KR101264473B1 - Ｒａｎｋ-ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드 - Google Patents

Ｒａｎｋ-ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RANK-L에 대한 아미노산 서열, 뿐만 아니라 하나 이상의 이러한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 화합물 또는 구조물, 특별히 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법; 이러한 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 발현하거나 발현가능한 숙주 세포; 이러한 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특별히 약학 조성물; 및 특별히 예방학적, 치료학적 또는 진단학적 목적을 위한 이러한 아미노산 서열, 또는 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

ＲＡＮＫ-Ｌ에 대한 아미노산 서열, 및 이를 포함하는 골 질환 및 장애 치료용 폴리펩티드{AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST RANK-L AND POLYPEPTIDES COMPRISING THE SAME FOR THE TREATMENT OF BONE DISEASES AND DISORDERS}
본 발명은 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제[RANK-L: Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligand; 또한 종양 괴사 인자-관련된, 활성화-유도된 사이토킨(TRANCE: tumor necrosis factor-related, activation-induced cytokin), 파골세포 분화 인자(ODF: osteoclast differentiation factor), 오스테오프로테게린 리간드(OPG-L: osteoprotegerin ligand) 또는 종양 괴사 인자 상과 구성원 11(TNFSF11: tumor necrosis factor superfamily member 11)]에 대한 아미노산 서열(본원에 정의된 바와 같음), 뿐만 아니라 하나 이상의 이러한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 화합물 또는 구조물, 특별히 단백질 및 폴리펩티드(또한 "본 발명의 아미노산 서열", "본 발명의 화합물", 및 "본 발명의 폴리펩티드"로서 개별적으로 본원에 지칭됨)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 코딩(encoding)하는 핵산(또한 "본 발명의 핵산" 또는 "본 발명의 뉴클레오티드 서열"로서 본원에 지칭됨); 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법; 이러한 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 이러한 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물, 특별히 약학적 조성물; 및 이러한 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도, 특별히 예방학적, 치료학적 또는 진단학적 목적, 예컨대 본원에 언급된 예방학적, 치료학적 또는 진단학적 목적을 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태, 실시양태, 이점 및 적용성은 본원의 추가의 기재내용으로부터 분명해질 것이다.
골의 재형성(remodeling)(교체)은 성인 골격이 연속적으로 재흡수(제거)되고 형성(대체)되는 과정이다. 골 재형성은 조골세포에 의한 골 세포간질(matrix)의 합성 및 파골세포에 의한 이의 재흡수를 포함한다. 조혈세포(hematopoetic cell)로부터 유도된 파골세포는 골 조직을 재흡수하는 능력을 갖는 조직 대식세포의 고유의 형태이다. 조골세포는 골 콜라겐을 분비하는 능력을 갖는 특수화된 섬유아세포이다. 이들 골 세포의 활성들 사이에 골 형성 및 골 재흡수 과정을 연결하는 정교한 공동작업이 존재한다.
골 재형성은 RANK-L/RANK 및 RANK-L 유인(decoy) 수용체 OPG 사이의 균형에 의해 제어된다. RANK-L 및 이의 수용체 RANK는 파골세포의 성장 및 활성화에 필수적이다. 분비 단백질인 OPG는 파골세포 성숙(maturation) 및 파골세포 활성화에 대한 효과적인 저해제이다. 정상적인 골 항상성(homeostasis)에서, RANK-L 및 OPG는 단핵세포 전구체로부터의 파골세포의 생성을 잘 제어하는 사이토킨 주축에 참여한다. 조골세포 및 골수 기질 세포(stromal cell)에 의해 발현되는 RANK-L은 이의 기 능적 수용체인 RANK에 결합하여, 전구체 세포로부터의 파골세포의 분화, 및 성숙 파골세포의 증식 및 활성을 자극한다. 조골세포, 기질 세포, 수지상(dendritic) 세포 및 거핵세포에 의해 발현되는 OPG는 RANK-L에 대한 가용성 유인 수용체로서 작용함으로써 상기 과정을 제한한다.
TNF 계열 분자 RANK-L은 단일 유전자(rankl)에 의해 인간 염색체 13q14에서 코딩된다. RANK-L mRNA는 골 및 골수, 뿐만 아니라 임파 조직(림프절, 흉선, 비장, 태아상태의 간 및 페이어 패치(Peyer's patches))에서 가장 높은 수준으로 발현된다(Anderson et al. 1997, Nature 390: 175-179; Wong et al. 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194; Lacey et al. 1998, Cell 93: 165-176; Yasuda et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3597-3602). RANK-L mRNA의 교대 접합(alternative splicing)은 316개 또는 270개 아미노산의 유형 II 막간 당단백질로서의 발현, 또는 243개 아미노산의 가용성 리간드로서의 발현을 허용한다(Kong et al. 1999, Nature 397: 315-323; Nagai et al. 2000, Biochem Biophys. Res. Commun. 269: 532-536). 또한, RANK-L은 TNF-알파 전환효소(convertase)를 비롯한 메탈로프로테나아제(metalloproteinase)에 의해 그의 막 결합 상태로부터 풀려날 수 있다(Lum et al. 1999, J. Biol. Chem. 274: 13613-13618). RANK-L의 모든 4가지 이소형(isoform)은 파골세포형성을 개시할 수 있는 삼량체 분자로 회합된다.
전구파골세포 상에서 발현되는 RANK(NF카파(kappa)B의 수용체 활성화제, TRANCE-R, ODAR, 또는 TNFRSF11A로서도 공지됨)는 RANK-L에 대한 이들 세포상의 유일한 수용체이다(Li et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1566-1571). RANK-L에 의한 RANK 활성화 이후 이는 TNF 수용체-회합된(TRAF) 계열 구성원과 상호작용하고, 핵 인자(NF)-카파B 및 c-Fos, JNK, c-src, 및 세린/트레오닌 키나아제(kinase) Akt/PKB를 활성화시킨다(Anderson et al. 1997, Nature 390: 175-179; Hsu et al. 1999, Proc. Acad. Sci. USA 96: 3540-3545).
오스테오프로테게린[OPG; "골의 보호자"; 파골세포생성 저해 인자(OCIF: osteoclastogenesis inhibitory factor)로서도 공지됨]은 TNF 수용체 계열에 상동성을 갖는, 활성화된 조골세포에 의해 생산되고 방출된 110-kDa의 가용성 이황화-연결 동종이량체성(homodimeric) 당단백질로서(Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319), RANK-L에 대한 유인 수용체로서 작용하고 RANK-L 결합에 대해 RANK와 경쟁한다. 결과적으로, OPG는 파골세포 성숙 및 파골세포 활성화에 대한 효과적인 저해제이고(Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319; Lacey et al. 1998, Cell 93: 165-176; Kong et al. 1999, Nature 397: 315-323), 이로써 골 재흡수를 감소시킨다.
골 형성 및 파괴에 대한 중재자로서의 OPG/RANK-L/RANK 시스템에 관한 보다 상세한 개요는 문헌[Khosla, 2001 Endocrinology 142: 5050-5055], [Holstead Jones et al. 2002, Ann. Rheum. Dis. 61 (Suppl II): ii32-ii39], [Bezerra et al. 2005, Brazilian J. Med. Biol. Res. 38: 161-170], 및 [McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33]에 제시되어 있다.
몇몇 골 장애는 골 재형성 활성의 재흡수 및 형성 성분들 사이에 불균형(골 항상성의 해체)이 있을 때 발생된다. 파골세포 및 조골세포 활성 사이의 불균형은 광범위한 호르몬 변화 또는 염증 및 성장 인자의 교란, 예컨대 OPG 및 RANK-L 사이의 변경된 균형으로부터 야기될 수 있다. 골 재흡수가 골 형성에 비하여 더 큰 경우, 시간에 따른 골의 순 손실(net loss)이 일어난다. 이는 결국 낮은 골 질량(골량감소: osteopenia) 또는 골다공증을 일으킬 수 있다. 골 형성이 재흡수를 초과하는 경우, 골 질량의 순 증가(골화석증: osteopetrosis)가 일어난다.
보다 높은 RANK-L, 보다 낮은 OPG 또는 이들 둘다에 기인한 과도한 골 손실 또는 파괴는 폐경후 골다공증(Eghbali-Fatourechi et al. 2003, Journal of Clinical Investigation 111: 1221-1230; Tsangari et al. 2004, Bone 35: 334-342; Abdallah et al. 2005, Calcified Tissue International 76: 90-97), 원발성 부갑상선기능항진증(primary hyperparathyroidism)(Stilgren et al. 2004, Bone 35: 256-265; Johnell et al. 2005, Journal of Bone and Mineral Research 20: 1185-1194), 골의 페이젯병(Paget's disease)(Reddy 2004, Journal of Cellular Biochemistry 93: 688-696), 전이성(metastatic) 골 질환(Brown 2004, Cancer Treatment and Research 118: 149-172), 골수종(Okada et al. 2003, Clinical and Experimental Metastasis 20: 639-646), 류마티스 관절염(Crotti et al. 2002, Annals of the Rheumatic Diseases 61: 1047-1054) 및 몇몇 다른 대사성 또는 염증성 골 및 관절 장애(Locklin et al. 2001, Bone 28 (Suppl.): S80; Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050)를 비롯한 많은 질환에 관여되어 왔다.
골절의 위험을 감소시키는 약리학적 제제가 10년 이상동안 통용되어 왔다. 항이화작용(anticatablolic) 약물(에스트로겐, 비스포스포네이트, 칼시토 닌(calcitonin) 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자)은 골 재흡수를 감소시키는 한편, 동화작용제, 예컨대 재조합 인간 부갑상선 호르몬(PTH: parathyroid hormone)은 골 형성 및 골 크기를 증가시킨다. 비스포스포네이트 부류의 약물은 골다공증의 치료에 가장 빈번히 사용되는 약물이다. 이러한 약물 부류는 일반적으로 매우 안전하지만, 경구 투여가 복잡하고, 적은 비율의 임상 실험 환자에서 위장관 부작용이 일어나고 있다. 정맥내 비스포스포네이트 투여의 간격을 증가시키는 임상 시험들을 평가하는 중이다.
골다공증과 같은 골 질환 및 장애의 병인론에서 중추적 조절 인자로서의 OPG/RANK-L/RANK 시스템의 최근 발견은 치료제를 위한 유례없는 표적을 제공한다. 실험실 동물 및 인간에서, OPG의 투여 형태는 파골세포 활성을 현저히 저해하고 골 강도를 개선시켰다(Bekker et al. 2001, J. Bone Miner. Res. 16: 348-360; Campagnuolo et al. 2002, Arthritis Rheum. 46: 1926-1936; Bezerra et al. 2005, Brazilian J. Med. Biol. Res. 38: 161-170; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33). 인간에서의 초기 연구에서, RANK-L에 대한 완전한 인간 항체(데노수맵: denosumab)는 골 교체를 감소시키고 골 밀도를 개선시켰다(Body et al. 2003, Cancer 97: 887-892; Bekker et al. 2004, J. Bone Miner. Res. 19: 1059-1066; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050; McClung et al. 2006, N. Engl. J. Med. 354: 821-831). 그러나, 이러한 완전 항체들은, 예컨대 높은 생산 비용, 낮은 안정성 및 이들의 큰 크기(이는 예를 들면 특정의 숨겨진 에피토프(epitope)에 대한 접 근성을 방해함)와 같은 전체 크기의 항체에 대한 단점에 직면한다.
나노바디(Nanobody)는 종래의 4-쇄 항체에 비하여 더 유효하고 안정적인데, 이는 (1) 투여 형태를 감소시키고 투여 빈도를 낮추어 부작용을 줄이고; (2) 안정성을 개선시킴으로써 정맥내 경로에 더하여 경구 또는 피하 경로 및 서방성 제형을 포함하여 투여 경로를 보다 광범위하게 선택할 수 있도록 한다.
나노바디는 이들의 작은 크기로 인하여 막을 통과하고 보다 큰 다른 폴리펩티드 및 단백질이 접근할 수 없는 생리학적 격실, 조직 및 기관내로 침투가능하다. 나노바디는, 예를 들면, 골 세포간질내로 쉽게 침투하여 이들이 골 질환 및 장애의 치료에 적합하도록 만든다.
또한 나노바디는 그의 작은 크기로 인해 다가 또는 다중특이적(multispecific) 폴리펩티드로 조작되기에 이상적으로 적합하다. RANK-L 삼량체중 단지 하나의 서브유닛(subunit)에 결합될 수 있는 완전 항체와는 대조적으로, 2가 또는 3가 폴리펩티드(개별적으로 RANK-L에 대한 2개 또는 3개의 나노바디에 기초함)는 삼량체성 RANK-L 분자의 2개 또는 3개의 서브유닛에 개별적으로 결합할 수 있고, 이들의 보다 높은 효능으로 인해 유리할 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 일반적으로 RANK-L의 RANK로의 결합을 조정, 특별히 저해 및/또는 방지하여, RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호를 조정, 특별히 저해 및/또는 예방함으로써 RANK-L 및/또는 RANK가 관여되는 생물학적 경로를 조정하고/하거나 이러한 신호 및 이들 경로와 연관되는 생물학적 기작, 반응 및 효과를 조정하기 위해 사용될 수 있다. RANK-L의 RANK로의 결합 및/또는 RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호는, 동일한 조건하에서이나 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 없는 경우의 RANK-L의 RANK로의 결합 및/또는 RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호와 비교하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상으로 저해 및/또는 방지될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 RANK-L의 OPG로의 결합을 조정, 특별히 저해 및/또는 방지하여 RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호를 조정(저해 및/또는 방지, 또는 조장)함으로써 RANK-L, RANK 및/또는 OPG가 관여되는 생물학적 경로를 조정하고/하거나 이러한 신호 및 이들 경로와 연관되는 생물학적 기작, 반응 및 효과를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 RANK-L 및/또는 이러한 신호의 작용물질 또는 길항물질일 수 있다. 이들은 OPG와 동일한 방식으로 RANK/RANK-L 중재된 신호를 저해하거나, 이들은 OPG가 RANK/RANK-L 중재된 신호를 저해하는 것을 전체적으로 또는 부분적으로 방지할 수 있다. RANK-L의 OPG로의 결합 및/또는 RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호는, 동일한 조건하에서이나 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 없는 경우의 RANK-L의 OPG로의 결합 및/또는 RANK-L, RANK 및/또는 OPG에 의해 중재되는 신호와 비교하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 저해 및/또는 방지될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 파골세포의 분화 및/또는 증식을 조정(저해 및/또는 방지 또는 조장)하기 위해 사용될 수 있다. 파골세포의 분화 및/또는 증식은, 동일한 조건하에서이나 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 없는 경우의 파골세포의 분화 및/또는 증식과 비교하여, 개별적으로, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 증가하거나 감소할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열, 폴리펩티드 및 조성물은 골 재형성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 골 재형성은, 동일한 조건하에서이나 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 없는 경우의 골 재형성과 비교하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 조정될 수 있다.
예컨대, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 골 질환 및 장애의 예방 및 치료(본원에 정의된 바와 같음)를 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, "골 질환 및 장애"는, 개별적으로, 필요한 대상(즉, 이러한 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증후를 나타내고/내거나, 이러한 질환 또는 장애가 유발되거나 발전될 위험이 있는 대상)에게 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물(특별히 이의 약학적으로 활성인 양으로), 및/또는 RANK-L 또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 또는 기작에 대해 활성인 공지의 활성 화학소(principle)(특별히 이의 약학적으로 활성인 양으로)를 적절히 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 있는 질환 및 장애로서 정의될 수 있다.
골 질환 및 장애는 골 형성 및 재흡수의 조절과 연관된 질환 및 장애를 포함한다. 순 골 손실(골 재흡수가 골 형성을 초과함)을 특징으로 하는 골 질환 및 장애는 또한 골량감소, 골다공증 및 골용해를 비롯한 골량감소성 장애로서도 지칭되고, RANK-L에 중재된 과도하고/하거나 원치않는 신호를 특징으로 한다. RANK-L의 RANK로의 결합을 조정, 특히는 저해 및/또는 방지하는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 길항물질로서 작용하고, 일반적으로 순 골 손실을 특징으로 하는 골 질환 및 장애를 예방 및 치료(본원에 정의된 바와 같음)하기 위해 사용될 것이다. 또한 RANK-L의 OPG로의 결합을 조정, 특히는 저해 및/또는 방지하는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 길항물질로서 작용하고, 일반적으로 순 골 손실을 특징으로 하는 골 질환 및 장애를 예방 및 치료(본원에 정의된 바와 같음)하기 위해 사용될 것이다.
골 질량의 순 증가를 특징으로 하는 골 질환 및 장애는 골화석증으로 지칭되고, RANK-L에 중재되는 불량한 신호를 특징으로 한다. RANK-L의 OPG로의 결합을 조정, 특별히 저해 및/또는 방지하는 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 작용물질로서 작용하고, 일반적으로 골 질량의 순 증가를 특징으로 하는 골 질환 및 장애를 예방 및 치료(본원에 정의된 바와 같음)하기 위해 사용될 것이다.
이러한 골 질환 및 장애의 예는 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 분명할 것이고, 예를 들면 다음의 질환 및 장애들이 포함된다: 골다공증(McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), 제한되지 않지만, 예를 들면, 원발성 골다공증, 내분비계 골다공증(제한되지 않지만, 예를 들면, 갑상선기능항진증, 부갑상선기능 항진증(Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 및 말단비대증), 골다공증의 유전적 및 선천적 형태(제한되지 않지만, 예를 들면, 골형성부전증, 호모시스틴요증, 멘케스 증후군(Menkes' syndrome), 릴리-데이 증후군(Riley-Day syndrome)), 사지 부동화(immobilization of extremities)에 기인한 골다공증, 글루코코르티코이드-유도된 골다공증(Locklin et al. 2001, Bone 28 (SuppL): S80; McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232) 및 폐경후 골다공증(McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33); (유년성 또는 가족성) 페이젯병(Cundy et al. 2002, Hum. Mol. Genet. 11: 2119-2127; Whyte et al. 2002, J. Bone Miner. Res. 17: 26-29; Whyte et al. 2002, N. Engl. J. Med. 347: 175-184; Johnson-Pais et al. 2003, J. Bone Miner Res. 18: 376-380; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 골수염, 즉 골 손실을 유도하는 골중의 감염성 병변; 고칼슘혈증(Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232), 제한되지 않지만, 예를 들면, 고형 종양(제한되지 않지만, 예를 들면, 유방, 폐 및 신장) 및 혈액학적 악성종양(제한되지 않지만, 예를 들면, 다발성 골수종(Sordillo and Pearse 2003, Cancer 97 (3 Suppl): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289), 림프종 및 백혈병)으로부터 야기되는 고칼슘혈증, 특발성 고칼슘혈증, 및 갑상선기능항진증 및 신장 기능 장애와 연관된 고칼슘혈증; 골 손실, 제한되지 않지만, 예를 들면, 수술후 골량감소, 스테로이드 투여에 의해 유도된 골량감소, 소장 및 대장 질환과 연관된 골량감소, 및 만성 간 및 신장 질환과 연관된 골량감소; 골괴사증, 즉 골 세포 사멸, 제한되지 않지만, 예를 들면, 외상과 연관된 골괴사증, 고셰병(Gaucher's disease)과 연관된 골괴사증, 겸상(鎌狀) 적혈구 빈혈증과 연관된 골괴사증, 전신성 홍반성 낭창과 연관된 골괴사증, 류마티스 관절염과 연관된 골괴사증, 치주질환과 연관된 골괴사증, 골용해성 전이와 연관된 골괴사증, 및 기타 증상과 연관된 골괴사증; 관절 장애, 예컨대 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 류마티스 관절염과 연관된 연골 손실 및 관절 무름과 연관된 골 손실(Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 관절염(Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170), 예컨대 염증성 관절염(McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33), 콜라겐-유도된 관절염(Bezerra et al. 2005, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 38: 161-170); 보철주변 골용해(McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 암-관련된 골 질환(McClung 2006, Current Osteoporosis Reports 4: 28-33); 아로마타아제(aromatase) 저해제 치료법과 연관된 골 손실(Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); 안드로겐 결핍 치료법과 연관된 골 손실(Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050); 골 전이와 연관된 골 손실; 면역계와 관여된 질환, 예컨대 성인 및 아동 백혈병, 암 전이, 자가면역, 및 다양한 감염과 연관된 골 손실(Holstead Jones et al. 2002, Ann. Rheum. Dis. 61 (Suppl II): ii32-ii39); 골량손실 장애, 예컨대 성인 및 아동 백혈병(Oliveri et al. 1999, Henry Ford Hosp. Med. 39: 45-48), 만성 감염, 예컨대 간염 C 또는 HIV(Stellon et al. 1985, Gastroenterology 89: 1078-1083), 자가면역 질환, 예컨대 진성당뇨병(Piepkorn et al. 1997, Horm. Metab. Res. 29: 584-91), 및 홍반성 낭창(Seitz et al. 1985, Ann. Rheum Dis. 44: 438-445), 알레르기성 질환, 예컨대 천식(Ebeling et al. 1998, J. Bone Min. Res. 13: 1283-1289), 다발성 암, 예컨대 유방암에서 용해성 골 전이(Coleman 1998, Curr. Opin. Oncol. 10 (Suppl 1): 7-13); Prostate cancer; Myeloma bone disease (Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 치주 감염(Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 팽창성 골격 과포스파타시아(hyperphosphatasia)(Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232); 골 전이(Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050; Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232).
또한 본 발명의 범주내에 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 및/또는 폴리펩티드에 의해 RANK-L/RANK/OPG 경로에서의 불균형과 연관된 다른 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료함이 포함된다. 이러한 질환 및 장애로는, 제한되는 것은 아니지만, 골다공증, 염증성 증상, 자가면역 증상, 천식, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 다발성 골수종(Sordillo and Pearse 2003, Cancer 97 (3 Suppl): 802-812; Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289); Vascular diseases(Anandarajah and Schwarz 2006, J. Cell Biochem. 97: 226-232) 및 심근 질환(Lewiecki 2006, Expert Opin. Biol. Ther. 6: 1041-1050)이 포함된다.
또한 본 발명의 범주내에 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 및/또는 폴리펩티드에 의해 골다공증, 예컨대 골다공증 타르다(tarda), 골다공증 긴장증(congenita) 및 골형 림프종(marble bone disease)을 예방 및/또는 치료함이 포함된다.
특히, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 RANK-L이 관여된 경로(들)에 의해 중재된 골 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 골 질환 및 장애의 예는 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다.
따라서, 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는, 예를 들면 RANK-L-중재된 신호를 조정할 수 있는 활성 화학소에 의해 현재 예방되거나 치료될 수 있는 모든 질환 및 장애, 예컨대 상기 인용된 선행 문헌에 언급된 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기 활성 화학소에 의한 치료가 현재 개발되고 제안되고 있거나, 앞으로 제안되거나 개발될 모든 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 파악된다. 또한, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 이들의 유리한 특성으로 인해, 본 발명의 폴리펩티드는 이들 공지의 활성 화학소가 사용되거나 제안 또는 개발될 질환 또는 장애와는 다른 질환 및 장애를 예방하고 치료하기 위해 사용될 수 있고/있거나; 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기재된 질환 및 장애를 치료하기 위한 신규 방법 및 섭생을 제공할 수 있는 것으로 파악된다.
따라서, 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 예를 들면 데노수맵에 의해 현재 예방되거나 치료되는 모든 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 다른 적용성 및 용도는 본원의 추가의 개시내용으로부터 숙련가에게 명백해질 것이다.
일반적으로, 본 발명의 목적은 골 질환 및 장애, 및 본원에 언급된 추가의 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 약리학적 활성 제제, 뿐만 아니라 이를 포함한 조성물을 제공하고; 이러한 활성제 및 조성물의 투여 및/또는 사용을 포함하는 상기 질환 및 장애를 진단, 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
특별히, 본 발명의 목적은 현재 사용되고/되거나 당분야에 공지된 제제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 특정 이점을 갖는 약리학적 활성 제제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점은 아래의 추가의 기재내용으로부터 명백해질 것이다.
보다 특별히, 본 발명의 목적은 골 질환 및 장애, 및 본원에 언급된 추가의 질환 및 장애의 진단, 예방 및/또는 치료에 약리학적 활성 제제로서 사용될 수 있는 치료학적 단백질, 뿐만 아니라 이를 포함하는 조성물을 제공하고, 이러한 치료학적 단백질 및 조성물의 투여 및/또는 사용을 포함하는 상기 질환 및 장애를 진단, 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 특정한 목적은 (본원에 정의된 바와 같은) RANK-L, 특별히 온혈동물로부터의 RANK-L, 보다 특별히 포유동물로부터의 RANK-L, 특히는 인간 RANK-L로 유도되는 아미노산 서열을 제공하고; 적어도 하나의 이러한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 및 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
특별히, 본 발명의 특정한 목적은 온혈동물, 특별히 포유동물, 보다 특별히 인간에서 예방학적, 치료학적 및/또는 진단학적 사용에 적합한 상기와 같은 아미노산 서열 및 상기와 같은 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
보다 특별히, 본 발명의 특정한 목적은 온혈동물, 특별히 포유동물, 보다 특별히 인간에서 RANK-L과 연관되고/되거나 RANK-L에 의해 중재되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 증상(예컨대 본원에 언급된 질환, 장애 및 증상)의 예방, 치료, 경감 및/또는 진단을 위해 사용될 수 있는 상기와 같은 아미노산 서열 및 상기와 같은 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 특정한 목적은 온혈동물, 특별히 포유동물, 보다 특별히 인간에서 RANK-L과 연관 및/또는 중재되는 하나 이상의 질환, 장애 또는 증상(예컨대 본원에 언급된 질환, 장애 및 증상)을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 수의학적 조성물의 제조에 사용될 수 있는 상기와 같은 아미노산 서열 및 상기와 같은 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명에서, 일반적으로, 이러한 목적들은 본원에 기재된 아미노산 서열, 단백질, 폴리펩티드 및 조성물을 사용함으로써 달성된다.
일반적으로, 본 발명은 RANK-L로 유도(본원에 정의된 바와 같음)되고/되거나 이에 특이적으로 결합(본원에 정의된 바와 같음)할 수 있는 아미노산 서열; 뿐만 아니라 적어도 하나의 이러한 아미노산 서열을 포함하는 화합물 및 구조물, 특별히 단백질 및 폴리펩티드를 제공한다.
보다 특별히, 본 발명은 본원에 정의된 친화도(본원에 추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)로 RANK-L에 결합할 수 있는 아미노산 서열; 뿐만 아니라 적어도 하나의 이러한 아미노산 서열을 포함하는 화합물 및 구조물, 특별히 단백질 및 폴리펩티드를 제공한다.
특별히, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는:
-RANK-L에 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(dissociation constant)(KD)(즉, 105∼1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107∼1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108∼1012 리터/몰의 회합 상수(association constant)(KA))로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 kon-속도로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 1 s-1(t1/2=0.69 s)∼10-6 s-1(다수일의 t1/2에 의해 거의 비가역적 착체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 koff-속도로 결합하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 1가 아미노산 서열(또는 본 발명의 아미노산 서열을 단지 1개 함유하는 폴리펩티드)은 RANK-L에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 RANK-L에 결합하기에 바람직한 몇몇 EC50 및 IC50 값은 본원의 추가의 기재내용 및 실시예로부터 명백할 것이다.
RANK-L로의 결합을 위해, 본 발명의 아미노산 서열은 대체적으로 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 신장부(stretch)(즉, 각 "신장부"는 아미노산 서열의 1차 또는 3차 구조에서 서로에 대해 인접하거나 서로에 대해 아주 근접한 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함함)를 함유하는데, 이를 통해 본 발명의 아미노산 서열은 RANK-L에 결합할 수 있고, 따라서 이러한 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 신장부는 RANK-L로의 결합을 위한 "부위"(또한 본원에 "항원 결합 부위"로서 지칭됨)를 형성한다.
