrita no pedido de patente internacional WO 03/020278 sob o nome de Novartis Pharma GMBH), pirrolo- pirimidinas descrita na publicação WO 03/020721 (Novartis Pharma GMBH) e a publicação WO 04/000843 (ASTRAZENECA AB) assim como os inibidores descritos nas publicações PCT WO 00/55126 de Axys Pharmaceuticals, WO 01/49288 de Merck Frosst Canada & Co. E Axys Pharmaceuticals. -“Inibidor de DKK-1(Dickkopf-1)” como usado aqui se refere a qualquer com-posto que é capaz de reduzir a atividade de DKK-1. DKK-1 é um antagonista de trajeto Wnt solúvel expresso predominantemente em osso de adulto e regulado para mais em mieloma de pacientes com lesões osteolíticas. Agentes a objetivação de DKK-1 podem desempenhar um papel em evitar doença osteolítica nos ossos em pacientes com múltiplos mielomas. BHQ880 da Novartis é uma primeiro-na-classe, anticorpo de neutralização anti-DKK-1, completamente humano. Estudos pré-clínicos suportam a hipótese de que BHQ880 promove formação de osso e desse modo inibe doença os- teolítica induzida a tumor (Ettenberg S. Et al., American Association for cancer Research Annual Meeting. April 12-16, 2008; San Diego, Calif. Abstract). -“Inibidor duplo MET e VEGFR2” como usado aqui se refere a qualquer com-posto que é um potente inibidor de trajetos MET e VEGF duplo projetado para blo-quear o escape de tumor acionado a MET. MET é expresso não só em células tumo- rais e células endoteliais, mas também em osteoblastos (células de formação de osso) e osteoclastos (células de remoção de osso). HGF se liga a MET em todos os referidos tipos de célula, dando ao trajeto MET um importante papel em múltiplas alças autócri- nas e parácrinas. A ativação de MET em células tumorais parece ser importante no estabelecimento de lesões metastáticas nos ossos. Ao mesmo tempo, a ativação do trajeto MET em osteoblastos e osteoclastos pode levar a características patológicas de metástases nos ossos, incluindo desenvolvimento ósseo anormal (ie, lesões blás- ticas) ou destruição (ie, lesão lítica. Assim, a objetivação do trajeto MET pode ser uma estratégia viável em evitar o estabelecimento e a progressão de lesões metastáticas nos ossos. Cabozantinib (Exelixis, Inc), anteriormente conhecida como XL184 (CAS 849217-68-1), é um potente inibidor dos trajetos de MET e VEGF duplo projetado para bloquear o escape de tumor acionado a MET. Em múltiplos estudos pré-clínicos ca- bozantinib foi mostrado exterminar as células tumorais, reduzir as metástases, e inibir a angiogênese (a formação de novos vasos sanguíneos necessário para suportar o desenvolvimento do tumor). Outros duplos inibidores adequados são E7050 (N-[2-Flu- oro-4-({2-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il] carbonilaminopiridin-4-il} oxi) fenil]-N‘- (4-fluorofenil) ciclopropano-1,1-dicarboxamida (2R,3R)-tartrato) (CAS 928037-13-2) ou Foretinib (também conhecida como GSK1363089, XL880, CAS 849217-64-7). -“Inibidores de RANKL” como usado aqui se refere a qualquer composto que é capaz de reduzir a atividade de RANK. RANKL é encontrado na superfície da mem-brana do osteoblasto do estroma e células de linfócito T, e as referidas células de linfócito T são as únicas que demonstraram a capacidade de secretar a mesma. A sua principal função é a ativação dos osteoclastos, células envolvidas na reabsorção do osso. Os inibidores de RANKL podem agir por bloquear a ligação de RANKL ao seu receptor (RANK), bloqueando a sinalização mediada a RANK ou reduzir a expressão de RANKL por bloquear a transcrição ou a tradução de RANKL. Antagonistas de RANK ou inibidores adequados para uso na presente invenção incluem, sem limitação: ouma proteína RANK adequada que é capaz de se ligar a RANKL e que compreende a totalidade ou um fragmento do domínio extracelular de uma proteína RANK. A RANK solúvel pode compreender o peptídeo de sinal e o domínio extracelular dos polipeptídeos RANK de murino ou humano, ou alternativamente, a forma madura da proteína com o peptídeo de sinal removido pode ser usada. oOsteoprotegerina ou uma variante da mesma com capacidade de ligação a RANKL. oMoléculas antisenso específicas de RANKL oRibozimas capazes de processar os produtos transcritos de RANKL oAnticorpos anti-RANKL específicos. “Anticorpo anti-RANKL ou anticorpo di-recionado contra RANKL” é entendido aqui como todo aquele anticorpo que é capaz de se ligar especificamente ao ligante do receptor de ativação para a inibição de fator nuclear kB (RANKL) de uma ou mais funções RANKL. Os anticorpos podem ser preparados usando qualquer dos métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Assim, os anticorpos policlonais são preparados por meio de imunizar um animal com a proteína a ser inibida. Os anticorpos monoclonais são preparados usando o método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). Anticor-pos adequados no contexto da presente invenção incluem anticorpos intactos que compreendem uma região de ligação a antígeno variável e uma região constante, fra-gmentos “Fab”, “F(ab')2” e “Fab'”, Fv, scFv, diacorpos e anticorpos específicos. oNanocorpos anti-RANKL específicos. Nanocorpos são proteínas terapêuti-cas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais e funcionais úni-cas dos anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. A tecnologia de nano- corpo foi originalmente desenvolvida em seguida da descoberta de que Camelidae (camelos e lhamas) possuem anticorpos completamente funcionais que faltam de ca-deias leves. A estrutura geral de nanocorpos é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4 oem que FR1 a FR4 são as regiões de estrutura 1 a 4 CDR1 a CDR3 são as regiões de determinação complementares 1 a 3. Os referidos anticorpos de cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Importante, o domínio VHH clonado e isolado é um polipeptídeo perfeitamente estável que abriga a capacidade de ligação a antígeno completa do anticorpo de ca-deia pesada original. Os referidos domínios recém-descobertos com as suas únicas propriedades funcionais e estruturais formam a base de uma nova geração de anti-corpos terapêuticos que Ablynx nomeou de nanocorpos.
[0125]Em uma modalidade, o inibidor de RANKL é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo específico de RANKL, um nanocorpo específico de RANKL e osteoprotegerina. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- RANKL é um anticorpo monoclonal. Ainda em uma modalidade mais específica, o anticorpo anti-RANKL é Denosumab (Pageau, Steven C. (2009). mAbs 1 (3): 210-215, CAS número 615258-40-7) (os conteúdos totais da qual se encontram aqui incorporados por referência). Denosumab é anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a RANKL e evita a sua ativação (ele não se liga ao receptor RANK). Vários aspectos de Denosumab são cobertos pelas Patentes US Nos. 6,740,522; 7,411,050; 7,097,834; 7,364,736 (os conteúdos totais de cada uma das quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Em outra modalidade, o inibidor de um anticorpo RANK, fragmento de anticorpo, ou construtor de fusão que liga o mesmo epí- topo como Denosumab.
[0126]Em uma modalidade preferida, o nanocorpo anti-RANKL é qualquer um dos nanocorpos como descrito em WO2008142164, (os conteúdos totais de cada uma das quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Em ainda uma outra modalidade mais preferida, o anticorpo anti-RANKL é o ALX-0141 (Ablynx). ALX- 0141 foi projetado para inibir a perda óssea associada com osteoporose pós menopausa, artrite reumatóide, câncer e determinadas medicações, e para restaurar o equilíbrio de metabolismo do osso saudável.
[0127]Em uma modalidade preferida, o agente que evita a degradação óssea é selecionado a partir do grupo que consiste de um bisfosfonato, um inibidor de RANKL, e inibidor de PTHLH ou PTH ou um análogo de PRG, ranelato de estrôncio, um inibidor de DKK-1, um inibidor duplo de MET e VEGFR2, um modulador receptor de estrogênio, Rádio-223, calcitonina, e um inibidor de catepsina K. Em uma modali-dade mais preferida o agente que evita a degradação óssea é um bisfosfonato. Em ainda uma modalidade mais preferida, o bisfosfonato é o ácido zoledrônico.
[0128]Em uma modalidade, um antagonista de CCR5 é administrado para evitar ou inibir metástase do tumor de câncer primário de próstata ao osso. Em uma modalidade, o antagonista de CCR5 é uma grande molécula. Em outra modalidade, o antagonista de CCR5 é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é Maraviroc. Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é Vicriviroc. Em alguns aspectos, o antagonista de CCR5 é Aplaviroc. Em alguns as-pectos, o antagonista de CCR5 é a spiropiperidina antagonista de CCR5. (Rotstein D.M. Et al. 2009. Spiropiperidina antagonista de CCR5s. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 19 (18): 5401-5406. Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é INCB009471 (Kuritzkes, D.R. 2009. HIV-1 entry inhibitors: an overview. Curr. Opin. HIV AIDS. 4(2): 82-7).
[0129]Em uma modalidade preferida o inibidor MET e VEGFR2 duplo é sele-cionado a partir do grupo que consiste em Cabozantinib, Foretinib e E7050.
[0130]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de mTor. Em alguns as-pectos, o inibidor de mTor é um inibidor de mTor/PI3quinase duplo. Em alguns aspectos, o inibidor de mTor é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos o inibidor de mTor é selecionado a partir do grupo que consiste de: ABI009 (sirolimus), rapamicina (sirolimus), Abraxane (paclitaxel), Absorb (everolimus), Afinitor (everoli- mus), Afinitor com Gleevec, AS703026 (pimasertib), Axxess (umirolimus), AZD2014, BEZ235, Biofreedom (umirolimus), BioMatrix (umirolimus), BioMatrix flex (umirolimus), CC115, CC223, Combo Bio-engineered Sirolimus Eluting Stent ORBUSNEICH (siroli- mus), Curaxin CBLC102 (mepacrine), DE109 (sirolimus), DS3078, Endeavor DES (zo- tarolimus), Endeavor Resolute (zotarolimus), Femara (letrozole), Hocena (antroquino- nol), INK128, Inspiron (sirolimus), IPI504 (hidrocloreto de retaspimicina), KRN951 (ti- vozanib), ME344, MGA031 (teplizumab), MiStent SES (sirolimus), MKC1, Nobori (umi- rolimus), OSI027, OVI123 (cordycepin), Palomid 529, PF04691502, Promus Element (everolimus), PWT33597, Rapamune (sirolimus), Resolute DES (zotarolimus), RG7422, SAR245409, SF1126, SGN75 (vorsetuzumab mafodotin), Synergy (everoli- mus), Taltorvic (ridaforolimus), Tarceva (erlotinib), Torisel (temsirolimus), Xience Prime (everolimus), Xience V (everolimus), Zomaxx (zotarolimus), Zortress (everoli- mus), Zotarolimus Eluting Periferal Stent MEDTRONIC (zotarolimus), AP23841, AP24170, ARmTOR26, BN107, BN108, Canstatin GENZIMA (canstatin), CU906, EC0371, EC0565, KI1004, LOR220, NV128, Rapamicina ONCOIMMUNE (sirolimus), SB2602, Sirolimus PNP SAMYANG BIOPHARMACEUTICALS (sirolimus), TOP216, VLI27, VS5584, WYE125132, XL388, Advacan (everolimus), AZD8055, Cyfer Select Plus Sirolimus eluting Coronary Stent (sirolimus), Cyfer Sirolimus eluting coronary stent (sirolimus), Drug Coated Balloon (sirolimus), E-Magic Plus (sirolimus), Emtor (si- rolimus), Esprit (everolimus), Evertor (everolimus), HBF0079, LCP-Siro (sirolimus), Li- mus CLARIS (sirolimus), inibidor de mTor CELLZOME, Nevo Sirolimus eluting Coro-nary Stent (sirolimus), nPT-mTOR, Rapacan (sirolimus), Renacept (sirolimus), Re- Zolve (sirolimus), Rocas (sirolimus), SF1126, Sirolim (sirolimus), Sirolimus NORTH CHINA (sirolimus), Sirolimus RANBAXY (sirolimus), Sirolimus WATSON (sirolimus) Siropan (sirolimus) , Sirova (sirolimus), Supralimus (sirolimus), Supralimus-Core (siro- limus), Tacrolimus WATSON (tacrolimus), TAFA93, Temsirolimus ACCORD (temsiro- limus), Temsirolimus SANDOZ (temsirolimus), TOP216, Xience Prime (everolimus), Xience V (everolimus). Em um aspecto específico o inibidor de mTor é Afinitor (evero- limus) (http://www.afinitor.com/index.jsp?usertrack.filter_aplicado=true&No- vaId=4029462064338207963; último acesso 28/11/2012). Em outro aspecto, inibido-res de mTor pode ser identificado através de métodos conhecidos na técnica. (Vide, e.g., Zhou, H. Et al. Updates of inibidor of mTores. 2010). Anticâncer Agentes Med. Chem. 10(7): 571-81, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de mTor é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avançado. Em alguns aspectos, o inibidor de mTor é usado em combinação com um segundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui.
[0131]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de Src quinase. Em alguns aspectos, o inibidor de Src é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é selecionado a partir do grupo: AZD0530 (saracatinib), Bosulif (bosutinib), ENMD981693, KD020, KX01, Sprycel (dasatinib), Yervoy (ipilimumab), AP23464, AP23485, AP23588, AZD0424, c-Src Quinase Inibidor KISSEI, CU201, KX2361, SKS927, SRN004, SUNK706, TG100435, TG100948, AP23451, Dasatinib HETERO (dasatinib), Dasatinib VALEANT (dasatinib), Fontrax (dasatinib), inibidor de Src quinase KINEX, VX680, (tozasertib lactate), XL228, e SUNK706. Em algumas modalidades, o inibidor de Src quinase é dasatinib. Em outro aspecto, inibidor de Src quinase pode ser identificado através de métodos conhecidos na técnica (vide, e.g., Sen, B. E Johnson, F.M. Regulation of Src Family Kinases in Human canceres. 2011. J. Signal Transduction. 2011: 14 páginas, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente que é positivo para a assinatura de resposta para SRC (SRS). Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avançado. Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado em combinação com um segundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui.