본 발명에 의해 제공된 아미노산 서열은 바람직하게는 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)이거나; 또는 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(하나 이상의 적합한 연결기를 경유해 선택가능하게 연결됨)을 포함할 수 있는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드(본원에 정의된 바와 같음)의 일부를 형성한다. 예를 들면, 제한없이, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 단백질 또는 폴리펩티드(이는 결합 단위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 추가의 아미노산(RANK-L 이외의 하나 이상의 표적에 대함)을 선택가능하게 함유할 수 있음)에서 결합 단위로서 사용되어, 본원에 기재된 바와 같은 모든 본 발명의 1가, 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 개별적으로 제공할 수 있다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 임의의 다른 아미노산 서열 또는 쇄에 이황화 가교를 경유하여 연결되지 않는 단일 아미노산 쇄(그러나 하나 이상의 분자내 이황화 결합을 함유하거나 함유하지 않을 수 있음. 예를 들면 나노바디-본원에 기재된 바와 같음-는 때때로 CDR3 및 CDR1 또는 FR2 사이에 이황화 가교를 함유할 수 있음)로 본질적으로 구성되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 서로 및/또는 다른 아미노산 서열에 연결되어(예를 들어, 이황화 가교를 경유하여) 본 발명에 유용할 수도 있는 펩티드 구조물(예를 들면, Fab' 단편, F(ab')2 단편, ScFv 구조물, "다이어바디(diabody)" 및 기타 다중특이적 구조물; 예를 들면 문헌[Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9): 1126-36]을 참조함)을 제공할 수 있음을 주지해야 한다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열(또는 이를 포함하는 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드)이 대상에게 투여되도록 의도되는 경우(예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 위해), 아미노산 서열은 상기 대상에서 자연적으로 발생되지 않는 것이 바람직하거나; 또는 상기 대상에서 자연적으로 발생될 경우, 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)이다.
또한 숙련가라면, 약학적 용도를 위해, 본 발명의 아미노산 서열(뿐만 아니라 이를 포함하는 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드)은 인간 RANK-L로 유도되는 것이 바람직하고; 반면 수의학적 목적을 위해, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 바람직하게는 치료될 종으로부터의 RANK-L로 유도되거나, 치료될 종으로부터의 RANK-L과 적어도 교차 반응하는 것이 바람직하다는 것을 분명히 알 것이다.
추가로, 본 발명의 아미노산 서열은, 선택가능하게는 RANK-L에 대한 결합을 위해 적어도 하나의 결합 부위에 더하여, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대해 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 부위를 가질 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드, 및 이를 함유하는 조성물의 유효성은, 관여된 특정 질환 또는 장애에 따라서, 임의의 적합한 시험관내 검정, 세포-기초 검정, 생체내 검정 및 자체 공지된 동물 모델, 또는 이의 임의의 조합을 사용하여 시험될 수 있다. 적합한 시험관내 검정은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 ELISA; FACS 결합 검정; 비아코어(Biacore); 경쟁 결합 검정[알파스크린(Alphascreen)(등록상표), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사츠세츠주 소재; FMAT]; TRAP 검정(파골세포 분화 검정; Rissanen et al. 2005, J. Bone Miner. Res. 20, Suppl. 1: S256); NF-카파B 수용체 유전자 검정(Mizukami et al. 2002, Mol. Cell. Biol. 22: 992-1000)이 포함된다. 예를 들면 ELISA 또는 FACS에서, 본 발명의 나노바디(및 이를 포함하는 폴리펩티드)의 RANK-L로의 결합에 대한 EC50 값은 바람직하게는 1 μM 내지 1 pM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 1 pM, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 1 pM이다. 예를 들면 알파스크린(등록상표), NF-카파B 검정 또는 TRAP 검정에서, 본 발명의 나노바디(및 이를 포함하는 폴리펩티드)의 RANK-L로의 결합에 대한 IC50 값은 바람직하게는 1 μM 내지 1 pM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 1 pM, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 1 pM이다.
적합한 동물 모델은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 (SCID)/ARH-77 마우스 모델(Sordillo and Pearse 2003, Cancer 97 (3 Suppl): 802-812); 인간 MM의 SCID-hu 마우스 모델(Sordillo and Pearse 2003, Cancer 97 (3 Suppl): 802-812; Tassone et al. 2005, Blood 106: 713-716); apoE 유전자 프로모터(promoter) 및 회합된 인헨서(enhancer)의 제어하에 OPG를 과발현하는 유전자도입 마우스 (Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319); 육종-유도된 골 파쇄된 마우스 모델(Honore et al. 2000, Nat. Med. 6: 521-528); 난소적출된 동물 모델, 예를 들면 난소적출된 원숭이(Jerome et al. 1995, Bone 17: 403S-408S), 난소적출된 마우스(Roggia et al. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20: 13960-13965) 또는 난소적출된 래트 및 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이(Simonet et al. 1997, Cell 89: 309-319; Hoegh -Andersen et al. 2004, Arthritis Res. Ther. 6: R169-R180); 관절염을 위한 래트(동물) 모델(Bendele et al. 1999, Toxicologic Pathology 27: 134-142; Romas et al. 2002, Am. J. Pathol. 161: 1419-1427; Mori et al. 2002, Histochemistry and Cell Biology 117: 283-292), 예컨대 콜라겐-유도된 관절염을 위한 모델 또는 보조제-유도된 관절염을 위한 모델; 종양-유도된 PTHrP-유도된 고칼슘혈증의 동물 모델(Morony et al. 1999, J. Bone Miner. Res. 14: 1478-1485; Capparelli et al. 2000, Cancer Res. 60: 783-778); 다발성 골수종의 뮤린(murine) 모델(Vanderkerken et al. 2003, Cancer Res. 63: 287-289); 마우스에서의 염증성 장 질환 모델(Byrne et al. 2005, Gut 54: 78-86); MIF를 과발현하는 유전자도입 마우스(Onodera et al. 2006, J. Bone Miner. Res. 21: 876-885); 가용성 파골세포 분화 인자(sODF: soluble osteoclast differentiation factor)를 과발현하는 유전자도입 마우스(Mizuno et al. 2002, 20: 337-44); CSF-1R 프로모터/제1 인트론(intron) 드라이버(driver)의 제어하에 CSF-1을 발현하는 유전자도입 마우스[트랜스유전자(transgene) TgN(Csflr-Csfl)Ers(TgRC) 마우스](Wei et al. 2006, J. Leukoc. Biol. 80: 1445-1453); 코어-결합 인자 알파(Cbfa1: core-binding factor alpha1)를 과발현하는 유전자도입 마우스(Geoffroy et al. Mol. Cell Biol. 22: 6222-6233); 유인 수용체 3(DcR3: Decoy receptor 3)을 과발현하는 유전자도입 마우스(Tang et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 2346-2354), 뿐만 아니라 이후 실험 파트에서 사용되고 본원에 인용된 선행 기술에서 사용된 검정 및 동물 모델이 포함된다.
또한, 본 발명에 따라서, 온혈동물의 제1 종으로부터의 RANK-L에 대한 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 하나 이상의 다른 종의 온혈동물로부터의 RANK-L과 교차-반응성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 예를 들면, 인간 RANK-L에 대한 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 하나 이상의 다른 종의 영장류[예컨대, 제한없이, 마카카(Macaca) 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특별히, 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 및/또는 레서스(rhesus) 원숭이(마카카 물라타(Macaca mulatta)) 및 개코원숭이(baboon)(파피오 우르시너스(Papio ursinus))로부터의 RANK-L, 및/또는 질환을 위한 동물 모델(예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 돼지 또는 개), 특별히 RANK-L과 연관된 질환 및 장애를 위한 동물 모델(예컨대 본원에 언급된 종 및 동물 모델]에서 종종 사용되는 하나 이상의 종의 동물로부터의 RANK-L과 교차-반응성을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 이와 관련하여, 존재할 경우 이러한 교차-반응성은, 인간 RANK-L에 대한 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 상기 질환 모델에서 시험될 수 있도록 허용하므로, 약물 개발에 있어서 이점을 가질 수 있음이 숙련가에게 명백할 것이다.
보다 일반적으로, 다수 종의 포유동물로부터의 RANK-L과 교차-반응성인 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는, 이러한 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 다수 종에 걸쳐 사용될 수 있도록 허용하므로, 대체적으로 수의학적 적용분야에 사용하기에 유리할 것이다. 따라서, 1종의 동물로부터의 RANK-L에 대한 아미노산 서열 및 폴리펩티드(예컨대 인간 RANK-L에 대한 아미노산 서열 및 폴리펩티드)의 사용이 치료될 종에서 원하는 효과를 제공하는 한, 이러한 아미노산 서열 및/또는 폴리펩티드가 동물의 또다른 종의 치료에 사용될 수 있음은 본 발명의 범주내에 또한 내포된다.
한 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 사이노몰구스 원숭이로부터의 RANK-L과 교차-반응성이다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 마우스 또는 래트로부터의 RANK-L과 교차-반응성이다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 사이노몰구스 원숭이로부터의 RANK-L 및 마우스 또는 래트로부터의 RANK-L과 교차-반응성이다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 마우스 또는 래트로부터의 RANK-L과 교차-반응성이 아니다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 사이노몰구스 원숭이로부터의 RANK-L과 교차-반응성인 반면, 마우스 또는 래트로부터의 RANK-L과는 교차-반응성이 아니다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 사이노몰구스 원숭이로부터의 RANK-L과 교차-반응성이 아니다.
또다른 실시양태에서, 인간 RANK-L에 대한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 사이노몰구스 원숭이로부터의 RANK-L과 교차-반응성이 아니고, 마우스 또는 래트로부터의 RANK-L과도 교차-반응성이 아니다.
본 발명은 이의 가장 넓은 의미에서 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 유도되는 RANK-L의 특이적 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인(domain), 서브유닛 또는 입체구조로 특별히 제한되거나 이로 정의되지 않는다. 예를 들면 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 "상호작용 부위(interaction site)"(본원에 정의된 바와 같음)로 유도되거나 유도되지 않을 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 바람직하게는 상호작용 부위(본원에 정의된 바와 같음)로 유도되고, 특별히 RANK에 대한 RANK-L 상의 결합 부위 또는 OPG에 대한 RANK-L 상의 결합 부위로 유도되는 것으로 추정되고 이것이 바람직하다.
따라서, 바람직하지만 비-제한적인 한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되고, 이는 본원에 추가로 정의된 바와 같다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 결합하는 것은 RANK-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하고, 이에 따라 이러한 RANK-L/RANK 결합에 의해 중재된 신호를 저해하거나 방지한다. 따라서 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L/RANK 중재된 신호의 길항물질로서 작용할 수 있다.
비제한적인 특정한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되지만, RANK-L/OPG 상호작용을 간섭(감소/저해)하지 않는다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 파골세포 성숙 및 활성화의 OPG 중재된 저해에 더하여 RANK-L/RANK 중재된 신호의 길항물질로서 작용(파골세포 성숙 및 활성화를 저해)할 것이다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고, 이는 추가로 본원에 정의되어 있다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L 상의 OPG 결합 부위로 결합하는 것은 RANK-L의 OPG로의 결합을 저해 및/또는 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L의 OPG로의 결합의 경쟁적 또는 비-경쟁적 저해제로서 작용할 수 있다(예를 들어 ELISA, 알파스크린(등록상표) 검정, TRAP 검정 및/또는 NF카파B 검정에서). 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L 상의 OPG 결합 부위에 결합하는 것은, 교대로, RANK-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하고, 이에 따라 이러한 RANK-L/RANK 결합에 의해 중재된 신호를 저해 및/또는 방지한다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 및 RANK-L/RANK 중재된 신호의 길항물질로서 작용할 수 있다(즉, 이들은 RANK/RANK-L 상호작용을 저해함).
그러나, 몇몇 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고, RANK-L의 RANK로의 결합을 본질적으로 감소시키지 않으면서 RANK-L의 OPG로의 결합을 간섭할 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 상기 RANK-L/RANK 상호작용에 의해 중재되는 신호를 조장하고, RANK-L 및 RANK-L/RANK 중재된 신호의 작용물질로서 작용한다(즉, 이들은 OPG 작용의 길항물질로서 작용함).
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 바람직하게는 데노수맵의 에피토프와 중첩된 RANK-L 상의 에피토프로 유도된다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 데노수맵의 에피토프와 중첩된 RANK-L 상의 에피토프에 결합하는 것은 데노수맵의 RANK-L로의 결합을 저해 및/또는 방지할 수 있다. 따라서 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 데노수맵의 RANK-L로의 결합에 대한 경쟁 또는 비-경쟁적 저해제로서 작용할 수 있다(예를 들어 ELISA, 알파스크린(등록상표) 검정, TRAP 검정 및/또는 NF카파B 검정에서).
본원에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 RANK-L에 대한 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일반적으로, 이러한 폴리펩티드는 본 발명의 단일 아미노산 서열에 비하여 증가된 활성으로 RANK-L에 결합될 것이다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들면 RANK-L의 동일한 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조(적용가능한 경우)(이는 상호작용 부위이거나 아닐 수 있음)로 유도되는 본 발명의 2개의 아미노산 서열을 포함하거나; RANK-L의 제1의 동일한 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조(적용가능한 경우)(이는 상호작용 부위이거나 아닐 수 있음)로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제1" 아미노산 서열, 및 제1과 상이한 제2 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조(적용가능한 경우)(이는 상호작용 부위이거나 아닐 수 있음)로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제2" 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 "비파라토프성(biparatopic)" 폴리펩티드에서, 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열은 상호작용 부위(본원에 정의된 바와 같음)로 유도되지만, 본 발명은 가장 넓은 의미에서 이에 제한되지 않는다.
따라서, 특별한 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 RANK-L 상의 RANK에 대한 결합 부위로 유도되는 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하거나; RANK-L 상의 RANK에 대한 결합 부위로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제1" 아미노산 서열; 및 제1과 상이하고 RANK-L 상의 RANK에 대한 결합 부위가 아닌 제2 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제2" 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 또다른 특별한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 RANK-L 상의 OPG에 대한 결합 부위로 유도되는 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하거나; RANK-L 상의 OPG에 대한 결합 부위로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제1" 아미노산 서열; 및 제1과 상이하고 RANK-L 상의 OPG에 대한 결합 부위가 아닌 제2 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조로 유도되는 적어도 하나의 본 발명의 "제2" 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 표적이 결합 쌍(예를 들면, 수용체-리간드 결합 쌍)의 부분인 경우, 아미노산 서열 및 폴리펩티드는, 이들이 표적으로의 결합을 위해 동족 결합 파트너(예를 들어, 적용가능한 경우, 리간드, 수용체 또는 다른 결합 파트너)와 경쟁하고/하거나 이들이 표적으로의 결합 파트너의 결합을 (전체적으로 또는 부분적으로) 무효화시킬 수 있다.
또한, 적용가능한 경우, 본 발명의 아미노산 서열이 RANK-L의 2개 이상의 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조에 결합될 수 있음이 본 발명의 범주내에 속한다. 이러한 경우, 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 폴리펩티드가 결합되는 RANK-L의 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인 또는 서브유닛은 본질적으로 동일하거나(예를 들면, RANK-L이 반복된 구조적 모티프(motif)를 함유하거나 다량체 형태로 초래되는 경우), 또는 상이할 수 있다(후자의 경우, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L의 이러한 상이한 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인 또는 서브유닛에 동일하거나 상이한 친화도 및/또는 특이성을 갖고 결합될 수 있음). 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 삼량체의 2개 또는 3개의 서브유닛에 결합된다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 이것이 적절한 리간드에 결합되는 RANK-L의 입체구조(conformation)에 결합되거나, 적절한 리간드에 결합되지 않는 RANK-L의 입체구조에 결합되거나, 이러한 입체구조 둘 다에 결합될 수 있다(동일하거나 상이한 친화도 및/또는 특이성을 갖고). 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK에 결합되는 RANK-L의 입체구조에 결합되거나, RANK에 결합되지 않는 RANK-L의 입체구조에 결합되거나, 이러한 입체구조 둘 다에 결합될 수 있다(동일하거나 상이한 친화도 및/또는 특이성을 갖고). 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 OPG에 결합되는 RANK-L의 입체구조에 결합되거나, OPG에 결합되지 않는 RANK-L의 입체구조에 결합되거나, 이러한 입체구조 둘 다에 결합될 수 있다(동일하거나 상이한 친화도 및/또는 특이성을 갖고).
RANK-L은 막 결합된 가용성 형태로 존재한다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 이중 한 형태에 결합될 수 있거나, 바람직하게는 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 이들 형태 둘다에 결합될 수 있다. RANK-L은 4종의 상이한 이소형(상기 참조)으로 존재한다. 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L의 4종의 이소형중 하나에 결합되거나, RANK-L의 1종 보다 많은, 예컨대 2종, 3종 또는 모든 4종의 이소형에 결합될 수 있다.
또한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 일반적으로 RANK-L의 모든 자연 발생 또는 합성 유사체, 변형체, 돌연변이체, 대립인자, 부분 및 단편; 또는 적어도 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L(예를 들어 야생형 RANK-L)에서 결합되는 항원 결정자(들) 또는 에피토프(들)과 본질적으로 동일한 하나 이상의 항원 결정자 또는 에피토프를 함유하는 RANK-L의 이러한 유사체, 변형체, 돌연변이체, 대립인자, 부분 및 단편에 결합될 것으로 기대된다. 다시, 이러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열이 (야생형) RANK-L에 결합되는 친화도 및 특이성과 동일하거나 상이한(보다 높거나 낮은) 친화도 및/또는 특이성을 갖고 이러한 유사체, 변형체, 돌연변이체, 대립인자, 부분 및 단편에 결합될 수 있다. 또한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L의 몇몇 유사체, 변형체, 돌연변이체, 대립인자, 부분 및 단편에는 결합되지만 다른 것에는 결합되지 않음이 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 다른 관련된 TNF 계열 구성원(예를 들어 TRAIL, TNF-알파 및/또는 CD40 리간드)에 결합될 수 있다. 그러나, 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 관련된 TNF 계열 구성원에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않을 것이다(즉, RANK-L에 대한 그의 친화도에 비하여 10배 보다 더, 바람직하게는 100배 보다 더, 보다 바람직하게는 1000 배 보다 더 낮음). 한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 TRAIL에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않을 것이다. 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 TNF-알파에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않을 것이다. 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 CD40 리간드에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않을 것이다. 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 TRAIL, TNF-알파 및/또는 CD40 리간드에 대해 검출가능한 친화도를 갖지 않을 것이다.
모든 공지된 TNF 사이토킨 계열 구성원과 유사하게, RANK-L은 비공유적으로 회합된 삼량체로 자가-조립된다. RANK-L이 단량체 형태 및 하나 이상의 다량체 형태로 존재할 경우, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 단지 단량체 형태의 RANK-L에만 결합하거나, 단지 다량체 형태의 RANK-L에만 결합하거나, 단량체 형태 및 다량체 형태 둘다에 결합함은 본 발명의 범주내에 속한다. 다시, 이러한 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열이 다량체 형태에 결합하는 친화도 및 특이성과 동일하거나 상이한(즉, 보다 높거나 낮음) 친화도 및/또는 특이성을 갖고 단량체 형태에 결합될 수 있다.
본 발명의 한 비-제한적 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L 삼량체의 형성이 방지 및/또는 저해되도록 RANK-L에 결합된다.
RANK-L이 단독삼량체의 이웃하는 단량체에 의해 형성된 각각 3개의 틈(또는 홈)을 따라 하나의 수용체 분자(RANK)와 결합하는 것이 허용된다. 이러한 방식으로, RANK-L 삼량체는 공간적으로 구별되지만 동등한 서브유닛간(intersubunit) 수용체-결합 홈을 나타내고, 이 안으로 3개의 수용체 분자가 결합된다. 따라서, RANK-L 및 그의 수용체 사이의 상호작용을 저해하기 위해서, 치료학적 분자는 바람직하게는 RANK-L의 서브유닛간 수용체 결합 홈을 표적으로 해야 한다. 나노바디(추가로 본원에 정의된 바와 같음)는 소위 강(cavity)-결합 특성을 나타낼 수 있고(무엇 보다도, 종래의 VH 도메인에 비하여, 이들의 연장된 CDR3 루프(loop)에 기인함), 따라서 RANK-L과 그의 RANK 수용체의 상호작용을 저해하는데 이상적으로 적합하다. 따라서, 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 RANK-L의 상호서브유닛 수용체-결합 홈에 결합된다.
또한, RANK-L이 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 회합하여 단백질 착체를 형성하는 경우(예를 들어 다중 서브유닛과 함꼐), 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L에 그의 비-회합된 상태로 결합되거나, RANK-L에 그의 회합된 상태로 결합되거나, 둘다에 결합됨이 본 발명의 범주내에 속한다. 모든 이들 경우에, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드가 RANK-L에 그의 단량체성 비-회합된 상태로 결합되는 친화도 및 특이성과 동일하거나 상이한(즉, 보다 높거나 낮은) 친화도 및/또는 특이성을 갖고 이러한 다량체 또는 회합된 단백질 착체에 결합될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는, 숙련가에게 명백하듯이, 적어도 생물학적 및/또는 치료학적 견해로부터 가장 관련있는 RANK-L(단량체, 다량체 및 회합된 형태가 포함됨)의 형태에 결합될 것이다.
또한, 일반적으로, RANK-L에 대한 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드는 상응하는 단량체성 아미노산 서열 및/또는 나노바디에 비하여 더 높은 결합력(avidity)을 갖고 결합될 수 있다.
예를 들면, 제한없이, RANK-L의 상이한 에피토프에 대한 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 함유하는 다가(본원에 정의된 바와 같음) 단백질 또는 폴리펩티드는 상응하는 단량체에 비하여 더 높은 결합력을 갖고 RANK-L에 결합될 수 있다.
보다 중요하게는, RANK-L에 대한 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 함유하는 다가(본원에 정의된 바와 같음) 단백질 또는 폴리펩티드는 RANK-L의 단량체에 비하여 RANK-L의 다량체에 보다 높은 결합력을 갖고 결합될 수 있고(대체적으로 그러할 것임), 또한 대체적으로 상응하는 단량체성 아미노산 서열 및/또는 나노바디에 비하여 더 높은 결합력을 갖고 결합될 것이다. 이러한 다가 단백질 또는 폴리펩티드에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는, 예를 들면 동일한 에피토프, 실질적으로 동등한 에피토프 또는 상이한 에피토프로 유도될 수 있다. 이러한 다가 단백질 또는 폴리펩티드의 한 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 동일할 수 있다(따라서 동일한 에피토프로 유도됨).
후자는 특히 중요한데, RANK-L에 의한 신호 형질도입의 주요 방식이 RANK-L 분자(이는 수용체 결합 부위를 함유함)의 삼량체로의 RANK 수용체의 결합에 관여되는 것으로 공지되어 있기 때문이다(예를 들면 문헌[Lam et al. 2001, J. Clin. Invest. 108: 971-979]을 참조함).
본 발명에서는, 아미노산 서열 및/또는 나노바디가, 시험관내 모델 및 세포 모델 둘다에서 RANK-L의 활성이 감소하는 방식으로 RANK-L에 결합될 수 있음이 밝혀졌다(아래의 실험 부분을 참조함). 본 발명이 임의의 특정한 기작, 설명 또는 가설에 제한되지 않지만, 이들의 작은 크기 및 RANK-L에 대한 높은 친화력으로 인하여, 본 발명의 2개 또는 3개의 1가 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 RANK-L 삼량체 상의 2개 또는 3개의 수용체 결합 부위를 동시에 차지할 수 있고, 이에 따라 삼량체가 수용체 결합을 개시하는 것을 방지함으로써 신호 형질도입 개시를 방지하는 것으로 추정된다(그러나, 작용의 다른 기작들이 제외되지는 않음: 예를 들면, 이것이 유도되는 에피토프에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 또한 RANK-L의 삼량체 상태로의 회합을 저해할 수 있음).
또한 단일 RANK-L 삼량체 상의 2개 이상의 수용체 결합 부위에 결합하는 것에 더하여 또는 이의 대안으로서, RANK-L의 에피토프에 대한 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 2개의 별도의 RANK-L 분자(예를 들어 2개의 별도의 삼량체) 상의 에피토프에 결합될 수 있음(예를 들명 분자간 결합으로)을 주지해야 한다.
그러나, 특히 바람직한 실시양태에 따라서, 본 발명은 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체에 결합될 때 RANK-L 삼량체에 의해 중재되는 RANK 수용체 결합 및/또는 이러한 수용체 결합에 의해 중재되는 신호 형질도입을 저해하거나 감소시킬 수 있도록, RANK-L 삼량체의 수용체 결합 부위(들)에 놓이고/놓이거나 이의 일부를 형성하는 RANK-L(특별히 RANK-L 삼량체) 상의 에피토프로 각각 유도되는 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하거나 이로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.
특별히, 바람직한 실시양태에 따라서, 본 발명은 RANK-L 삼량체의 수용체 결합 부위(들)에 놓이고/놓이거나 이의 일부를 형성하는 RANK-L(특별히 RANK-L 삼량체) 상의 에피토프로 각각 유도되는 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 아미노산 서열 및/또는 나노바디는, 단백질 또는 폴리펩티드가 단일 RANK-L 삼량체 상의 2개 이상의 수용체 결합 부위에 동시에 결합할 수 있도록(달리 말하면, RANK-L 삼량체 상의 적어도 2개의 RANK-L 수용체 결합 부위에 분자내 결합할 수 있도록) 서로 연결된다. 상기 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같고, 가장 바람직하게는 나노바디이다(이를 위하여, 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다가 나노바디 구조물임). 또한, 이러한 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 동일하거나 상이할 수 있고; RANK 수용체 결합 부위(들)내의 상이한 에피토프로 유도될 수 있지만, 바람직하게는 동일한 에피토프로 유도된다. 본 발명의 상기 실시양태의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 구조물은 서열 번호 622∼693, 761∼762 및 766∼773이다.
본 발명의 상기 실시양태에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 대체적으로 하나 이상의 적합한 연결기를 통해 연결되는데, 이러한 연결기는 각각의 아미노산 서열 및/또는 나노바디가 동일한 RANK-L 삼량체 상의 상이한 수용체 결합 부위에 결합될 수 있도록 한다. 적합한 연결기는 무엇 보다도 아미노산 서열 및/또는 나노바디가 결합되어 지는 RANK-L 삼량체 상의 에피토프(사이의 거리)에 좌우될 것이고, 이는 선택가능하게는 일부 제한된 정도의 통상적 실험 이후에 본원의 개시내용에 기초하여 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 2개 이상의 아미노산 서열이 (단일)도메인 항체 또는 나노바디인 경우, 적합한 연결기는 본원에 기재된 연결기로부터 선택될 수 있지만, 연결기의 길이는 2개 이상의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디가 동일한 RANK-L 삼량체 상의 상이한 수용체 결합 부위에 각각 결합될 수 있도록 해야 한다.
또한, RANK-L의 수용체 결합 부위에 결합된 2개 이상의 아미노산 서열이 (단일)도메인 항체 또는 나노바디인 경우, 이들은 또한 제3의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디를 경유하여 서로 연결될 수도 있다(여기서, 2개 이상의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디는 제3의 (단일)도메인 항체/나노바디에 직접적으로 또는 적합한 연결기를 통해 연결될 수 있음). 이러한 제3의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디는, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 예를 들면 증가된 반감기를 제공하는 (단일)도메인 항체 또는 나노바디일 수 있다. 예를 들면, 후자의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디는, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, (인간)혈청 단백질, 예컨대 (인간)혈청 알부민에 결합될 수 있는 (단일)도메인 항체 또는 나노바디일 수 있다. 이러한 구조물의 몇몇 비-제한적 예는 서열 번호 694∼729 및 759∼760의 구조물이다. 이러한 제3의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디는, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 예를 들면 RANK-L 상의 또다른 에피토프로 유도되고/되거나 이에 결합되어서 비파라토프성 (단일)도메인 항체 또는 나노바디를 제공할 수 있는 (단일)도메인 항체 또는 나노바디일 수 있다.
다르게는, RANK-L의 수용체 결합 부위(들)에 결합된 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 연속적으로(직접적으로 또는 적합한 연결기를 통해) 연결되고, 제3의 (단일)도메인 항체 또는 나노바디(이는, 상기 기재된 바와 같이, 증가된 반감기를 제공하거나, RANK-L 상의 또다른 에피토프에 결합될 수 있음)는 2개 이상의 전술된 아미노산 서열 및/또는 나노바디중 하나에 직접적으로 또는 연결기를 통해 연결될 수 있다.
보다 일반적으로, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디 사이의 거리는 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체로의 분자내 결합(즉, 분자간 결합대신)을 허용해야 한다. 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 거리는 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 결정학 또는 분자 모델링(molecular modelling)(예를 들면 문헌[Lam et al. 2001, J. Clin. Invest. 108: 971-979]에 기재된 바와 같음)에 의해 결정될 수 있다. 이들 기법은 일반적으로 또한 특이적 다가 또는 다중특이적 단백질 또는 폴리펩티드가 분자내 모델링을 제공할 수 있는지의 여부를 결정할 수 있도록 한다. 다르게는, 크기-배제 크로마토그래피(문헌[Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129]에 기재된 바와 같음)는 본 발명의 소정의 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체로의 분자내 결합을 제공하는지(우세하게) 2개 이상의 RANK-L 삼량체 사이의 분자내 결합을 제공하는지(우세하게)를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 특별한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는, 상기 실험에서, 우세하게 또는 본질적으로 독점적으로 분자내 결합을 유도하는 것이 바람직하다. 그러나, 앞서 강조된 바와 같이, 별도의 RANK-L 분자(예를 들어 삼량체)의 분자간 결합을 경유하여 작동되는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드 또한 본 발명의 범주내에 속함을 주지해야 한다.
따라서, 또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 RANK-L(특별히 RANK-L 삼량체)에 대한 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하고, 이때 이러한 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디가, 적어도 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 거리가 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 수행할 수 있도록 연결되는, 다가 또는 다중특이적 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다.
이러한 바람직한 단백질 또는 폴리펩티드에서, 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는, 적어도 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 바람직한 거리가 달성되고/되거나 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 수행할 수 있는 한, 임의의 적합한 양식으로 연결될 수 있다.
예를 들면, 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는, 이의 가장 단순한 형태에서, 적어도 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 바람직한 거리를 제공하고 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 수행할 수 있도록 허용하는 적합한 연결기 또는 이격자(spacer)를 경유하여 직접적으로 연결된다. 적합한 연결기는 본원에 기재되어 있고, -예를 들면 제한없이-아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이러한 아미노산 서열은 바람직하게는 1∼50개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 5∼30개의 아미노산, 예컨대 약 9∼20개의 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 이러한 아미노산 서열은 또한 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 수행할 수 있도록 허용해야 한다.
따라서, 또다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 거리가, 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 수행할 수 있도록 하는, 적합한 연결기 또는 이격자를 사용하여 아미노산 서열 및/또는 나노바디가 바람직하게는 직접적으로 서로 연결되는, RANK-L(특별히 RANK-L 삼량체)에 대한 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하는 다가 또는 다중특이적 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 바람직하게는, 상기 바람직한 양태에서, 연결기 또는 이격자는 바람직하게는 1∼50개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 5∼30개의 아미노산, 예컨대 약 9∼20개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다. 바람직하지만 비제한적인 한 실시양태에서, 연결기는 글리신 및 세린 잔기로 본질적으로 구성된다(아래에 추가로 기재된 바와 같음). 예를 들면, 적합한 연결기는 9개의 아미노산 잔기를 포함하는 본원에 기재된 GS9 연결기, 15개의 아미노산 잔기를 포함하는 본원에 기재된 GS15 연결기, 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 본원에 기재된 GS20 연결기, 및 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 본원에 기재된 GS30 연결기이다.
또다른 실시양태에서, RANK-L에 대한 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는 또다른 부분구조(선택가능하게는 1개 또는 2개의 연결기), 예컨대 또다른 단백질 또는 폴리펩티드를 경유하여 서로 연결된다. 이러한 실시양태에서, 예를 들면 단백질 또는 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체와 분자내 결합(본원에 기재된 바와 같음)을 형성할 수 있도록, 적어도 2개의 항-RANK-L 아미노산 서열 및/또는 나노바디의 N-말단 및 C-말단 사이의 바람직한 거리(즉, 상기 언급된 바와 같음)를 갖는 것이 요망될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산 서열 및/또는 나노바디는, 바람직한 거리 및/또는 원하는 분자내 결합이 달성될 수 있는 한, 나머지 부분구조에 직접적으로 또는 적합한 연결기나 이격자를 사용하여 연결될 수 있다. 부분구조는 단백질 또는 폴리펩티드의 RANK-L로의 결합으로부터 및/또는 단백질 또는 폴리펩티드의 추가의 원하는 생물학적 또는 약리학적 특성으로부터 (너무 많이) 훼손시키지 않는 임의의 적합한 부분구조일 수 있다. 그것으로서, 부분구조는 본질적으로 비활성이거나 생물학적으로 활성일 수 있고, 그것으로서 단백질 또는 폴리펩티드의 원하는 특성을 개선시키거나 개선시키지 않을 수 있고/있거나 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 추가의 원하는 특성을 부여할 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 부분구조는 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 개선시키고/시키거나, 그의 면역원성을 감소시키거나 임의의 다른 원하는 특성을 개선시킬 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 부분구조는 또다른 아미노산 서열 및/또는 나노바디(제한되지 않지만 RANK-L에 대한 제3의 아미노산 서열 및/또는 나노바디가 포함되나, 이는 필수적이지 않고 대체적으로 덜 바람직함), 특별히 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 개선시키는 또다른 아미노산 서열 및/또는 나노바디, 예컨대 혈청 단백질, 예를 들면 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열 및/또는 나노바디이다. 이러한 단백질 및 폴리펩티드의 예는 본원에 기재되어 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 수용체 결합 부위에 위치하고/하거나 이의 일부를 형성하고, 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체에 결합될 때 RANK 수용체 결합 및 또는 RANK-L에 의해 중재된 신호 형질도입을 저해하거나 감소시킬 수 있도록, 증가된 반감기를 제공하는 적어도 하나의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 경유하여 서로 연결되는(선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기를 통해), RANK-L(예를 들어 RANK-L 삼량체) 상의 에피토프로 각각 유도되는 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디를 포함하는 다가 다중특이적 구조물에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 상기 먼저 언급된 2개 이상의 아미노산 서열 및/또는 나노바디가 각각 RANK-L 삼량체 상의 상이한 수용체 결합 부위에 결합할 수 있도록 한다.
특별히, 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 수용체 결합 부위에 위치하고/하거나 이의 일부를 형성하는 RANK-L(예를 들어 RANK-L 삼량체) 상의 에피토프로 각각 유도되는 2개의 나노바디를 포함하는, 3가 이특이적 나노바디를 포함할 수 있고, 여기서 상기 나노바디는 증가된 반감기를 제공하는 제3의 나노바디(예를 들어 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디)를 경유하여 서로 연결되고, 먼저언급된 2개의 나노바디는, 상기 폴리펩티드가 RANK-L 삼량체에 결합될 때 RANK 수용체 결합 및 또는 RANK-L에 의해 중재된 신호 형질도입을 저해하거나 감소시킬 수 있도록 각각 상기 제3의 나노바디에 직접적으로 또는 하나 이상의 적합한 연결기를 통해 연결된다. 이러한 폴리펩티드는 상기 먼저언급된 2개의 나노바디가 RANK-L 삼량체 상의 상이한 수용체 결합 부위에 각각 결합될 수 있도록 한다. 다시, 본 발명의 이러한 실시양태에 사용하기에 특별히 바람직한 몇몇 나노바디는 서열 번호 560∼621, 뿐만 아니라 인간화된 이의 다른 변형체(예컨대, 예를 들어 서열 번호 730∼757 및 765); 및 본원에 기재된 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디에 존재한다. 본 발명의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 구조물은 서열 번호 694∼729 및 759∼760이다.
또한 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자 및/또는 유도체를 사용함, 및/또는 하나 이상의 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자 및/또는 유도체를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드를 사용함은, 이들이 본원에 구현된 용도에 적합한 한, 본 발명의 범주내에 속한다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자 및/또는 유도체는 대체적으로 RANK-L에 대한 결합을 위한 기능적 항원-결합 부위(의 적어도 일부)를 함유하고; 보다 바람직하게는 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 RANK-L에 본원에 정의된 바와 같은 친화도(추가로 본원에 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)로 결합될 수 있다. 이러한 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자, 유도체, 단백질 및/또는 폴리펩티드의 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다. 본 발명의 추가의 단편 또는 폴리펩티드는 또한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 (보다 작은) 부분 또는 단편을 적합하게 조합함(즉, 연결시키거나 유전자 융합에 의해)으로써 제공될 수도 있다.
추가로 본원에 기재될 본 발명의 구체적이지만 비제한적인 하나의 양태에서, 이러한 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자 및 유도체는 이들이 유도되어진 아미노산 서열에 비하여 혈청(본원에 추가로 기재된 바와 같음)에서 증가된 반감기를 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열은 반감기를 연장시키는 하나 이상의 기 또는 부분구조(예컨대 PEG)에 연결되어(화학적으로 또는 다르게), 본 발명의 아미노산 서열의 유도체에 증가된 반감기를 제공한다.
구체적이지만 비제한적인 하나의 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 면역글로불린 접힘부(fold)를 포함하는 아미노산 서열이거나, 적합한 조건(예컨대 생리학적 조건)하에 면역글로불린 접힘부를 형성할 수 있는(즉, 접음으로써) 아미노산 서열일 수 있다. 무엇보다도 문헌[Halaby et al., J. (1999) Protein Eng. 12, 563-71]을 참조한다. 바람직하게는, 면역글로불린 접힘부를 형성하도록 적절히 접힐 경우, 이러한 아미노산 서열은 RANK-L에 특이적으로 결합가능하고(본원에 정의된 바와 같음); 보다 바람직하게는 RANK-L에 본원에 정의된 바와 같은 친화도(추가로 본원에 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)로 결합될 수 있다. 또한 이러한 아미노산 서열의 부분, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자 및/또는 유도체는, 바람직하게는 이들이 면역글로불린 접힘부를 포함하거나 적합한 조건하에 면역글로불린 접힘부를 형성할 수 있도록 한다.
특별히, 그러나 제한없이, 본 발명의 아미노산 서열은 4개의 기본골격 영역(각각 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성된 아미노산 서열; 또는 이러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편(이는, 추가로 본원에 기재된 바와 같이, 대체적으로 CDR들중 적어도 1개를 형성하는 아미노산 잔기의 적어도 일부를 함유할 것임)일 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열은 특별히 면역글로불린 서열 또는 이의 적합한 단편, 보다 특별히 면역글로불린 가변성(variable) 도메인 서열 또는 이의 적합한 단편, 예컨대 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VH-서열) 또는 이의 적합한 단편이다. 본 발명의 아미노산 서열이 중쇄 가변 도메인 서열인 경우, 이는 종래의 4-쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열(예컨대, 제한없이, 인간 항체로부터 유도된 VH 서열), 또는 소위 "중쇄 항체"(본원에 정의된 바와 같음)로부터 유도된 소위 VHH-서열(본원에 정의된 바와 같음)이다.
그러나, 본 발명의 아미노산 서열(또는 이를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 뉴클레오티드 서열)의 기원에 대하여 제한되지 않을 뿐만 아니라, 본 발명의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 발생되거나 수득되는(발생되거나 수득되어 온) 방식에 대하여도 제한되지 않음을 주지해야 한다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열은 자연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종으로부터)이거나 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명의 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 아미노산 서열은 자연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종으로부터)이거나 합성 또는 반합성 면역글로불린 서열일 수 있고, 제한되지 않지만 "인간화된"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(예컨대 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특별히 부분적으로 또는 전체적으로 인간화된 VHH 서열 또는 나노바디), "카멜화된(camelized)"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열, 뿐만 아니라 친화도 증진(affinity maturation)(예를 들면, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발함), CDR 그라프팅(grafting), 베너링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터의 단편들의 조합, 중첩 프라이머(primer)를 사용한 PCR 조립, 및 숙련가에게 공지된 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사 기법; 또는 임의의 전술된 기법의 임의의 적합한 조합 등의 기법에 의해 수득된 면역글로불린이 포함된다. 예를 들면 표준 편람(standard handbook), 뿐만 아니라 추가의 기재내용 및 본원에 언급된 선행 기술을 참조한다.
유사하게, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들면 적합한 자연 발생 주형(template)(예를 들어 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(library)(특별히, 발현 라이브러리)로부터 단리되어진 뉴클레오티드 서열, 자연 발생 뉴클레오티드 서열내로 돌연변이를 도입하여(자체 공지된 적합한 기법, 예컨대 미스매치(mismatch) PCR을 사용함) 제조된 뉴클레오티드 서열, 중첩 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열, 또는 자체 공지된 DNA 합성을 위한 기법을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 아미노산 서열은 특별히 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 나노바디(본원에 정의된 바와 같고, 제한되지 않지만 VHH 서열이 포함됨); 기타 단일 가변 도메인, 또는 이의 임의의 적합한 단편이다. (단일)도메인 항체에 대한 일반적 설명을 위해, 또한 상기 인용된 선행 기술, 뿐만 아니라 EP 제0 368 684호를 참조한다. "dAb's"라는 용어를 위해, 예를 들면 문헌[Ward et al., Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6], [Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490]; 뿐만 아니라 예를 들면 WO 제06/030220호, WO 제06/003388호 및 도만티스 리미티드(Domantis Ltd.)의 다른 공개된 특허 출원들을 참조한다. 또한, 본 발명에 있어서 포유동물 기원이 아니기 때문에 덜 바람직할 지라도, 단일 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인은 특정 종의 상어로부터 유도될 수 있음을 주지해야 한다(예를 들면, 소위 "IgNAR 도메인", 예를 들면 WO 제05/18629호 참조).
특별히, 본 발명의 아미노산 서열은 나노바디(Nanobody)(등록상표)(본원에 정의된 바와 같음) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.[주: 나노바디(등록상표), 나노바디즈(Nanobodies)(등록상표) 및 나노클론(Nanoclone)(등록상표)은 아블인스 엔.브이.(Ablynx N.V.)의 등록된 상표명이다]. RANK-L에 대한 이러한 나노바디는 또한 "본 발명의 나노바디"로서 본원에 지칭될 것이다.
나노바디에 대한 일반적인 설명을 위해, 아래의 추가의 기재내용, 뿐만 아니라 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다. 그러나, 이와 관련하여, 본 기재내용과 선행 기술은 주로 소위 "VH3 부류"의 나노바디(즉, VH3 부류의 인간 생식계열 서열에 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 나노바디, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29)에 대해 주로 설명하였음을 주지해야 하고, 이 나노바디는 본 발명의 바람직한 양태를 형성한다. 그러나, 본 발명은 그의 광범위한 의미내에서 일반적으로 RANK-L에 대한 임의의 유형의 나노바디를 포함하고, 또한 예를 들면 제WO 07/118670호에 기재된 바와 같이, 예를 들면 소위 "VH4 부류"에 속하는 나노바디(즉, VH4 부류의 인간 생식계열 서열에 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 나노바디, 예컨대 DP-78)를 포함함을 주지해야 한다.
일반적으로, 나노바디(특별히 VHH 서열 및 부분적으로 인간화된 나노바디)는 특별히 하나 이상의 골격구조 서열(다시 본원에 추가로 기재된 바와 같음)에 하나 이상의 "인증 잔기(Hallmark residue)"(본원에 기재된 바와 같음)가 존재함을 특징으로 한다.
따라서, 일반적으로, 나노바디는 하기 (일반) 구조식의 아미노산 서열로서 정의될 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 하나 이상의 인증 잔기는 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
특별히, 나노바디는 하기 (일반) 구조식의 아미노산 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 하나 이상의 골격구조 서열은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
보다 특별히, 나노바디는 (일반) 구조식의 아미노산 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서,
FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고,
i) 바람직하게는 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 따른 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 하기 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되고;
ii) 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고, 여기서 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해 CDR 서열을 형성하는 아미노산 서열(서열 번호 1∼22의 서열에서 X로 지시됨)은 무시된다.
이들 나노바디에서, CDR 서열은 일반적으로 본원에 추가로 기재된 바와 같다.
따라서, 본 발명은 또한 RANK-L에 결합될 수 있고/있거나(본원에 정의된 바와 같음)이로 유도되는 이러한 나노바디, 이의 적합한 단편, 뿐만 아니라 하나 이상의 이러한 나노바디 및/또는 적합한 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 폴리펩티드에 관한 것이다.
서열 번호 560∼621은 RANK-L에 대하여 야기된 다수의 VHH 서열의 아미노산 서열을 제공한다.
특별히, 몇몇 특정 양태의 본 발명은:
-RANK-L로 유도되고(본원에 정의된 바와 같음), 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 예컨대 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열[이들 아미노산 서열은 추가로 이들이 RANK 또는 OPG의 RANK-L로의 결합을 무효화시키고/시키거나; RANK-L에 결합하기 위해 RANK 또는 OPG와 경쟁하고/하거나; RANK-L 상의 상호작용 부위(본원에 정의된 바와 같음)(예컨대 RANK 또는 OPG 결합 부위)로 유도되도록 할 수 있음];
-서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열이 RANK-L에 결합하는 것을 교차-차단(본원에 정의된 바와 같음)하고/하거나, RANK-L로의 결합을 위해 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 경쟁하는 아미노산 서열[다시, 이들 아미노산 서열은 추가로 이들이 동계(cognate) 리간드의 RANK-L로의 결합을 무효화시키고/시키거나; RANK-L에 결합하기 위해 동계 리간드와 경쟁하고/하거나; RANK-L 상의 상호작용 부위(본원에 정의된 바와 같음)(예컨대 RANK 또는 OPG 결합 부위)로 유도되도록 할 수 있음; 이러한 아미노산 서열은 추가로 본원에 기재된 바와 같음(예를 들면 나노바디일 수 있음)]; 뿐만 아니라 하나 이상의 이러한 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 및 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드(이는 본원에 추가로 기재된 바와 같고, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 이특이적 및/또는 비파라토프성 폴리펩티드임)를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 임의의 자연 발생 리간드를 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명의 특별히 바람직한 몇몇 나노바디는, RANK-L에 결합할 수 있고/있거나(추가로 본원에 정의된 바와 같음) 이로 유도되는 나노바디로서 이는:
i) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고, 여기서 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해 CDR 서열을 형성하는 아미노산 서열은 무시된다. 이와 관련하여, 서열 번호 560∼621의 나노바디의 골격구조 1 서열(서열 번호 126∼187), 골격구조 2 서열(서열 번호 250∼311), 골격구조 3 서열(서열 번호 374∼435) 및 골격구조 4 서열(서열 번호 498∼559)을 열거하는 표 A-1을 참조한다(골격구조 1 서열의 1∼4 및 27∼30 위치에 있는 아미노산 잔기에 대하여, 아래의 해설을 또한 참조함. 따라서, 아미노산 동일성을 결정하기 위해, 이들 잔기는 무시되는 것이 바람직함):
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 하기 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택된다.
이들 나노바디에서, CDR 서열은 일반적으로 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
다시, 이러한 나노바디는 임의의 적합한 방식으로 임의의 적합한 공급원으로부터 유도되고, 예를 들면 자연 발생 VHH 서열(즉, 카멜리드(Camelid)의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열일 수 있고, 제한되지 않지만 "인간화된"(본원에 정의된 바와 같음) 나노바디, "카멜화된"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(특별히, 카멜화된 중쇄 가변 도메인 서열), 뿐만 아니라 친화도 증진(예를 들면, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발함), CDR 그라프팅, 베너링, 상이한 면역글로불린 서열로부터의 단편들의 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 숙련가에게 공지된 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사 기법; 또는 임의의 전술된 기법의 임의의 적합한 조합 등의 기법에 의해 수득된 나노바디일 수 있다. 또한, 나노바디가 VHH 서열을 포함하는 경우, 상기 나노바디는 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화되어 본 발명의 하나 이상의 추가로 인간화된(부분적으로 또는 전체적으로) 나노바디를 제공한다. 유사하게, 나노바디가 합성 또는 반합성 서열(예컨대 부분적으로 인간화된 서열)을 포함하는 경우, 상기 나노바디는 선택가능하게는, 다시 본원에 기재된 바와 같이, 추가로 적합하게 인간화되어 본 발명의 하나 이상의 추가로 인간화된(부분적으로 또는 전체적으로) 나노바디를 제공한다.
특별히, 인간화된 나노바디는, 이전 문단들에서 나노바디에 대해 일반적으로 정의된 바와 같은 아미노산 서열일 수 있지만, 여기서 인간화 치환(본원에 정의된 바와 같음)이거나 이에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재한다(특별히, 적어도 하나의 골격구조 잔기에). 바람직하지만 비제한적인 몇몇 인간화 치환(및 이의 적합한 조합)은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다. 또한, 또는 다르게는, 다른 잠재적으로 유용한 인간화 치환이, 자연 발생 VHH 서열의 골격구조 영역의 서열을 하나이상의 매우 관련된 인간 VH 서열의 상응하는 골격구조 서열과 비교함으로써 확인되고, 이후 이렇게 결정된 하나 이상의 잠재적으로 유용한 인간화 치환(또는 이의 조합)은 상기 VHH 서열내로 도입되고(본원에 추가로 정의된 바와 같이, 자체 공지된 임의의 방식으로), 생성된 인간화된 VHH 서열은 표적에 대한 친화도, 안정성, 발현의 용이성 및 수준, 및/또는 다른 원하는 특성에 대하여 시험될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오법(trial and error)에 의해, 다른 적합한 인간화 치환(또는 이의 적합한 조합)은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 또한, 전술된 사항에 기초하여, 나노바디(의 골격구조 영역)는 부분적으로 인간화되거나 전체적으로 인간화될 수 있다.
본 발명의 특별히 바람직한 몇몇 인간화된 나노바디는 서열 번호 560∼621의 나노바디의 인간화된 변형체이고, 이의 서열 번호 730∼757 및 765의 아미노산 서열은 특히 바람직한 몇몇 예이다.
따라서, 본 발명의 몇몇 바람직한 다른 나노바디는 RANK-L에 결합될 수 있고(추가로 본원에 정의된 바와 같음):
i) 서열 번호 560∼621의 아미노산 서열중 하나의 인간화된 변형체이고/이거나;
ii) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 730∼757 및 765의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디이고, 여기서 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고, 여기서
i) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 위치에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 하기 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 특정 양태에 따라서, 본 발명은 RANK-L에 결합하기에 특별히 적합한 아미노산 잔기의 다수의 연장부(즉, 작은 펩티드)를 제공한다. 아미노산 잔기의 이들 연장부는 본 발명의 아미노산 서열내에 존재하고/하거나, 특별히 이들이 본 발명의 아미노산 서열의 항원 결합 부위(의 일부)를 형성하도록 이에 혼입된다. 아미노산 잔기의 이들 연장부가 RANK-L에 대하여 야기된 VHH 서열 또는 중쇄 항체의 CDR 서열로서 최초로 발생되었기 때문에(또는, 본원에 추가로 기재된 바와 같이 이러한 CDR 서열에 근거하고/하거나 이로부터 유도될 수 있기 때문에), 이들은 또한 일반적으로 본원에 "CDR 서열"(즉, 개별적으로 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열)로서 지칭될 수 있다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 아미노산 잔기의 이들 연장부가 본 발명의 아미노산 서열을 RANK-L에 결합하는 것을 허용하는 한, 아미노산 잔기의 이들 연장부가 본 발명의 아미노산 서열에서 가질 수 있는 특이적인 구조적 역할 또는 기능에 제한되지 않음을 주지해야 한다. 따라서, 일반적으로, 본 발명은 그의 가장 넓은 의미에서 RANK-L에 결합가능하고 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열, 특별히, 전체 아미노산 서열이 RANK-L에 결합가능한 결합 도메인 및/또는 결합 단위를 형성하도록 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 경유하여 서로 적합하게 연결된 2개 이상의 이러한 CDR 서열의 적합한 조합을 포함한다. 그러나 또한 본 발명의 아미노산 서열에 이러한 CDR 서열이 단지 하나만 존재한다는 것은 RANK-L에 결합가능한 본 발명의 아미노산 서열을 제공하기에 그 자체로 이미 충분하다는 것을 주지해야 하고; 다시 예를 들면 WO 제03/050531호에 기재된 소위 "엑스퍼다이트 단편(Expedite fragment)"를 참조한다.
따라서, 구체적이지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 본원에 기재된 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열(또는 이의 임의의 적합한 조합)을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 특별히, 본 발명의 아미노산 서열은 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 이러한 항원 결합 부위가 본원에 기재된 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열(또는 이의 임의의 적합한 조합)을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 이러한 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열은 아미노산 잔기의 적어도 하나의 연장부를 포함하고, 여기서 아미노산 잔기의 상기 연장부가 본원에 기재된 적어도 하나의 CDR 서열의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 잔기일 수 있다. 이러한 아미노산 서열은 면역글로불린 접힘부를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 이러한 아미노산 서열은 적어도 하나의 이러한 CDR 서열을 포함하지만 (완전한)면역글로불린 접힘부를 형성할 만큼 충분히 크지 않은 면역글로불린 서열의 적합한 단편일 수 있다(예를 들면 다시 WO 제03/050531호에 기재된 "엑스퍼다이트 단편"을 참조함). 다르게는, 이러한 아미노산 서열은 이러한 CDR 서열에 상응하는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 연장부(즉, 이의 항원 결합 부위의 일부로서)를 포함하는 적합한 "단백질 골격(protein scaffold)"일 수 있다. 아미노산 서열을 제시하기에 적합한 골격은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 제한없이, 면역글로불린에 기초하거나 이로부터 유도된 결합 골격(즉, 본원에 이미 기재된 면역글로불린 서열과 다름), 단백질 A 도메인으로부터 유도된 단백질 골격(예컨대 아피바디즈(Affibodies)(등록상표)), 텐다미스타트(tendamistat), 피브로넥틴(fibronectin), 리포칼린(lipocalin), CTLA-4, T-세포 수용체, 고안된 안키린(ankyrin) 반복부, 아비머(avimer) 및 PDZ 도메인(Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), 및 DNA 또는 RNA에 기초한 결합 잔기, 제한되지 않지만 DNA 또는 RNA 압타머(aptamer)(Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32)가 포함된다.
다시, 하나 이상의 이들 CDR 서열을 포함하는 본 발명의 임의의 아미노산 서열은 RANK-L에 특이적으로 결합(본원에 정의된 바와 같음)하고, 보다 특별히 본원에 정의된 친화도(본원에 추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표시됨)로 RANK-L에 결합하는 것이 바람직하다.
보다 특별히, 본 발명의 이러한 양태에 따른 아미노산 서열은 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 부위가 (i) 제1 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR1 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR2 서열 또는 본원에 기재된 CDR3 서열로부터 선택되거나; (ii) 제1 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR2 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR1 서열 또는 본원에 기재된 CDR3 서열로부터 선택되거나; (iii) 제1 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR3 서열로부터 선택될 경우, 제2 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR1 서열 또는 본원에 기재된 CDR3 서열로부터 선택되도록, 본원에 기재된 CDR1 서열, 본원에 기재된 CDR2 서열 및 본원에 기재된 CDR3 서열로 구성된 군에서 선택된 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다.
보다 더 특별히, 본 발명의 아미노산 서열은 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 항원 결합 부위가, 제1 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR1 서열로부터 선택되고, 제2 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR2 서열로부터 선택되고, 제3 아미노산 서열이 본원에 기재된 CDR3 서열로부터 선택되도록 본원에 기재된 CDR1 서열, 본원에 기재된 CDR2 서열 및 본원에 기재된 CDR3 서열로 구성된 군에서 선택된 적어도 3개의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 바람직한 조합은 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이러한 아미노산 서열은 바람직하게는 면역글로불린 서열(본원에 추가로 기재된 바와 같음)이지만, 또한 예를 들면 상기 CDR 서열을 제시하기에 적합한 골격을 포함하는 임의의 다른 아미노산 서열일 수 있다.
따라서, 구체적이지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명은 다음의 a)∼i) 및 이의 임의의 적합한 조합으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기의 하나 이상의 연장부를 포함하는, RANK-L에 대한 아미노산 서열에 관한 것이다:
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열; 또는 임의의 이의 적합한 조합.
본 발명의 아미노산 서열이 b) 및/또는 c)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 경우:
i) b) 및/또는 c)에 따른 이러한 아미노산 서열중의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, a)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 보존적(conservative) 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) b) 및/또는 c)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는, a)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 아미노산 결실(deletion) 또는 삽입(insertion) 없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) b) 및/또는 c)에 따른 아미노산 서열은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하는 친화도 증진에 의해 a)에 따른 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열일 수 있다.