[0132]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de COX-2. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é selecionado a partir do grupo: ABT963, Acetamino- feno ER JOHNSON (acetaminofeno), Acular X (cetorolac trometamina), BAY1019036 (aspirina), BAY987111 (difenhidramina, naproxeno de sódio), BAIl1902 (piroxicam), BCIBUCH001 (ibuprofeno), Capoxigem (apricoxib), CS502, CS670 (pelubiprofeno), Diclofenaco HPBCD (diclofenaco), Diractin (cetoprofeno), GW406381, HCT1026 (ni- troflurbiprofeno), Hianalgese-D (diclofenaco), HidrocoDex (acetaminofeno, dextrome- torfan, hidrocodona), Ibuprofeno de sódio PFIZER (ibuprofeno de sódio), Ibuprofeno com Acetaminofeno PFIZER (acetaminofeno, ibuprofeno), Impracor (cetoprofeno), IP880 (diclofenaco), IP940 (Indometacina), ISV205 (diclofenaco de sódio), JNS013 (acetaminofeno, hidrocloreto de tramadol), Cetoprofeno TDS (cetoprofeno), LTNS001 (naproxeno etemesil), Mesalamina SALIX (mesalamina), Mesalamina SOFAR (mesa-lamina), Mesalazine (mesalamina), ML3000 (licofelone), MRX7EAT (etodolac), Napro- xeno IROKO (naproxeno), NCX4016 (nitroaspirina), NCX701 (nitroacetaminofen), Nuprin SCOLR (ibuprofeno), OMS103HP (hidrocloreto de amitriptilina, cetoprofeno, hidrocloreto de oximetazolina), Oralease (diclofenaco), OxicoDex (dextrometorfan, oxicodona), P54, PercoDex (acetaminofeno, dextrometorfan, oxicodona), PL3100 (na- proxeno, fosfatidil colina), PSD508, R-Cetoprofeno (cetoprofeno), Remura (bromfenac de sódio), ROX828 (cetorolac trometamina), RP19583 (cetoprofeno lisina), RQ00317076, SDX101 (R-etodolac), TDS943 (diclofenaco de sódio), TDT070 (ceto- profeno), TPR100, TQ1011 (cetoprofeno), TT063 (S-flurbiprofeno), UR8880 (cimico- xib), V0498TA01A (ibuprofeno), VT122 (etodolac, propranolol), XP20B (acetamino- feno, dextropropoxifeno), XP21B (diclofenaco de potássio), XP21L (diclofenaco de po-tássio), Zoenasa (acetilcisteína, mesalamina), Acefen, Actifed Plus, Actifed-P, Acular, Acular LS, Acular PF, Acular X, Acuvaila, Advila, Advil Allergy Sinus, Advil Cold e Si-nus, Advil Congestion Relief, Advil PM, Advil PM Cápsula, Air Salonpas, Airtal, Alco-hol-Free NyQuil Cold & Flu Relief, Aleve, Aleve ABDI IBRAHIM, Aleve-D, Alka-Seltzer, Alka-Seltzer BAYER, Alka-Seltzer Extra Strength, Alka-Seltzer Lemon-Lime, Alka- Seltzer Original, Alka-Seltzer Plus, Alka-Seltzer plus Cold e Cough, Alka-Seltzer plus Cold e Cough Formula, Alka-Seltzer Plus Dia e Noite Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Day Not-Drowsy Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Flu Formula, Alka-Seltzer Plus Night Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Sinus Formula, Alka-Seltzer Plus Sparkling Original Cold Formula, Alka-Seltzer PM, Alka-Seltzer Wake-Up Call, Anacin, Anaprox, Anaprox MINERVA, Ansaid, Apitoxin, Apranax, Apranax abdi, Arcoxia, Arthritis Formula Ben- gay, Arthrotec, Asacol, Asacol HD, Asacol MEDUNA ARZNEIMITTEL, Asacol ORIFARM, Aspirina BAYER, Aspirina Complex, Aspirina Migran, AZD3582, Azulfidina, Baralgan M, BAY1019036, BAY987111, BAIl1902, BCIBUCH001, Benadril Allergy, Benadril Dia e Noite, Benilin 4 Flu, Benilin Cold e Flu, Benilin Cold e Flu Dia e Noite, Benilin Cold e Sinus Dia e Noite, Benilin Cold e Sinus Plus, Benilin Dia e Noite Cold e Flu Relief, Benilin1 All-Em-ona, Brexin, Brexin ANGELINI, Bromday, Bufferin, Busco- pan Plus, Caldolor, Calmatel, Cambia, Canasa, Capoxigem, Cataflam, Celebrex, Celebrex ORIFARM, Children’s Advil Allergy Sinus, Children’s Tylenol, Children’s Tylenol Cough e Runny Nose, Children’s Tylenol plus cold, Children’s Tylenol plus Cold e Cough, Children’s Tylenol plus cold e stuffy nose, Children’s Tylenol plus Flu, Children’s Tylenol plus cold & allergy, Children’s Tylenol plus Cough & Runny Nose, Children’s Tylenol plus Cough & Sore Throat, Children’s Tylenol plus multi sintoma cold, Clinorila, Codral Cold e Flu, Codral Dia e Noite Day Tablets, Codral Dia e Noite Night Tablets, Codral Nightime, Colazal, Combunox, Contac Cold plus Flu, Contac Cold plus Flu Not-Drowsy, Coricidin D, Coricidin HBP Cold e Flu, Coricidin HBP Dia e Noite Multi- Sintoma Cold, Coricidin HBP Maximum Strength Flu, Coricidin HBP Nighttime Multi- Sintoma Cold, Coricidin II Extra Strength Cold e Flu, CS502, CS670, Daypro, Daypro Alta, DDS06C, Demazin Cold e Flu, Demazin Cough, Cold e Flu, Demazin dia/noite Cold e Flu, Demazin PE Cold e Flu, Demazin PE dia/noite Cold e Flu, Diclofenaco HPBCD, Dimetapp Day Relief, Dimetapp Multi-Sintoma Cold e Flu, Dimetapp Night Relief, Dimetapp dor e Fever Relief, Dimetapp PE Sinus dor, Dimetapp PE Sinus dor plus Allergy, Dipentum, Diractin, Disprin Cold ‘n’ Fever, Disprin Extra, Disprin Forte. Disprin Plus, Dristan Cold, Dristan Junior, Drixoral Plus, Duexis, Dynastat, Efferalgan, Efferalgan Plus Vitamina C, Efferalgan Vitamina C, Elixsure IB, Excedrin Back e Corpo, Excedrin Migraine, Excedrin PM, Excedrin Sinus Headache, Excedrin Tension Headache, Falcol, Fansamac, Feldene, FeverAll, Fiorinal, Fiorinal com Codeine, Flanax, Flector Patch, Flucam, Fortagesic, Gerbin, Giazo, Gladio, Bomy’s Back e Corpo dor, Bomy’s Cool Laranja, Bomy’s Extra Strength, Bomy’s PM, Greaseless Bengay, GW406381, HCT1026, He Xing Yi, Hianalgese-D, HidrocoDex, Ibuprofeno de sódio PFIZER, Ibuprofeno com, Acetaminofeno PFIZER, Icy Hot SANOFI AVENTIS, Impra- cor, Indocin, Indometacina APP PHARMA, Indometacina MILAN, Infants’ Tylenol, IP880, IP940, Iremod, ISV205, JNS013, Jr. Tylenol, Junifen, Junior Strength Advila, Junior Strength Motrin, Cetoprofeno TDS, Lemsip Max, Lemsip Max All em Um, Lemsip Max All Night, Lemsip Max Cold e Flu, Lialda, Listerine Mouth Wash, Lloyds Cream, Lodine, Lorfit P, Loxonin, LTNS001, Mersyndol, Mesalamina SALIX, Mesala-mina SOFAR, Mesalazine, Mesasal GLAXO, Mesasal SANOFI, Mesulid, Metsal Heat Rub, Midol Complete, Midol Extended Relief, Midol Liquid Gels, Midol PM, Midol Teen Formula, Migranin COATED TABLETS, ML3000, Mobic, Mohrus, Motrin, Motrin Cold e Sinus dor, Motrin PM, Movalis ASPEN, MRX7EAT, Nalfon, Nalfon PEDINOL, Napre- lan, Naprosyn, Naprosyn RPG LIFE SCIENCE, Naproxeno IROKO, NCX4016, NCX701, NeoProfen LUNDBECK, Nevanac, Nexcede, Niflan, Norgesic MEDICIS, No- valgina, Nuprin SCOLR, Nurofen, Nurofen Cold e Flu, Nurofen Max Strength Migraine, Nurofen Plus, Nuromol, NyQuil com Vitamina C, Ocufen, OMS103HP, Oralease, Orudis ABBOTT JAPAN, Oruvaila, Osteluc, OxicoDex, P54, Panadol, Panadol Actifast, Paradine, Paramax, Parfenac, Pedea, Pennsaid, Pentasa, Pentasa ORIFARM, Peon, Percodan, Percodan-Demi, PercoDex, Percogesic, Perfalgan, PL2200, PL3100, Pons- tel, Prexige, Prolensa, PSD508, R-Cetoprofeno, Rantudila, Relafen, Remura, Robaxi- sal, Rotec, Rowasa, ROX828, RP19583, RQ00317076, Rubor, Salofalk, Salonpas, Saridon, SDX101, Seltouch, sfRowasa, Shinbaro, Sinumax, Sinutab, Sinutab, sinus, Spalt, Sprix, Strefen, Sudafed Cold e Cough, Sudafed Head Cold e Sinus, Sudafed PE Cold plus Cough, Sudafed PE Pressure plus dor, Sudafed PE, Severe Cold, Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Day Tablets, Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Night Tablets, Sudafed PE Sinus plus Anti-inflammatory pain Relief, Sudafed Sinus Advance, Surgam, Synalgos-DC, Synflex, Tavist allergy/sinus/headache, TDS943, TDT070, Theraflu Cold e Sore Throat, Theraflu Daytime Severe Cold e Cough, Ther- aflu Daytime Warming Relief,Theraflu Warming Relief Caplets Daytime Multi-Sintoma Cold, Theraflu Warming Relief Cold e Chest Congestion, Thomapirin, Thomapirin C, Thomapirin Effervescent, Thomapirin Medium, Tilcotila, Tispol, Tolectin, Toradol, TPR100, TQ1011, Trauma-Salbe, Trauma-Salbe Kwizda, Treo, Treximet, Trovex, TT063, Tylenol, Tylenol Allergy Multi-Sintoma, Tylenol Back dor, Tylenol Cold & Cough Daytime, Tylenol Cold & Cough Nighttime, Tylenol Cold e Sinus Daytime, Tylenol Cold e Sinus Nighttime, Tylenol Cold Head Congestion Severe, Tylenol Cold Multi Sintoma Daytime, Tylenol Cold Multi Sintoma Nighttime Liquid, Tylenol Cold Multi Sintoma Severe, Tylenol Cold Not-Drowsiness Formula, Tylenol Cold Severe Congestion Daytime, Tylenol Complete Cold, Cough e Flu Night time, Tylenol Flu Nighttime, Tylenol Menstrual, Tylenol PM, Tylenol Sinus Congestion & dor Daytime, Tylenol Sinus Congestion & dor Nighttime, Tylenol Sinus Congestion & dor Severe, Tylenol Sinus Severe Congestion Daytime, Tylenol Ultra Relief, Tylenol com Caffeine e Fosfato de codeína, Tylenol com Fosfato de codeína, Ultra Strength Bengay Cream, Ultracet, UR8880, V0498TA01A, Vicks NyQuil Cold e Flu Relief, Vicoprofen, Vimovo, Voltaren Emulgel, Voltaren GEL, Voltaren NOVARTIS CONSUMER HEALTH GMBH, Voltaren XR, VT122, Xefo, Xefo Rapid, Xefocam, Xibrom, XL3, Xodol, XP20B, XP21B, XP21L, Zipsor, e Zoenasa. Em outro aspecto, inibidores de COX-2 podem ser identifcados através de métodos conhecidos na técnica (vide, e.g., Dannhardt, G. E Kiefer, W. Ci- clooxigenase inhitors- current status and future prospects. 2001. Eur. J. Med. Chem. 36: 109-126, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avançado. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado em combinação com um segundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado em combinação com um segundo tratamento selecionado a partir do grupo que consiste de: Denosumab, Zometa (http://www.us.zometa.com/index.jsp?usertrack.filteraplicado =true& N o- vaId=2935376934467633633; acessado por último 12/2/2012), Carbozantinib ou Cabozantinib, Anticorpo ou peptídeo bloqueando PTHLH (hormônio similar a hormô-nio de paratireoide) ou PTHrP (proteína relacionada a hormônio de paratireoide).
[0133]Em uma modalidade, o tratamento é Rádio 223. Em uma modalidade preferida a terapia de Rádio 223 é Alfaradin (aka, Xofigo) (dicloreto de rádio-223). Alfaradin usa radiação alfa a partir da decaída de rádio-223 para exterminar células cancerígenas. Rádio-223 naturalmente auto direciona para as metástases nos ossos em virtude de suas propriedades como um mimético de cálcio. Alfa radiação tem uma faixa muito curta de 2-10 células (quando comparado a terapia de radiação atual que é com base em radiação beta ou gama), e, portanto, causa menos danos aos tecidos saudáveis circundantes (particularmente medula óssea). Com propriedades similares ao cálcio, rádio-223 é encaminhado a lugares onde o cálcio é usado para construir osso no corpo, incluindo o campo de desenvolvimento ósseo anormal mais rápido - tal como aqueles vistos nas metástases esquelética de homens com câncer de prós-tata avançado resistente a castração. Rádio-223, após injeção, é transportado pela corrente sanguínea a campos de desenvolvimento ósseo anormal. O local onde um câncer se inicia no corpo é conhecida como o tumor primário. Algumas das referidas células podem se romper e serem transportadas pela corrente sanguínea a outra parte do corpo. As células cancerígenas podem então se assentar naquela parte do corpo e formar um novo tumor. Se isso acontecer é chamado de câncer secundário ou a metástase. A maioria dos pacientes com estágio tardio de câncer de próstata sofrem da carga máxima da doença em seus ossos. O objetivo com rádio-223 é de se seletivamente objetivar esse câncer secundário. Qualquer rádio-223 não captado pelos ossos é rapidamente encaminhado para os intestinos e secretado.
[0134]Alternativamente um tratamento combinado pode ser realizado no qual mais do que um agente a partir dos mencionados acima são combinados para tratar e/ou evitar a metástase ou os referidos agentes podem ser combinados com outros suplementos, tal como cálcio ou vitamina D ou com um tratamento de hormônio.
[0135]Quando o câncer tiver sofrido metástase, tratamentos sistêmicos inclu-indo, mas não limitados a quimioterapia, hormônio de tratamento, imunoterapia, ou uma combinação dos mesmos são usados. Adicionalmente, radioterapia e/ou cirurgia pode ser usada. A escolha de tratamento em geral depende do tipo de câncer primário, do tamanho, do local da metástase, da idade, da saúde geral do paciente e dos tipos de tratamentos usados anteriormente.
[0136]Os tratamentos sistêmicos são aqueles que alcançam todo o corpo: -Quimioterapia é o uso de medicamentos para destruir células cancerígenas. Os medicamentos são em geral administrados através de via oral ou intravenosa. Al-gumas vezes, quimioterapia é usada junto com tratamento de radiação. -A hormônio terapia é com base no fato e que alguns hormônios promovem o desenvolvimento do câncer. Por exemplo, estrogênio em mulheres produzido pelos ovários algumas vezes promove o desenvolvimento do câncer de mama. Há diversos modos de parar a produção dos referidos hormônios. Um modo é de se remover os órgãos que produzem os mesmos: os ovários no caso de mulher, os testículos no caso dos homens. Mais frequentemente, medicamentos para evitar que referidos órgãos produzam os hormônios ou para evitar que os hormônios ajam nas células cancerígenas podem ser usados. -Imunoterapia é um tratamento que ajuda o sistema imune do paciente a combater câncer. Há diversos tipos de imunoterapia que são usados para tratar metástase nos pacientes. Os referidos incluem, mas não são limitados a citocinas, anticorpos monoclonais e vacinas antitumoral.
[0137]Pacientes que sofrem de câncer de próstata que já sofreram metástase para os ossos e nos quais há níveis elevados de c-MAF podem particularmente se beneficiar de terapias com o objetivo de evitar a degradação óssea causada pela maior atividade do osteoclasto.
[0138]Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia customizada para um indivíduo com câncer de prós-tata com metástase nos ossos que compreende: (ix)quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de me- tástase de tumor a partir de osso do referido indivíduo, e (x)comparar o nível de expressão anteriormente obtido com o nível de expres-são do referido gene em uma amostra de controle, em que se os níveis de expressão estão aumentados com relação aos níveis de expressão do referido gene na amostra de controle, então o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar a degradação óssea. em que se o níveis de expressão estão aumentados com relação ao referido valor de referência, então o referido indivíduo não é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar e/ou tratar a metástase nos ossos.
[0139]Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de próstata”, “amostra de tumor”, “metástase”, “determinação de níveis de expressão”, “gene c-MAF”, “níveis de expressão aumentados” e “amostra de controle” foram descritos em detalhes em re-lação ao primeiro método da presente invenção e são igualmente aplicáveis aos se-gundo e terceiro método da presente invenção.
[0140]Em uma modalidade preferida, a metástase nos ossos é metástase os- teolítica.
[0141]O terceiro método da presente invenção compreende em uma primeira etapa, quantificar o nível de expressão de gene c-MAF em uma amostra de tumor em um indivíduo que sofre de câncer de próstata. No caso do terceiro método da presente invenção, a amostra é uma amostra de tecido a partir de metástase nos ossos.
[0142]Em uma modalidade preferida, o terceiro método da presente invenção compreende quantificar apenas o nível de expressão de gene c-MAF como um único marcador, i.e., o método não envolve determinar o nível de expressão de qualquer marcador adicional.
[0143]Em uma segunda etapa o nível de expressão de gene c-MAF obtido na amostra de tumor do indivíduo é comparado com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão de gene c-MAF deve ser correlacionada a valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim, no caso envolvendo o terceiro método da presente invenção, então a amostra de referência é a amostra de tecido tumoral de indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio do nível de expressão de gene c-MAF medido em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreu metástase.
[0144]Uma vez que o nível de expressão de gene c-MAF na amostra é medido e comparado com a amostra de controle, se o nível de expressão do referido gene é aumentado com relação ao seu nível de expressão na amostra de controle, então pode ser concluído que o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de impedir ou evitar a degradação óssea.