유사하게, 본 발명의 아미노산 서열이 e) 및/또는 f)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 경우:
i) e) 및/또는 f)에 따른 이러한 아미노산 서열중의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, d)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) e) 및/또는 f)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는, d)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 아미노산 결실 또는 삽입 없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) e) 및/또는 f)에 따른 아미노산 서열은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하는 친화도 증진에 의해 d)에 따른 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 유사하게, 본 발명의 아미노산 서열이 h) 및/또는 i)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 함유할 경우:
i) h) 및/또는 i)에 따른 이러한 아미노산 서열중의 임의의 아미노산 치환은 바람직하게는, g)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) h) 및/또는 i)에 따른 아미노산 서열은 바람직하게는, g)에 따른 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 아미노산 결실 또는 삽입 없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) h) 및/또는 i)에 따른 아미노산 서열은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하는 친화도 증진에 의해 g)에 따른 아미노산 서열로부터 유도된 아미노산 서열일 수 있다.
선행된 최종 문단들이 개별적으로 b), c), e), f), h) 또는 i)에 따른 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 본 발명의 아미노산 서열에 일반적으로 적용됨을 이해해야 한다.
이러한 구체적인 양태에서, 아미노산 서열은 바람직하게는
i) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
ii) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열; 및
iii) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열; 또는 이의 임의의 적합한 조합으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기의 하나 이상의 연장부를 포함한다.
또한, 바람직하게는, 이러한 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기의 적어도 하나의 상기 연장부는 RANK-L에 대하여 결합하는 항원 결합 부위의 일부를 형성한다.
보다 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은
(i) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 a), b) 또는 c)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하거나; (ii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 d), e) 또는 f)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 a), b), c), g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하거나; 또는 (iii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 a), b), c), d), e) 또는 f)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하도록,
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연장부를 포함하는, RANK-L에 대한 아미노산 서열에 관한 것이다.
이러한 구체적인 양태에서, 아미노산 서열은 바람직하게는,
(i) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 서열 번호 188∼249의 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 서열 번호 312∼373 및 758 또는 서열 번호 436∼497의 하나의 아미노산 서열에 상응하거나; (ii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 서열 번호 312∼373 및 758의 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 서열 번호 188∼249 또는 서열 번호 436∼497의 하나의 아미노산 서열에 상응하거나; (iii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 서열 번호 436∼497의 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 서열 번호 188∼249 또는 서열 번호 312∼373 및 758의 하나의 아미노산 서열에 상응하도록,
i) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
ii) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열; 및
iii) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연장부를 포함한다.
또한, 이러한 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기의 적어도 2개의 연장부는 다시 바람직하게는 RANK-L에 대하여 결합하기 위한 항원 결합 부위의 일부를 형성한다.
보다 더 구체적이지만 비제한적인 양태에서, 본 발명은 아미노산 잔기의 3개 이상의 연장부를 포함하고, 여기서
아미노산 잔기의 제1 연장부가
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
아미노산 잔기의 제2 연장부가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
아미노산 잔기의 제3 연장부가
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는, RANK-L에 대한 아미노산 서열에 관한 것이다.
바람직하게는, 이러한 구체적인 양태에서, 아미노산 잔기의 제1 연장부는 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고; 아미노산 잔기의 제2 연장부는 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고; 아미노산 잔기의 제3 연장부는 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된다.
다시, 바람직하게는, 이러한 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기의 적어도 3개의 연장부는 RANK-L에 대한 결합을 위한 항원 결합 부위의 일부를 형성한다.
아미노산 서열의 이러한 연장부의 바람직한 조합은 본원의 추가의 개시내용으로부터 명백할 것이다.
바람직하게는, 이러한 아미노산 서열에서, CDR 서열은 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95%의 아미노산 동일성, 보다 더 본질적으로는 100%의 아미노산 동일성을 갖는다. 아미노산 동일성의 이러한 정도는 예를 들면 상기 아미노산 서열 및 서열 번호 560∼621의 하나 이상의 서열 사이의 아미노산 동일성의 정도를 결정함으로써(본원에 기재된 방식으로) 결정될 수 있는데, 여기서 골격구조 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 또한, 본 발명의 이러한 아미노산 서열은 본원에 추가로 기재된 바와 같을 수 있다.
또한, 이러한 아미노산 서열은 RANK-L에 특이적으로 결합되고(본원에 정의된 바와 같음); 보다 특별히 RANK-L에 본원에 정의된 바와 같은 친화도(추가로 본원에 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)로 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 아미노산 서열은 4개의 골격구조 영역(개별적으로, FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로, CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성될 경우, 본 발명의 아미노산 서열은:
-CDR1이
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR2가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR3이
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
특별히, 본 발명의 이러한 아미노산 서열은, CDR1이 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나; CDR2가 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나; CDR3이 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되도록 할 수 있다.
특별히, 본 발명의 아미노산 서열은 4개의 골격구조 영역(개별적으로, FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로, CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성될 경우, 본 발명의 아미노산 서열은:
-CDR1이
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR2가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR3이
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되거나, 이러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편인 것이 바람직하다.
특별히, 본 발명의 이러한 아미노산 서열은, CDR1이 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나; CDR2가 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나; CDR3이 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되도록 할 수 있다.
다시, CDR 서열의 바람직한 조합은 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
또한, 이러한 아미노산 서열은 RANK-L에 특이적으로 결합(본원에 정의된 바와 같음)될 수 있고, 보다 특별히 RANK-L에 본원에 정의된 바와 같은 친화도(추가로 본원에 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)를 갖고 결합될 수 있는 것이 바람직하다.
바람직하지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명은 4개의 골격구조 영역(개별적으로, FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로, CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열에 관한 것으로, 여기서 상기 아미노산의 CDR 서열은 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95%의 아미노산 동일성, 또는 보다 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성을 갖는다. 아미노산 동일성의 이러한 정도는 예를 들면 상기 아미노산 서열 및 서열 번호 560∼621의 하나 이상의 서열 사이의 아미노산 동일성의 정도를 결정함으로써(본원에 기재된 방식으로) 결정될 수 있는데, 여기서 골격구조 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 본 발명의 이러한 아미노산 서열은 본원에 추가로 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 이러한 아미노산 서열에서, 골격구조 서열은 임의의 적합한 골격구조 서열일 수 있고, 적합한 골격구조 서열의 예는 숙련가에게, 예를 들면 표준 편람, 및 본원에 언급된 추가의 개시내용 및 선행 기술에 기초하여 명백할 것이다.
골격구조 서열은 바람직하게는 면역글로불린 골격구조 서열 또는 면역글로불린 골격구조 서열로부터 유도되어진(예를 들면, 인간화 또는 카멜화에 의해) 골격구조 서열(의 적합한 조합)이다. 예를 들면, 골격구조 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어 VL-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어 VH-서열)으로부터 유도된 골격구조 서열일 수 있다. 특별히 바람직한 한 양태에서, 골격구조 서열은 VHH-서열로부터 유도되어진 골격구조 서열(여기서 상기 골격구조 서열은 선택가능하게는 부분적으로 또는 전체적으로 인간화됨)이거나 카멜화된 종래의 VH 서열(본원에 정의된 바와 같음)이다.
골격구조 서열은, 본 발명의 아미노산 서열이 도메인 항체(또는 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열); 단일 도메인 항체(또는 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열); "dAb"(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열); 또는 나노바디(등록상표)(제한되지 않지만 VHH 서열이 포함됨)인 것이 바람직하다. 다시, 적합한 골격구조 서열은 숙련가에게, 예를 들면 표준 편람, 및 본원에 언급된 추가의 개시내용 및 선행 기술에 기초하여 명백할 것이다.
특별히, 본 발명의 아미노산 서열에 제공된 골격구조 서열은, 본 발명의 아미노산 서열이 나노바디이도록, 하나 이상의 인증 잔기(본원에 정의된 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 골격구조 서열(의 적합한 조합)의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 개시내용으로부터 명백할 것이다.
다시, 본 발명의 아미노산에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 전술된 임의의 적합한 단편(또는 단편의 조합), 예컨대 하나 이상의 골격구조 서열에 의해 적절히 플랭크(flank)되고/되거나 이를 경유하여 연결되는 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는 단편을 사용하는 것이 가능하다(예를 들면, 이들 CDR과 동일한 순서로 골격구조 서열은 단편이 유도되어 지는 전체-크기의 면역글로불린 서열에서 초래될 수 있음). 이러한 단편은 또한 이들이 면역글로불린 접힘부를 포함하거나 이를 형성할 수 있거나, 다르게는 이들이 면역글로불린 접힘부를 포함하지 않거나 이를 형성할 수 없도록 할 수 있다.
한 구체적인 양태에서, 이러한 단편은, 골격구조 서열(의 일부)(특별히, 골격구조 서열(들)의 일부, 이는 단편이 유도되어지는 면역글로불린 서열에서 CDR 서열에 인접함. 예를 들면, CDR3 서열은 FR3 서열(의 일부) 뒤에 위치하고, FR4 서열(의 일부) 앞에 위치함)에 의해 각 측부 상에서 플랭크되는, 본원에 기재된 바와 같은 단일 CDR 서열(및 특별히 CDR3) 서열을 포함한다. 이러한 단편은 또한 이황화 가교, 특별히 개별적으로 CDR 서열 앞뒤에 위치한 2개의 골격구조 영역을 연결시키는 이황화 가교를 함유할 수 있다(이러한 이황화 가교를 형성하기 위해, 상기 골격구조 영역에 자연 발생된 시스테인 잔기가 사용될 수 있거나, 다르게는 시스테인 잔기가 상기 골격구조 영역내로 합성적으로 부가되거나 도입될 수 있음). 이러한 "엑스퍼다이트 단편"에 대한 추가의 설명을 위해, 다시 WO 제03/050531호, 뿐만 아니라 2006년 12월 5일자로 출원된 "혈청 단백질로 결합가능한 펩티드(Peptides capable of binding to serum proteins)"란 명칭의 미국 가특허 출원(Ablynx N.V.)(발명자: Revets, Hilde Adi Pierrette; Kolkman, Joost Alexander; 및 Hoogenboom, Hendricus Renerus Jacobus Mattheus)(또한 PCT/EP2007/063348호 참조)을 참조한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열(또는 이의 적합한 단편)을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게는 추가로 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위를 포함하는 화합물 또는 구조물, 특별히 단백질 또는 폴리펩티드(또한 본원에 개별적으로 "본 발명의 화합물" 또는 "본 발명의 폴리펩티드"로 지칭됨)에 관한 것이다. 본원의 추가의 개시내용으로부터 숙련가에게 명백하듯이, 이러한 추가의 기, 잔기, 부분구조, 결합 단위 또는 아미노산 서열은 본 발명의 아미노산 서열(및/또는 이것이 존재하는 화합물 또는 구조물)에 추가의 작용성을 제공하거나 제공하지 않고, 본 발명의 아미노산 서열의 특성을 개질시키거나 개질시키지 않을 수 있다.
예를 들면, 이러한 추가의 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는, 화합물 또는 구조물이 (융합)단백질 또는 (융합)폴리펩티드이도록 하는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열일 수 있다. 바람직하지만 비-제한적인 양태에서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는 면역글로불린 서열이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는 도메인 항체, 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택된다.
다르게는, 이러한 기, 잔기, 부분구조 및 결합 단위는, 예를 들면 그 자체로 생물학적 및/또는 약리학적 활성을 갖거나 갖지 않는 화학 기, 잔기, 부분구조일 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 이러한 기는 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열에 연결되어, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 "유도체"를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 유도체를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 추가로 선택가능하게는 하나 이상의 연결기를 통해 연결되는 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위를 포함하는 화합물 또는 구조물은 본 발명의 범주내에 속한다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는 아미노산 서열이다.
상기 기재된 화합물 또는 구조물에서, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열 및 하나 이상의 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는 서로에 직접적으로 또는 하나 이상의 적합한 연결기나 이격자를 통해 연결될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위는 아미노산 서열이고, 연결기 또한 아미노산 서열이어서, 생성된 화합물 또는 구조물은 융합(단백질) 또는 융합(폴리펩티드)이다.
본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열을 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위에, 선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기를 통해 적합하게 연결시켜 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 제공하는 적어도 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 적어도 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계, 상기 핵산을 적합한 방식으로 발현시키는 단계, 및 본 발명의 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 숙련가라면 잘 알고 있을 자체 공지된 방식으로, 예를 들면 본원에 추가로 기재된 방법 및 기법에 기초하여 수행될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열로부터 출발하여, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드를 고안/선택 및/또는 제조하는 공정은 또한 본원에 본 발명의 상기 아미노산 서열을 "포매팅(formatting)"하는 것으로 지칭되어 있고; 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드의 일부를 이루는 본 발명의 아미노산은 본 발명의 상기 화합물 또는 폴리펩티드로 "포매팅된다(formatted)" 또는 이의 "포맷(format)으로 있다"고 일컬어 진다. 본 발명의 아미노산 서열이 포매팅될 수 있는 방식의 예 및 이러한 포맷의 예는 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고; 이러한 포매팅된 아미노산 서열은 본 발명의 추가의 양태를 형성한다.
본 발명의 한 구체적인 양태에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 증가된 반감기를 가질 수 있다. 이러한 화합물 및 폴리펩티드의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 이의 반감기가 증가하도록 화학적으로 개질된(예를 들면, 페그화(pegylation)에 의해) 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드; 혈청 단백질(예컨대 혈청 알부민)에 결합하기 위한 적어도 하나의 추가의 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열; 또는 본 발명의 아미노산 서열의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 부분구조(및 특별히 적어도 하나의 아미노산 서열)에 연결된 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 반감기 증진 부분구조 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고; 예를 들면, 제한없이, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 하나 이상의 혈청 단백질 또는 이의 단편(예컨대 (인간)혈청 알부민 또는 적합한 이의 단편), 또는 혈청 단백질에 결합될 수 있는 하나 이상의 결합 단위에 적합하게 연결되는 폴리펩티드(예컨대, 예를 들면, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민), 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG, 또는 트랜스페린(transferrine)에 결합할 수 있는 도메인 항체, 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디; 추가의 기재내용 및 본원에 언급된 문헌을 참조함); 본 발명의 아미노산 서열이 Fc 부분(예컨대 인간 Fc) 또는 이의 적합한 부분 또는 단편에 연결된 폴리펩티드; 또는 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 혈청 단백질에 결합될 수 있는 하나 이상의 작은 단백질 또는 펩티드에 적합하게 연결된 폴리펩티드(예컨대, 제한없이, WO 제91/01743호, WO 제01/45746호, WO 제02/076489호 및 2006년 12월 5일자로 출원된 "혈청 단백질에 결합가능한 펩티드"란 명칭의 미국 가특허 출원(Ablynx N.V.)(또한 PCT/EP2007/063348호 참조)에 기재된 단백질 및 펩티드)가 포함된다.
일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 그 자체의 반감기에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 보다 더 크다. 예를 들면, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 그 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 더욱이 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 초과하여 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 한 양태에서, 이러한 본 발명의 화합물또는 폴리펩티드는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 그 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 더욱이 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 초과하여 증가된 혈청 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 이러한 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상의 인간에서의 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 5일 이상(예컨대, 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 반감기를 갖는다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 또는 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 적합한 단편)을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 이러한 핵산은 또한 본원에 "본 발명의 핵산"으로 지칭되고, 예를 들면 본원에 추가로 기재된 바와 같이 유전적 구조물의 형태일 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현(또는 적합한 환경하에 발현가능)하고/하거나; 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 또는 숙주 세포의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
추가로 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 적어도 하나의 본 발명의 본 발명의 폴리펩티드(또는 이의 적합한 단편) 및/또는 적어도 하나의 본 발명의 핵산, 및 선택가능하게는 자체 공지된 이러한 조성물의 하나 이상의 추가의 성분(즉, 조성물의 의도된 용도에 따라서)을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다. 이러한 생성물 또는 조성물은 예를 들면 약학적 조성물(본원에 기재된 바와 같음), 수의학적 조성물 또는 진단용 생성물 또는 조성물(또한 본원에 기재된 바와 같음)일 수 있다. 이러한 생성물 또는 조성물의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 또한 시험관내(예를 들어 시험관내 또는 세포 검정) 또는 생체내에서(예를 들어 단세포 또는 다세포 유기체에서, 특별히 포유동물에서, 보다 특별히 인간에서, 예컨대 골 질환 또는 장애의 위험이 있거나 이를 앓는 인간에서) RANK-L을 조정하는(조정하기 위한 방법 또는 조성물에서의) 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드, 또는 이를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드로 RANK-L을 조정하기에 적합한 방식 및 양으로 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드, 또는 이를 함유한 조성물과 RANK-L을 접촉시키는 단계를 적어도 포함하는, 시험관내(예를 들어 시험관내 또는 세포 검정) 또는 생체내에서(예를 들어 단세포 또는 다세포 유기체에서, 특별히 포유동물에서, 보다 특별히 인간에서, 예컨대 골 질환 또는 장애의 위험이 있거나 이를 앓는 인간에서) RANK-L을 조정하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 시험관내(예를 들어 시험관내 또는 세포 검정) 또는 생체내에서(예를 들어 단세포 또는 다세포 유기체에서, 특별히 포유동물에서, 보다 특별히 인간에서, 예컨대 골 질환 또는 장애의 위험이 있거나 이를 앓는 인간에서) RANK-L을 조정하기 위한 조성물(예컨대, 제한없이, 추가로 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 제제)의 제조에서의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, "조정함" 또는 "조정하는"이란 일반적으로 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 검정(예컨대 본원에 언급된 것들)을 사용하여 측정될 경우 RANK-L의 활성을 감소 또는 저해하거나, 다르게는 활성을 증가시킴을 의미한다. 특별히, "조정함" 또는 "조정하는"이란, 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 검정(예컨대 본원에 언급된 것들)을 사용하여 측정될 경우, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건하에 동일한 검정에서의 RANK-L의 활성에 비하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 RANK-L의 활성을 감소 또는 저해하거나, 다르게는 활성을 증가시킴을 의미한다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, "조정함"은 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건에 비하여, RANK-L의 그의 하나 이상의 표적에 대한 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성에 변화를 일으키고/일으키거나(증가 또는 감소일 수 있음) RANK-L이 존재하는 매질 또는 환경에서 하나 이상의 조건에 대한 RANK-L의 선택성(예컨대 pH, 이온 강도, 보조인자의 존재 등)에 변화를 일으킴(증가 또는 감소일 수 있음)을 포함한다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 다시 이는 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지된 임의의 적합한 검정, 예컨대 본원, 또는 본원에 인용된 선행 기술에 기재된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
"조정함"은 또한 RANK-L이 관여된(또는 그의 기질(들), 리간드(들) 또는 경로(들)이 관여된) 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기작, 효과, 반응, 기능, 경로 또는 활성(예컨대 그의 신호 경로 또는 대사 경로 및 그들의 연관된 생물학적 또는 생리학적 효과)에 대해 변화(즉, 개별적으로 작용물질 또는 길항물질로서의 활성)를 일으킴을 의미할 수 있다. 다시, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 작용물질 또는 길항물질로서의 이러한 작용은 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 및/또는 임의의 적합한 (시험관내 및 대체적으로 세포성 또는 생체내)검정, 예컨대 본원, 또는 본원에 인용된 선행 기술에 기재된 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특별히, 작용물질 또는 길항물질로서의 작용은 의도된 생물학적 또는 생리학적 활성이, 개별적으로, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건하에 동일한 검정에서의 생물학적 또는 생리학적 활성에 비하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 증가 또는 감소하도록 할 수 있다.
조정은 예를 들면 RANK-L의 그의 기질 또는 리간드로의 결합을 감소 또는 저해함, 및/또는 RANK-L로의 결합에 대한 천연 리간드 및 기질과 경쟁함을 포함한다. 조정은 또한 RANK-L 또는 이것이 관여된 기작이나 경로의 활성화를 포함한다. 조정은 가역적이거나 비가역적일 수 있지만, 약학적 및 약리학적 목적을 위해 대체적으로 가역적 방식일 것이다.
추가로 본 발명은 본원에 기재된 아미노산 서열, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물을 제조 또는 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
일반적으로, 이들 방법은:
a) 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열을 위해 아미노산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 단계; 및
c) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 임의의 적합한 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 면역글로불린 서열(본원에 기재된 바와 같음)의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리, 예컨대 면역글로불린 서열의 천연 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 면역글로불린 서열의 합성 또는 반합성 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 증진 처리된 면역글로불린 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 이러한 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 중쇄 가변 도메인(예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리이거나, 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 작용가능한 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
이러한 방법의 한 바람직한 양태에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는, 예를 들면, RANK-L로, 또는 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 포유동물로부터 유도된 면역글로불린 서열의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 스크리닝을 촉진시키기 위해 파지(phage), 파지미드(phagemid), 리보좀(ribosome) 또는 적합한 미생물(예컨대 효모) 상에 표시될 수 있다. 아미노산 서열(의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)을 표시하고 스크리닝하기 위해 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들면 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 문헌[Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
또다른 양태에서, 아미노산 서열을 생성하는 방법은 적어도:
a) 아미노산 서열을 발현하는 세포의 콜렉션 또는 샘플을 제공하는 단계 ;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 친화도를 갖는 아미노산 서열을 발현하는 세포를 위해 세포의 상기 콜렉션 또는 샘플을 스크리닝하는 단계; 및
c) (i) 상기 아미노산 서열을 단리하는 단계; 또는
(ii) 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 상기 세포로부터 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
예를 들면, 원하는 아미노산 서열이 면역글로불린 서열인 경우, 세포의 콜렉션 또는 샘플은, 예를 들면 B-세포의 콜렉션 또는 샘플일 수 있다. 또한, 이 방법에서, 세포의 샘플은 RANK-L로, 또는 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 포유동물로부터 유도될 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법은, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면 EP 제0 542 810호, WO 제05/19824호, WO 제04/051268호 및 WO 제04/106377호를 참조한다. 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유세포분석(flow cytometry) 기법, 예컨대 FACS를 사용하여 수행된다. 이를 위해, 예를 들면 문헌[Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820 (2001)]을 참조한다.
또다른 양태에서, RANK-L에 대한 아미노산 서열을 생성하는 방법은 적어도:
a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 위해 핵산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 단리하고, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
이러한 방법에서, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 예를 들면 면역글로불린 서열의 천연 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 면역글로불린 서열의 합성 또는 반합성 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 증진 처리된 면역글로불린 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
또한, 이러한 방법에서, 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 중쇄 가변 도메인(예컨대 VH 도메인 또는 VHH 도메인) 또는 경쇄 가변 도메인의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리, 또는 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체로서 작용가능한 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다.
이러한 방법의 한 바람직한 양태에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는, 예를 들면 RANK-L로, 또는 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 포유동물로부터 유도된 핵산 서열의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 예를 들면 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다. 한 구체적인 양태에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 VHH 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩할 수 있다.
상기 방법에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 스크리닝을 촉진시키기 위해 파지, 파지미드, 리보좀 또는 적합한 미생물(예컨대 효모) 상에 표시될 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)을 표시하고 스크리닝하기 위해 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들면 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 문헌[Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
또다른 양태에서, RANK-L에 대한 아미노산 서열을 생성하는 방법은 적어도:
a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열을 코딩하고, 본 발명의 나노바디, 예를 들어 서열 번호 560∼621, 또는 본 발명의 인간화된 나노바디, 예를 들어 서열 번호 730∼757 및 765, 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 구조물, 예를 들어 서열 번호 622-729, 759-762 및 766-789를 교차-차단하거나 교차-차단되는 핵산 서열을 위해 핵산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 단리하고, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해, 또는 다르게는 상기 방법중 하나 및 추가로 적어도 상기 면역글로불린 서열의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계, 및 상기 아미노산 서열을 자체 공지된 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현시키거나 화학적으로 합성함으로써 발현 또는 합성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 아미노산 서열에 관한 것이다.
또한, 상기 단계에 이어, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 적합하게 인간화(또는 다르게는 카멜화)되고/되거나; 이렇게 수득된 아미노산 서열(들)은 서로 또는 하나 이상의 다른 적합한 아미노산 서열과 연결되어(선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기를 통해) 본 발명의 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 적합하게 인간화(또는 다르게는 카멜화)되고 적합하게 발현될 수 있고/있거나; 본 발명의 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열은 서로 연결되거나 다른 적합한 아미노산 서열을 코딩하는 하나 이상의 다른 핵산 서열에 연결되고(선택가능하게는 하나 이상의 다른 적합한 연결기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 경유하여), 이후 이렇게 수득된 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하도록 적합하게 발현될 수 있다.
본 발명은 추가로 RANK-L과 연관된 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 적용성 및 용도, 뿐만 아니라 방법에 관한 것이다. 바람직하지만 비제한적인 몇몇 적용성 및 용도는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 또한 치료법에 사용하기 위한 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
특별히, 본 발명은 또한 치료가 필요한 대상에게 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드(약학적 효과량)를 투여함으로써 예방되거나 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 치료법에 사용하기 위한 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
보다 특별히, 본 발명은 골 질환 및 장애의 치료법에 사용하기 위한 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태, 실시양태, 이점 및 적용성은 또한 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이고, 여기서 본 발명은 본 발명의 나노바디 및 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 보다 상세히 설명되고 논의될 것이며, 이는 본 발명의 바람직한 몇몇 양태를 형성한다.
본원의 추가의 기재내용으로부터 명백한 바와 같이, 나노바디는 일반적으로 "dAb" 또는 유사 (단일)도메인 항체 또는 면역글로불린 서열에 비하여 특정한 이점(본원에 개략됨)을 제공하고, 이러한 이점은 또한 본 발명의 나노바디에 의해 제공된다. 그러나, 하기 교시의 보다 일반적인 양태가 본 발명의 다른 아미노산 서열에 적용(직접적으로 또는 유사하게)될 수 있음이 숙련가에게 명백할 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 설명, 실시예 및 청구의 범위에서:
a) 별도로 지시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당분야에서의 이들의 통상의 의미(이는 숙련가에게 명백할 것임)를 갖는다. 예를 들면 표준 편람, 예컨대 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)], 뿐만 아니라 본원에 인용된 일반적 배경지식을 참조한다;
b) 별도로 지시되지 않는 한, "면역글로불린 서열"이란 용어는 -본원에서 중쇄 항체를 지칭하던지, 또는 종래의 4-쇄 항체를 지칭하기 위해 사용되든지 간에 - 전체-크기 항체, 이의 개별적 쇄, 뿐만 아니라 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편(제한되지 않지만 항체-결합 도메인 또는 단편, 예컨대 개별적으로 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인이 포함됨) 모두를 포함하는 보편적 용어로서 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 "서열"이라는 용어는(예를 들면 "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서), 그 의미가 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 한, 일반적으로 관련 아미노산 서열 뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 둘다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다;
c) 별도의 지시가 없는 한, 구체적으로 상세히 설명되지 않은 모든 방법, 기법 및 조작은, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있거나 수행되어 졌다. 예를 들면 다시 표준 편람 및 본원에 언급된 일반적 배경지식, 및 본원에 인용된 추가의 문헌; 뿐만 아니라 예를 들면 하기 문헌[Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al, J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol, 2005, 26(1), 31-43](이는 단백질 공학, 예컨대 친화도 증진을 위한 기법 및 단백질, 예컨대 면역글로불린의 특이성 및 다른 원하는 특성을 개선시키기 위한 다른 기법에 대해 기재함)을 참조한다;
d) 아미노산 잔기는 하기 표 A-2에 언급된 바와 같이 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 지시될 것이다;
[표 A-2] 1문자 및 3문자 아미노산 코드
Figure 112009080144011-pct00001
e) 2개 이상의 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위하여, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율은 [제2 뉴클레오티드 서열에서 상응하는 위치의 뉴클레오티드에 동일한 제1 뉴클레오티드 서열중의 뉴클레오티드의 수]를 [제1 뉴클레오티드 서열중의 뉴클레오티드의 총 수]로 나눠주고 [100%]로 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 첨가는-제1 뉴클레오티드 서열에 비하여-단일 뉴클레오티드(위치)에서의 차이로 고려된다.
다르게는, 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 서열 정렬을 위한 공지의 컴퓨터 알고리즘(algorithm), 예컨대 표준 세팅(setting)을 사용하는 NCBI 블라스트(Blast) v2.0을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성의 정도를 결정하는 몇몇 다른 기법, 컴퓨터 알고리즘 및 세팅은 예를 들면 WO 제04/037999호, EP 제0 967 284호, EP 제1 085 089호, WO 제00/55318호, WO 제00/78972호, WO 제98/49185호 및 GB 제2 357 768-A호에 기재되어 있다.