[0145]Como usado aqui, um “agente para impedir ou evitar a degradação ós-sea” se refere a qualquer molécula capaz de tratar ou parar a degradação óssea seja por estimular a proliferação de osteoblasto ou inibir a proliferação de osteoclasto. Exemplos ilustrativos dos agentes usados para impedir e/ou evitar degradação óssea incluem, embora não limitados a: - Inibidores de hormônio de paratireoide (PTH) e Hormônio similar a paratire- oide (PTHLH) (incluindo anticorpos de bloqueio) ou formas recombinantes do mesmo (teriparatide que corresponde aos aminoácidos 7-34 de PTH). O referido hormônio age por estimular os osteoclastos e aumentar a sua atividade. - Ranelato de estrôncio: é um tratamento oral alternativo, e forma parte do grupo de fármacos chamados “agentes de ação duplo nos ossos” (DABAs) pelo fato de que estimulam a proliferação de osteoblasto e inibem a proliferação de osteoclasto. - “Moduladores receptores de estrogênio” (SERM) se referem a compostos que interferem ou inibem a ligação de estrogênios ao receptor, independente do me-canismo. Exemplos de Moduladores receptores de estrogênio incluem, entre outros, estrogênios progestagen, estradiol, droloxifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, TSE-424, ta-moxifen, idoxifeno, L Y353381, LY117081, toremifeno, fluvestrant, 4-[7-(2,2-dimetil-1- oxopropoxi-4-metil-2-[4-[2-(1-piperidinil)etoxi]fenil]-2H-1-benzopiran-3-il]-fenil-2,2-di- metilpropanoato 4,4’dihidroxibenzofenona-2,4-dinitrofenil-hidrazone e SH646. - Calcitonina: diretamente inibe a atividade de osteoclasto através do receptor de calcitonina. Os receptores de calcitonina foram identificados na superfície dos os- teoclastos. - Bisfosfonatos: são um grupo de produtos medicinais usados para a preven-ção e o tratamento de doenças com reabsorção do osso e reabsorção tal como oste- oporose e câncer com metástase nos ossos, o último sendo com ou sem hipercalce- mia, associada a câncer de mama e câncer de próstata. Exemplos de bisfosfonatos que podem ser usados em terapia projetada por meio do quinto método da presente invenção incluem, embora não limitados a, bisfosfonatos nitrogenosos (tal como pa- midronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronato, incadro- nato, zoledronato ou ácido zoledrônico, etc.) e bisfosfonatos não nitrogenosos (tal como etidronato, clodronato, tiludronato, etc.). -“Inibidor de catepsina Kes” se refere a compostos que interferem na atividade da protease de cisteína catepsina K. Exemplos não limitantes de inibidor de catepsina Kes incluem derivados de 4-amino-pirimidina-2-carbonitrila (descrito no pedido de patente internacional WO 03/020278 sob o nome de Novartis Pharma GMBH), pirrolo- pirimidinas descritas na publicação WO 03/020721 (Novartis Pharma GMBH) e a pu-blicação WO 04/000843 (ASTRAZENECA AB) assim como os inibidores descritos nas publicações PCT WO 00/55126 de Axys Pharmaceuticals, WO 01/49288 de Merck Frosst Canada & Co. E Axys Pharmaceuticals. -“DKK-1(Dickkopf-1) inibidor” como usado aqui se refere a qualquer composto que é capaz de reduzir atividade de DKK-1. DKK-1 é um antagonista de trajeto Wnt solúvel expresso predominantemente em osso de adulto e regulado para mais em mieloma de pacientes com lesões osteolíticas. Agentes de objetivação de DKK-1 podem desempenhar um papel em evitar doença osteolítica nos ossos em pacientes com múltiplos mielomas. BHQ880 a partir da Novartis é um primeiro-em-classe, anticorpo de neutralização anti-DKK-1, completamente humano. Estudos pré-clínicos suportam a hipótese de que BHQ880 promove a formação de osso e desse modo inibe doença osteolítica induzida a tumor (Ettenberg S. Et al., American Association for cancer Research Annual Meeting. April 12-16, 2008; San Diego, Calif. Abstract). -“Inibidor Dual MET e VEGFR2” como usado aqui se refere a qualquer com-posto que é um potente inibidor dos trajetos de MET e VEGF duplo projetado para bloquear o escape de tumor acionado a MET. MET é expresso não só em células tumorais e células endoteliais, mas também em osteoblastos (células de formação de osso) e osteoclastos (células de remoção de osso). HGF se liga a MET em todos os referidos tipos de célula, dando ao trajeto MET um importante papel em múltiplos ci-clos autócrino e parácrina. A ativação de MET em células tumorais parece ser impor-tante no estabelecimento de lesões metastáticas nos ossos. Ao mesmo tempo, ativa-ção do trajeto MET em osteoblastos e osteoclastos pode levar a características pato-lógicas de metástases nos ossos, incluindo desenvolvimento ósseo anormal (ie, le-sões blásticas) ou destruição (ie, lesão lítica. Assim, a objetivação do trajeto MET pode ser uma estratégia viável em evitar o estabelecimento e progressão de lesões metas- táticas nos ossos. Cabozantinib (Exelixis, Inc), anteriormente conhecido como XL184 (CAS 849217-68-1), é um potente inibidor dos trajetos de MET e VEGF duplo proje-tado para bloquear o escape de tumor acionado a MET. Em múltiplos estudos pré- clínicos cabozantinib foi mostrado exterminar células tumorais, reduzir metástases, e inibir angiogênese (a formação de novos vasos sanguíneos necessário para suportar o desenvolvimento do tumor). Outros duplos inibidores adequados são E7050 (N-[2- Fluoro-4-({2-[4-(4-metilpiperazin-1-il)piperidin-1-il] carbonilaminopiridin-4-il} oxi) fenil]- N‘-(4-fluorofenil) ciclopropano-1,1-dicarboxamida (2R,3R)-tartrato) (CAS 928037-132) ou Foretinib (também conhecida como GSK1363089, XL880, CAS 849217-64-7). -“Inibidores de RANKL” como usado aqui se refere a qualquer composto que é capaz de reduzir a atividade de RANK. RANKL é encontrado na superfície da mem-brana do osteoblasto do estroma e células de linfócito T, e as referidas células de linfócito T são as únicas que demonstraram a capacidade de secretar o mesmo. A sua principal função é a ativação dos osteoclastos, células envolvidas na reabsorção do osso. Os inibidores de RANKL podem agir por bloquear a ligação de RANKL ao seu receptor (RANK), bloqueando a sinalização mediada a RANK ou reduzir a expressão de RANKL por bloquear a transcrição ou a tradução de RANKL. Antagonistas de RANK ou inibidores adequados para uso na presente invenção incluem, sem limitação: oa proteína RANK adequada que é capaz de se ligar a RANKL e que compreende a totalidade ou um fragmento do domínio extracelular da proteína RANK. A RANK solúvel pode compreender o peptídeo de sinal e o domínio extracelular dos polipeptídeos RANK de murino ou humano, ou alternativamente, a forma madura da proteína com o peptídeo de sinal removido pode ser usada. oOsteoprotegerina ou uma variante do mesmo com capacidade de ligação a RANKL. oMoléculas antisenso específicas de RANKL oRibozimas capazes de processar os produtos transcritos de RANKL oAnticorpos anti-RANKL específicos. “Anticorpo anti-RANKL ou anticorpo di-recionado contra RANKL” é entendido aqui como todo aquele anticorpo que é capaz de se ligar especificamente ao ligante do receptor de ativação para a inibição de fator nuclear kB (RANKL) de uma ou mais funções RANKL. Os anticorpos podem ser pre-parados usando qualquer dos métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Assim, os anticorpos policlonais são preparados por meio de imunizar um animal com a proteína a ser inibida. Os anticorpos monoclonais são preparados usando o método descrita por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). Anticor-pos adequados no contexto da presente invenção incluem anticorpos intactos que compreendem a região de ligação a antígeno variável e uma região constante, frag-mentos “Fab”, “F(ab')2” e “Fab'”, Fv, scFv, diacorpos e anticorpos biespecífcos. oNanocorpos anti-RANKL específicos. Nanocorpos são proteínas terapêuti-cas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais e funcionais úni-cas dos anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. A tecnologia de nano- corpo foi originalmente desenvolvida em seguida da descoberta de que camelidae (camelos e lhamas) possuem anticorpos completamente funcionais que faltam de ca-deias leves. A estrutura geral de nanocorpos é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4 oem que FR1 a FR4 são as regiões de estrutura 1 a 4 CDR1 a CDR3 são as regiões de determinação complementares 1 a 3. Os referidos anticorpos de cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Importante, o domínio VHH clonado e isolado é a polipeptídeo perfeitamente estável que abriga a capacidade de ligação a antígeno completa do anticorpo de ca-deia pesada original. Os referidos domínios recém-descobertos com as suas únicas propriedades funcionais e estruturais formam a base de uma nova geração de anti-corpos terapêuticos que Ablynx nomeou de nanocorpos.
[0146]Em uma modalidade, o inibidor de RANKL é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo específico de RANKL, um nanocorpo específico de RANKL e osteoprotegerina. Em uma modalidade específica, o anticorpo anti- RANKL é um anticorpo monoclonal. Ainda em uma modalidade mais específica, o anticorpo anti-RANKL é Denosumab (Pageau, Steven C. (2009). mAbs 1 (3): 210-215, CAS número 615258-40-7) (os conteúdos totais da qual se encontram aqui incorporados por referência). Denosumab é anticorpo monoclonal completamente humano que se liga a RANKL e evita a sua ativação (ele não se liga ao receptor RANK). Vários aspectos de Denosumab são cobertos pelas Patentes US Nos. 6,740,522; 7,411,050; 7,097,834; 7,364,736 (os conteúdos totais de cada uma das quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Em outra modalidade, o inibidor de um anticorpo RANK, fragmento de anticorpo, ou construtor de fusão que liga o mesmo epí- topo como Denosumab.
[0147]Em uma modalidade preferida, o nanocorpo anti-RANKL é qualquer um dos nanocorpos como descrito em WO2008142164, (os conteúdos totais de cada uma das quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade). Em ainda uma outra modalidade mais preferida, o anticorpo anti-RANKL é o ALX-0141 (Ablynx). ALX- 0141 foi projetado para inibir a perda de osso associada com osteoporose pós menopausa, artrite reumatóide, câncer e determinadas medicações, e para restaurar o equilíbrio de metabolismo do osso saudável.
[0148]Em uma modalidade preferida, o agente que evita a degradação óssea é selecionado a partir do grupo que consiste de um bisfosfonato, um inibidor de RANKL, e inibidor de PTHLH ou PTH ou um análogo de PRG, ranelato de estrôncio, um inibidor de DKK-1, um inibidor duplo de MET e VEGFR2, um modulador receptor de estrogênio, Rádio-223, calcitonina, e um inibidor de catepsina K. Em uma modali-dade mais preferida o agente que evita a degradação óssea é um bisfosfonato. Em ainda uma modalidade mais preferida, o bisfosfonato é o ácido zoledrônico.
[0149]Em uma modalidade, um antagonista de CCR5 é administrado para evitar ou inibir metástase do tumor de câncer primário de próstata ao osso. Em uma modalidade, o antagonista de CCR5 é uma grande molécula. Em outra modalidade, o antagonista de CCR5 é uma pequena molécula. Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é Maraviroc (Velasco-Veláquez, M. Et al. 2012. CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells. Cancer Research. 72:3839-3850). Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é Vicriviroc. Velasco-Veláquez, M. Et al. 2012. CCR5 Antagonist Blocks Metastasis of Basal Breast Cancer Cells. Cancer Research. 72:3839-3850). Em alguns aspectos, o antagonista de CCR5 é Aplaviroc (Demarest J.F. Et al. 2005. Update on Aplaviroc: An HIV Entry Inibidor A objetivação de CCR5. Retrovirology 2(Suppl. 1): S13). Em alguns aspectos, o antagonista de CCR5 é a spiropiperidina antagonista de CCR5. (Rotstein D.M. Et al. 2009. Spiropiperidine CCR5 antagonists. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 19 (18): 54015406. Em algumas modalidades, o antagonista de CCR5 é INCB009471 (Kuritzkes, D.R. 2009. HIV-1 entry inhibitors: an overview. Curr. Opin. HIV AIDS. 4(2): 82-7).
[0150]Em uma modalidade preferida o inibidor MET e VEGFR2 duplo é sele-cionado a partir do grupo que consiste em Cabozantinib, Foretinib e E7050.
[0151]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de mTor. Em alguns as-pectos, o inibidor de mTor é um inibidor de mTor/PI3 quinase duplo. Em alguns as-pectos, o inibidor de mTor é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos o inibidor de mTor é selecionado a partir do grupo que consiste de: ABI009 (sirolimus), rapamicina (sirolimus), Abraxane (paclitaxel), Absorb (everolimus), Afinitor (everoli- mus), Afinitor com Gleevec, AS703026 (pimasertib), Axxess (umirolimus), AZD2014, BEZ235, Biofreedom (umirolimus), BioMatrix (umirolimus), BioMatrix flex (umirolimus), CC115, CC223, Combo Bio-engineered Sirolimus Eluting Stent ORBUSNEICH (siroli- mus), Curaxin CBLC102 (mepacrine), DE109 (sirolimus), DS3078, Endeavor DES (zo- tarolimus), Endeavor Resolute (zotarolimus), Femara (letrozole), Hocena (antroquinonol), INK128, Inspiron (sirolimus), IPI504 (hidrocloreto de retaspimicina), KRN951 (tivozanib), ME344, MGA031 (teplizumab), MiStent SES (sirolimus), MKC1, Nobori (umirolimus), OSI027, OVI123 (cordycepin), Palomid 529, PF04691502, Pro- mus Element (everolimus), PWT33597, Rapamune (sirolimus), Resolute DES (zotaro- limus), RG7422, SAR245409, SF1126, SGN75 (vorsetuzumab mafodotin), Synergy (everolimus), Taltorvic (ridaforolimus), Tarceva (erlotinib), Torisel (temsirolimus), Xience Prime (everolimus), Xience V (everolimus), Zomaxx (zotarolimus), Zortress (everolimus), Zotarolimus Eluting Periferal Stent MEDTRONIC (zotarolimus), AP23841, AP24170, ARmTOR26, BN107, BN108, Canstatin GENZIMA (canstatin), CU906, EC0371, EC0565, KI1004, LOR220, NV128, Rapamicina ONCOIMMUNE (si- rolimus), SB2602, Sirolimus PNP SAMYANG BIOPHARMACEUTICALS (sirolimus), TOP216, VLI27, VS5584, WYE125132, XL388, Advacan (everolimus), AZD8055, Cyfer Select Plus Sirolimus eluting Coronary Stent (sirolimus), Estente coronário com eluição de Sirolimus cyfer selected plus (sirolimus), balão revestido de fármaco (siro- limus), E-Magic Plus (sirolimus), Emtor (sirolimus), Esprit (everolimus), Evertor (eve- rolimus), HBF0079, LCP-Siro (sirolimus), Limus CLARIS (sirolimus), inibidor de mTor CELLZOME, Estente coronário eluído com Nevo Sirolimus (sirolimus), nPT-mTOR, Rapacan (sirolimus), Renacept (sirolimus), ReZolve (sirolimus), Rocas (sirolimus), SF1126, Sirolim (sirolimus), Sirolimus NORTH CHINA (sirolimus), Sirolimus RANBAXY (sirolimus), Sirolimus WATSON (sirolimus) Siropan (sirolimus), Sirova (si- rolimus), Supralimus (sirolimus), Supralimus-Core (sirolimus), Tacrolimus WATSON (tacrolimus), TAFA93, Temsirolimus ACCORD (temsirolimus), Temsirolimus SANDOZ (temsirolimus), TOP216, Xience Prime (everolimus), Xience V (everolimus). Em um aspecto específico o inibidor de mTor é Afinitor (everolimus) (http://www.afini- tor.com/index.jsp?usertrack.filter_aplicado=true&NovaId=4029462064338207963; acessado por último 11/28/2012). Em outro aspecto, inibidores de mTor podem ser identifcados através de métodos conhecidos na técnica. (vide, e.g., Zhou, H. Et al. Updates of mTor inhibitors. 2010. Anticancer Agents Med. Chem. 10(7): 571-81, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de mTor é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avan-çado. Em alguns aspectos, o inibidor de mTor é usado em combinação com um se-gundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui.
[0152]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de Src quinase. Em alguns aspectos, o inibidor de Src é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é selecionado a partir do grupo: AZD0530 (saracatinib), Bosulif (bosutinib), ENMD981693, KD020, KX01, Sprycel (dasatinib), Yervoy (ipilimu- mab), AP23464, AP23485, AP23588, AZD0424, inibidor de c-Src Quinase KISSEI, CU201, KX2361, SKS927, SRN004, SUNK706, TG100435, TG100948, AP23451, Dasatinib HETERO (dasatinib), Dasatinib VALEANT (dasatinib), Fontrax (dasatinib), inibidor de Src quinase KINEX, VX680, (tozasertib lactate), XL228, e SUNK706. Em algumas modalidades, o inibidor de Src quinase é dasatinib. Em outro aspecto, inibidores de Src quinase podem ser identifcados através de métodos conhecidos na técnica (vide, e.g., Sen, B. E Johnson, F.M. Regulation of Src Family Kinases in Human canceres. 2011. J. Signal Transduction. 2011: 14 pages, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente que é positivo para a assinatura de resposta para SRC (SRS). Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avançado. Em alguns aspectos, o inibidor de Src quinase é usado em combinação com um segundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui.