대체적으로, 상기 개략된 계산 방법에 따라 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위해, 뉴클레오티드의 가장 큰 수를 갖는 뉴클레오티드 서열이 "제1" 뉴클레오티드로 정해지고, 나머지 뉴클레오티드 서열이 "제2" 뉴클레오티드 서열로 정해질 것이다;
f) 2개 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위하여, 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"(본원에 "아미노산 동일성"으로도 지칭됨)의 백분율은 [제2 아미노산 서열에서 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 동일한 제1 아미노산 서열중의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열중의 아미노산 잔기의 총 수]로 나눠주고 [100%]로 곱함으로써 계산될 수 있고, 여기서 -제1 아미노산 서열에 비하여- 제2 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 첨가는 단일 아미노산 잔기(위치)에서의 차이, 즉 본원에 정의된 바와 같은 "아미노산 차이"로 고려된다.
다르게는, 2개 이상의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 표준 세팅을 사용하는, 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성의 정도를 결정하기 위해 상기 언급된 바와 같은 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 계산될 수 있다.
대체적으로, 상기 개략된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하기 위해, 아미노산 잔기의 가장 큰 수를 갖는 아미노산 서열이 "제1" 아미노산 서열로 정해지고, 나머지 아미노산 서열이 "제2" 아미노산 서열로 정해질 것이다.
또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도를 결정하는데 있어서, 숙련가라면 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있는데, 이는 일반적으로 아미노산 잔기가 유사 화학 구조의 또다른 아미노산 잔기로 대체되고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 또는 본질적으로 전혀 영향을 주지 않는 아미노산 치환으로서 설명될 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 당분야에, 예를 들면 WO 제04/037999호, GB-A-제3 357 768호, WO 제98/49185호, WO 제00/46383호 및 WO 제01/09300호로부터 공지되어 있고; 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은 WO 제04/037999호 뿐만 아니라 WO 제98/49185호 및 본원에 인용된 추가의 문헌으로부터의 적절한 교시에 기초하여 선택될 수 있다.
이러한 보존적 치환은 바람직하게는 하기 그룹 (a)∼(e)중의 하나의 아미노산이 동일한 그룹내의 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (a) 작은 지방족 비극성 또는 약간 극성의 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성의 음성으로 하전된 잔기 및 이들의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성의 양성으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
특별히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala의 Gly 또는 Ser로의 치환; Arg의 Lys로의 치환; Asn의 Gln 또는 His로의 치환; Asp의 Glu로의 치환; Cys의 Ser로의 치환; Gln의 Asn로의 치환; Glu의 Asp로의 치환; Gly의 Ala 또는 Pro로의 치환; His의 Asn 또는 Gln로의 치환; Ile의 Leu 또는 Val로의 치환; Leu의 Ile 또는 Val로의 치환; Lys의 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환; Met의 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환; Phe의 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환; Ser의 Thr로의 치환; Thr의 Ser로의 치환; Trp의 Tyr로의 치환; Tyr의 Trp로의 치환; 및/또는 Phe의 Val, Ile 또는 Leu로의 치환.
본원에 기재된 폴리펩티드에 적용된 임의의 아미노산 치환은 또한 문헌[Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978]에 기재된 상이한 종의 상동 단백질 사이의 아미노산 편차의 빈도에 대한 분석, 문헌[Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 and Adv. EnzymoL, 47: 45-149, 1978]에 기재된 구조형성 전위의 분석, 및 문헌[Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, and Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986]에 기재된 단백질에서 소수성 패턴의 분석에 기초할 수 있고, 이들 모두는 본원에 참고로 이들 전체가 인용되어 있다. 나노바디의 1차, 2차 및 3차 구조에 대한 정보는 본원 기재내용 및 상기 인용된 일반적 배경지식에서 제공된다. 또한, 이를 위하여, 라마로부터의 VHH 도메인의 결정 구조는 예를 들면 문헌[Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803(1996)]; [Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757]; 및 [Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)]에 의해 제공된다. 종래의 VH 도메인에서 VH/VL 계면 및 이들 위치에 유효한 카멜화 치환을 형성하는 몇몇 아미노산 잔기에 대한 추가의 정보는 상기 인용된 선행 기술에서 찾아볼 수 있다;
g) 아미노산 서열 및 핵산 서열은 이들이 이들의 전체 길이에 대해 100% 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는다면 "정확히 동일"한 것으로 일컬어 진다;
h) 2개의 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"라는 용어는, 제2 서열에 비교된, 제1 서열의 위치상의 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭하고; 2개의 아미노산 서열이 1개, 2개 이상의 이러한 아미노산 차이를 갖는 것으로 이해된다;
i) 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 개별적으로 또다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 "포함"하거나, 또다른 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열로 "본질적으로 구성"된다고 일컬어지는 경우, 이는 후자의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 개별적으로 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열내로 혼입됨을 의미하지만, 그러나 보다 대체적으로 이는 일반적으로 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 실제로 어떻게 생성되거나 수득되는지와는 무관하게(이는 예를 들면 본원에 기재된 임의의 적합한 방법에 의해), 전술된 서열이 이의 서열내에 개별적으로 후자의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 연장부를 포함함을 의미한다. 비제한적 예에 의해, 본 발명의 나노바디가 CDR 서열을 포함한다고 하면, 이는 상기 CDR 서열이 본 발명의 나노바디내로 혼입되었음을 의미하지만, 보다 대체적으로 이는 일반적으로, 본 발명의 나노바디가 어떻게 생성되고 수득되었는지와 무관하게 이의 서열내에 상기 CDR 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 아미노산 잔기의 연장부를 함유함을 의미한다. 또한, 후자의 아미노산 서열이 특이적인 생물학적 또는 구조적 기능을 가질 경우, 이는 바람직하게는 본질적으로 동일하거나, 유사하거나 동등한 생물학적 또는 구조적 기능을 전술된 아미노산 서열에 가짐(달리 말하면, 전술된 아미노산 서열은, 바람직하게는 후자의 서열이 본질적으로 동일하거나, 유사하거나 동등한 생물학적 또는 구조적 기능을 수행할 수 있도록 함)을 주지해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디가 개별적으로 CDR 서열 또는 골격구조 서열을 포함한다고 할 경우, CDR 서열 및 골격구조는 바람직하게는 상기 나노바디에서 개별적으로 CDR 서열 또는 골격구조 서열처럼 작용할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열이 또다른 뉴클레오티드 서열을 포함한다고 할 경우, 먼저 언급된 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 이것이 발현 생성물(예를 들어 폴리펩티드)내로 발현될 경우, 후자의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 상기 발현 생성물의 일부를 형성하게 한다(달리 말하면, 후자의 뉴클레오티드 서열은 먼저 언급된 보다 큰 뉴클레오티드 서열과 동일한 판독 프레임(reading frame)내에 있음);
j) 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 -예를 들면, 그의 천연 생물학적 공급원 및/또는 이것이 수득되는 반응 매질 또는 배지에 비하여- 이 서열이 상기 공급원 또는 매질(배지)에서 대체적으로 회합되는 적어도 하나의 다른 성분, 예컨대 또다른 핵산, 또다른 단백질/폴리펩티드, 또다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 적어도 하나의 오염원, 불순물 또는 소수의 성분으로부터 분리되어진 경우, "본질적으로 단리된(형태)" 것으로 고려된다. 특별히, 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 그것이 2-배 이상, 특별히 10-배 이상, 보다 특별히 100-배 이상, 및 1000-배 이상 더 정제되어진 경우 "본질적으로 단리"된 것으로 고려된다. "본질적으로 단리된 형태"인 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 적합한 기법, 예컨대 적합한 크로마토그래피 기법, 예컨대 폴리아크릴아미드-겔 전기이동을 사용하여 결정될 경우 바람직하게는 본질적으로 균질하다;
k) 본원에서 사용된 "도메인"이라는 용어는 일반적으로 아미노산 서열의 구형 영역(예컨대 항체 쇄, 특별히 중쇄 항체의 구형 영역), 또는 이러한 구형 영역으로 본질적으로 구성된 폴리펩티드를 지칭한다.
일반적으로, 이러한 도메인은, 예를 들면 시이트(sheet)로서 또는 이황화 결합에 의해 펩티드 루프(예를 들면 3개 또는 4개의 펩티드 루프)를 포함할 것이다. "결합 도메인"이란 용어는 항원 결정자(본원에 정의된 바와 같음)에 대한 이러한 도메인을 지칭한다;
l) "항원 결정자"라는 용어는 항원-결합 분자(예컨대 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드), 보다 특별히 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인식된 항원 상의 에피토프를 지칭한다. "항원 결정자" 및 "에피토프"라는 용어는 또한 본원에 상호교환적으로 사용될 수 있다;
m) 특정 항원 결정자, 에피토프, 항원 또는 단백질(또는 이의 적어도 하나의 부분, 단편 또는 에피토프)에 (특이적으로)결합될 수 있거나, 이에 대해 친화도 및/또는 특이성을 갖는 아미노산 서열(예컨대 나노바디, 항체, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 일반적으로 항원 결합 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이의 단편)은 상기 항원 결정자, 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 또는 "이로 유도"되는 것으로 일컬어 진다;
n) "특이성"이라는 용어는 특별한 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예컨대 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드) 분자가 결합될 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정자의 수를 지칭한다. 항원-결합 단백질의 특이성은 친화도 및/또는 결합력에 기초하여 결정될 수 있다. 항원의 항원-결합 단백질과의 해리에 대한 평형 상수(KD)로 표시되는 친화도는 항원-결합 단백질 상에서 항원 결정자 및 항원-결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 측정값이고; KD 값이 적을 수록, 항원 결정자 및 항원-결합 분자간의 결합 강도는 강해진다(다르게는, 친화도는 1/KD인 친화도 상수(KA)로 표시될 수 있음). 숙련가에게 명백한 바와 같이(예를 들면 본원의 추가의 개시내용에 기초하여), 친화도는, 목적하는 특이적 항원에 따라서, 자체 공지된 방식으로 결정될 수 있다. 결합력은 항원-결합 분자(예컨대 나노바디 또는 본 발명의 폴리펩티드) 및 적절한 항원 사이의 결합 강도에 대한 측정값이다. 결합력은 항원-결합 분자 상에서 항원 결정자 및 이의 항원 결합 부위 사이의 친화도, 및 항원-결합 분자 상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 둘다에 관한 것이다. 전형적으로, 항원-결합 단백질(예컨대 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드)은 이들의 항원에 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)(즉, 105∼1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107∼1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108∼1012 리터/몰의 회합 상수(KA))로 결합될 것이다. 104 리터/몰 초과의 임의의 KD 값(104 M-1 미만의 임의의 KA 값)은 일반적으로 비-특이적 결합을 지시하는 것으로 고려된다. 바람직하게는, 본 발명의 1가 면역글로불린 서열은 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 원하는 항원에 결합될 것이다. 항원 또는 항원 결정자로의 항원-결합 단백질의 특이적 결합은 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로, 예를 들면 스카차드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 표지면역검정(RIA: radioimmunoassay), 효소 면역검정(EIA: enzyme immunoassay) 및 샌드위치 경쟁 검정(sandwich competition assay), 및 당분야에 자체 공지된 이의 상이한 변형법, 뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 기법들에 의해 결정될 수 있다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 해리 상수는 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 본원에 언급된 기법들이 포함된다. 이와 관련하여, 또한 10-4 몰/리터 또는 10-3 몰/리터(예를 들어 10-2 몰/리터) 초과의 해리 상수를 측정할 수 없음이 명백할 것이다.
선택가능하게는, 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 (실제 또는 겉보기) 회합 상수(KA)에 기초하여 관계식[KD = 1/KA]에 의해 계산될 수 있다.
친화도는 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 표시한다. 친화도는 흔히 KD, 또는 해리 상수로 제공되고, 이는 몰/리터(또는 M)의 단위를 갖는다. 친화도는 또한 회합 상수, KA로서 표현될 수 있고, 이는 1/KD와 같고 (몰/리터)-1(또는 M-1)의 단위를 갖는다. 본 명세서에서, 2개 분자(예컨대 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드 및 이의 의도된 표적) 사이의 상호작용의 안정성은 주로 이들 상호작용의 KD 값으로 표현될 수 있고; KA = 1/KD 관계식에 있어서, 이의 KD 값에 의한 분자 상호작용의 강도를 구체화하는 것은 또한 상응하는 KA 값을 계산하기 위해 사용될 수 있음이 숙련가에게 명백할 것이다. KD-값은 또한 열동력학적 의미에서 분자 상호작용의 강도를 특징짓는데, 이것이 공지된 관계 DG = RT.ln(KD)(대등하게 DG = RT.ln(KA))(여기서 R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이고, ln은 자연 로그임)에 의한 결합의 자유 에너지(DG)에 관련되기 때문이다.
의미있는 것으로 고려되는(예를 들어 특이적인) 생물학적 상호작용을 위한 KD는 전형적으로 10-10 M(0.1 nM)∼10-5 M(10000 nM)의 범위이다. 상호작용이 보다 강할 수록, 그의 KD는 보다 낮아 진다.
KD는 착체의 해리 속도 상수(koff로 표현됨)의 그의 결합 속도(kon로 표현됨)에 대한 비율로서 표현될 수 있다(따라서, KD = koff/kon 및 KA = kon/koff). 오프-속도(off-rate) koff의 단위는 s-1(여기서 s는 초의 SI 단위 표시법임)이다. 온-속도(on-rate) kon의 단위는 M-1s-1이다. 온-속도는 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1 사이에서 다양할 수 있고, 2분자 상호작용에 대한 확산-제한된 해리 속도 상수에 근접한다. 오프-속도는 관계식 t1 /2 = ln(2)/koff에 의해 소정의 분자 상호작용의 반감기와 관련된다. 오프-속도는 10-6 s-1(다수일의 t1 /2에 의한 거의 비가역적 착체)∼1 s-1(t1 /2 = 0.69 s) 사이에서 다양할 수 있다.
2분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 자체 공지된 상이한 기법, 예컨대 공지된 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 바이오센서(biosensor) 기법(예를 들면 문헌[Ober et ah, Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001] 참조)을 통해 측정될 수 있고, 여기서 하나의 분자는 바이오센서 칩에 고정화되고, 나머지 분자는 고정화된 분자위를 유동 조건하에 통과되어 kon, koff 측정값을 산출하고, 이에 따라 KD(또는 KA) 값을 산출한다. 이는 예를 들면 공지된 비아코어(BIACORE) 기기를 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 측정 과정이, 예를 들면 하나의 분자의 바이오센서 상의 코팅에 대한 인공산물에 의해 내포된 분자들의 고유 결합 친화도에 어느 정도 영향을 미친다면, 측정된 KD가 겉보기 KD에 상응할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 또한, 하나의 분자가 나머지 분자에 대해 하나 이상의 인식 부위를 함유한다면 겉보기 KD가 측정될 수 있다. 이러한 상황에서, 측정된 친화도는 2개의 분자에 의한 상호작용의 결합도에 의해 영향받을 수 있다.
친화도를 평가하기 위해 사용될 수 있는 또다른 접근법은 문헌[Friguet et al., J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985]에 기재된 2-단계 효소-연결된 면역흡착제 검정(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 절차이다. 이 방법은 용액 상 결합 평형 측정법을 달성하고, 지지체, 예컨대 플라스틱 상의 분자중 하나의 흡착과 관련된 가능한 인공산물을 방지한다.
그러나, KD의 정확한 측정은 꽤 노동-집약적이고, 결과로서 종종 겉보기 KD 값이 2개 분자의 결합 강도를 평가하기 위해 결정된다. 모든 측정이 일관된 방식으로 이루어지는 한(예를 들어 검정 조건을 바꾸지 않음), 겉보기 KD 측정값은 진정한 KD의 근사값으로서 사용될 수 있고, 따라서 본 문서에서 KD 및 겉보기 KD는 동일한 중요성 및 연관성을 갖고 처리되어야 함을 주지해야 한다.
최종적으로, 많은 상황에서, 실험 과학자는 몇몇 참조 분자에 관한 결합 친화도를 결정하는 것이 편리한지를 판단할 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들면, 분자 A 및 B 사이의 결합 강도를 평가하기 위해, 예를 들어 B에 결합하는 것으로 공지되고, 형광발색단(fluorophore) 또는 발색단(chromophore) 기 또는 다른 화학 부분구조, 예컨대 ELISA 또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS: Fluorescent activated cell sorting)에서 용이하게 검출하기 위한 비오틴(biotin) 또는 다른 포맷(형광 검출을 위한 형광발색단, 광 흡수 검출을 위한 발색단, 스트렙타비딘(streptavidin)-중재된 ELISA 검출을 위한 비오틴)으로 적합하게 표지된 참조 분자 C를 사용할 수 있다. 전형적으로, 참조 분자 C는 고정된 농도로 유지되고 A의 농도는 B의 소정의 농도 또는 양에 대해 달라진다. 결과로서, IC50 값은 A의 부재하에 C에 대해 측정된 신호가 반감되는 A의 농도에 상응하여 수득된다. 참조 분자의 KD(KDref), 뿐만 아니라 참조 분자의 총 농도 cref가 공지되어 있다면, 상호작용 A-B에 대한 겉보기 KD는 다음의 식으로부터 수득될 수 있다: KD = IC50/(l+cref/KDref). cref ≪ KDref인 경우, KD
Figure 112009080144011-pct00002
IC50이다. IC50의 측정이 비교되는 결합제에 대해 일정한 방식으로(예를 들어 Cref를 고정시킨채) 수행된다면, 분자 상호작용의 강도 또는 안정성은 IC50에 의해 평가될 수 있고, 이러한 측정값은 KD 또는 겉보기 KD에 동등한 것으로 판단된다;
o) 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 반감기는 일반적으로 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체내에서, 예를 들면 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 자연 기작에 의한 서열 또는 화합물의 소거 또는 소실로 인하여, 50% 감소되는데 걸리는 시간으로서 정의될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는 자체 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약물동력학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기법은 당분야의 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 일반적으로 온혈 동물(즉, 인간 또는 또다른 적합한 포유동물, 예컨대 마우스, 토끼, 래트, 돼지, 개 또는 영장류, 예를 들면 마카카 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특별히, 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스) 및/또는 레서스 원숭이(마카카물라타) 및 개코원숭이(파피오 우르시너스))에게 적합한 용량의 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드를 적합하게 투여하는 단계; 상기 동물의 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 결정하는 단계; 및 이렇게 수득된 데이터(의 플롯)로부터, 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 투여시 초기 수준에 비하여 50% 감소될 때까지의 시간을 계산하는 단계가 포함된다. 예를 들면 아래의 실험 부분, 뿐만 아니라 표준 편람, 예컨대 문헌[Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)]을 참조한다.
또한 숙련가에게 명백한 바와 같이(예를 들면 WO 제04/003019호의 6면 및 7면과 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조함), 반감기는 매개변수, tl /2-알파, tl /2-베타 및 곡선 아래의 면적(AUC: area under the curve)을 사용하여 표현될 수 있다. 본 명세서에서, "반감기의 증가"는 임의의 하나의 이러한 매개변수, 예컨대 임의의 2개의 매개변수 또는 본질적으로 3개의 모든 이들 매개변수에서의 증가를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "반감기의 증가", 또는 "증가된 반감기"는 특별히 tl /2-알파 및/또는 AUC 또는 이들 둘다의 증가와 함께 또는 이들의 증가없이 tl /2-베타에서 증가함을 지칭한다;
p) 본 발명에 있어서, "조정함" 또는 "조정하는"은 일반적으로 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 검정을 사용하여 측정될 경우 표적 또는 항원의 활성을 감소 또는 저해하거나 다르게는 이를 증가시킴을 의미한다. 특별히, "조정함" 또는 "조정하는"은 적합한 시험관내, 세포성 또는 생체내 검정(이는 대체적으로 관여된 표적 또는 항원에 의존할 것임)을 사용하여 측정될 경우, 본 발명의 구조물이 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건하에 동일한 검정에서 표적 또는 항원의 활성에 비하여, 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90%이상 표적 또는 항원의 생물학적(관련된 또는 의도된) 활성을 감소 또는 저해하거나 다르게는 이를 증가시킴을 의미한다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, "조정함"은 또한 표적 또는 항원의 하나 이상의 그의 리간드, 결합 파트너, 동종다중결합성(homomultimeric) 또는 이종다중결합성(heteromultimeric) 형태로의 회합을 위한 파트너, 또는 기질에 대한 친화도, 결합력, 특이성 및/또는 선택성에 변화(이는 증가이거나 감소일 수 있음)를 일으키고/일으키거나; 본 발명의 구조물이 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건에 비하여, 표적 또는 항원이 존재하는 매질 또는 환경에서의 하나 이상의 조건(예컨대 pH, 이온 강도, 보조인자의 존재 등)에 대한 표적 또는 항원의 민감도에 변화(이는 증가이거나 감소일 수 있음)를 일으킴을 포함한다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이는 관여된 표적 또는 항원에 따라서 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지된 임의의 적합한 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
"조정함"은 또한 표적 또는 항원(또는 그의 기질(들), 리간드(들) 또는 경로(들))이 관여된 하나 이상의 생물학적 또는 생리학적 기작, 효과, 반응, 작용, 경로 또는 활성(예컨대 그의 신호 경로 또는 대사 경로 및 그들의 연관된 생물학적 또는 생리학적 효과)에 대하여 변화(즉, 표적 또는 항원 및 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과에 따른, 각각의 작용물질, 길항물질 또는 역 작용물질로서의 활성)를 일으킴을 의미할 수 있다. 다시, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 작용물질 또는 길항물질로서의 이러한 작용은 관여된 표적 또는 항원에 따라서 임의의 적합한 방식으로 및/또는 자체 공지된 임의의 적합한 (시험관내 및 대체적으로 세포성 또는 생체내) 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특별히, 작용물질 또는 길항물질로서의 작용은, 의도된 생물학적 또는 생리학적 활성이, 본 발명의 구조물이 존재하지 않음을 제외하고 동일한 조건하에 동일한 검정에서의 생물학적 또는 생리학적 활성에 비하여, 개별적으로 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상, 예컨대 10% 이상 또는 25% 이상, 예를 들면 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 증가 또는 감소시킬 수 있다.
조정은 예를 들면 표적 또는 항원의 알로스테릭(allosteric) 조정; 및/또는 표적 또는 항원의 그의 기질 및/또는 리간드중 하나로의 결합을 감소 또는 저해함, 및/또는 표적 또는 항원으로의 결합을 위한 천연 리간드, 기질과의 경쟁을 포함한다. 조정은 또한 표적 또는 항원, 또는 이것이 관여된 기작 또는 경로를 활성화시킴을 포함한다. 조정은 예를 들면 표적 또는 항원의 접힘 또는 입체구조에 관하여, 또는 표적 또는 항원이 접히거나, 그의 입체구조(예를 들면 리간드의 결합에 대한)를 바꾸거나, 다른 (서브)유닛과 회합되거나, 해리되는 능력에 관하여 변화를 일으킴을 포함한다. 조정은 예를 들면 또한 표적 또는 항원이 다른 화합물을 수송하거나 다른 화합물(예컨대 이온)을 위한 채널(channel)로서 작용할 수 있는 능력에 변화를 일으킴을 포함한다.
조정은 가역적이거나 비가역적일 수 있지만, 약학적 및 약리학적 목적을 위해서는 대체적으로 가역적인 방식일 것이다;
q) 표적 또는 항원에 있어서, 표적 또는 항원 상의 "상호작용 부위"라는 용어는, 표적 또는 항원의 리간드, 수용체 또는 다른 결합 파트너에 결합하기 위한 부위, 촉매적 부위, 분할 부위, 알로스테릭 상호작용을 위한 부위, 다중 결합에 관여된 부위(예컨대 동종결합 또는 이종이량체결합)인 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 부위, 에피토프, 항원 결정자, 부분, 도메인 또는 연장부; 또는 표적 또는 항원의 생물학적 작용 또는 기작에 관여된, 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 다른 부위, 에피토프, 항원 결정자, 부분, 도메인 또는 연장부를 의미한다. 보다 일반적으로, "상호작용 부위"는, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 결합하여 표적 또는 항원(및/또는 표적 또는 항원이 관여된 임의의 경로, 상호작용, 신호, 생물학적 기작 또는 생물학적 효과)가 조정되도록 하는(본원에 정의됨), 표적 또는 항원 상의 아미노산 잔기의 임의의 부위, 에피토프, 항원 결정자, 부분, 도메인 또는 연장부일 수 있다;
r) 아미노산 서열 또는 폴리펩티드는, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합하는 친화도에 비하여 10배 이상, 예컨대 100배 이상, 바람직하게는 1000배 이상, 및 10,000배 까지 또는 그보다 더 큰 친화도(상기 기재된 바와 같고, 적합하게는 KD 값, KA 값, Koff 속도 및/또는 Kon 속도로 적합하게 표현됨)를 갖고 제1 항원에 결합할 경우, 제2 표적 또는 항원에 비하여 제1 항원 또는 항체에 "특이적"이라고 일컬어 진다. 예를 들면, 제1 항원은, 상기 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 폴리펩티드에 결합되는 KD 값에 비하여 적어도 10배 미만, 예컨대 적어도 100배 미만, 바람직하게는 적어도 1000배 미만, 및 10,000배 까지 또는 그보다 더 작은 KD 값으로 표적 또는 항원에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열 또는 폴리펩티드가 제2 표적 또는 항원에 비하여 제1 표적 또는 항원에 "특이적"인 경우, 이는 상기 제1 표적 또는 항원으로는 유도(본원에 정의된 바와 같음)되지만, 상기 제2 표적 또는 항원으로는 유도되지 않는다;
s) "교차-차단", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는"이란 용어는, 아미노산 서열 또는 다른 결합제(예컨대 본 발명의 폴리펩티드)가 본 발명의 다른 아미노산 서열 또는 결합제의 소정의 표적으로의 결합을 간섭하는 능력을 의미하기 위해 상호교환적으로 본원에 사용된다. 본 발명의 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 또다른 것들의 RANK-L로의 결합을 간섭하여, 본 발명에 따른 교차-차단으로 말하여 질 수 있을 지의 정도는, 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 특별히 적합한 정량적 교차-차단 검정은 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 상호작용 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기계를 사용한다. 또다른 적합한 정량적 교차-차단 검정은 아미노산 서열 또는 다른 결합제 사이의 경쟁을 그들의 표적에 대한 결합에 대해 측정하는 ELISA-기초 접근 방법을 사용한다.
아래에, 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 본 발명에 따른 교차-차단을 하거나 교차-차단을 할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 적합한 비아코어 검정을 일반적으로 설명한다. 이 검정이 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열 또는 다른 결합제에 의해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 비아코어 기계(예를 들면 비아코어 3000)는 제조업체의 권고에 따라 작동된다. 따라서, 하나의 교차-차단 검정에서, 표준 아민 커플링 화학을 사용하여 표적 단백질을 CM5 비아코어 칩에 커플링시켜 표적으로 코팅된 표면을 생성한다. 전형적으로 200∼800 공명 단위의 표적을 칩에 커플링시킨다(쉽게 측정가능한 결합 수준을 제공하지만, 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 용이하게 포화될 수 있는 양). 서로 교차-차단되는 능력을 평가받을 2개의 시험 아미노산 서열(A* 및 B*로 표시)을 적합한 완충액에서 결합 부위의 1 대 1 몰 비율로 혼합하여 시험 혼합물을 생성한다. 결합 부위에 기초한 농도를 계산할 경우, 아미노산 서열의 몰 중량은 아미노산 서열 상의 표적 결합 부위의 수로 나뉘어진 아미노산 서열의 총 몰 중량으로 간주된다. 이 시험 혼합물에서 각각의 아미노산 서열의 농도는 비아코어 칩 상에 포획된 표적 분자 상의 아미노산 서열에 대한 결합 부위를 쉽게 포화시키도록 충분히 높아야 한다. 혼합물에서 아미노산 서열은 동일한 몰 농도(결합 기준으로)이고, 이러한 농도는 전형적으로 1.00 내지 1.5 마이크로몰(결합 부위 기준으로)이다. A*만 단독으로, B*만 단독으로 함유하는 별도의 용액을 또한 준비한다. 이러한 용액에서 A* 및 B*는 시험 혼합물에서와 동일한 완충액내에 동일한 조건하에 있어야 한다. 시험 혼합물을 표적-코팅된 비아코어 칩 상으로 통과시키고, 결합의 총량을 기록한다. 이어서 칩-결합된 표적을 손상시키지 않으면서 결합된 아미노산 서열을 제거하는 방식으로 칩을 처리한다. 전형적으로, 이는 칩을 30 mM HCl로 60 초동안 처리함으로써 이루어 진다. 이어서 A* 단독 용액을 표적-코팅된 표면 상으로 통과시키고, 결합량을 기록한다. 다시 칩-결합된 표적을 손상시키지 않으면서 결합된 모든 아미노산 서열을 제거하도록 칩을 처리한다. 이어서 B* 단독 용액을 표적-코팅된 표면 상으로 통과시키고, 결합량을 기록한다. 그런 다음, A* 및 B*의 혼합물의 최대이론적 결합을 계산하고, 이는 단지 표적 표면 상으로 통과될 경우의 각 아미노산 서열의 결합의 합이다. 실제 기록된 혼합물의 결합이 이러한 이론적 최대값 보다 작으면, 2개의 아미노산 서열은 서로 교차-차단한 것이다. 따라서, 일반적으로, 본 발명에 따른 교차-차단 아미노산 서열 또는 다른 결합제는, 상기 비아코어 교차-차단 검정에서, 검정 동안 본 발명의 제2 아미노산 서열 또는 다른 결합제의 존재하에 기록된 결합이, 조합된 2개의 아미노산 서열 또는 결합제의 최대 이론적 결합(상기 정의된 바와 같음)의 80%∼0.1%(예를 들어 80%∼4%), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75%∼0.1%(예를 들어 75%∼4%), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 70%∼0.1%(예를 들어 70%∼4%)이도록 상기 검정에서 표적에 결합하는 것이다. 상기 기재된 비아코어 검정은 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 본 발명에 따라 서로 교차-차단하는지를 결정하기 위해 사용되는 주요한 검정이다. 드문 경우에 특별한 아미노산 서열 또는 다른 결합제가 CM5 비아코어 칩으로 아민 화학을 경유하여 커플링된 표적에 결합하지 않을 수 있다(이는 대체적으로 표적 상의 관련 결합 부위가 칩으로의 커플링에 의해 차폐되거나 파괴될 경우 초래됨). 이러한 경우, 교차-차단은 표적의 태깅된(tagged) 버전, 예를 들면 N-말단 His-태깅된 버전을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 특별한 포맷에서, 항-His 아미노산 서열을 비아코어 칩에 커플링시키고, 이어서 His-태깅된 표적을 칩의 표면 상으로 통과시키고 항-His 아미노산 서열에 의해 포획한다. 교차-차단 분석은, 각각의 칩 재생 순환 이후에 새로운 His-태깅된 표적이 항-His 아미노산 코팅된 표면으로 역 적재됨을 제외하고, 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된다. N-말단 His-태깅된 표적을 사용하는 주어진 예에 더하여, 다르게는 C-말단 His-태깅된 표적이 사용될 수 있다. 추가로, 당분야에 공지된 다양한 다른 태그 및 태그 결합 단백질 조합물이 이러한 교차-차단 분석에 사용될 수 있다(예를 들어 항-HA 항체를 갖는 HA 태그; 항-FLAG 항체를 갖는 FLAG 태그; 스트렙타비딘을 갖는 비오틴 태그).
아래에, 표적에 대한 아미노산 서열 또는 결합제가 본원에 정의된 바와 같이 교차-차단하는지 또는 교차-차단가능한지의 여부를 결정하기 위한 ELISA 검정을 일반적으로 설명한다. 이 검정이 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열(또는 본 발명의 다른 결합제, 예컨대 폴리펩티드)에 의해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이 검정의 일반적 원리는 표적으로 유도되는 아미노산 서열 또는 결합제를 ELISA 플레이트의 웰(well) 상으로 코팅시키는 것이다. 과량의 제2의 유효한 교차-차단 항-표적 아미노산 서열을 용액에 첨가한다(즉 ELISA 플레이트에 결합되지 않음). 이어서 제한된 양의 표적을 웰에 첨가한다. 코팅된 아미노산 서열 및 용액중의 아미노산 서열이 제한된 수의 표적 분자와 결합하기 위해 경쟁한다. 플레이트를 세척하여 코팅된 아미노산 서열과 결합되지 않은 과량의 표적을 제거하고, 또한 제2의 용액 상 아미노산 서열 뿐만 아니라 제2의 용액 상 아미노산 서열과 표적 사이에 형성된 착체를 제거한다. 이어서 표적을 검출하기에 적절한 시약을 사용하여 결합된 표적을 측정한다. 코팅된 아미노산 서열을 교차-차단할 수 있는 용액중의 아미노산 서열은, 코팅된 아미노산 서열이 제2의 용액 상 아미노산 서열의 부재하에 결합될 수 있는 표적 분자의 수에 비하여, 코팅된 아미노산 서열이 결합될 수 있는 표적 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다. 제1 아미노산 서열, 예를 들어 Ab-X가 고정화된 아미노산 서열인 것으로 선택되는 경우, 이를 ELISA 플레이트의 웰 상으로 코팅하고, 이후 플레이트를 적합한 차단 용액으로 차단시켜 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화시킨다. 이어서, 과량의 제2 아미노산 서열, 즉 Ab-Y를 ELISA 플레이트에 첨가하여, 웰당 Ab-Y 표적 결합 부위의 몰은 ELISA 플레이트의 코팅 동안에 웰당 사용된 Ab-X 표적 결합 부위의 몰에 비하여 10배 이상 높도록 한다. 이어서, 표적을 첨가하여 웰당 첨가된 표적의 몰이 각각의 웰을 코팅하기 위해 사용된 Ab-X 표적 결합 부위의 몰에 비하여 25배 이상 낮도록 한다. 적절한 배양 기간후, ELISA 플레이트를 세척하고, 표적을 검출하기 위한 시약을 첨가하여 코팅된 항-표적 아미노산 서열(이 경우 Ab-X)에 의해 특이적으로 결합된 표적의 양을 측정한다. 검정을 위한 배경 신호는 코팅된 아미노산 서열(이 경우 Ab-X), 제 2의 용액 상 아미노산 서열(이 경우 Ab-Y), 표적 완충액 단독(즉, 첨가된 표적이 없음) 및 표적 검출 시약에 의해 웰에서 수득된 신호로서 정의된다. 검정을 위한 양성 제어 신호는 코팅된 아미노산 서열(이 경우 Ab-X), 제2의 용액 상 아미노산 서열 완충액 단독(즉, 첨가된 제2의 용액 상 아미노산 서열이 없음), 표적 및 표적 검출 시약에 의해 웰에서 수득된 신호로서 정의된다. ELISA 검정은 이러한 방식으로 수행되어 배경 신호의 6배 이상의 양성 제어 신호를 갖는다. 코팅 아미노산 서열로서 사용하기 위한 아미노산 서열 및 제2 (경쟁자) 아미노산 서열로서 사용하기 위한 아미노산 서열을 선택함으로써 야기된 임의의 인공산물(예를 들어 표적에 대한 Ab-X와 Ab-Y 사이의 유의적으로 상이한 친화도)을 피하기 위해, 교차-차단 검정은 다음의 2가지 포맷으로 수행된다: 1) 포맷 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트 상으로 코팅되는 아미노산 서열이고, Ab-Y가 용액중의 경쟁자 아미노산 서열인 경우이다; 2) 포맷 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트 상으로 코팅되는 아미노산 서열이고, Ab-X가 용액중의 경쟁자 아미노산 서열인 경우이다. Ab-X 및 Ab-Y는, 포맷 1 및 포맷 2에서, 용액 상 항-표적 아미노산 서열의 부재하에(즉, 양성 제어 웰에서) 수득된 표적 검출 신호에 비하여, 용액 상 항-표적 아미노산 서열이 표적 검출 신호(즉, 코팅된 아미노산 서열에 의해 결합된 표적의 양)를 60%∼100%, 구체적으로 70%∼100%, 보다 구체적으로 80%∼100% 감소시킬 수 있다;
t) 아미노산 서열은, 2개의 상이한 항원 또는 항원 결정자에 대해 특이적(본원에 정의된 바와 같음)인 경우 이들 2개의 상이한 항원 또는 항원 결정자에 대해 "교차-반응성"인 것으로 일컬어 진다;
u) "pH에 본질적으로 무관한" 결합은, 일반적으로 본원에서, 동물 또는 인체의 세포에서 발생되는 pH 값(들)(추가로 본원에 기재된 바와 같음)에서 혈청 단백질(예컨대 혈청 알부민)에 대한 아미노산 서열의 회합 상수(KA)가, 상기 세포 밖에서 발생되는 pH 값(들)에서 혈청 단백질에 대한 아미노산 서열의 회합 상수(KA)의 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 예컨대 보다 더 바람직하게는 70% 이상, 예컨대 80% 이상 또는 90% 이상(또는 100% 더 초과, 예컨대 110% 초과, 120% 초과, 또는 130% 더 초과, 또는 심지어 150% 초과, 또는 200% 더 초과)임을 의미한다. 다르게는, "pH에 본질적으로 무관한" 결합은, 일반적으로 본원에서, 동물 또는 인체의 세포에서 발생되는 pH 값(들)(추가로 본원에 기재된 바와 같음, 예컨대 pH 5.5 주변, 예를 들어 5.3∼5.7)에서 혈청 단백질(예컨대 혈청 알부민)에 대한 아미노산 서열의 Koff 비율(비아코어에 의해 측정됨)이, 상기 세포 밖에서 발생되는 pH 값(들), 예를 들어 pH 7.2∼7.4에서 혈청 단백질에 대한 아미노산 서열의 Koff 비율의 5% 이상, 예컨대 10% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 예컨대 보다 더 바람직하게는 70% 이상, 예컨대 80% 이상 또는 90% 이상(또는 100% 더 초과, 예컨대 110% 초과, 120% 초과, 또는 130% 더 초과, 또는 150% 더 초과, 또는 200% 더 초과)임을 의미한다. "동물 또는 인체의 세포에서 발생되는 pH 값(들)"은 세포내, 특별히 혈청 단백질의 재순환에 관여된 세포내에서 발생될 수 있는 pH 값(들)을 의미한다. 특별히, "동물 또는 인체의 세포에서 발생되는 pH 값(들)"은 혈청 단백질의 재순환(예를 들어 음세포작용(pinocytosis), 세포이물흡수작용(endocytosis), 트랜스사이토시스(transcytosis), 토세포작용(exocytosis) 및 식세포작용(phagocytosis), 또는 상기 세포내로의 섭취 또는 내재화의 유사한 기작의 결과로서)에 관여된 세포 격실 또는 소낭, 예컨대 엔도솜(endosome), 리소좀(lysosome) 또는 피노솜(pinosome)내부에서 발생될 수 있는 pH 값(들)을 의미한다;
v) 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 나노바디중 아미노산 잔기의 총 수는 110∼120, 바람직하게는 112∼115, 가장 바람직하게는 113일 수 있다. 그러나, 나노바디의 부분, 단편, 유사체 또는 유도체(본원에 추가로 기재된 바와 같음)는, 이러한 부분, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에 개략된 추가의 요건을 충족하고 또한 바람직하게는 본원에 기재된 목적에 적합한 한, 그들의 길이 및/또는 크기에 특별히 제한되지 않음을 주지해야 한다;
w) 나노바디의 아미노산 잔기는, 문헌[Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195](예를 들면 이 출판물의 도 2를 참조함)에서 카멜리드로부터의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이, 문헌[Kabat et al, "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91]에 제시되거나 또는 본원에 언급된 VH에 대한 일반적 번호매김에 따라 번호매겨진다. 이러한 번호매김에 따라, 나노바디의 FR1은 위치 1∼30에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31∼35에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36∼49에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50∼65에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3은 위치 66∼94에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95∼102에서의 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103∼113에서의 아미노산 잔기를 포함한다. [이와 관련하여, -VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당분야에 공지된 바와 같이- 각각의 CDR중의 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있고, 카밧 번호매김에 의해 지시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다(즉, 카밧 번호매김에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유하지 않거나, 실제 서열은 카밧 번호매김에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음). 이는, 일반적으로 카밧에 따른 번호매김이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 번호매김에 상응하거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다. 그러나, 일반적으로, 카밧의 번호매김에 따라 CDR중의 아미노산 잔기의 수와 무관하게, 카밧 번호매김에 따른 위치 1은 FR1의 출발점과 상응하고, 역으로 카밧 번호매김에 따른 위치 36은 FR2의 출발점과 상응하고, 역으로 카밧 번호매김에 따른 위치 66은 FR3의 출발점과 상응하고, 역으로 카밧 번호매김에 따른 위치 103은 FR4의 출발점과 상응한다고 말할 수 있다.]
VH 도메인의 아미노산 잔기의 번호매김을 위한 대안의 방법(이 방법은 카멜리드로부터의 VHH 도메인 및 나노바디에 유사한 방식으로 또한 적용될 수 있음)은, 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의(contact definition)"로 일컬어 지는 문헌[Chothia et al., Nature 342, 877-883 (1989)]에 기재된 방법이다.
그러나, 본 명세어, 청구의 범위 및 도면에서, 별도의 지시가 없는 한, 리에흐만(Riechmann) 및 무일데르만스(Muyldermans)에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같이 카밧에 따른 번호매김이 수행될 것이다;
x) 도면, 서열 목록 및 실험 부분/실시예는 단지 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되고, 본원에 달리 명확히 지시되지 않는 한, 본 발명 및/또는 첨부된 청구의 범위의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는 것으로 해석되거나 파악되어야 한다.
중쇄 항체 및 이의 가변 도메인에 대한 일반적 설명을 위해, 무엇 보다도 본원에 인용된 선행 기술, 문헌[Muyldermans in Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302]; 뿐만 아니라 일반적 배경 기술로서 언급되는 하기 특허 출원을 참조한다: WO 제94/04678호, WO 제95/04079호 및 WO 제96/34103호(Vrije Universiteit Brussel); WO 제94/25591호, WO 제99/37681호, WO 제00/40968호, WO 제00/43507호, WO 제00/65057호, WO 제01/40310호, WO 제01/44301호, EP 제1134231호 및 WO 제02/48193호(Unilever); WO 제97/49805호, WO 제01/21817호, WO 제03/035694호, WO 제03/054016호 및 WO 제03/055527호(Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)); WO 제03/050531호(Algonomics N.V. and Ablynx N.V.); WO 제01/90190호(National Research Council of Canada); WO 제03/025020호(= EP 제1 433 793호)(the Institute of Antibodies); 뿐만 아니라 WO 제04/041867호, WO 제04/041862호, WO 제04/041865호, WO 제04/041863호, WO 제04/062551호, WO 제05/044858호, WO 제06/40153호, WO 제06/079372호, WO 제06/122786호, WO 제06/122787호 및 WO 제06/122825호(Ablynx N.V.) 및 추가의 공개된 특허 출원(Ablynx N.V.). 또한 이들 출원에 언급된 추가의 선행 기술, 특별히 국제 특허 출원 WO 제06/040153호의 41∼43면에 언급된 문헌의 목록을 참조하고, 이러한 목록 및 문헌은 참고로 본원에 인용되어 있다.
당분야에 사용되는 용어법에 따르면(상기 문헌 참조), 자연 발생 중쇄 항체에 존재하는 가변 도메인은, 종래의 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(이는 이후 "VH 도메인"으로 지칭될 것임), 및 종래의 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(이는 이후 "VL 도메인"으로서 지칭될 것임)과 구별하기 위해 "VHH 도메인"으로 지칭될 것이다.
상기 지칭된 선행 기술에서 언급된 바와 같이 VHH 도메인은, 단리된 VHH 도메인(뿐만 아니라, 자연 발생 VHH 도메인과 구조적 특징 및 기능적 특성을 공유하는, 단리된 VHH 도메인에 기초한 나노바디) 및 이를 함유하는 단백질이 기능적 항원-결합 도메인 또는 단백질로서 사용하기에 매우 유용하도록 만드는 다수의 고유의 구조적 특징 및 기능적 특성을 갖는다. 특별히, 제한되지 않지만, VHH 도메인(이는 경쇄 가변성 도매인의 부재하에 이와의 어떠한 상호작용 없이 항원에 기능적으로 결합하도록 자연적으로 "고안"되어짐) 및 나노바디는 단일한 비교적 작은 기능적 항원-결합 구조 단위, 도메인 또는 단백질로서 작용할 수 있다. 이로 인해, 그 자체로 단일 항원-결합 단백질 또는 도메인으로서 실제 적용하기에 일반적으로 적합하지 않지만 기능적 항원-결합 단위를 제공하기 위해 몇몇 형태 또는 또다른 형태로 조합될 필요가 있는(예를 들면 종래의 항체 단편, 예컨대 Fab 단편에서; VL 도메인에 공유적으로 결합된 VH 도메인으로 구성된 ScFv 단편에서와 같이) 종래의 4-쇄 항체의 VH 및 VL 도메인으로부터 VHH 도메인이 구별된다.
이들 고유의 특성으로 인하여, 단일 항원-결합 단백질 또는 항원-결합 도메인으로서(즉, 보다 큰 단백질 또는 폴리펩티드의 일부로서) VHH 도메인 및 나노바디를 사용함은, 종래의 VH 및 VL 도메인, scFv 또는 종래의 항체 단편(예컨대 Fab- 또는 F(ab')2-단편)에 비하여 다수의 상당한 이점을 제공한다:
-높은 친화도 및 높은 선택성을 갖고 항원에 결합되기 위해 단지 단일 도메인이 필요하고, 이로써 2개의 별도의 도메인이 존재할 필요가 없을 뿐만 아니라 2개의 도메인이 적합한 공간적 입체구조 및 배열로 존재하는지 확인(즉, 특별히 고안된 연결기를 사용하여, 예컨대 scFv에 의해)할 필요가 없다;
-VHH 도메인 및 나노바디는 단일 유전자로부터 발현될 수 있고, 번역후 접힘 또는 개질이 필요없다;
-VHH 도메인 및 나노바디는 쉽게 다가 및 다중특이적 형태으로 조작될 수 있다(추가로 본원에 논의된 바와 같음);
-VHH 도메인 및 나노바디는 매우 가용성이고 응집하는 경향이 없다(문헌[Ward et al, Nature, Vol. 341, 1989, p. 544]에 기재된 마우스-유도된 "dAb"에 의해서와 같음);
-VHH 도메인 및 나노바디는 열, pH, 단백질분해효소 및 다른 변성제 또는 조건에 매우 안정하다(예를 들면 상기 문헌[Ewert et al] 참조);
-VHH 도메인 및 나노바디는 제조에 필요한 스케일 상에서 쉽고 비교적 저렴하게 제조된다. 예를 들면, VHH 도메인, 나노바디 및 이를 함유한 단백질/폴리펩티드는 미생물 발효(예를 들어 이후 추가로 기재되는 바와 같음)에 의해 생산될 수 있고, 예를 들면 종래의 항체 단편에 의해서와 같이, 포유동물 발현 시스템을 사용할 필요가 없다;
-VHH 도메인 및 나노바디는 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항체-결합 단편에 비하여 비교적 작고(대략 15 kDa, 또는 종래의 IgG에 비하여 10배 더 작음), 따라서 이러한 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항체-결합 단편에 비하여 조직(제한되지 않지만 고형 종양 및 다른 치밀한 조직)내로 (더) 높은 침투성을 보인다;
-VHH 도메인 및 나노바디는 소위 강-결합 특성(무엇 보다도 종래의 VH 도메인에 비하여 이들의 연장된 CDR3 루프에 기인함)을 나타낼 수 있고, 따라서 또한 종래의 4-쇄 항체 및 이의 항체-결합 단편이 접근할 수 없는 표적 및 에피토프에 접근할 수 있다. 예를 들면 VHH 도메인 및 나노바디가 효소를 저해할 수 있음이 제시되어 있다(예를 들면 WO 제97/49805호; 문헌[Transue et al, Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Lauwereys et al, EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20] 참조).
구체적이고 바람직한 양태에서, 본 발명은 RANK-L에 대한 나노바디, 특별히 온혈동물로부터의 RANK-L에 대한 나노바디, 보다 특별히 포유동물로부터의 RANK-L에 대한 나노바디, 특별히 인간 RANK-L에 대한 나노바디; 뿐만 아니라 적어도 하나의 이러한 나노바디를 포함하는 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다.
특별히 본 발명은, RANK-L에 대한 종래의 항체 또는 이의 단편에 비하여, 이러한 종래의 항체 또는 항체 단편(예컨대 Fab' 단편, F(ab')2 단편, ScFv 구조물, "다이어바디" 및 다른 다중특이적 구조물(예를 들면 문헌[Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36] 참조)에 비하여, 또한 종래의 항체의 가변 도메인으로부터 유도될 수 있는 소위 "dAb" 또는 유사 (단일)도메인 항체에 비하여, 개선된 치료학적 및/또는 약리학적 특성 및/또는 기타 유용한 특성(예컨대, 예를 들면 개선된 제조의 용이성 및/또는 상품의 감소된 비용)을 갖는, RANK-L에 대한 나노바디, 이를 포함하는 단백질 및/또는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 개선되고 유용한 특성은 본원의 추가의 기재내용으로부터 분명할 것이고, 예를 들면 제한없이 하기 사항중 하나 이상이 포함된다:
-1가 포맷, 다가 포맷(예를 들면 2가 포맷) 및/또는 다중특이적 포맷(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 포맷중 하나)에서 RANK-L에 대한 증가된 친화도 및/또는 결합력;
-다가 포맷(예를 들면 2가 포맷)으로 포매팅하기 위한 보다 나은 적합성;
-다중특이적 포맷(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 포맷중 하나)로 포매팅하기 위한 보다 나은 적합성;
-"인간화" 치환(본원에 정의된 바와 같음)을 위한 개선된 적합성 또는 감수성;
-1가 포맷, 다가 포맷(예를 들면 2가 포맷) 및/또는 다중특이적 포맷(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 포맷중 하나)에서 보다 낮은 면역원성;
-1가 포맷, 다가 형태(예를 들면 2가 형태) 및/또는 다중특이적 형태(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 형태중 하나)에서 증가된 안정성;
-1가 형태, 다가 형태(예를 들면 2가 형태) 및/또는 다중특이적 형태(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 형태중 하나)에서 RANK-L에 대한 증가된 특이성;
-상이한 종으로부터의 RANK-L과의 감소되거나 필요에 따라 증가된 교차-반응성; 및/또는
-1가 형태, 다가 형태(예를 들면 2가 형태) 및/또는 다중특이적 형태(예를 들면 이후 기재된 다중특이적 형태중 하나)에서 약학적 용도(예방학적 용도 및/또는 치료학적 용도를 포함함) 및/또는 진단학적 용도(제한되지 않지만 이미지화 목적을 위한 용도를 포함함)를 위해 요망되는 하나 이상의 다른 개선된 특성.
본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 바람직하게는 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)이거나, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드(본원에 정의된 바와 같음)의 일부를 형성할 수 있고, 이는 하나 이상의 본 발명의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 이는 선택가능하게는 추가로 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(모두 선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기를 통해 연결됨)을 포함한다. 예를 들면, 제한없이, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 이러한 단백질 또는 폴리펩티드에서 결합 단위로서 사용되고, 이는 결합 단위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(즉, RANK-L 이외의 하나 이상의 다른 표적에 대함)을 함유하여, 본원에 기재된 바와 같은 모든 본 발명의 1가, 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 개별적으로 제공한다. 특별히, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 본 발명의 하나 이상의 나노바디 및 선택가능하게는 하나 이상의 (다른) 나노바디(즉, RANK-L 이외의 하나 이상의 다른 표적에 대함)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되어(모두는 선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기로 연결됨), 본원에 기재된 바와 같은 모든 본 발명의 1가, 다가 또는 다중특이적 나노바디 구조물을 개별적으로 제공한다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 본질적으로 단리된 형태(본원에 정의된 바와 같음)일 수 있다.
본 발명의 나노바디에서, RANK-L에 대한 결합 부위는 바람직하게는 CDR 서열에 의해 형성된다. 선택가능하게는, 본 발명의 나노바디는, RANK-L에 대한 적어도 하나의 결합 부위에 더하여, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대하여 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 부위를 또한 함유한다. 이러한 제2 결합 부위를 도입하기 위한 방법 및 위치에 대하여, 예를 들면 문헌[Keck and Huston, Biophysical Journal, 71, October 1996, 2002-2011]; EP 제0 640 130호 및 WO 제06/07260호를 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열에 대하여 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노바디(또는 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드)는 대상에게 투여되도록 의도될 경우(예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 및/또는 진단학적 목적을 위해), 이는 바람직하게는 인간 RANK-L로 유도되는 반면; 수의학적 용도를 위해서, 이는 치료될 종으로부터의 RANK-L로 유도되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열에 의해서와 같이, 본 발명의 나노바디는 교차-반응성이거나 아닐 수 있다(즉, 2종 이상의 포유동물로부터의 RANK-L, 예컨대 인간 RANK-L 및 본원에 언급된 포유동물의 적어도 하나의 종으로부터의 RANK-L로 유도됨).
또한, 다시 본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 일반적으로 RANK-L의 임의의 항원 결정자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유닛 또는 입체구조(적용가능할 경우)로 유도될 수 있다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 나노바디(및 이를 포함하는 폴리펩티드)가 RANK-L 상의 RANK에 대한 결합 부위, 또는 RANK-L 상의 OPG에 대한 결합 부위로 유도되는 것으로 추정되고 이것이 바람직하다. 본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 바람직하게는 데노수맵의 에피토프와 중첩된 RANK-L 상의 에피토프로 유도된다.
본원에 이미 기재된 바와 같이, 나노바디의 아미노산 서열 및 구조는-제한되지 않지만-4개의 골격구조 영역 또는 "FR"(또는 때때로 "FW"로 지칭됨)로 구성되는데, 이는 당분야 및 본원에 개별적으로 "골격구조 영역 1" 또는 "FR1"; "골격구조 영역 2" 또는 "FR2"; "골격구조 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "골격구조 영역 4" 또는 "FR4"로 지칭되고, 이러한 골격구조 영역은 3개의 상보성 결정 영역(complementarity determining region) 또는 "CDR"에 의해 가로막히고, 이는 당분야에 개별적으로 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로 지칭된다. 본 발명의 나노바디에 존재하는 몇몇 바람직한 골격구조 서열 및 CDR(및 이의 조합)은 본원에 기재된 바와 같다. 다른 적합한 CDR 서열은 본원에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 비제한적이지만 바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디(에 존재하는 CDR 서열)는 다음과 같다:
-나노바디는 RANK-L에 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)(즉, 105∼1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107∼1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108∼1012 리터/몰의 회합 상수(KA))로 결합할 수 있고/있거나;
-나노바디는 RANK-L에 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 kon-속도로 결합할 수 있고/있거나;
-나노바디는 RANK-L에 1 s-1(t1 /2 = 0.69 s)∼10-6 s-1(다수일의 t1 /2에 의해 거의 비가역적 착체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 koff-속도로 결합할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디(중에 존재하는 CDR 서열)는, 본 발명의 1가 나노바디(또는 본 발명의 1개의 나노바디만 함유한 폴리펩티드)가 바람직하게는 RANK-L에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합하도록 한다.
RANK-L에 대한 본 발명의 나노바디의 친화도는 자체 공지된 방식으로, 예를 들면 본원에 언급된 KD. KA, koff 또는 kon를 측정하는 일반적 기법, 뿐만 아니라 본원에 기재된 몇몇 특이적 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 나노바디(및 이를 포함하는 폴리펩티드)의 RANK-L로의 결합에 대한 바람직한 IC50 값은 본원의 추가의 기재내용 및 실시예로부터 명백할 것이다.
바람직하지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명은 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 구성된, RANK-L에 대한 나노바디(본원에 정의된 바와 같음)에 관한 것으로, 여기서
-CDR1은
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR2는
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR3은
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열, 또는 이러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편으로 구성된 군에서 선택된다.
특별히, 이러한 바람직하지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명은 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 구성된, RANK-L에 대한 나노바디(본원에 정의된 바와 같음)에 관한 것으로, 여기서
-CDR1은
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR2는
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR3은
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열, 또는 이러한 아미노산 서열의 임의의 적합한 단편으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 아미노산 서열에 대해 본원에 일반적으로 언급된 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 b) 및/또는 c)에 따른 하나 이상의 CDR1 서열을 함유할 경우:
i) b) 및/또는 c)에 따른 이러한 CDR에서의 임의의 아미노산 치환은, 바람하게는 a)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) b) 및/또는 c)에 따른 CDR은, 바람직하게는 a)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 아미노산 결실 또는 삽입없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) b) 및/또는 c)에 따른 CDR은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하여 친화도 증진에 의해 a)에 따른 CDR 서열로부터 유도된 CDR일 수 있다.