[0153]Em outro aspecto, o tratamento é um inibidor de COX-2. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado para evitar ou inibir metástase. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é selecionado a partir do grupo: ABT963, Acetamino- feno ER JOHNSON (acetaminofeno), Acular X (cetorolac trometamina), BAY1019036 (aspirina), BAY987111 (difenhidramina, naproxeno de sódio), BAIl1902 (piroxicam), BCIBUCH001 (ibuprofeno), Capoxigem (apricoxib), CS502, CS670 (pelubiprofeno), Diclofenaco HPBCD (diclofenaco), Diractin (cetoprofeno), GW406381, HCT1026 (ni- troflurbiprofeno), Hianalgese-D (diclofenaco), HidrocoDex (acetaminofeno, dextrome- torfan, hidrocodona), Ibuprofeno de sódio PFIZER (ibuprofeno de sódio), Ibuprofeno com Acetaminofeno PFIZER (acetaminofeno, ibuprofeno), Impracor (cetoprofeno), IP880 (diclofenaco), IP940 (Indometacina), ISV205 (diclofenaco de sódio), JNS013 (acetaminofeno, hidrocloreto de tramadol), Cetoprofeno TDS (cetoprofeno), LTNS001 (naproxeno etemesil), Mesalamina SALIX (mesalamina), Mesalamina SOFAR (mesa-lamina), Mesalazine (mesalamina), ML3000 (licofelone), MRX7EAT (etodolac), Napro- xeno IROKO (naproxeno), NCX4016 (nitroaspirina), NCX701 (nitroacetaminofen), Nuprin SCOLR (ibuprofeno), OMS103HP (hidrocloreto de amitriptilina, cetoprofeno, hidrocloreto de oximetazolina), Oralease (diclofenaco), OxicoDex (dextrometorfan, oxicodona), P54, PercoDex (acetaminofeno, dextrometorfan, oxicodona), PL3100 (na- proxeno, fosfatidil colina), PSD508, R-Cetoprofeno (cetoprofeno), Remura (bromfenac de sódio), ROX828 (cetorolac trometamina), RP19583 (cetoprofeno lisina), RQ00317076, SDX101 (R-etodolac), TDS943 (diclofenaco de sódio), TDT070 (ceto- profeno), TPR100, TQ1011 (cetoprofeno), TT063 (S-flurbiprofeno), UR8880 (cimico- xib), V0498TA01A (ibuprofeno), VT122 (etodolac, propranolol), XP20B (acetamino- feno, dextropropoxifeno), XP21B (diclofenaco de potássio), XP21L (diclofenaco de po-tássio), Zoenasa (acetilcisteína, mesalamina), Acefen, Actifed Plus, Actifed-P, Acular, Acular LS, Acular PF, Acular X, Acuvaila, Advila, Advil Allergy Sinus, Advil Cold e Si-nus, Advil Congestion Relief, Advil PM, Advil PM Cápsula, Air Salonpas, Airtal, Alco-hol-Free NyQuil Cold & Flu Relief, Aleve, Aleve ABDI IBRAHIM, Aleve-D, Alka-Seltzer, Alka-Seltzer BAYER, Alka-Seltzer Extra Strength, Alka-Seltzer Lemon-Lime, Alka- Seltzer Original, Alka-Seltzer Plus, Alka-Seltzer plus Cold e Cough, Alka-Seltzer plus Cold e Cough Formula, Alka-Seltzer Plus Dia e Noite Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Day Not-Drowsy Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Flu Formula, Alka-Seltzer Plus Night Cold Formula, Alka-Seltzer Plus Sinus Formula, Alka-Seltzer Plus Sparkling Original Cold Formula, Alka-Seltzer PM, Alka-Seltzer Wake-Up Call, Anacin, Anaprox, Anaprox MINERVA, Ansaid, Apitoxin, Apranax, Apranax abdi, Arcoxia, Arthritis Formula Ben- gay, Arthrotec, Asacol, Asacol HD, Asacol MEDUNA ARZNEIMITTEL, Asacol ORIFARM, Aspirina BAYER, Aspirina Complex, Aspirina Migran, AZD3582, Azulfidina, Baralgan M, BAY1019036, BAY987111, BAIl1902, BCIBUCH001, Benadril Allergy, Benadril Dia e Noite, Benilin 4 Flu, Benilin Cold e Flu, Benilin Cold e Flu Dia e Noite, Benilin Cold e Sinus Dia e Noite, Benilin Cold e Sinus Plus, Benilin Dia e Noite Cold e Flu Relief, Benilin1 All-Em-ona, Brexin, Brexin ANGELINI, Bromday, Bufferin, Busco- pan Plus, Caldolor, Calmatel, Cambia, Canasa, Capoxigem, Cataflam, Celebrex, Celebrex ORIFARM, Children’s Advil Allergy Sinus, Children’s Tylenol, Children’s Tylenol Cough e Runny Nose, Children’s Tylenol plus cold, Children’s Tylenol plus Cold e Cough, Children’s Tylenol plus cold e stuffy nose, Children’s Tylenol plus Flu, Children’s Tylenol plus cold & allergy, Children’s Tylenol plus Cough & Runny Nose, Children’s Tylenol plus Cough & Sore Throat, Children’s Tylenol plus multi sintoma cold, Clinorila, Codral Cold e Flu, Codral Dia e Noite Day Tablets, Codral Dia e Noite Night Tablets, Codral Nightime, Colazal, Combunox, Contac Cold plus Flu, Contac Cold plus Flu Not-Drowsy, Coricidin D, Coricidin HBP Cold e Flu, Coricidin HBP Dia e Noite Multi- Sintoma Cold, Coricidin HBP Maximum Strength Flu, Coricidin HBP Nighttime Multi- Sintoma Cold, Coricidin II Extra Strength Cold e Flu, CS502, CS670, Daypro, Daypro Alta, DDS06C, Demazin Cold e Flu, Demazin Cough, Cold e Flu, Demazin dia/noite Cold e Flu, Demazin PE Cold e Flu, Demazin PE dia/noite Cold e Flu, Diclofenaco HPBCD, Dimetapp Day Relief, Dimetapp Multi-Sintoma Cold e Flu, Dimetapp Night Relief, Dimetapp dor e Fever Relief, Dimetapp PE Sinus dor, Dimetapp PE Sinus dor plus Allergy, Dipentum, Diractin, Disprin Cold ‘n’ Fever, Disprin Extra, Disprin Forte. Disprin Plus, Dristan Cold, Dristan Junior, Drixoral Plus, Duexis, Dynastat, Efferalgan, Efferalgan Plus Vitamina C, Efferalgan Vitamina C, Elixsure IB, Excedrin Back e Corpo, Excedrin Migraine, Excedrin PM, Excedrin Sinus Headache, Excedrin Tension Headache, Falcol, Fansamac, Feldene, FeverAll, Fiorinal, Fiorinal com Codeine, Flanax, Flector Patch, Flucam, Fortagesic, Gerbin, Giazo, Gladio, Bomy’s Back e Corpo dor, Bomy’s Cool Laranja, Bomy’s Extra Strength, Bomy’s PM, Greaseless Bengay, GW406381, HCT1026, He Xing Yi, Hianalgese-D, HidrocoDex, Ibuprofeno de sódio PFIZER, Ibuprofeno com, Acetaminofeno PFIZER, Icy Hot SANOFI AVENTIS, Impra- cor, Indocin, Indometacina APP PHARMA, Indometacina MILAN, Infants’ Tylenol, IP880, IP940, Iremod, ISV205, JNS013, Jr. Tylenol, Junifen, Junior Strength Advila, Junior Strength Motrin, Cetoprofeno TDS, Lemsip Max, Lemsip Max All em Um, Lemsip Max All Night, Lemsip Max Cold e Flu, Lialda, Listerine Mouth Wash, Lloyds Cream, Lodine, Lorfit P, Loxonin, LTNS001, Mersyndol, Mesalamina SALIX, Mesalamina SOFAR, Mesalazine, Mesasal GLAXO, Mesasal SANOFI, Mesulid, Metsal Heat Rub, Midol Complete, Midol Extended Relief, Midol Liquid Gels, Midol PM, Midol Teen Formula, Migranin COATED TABLETS, ML3000, Mobic, Mohrus, Motrin, Motrin Cold e Sinus dor, Motrin PM, Movalis ASPEN, MRX7EAT, Nalfon, Nalfon PEDINOL, Napre- lan, Naprosyn, Naprosyn RPG LIFE SCIENCE, Naproxeno IROKO, NCX4016, NCX701, NeoProfen LUNDBECK, Nevanac, Nexcede, Niflan, Norgesic MEDICIS, No- valgina, Nuprin SCOLR, Nurofen, Nurofen Cold e Flu, Nurofen Max Strength Migraine, Nurofen Plus, Nuromol, NyQuil com Vitamina C, Ocufen, OMS103HP, Oralease, Orudis ABBOTT JAPAN, Oruvaila, Osteluc, OxicoDex, P54, Panadol, Panadol Actifast, Paradine, Paramax, Parfenac, Pedea, Pennsaid, Pentasa, Pentasa ORIFARM, Peon, Percodan, Percodan-Demi, PercoDex, Percogesic, Perfalgan, PL2200, PL3100, Pons- tel, Prexige, Prolensa, PSD508, R-Cetoprofeno, Rantudila, Relafen, Remura, Robaxi- sal, Rotec, Rowasa, ROX828, RP19583, RQ00317076, Rubor, Salofalk, Salonpas, Saridon, SDX101, Seltouch, sfRowasa, Shinbaro, Sinumax, Sinutab, Sinutab, sinus, Spalt, Sprix, Strefen, Sudafed Cold e Cough, Sudafed Head Cold e Sinus, Sudafed PE Cold plus Cough, Sudafed PE Pressure plus dor, Sudafed PE, Severe Cold, Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Day Tablets, Sudafed PE Sinus Day plus Night Relief Night Tablets, Sudafed PE Sinus plus Anti-inflammatory pain Relief, Sudafed Sinus Advance, Surgam, Synalgos-DC, Synflex, Tavist allergy/sinus/headache, TDS943, TDT070, Theraflu Cold e Sore Throat, Theraflu Daytime Severe Cold e Cough, Ther- aflu Daytime Warming Relief,Theraflu Warming Relief Caplets Daytime Multi-Sintoma Cold, Theraflu Warming Relief Cold e Chest Congestion, Thomapirin, Thomapirin C, Thomapirin Effervescent, Thomapirin Medium, Tilcotila, Tispol, Tolectin, Toradol, TPR100, TQ1011, Trauma-Salbe, Trauma-Salbe Kwizda, Treo, Treximet, Trovex, TT063, Tylenol, Tylenol Allergy Multi-Sintoma, Tylenol Back dor, Tylenol Cold & Cough Daytime, Tylenol Cold & Cough Nighttime, Tylenol Cold e Sinus Daytime, Tylenol Cold e Sinus Nighttime, Tylenol Cold Head Congestion Severe, Tylenol Cold Multi Sintoma Daytime, Tylenol Cold Multi Sintoma Nighttime Liquid, Tylenol Cold Multi Sintoma Severe, Tylenol Cold Not-Drowsiness Formula, Tylenol Cold Severe Congestion Daytime, Tylenol Complete Cold, Cough e Flu Night time, Tylenol Flu Nighttime, Tylenol Menstrual, Tylenol PM, Tylenol Sinus Congestion & dor Daytime, Tylenol Sinus Congestion & dor Nighttime, Tylenol Sinus Congestion & dor Severe, Tylenol Sinus Severe Congestion Daytime, Tylenol Ultra Relief, Tylenol com Caffeine e Fosfato de codeína, Tylenol com Fosfato de codeína, Ultra Strength Bengay Cream, Ultracet, UR8880, V0498TA01A, Vicks NyQuil Cold e Flu Relief, Vicoprofen, Vimovo, Voltaren Emulgel, Voltaren GEL, Voltaren NOVARTIS CONSUMER HEALTH GMBH, Voltaren XR, VT122, Xefo, Xefo Rapid, Xefocam, Xibrom, XL3, Xodol, XP20B, XP21B, XP21L, Zipsor, e Zoenasa. Em outro aspecto, inibidores de COX-2 podem ser identifcados através de métodos conhecidos na técnica (vide, e.g., Dannhardt, G. E Kiefer, W. Ci- clooxigenase inhibitors - current status and future prospects. 2001. Eur. J. Med. Chem. 36: 109-126, que é aqui incorporado por referência). Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado para tratar ou evitar ou inibir metástase em um paciente com câncer de próstata avançado. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado em combinação com um segundo tratamento. Em alguns aspectos, o segundo tratamento é qualquer tratamento descrito aqui. Em alguns aspectos, o inibidor de COX-2 é usado em combinação com um segundo tratamento selecionado a partir do grupo que consiste de: Denosumab, Zometa (http://www.us.zometa.com/index.jsp?usertrack.filteraplicado= t ru e& N o- vaId=2935376934467633633; acessado por último 12/2/2012), Carbozantinib ou Ca- bozantinib, Anticorpo ou peptídeo bloqueando PTHLH (hormônio similar a hormônio de paratireoide) ou PTHrP (proteína relacionada a hormônio de paratireoide).
[0154]Em uma modalidade, o tratamento é Rádio 223. Em uma modalidade preferida a terapia de Rádio 223 é Alfaradin (aka, Xofigo) (dicloreto de rádio-223). Alfaradin usa radiação alfa a partir da decaída de rádio-223 para exterminar células cancerígenas. Rádio-223 naturalmente auto direciona para as metástases nos ossos em virtude de suas propriedades como um mimético de cálcio. Alfa radiação tem uma faixa muito curta de 2-10 células (quando comparado a terapia de radiação atual que é com base em radiação beta ou gama), e, portanto, causa menos danos aos tecidos saudáveis circundantes (particularmente medula óssea). Com propriedades similares ao cálcio, rádio-223 é encaminhado a lugares onde o cálcio é usado para construir osso no corpo, incluindo o campo de desenvolvimento ósseo anormal mais rápido - tal como aqueles vistos nas metástases esquelética de homens com câncer de prós-tata avançado resistente a castração. Rádio-223, após injeção, é transportado pela corrente sanguínea a campos de desenvolvimento ósseo anormal. O local onde um câncer se inicia no corpo é conhecida como o tumor primário. Algumas das referidas células podem se romper e serem transportadas pela corrente sanguínea a outra parte do corpo. As células cancerígenas podem então se assentar naquela parte do corpo e formar um novo tumor. Se isso acontecer é chamado de câncer secundário ou a metástase. A maioria dos pacientes com estágio tardio de câncer de próstata sofrem da carga máxima da doença em seus ossos. O objetivo com rádio-223 é de se seleti-vamente objetivar esse câncer secundário. Qualquer rádio-223 não captado pelos os-sos é rapidamente encaminhado para os intestinos e secretado.
[0155]Alternativamente um tratamento combinado pode ser realizado no qual mais do que um agente a partir dos mencionados acima são combinados para tratar e/ou evitar a metástase ou os referidos agentes podem ser combinados com outros suplementos, tal como cálcio ou vitamina D ou com um tratamento de hormônio.
[0156]Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata (daqui em diante, quarto método de diagnóstico da presente invenção) e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata que compreende determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra de tecido tumoral do referido indivíduo; em que se o referido gene é amplificado com relação a uma amostra de controle, então o referido indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[0157]Os termos “gene c-MAF”, “metástase”, “amostra de tumor”, “câncer de próstata”, “diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata”, “prog-nóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata”, “indivíduo”, “paciente”, “indivíduo tendo um diagnóstico positivo de metástase”, “indivíduo tendo uma maior tendência de desenvolver metástase” foram descritos em detalhes no contexto do primeiro método da presente invenção e são igualmente aplicáveis ao quarto método da presente invenção.
[0158]Em uma modalidade particular, o grau de amplificação do gene c-MAF pode ser determinado por meio de determinar a amplificação de uma região de cro-mossomo contendo o referido gene. Preferivelmente, a região de cromossomo a am-plificação do qual é indicativo da existência de amplificação do gene c-MAF é o locus 16q22-q24 que inclui o gene c-MAF. O locus 16q22-q24 é localizado em cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em uma faixa entre a banda 22 e a banda 24. A referida região corresponde no banco de dados de NCBI com os contíguos NT_010498.15 e NT_010542.15. Em outra modalidade preferida, o grau de amplificação do gene c-MAF pode ser determinado por meio de usar a sonda específica para o referido gene.
[0159]Os quatro métodos de diagnóstico/prognóstico da presente invenção compreendem, em uma primeira etapa, determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra de tumor de um indivíduo. Para esse fim, a amplificação do gene c-MAF na amostra de tumor é comparada com relação a uma amostra de controle.
[0160]O termo “amplificação de um gene” como entendido aqui se refere a um processo através do qual várias cópias de um gene ou de um fragmento de gene são formadas em uma célula individual ou uma linhagem celular. As cópias do gene não estão necessariamente localizadas no mesmo cromossomo. A região duplicada é frequentemente chamada de um “amplicon”. Normalmente, a quantidade de mRNA produzido, i.e., o nível de expressão de gene também aumenta em proporção ao número de cópia de um gene particular.
[0161]Em uma modalidade particular, o quarto método da presente invenção para o diagnóstico de metástase em um indivíduo com câncer de próstata e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase em um indivíduo com câncer de próstata, compreende determinar o número de cópia do gene c-MAF em uma amostra de tumor do referido indivíduo e comparar o referido número de cópia com o número de cópia de um controle ou amostra de referência, em que se o número de cópia de c-MAF é maior com relação ao número de cópia de c-MAF de uma amostra de controle, então o indivíduo tem um diagnóstico positivo de metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[0162]A amostra de controle se refere a uma amostra de tumor de um indiví-duo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio do número de cópia do gene c-MAF medido em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreram me- tástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida por combinar quantida-des iguais de amostras a partir de uma população de indivíduos. Se o número de cópia do gene c-MAF é aumentado com relação ao número de cópia do referido gene na amostra de controle, então o indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[0163]Como usado aqui, o termo “número de cópia de gene” se refere ao nú-mero de cópia de uma molécula de ácido nucleico em uma célula. O número de cópia de gene inclui o número de cópia de gene no DNA genômico (cromossomal) de uma célula. Em uma célula normal (célula não tumor), o número de cópia de gene é normalmente duas cópias (uma cópia em cada membro do par do cromossomo). O número de cópia de gene algumas vezes inclui metade do número de cópia de gene tida a partir de amostras de uma população de células.
[0164]Na presente invenção, “aumentado número de cópia de gene” é entendido como quando o número de cópia do gene c-MAF é maior do que o número de cópia que a amostra de referência ou amostra de controle tem. Em particular, pode ser considerado que a amostra tem um aumentado número de cópia de c-MAF quando o número de cópia é mais do que 2 cópias, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cópias, e mesmo mais do que 10 cópias do gene c-MAF.
[0165]Em algumas modalidades, a amplificação é em região no locus 16q23. Em algumas modalidades, a amplificação é em qualquer parte da região cromossomal entre Chr. 16 - 79,392,959 bp to 79,663,806 bp (a partir de centrômero para telômero). Em algumas modalidades, a amplificação é na região genômica entre Chr. 16 - 79,392,959 bp to 79,663,806 bp, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, amplificação é medida usando a sonda específica para aquela região.
[0166]Em uma modalidade particular, a amplificação ou o número de cópia é determinado por meio de hibridização in situ ou PCR.
[0167]Métodos para determinar se o gene c-MAF ou a região de cromossomo 16q22-q24 é amplificado são amplamente conhecidos no estado da técnica. Os refe-ridos métodos incluem, sem limitação, hibridização in situ (ISH) (tal como hibridização de fluorescência in situ (FISH), hibridização cromogênica in situ (CISH) ou hibridização de prata in situ (SISH)), hibridização comparativa genômica ou reação de cadeia de polimerase (tal como PCR quantitativa de tempo real). Para qualquer método ISH, a amplificação ou o número de cópia pode ser determinado por contar o número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo.
[0168]A hibridização de fluorescência in situ (FISH) é uma técnica citogenética que é usada para detectar e localizar a presença ou a ausência de sequências de DNA específicas em cromossomos. FISH usa sondas de fluorescência que apenas se ligam a algumas partes do cromossomo com as quais mostram um alto grau de similaridade de sequência. Em um típico método FISH, a sonda de DNA é marcada com uma molécula fluorescente ou um hapteno, tipicamente na forma de flúor-dUTP, digo- xigenina-dUTP, biotina-dUTP ou hapteno-dUTP que é incorporado no DNA usando reações enzimáticas, tal como tradução nick ou PCR. A amostra contendo o material genético (os cromossomos) é disposta em lâminas de vidro e é desnaturada por um tratamento de formamida. A sonda marcada é então hibridizada com a amostra contendo o material genético sob condições adequadas que serão determinadas por aqueles versados na técnica. Após a hibridização, a amostra é vista seja diretamente (no caso de uma sonda marcada com flúor) ou indiretamente (usando anticorpos marcados por fluorescência para detectar o hapteno).