유사하게, 본 발명의 나노바디가 e) 및/또는 f)에 따른 하나 이상의 CDR2 서열을 함유할 경우:
i) e) 및/또는 f)에 따른 이러한 CDR에서의 임의의 아미노산 치환은, 바람하게는, d)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) e) 및/또는 f)에 따른 CDR은, 바람직하게는 d)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 아미노산 결실 또는 삽입없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) e) 및/또는 f)에 따른 CDR은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하여 친화도 증진에 의해 d)에 따른 CDR 서열로부터 유도된 CDR일 수 있다.
또한, 유사하게, 본 발명의 나노바디가 h) 및/또는 i)에 따른 하나 이상의 CDR3 서열을 함유할 경우:
i) h) 및/또는 i)에 따른 이러한 CDR에서의 임의의 아미노산 치환은, 바람하게는, g)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) h) 및/또는 i)에 따른 CDR은, 바람직하게는 g)에 따른 상응하는 CDR과 비교하여, 아미노산 결실 또는 삽입없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) h) 및/또는 i)에 따른 CDR은 자체 공지된 친화도 증진의 하나 이상의 기법을 사용하여 친화도 증진에 의해 g)에 따른 CDR 서열로부터 유도된 CDR일 수 있다.
일반적으로 마지막 3개의 문단은 개별적으로 b), c), e), f), h) 또는 i)에 따른 하나 이상의 CDR1 서열, CDR2 서열 및/또는 CDR3 서열을 포함하는 본 발명의 임의의 나노바디에 적용됨을 알아야 한다.
본 발명의 나노바디중, 상기 명확히 열거된 CDR을 하나 이상 포함하는 나노바디가 특별히 바람직하고; 상기 명확히 열거된 CDR을 2개 이상 포함하는 나노바디가 보다 특별히 바람직하고; 상기 명확히 열거된 CDR을 3개 포함하는 나노바디가 가장 특별히 바람직하다.
CDR 서열의 특별히 바람직하지만 비제한적인 몇몇 조합, 뿐만 아니라 CDR 서열 및 골격구조 서열의 바람직한 조합이 하기 표 A-1에 언급되어 있고, 이는 본 발명의 다수의 바람직한(그러나 비제한적인) 나노바디에 존재하는 CDR 서열 및 골격구조 서열을 열거한다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 동일한 클론에서 발생된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(즉, 표 A-1에서 동일한 선상에 언급된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열)의 조합이 대체적으로 바람직할 것이다(그러나 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않고, 또한 표 A-1에 언급된 CDR 서열의 다른 적합한 조합을 포함함). 또한, 동일한 클론에서 발생된 CDR 서열 및 골격구조 서열(즉, 표 A-1에서 동일한 선상에 언급된 CDR 서열 및 골격구조 서열)의 조합이 대체적으로 바람직할 것이다(그러나 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않고, 또한 표 A-1에 언급된 CDR 서열 및 골격구조 서열의 다른 적합한 조합, 뿐만 아니라 예를 들어 이러한 CDR 서열 및 추가로 본원에 기재된 바와 같은 다른 적합한 골격구조 서열의 조합도 포함함).
또한, 표 A-1에 언급된 CDR의 조합을 포함하는 본 발명의 나노바디에서, 각각의 CDR은 언급된 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 CDR에 의해 대체될 수 있고; 여기서
i) 이러한 CDR에서의 임의의 아미노산 치환은, 바람직하게는, 표 A-1에 언급된 상응하는 CDR 서열과 비교하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) 임의의 이러한 CDR 서열은, 바람직하게는, 표 A-1에 언급된 상응하는 CDR 서열과 비교하여, 아미노산 결실 또는 삽입없이 단지 아미노산 치환만을 함유하고/하거나;
iii) 임의의 이러한 CDR 서열은 자체 공지된 친화도 증진을 위한 기법에 의해, 특별히 표 A-1에 언급된 상응하는 CDR 서열로부터 출발하여 유도된 CDR이다.
그러나, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 표 A-1에 언급된 CDR 서열(의 조합), 뿐만 아니라 CDR 서열 및 골격구조 서열(의 조합)이 일반적으로 바람직할 것이다.
[표 A-1a]
CDR 서열의 바람직한 조합, 골격구조 서열의 바람직한 조합, 및 골격구조 및 CDR 서열의 바람직한 조합("ID"는 첨부된 서열 목록에서 서열 번호를 지칭함)
Figure 112009080144011-pct00003
[표 A-1b]
Figure 112009080144011-pct00004
[표 A-1c]
Figure 112009080144011-pct00005
[표 A-1d]
Figure 112009080144011-pct00006
[표 A-1e]
Figure 112009080144011-pct00007
따라서, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 적어도 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와, 개별적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 "서열 동일성"(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와 개별적으로 3개, 2개 또는 단지 1개의 "아미노산 차이(들)"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
이와 관련하여, "적합하게 선택된"이란, 적용가능한 경우, 개별적으로, CDR1 서열이 적합한 CDR1 서열(즉, 상기 정의된 바와 같음)로부터 선택되고, CDR2 서열이 적합한 CDR2 서열(즉, 상기 정의된 바와 같음)로부터 선택되고, CDR3 서열이 적합한 CDR3 서열(즉, 상기 정의된 바와 같음)로부터 선택됨을 의미한다. 보다 특별히, CDR 서열은 바람직하게는 본 발명의 나노바디가 RANK-L에 본원에 정의된 바와 같은 친화도(추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로 적절히 측정되고/되거나 표현됨)로 결합되도록 선택된다.
특별히, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR3 서열은 표 A-1에 열거된 CDR3 서열로 구성된 그룹; 표 A-1에 열거된 CDR3 서열중 적어도 하나와, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열로 구성된 그룹; 및/또는 표 A-1에 열거된 CDR3 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 2개 이상은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와, 개별적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 "아미노산 차이(들)"를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
특별히, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR3 서열은 표 A-1에 열거된 CDR3 서열로 구성된 그룹; 또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR3 서열중 적어도 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열로 구성된 군에서 선택되고; 존재하는 CDR1 및 CDR2 서열중 하나 이상은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 그룹; 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열중 적어도 하나와, 개별적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 모두는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와, 개별적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 적어도 하나는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다. 바람직하게는, 이러한 양태에서, 존재하는 다른 2개의 CDR중 적어도 하나, 또는 바람직하게는 둘다가 개별적으로 표 A-1에 열거된 상응하는 CDR 서열중 적어도 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 상응하는 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
특별히, 본 발명의 나노바디에서, 적어도 존재하는 CDR3 서열은 표 A-1에 열거된 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다. 바람직하게는, 이러한 양태에서, 존재하는 CDR1 및 CDR2 서열중 적어도 하나, 바람직하게는 둘다가 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열과 개별적으로 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 그룹; 및/또는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열중 2개 이상은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다. 바람직하게는, 이러한 양태에서, 존재하는 나머지 CDR 서열은 표 A-1에 열거된 상응하는 CDR 서열중 적어도 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 구성된 그룹; 및/또는 표 A-1에 열거된 상응하는 서열중 적어도 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
특별히, 본 발명의 나노바디에서, 적어도 CDR3 서열은 표 A-1에 열거된 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택되고, CDR1 서열 또는 CDR2 서열은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1 및 CDR2 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다. 바람직하게는, 이러한 양태에서, 존재하는 나머지 CDR 서열은 표 A-1에 열거된 상응하는 CDR 서열중 적어도 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 구성된 그룹; 및/또는 표 A-1에 열거된 상응하는 CDR 서열과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서, 존재하는 3개의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 모두는 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택된다.
또한, 일반적으로, 표 A-1에 열거된 CDR의 조합(즉, 표 A-1에서 동일한 선상에 언급된 것들)이 바람직하다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 나노바디중의 CDR이 표 A-1에 언급된 CDR 서열이거나, 표 A-1에 열거된 CDR 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 구성된 그룹; 및/또는 표 A-1에 열거된 CDR 서열과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택되는 경우, 나머지 CDR중 적어도 하나, 바람직하게는 둘다는 표 A-1에서의 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(표 A-1에서 동일한 선상에 언급됨)로부터 적합하게 선택되거나, 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 CDR 서열로 구성된 그룹; 및/또는 동일한 조합에 속하는 CDR 서열(들)과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 CDR 서열로 구성된 군에서 적합하게 선택되는 것이 바람직하다. 상기 문단에 지시된 다른 바람직한 사항은 또한 표 A-1에 언급된 CDR의 조합에 적용된다.
따라서, 비제한적인 예에 의해, 본 발명의 나노바디는 예를 들면 표 A-1에 언급된 CDR1 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열, 표 A-1에 언급된(그러나 상이한 조합에 속함) CDR2 서열중 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열, 및 CDR3 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 바람직한 나노바디는 예를 들면: (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; 표 A-1에 언급된(그러나 상이한 조합에 속함) CDR2중 하나와 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열; 및 표 A-1에 언급된(그러나 상이한 조합에 속함) CDR3 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열; 또는 (2) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; CDR2 서열; 및 표 A-1에 열거된 CDR3 서열중 하나; 또는 (3) CDR1 서열; 표 A-1에 열거된 CDR2 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR2 서열; 및 CDR2 서열과 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 몇몇 나노바디는 예를 들면: (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; 동일한 조합에 속하는, 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열; 및 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열; (2) CDR1 서열; 표 A-1에 열거된 CDR 2 및 표 A-1에 열거된 CDR3 서열(여기서 CDR2 서열 및 CDR3 서열은 상이한 조합에 속할 수 있음)을 포함한다.
본 발명의 보다 바람직한 몇몇 나노바디는 예를 들면: (1) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열중 하나와 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR1 서열; 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열; 및 상이한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열; 또는 (2) 표 A-1에 언급된 CDR1 서열; 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이를 갖는 CDR2 서열; 및 동일하거나 상이한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 나노바디는 예를 들면 표 A-1에 언급된 CDR1 서열, 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR2 서열과 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 CDR2 서열, 및 동일한 조합에 속하는 표 A-1에 언급된 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 나노바디에서, 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 개별적으로 표 A-1에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조합중 하나로부터 적합하게 선택된다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에 따라서, (a) CDR1은 1∼12개의 아미노산 잔기, 대체적으로 2∼9개의 아미노산 잔기, 예컨대 5, 6 또는 7개의 아미노산의 길이를 갖고/갖거나; (b) CDR2는 13∼24개의 아미노산 잔기, 대체적으로 15∼21개의 아미노산 잔기, 예컨대 16 및 17개의 아미노산 잔기의 길이를 갖고/갖거나; (c) CDR3은 2∼35개의 아미노산 잔기, 대체적으로 3∼30개의 아미노산 잔기, 예컨대 6∼23개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명은 CDR 서열(본원에 정의된 바와 같음)이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 이상의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 나노바디에 관한 것이다.
일반적으로, 상기 CDR 서열을 갖는 나노바디는 본원에 추가로 기재된 바와 같고, 바람직하게는 또한 본원에 추가로 기재된 바와 같은 골격구조 서열을 갖는다. 따라서, 예를 들면 본원에 언급된 바와 같이, 이러한 나노바디는 자연 발생 나노바디(임의의 적합한 종으로부터), 자연 발생 VHH 서열(즉, 카멜리드의 적합한 종으로부터) 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열 또는 나노바디, 예컨대 제한되지 않지만 부분적으로 인간화된 나노바디 또는 VHH 서열, 완전히 인간화된 나노바디 또는 VHH 서열, 카멜화된 중쇄 가변 도메인 서열, 뿐만 아니라 본원에 언급된 기법에 의해 수득되어진 나노바디일 수 있다.
따라서, 구체적이지만 비제한적인 하나의 양태에서, 본 발명은 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 구성된 인간화된 나노바디에 관한 것으로, 여기서 CDR1∼CDR3은 본원에 정의된 바와 같고, 상기 인간화된 나노바디는 적어도 하나의 인간화 치환(본원에 정의된 바와 같음), 특별히 적어도 하나의 인간화 치환을 적어도 하나의 그의 골격구조 서열(본원에 정의된 바와 같음)에 포함한다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명은 CDR 서열이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95% 이상의 아미노산 동일성, 또는 보다 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디에 관한 것이다. 아미노산 동일성의 이러한 정도는 예를 들면 상기 나노바디와 서열 번호 560∼621의 하나 이상의 서열 사이의 아미노산 동일성의 정도를 결정함으로써(본원에 기재된 방식으로) 결정될 수 있고, 여기서 골격구조 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 이러한 나노바디는 본원에 추가로 기재될 수 있다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 560∼621로 구성된 그룹, 또는 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 나노바디에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 바람직하지만 비제한적인 양태는, 상응하는 천연 VHH 서열과 비교하여, 적어도 하나의 인간화 치환(본원에 정의된 바와 같음), 특별히 적어도 하나의 인간화 치환을 적어도 하나의 그의 골격구조 서열(본원에 정의된 바와 같음)에 포함하는, 서열 번호 560∼621의 나노바디의 인간화된 변형체에 관한 것이다. 이러한 인간화된 변형체의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 서열 번호 730∼757 및 765의 인간화된 나노바디이다. 따라서, 본 발명은 또한 서열 번호 730∼757 및 765로 구성된 그룹, 또는 서열 번호 730∼757 및 765의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 인간화된 나노바디에 관한 것이다(여기서 후자 그룹의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열은, 이들이 서열 번호 730∼757 및 765의 상응하는 서열에 존재하는 적어도 하나의 인간화 치환을 보유하는 한, 서열 번호 730∼757 및 765의 상응하는 서열에 비하여 보다 많거나 보다 적은 수의 인간화 치환을 포함할 수 있음).
본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 본 발명의 폴리펩티드의 몇몇 바람직한 비제한적인 예는 서열 번호 622∼729, 759∼762 및 766∼789에 제시된다.
본원에 "바람직함"(또는 보다 바람직함", "보다 더 바람직함" 등)으로 언급된 나노바디가 또한 본원에 기재된 폴리펩티드에 사용하기에 "바람직함"(또는 "보다 바람직함", "보다 더 바람직함" 등)은 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 "바람직한" 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 폴리펩티드가 일반적으로 바람직하고, 본 발명의 하나 이상의 "보다 바람직한" 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 폴리펩티드가 보다 바람직할 것이다.
일반적으로, 단일 나노바디(예컨대 본 발명의 단일 나노바디)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드는 "1가" 단백질 또는 폴리펩티드로서 또는 "1가 구조물"로서 본원에 지칭될 것이다. 2개 이상의 나노바디(예컨대 본 발명의 2개 이상의 나노바디 또는 본 발명의 하나 이상의 나노바디 및 하나 이상의 다른 나노바디)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 및 폴리펩티드는 "다가" 단백질 또는 폴리펩티드로서, 또는 "다가 구조물"로서 지칭될 것이고, 이들은 본 발명의 상응하는 1가 나노바디와 비교하여 특정한 이점을 제공한다. 이러한 다가 구조물의 몇몇 비제한적인 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
구체적이지만 비제한적인 한 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 2개 이상의 나노바디, 예컨대 본 발명의 2개 또는 3개의 나노바디를 포함하고 이로 본질적으로 구성된다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 다가 구조물은 본 발명의 단일 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 특정한 이점, 예컨대 RANK-L에 대한 크게 개선된 결합력을 제공할 수 있다. 이러한 다가 구조물은 본원의 기재내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고, 이러한 다가 나노바디 구조물의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 서열 번호 622∼693, 761∼762 및 766∼773(2가) 및 서열 번호 694∼729 및 759∼760(3가)의 구조물이다.
또다른 특이적이지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 나노바디 및 적어도 하나의 다른 결합 단위(즉, 또다른 에피토프, 항원, 표적, 단백질 또는 폴리펩티드에 대함)(이는 바람직하게는 또한 나노바디임)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 또한 본원에 "다중특이적" 단백질 또는 폴리펩티드로서, 또는 "다중특이적 구조물"로서 지칭되고, 이들은 본 발명의 상응하는 1가 나노바디에 비하여 특정한 이점을 제공할 수 있다(몇몇 바람직하지만 비제한적인 다중특이적 구조물에 대한 본원의 추가의 논의로부터 명백한 바와 같음). 이러한 다중특이적 구조물은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고; 이러한 다중특이적 나노바디 구조물의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 서열 번호 694∼729 및 759∼790의 구조물이다.
또다른 특이적이지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 나노바디, 선택가능하게는 하나 이상의 추가의 나노바디, 및 적어도 하나의 원하는 특성을 본 발명의 나노바디 및/또는 생성된 융합 단백질에 부여하는 적어도 하나의 다른 아미노산 서열(예컨대 단백질 또는 폴리펩티드)를 포함하거나 이로 본질적으로 구성된다. 다시, 이러한 융합 단백질은 본 발명의 상응하는 1가 나노바디에 비하여 특정한 이점을 제공할 수 있다. 이러한 아미노산 서열 및 이러한 융합 구조물의 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
또한 둘 이상의 상기 양태를 조합하여, 예를 들면 2개의 본 발명의 나노바디 및 하나의 다른 나노바디, 및 선택가능하게는 하나 이상의 다른 아미노산 서열을 포함하는 3가 이특이적 구조물을 제공할 수 있다. 추가로, 이러한 구조물의 비제한적인 예, 뿐만 아니라 본 발명에 있어서 특별히 바람직한 몇몇 구조물은 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
상기 구조물에서, 하나 이상의 나노바디 및/또는 다른 아미노산 서열은 서로 직접 연결되고/되거나, 하나 이상의 연결기 서열을 경유하여 서로 연결된다. 이러한 연결기의 적합하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 한 구체적인 양태에서, 본 발명의 나노바디, 또는 본 발명의 적어도 하나의 나노바디를 포함하는 본 발명의 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드는, 본 발명의 상응하는 아미노산 서열에 비하여, 증가된 반감기를 가질 수 있다. 이러한 나노바디, 화합물 및 폴리펩티드의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 반감기를 증가시키도록 화학적으로 개질된(예를 들면 페그화에 의해) 본 발명의 나노바디 서열 또는 폴리펩티드; 혈청 단백질(예컨대 혈청 알부민)에 결합하기 위한 적어도 하나의 부가 결합 부위를 포함하는 본 발명의 아미노산 서열; 또는 본 발명의 나노바디의 반감기를 증가시키는 적어도 하나의 부분구조(특별히 적어도 하나의 아미노산 잔기)에 연결된 적어도 하나의 본 발명의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 반감기-증진 부분구조 또는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 예는 본원의 추가의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고; 예를 들면, 제한없이, 본 발명의 하나 이상의 나노바디가 하나 이상의 혈청 단백질 또는 이의 단편(예컨대 혈청 알부민 또는 이의 적합한 단편), 또는 혈청 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 단위(예컨대, 예를 들면, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 예컨대 IgG, 또는 트랜스페린에 결합할 수 있는 나노바디 또는 (단일)도메인 항체)에 적합하게 연결되는 폴리펩티드; 본 발명의 나노바디가 Fc 부분(예컨대 인간 Fc) 또는 이의 적합한 부분 또는 단편에 연결된 폴리펩티드(예를 들면 본 발명은 나노바디가 Fc 부분에 연결기에 의해 상이한 크기로 적합하게 연결되어 RANK-L의 분자내 및/또는 분자간 결합을 허용하는 폴리펩티드를 구현함); 또는 본 발명의 하나 이상의 나노바디가 혈청 단백질에 결합될 수 있는 하나 이상의 작은 단백질 또는 펩티드(예컨대, 제한없이 WO 제91/01743호, WO 제01/45746호, WO 제02/076489호 및 2006년 12월 5일자로 출원된 "혈청 단백질에 결합가능한 펩티드"란 명칭의 미국 가특허 출원(Ablynx N.V.)(또한 PCT/EP2007/063348호 참조)에 기재된 단백질 및 펩티드)에 적합하게 연결되는 폴리펩티드가 포함된다.
다시, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이러한 나노바디, 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 추가의 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위, 예컨대 하나 이상의 추가의 아미노산 서열 및 특별히 하나 이상의 추가의 나노바디(즉, RANK-L로 유도되지 않음)를 함유하여 3가의 다중특이적 나노바디 구조물을 제공할 수 있다.
일반적으로, 바람직하게는 반감기가 증가된 본 발명의 나노바디(이를 포함하는 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드)는 본 발명의 상응하는 아미노산 서열 자체의 반감기에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 초과의 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들면, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 나노바디, 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드는, 본 발명의 상응하는 아미노산 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 또는 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 더 초과하여 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명의 이러한 나노바디, 화합물, 구조물 또는 폴리펩티드는 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상의 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 화합물 또는 폴리펩티드는 5일 이상(예컨대 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 또다른 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 생성된 폴리펩티드가 혈뇌 장벽을 가로지르도록 허용하는 하나 이상의(예컨대 2개 또는 바람직하게는 1개의) 아미노산 서열에 연결된(선택가능하게는 하나 이상의 적합한 연결기 서열을 경유하여) 하나 이상의(예컨대 2개 또는 바람직하게는 1개의) 본 발명의 나노바디를 포함한다. 특별히, 본 발명의 생성된 폴리펩티드가 혈뇌 장벽을 가로지르도록 허용하는 상기 하나 이상의 아미노산 서열은 하나 이상의(예컨대 2개 또는 바람직하게는 1개의) 나노바디, 예컨대 WO 제02/057445호에 기재된 나노바디(이의 FC44 (WO 제06/040153호의 서열 번호 189) 및 FC5(WO 제06/040154호의 서열 번호 190)가 바람직한 예임)일 수 있다.
특별히, 본 발명의 하나 이상의 나노바디를 포함하는 폴리펩티드는, 이들이:
-RANK-L에 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)(즉, 105∼1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107∼1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108∼1012 리터/몰의 회합 상수(KA))로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 kon-속도로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 1 s-1(t1 /2 = 0.69 s)∼10-6 s-1(다수일의 t1 /2에 의해 거의 비가역적 착체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 koff-속도로 결합하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 아미노산 서열을 1개만 함유하는 폴리펩티드는 RANK-L에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합하는 것이 바람직하다. 이러한 양태에서, 본 발명의 2개 이상의 나노바디를 함유하는 폴리펩티드가, 본 발명의 아미노산 서열을 1개만 함유하는 폴리펩티드에 비하여 증가된 결합력으로 RANK-L에 결합할 수 있음이 숙련가에게 명백할 것이다.
본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리펩티드의 RANK-L로의 결합을 위한 몇몇 바람직한 IC50 값은 본원의 추가의 기재내용 및 실시예로부터 명백할 것이다.
본 발명의 이러한 바람직한 양태에 따른 다른 폴리펩티드는 예를 들면 서열 번호 622∼729, 759∼762 및 766∼773의 하나 이상의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 이상의 "서열 동일성"(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고, 상기 아미노산 서열내에 포함된 나노바디는 바람직하게는 본원에 추가로 정의된 바와 같다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 아미노산 서열(예컨대 본 발명의 나노바디) 또는 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 다시, 일반적으로 본 발명의 핵산에 대해 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 핵산은 본원에 정의된 바와 같은 유전자 구조물의 형태일 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열(예컨대 나노바디) 및/또는 이를 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 발현하거나 발현가능하고/하거나; 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 또는 숙주 세포의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 또다른 양태는 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 적어도 하나의 본 발명의 핵산, 및 선택가능하게는 하나 이상의 자체 공지된 이러한 조성물의 추가의 성분(조성물의 의도된 용도에 따라)을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다. 이러한 생성물 또는 조성물은 예를 들면 약학적 조성물(본원에 기재된 바와 같음), 수의학적 조성물, 또는 진단 용도를 위한 생성물 또는 조성물(또한 본원에 기재된 바와 같음)일 수 있다. 이러한 생성물 또는 조성물의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물을 제조 또는 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명은 추가로 RANK-L과 연관된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 본원에 기재된 아미노산 서열, 화합물, 구조물, 폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포, 생성물 및 조성물의 적용성 및 용도, 뿐만 아니라 방법에 관한 것이다. 바람직하지만 비제한적인 몇몇 적용성 및 용도는 본원의 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 다른 양태, 실시양태, 이점 및 적용성은 또한 이후 추가의 기재내용으로부터 명백할 것이다.
일반적으로, 본원에서 사용된 "나노바디"라는 용어는 그의 가장 넓은 의미에서 구체적인 생물학적 공급원 또는 구체적인 제조 방법에 제한되지 않는다. 예를 들면, 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 나노바디는 일반적으로: (1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인을 단리함으로써; (2) 자연 발생 VHH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써; (3) 자연 발생 VHH 도메인의 "인간화"(본원에 기재된 바와 같음)에 의해, 또는 이러한 인간화된 VHH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (4) 임의의 동물 종, 특별히 포유동물 종, 예컨대 인간으로부터의 자연 발생 VH 도메인의 "카멜화"(본원에 기재된 바와 같음)에 의해 또는 이러한 카멜화된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (5) 상기 문헌(Ward et al)에 기재된 바와 같은 "도메인 항체" 또는 "Dab"의 "카멜화"에 의해, 또는 이러한 카멜화된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해; (6) 자체 공지된 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하는 합성 또는 반합성 기법을 사용함으로써; (7) 자체 공지된 핵산 합성을 위한 기법을 사용하여 나노바디를 코딩하는 핵산을 제조한 다음 이렇게 수득된 핵산을 발현시킴으로써; 및/또는 (8) 하나 이상의 선행 수단의 임의의 조합에 의해 수득될 수 있다. 상기를 수행하기 위한 적합한 방법 및 기법은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 본원에 보다 상세히 기재된 방법 및 기법을 포함한다.
나노바디의 한 바람직한 부류는 RANK-L에 대한 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인에 상응한다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 VHH 서열은 일반적으로 RANK-L에 의해 일종의 카멜리드를 적합하게 면역화하고(즉, RANK-L에 대한 면역 반응 및/또는 중쇄 항체를 일으키도록), 상기 카멜리드로부터 적합한 생물학적 샘플(예컨대 혈액 샘플, 혈청 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 수득하고, 상기 샘플로부터 출발하여 자체 공지된 임의의 적합한 기법을 사용하여 RANK-L에 대한 VHH 서열을 생성함으로써 생성되거나 수득될 수 있다.
다르게는, RANK-L에 대한 이러한 자연 발생 VHH 도메인은 카멜리드 VHH 서열의 천연 라이브러리로부터, 예를 들면 이러한 라이브러리를 RANK-L, 또는 적어도 하나의 이의 부분, 단편, 항원 결정자 또는 에피토프에 의해 자체 공지된 하나 이상의 스크리닝 기법을 사용하여 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 이러한 라이브러리 및 기법은 예를 들면 WO 제99/37681호, WO 제01/90190호, WO 제03/025020호 및 WO 제03/035694호에 기재되어 있다. 다르게는, 천연 VHH 라이브러리로부터 유도된 개선된 합성 또는 반합성 라이브러리가 사용될 수 있고, 예컨대, 예를 들면 WO 제00/43507호에 기재된 바와 같이, 랜덤 돌연변이생성 및/또는 CDR 셔플링(shuffling)과 같은 기법에 의해 천연 VHH 라이브러리로부터 수득된 VHH 라이브러리이다.
따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 RANK-L에 대한 나노바디를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 상기 방법은:
a) 나노바디의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 나노바디 서열을 위한 나노바디 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
c) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계를 포함한다.
이러한 방법에서, 나노바디 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 나노바디 서열의 천연 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 나노바디 서열의 합성 또는 반합성 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 증진을 거친 나노바디 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
이러한 방법의 한 바람직한 양태에서, 나노바디 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 나노바디 서열의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리, 특별히 RANK-L 또는 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 이의 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 일종의 카멜리드로부터 유도되어진, VHH 서열의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, 나노바디 또는 VHH 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물체(예컨대 효모) 상에 표시되어, 예컨대 스크리닝을 촉진시킨다. 나노바디 서열(의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)의 표시 및 스크리닝을 위해 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들면 본원의 추가의 개시내용에 기초하여, 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 WO 제03/054016호 및 문헌[Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
또다른 양태에서, 나노바디 서열을 생성하기 위한 방법은:
a) 면역글로불린 서열을 발현하는 일종의 카멜리드로부터 유도된 세포의 콜렉션 또는 샘플을 제공하는 단계;
b) (i) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 면역글로불린 서열을 발현하는 세포; 및 (ii) 중쇄 항체를 발현하는 세포를 위한 세포의 상기 콜렉션 또는 샘플을 스크리닝하는 단계(여기서 상기 하위단계 (i) 및 (ii)는 본질적으로 단일 스크리닝 단계로서 또는 2개의 별도의 스크리닝 단계로서 임의의 적합한 순서로 수행되어, RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 중쇄 항체를 발현하는 적어도 하나의 세포를 제공함); 및
c) (i) 상기 세포로부터 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 단리하거나, (ii) 상기 세포로부터 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 코딩하는 핵산 서열을 단리한 후 상기 VHH 도메인을 발현시키는 단계를 포함한다.