[0169]No caso de CISH, a sonda é marcada com digoxigenina, biotina ou flu- oresceína e é hibridizada com a amostra contendo o material genético em condições adequadas.
[0170]Qualquer marcação ou molécula de marcação que pode se ligar a um DNA pode ser usada par marcar as sondas usadas no quarto método da presente invenção, assim permitindo a detecção de moléculas de ácido nucleico. Exemplos de marcações para a marcação incluem, embora não limitados a, isótopos radioativos, substratos de enzima, cofatores, ligantes, agentes de quimioluminescência, fluorófo- ros, haptenos, enzimas e combinações dos mesmos. Métodos para a marcação e di-retriz para selecionar as marcações adequadas para diferentes fins podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Resfriado Spring Harbor, New York, 1989) e Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, New York, 1998).
[0171]Uma vez que a existência de amplificação é determinada, seja por dire-tamente determinar a amplificação do gene c-MAF ou por determinar a amplificação do locus 16q22-q24, e após ser comparado com a amplificação do referido gene na amostra de controle, se amplificação no gene c-MAF é detectado, é indicativo do fato e que o indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[0172]A determinação da amplificação do gene c-MAF precisa ser correlacio-nada com valores de uma amostra de controle ou amostra de referência que corres-ponde ao nível de amplificação do gene c-MAF medido em uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio da amplificação do gene c-MAF medida em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreram metástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida por combinar quantidades iguais de amostras a partir de uma população de indivíduos. Em geral, as típicas amostras de referência serão obtidas a partir de indivíduos que são clinicamente bem documentados e em quem a ausência de metástase é bem caracterizada. A coleta de amostra a partir da qual o nível de referência é derivado preferivelmente será produzida de indivíduos que sofrem do mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo. Uma vez que esse valor médio foi estabelecido, o nível de amplificação de c-MAF em tecidos de tumor de pacientes pode ser compa-rado com esse valor médio, e assim, se há amplificação, o indivíduo tem um diagnós-tico positivo de metástase ou uma maior tendência de desenvolver metástase.
[0173]Em uma modalidade preferida, a metástase é metástase nos ossos. Em ainda uma modalidade mais preferida, a metástase nos ossos é metástase osteolítica óssea. Como usado aqui, a expressão “metástase osteolítica óssea” se refere a um tipo de metástase no qual a reabsorção do osso (perda progressiva de densidade óssea) é produzida na proximidade da metástase que resulta a partir da estimulação da atividade de osteoclasto pelas células tumorais e é caracterizada por severa dor, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndro- mes que resultam da compressão do nervo.
[0174]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para a previsão do resultado clínico de um paciente que sofre de câncer de próstata, que compreende determinar se o gene c-MAF é translocado em uma amostra do re-ferido indivíduo em que a translocação do gene c-MAF é indicativo de um pobre re-sultado clínico.
[0175]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para a previsão do resultado clínico de um paciente que sofre de câncer de próstata, que compreende determinar se o gene c-MAF é translocado em uma amostra do re-ferido indivíduo em que a translocação do gene c-MAF é indicativo de um pobre re-sultado clínico.
[0176]Em algumas modalidades, o gene translocado é a partir de uma região no locus 16q23. Em algumas modalidades, o gene translocado é a partir de qualquer parte da região cromossomal entre Chr. 16 - 79,392,959 bp to 79,663,806 bp (a partir de centrômero para telômero). Em algumas modalidades, o gene translocado é a partir de uma região genômica entre Chr. 16 - 79,392,959 bp to 79,663,806 bp, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando a sonda específica para aquela região.
[0177]Em uma modalidade particular, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio de determinar a translocação de uma região de cromossomo contendo o referido gene. Em uma modalidade, a translocação é a translocação t(14,16). Em outra modalidade, a região de cromossomo que é translocada é a partir de locus 16q22-q24. O locus 16q22-q24 é localizado no cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em uma faixa entre a banda 22 e a banda 24. A referida região corresponde no banco de dados de NCBI com os contíguos NT_010498.15 e NT_010542.15. Em uma modalidade preferida, o gene c-MAF se transloca para o cromossomo 14 no locus 14q32, que resulta na translocação t(14,16)(q32,q23). A referida translocação dispõe o gene MAF próximo aos fortes in- tensificadores no locus IgH, que, em alguns casos, leva a superexpressão de MAF. (Eychène, A., Rocques, N., e Puoponnot, C., A new MAFia in cancer. 2008. Nature Reviews: cancer. 8: 683-693.)
[0178]Em uma modalidade preferida, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio de usar a sonda específica para a referida translocação. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando uma sonda de cor dupla. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando uma sonda de dupla fusão. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando a sonda de cor dupla, dupla fusão. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando duas sondas separadas.
[0179]Em outra modalidade preferida, a translocação do gene c-MAF é deter-minada usando a sonda Vysis LSI IGH/MAF de cor dupla e dupla fusão (http://www.abbottmolecular.com/us/products/analyte-specific-reagent/fish/vysis-lsi- igh-maf-dual-color-dual-fusion-probe.html; acessado por último 11/5/2012), que com-preende a sonda contra 14q32 e 16q23. Em outra modalidade preferida, a transloca- ção do gene c-MAF é determinada usando uma sonda de fusão Kreatech diagnostics MAF/IGH gt(14;16) (http://www.kreatech.com/products/repeat-freetm-poseidontm- fish-probes/hematology/maf-igh-gt1416-fusion-probe.html; acessado por último 11/5/2012), an Abnova MAF FISH sonda (http://www.abnova.com/products/pro- ducts_detail.asp?Catalog_id=FA0375; acessado por último 11/5/2012), Cancer Genetics Italia IGH/MAF sonda de translocação de duas fusões, duas cores (http://www.cancergeneticsitalia.com/dna-fish-probe/ighmaf/; acessado por último 11/5/2012), a Creative Bioa ray IGH/MAF-t(14;16)(q32;q23) sonda FISH (http://www.creative-bioarray.com/products.asp?cid=35&page=10; acessado por último 11/5/2012), Laboratórios Arup painel de mielomas múltiplos por FISH (http://www.aruplab.com/files/technical-bulletins/Multiple%20Mi- eloma%20%28MM%29%20by%20FISH. pdf; acessado por último 11/5/2012), uma sonda específica Agilent para 16q23 ou 14q32 (http://www.genomics.agilent.com/Pro- ductSearch.aspx?chr=16&start=79483700&end=79754340; acessado por último 11/5/2012; http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx?Pa- geid=3000&ProductID=63; acessado por último 11/5/2012), a Dako sonda específica para 16q23 ou 14q32 (http://www.dako.com/us/ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm?set- Country=true&purl=ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm?undefined&sub- mit=Accept%20country; acessado por último 11/5/2012), uma sonda de dupla fusão, Cytocell IGH/Translocação MAF, (http://www.zentech.ser/uploads/docs/pro- ducts_info/prenatalogy/cytocell%202012-2013%20catalogue%5B3%5D.pdf; aces-sado por último 11/5/2012), a sonda de dupla fusão Metasistemas XL IGH / Translo- cação MAF - (http://www.metasistemas-international.com/index.php?option=com_jo- odb&view=article&joobase=5&id=12%3Ad-5029-100-og&Itemid=272; acessado por último 11/5/2012), a Zeiss FISH Sondas XL, 100μl, IGH / MAFB (https://www.micro- shop.zeiss.com/?s=440675675dedc6&l=en&p=uk&f=r&i=5000&o=&h=25&n=1&sd=0 00000-0528-231-uk; acessado por último 11/5/2012) ou a sonda de dupla fusão Genycell Biotech IGH/MAF (http://www.goo- gle.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCQQFjAA&url=http %3A%2F%2Fwww.genycell.es%2Fimages%2Fproductos%2Fbrochures%2Flph- mie6__86.ppt&ei=MhGYUOi3GKWH0QGlt4DoDw&usg=AFQjCNEqQMbT8vQGjJbi9r iEf3lVgoFTFQ&sig2=V5IS8juEMVHB18Mv2Xx_Ww; acessado por último 11/5/2012)
[0180]Em algumas modalidades, a marcação na sonda é um fluoróforo. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é laranja. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é verde. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é ver-melho. Em alguns casos, o fluoróforo na sonda é amarelo. Em algumas modalidades, uma sonda é marcada com um fluoróforo vermelho, e um com um fluoróforo verde. Em algumas modalidades, uma sonda é marcada com um fluoróforo verde e um com um fluoróforo laranja. Em alguns casos, o fluoróforo na sonda é amarelo. Por exemplo, se a sonda específica de MAF é marcada com um fluoróforo vermelho, e a sonda específica para IGH é marcada com um fluoróforo verde, se branco for visto indica que os sinais se sobrepõem e a translocação ocorreu.
[0181]Em algumas modalidades, o fluoróforo é de espectro Laranja. Em algu-mas modalidades, o fluoróforo é de espectro Verde. Em algumas modalidades, o flu- oróforo é DAPI. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright405 em algu-mas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright415. Em algumas modalidades, o flu- oróforo é PlatinumBright495. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBri- ght505. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright547. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright570. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright590. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright647. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é Plati- numBright415/495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é DAPI/PlatinumBright495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é FITC. Em algumas modalidades, o fluoróforo é Texas Vermelho. Em algumas modalidades, o flu- oróforo é DEAC. Em algumas modalidades, o fluoróforo é R6G. Em algumas modalidades, o fluoróforo é Cy5. Em algumas modalidades, o fluoróforo é FITC, Texas Vermelho e DAPI. Em algumas modalidades, um contrastante DAPI é usado para visualizar a translocação, amplificação ou a alteração do número de cópia.
[0182]Uma modalidade da presente invenção compreende um método no qual na primeira etapa é determinado se o gene c-MAF é translocado em uma amostra de um indivíduo. Em uma modalidade preferida, a amostra é uma amostra de tecido tumoral.
[0183]Em uma modalidade particular, um método da presente invenção para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase nos ossos em um indivíduo com câncer de próstata compreende determinar o número de cópia do gene c-MAF em uma amostra do referido indivíduo em que o gene c-MAF é translocado e comparar o referido número de cópia com o número de cópia de um controle ou amostra de referência, em que se o número de cópia de c-MAF é maior com relação ao número de cópia de c-MAF de uma amostra de controle, então o indivíduo tem uma maior ten-dência de desenvolver metástase nos ossos.
[0184]Métodos para determinar se o gene c-MAF ou a região de cromossomo 16q22-q24 é translocado são amplamente conhecidos no estado da técnica e incluem os descritos anteriormente para a amplificação de c-MAF. Os referidos métodos incluem, sem limitação, hibridização in situ (ISH) (tal como hibridização de fluorescência in situ (FISH), hibridização cromogênica in situ (CISH) ou hibridização de prata in situ (SISH)), hibridização comparativa genômica ou reação de cadeia de polimerase (tal como PCR quantitativa de tempo real). Para qualquer método ISH, a amplificação, o número de cópia, ou a translocação pode ser determinado por contar o número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo. Em outras modalidades, a detecção de alterações no número de cópia e trans- locações pode ser detectado através do uso de sequenciamento de genoma total, sequenciamento de exoma ou pelo uso de qualquer tecnologia derivada de PCR. Por exemplo, PCR pode ser realizado em amostras de DNA genômico para detectar a translocação. Em uma modalidade, PCR quantitativa é usada. Em uma modalidade, PCR é realizado com um primer específico para o gene c-MAF e um primer específico para a região do promotor IGH; se um produto é produzido, a translocação ocorreu.
[0185]Em algumas modalidades, a amplificação e o número de cópia do gene c-MAF são determinados após a translocação do gene c-MAF ser determinada. Em algumas modalidades, a sonda é usada para determinar se a célula é poliplóide para o gene c-MAF. Em algumas modalidades, a determinação de poliplóidia é produzida por determinar se há mais do que 2 sinais do gene de interesse. Em algumas modalidades, poliplóidia é determinado por medir o sinal a partir da sonda específica para o gene de interesse e comparar o mesmo com uma sonda centromérica ou outra sonda.
[0186]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro (daqui em diante sétimo método da presente invenção) para a previsão do resultado clínico de um paciente que sofre de câncer de próstata, que compre-ende determinar se o gene c-MAF é amplificado ou translocado em uma amostra do referido indivíduo com relação a um número de cópia do gene de referência em que uma amplificação do gene c-MAF com relação ao referido número de cópia do gene de referência é indicativo de um pobre resultado clínico.
[0187]O sétimo método da presente invenção compreende, em uma primeira etapa, determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra de um indivíduo. A determinação da amplificação do c-MAF é realizado essencialmente como descrito no quinto método da presente invenção. Em uma modalidade preferida a amostra é uma amostra de tecido tumoral. Em uma modalidade preferida, a amplificação do gene c-MAF é determinada por meio de determinar a amplificação do locus 16q23 ou 16q22-q24. Em outra modalidade preferida, a amplificação do gene c-MAF é determinada por meio de usar uma sonda específica de gene c-MAF.
[0188]Em uma segunda etapa, o sétimo método da presente invenção compreende comparar o referido número de cópia com o número de cópia de um controle ou amostra de referência, em que se o número de cópia de c-MAF é maior com relação ao número de cópia de c-MAF de uma amostra de con-trole, então isso é indicativo de um pobre resultado clínico.
[0189]Em uma modalidade preferida, o gene c-MAF é amplificado com relação a um número de cópia do gene de referência quando o número de cópia do gene c-MAF é maior do que o número de cópia que a amostra de referência ou a amostra de controle tem. Em um exemplo, o gene c-MAF é referido ser “amplificado” se o número genômico de cópia do gene c-MAF é aumentado por pelo menos cerca de 2- (i.e., 6 cópias), 3- (i.e., 8 cópias), 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, ou 50-vezes em uma amostra de teste com relação a uma amostra de controle. Em outro exemplo, um gene c-MAF é dito ser “amplificado” se o número genômico de cópia do gene c-MAF por célula é pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, e semelhante.
[0190]Em outra modalidade, o número de cópia do gene de referência é o número de cópia de gene em uma amostra de câncer de próstata, a partir de um indivíduo que não sofreu metástase nos ossos.
[0191]Em outra modalidade, a amplificação é determinada por meio de hibridização in situ ou PCR.
[0192]Em outra modalidade e como descrito na presente invenção, considerando que o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, é amplificado em células de câncer de próstata é relacionada à presença de metástase, o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, amplificação permite tomar decisões em termos da terapia mais adequada para o indivíduo que sofre do referido câncer.
[0193]Assim, em outro aspecto a presente invenção se refere a um método in vitro para projetar uma terapia customizada para um indivíduo com câncer de próstata, que compreende (xi)quantificar o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, amplificação em uma amostra de tumor do referido indivíduo e (xii)comparar o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, amplificação anterior-mente obtido com o grau de amplificação do referido gene em uma amostra de con-trole, em que se o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, é amplificado com relação ao número de cópias da referida região genômica na amostra de controle, então o referido indivíduo é susceptível para receber a terapia com o objetivo de evitar e/ou tratar a metástase. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo é então administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos. em que se o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, não é amplificado com relação ao número de cópias da referida região genômica na amostra de referência, então o referido indivíduo não é susceptível para receber a terapia para evitar a de-gradação óssea. Em um aspecto particular do referido método, o indivíduo então não é administrado com pelo menos um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos.
[0194]A presente invenção se refere a um fármaco terapêutico que evita, inibe e/ou trata a metástase nos ossos a partir daqueles anteriormente listados.
[0195]Um agente de inibição de expressão de gene c-MAF ou um agente de inibição da proteína codificada pelo referido gene pode ser usado no tratamento e/ou a prevenção de metástase de câncer de próstata.
[0196]Portanto, em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um agente de inibição de expressão de gene c-MAF ou um agente de inibição da proteína codificada pelo referido gene (daqui em diante, agente de inibição da presente invenção) na preparação de um produto medicinal para tratar e/ou evitar metástase de câncer de próstata. Alternativamente, a presente invenção se refere a um agente de inibição de expressão de gene c-MAF ou um agente de inibição da proteína codificada pelo referido gene para uso no tratamento e/ou a prevenção de metástase de câncer de próstata. Alternativamente, a presente invenção se refere a um método para tratar o metástase de câncer de próstata em um indivíduo que compreende administrar um inibidor de c-MAF ao referido indivíduo. Como usado aqui, um “agente de inibição de c-MAF” se refere a qualquer molécula capaz de completamente ou parcialmente inibir a expressão de gene c-MAF, não só por evitar o produto de expressão do referido gene seja produzido (interrompendo a transcrição do gene c-MAF e/ou bloqueando a tradução do mRNA proveniente da expressão de gene c-MAF) mas também por diretamente inibir a atividade da proteína c-MAF. Inibidores da expressão de gene c-MAF podem ser identifcados usando métodos com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a capacidade de c-MAF de promover a proliferação celular in vitro, tal como mostrado no pedido de patente internacional WO 2005/046731 (aqui incorporado por referência em sua totalidade), com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle do promotor D2 de ciclina ou de um promotor contendo a região de resposta de c- MAF (MARE ou elemento que responde a c-MAF) em células que expressam c-MAF tal como descrita em WO 2008098351 (aqui incorporado por referência em sua totalidade) ou com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a expressão de um gene repórter sob o controle do promotor IL-4 em resposta à estimulação com PMA/ionomicina em células que expressam NFATc2 e c-MAF tal como descrito em US2009048117A (aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[0197]Por meio de ilustração não limitante, os agentes de inibição de c-MAF adequados para uso na presente invenção incluem oligonucleotídeos antisenso, RNAs de interferência (siRNAs), RNAs catalíticos ou ribozimas es-pecíficas e anticorpos inibitórios.
[0198]Um aspecto adicional da presente invenção se refere ao uso de ácidos nucleicos “antisenso” isolados para inibir a expressão, por exemplo, para inibir a transcrição e/ou a tradução de um ácido nucleico que codifica c- MAF a atividade do qual tem que ser inibida. Os ácidos nucleicos antisenso podem ser ligados a o alvo potencial do fármaco por meio de complementarie- dade de base convencional ou, por exemplo, no caso de ligação a DNA de dupla fita através da interação específica na grande ranhura da hélice dupla. Em geral, os referidos métodos se referem a uma faixa de técnicas em geral usadas na técnica e os mesmos incluem qualquer método que seja com base na específica ligação às sequências de oligonucleotídeo.
[0199]Um construtor antisenso da presente invenção pode ser admi-nistrado, por exemplo, como um plasmídeo de expressão que, quando é trans-crito na célula, produz RNA complementar a pelo menos uma única parte do mRNA celular que codifica c-MAF. Alternativamente, o construtor antisenso é uma sonda de oligonucleotídeo gerada ex vivo que, quando introduzida na célula, produz inibição da expressão do gene que hibridiza com o mRNA e/ou as sequências de gene de um ácido nucleico alvo. As referidas sondas de oligo- nucleotídeo são preferivelmente oligonucleotídeos modificados que são resistentes a nucleases endógenas, por exemplo, exonucleases e/ou endonucleases e são, portanto, estáveis in vivo. Exemplos de moléculas de ácido nucleico para uso do mesmo como oligonucleotídeos antisenso são análogos de DNA de fosforamidato, fosfotionato e metilfosfonato (vide também patentes US Nos. 5176996; 5264564; e 5256775) (aqui incorporado por referência em sua totalidade). Adicionalmente, as aproximações gerais para a construção de oligôme- ros uteis na terapia antisenso foram revistas, por exemplo, em Van der Krol et al., BioTechniques 6: 958-976, 1988; e Stein et al., cancer Res 48: 2659-2668, 1988.
[0200]Com relação ao oligonucleotídeo antisenso, as regiões de oligo- deoxiribonucleotídeo derivadas do campo de partida da tradução, por exemplo, entre -10 e +10 do gene alvo são preferidas. As aproximações antisenso envolvem o desenho do oligonucleotídeo (seja DNA ou RNA) que são comple-mentares ao mRNA que codifica o polipeptídeo alvo. O oligonucleotídeo anti- senso serão ligados aos mRNA transcrito e a tradução será evitada.
[0201]Os oligonucleotídeos que são complementares à terminação 5’ do mRNA, por exemplo, a sequência 5’ não traduzida até e incluindo o início do códon AUG deve funcionar do modo mais eficiente para inibir a tradução. No entanto, foi mostrado que as sequências complementares às sequências 3’ não traduzidas do mRNA são também eficientes para inibir a tradução do mRNA (Wagner, Nature 372: 333, 1994). Portanto, oligonucleotídeos comple-mentares podem ser usados nas regiões 5’ ou 3’ não traduzidas, regiões de não codificação de um gene em uma aproximação antisenso para inibir a tra-dução daquele mRNA. Os oligonucleotídeos complementares para a região 5’ não traduzida do mRNA deve incluir o complemento do códon de partida AUG. Os oligonucleotídeos complementares para a região de codificação do mRNA são inibidores de tradução menos eficientes, mas os mesmos podem também ser usados de acordo com a presente invenção. Se os mesmos são projetados para hibridizar com a região 5’, a região 3’ ou a região de codificação do mRNA, os ácidos nucleicos antisenso devem ter pelo menos cerca de seis nucleotídeos de comprimento e preferivelmente ter menos do que aproximadamente 100 e mais preferivelmente menos do que aproximadamente 50, 25, 17 ou 10 nucle- otídeos de comprimento.
[0202]Preferivelmente, estudos in vitro são realizados primeiro para quantificar a capacidade dos oligonucleotídeos antisenso de inibir a expressão de gene. Preferivelmente os referidos estudos usam controles que distinguem entre inibição de gene antisenso e efeitos biológicos não específicos dos oligo- nucleotídeos. Também preferivelmente os referidos estudos comparados aos níveis de RNA alvo ou proteína com aquele de um controle interno de RNA ou proteína. Os resultados obtidos usando os oligonucleotídeos antisenso podem ser comparados com os obtidos usando um oligonucleotídeo de controle. Pre-ferivelmente o oligonucleotídeo de controle é aproximadamente de mesmo comprimento que o oligonucleotídeo a ser testado e que a sequência de oligo- nucleotídeo não difere a partir da sequência antisenso mais do que é conside-rado necessário para evitar a hibridização específica a sequência alvo.
[0203]O oligonucleotídeo antisenso pode ser um único ou DNA de du-pla fita ou RNA ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas do mesmo. O oligonucleotídeo pode ser modificado no grupo de base, no grupo de açúcar ou na estrutura de fosfato, por exemplo, para aprimorar a estabilidade da molécula, a sua capacidade de hibridização etc. O oligonucleotídeo pode incluir outros grupos ligados, tal como peptídeos (por exemplo, para direcionar os mesmos aos receptores das células hospedeiras) ou agentes para facilitar o transporte através da membrana celular (vide, por exemplo, Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652, 1987; Publicação PCT No. WO 88/09810) ou a barreira sangue-cérebro (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 89/10134), agentes de intercalação (vide, por exemplo, Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988). Para esse fim, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, um peptídeo, um agente de transporte, agente de clivagem engatilhado por hibridização, etc.
[0204]Os oligonucleotídeos antisenso podem compreender pelo menos um grupo de base modificado. O oligonucleotídeo antisenso pode também compreender pelo menos um grupo de açúcar modificado selecionado a partir do grupo incluindo, mas não limitado a arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose, e hexose. O oligonucleotídeo antisenso pode também conter uma estrutura similar a um peptídeo neutro. As referidas moléculas são conhecidas como peptídeo ácido nucleico (PNA) oligômeros e são descritos, por exemplo, em Perry-O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 14670, 1996, e em Eglom et al., Nature 365: 566, 1993.
[0205]Em ainda outra modalidade, o oligonucleotídeo antisenso com-preende pelo menos uma estrutura de fosfato modificado. Em ainda outra mo-dalidade, o oligonucleotídeo antisenso é um oligonucleotídeo alfa-anomérico.
[0206]Embora os oligonucleotídeos antisenso complementares para a região de codificação da sequência de mRNA alvo possam ser usados, os complementares para as regiões dos transcritos não traduzidas podem também ser usados.
[0207]Em alguns casos, pode ser difícil de alcançar as concentrações intracelulares suficientes do antisenso para suprimir a tradução de mRNA en-dógeno. Portanto, a aproximação preferida usa um construtor de DNA recom- binante no qual o oligonucleotídeo antisenso é disposto sob o controle de um forte promotor pol III ou pol II.
[0208]Alternativamente, a expressão de gene alvo pode ser reduzida por direcionar as sequências de deoxiribonucleotídeo complementares para a região de regulação de gene (i.e., o promotor e/ou intensificadores) para formar estruturas de tripla hélice evitando a transcrição do gene nas células alvo no corpo (vide, em geral, Helene, Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991). Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso são morfolinas an- tisenso.
[0209]Pequeno RNA de interferência ou siRNA são agentes que são capazes de inibir a expressão de um gene alvo por meio de RNA de interferência. Um siRNA pode ser quimicamente sintetizado, pode ser obtido por meio de transcrição in vitro ou pode ser sintetizado in vivo na célula alvo. Tipicamente, o siRNA consiste em um RNA de dupla fita entre 15 e 40 nucleotídeos de comprimento e pode conter uma região 3’ e/ou 5’ que se salienta de 1 a 6 nucleotí- deos. O comprimento da região saliente é independente do comprimento total da molécula de siRNA. O siRNA age por meio de degradar ou silenciar o mensageiro alvo após a transcrição.
[0210]O siRNA da presente invenção é substancialmente homólogo ao mRNA do c-MAF que codifica o gene ou a sequência de gene que codifica a referida proteína. “Substancialmente homólogo” é entendido como tendo uma sequência que é suficientemente complementar ou similar ao mRNA alvo de modo gene o siRNA é capaz de degradar o último através de RNA de interferência. O siRNA adequado para causar a referida interferência inclui o siRNA formado por RNA, assim como o siRNA contendo diferentes modificações químicas tais como: - siRNA no qual as ligações entre os nucleotídeos são diferentes do que os que aparecem na natureza, tal como ligações fosforotionato. - Conjugados da fita de RNA com um reagente funcional, tal como um fluoró- foro. - Modificações das extremidades das fitas de RNA, particularmente da extre-midade 3’ por meio da modificação com diferentes grupos funcionais hidroxila na po-sição 2’. - Nucleotídeos com açúcares modificados tal como resíduos O-alquilados na posição 2’ tal como 2’-O-metilribose ou 2’-O-fluororibose. - Nucleotídeos com bases modificadas tal como bases halogenadas (por exemplo, 5-bromouracila e 5-iodouracila), bases alquiladas (por exemplo, 7-metilgua- nosina). - O siRNA pode ser usado como é, i.e., na forma de um RNA de dupla fita com as características acima mencionadas. Alternativamente, o uso de vetores contendo a sequência de filamento de sentido e antisenso do siRNA é possível sob o controle de promotores adequados para a expressão do mesmo na célula de interesse. - Vetores adequados para expressar siRNA são os nos quais as duas regiões de DNA que codificam as duas fitas de siRNA são arranjadas em tandem em um e a mesma fita de DNA separada por uma região de espaçamento que, com a transcrição, forma uma alça e em que um único promotor direciona a transcrição da molécula de DNA que acarreta no shRNA. - Alternativamente, o uso de vetores nos quais cada uma das fitas formando o siRNA é formada a partir da transcrição de uma diferente unidade de transcrição é possível. Os referidos vetores são por sua vez divididos em vetores de transcrição divergentes e convergentes. Nos vetores de transcrição divergentes, as unidades de transcrição que codificam cada uma das fitas de DNA que formam o siRNA são loca-lizadas em tandem em um vetor de modo que a transcrição de cada fita de DNA de-pende de seu próprio promotor que pode ser o mesmo ou diferente (Wang, J. Et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100:5103-5106 e Lee, N.S., et al., 2002, Nat. Bio- technol., 20:500-505). Nos vetores de transcrição convergentes, as regiões de DNA que acarretam no siRNA formam as fitas de sentido e antisenso da região de DNA que são margeadas por dois promotores reversos. Após a transcrição das fitas de sentido e antisenso de RNA, o último irá formar o híbrido para formar um siRNA fun-cional. Vetores com sistemas de promotor reverso nos quais 2 promotores U6 (Tran, N. Et al., 2003, BMC Biotechnol., 3:21), um promotor U6 de rato e um promotor H1 de humano (Zheng, L., et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 135-140 e WO 2005026322) e um promotor U6 humano e um promotor H1 de rato (Kaykas, A. E Moon, R., 2004, BMC Cell Biol., 5:16) são usados foram descritos. - Promotores adequados para uso dos mesmos na expressão de siRNA a partir de vetores de expressão convergentes ou divergentes incluem qualquer promotor ou par de promotores compatíveis com as células nas quais o siRNA tem que ser expresso. Assim, promotores adequados para a presente invenção incluem mas não são necessariamente limitados a promotores constitutivos tais como os derivados a partir dos genomas de vírus eucarióticos tal como o vírus polioma, adenovírus, SV40, CMV, vírus de sarcoma de ave, vírus da hepatite B, o promotor de gene metalotio- neina, o promotor de gene timidina quinase do vírus da herpes simplex, regiões de retrovírus LTR, o promotor de gene de imunoglobulina, o promotor de gene de actina, o promotor de gene de EF-1alfa assim como os promotores induzíveis nos quais a expressão de proteína depende da adição da molécula ou de um sinal exógeno tal como o sistema de tetraciclina, o sistema NFkappaB/UV light, o sistema Cre/Lox e o promotor de gene de choque de calor, os promotores reguláveis de RNA polimerase II descritos em WO/2006/135436 assim como os promotores específicos de tecido (por exemplo, o promotor PSA descrito em WO2006012221). Em uma modalidade preferida, os promotores são promotores de RNA polimerase III que agem constituti-vamente. Os promotores de RNA polimerase III são encontrados em um número de limitado de genes tal como 5S RNA, tRNA, 7SL RNA e U6 snRNA. Diferente de outros promotores de RNA polimerase III, os promotores do tipo III não requerem qualquer sequência intragênica mas em vez disso precisam de sequências na direção 5’ compreendendo uma caixa TATA nas posições -34 e -24, um elemento de sequência proximal ou PSE entre -66 e -47 e, em alguns casos, um elemento de sequência distal ou DSE entre as posições -265 e -149. Em uma modalidade preferida, os promotores de RNA polimerase de tipo III são os promotores de gene humano ou de murino H1 e U6. Em ainda uma modalidade mais preferida, os promotores são 2 promotores de U6 humano ou murino, um promotor de rato U6 e um promotor de humano H1 ou um promotor de humano U6 e um promotor de rato H1. - O siRNA pode ser gerado intracelularmente a partir do assim chamado shRNA (RNA de hairpin curto) caracterizado em que as antiparalelas formando o siRNA são conectadas pela alça ou região de hairpin. Os shRNAs podem ser codificados por plasmídeos ou vírus, particularmente retrovírus, e estão sob o controle de um promotor. Promotores adequados para expressar shRNA são os indicados no parágrafo acima para expressar siRNA. - Vetores adequados para expressar siRNA e shRNA incluem os vetores de expressão procarióticos tal como pUC18, pUC19, Bluescript e os derivados dos mes-mos, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, fagos e vetores de lança tais como pSA3 e pAT28, vetores de expressão de levedura tais como os vetores de tipo de plasmídeo de 2 mícrons, plasmídeos de integração, vetores YEP, plasmídeos cen- tromericos e semelhante, vetores de expressão de célula de inseto tal como os vetores da série pAC e vetores da série pVL, vetores de expressão de vegetais tais como os vetores da série pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE e semelhante e vetor viral com base (adenovírus, vírus associados com ade- novírus assim como retrovírus e particularmente lentivírus) vetores de expressão de célula eucariótica maior ou vetores não virais tais como pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5- His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl. Em uma mo-dalidade preferida, os vetores são vetores lentivirais. - O siRNA e shRNA da presente invenção podem ser obtidos usando uma série de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. A região da sequência de nucleotídeo tomada como a base para projetar o siRNA não é limitante e pode conter a região da sequência de codificação (entre o códon de partida e o códon de terminação) ou pode alternativamente conter sequências da região não traduzida 5’ ou 3’ preferivelmente entre 25 e 50 nucleotídeos de comprimento e em qualquer posição de direção 3’ com relação ao códon de partida. Um modo de desenhar um siRNA envolve a identificação dos motivos AA(N19)TT em que N pode ser qualquer nucleo- tídeo na sequência do gene c-MAF, e a seleção dos tendo um alto teor de G/C. Se o referido motivo não é encontrado, é possível se identificar o motivo NA(N21) em que N pode ser qualquer nucleotídeo.
[0211]siRNAs específicos de c-MAF incluem o siRNA descrito em WO2005046731 (aqui incorporado por referência em sua totalidade), uma das fitas dos quais é ACGGCUCGAGCAGCGACAA (SEQ ID NO: 6). Outro siRNA específico de sequências c-MAF incluem mas não são limitados a CUUACCAGUGUGUUCACAA (SEQ ID NO: 7), UGGAAGACUACUACUGGAUG (SEQ ID NO: 8), AUUUGCAGUCAUGGAGAACC (SEQ ID NO: 9), CAAGGAGAAAUACGAGAAGU (SEQ ID NO: 10), ACAAGGAGAAAUACGAGAAG (SEQ ID NO: 11) e ACCUGGAAGACUACUACUGG (SEQ ID NO: 12).
[0212]Por outro lado, a presente invenção também contempla o uso de enzi-mas de DNA para inibir a expressão do gene c-MAF da presente invenção. Enzimas de DNA incorporam algumas das características mecânicas de ambas as tecnologias antisenso e ribozima. Enzimas de DNA são projetadas de modo que as mesmas re-conhecem uma sequência de ácido nucleico alvo particular similar ao oligonucleotídeo antisenso, no entanto tal como a ribozima as mesmas são catalíticas e especificamente clivam o ácido nucleico alvo.
[0213]Moléculas de ribozima projetadas para clivar cataliticamente os produ-tos de transcrição de um mRNA alvo para evitar a tradução do mRNA que codifica c- MAF a atividade da qual tem que ser inibida, pode também ser usada. Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes de catalisar a clivagem de RNA específico. (para uma revisão, vide, Rossi, Current Biology 4: 469-471, 1994). O mecanismo de ação da ribozima envolve uma hibridização específica da sequência de molécula de ribozima a um RNA alvo complementar seguido por um evento de clivagem endonu- cleolítico. A composição das moléculas de ribozima preferivelmente inclui uma ou mais sequências complementares ao mRNA alvo e a bem conhecida sequência responsável por clivar o mRNA ou a sequência equivalente funcional (vide, por exemplo, a patente US No. 5,093,246).
[0214]As ribozimas usadas na presente invenção incluem ribozimas de ca-beça de martelo e endoribonuclease RNA (daqui em diante “ribozimas do tipo Cech”) (Zaug et al., Science 224:574-578, 1984.
[0215]As ribozimas podem ser formadas por oligonucleotídeos modificados (por exemplo, para aprimorar a estabilidade, objetivação, etc.) e as mesmas devem ser distribuídas em células que expressam o gene alvo em vivo. O método preferido de distribuição envolve usar um construtor de DNA que “codifica” a ribozima sob o controle de um promotor forte constitutivo pol III ou pol II de modo que as células transfectadas produzirão suficientes quantidades da ribozima para destruir os mensageiros alvos endógenos e para inibir a tradução. Uma vez que as ribozimas são catalíticas, diferente de outras moléculas antisenso, uma baixa concentração intracelular é necessária para a sua eficiência.
[0216]No contexto da presente invenção, “anticorpo inibidor” é entendido como qualquer anticorpo capaz de se ligar especificamente a uma proteína c-MAF e inibir uma ou mais das funções da referida proteína, preferivelmente as relacionadas a transcrição. Os anticorpos podem ser preparados usando qualquer dos métodos que são conhecidos por aqueles versados na técnica, alguns dos quais foram mencionados acima. Assim, os anticorpos policlonais são preparados por meio de imunizar um animal com a proteína a ser inibida. Os anticorpos monoclonais são preparados usando o método descrito por Kohler, Milstein et al. (Nature, 1975, 256: 495). No contexto da presente invenção, anticorpos adequados incluem anticorpos intactos compreendendo a região de ligação a antígeno variável e uma região constante, “Fab”, “F(ab')2” e “Fab'”, fragmentos de Fv, scFv, diacorpos, anticorpos biespecíficos, alfa- corpos, ciclopeptídeos e peptídeos de comprimento cortado. Uma vez que os anticorpos com a capacidade de ligação a proteína c-MAF são identifcados, os capa-zes de inibir a atividade da referida proteína serão selecionados usando um teste de identificação de agente de inibição.
[0217]Como usado aqui, o termo “peptídeo inibidor” se refere aos peptídeos capazes de se ligar a uma proteína c-MAF e inibir a sua atividade como foi explicado acima, i.e., evitar que a c-MAF seja capaz de ativar a transcrição do gene.
[0218]Uma vez que as proteínas a partir da família maf são capazes de ho- modimerização e heterodimerização com outros membros da família AP-1 tal como Fos e Jun, um modo de inibir a atividade de c-MAF é por meio de usar negativos dominantes capazes de dimerizar com c-MAF mas desprovido da capacidade de ati-vação da transcrição. Assim, os dominantes negativos c-MAF podem ser qualquer uma das pequenas proteínas maf existentes na célula e desprovidas de dois terços da extremidade amino terminal contendo o domínio de transativação (por exemplo, mafK, mafF, mafg e pi 8) (Fujiwara et al (1993) Oncogene 8, 2371-2380; Igarashi et al. (1995) J. Biol.Chem. 270, 7615-7624; Andrews et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11488-11492; Kataoka et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2180-2190) (Kataoka et al. (1996) Oncogene 12, 53-62).
[0219]Alternativamente, os dominantes negativos de c-MAF incluem variantes de c-MAF que mantêm a capacidade para dimerizar com outras proteínas, mas faltam de capacidade para ativar a transcrição. As referidas variantes são, por exemplo, as que faltam de domínio de transativação de c-MAF localizado na extremidade N- terminal da proteína. Assim, variantes de c-MAF negativo dominante incluem em um modo ilustrativo as variantes nas quais pelo menos os aminoácidos 1 a 122, pelo menos os aminoácidos 1-187 ou pelo menos os aminoácidos 1 a 257 (por considerar a numeração de c-MAF humano como descrito em US6,274,338, aqui incorporada por referência em sua totalidade) foi removido.
[0220]A presente invenção contempla o uso não só de variantes de c-MAF negativo dominante, mas também de polinucleotídeos que codificam c-MAF sob o controle operacional de um promotor adequado para a expressão em célula alvo. Os promotores que podem ser usados para regular a transcrição de polinucleotídeo da presente invenção podem ser promotores constitutivos, i.e., promotores que direcionam a transcrição a um nível basal, ou promotores indutíveis nos quais a atividade de transcrição requer um sinal externo. Promotores constitutivos adequados para regular a transcrição são, entre outros, o promotor CMV, o promotor SV40, o promotor DHFR, o promotor de vírus de tumor mamário de rato (MMTV), o promotor de fator de alongamento 1a (EFla), o promotor de albumina, o promotor de ApoA1, o promotor de queratina, o promotor de CD3, o promotor de imunoglobulina de cadeia pesada ou leve, o promotor de neurofilamento, o promotor de enolase específica de neurônio, o promotor de L7, o promotor de CD2, o promotor de miosina quinase de cadeia leve, o promotor de HOX gene, o promotor de timidina quinase, o promotor de RNA polimerase II, o promotor de gene MyoD, o promotor do gene fosfogliceratequinase (PGK), o promotor de lipoproteína de baixa densidade (LDL), o promotor de gene actina. Em uma modalidade preferida, o promotor que regula a expressão do transativator é o promotor do gene PGK. Em uma modalidade preferida, o promotor que regula a transcrição de polinucleotídeo da presente invenção é o promotor de RNA polimerase do fago T7.
[0221]Preferivelmente, os promotores indutíveis que podem ser usados no contexto da presente invenção são os que respondem a um agente indutor que mostra zero ou expressão basal insignificante na ausência de um agente indutor e são capazes de promover a ativação de gene localizado na posição 3’. Dependendo do tipo de agente indutor, os promotores indutíveis são classificados como promotores Tet on/off (Gossen, M. E H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Gossen, M. Et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V. E H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456); promotores Pip on/off (US 6287813); promotores dependentes de antiprogestina (US 2004132086), promotores dependentes de ecdisona (Christoferson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004 e WO9738117), um promotor dependente de metalotioneina (WO8604920) e promotores dependentes de rapamicina (Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32).
[0222]Vetores adequados para expressar o polinucleotídeo que codifica a variante de c-MAF negativo dominante incluem vetores derivados a partir de vetores de expressão procarióticos tais como pUC18, pUC19, Bluescript e derivados do mesmo, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl , RP4, fagos e vetores de lança tais como pSA3 e pAT28, vetores de expressão de levedura tais como vetores de plasmídeo do tipo de 2 microns, plasmídeos de integração, vetores YEP, plasmídeos centroméricos e semelhante, vetores de expressão de célula de inseto tal como os vetores da série pAC e os vetores da série pVL, vetores de expressão de vegetal tal como pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, vetores da série pORE e semelhante e vetor com base viral (adenovírus, vírus associado com adenovírus assim como retrovírus e particularmente lentivírus) vetores de expressão de célula eucariótica maior ou vetores não virais tais como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hig pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL e pKSV-10, pBPV-1, pML2d e pTDTl.
[0223]Outros compostos inibitórios de c-MAF adequados para uso na presente invenção incluem:
Tabela 1: moléculas pequenas com capacidade de inibir c-MAF
[0224]Outros inibidores de c-MAF são descritos no pedido de patente WO2005063252, tal como mostrado na Tabela a seguir (Tabela 2).
Tabela 2: Inibidores de c-MAF
[0225]Em uma modalidade preferida, os agentes de inibição de c-MAF é usado para o tratamento e/ou a prevenção de metástase nos ossos. Em ainda uma modalidade mais preferida, a metástase nos ossos é metástase osteolítica.
[0226]Os agentes de inibição de c-MAF são tipicamente administrados em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0227]O termo “veículo” se refere a um diluente ou um excipiente com o que o ingrediente ativo é administrado. Os referidos veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis tais como água e óleo, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintético tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhante. Água ou soluções salinas aquosas e dextrose aquosa e soluções de glicerol, particularmente para soluções injetáveis, são preferivelmente usados como veículos. Veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin, 1995. Preferivelmente, os veículos da presente invenção são aprovados pelo estado ou pela agência reguladora do governo federal ou são listados na Farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia em geral reconhecida para uso do mesmo em animais e mais particularmente em seres humanos.
[0228]Os veículos e substâncias auxiliares necessárias para a fabricação da forma de dosagem farmacêutica desejada da composição farmacêutica da presente invenção dependerá, entre outros fatores, da forma de dosagem farmacêutica escolhida. As referidas formas de dosagem farmacêuticas da composição farmacêutica serão fabricadas de acordo com os métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma revisão dos diferentes métodos para administrar ingredientes ativos, excipientes a serem usados e processos para produzir os mesmos pode ser encontrada em “Tratado de Farmácia Galénica”, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. 1993 Edition. Exemplos de composição farmacêutica incluem qualquer composição sólida (tabletes, pílulas, cápsulas, grânulos, etc.) ou composição líquida (soluções, suspensões ou emulsões) para administração oral, tópica ou parenteral. Adicionalmente, a composição farmacêutica pode conter, como necessário, estabilizantes, suspensões, conservantes, tensoativos e semelhante.
[0229]Para uso na medicina, os agentes de inibição de c-MAF podem ser encontrados na forma de um profármaco, sal, solvato ou clatrato, seja isolado ou em combinação com agentes ativos adicionais e podem ser formulados junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Excipientes preferidos para uso do mesmo na presente invenção incluem açúcares, amidos, celuloses, borrachas e proteínas. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da presente invenção será formulada em uma forma de dosagem farmacêutica sólida (por exemplo, tabletes, cápsulas, pílulas, grânulos, supositórios, sólidos estéreis de cristal ou amorfos que podem ser reconstituídos para proporcionar formas líquidas etc.), forma de dosagem farmacêutica líquida (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, elixires, loções, unguentos etc.) ou forma de dosagem farmacêutica semi-sólida (géis, unguentos, cremes e semelhante). A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por qualquer via, incluindo mas não limitado a via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intraarterial, via intramedular, via intratecal, via intraventricular, via transdermal, via subcutânea, via intraperitoneal, via intranasal, via entérica, via tópica, via sublingual ou via retal. Uma revisão dos diferentes meios para administrar ingredientes ativos, dos excipientes a serem usados e dos processos de fabricação dos mesmos pode ser encontrados em Tratado de Farmácia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A., 1993 Edition e em Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20 edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos no estado da técnica e incluem soluções de salina tamponada a fosfato, água, emulsões tais como emulsões de óleo/água, diferentes tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. as composições compreendendo os ditos veículos podem ser formuladas por processos convencionais conhecidos no estado da técnica.
[0230]No caso de ácidos nucleicos (siRNA, polinucleotídeos que codificam siRNA ou shRNA ou polinucleotídeos que codificam c-MAFs negativos dominantes) são administrados a presente invenção contempla composição farmacêutica particularmente preparada para administrar os referidos ácidos nucleicos. A composição farmacêutica pode compreender os referidos ácidos nucleicos nus, i.e., na ausência de compostos de proteção dos ácidos nucleicos a partir de degradação pelas nucleases do corpo, o que acarreta na vantagem de que a toxicidade associada com os reagentes usados para a transfecção é eliminada. As vias de administração adequadas para os compostos nus incluem a via intravascular, via intratumoral, via intracranial, via intraperitoneal, via intrasplenica, via intramuscular, via subretinal, via subcutânea, via mucosal, via tópica e via oral (Templeton, 2002, DNA Cell Biol., 21:857-867). Alternativamente, os ácidos nucleicos podem ser administrados formando parte de lipossomos conjugados a colesterol ou conjugados a compostos capazes de promover a translocação através das membranas celulares tal como o peptídeo Tat derivado a partir da proteína HIV-1 TAT, a terceira hélice do homeodomínio da proteína de D. melanogaster antennapedia, a proteína VP22 do vírus da herpes simplex, oligômeros de arginina e peptídeos como descritos em WO07069090 (Lindgren, A. Et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. Et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol Terapia 8:143-150 e Snyder, E.L. E Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393). Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser administrado formando parte de um vetor de plasmídeo ou vetor viral, preferivelmente vetores com base em adenovirus, em vírus adeno associados ou em retrovírus tais como vírus com base em vírus de leucemia de murino (MLV) ou em lentivírus (HIV, FIV, EIAV).
[0231]Os agentes de inibição de c-MAF ou a composição farmacêutica contendo os mesmos pode ser administrada a uma dose de menos do que 10 mg por kg de peso corporal, preferivelmente menos do que 5, 2, 1, 0.5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal. A dose unitária pode ser administrada por injeção, inalação ou administração tópica.
[0232]A dose depende da gravidade e da resposta da condição a ser tratada e pode variar entre diversos dias e meses ou até a condição cessar. A dosagem ótima pode ser determinada por periodicamente medir as concentrações do agente no corpo do paciente. A dose ótima pode ser determinada a partir dos valores de EC50 obtidos por meio dos testes anteriores in vitro ou in vivo em modelos de animal. A dose unitária pode ser administrada uma vez ao dia ou menos do que uma vez ao dia, preferivelmente menos do que uma vez a cada 2, 4, 8 ou 30 dias. Alternativamente, é possível se administrar uma dose inicial seguida por uma ou diversos doses de manutenção, em geral de uma menor quantidade do que a dose inicial. O regime de manutenção pode envolver tratar o paciente com uma dose que varia entre 0,01 μg e 1.4 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, ou 0,00001 mg por kg de peso corporal por dia. As doses de manutenção são preferivelmente administradas no máximo uma vez a cada 5, 10 ou 30 dias. O tratamento deve ser continuado por um tempo que irá variar de acordo com o tipo de desordem que o paciente sofre, a gravidade da mesma e a condição do paciente. Após o tratamento, o progresso do paciente deve ser monitorado para determinar se a dose deve ser aumentada no caso de que a doença não responde ao tratamento ou a dose é reduzida se um aprimoramento da doença é observado ou se efeitos colaterais indesejados são observados.
[0233]Pacientes que sofrem de câncer de próstata que sofreram metástase nos ossos e nos quais há níveis elevados de c-MAF na referida metástase podem se beneficiar particularmente de terapias com o objetivo de evitar a degradação óssea causada pela maior atividade osteoclástica.
[0234]Assim, em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um agente para impedir ou evitar a degradação óssea na preparação de um produto medicinal para a prevenção e/ou o tratamento de metástase nos ossos em um indivíduo que sofre de câncer de próstata e tendo níveis elevados de c-MAF em uma amostra metastática de tecido tumoral com relação a uma amostra de controle.
[0235]Alternativamente, a presente invenção se refere a um agente para impedir ou evitar degradação óssea para uso na prevenção e/ou no tratamento de metástase nos ossos em um indivíduo que sofre de câncer de próstata e has níveis elevados de c-MAF em uma amostra metastática de tecido tumoral com relação a uma amostra de controle.
[0236]Alternativamente, a presente invenção se refere a um método de prevenção e/ou tratamento de degradação em um indivíduo que sofre de câncer de próstata e has níveis elevados de c-MAF em uma amostra metastática de tecido tumoral com relação a uma amostra de controle, que compreende administrar um agente para impedir ou evitar degradação óssea ao referido indivíduo.
[0237]Em uma modalidade particular, a metástase nos ossos é metástase osteolítica.
[0238]Os termos e expressões “indivíduo”, “câncer de próstata”, “amostra de tumor”, “metástase”, “gene c-MAF”, “níveis aumentados ou elevados de expressão” e “amostra de controle” foram descritos em detalhes em relação ao primeiro método da presente invenção e são igualmente aplicáveis ao agente para impedir ou evitar degradação óssea.
[0239]Agentes capazes de impedir ou de evitar degradação óssea adequado para o método terapêutico descrito na presente invenção foram descritos em detalhes acima no contexto do método de terapia customizada.
[0240]A amostra de referência ou amostra de controle é uma amostra de tumor de um indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão de gene c-MAF medidos em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de indivíduos com câncer de próstata que não sofreram metástase.
[0241]Métodos para determinar ou quantificar se os níveis de c-MAF são elevados com relação a uma amostra de controle foram descritos em detalhes em relação com o primeiro método da presente invenção e são igualmente aplicáveis ao agente para impedir ou evitar degradação óssea.
[0242]Alternativamente um tratamento combinado pode ser realizado, no qual mais do que um agente para impedir ou evitar degradação óssea a partir dos mencionados acima são combinados para tratar e/ou evitar a metástase ou os referidos agentes podem ser combinados com outros suplementos, tal como cálcio ou vitamina D ou com um hormônio.
[0243]Os agentes para impedir ou evitar a degradação óssea são tipicamente administrados em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo “veículo” e os tipos de veículos foram definidos acima para o agente de inibição de c- MAF, assim como a forma e a dose na qual os mesmos podem ser administrados e são igualmente aplicáveis ao agente para impedir ou evitar degradação óssea.
[0244]Os exemplos a seguir ilustram a presente invenção e não limitam o âmbito do mesmo.
[0245]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a previsão de metástase nos ossos de um câncer de próstata, em um indivíduo que sofre do referido câncer, o kit compreendendo: a) meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; e b) meios para comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de expressão de referência de c-MAF.
[0246]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a previsão do resultado clínico de um indivíduo que sofre a partir de metástase nos ossos em decorrência de um câncer de próstata, o kit compreendendo: a) meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; e b) meios para comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de expressão de referência de c-MAF.
[0247]Em outro aspecto a presente invenção se refere a um kit para determinar a terapia para um indivíduo que sofre de câncer de próstata, o kit compreendendo: a) meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; b) meios para comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de expressão de referência de c- MAF; e c) meios para determinar a terapia para evitar e/ou reduzir metástase nos ossos no referido indivíduo com base na comparação do nível quantificado de expressão ao nível de expressão de referência. d) meios para excluindo a terapia para evitar e/ou reduzir metástase nos ossos no referido indivíduo com base na comparação do nível quantificado de expressão ao nível de expressão de referência.
[0248]Em outro aspecto a presente invenção se refere a um kit compreendendo: i) um reagente para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra de um indivíduo que sofre de câncer de próstata, e ii) um ou mais índices de nível de expressão de gene c-MAF que foram predeterminados para se correlacionar com o risco de metástase nos ossos.
[0249]Meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo que foram anteriormente descrita em detalhes incluindo a amplificação e a translocação dos locus 16q23 e 16q22-24.
[0250]Em uma modalidade preferida, meios para quantificar a expressão compreendem um conjunto de sondas e/ou primers que especificamente se ligam e/ou amplificam o gene c-MAF.
[0251]Em uma modalidade particular o câncer de próstata é adenoma de próstata ou carcinoma de células pequenas de próstata.
[0252]Em uma modalidade particular o kit é aplicado, mas não limitado, a um câncer de biópsia da próstata, célula circulante de câncer de próstata, DNA circulante de tumor de próstata.
[0253]Todas as modalidades particulares dos métodos da presente invenção são aplicáveis aos kits da presente invenção e aos usos dos mesmos.
[0254]Método para a tipagem da amostra de um indivíduo que sofre de câncer de próstata.
[0255]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método in vitro para a tipagem da amostra de um indivíduo que sofre de câncer de próstata, o método compreendendo: a) proporcionar a amostra a partir do referido indivíduo; b) quantificar o nível de expressão de c-MAF na referida amostra; c) realizar a tipagem da referida amostra por comparar o nível quantificado de expressão de c-MAF a um nível de referência predeterminado de expressão de c- MAF; em que a referida realização da tipagem proporciona informação de prognóstico relacionada ao risco de metástase nos ossos no referido indivíduo.
[0256]Meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo foram anteriormente descritos em detalhes incluindo a amplificação e translocação dos locus 16q23 e 16q22-24.
[0257]Em uma modalidade preferida a amostra é uma amostra de tecido tumoral, uma célula de tumor circulante ou a DNA de tumor circulante.
[0258]Método para classificar um indivíduo que sofre de câncer de próstata.
[0259]Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para classificar um indivíduo que sofre de câncer de próstata em uma coorte, compreendendo: a) determinar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo; b) comparar o nível de expressão de c-MAF na referida amostra a um nível de referência predeterminado de expressão de c-MAF; e c) classificar o referido indivíduo em uma coorte com base no referido nível de expressão de c-MAF na amostra.
[0260]Meios para quantificar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra do referido indivíduo foram anteriormente descritos em detalhes incluindo a amplificação e translocação dos locus 16q23 e 16q22-24.
[0261]Em uma modalidade particular o câncer de próstata é um adenoma ou um carcinoma de pequena célula.
[0262]Em uma modalidade preferida a amostra é uma amostra de tecido tumoral, uma célula de tumor circulante ou um DNA circulante.
[0263]Em uma modalidade preferida a referida coorte compreende pelo menos um outro indivíduo que foi determinado ter um nível de expressão comparável de c-MAF em comparação ao referido nível de expressão de referência.
[0264]Em outra modalidade preferida o referido nível de expressão de c-MAF na referida amostra é aumentado com relação ao referido nível de referência predeterminado, e em que os membros da coorte são classificados como tendo maior risco de metástase nos ossos.
[0265]Em outra modalidade preferida a referida coorte é para a condução de um teste clínico.
[0266]Em uma modalidade preferida, a amostra é uma amostra de tecido tumoral.
[0267]Relevância clínica e prognostico de valor do gene de metástase específica óssea
[0268]c-MAF foi testada em uma microestrutura de tecido (TMA) incluindo biópsias de 37 Tumor de próstata para as quais as anotações clínicas de tempo para metástase nos ossos ou metástase visceral foram conhecidas. Os referidos tumores são representativos de todos os subtipos e estágios de câncer de próstata. Os níveis de c-MAF foram determinados por imunohistoquímica (IHC) usando um anticorpo específico para c-MAF e a associação entre os níveis de expressão de c-MAF e risco de osso relapso foi estabelecido por meio de cálculos de relação de probabilidade (OR). A OR é uma medida de tamanho de efeito, que descreve a resistência da associação ou não independência entre dois dados binários. OR é descrita em Glas, A.S. “The diagnostic odds ratio: a single indicator of test performance” (2003) J. de Clinical Epidemiology 56: 1129-1135. A relação de probabilidade descreve a força da associação ou não independência entre dois valores de dados binários (gene de interesse positivo ou negativo, metástase nos ossos positivo ou negativo). Em algumas modalidades, a relação de probabilidade é pelo menos cerca de 1, 1.2, 1.2, 1.3, 1.4, 1,5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, ou 5. As referidas amostras em TMA são tecidos tumorais primários embebidos em parafina a partir de Tumores de próstata. As referidas amostras foram coletadas no Vall d’Hebron Oncology Institute e Vall d’Hebron Hospital durante a prática clínica regular junto com os dados clínicos relevantes necessários e a aprovação do comitê clínico.
[0269]As amostras foram selecionadas para preencher os critérios a seguir:
[0270]5 amostras pertenceram a pacientes com doença local (M0) em diagnóstico com uma confirmação de osso relapso em qualquer tempo do acompanhamento acima.
[0271]29 amostras pertenceram a pacientes de diagnóstico que permaneceram livre de metástase após pelo menos 5 anos.
[0272]Os 3 tumores restantes são de pacientes M0 em diagnóstico que tinham por último um relapso em qualquer local diferente de osso.
[0273]Análise Imunohistoquímica
[0274]A imunocoloração de c-MAF foi realizada em TMAs. O referido TMA foi construído em lâminas de vidro e IHC foi realizado usando a Dako Link Platform de acordo com o procedimento operacional
[0275]Em suma, a imunocoloração foi realizada em seções de tecido tumoral TMA de 3 μm, dispostas em lâminas de vidro positivamente carregadas (Superfrost ou similar) em a uma plataforma Dako Link. Após a desparafinação, a recuperação de antígeno por calor foi realizada em pH 6.1, 0,01 mol/L de solução tamponada com base em citrato (Dako). Peroxidase endógena foi resfriada. O anticorpo anti-c-MAF policlonal de rato (Santa Cruz) diluição de 1:100 foi usado por 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por incubação com um polímero de dextrano de Ig anti-coelho acoplado com peroxidase (Flex+, Dako). Seções foram então visualizadas com 3,3’-diaminobenzidina (DAB) e contracoradas com Hematoxilina.
[0276]Imunocoloração de c-MAF foi pontuada por um algoritmo computadorizado. Nove imagens representativas a partir de cada espécime foram adquiridas a intervalos de 10-nm de comprimento de onda entre 420 e 700 nm, usando um microscópio DM2000 Leica equipado com o sistema de imagem Nuance FX Multispectral (CRI Inc). Os sinais positivos foram convertidos a partir da transmissão para unidades de densidade ótica ao tomar o log negativo da relação da amostra dividido pelo cubo de referência usando a lei de conversão de Beer. Um limiar auxiliado a computador foi ajustado, o que criou uma imagem pseudo-colorida que ressaltou todos os sinais positivos. As análises anteriores suportaram a medição quantitativa de expressão de c-MAF.
[0277]Apenas os núcleos das células epiteliais (normal e maligno), mas não células estromais ou linfócitos, foram automaticamente detectados por ajustar o tamanho de limiar distinto e confirmado por um patologista. Para cada caso foi calculado o valor médio da intensidade do sinal de todas as regiões de interesse para a análise estatística.
[0278]Valor prognóstico e preditivo de c-MAF para metástase e metástase nos ossos em câncer de próstata
[0279]O valor de expressão de c-MAF prognóstico e preditivo para metástase de câncer de próstata foi avaliado. Os níveis de proteína c-MAF foram determinados por imunohistoquímica (IHC). A imunocoloração de MAF foi pontuada por uma medição computadorizada. A saída da medição computadorizada produziu um dado contínuo que varia a partir de 1160 a 99760 unidades de densidade ótica (O.D.) para a expressão de c-MAF. O corte (10000 O.D.) para a expressão alta e baixa foi determinado com base na curva de operação de recebimento como por procedimentos padrão.
[0280]Os resultados são resumidos na tabela 3 Tabela 3 Níveis de expressão de proteína c-MAF Metástase nos ossos expressão de c-MAFNOYes <=10,000 OD 212 >10,000 OD 56
[0281]Com base nos referidos valores de relações de probabilidade de risco do grupo que sofreu metástase nos ossos em c-MAF alto versus o grupo de baixo foi OR (metástase nos ossos at qualquer time) = 12,60 (95% C.I. 1,93 - 82,09)
[0282]Com base na segundao coorte analisada, foram extraídas algumas características clínicas de diagnóstico. O alto nível de expressão de proteína c-MAF prevê metástase nos ossos com uma sensibilidade de 0,75, uma especificidade de 0,81. Isso é resumido e expresso em percentagem incluindo os intervalos de confiança na tabela 4. Tabela 4
[0283]O gene c-MAF ou expressão de proteína em tumores de próstata identifica uma população em risco de metástase, em particular metástase nos ossos a qualquer tempo.
[0284]Foi testado se o ganho em chr16q22-q24, que incluiu o loci genômico de c-MAF, é associado com risco de metástase nos ossos em pacientes com câncer de próstata. Par esse fim foi usado um método que identifica as amplificações de chr16q22-q24, nesse caso por meio de uma sonda de chr16q23 e chr14q32 de duplo hibridização de fluorescência in situ (FISH) para medir o número de cópias da região chr16q22-24. Foi também usado a sonda chr14q32 para normalizar a poliplóidia do tumor.
[0285]A análise de hibridização fluorescente in situ (FISH) de 16q23, dentro da amplificação região genômica de 16q22-24, incluindo o gene c-MAF, foi realizado em TMA acima descrita usando o microscópio de fluorescência DM2000 Leica de acordo com o Procedimento Operacional. Foi usado uma sonda mix SpectrumLaranja que margeia a região genômica do gene MAF e é composta de dois segmentos que são cada um dos quais aproximadamente 350 kb com um espaço de aproximadamente 2.2 Mb. O segmento centromérico é localizado a chr16:75729985- 76079705 (March 2006 assembly, UCSC genoma Browser) e o segmento telomérico é localizado a chr16:78290003-78635873 (March 2006 assembly, UCSC genoma Browser). A referida sonda margeia cinco genes VAT1L, CLEC3A, WWOX, 5srRNA e MAF (ordenado a partir de centrômero par o telômero).
[0286]Em suma, a região de amplificação 16q23, incluindo o gene MAF, e a região de controle 14q32, incluindo o gene IgH, foram determinadas por FISH em seções de 5 μm de TMA usando procedimentos padrão. Seções de tecido de parafinizadas foram tratadas com 0,2 M de HCl e então com tiocianato de sódio, para eliminar o sal precipitado. As lâminas pré-tratadas foram incubadas por 10 min em uma solução de proteinase K a 37°C. As lâminas foram então pós-fixadas em formalina tamponada. As sondas de DNA 16q23/14q32 fluorescentemente marcadas foram desnaturadas a 78°C por 5 min e hibridizadas durante a noite a 37°C em uma placa quente. As lavagens foram realizadas por 2 min a 72°C em uma solução de 2 x SSC/0,3% Nonidet P40. As seções de tecido foram contracoradas com 10 μL de 4,6- diamino-2-fenilindola (DAPI contrastante).
[0287]Os resultados foram capturados com um microscópio de fluorescência DM2000 Leica e analisados com o sistema de imagem Nuance FX Multispectral. A pontuação FISH dos sinais de fluorescência (vermelho para 16q23 e verde para a região de controle 14q32) foram realizados por contar o número de cada cópia de região em uma média de 50 núcleos não sobrepostos para cada caso. O valor de prognóstico e preditivo da associação de ganho cromossomal 16q22-24 CNA com metástase nos ossos em câncer de próstata foi avaliado. O número de cópias por núcleo da região chr16q23 e chr14q32 foi determinado por FISH. O número esperado de cada sinal de sonda foi dois por núcleo. A amplificação foi considerada quando a média de sinais de sonda 16q23 foi mais do que 1,5 quando normalizada por número de cópias da região 14q32.
[0288]Os resultados são resumidos nas tabelas 5 e 6. Tabela 5: Relação chr16q23/chr14q32 e risco de metástase.
[0289]Um tumor será positivo para um ganho de 16q22-24 CNA com base em um corte >= to 1,5 cópias de 16q23 normalizado por número de cópias de 14q32. Metástase Relação 16q23/14q32NÃOSIM <=1,5 27 2 >1,5 2 6 Tabela 6: Relação chr16q23/chr14q32 > ou = 1,5 e predição de risco de metástase nos ossos.
[0290]Um tumor será positivo para um ganho de chr16q22-24 CNA com base no corte >= a 1,5 cópias do chr16q23 normalizada por número de cópias de chr14q32. Metástase nos ossos Relação 16q23/14q32NÃOSIM <=1,5312 >1,513
[0291]Com base nos referidos valores foi calculado a relação de probabilidade de risco de sofrer metástase e metástase nos ossos no grupo de ganho chr16q22-24 ou grupo positivo de ganho CNA versus o negativo. Com base na referida estimativa, a OR para os pacientes positivos para chr16q22-24 CNA de sofrer metástase foi 40.50 (95%CI 4.72-347.82), e a OR par o ganho normalizado chr16q22-24 CNA usando 14q32 pacientes positivos versus o controle e metástase nos ossos foi 46.50 (95%CI 3.20-676.24). o pequeno tamanho da coorte produziu a estimativa imprecisa, mas dentro de um caso clinicamente relevante ou de pelo menos 4.72 e 3.20 com a 95% de confiança em cada caso.
[0292]Com base nos dados analisados por FISH, foram extraídas algumas características clínicas diagnósticas. Ganho de Chr16q22-24 CNA (>=1,5 16q23 cópias por célula normalizada para chr14q32) prevê risco de metástase de câncer de próstata com uma sensibilidade de 0,75, uma especificidade de 0,93. Esses resultados expressos em porcentagens são resumidos como a seguir na tabela 7 incluindo 95% de intervalos de confiança (C.I.). Tabela 7 Características de diagnóstico clínico com base no ganho Chr16q22- 24 CNA (>=1,5 16q23 cópias por normalização celular to chr14q32) para a predição de câncer de próstata risco de metástase
[0293]Com base nos dados analisados por FISH, foram extraídas algumas características clínicas de diagnóstico. Ganho Chr16q22-24 CNA (>=1,5 16q23 cópias por célula normalizada pára chr14q32) prevê risco de metástase nos ossos por câncer de próstata com uma sensibilidade de 0,60, uma especificidade de 0,97. Esses resultados expressos em porcentagens são resumidos como a seguir na tabela 8 incluindo 95% de intervalos de confiança (C.I.) Tabela 8. Características de diagnóstico clínico com base no ganho Chr16q22-24 CNA (>=1,5 16q23 cópias por célula normalizada para chr14q32) para a previsão de . risco de metástase nos ossos por câncer de próstata.
[0294]O chr16q22-24, e em particular chr16q23, o ganho CNA em Tumores de próstata fortemente prevê e é associado com risco de metástase e metástase nos ossos a qualquer momento.
Claims (5)
1. Método in vitro para o diagnóstico de metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método compreende: (i) quantificar o nível de expressão do gene c-MAF em uma amostra de tumor de próstata do referido indivíduo, e (ii) comparar o nível de expressão obtido em (i) com o nível de expressão do gene c-MAF em uma amostra controle, em que se o nível de expressão do gene c-MAF na referida amostra de tumor é aumentado com relação ao nível de expressão do gene c-MAF na amostra controle, então o referido indivíduo tem um diagnóstico positivo para metástase óssea ou uma maior tendência de desenvolver metástase óssea, em que a amostra controle é uma amostra de tumor de um indivíduo com câncer de próstata que não sofreu metástase, em que o nível de expressão do gene c-MAF na referida amostra de tumor é considerado aumentado quando o nível de expressão do gene c-MAF na referida amostra de tumor é pelo menos 1,1 vezes com relação ao nível de expressão do gene c-MAF na amostra de controle.
2. Método in vitro para diagnosticar metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata e/ou para o prognóstico da tendência de desenvolver metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar se o gene c-MAF é amplificado em uma amostra de tumor do referido indivíduo com relação ao número de cópias do gene de referência, em que uma amplificação do gene c-MAF com relação ao referido número de cópias do gene de referência é indicativo da presença de metástase óssea ou de um risco aumentado de desenvolver metástase óssea, e em que a amplificação de c-MAF na referida amostra de tumor é considerada amplificada quando o nível de amplificação do gene c-MAF na referida amostra de tumor é aumentado em pelo menos 2 vezes em relação ao número de cópias do gene de referência.
3. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a metástase óssea é metástase osteolítica.
4. Método para classificar um indivíduo que sofre de câncer de próstata em uma coorte, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) determinar o nível de expressão de c-MAF em uma amostra de tumor de próstata do referido indivíduo; b) comparar o nível de expressão de c-MAF na referida amostra com um nível de expressão de c-MAF de referência predeterminado; e c) classificar o referido indivíduo em uma coorte com base no referido nível de expressão de c-MAF na amostra, em que se o referido nível de expressão de c-MAF em uma amostra de tumor de próstata do referido indivíduo é aumentado em relação ao referido nível de referência predeterminado, então os membros da coorte são classificados como tendo risco aumentado de metástase óssea, e em que o nível de expressão do gene c-MAF na referida amostra de tumor é considerado aumentado quando o nível de expressão do gene c-MAF na referida amostra de tumor é de pelo menos 1,1 vezes em relação ao nível de referência predeterminado de c-MAF expressão.
5. Método in vitro para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase óssea em um indivíduo com câncer de próstata, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método compreende determinar se o gene c-MAF é translocado em uma amostra de tumor do referido indivíduo, em que a translocação do gene c-MAF é indicativo de um risco aumentado de metástase óssea, em que a translocação do gene c-MAF é medida pela quantificação da translocação do locus 16q22-24.
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