이러한 양태에 따른 방법에서, 세포의 콜렉션 또는 샘플은 예를 들면 B-세포의 콜렉션 또는 샘플일 수 있다. 또한, 이러한 방법에서, 세포의 샘플은 RANK-L 또는 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 카멜리드로부터 유도되될 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법은, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면 EP 제0 542 810호, WO 제05/19824호, WO 제04/051268호 및 WO 제04/106377호를 참조한다. 단계 b)의 스크리닝은 바람직하게는 유세포분석 기법, 예컨대 FACS를 사용하여 수행된다. 이에 대하여, 예를 들면 문헌[Lieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820]을 참조한다. 특별히 국제 특허 출원 WO 제06/079372호(Ablynx N.V.)에 기재된 소위 "나노클론(등록상표)" 기법을 참조한다.
또다른 양태에서, RANK-L에 대한 아미노산 서열을 생성하는 방법은 적어도:
a) 중쇄 항체 또는 나노바디 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖는 중쇄 항체 또는 나노바디 서열을 코딩하는 핵산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산을 단리한 후, 상기 중쇄 항체에 존재하는 VHH 서열을 발현시키거나, 또는 상기 나노바디 서열을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법에서, 중쇄 항체 또는 나노바디 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 예를 들면 중쇄 항체 또는 VHH 서열의 천연 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 나노바디 서열의 합성 또는 반합성 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화도 증진을 거친 나노바디 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
이러한 방법의 한 바람직한 양태에서, 아미노산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 RANK-L 또한 이에 기초하거나 이로부터 유도된 적합한 항원 결정자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 카멜리드로부터 유도되어진 VHH 서열 또는 중쇄 항체를 코딩하는 핵산 서열의 면역 세트, 콜렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 한 특별한 양태에서, 상기 항원 결정자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, 뉴클레오티드 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물체(예컨대 효모) 상에 표시되어, 예컨대 스크리닝을 촉진시킨다. 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리)의 표시 및 스크리닝을 위해 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들면 본원의 추가의 개시내용에 기초하여, 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 WO 제03/054016호 및 문헌[Hoogenboom in Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]을 참조한다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재된 방법의 스크리닝 단계는 또한 선택 단계로서 수행될 수 있다. 따라서, 본 설명에 사용되는 "스크리닝"이라는 용어는 선택, 스크리닝, 또는 선택 및/또는 스크리닝 기법의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 또한, 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리가 사용될 경우, 이는 임의의 적합한 수의 서열, 예컨대 1, 2, 3 또는 약 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 104, 105, 106, 107, 108개 이상의 서열을 함유할 수 있다.
또한, 아미노산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리에서 서열의 하나 이상 또는 모두는, 유리적(rational), 또는 반-실험적(semi-empirical) 접근, 예컨대 컴퓨터 모델링 기법 또는 생물정역학(biostatics) 또는 이터마이닝(datamining) 기법에 의해 수득되거나 정의될 수 있다.
추가로, 이러한 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 또다른 것으로부터의 변형체(예를 들어 고안된 포인트 돌연변이 또는 랜덤화된 위치에 의해)인 1개 또는 2개 이상의 서열을 포함할 수 있고, 자연적으로 다변화된 서열의 다양한 세트으로부터 유도된 다중 서열(예를 들어 면역 라이브러리), 또는 다양한 서열의 임의의 다른 공급원(예를 들면 문헌[Hoogenboom et al, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005 and Binz et al, Nat Biotechnol 2005, 23:1247]에 기재된 바와 같음)을 절충한다. 서열의 이러한 세트, 콜렉션 또는 라이브러리는 파지 입자, 리보솜, 박테리아, 효모 세포, 포유동물 세포의 표면 상에 표시되고, 이들 담체내에 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 이는 이러한 세트, 콜렉션 또는 라이브러리가 선택 절차를 받을 수 있도록 하여 본 발명의 원하는 아미노산 서열을 단리한다. 보다 일반적으로, 서열이 적합한 숙주나 숙주 세포 상에 표시될 경우, 우선 원하는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 또는 숙주 세포로부터 단리하고, 이어서 적합한 숙주 유기체에서 상기 뉴클레오티드 서열을 적합하게 발현시킴으로써 원하는 서열을 수득하는 것도 가능하다(관습적임). 다시, 이는 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다.
RANK-L에 대한 VHH 서열 또는 나노바디 서열을 수득하기 위한 또다른 기법은 중쇄 항체를 발현할 수 있는 유전자도입 포유동물을 적합하게 면역화하는 단계(즉, RANK-L에 대한 중쇄 항체 및/또는 면역 반응를 일으킴), 상기 VHH 서열 또는 나노바디 서열(을 코딩하는 핵산 서열)을 함유하는 상기 유전자도입 포유동물로부터 적합한 생물학적 샘플(예컨대 혈액 샘플, 혈장 샘플 또는 B-세포의 샘플)을 수득하는 단계, 및 상기 샘플로부터 출발하여 자체 공지된 임의의 적합한 기법(예컨대 본원에 기재된 임의의 방법 또는 하이브리도마(hybridoma) 기법)에 의해 RANK-L에 대한 VHH 서열을 생성시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 이러한 목적을 위해, WO 제02/085945호, WO 제04/049794호 및 WO 제06/008548호, 및 문헌[Janssens et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Oct 10;103(41):15130-5]에 기재된 중쇄 항체-발현 마우스 및 추가의 방법과 기법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 중쇄 항체 발현 마우스는 임의의 적합한 (단일)가변 도메인, 예컨대 천연 공급원으로부터의 (단일)가변 도메인(예를 들어 인간 (단일)가변 도메인, 카멜리드 (단일)가변 도메인 또는 상어 (단일)가변 도메인), 뿐만 아니라 예를 들면 합성 또는 반합성 (단일)가변 도메인을 갖는 중쇄 항체를 발현할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법, 또는 다르게는 상기 방법중 하나 및 추가로 적어도 상기 VHH 서열 또는 나노바디 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 상기 VHH 서열 또는 나노바디 서열을 자체 공지된 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 발현시키거나 합성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 VHH 서열 또는 나노바디 서열에 관한 것이다.
본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 나노바디의 특별히 바람직한 부류는 자연 발생 VHH 서열 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "인간화된"(즉, 상기 자연 발생 VHH 서열(및 특별히 골격구조 서열)의 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 서열을 인간으로부터의 종래의 4-쇄 항체(예컨대 상기 지시된 바와 같음)로부터의 VH 도메인중의 상응하는 위치(들)에서 발생되는 하나 이상의 아미노산 서열과 대체시킴으로써) 아미노산 서열을 갖는 나노바디를 포함한다. 이는, 예를 들면 본원에 지칭된 인간화에 대한 본원의 추가의 기재내용 및 선행 기술에 기초하여, 숙련가에게 명백할, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 다시, 본 발명의 이러한 인간화된 나노바디는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로(즉, 상기 (1)∼(8)에 지시된 바와 같음) 수득될 수 있고, 따라서 이는 자연 발생 VHH 도메인을 출발 물질로서 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득되어진 폴리펩티드에 엄격히 제한되지 않음을 주지해야 한다.
본 발명의 나노바디의 또다른 특별히 바람직한 부류는 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "카멜화된"(즉, 종래의 4-쇄 항체로부터의 자연 발생 VH 도메인의 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인중의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산으로 대체함으로써) 아미노산 서열을 갖는 나노바디를 포함한다. 이는, 본원의 추가의 기재내용에 기초하여, 숙련가에게 명백할, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 "카멜화" 치환은 바람직하게는 VH-VL 계면을 형성하고/하거나 이에 존재하는 아미노산 위치에서, 및/또는 소위 카멜리드 인증 잔기(본원에 정의된 바와 같음)에서 삽입된다(예를 들면 WO 제94/04678호 및 상기 문헌[Davies and Riechmann (1994 and 1996)] 참조). 바람직하게는, 카멜화된 나노바디를 생성하거나 고안하기 위한 출발 물질 또는 출발 지점으로서 사용되는 VH 서열은 바람직하게는 포유동물로부터의 VH 서열, 보다 바람직하게는 인간의 VH 서열, 예컨대 a VH3 서열이다. 그러나, 이러한 본 발명의 카멜화된 나노바디는 임의의 적합한 방식으로(즉, 상기 (1)∼(8)에 지시된 바와 같음) 수득될 수 있고, 따라서 이는 자연 발생 VH 도메인을 출발 물질로서 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 수득되어진 폴리펩티드에 엄격히 제한되지 않음을 주지해야 한다.
예를 들면, 다시 본원에 추가로 기재된 바와 같이, "인간화" 및 "카멜화" 둘다는 개별적으로 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 이어서 신규 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 "인간화된" 또는 "카멜화된" 나노바디를 개별적으로 코딩하는 방식으로 상기 뉴클레오티드 서열중의 하나 이상의 코돈을 자체 공지된 방식으로 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서 이러한 핵산은 자체 공지된 방식으로 발현되어 본 발명의 원하는 나노바디를 제공할 수 있다. 다르게는, 개별적으로, 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 원하는 인간화되거나 카멜화된 본 발명의 나노바디의 아미노산 서열이 고안되고, 이어서 자체 공지된 펩티드 합성을 위한 기법을 사용하여 새로이 합성될 수 있다. 또한, 개별적으로, 자연 발생 VHH 도메인 또는 VH 도메인의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드에 기초하여, 인간화되거나 카멜화된 본 발명의 원하는 나노바디를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 고안되고, 이어서 자체 공지된 핵산 합성을 위한 기법을 사용하여 새로이 합성될 수 있고, 이후 이렇게 수득된 핵산은 자체 공지된 방식으로 발현되어 본 발명의 원하는 나노바디를 제공할 수 있다.
자연 발생 VH 서열 또는 바람직하게는 VHH 서열로부터 출발하여 본 발명의 나노바디 및 이를 코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다른 적합한 방법 및 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 하나 이상의 자연 발생 VH 서열의 하나 이상의 부분(예컨대 하나 이상의 FR 서열 및/또는 CDR 서열), 하나 이상의 자연 발생 VHH 서열의 하나 이상의 부분(예컨대 하나 이상의 FR 서열 또는 CDR 서열), 및/또는 하나 이상의 합성 또는 반합성 서열을 적합한 방식으로 조합함을 포함하여, 본 발명의 나노바디 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산(이는 이어서 적합하게 발현됨)을 제공한다. VHH 서열 또는 나노바디의 골격구조 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 본원의 개시내용 및/또는 본원에 인용된 추가의 선행 기술에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이고(다르게는 본원에 기재된 방법을 사용하여 수득된 뉴클레오티드 서열로부터 출발하여 PCR에 의해 수득될 수 있음), 원하는 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적합하게 조합하여(예를 들면, 중첩 프라이머를 사용하는 PCR 조립에 의해) 본 발명의 나노바디를 코딩하는 핵산을 제공할 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, 나노바디는 특별히 하나 이상의 골격구조 서열중의 하나 이상의 "인증 잔기"(본원에 기재된 바와 같음)의 존재를 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 한 바람직하지만 비-제한적인 양태에 따라서, 나노바디는 그의 가장 넓은 의미로 일반적으로:
a) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q임);
b) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 하전된 아미노산(본원에 정의된 바와 같음) 또는 시스테인 잔기이고, 위치 44는 바람직하게는 E임); 및/또는
c) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고, 특별히 R 및 S로 구성된 군에서 선택됨)을 포함하는 폴리펩티드로서 정의될 수 있다.
따라서, 제1의 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서,
a) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고/이거나;
b) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기이고, 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 E이고/이거나;
c) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고, 특별히 R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
특별히, 나노바디는 그의 가장 넓은 의미로 일반적으로:
a) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q임); 및/또는:
b) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 E이고, 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R임); 및/또는
c) 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열(여기서, 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고, 특별히 R 및 S로 구성된 군에서 선택됨)을 포함하는 폴리펩티드로서 정의될 수 있다.
따라서, 바람직하지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서,
a) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고/이거나;
b) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 E이고, 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R이고/이거나;
c) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고, 특별히 R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
특별히, RANK-L에 대한 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서,
FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고,
CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서,
a) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고/이거나;
b) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 E이고, 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R이고/이거나;
c) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고, 특별히 R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
특별히, 본 발명의 바람직하지만 비제한적인 한 양태에 따라서, 나노바디는 일반적으로 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 가로막힌 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서 정의될 수 있고, 여기서
a-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
a-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되고;
a-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 W 및 R로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 W이고;
a-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이거나; 또는
여기서:
b-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
b-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R이고;
b-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;바람직하게는 W이고;
b-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 Q이거나; 또는
여기서:
c-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, Q, R, S 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
c-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되고;
c-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;
c-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 Q이거나; 또는
여기서:
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
따라서, 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
a-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, G, Q, R, S 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
a-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되고;
a-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 W 및 R로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 W이고;
a-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고;
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
b-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
b-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 R이고;
b-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;바람직하게는 W이고;
b-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 Q이고;
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
c-1) 카밧 번호매김에 따른 위치 44에서의 아미노산 잔기는 A, G, E, D, Q, R, S 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 G, E 및 Q로 구성된 군에서 선택되고;
c-2) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 L, R 및 C로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 L 및 R로 구성된 군에서 선택되고;
c-3) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 및 S로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 R 및 S로 구성된 군에서 선택되고;
c-4) 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 및 L로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 Q이고:
d) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
본 발명의 나노바디의 특히 바람직한 비제한적인 2개의 그룹은 상기 a); 상기 (a-1)∼(a-4); 상기 b); 상기 (b-1)∼(b-4); 상기 (c); 및/또는 상기 (c-1)∼(c-4)에 따른 것이고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 44∼47에서의 아미노산 잔기는 서열 GLEW(또는 본원에 기재된 바와 같은 GLEW-유사 서열)를 형성하고, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이거나;
ii) 카밧 번호매김에 따른 위치 43∼46에서의 아미노산 잔기는 서열 KERE 또는 KQRE(또는 본원에 기재된 바와 같은 KERE-유사 서열)를 형성하고, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 또는 L이고, 바람직하게는 Q이다.
따라서, 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 44∼47에서의 아미노산 잔기는 서열 GLEW(또는 본원에 기재된 바와 같은 GLEW-유사 서열)를 형성하고, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고;
ii) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 구조식을 갖는다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 43∼46에서의 아미노산 잔기는 서열 KERE 또는 KQRE(또는 KERE-유사 서열)를 형성하고, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q 또는 L이고, 바람직하게는 Q이고;
ii) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
카밧 번호매김에 따른 위치 43∼46에서의 아미노산 잔기가 서열 KERE 또는 KQRE를 형성하는 본 발명의 나노바디에서, 위치 37에서의 아미노산 잔기는 가장 바람직하게는 F이다. 카밧 번호매김에 따른 위치 44∼47에서의 아미노산 잔기가 서열 GLEW를 형성하는 본 발명의 나노바디에서, 위치 37에서의 아미노산 잔기는 Y, H, I, L, V 및 F로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 V이다.
따라서, 임의의 방식으로 이에 제한되지 않고, 상기 언급된 위치에 존재하는 아미노산을 근거로 하여, 본 발명의 나노바디는 일반적으로 하기 3개의 그룹을 기초로 분류될 수 있다:
i) The "GLEW-군": 카밧 번호매김에 따른 위치 44∼47에서의 아미노산 서열 GLEW 및 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 Q를 갖는 나노바디. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 그룹의 나노바디는 대체적으로 위치 37에서 V를 갖고, 위치 103에서 W, P, R 또는 S를 가질 수 있으며, 바람직하게는 위치 103에서 W를 갖는다. 또한 GLEW 그룹은 몇몇 GLEW-유사 서열, 예컨대 하기 표 A-3에 언급된 서열을 포함한다. 보다 일반적으로, 제한없이, GLEW-군에 속하는 나노바디는 위치 44에서 G를 갖고/갖거나 위치 47에서 W를 갖는 나노바디로서 정의될 수 있고, 여기서 위치 46은 대체적으로 E이고, 바람직하게는 위치 45는 하전된 아미노산 잔기 및 시스테인이 아니다;
ii) "KERE-군": 카밧 번호매김에 따른 위치 43∼46에서의 아미노산 서열 KERE 또는 KQRE(또는 또다른 KERE-유사 서열) 및 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서의 Q 또는 L을 갖는 나노바디. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 그룹의 나노바디는 대체적으로 위치 37에서 F를, 위치 47에서 L 또는 F를 갖고; 위치 103에서 W, P, R 또는 S를 가질 수 있고, 바람직하게는 위치 103에서 W를 갖는다. 보다 일반적으로, 제한없이, KERE-군에 속하는 나노바디는 그룹은 위치 44에서 K, Q 또는 R(대체적으로 K)을 갖는 나노바디로서 정의될 수 있고, 여기서 위치 45는 하전된 아미노산 잔기 또는 시스테인이고, 위치 47은 본원에 추가로 정의된 바와 같다;
iii) "103 P, R, S-군": 위치 103에서 P, R 또는 S를 갖는 나노바디. 이들 나노바디는 카밧 번호매김에 따른 위치 44∼47에서의 아미노산 서열 GLEW 또는 카밧 번호매김에 따른 위치 43∼46에서의 아미노산 서열 KERE 또는 KQRE를 가질 수 있고, 후자는 가장 바람직하게는 위치 37에서의 F 및 위치 47에서의 L 또는 F의 조합이고(KERE-군에 대해 정의된 바와 같음); 카밧 번호매김에 따른 위치 108에서 Q 또는 L을 가질 수 있고, 바람직하게는 Q를 갖는다.
또한, 적절한 경우, 나노바디는 2개 이상의 이들 그룹에 속할 수 있다(즉, 이들 그룹의 특징을 가질 수 있음). 예를 들면, 나노바디의 한 구체적으로 바람직한 그룹은 44∼47에서 GLEW 또는 GLEW-유사 서열을; 위치 103에서 P,R 또는 S(및 특별히 R)를; 위치 108에서 Q(이는 L로 인간화 될 수 있음)를 갖는다.
보다 일반적으로, 상기에 언급된 정의들은 천연(즉, 비-인간화된) VHH 서열 형태의 나노바디를 설명하고 이에 적용되며, 이들 나노바디의 인간화된 변형체는 상기 지시된 것들 이외의 다른 아미노산 잔기(즉, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 인간화 치환)를 함유할 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들면, 제한없이, GLEW-군 또는 103 P, R, S-군의 몇몇 인간화된 나노바디에서, 위치 108에서의 Q는 108L로 인간화될 수 있다. 본원에 이미 언급된 바와 같이, 다른 인간화 치환(및 적합한 이의 조합)은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다. 추가로, 또는 다르게는, 다른 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 자연 발생 VHH 서열의 골격구조 영역의 서열을 하나 이상의 매우 상관된 인간 VH 서열의 상응하는 골격구조와 비교함으로써 확인될 수 있고, 이후 이렇게 결정된 하나 이상의 잠재적으로 유용한 치환(또는 이의 조합)은 상기 VHH 서열내로 도입되고(본원에 추가로 기재된 바와 같이, 자체 공지된 임의의 방식으로), 생성된 인간화된 VHH 서열은 표적에 대한 친화도, 안정성, 발현의 용이성 및 수준, 및/또는 다른 원하는 특성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 방식에서, 제한된 정도의 시행착오법에 의해, 다른 적합한 인간화 치환(또는 이의 적합한 조합)은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 또한, 전술된 내용에 기초하여, 나노바디(의 골격구조 영역)는 부분적으로 인간화되거나 전체적으로 인간화된다.
따라서, 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 GLEW-군(본원에 정의된 바와 같음)에 속할 수 있고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 KERE-군(본원에 정의된 바와 같음)에 속하는 나노바디일 수 있고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
따라서, 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 103 P, R, S-군(본원에 정의된 바와 같음)에 속하는 나노바디일 수 있고, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
또한, 보다 일반적으로 및 상기 언급된 108Q, 43E/44R 및 103 P,R,S 잔기에 추가로, 본 발명의 나노바디는, 종래의 VH 도메인에서 VH/VL 계면(의 일부)을 형성하는 하나 이상의 위치에서, 상응하는 자연 발생 VH 서열에서의 동일한 위치(들)에서 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기에 비하여 보다 높게 하전된 하나 이상의 아미노산 잔기, 및 특별히 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기(표 A-2에 언급된 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 치환은, 제한되지 않지만, 하기 표 A-3에 언급된 GLEW-유사 서열; 뿐만 아니라 소위 "미소체(microbody)"에 대해 국제 출원 제WO 00/29004호에 기재된 치환을 포함함으로써, 예컨대 위치 44∼47에서의 KLEW와 함께 위치 108에서 Q를 갖는 나노바디를 수득한다. 이들 위치에서의 다른 가능한 치환은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다.
본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 83에서의 아미노산 잔기는 L, M, S, V 및 W로 구성된 군에서 선택되고; 바람직하게는 L이다.
또한, 본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 83에서의 아미노산 잔기는 R, K, N, E, G, I, T 및 Q로 구성된 군에서 선택되고; 가장 바람직하게는 K 또는 E(자연 발생 VHH 도메인에 상응하는 나노바디를 위해) 또는 R(본원에 기재된 바와 같이, "인간화된" 나노바디를 위해)이다. 위치 84에서의 아미노산 잔기는 한 양태에서 P, A, R, S, D, T, 및 V로 구성된 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 P(자연 발생 VHH 도메인에 상응하는 나노바디를 위해) 또는 R(본원에 기재된 바와 같은, "인간화된" 나노바디를 위해)이다.
추가로, 본 발명의 나노바디의 한 양태에서, 위치 104에서의 아미노산 잔기는 G 및 D로 구성된 군에서 선택되고; 가장 바람직하게는 G이다.
총체적으로, 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 아미노산 잔기(이는 나노바디에서 상기 언급된 바와 같음)는 또한 본원에 "인증 잔기"로 지칭될 것이다. 가장 매우 상관된 인간 VH 도메인의 상응하는 위치, VH3에서의 아미노산 잔기 및 인증 잔기는 표 A-3에 요약되어 있다.
자연 발생 VHH 도메인에서 초래될 경우 이들 인증 잔기의 특히 바람직하지만 비제한적인 조합은 표 A-4에 언급되어 있다. 비교를 위해, DP-47로 지칭되는 인간 VH3의 상응하는 아미노산 잔기는 이탤릭체로 지시되어 있다.
[표 A-3]
나노바디중의 인증 잔기
Figure 112009080144011-pct00008
[표 A-4]
자연 발생 나노바디중의 인증 잔기의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 조합(이들 조합의 인간화를 위해, 명세서를 참조함)
Figure 112009080144011-pct00009
나노바디에서, 인증 잔기 이외의 다른 임의의 위치에서의 아미노산 잔기는 각각 자연 발생 VHH 도메인의 상응하는 위치(카밧 번호매김에 따라서)에서 자연 발생된 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
이러한 아미노산 잔기는 숙련가에게 명백할 것이다. 표 A-5∼A-8는 자연 발생 VHH 도메인의 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 각각의 위치(카밧 번호매김에 따라서)에 존재할 수 있는 몇몇 비제한적 잔기를 언급한다. 각각의 위치에 대해, 자연 발생 VHH 도메인의 각각의 위치에서 가장 빈번하게 발생한 아미노산 잔기(이는 나노바디의 상기 위치에서 가장 바람직한 아미노산임)는 볼드체로 지시되고; 각각의 위치에 대한 다른 바람직한 아미노산 잔기는 밑줄쳐져 있다(주: 자연 발생 VHH 도메인의 위치 26∼30에서 발견되는 아미노산 잔기의 수는 이들 위치에서의 잔기가 이미 CDR1의 일부를 형성한 상기 문헌[Chothia]에 의한 번호매김의 기초가 되는 가설을 지지한다.
표 A-5∼A-8에서는, 인간 VH3 도메인의 각각의 위치에 존재할 수 있는 비제한적이 몇몇 잔기가 또한 언급되어 있다. 다시, 이러한 위치에 대해, 자연 발생 인간 VH3 도메인의 각각의 위치에서 가장 빈번히 발생되는 아미노산 잔기는 볼드체로 지시되고; 다른 바람직한 아미노산 잔기는 밑줄쳐 있다.
단지 참조하기 위해, 표 A-5∼A-8는 또한 1118 VHH 서열의 대표적인 샘플에 대한 각각의 아미노산 위치에서의 VHH 엔트로피(entropy)("VHH Ent.") 및 VHH 변이성(variablility)("VHH Var.")에 대한 데이터를 갖고 있다(문헌[David Lutje Hulsing and Prof. Theo Verrips of Utrecht University]에 의해 친절히 제공되는 데이터). VHH 엔트로피 및 VHH 변이성에 대한 값은 분석된 1118 VHH 서열들 사이의 아미노산 잔기의 변이성 및 보존도에 대한 측정값을 제공하고: 낮은 값(즉, <1, 예컨대 < 0.5)은 아미노산 잔기가 VHH 서열 사이에서 매우 보존적임(즉, 변이성이 거의 없음)을 지시한다. 예를 들면, 위치 8에서의 G 및 위치 9에서의 G는 개별적으로 0.1 및 0의 VHH 엔트로피에 대한 값을 갖고, 이는 이들 잔기가 매우 보존적이고 거의 변이성이 없음(분석된 모든 1118 서열에서 위치 9가 G인 경우)을 의미하는 반면, CDR의 일부를 형성하는 잔기의 경우 일반적으로 1.5 이상의 값이 발견된다(데이터는 제시되지 않음). (비록 본 발명이 임의의 구체적인 가설 또는 설명에 제한되지 않고, 상기 언급된 바와 같이 본원에 카밧에 따른 번호매김이 사용되지만) (1) 표 A-5∼A-8의 제2 단락에 열거된 아미노산 잔기는 마지막 두 단락에 지칭된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이성을 결정하기 위해 분석된 1118 VHH 서열에 비하여 더 큰 샘플에 기초하고; (2) 아래에 제시된 데이터는 위치 27∼30에서의 아미노산 잔기 및 또한 위치 93 및 94에서의 아미노산 잔기가 이미 CDR의 일부를 형성한다는 가설을 지지함을 주지해야 한다. 서열 엔트로피, 서열 변이성 및 이를 결정하는 방법론에 대한 일반적 설명을 위해, 문헌[Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52: 544-552 (2003)]을 참조한다.
[표 A-5a]
FR1중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예(주석에 대해, 표 A-3의 주석을 참조함)
Figure 112009080144011-pct00010
[표 A-5b]
FR1중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예
Figure 112009080144011-pct00011
[표 A-6]
FR2중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예(주석에 대해, 표 A-3의 주석을 참조함)
Figure 112009080144011-pct00012
[표 A-7a]
FR3중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예(주석에 대해, 표 A-3의 주석을 참조함)
Figure 112009080144011-pct00013
[표 A-7b]
FR3중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예
Figure 112009080144011-pct00014
[표 A-8]
FR4중의 아미노산 잔기의 비제한적인 예(주석에 대해, 표 A-3의 주석을 참조함)
Figure 112009080144011-pct00015
따라서, 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명의 나노바디는 하기 (일반) 구조식의 아미노산 서열로서 정의될 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되고;
ii) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 더 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열이거나 인간화된 나노바디일 수 있다. 상기 나노바디 서열이 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화될 수 있다. 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 선택가능하게는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화된다.
특별히, 본 발명의 나노바디는 하기 (일반) 구조식의 아미노산 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서, FR1∼FR4는 개별적으로 골격구조 영역 1∼4를 지칭하고, CDR1∼CDR3은 개별적으로 상보성 결정 영역 1∼3을 지칭하고, 여기서
i) (바람직하게는) 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되고(VHH 서열은 하나 이상의 인증 잔기를 함유할 것이고; 부분적으로 인간화된 나노바디는 대체적으로 바람직하게는, [여전히] 하나 이상의 인증 잔기를 함유하고[그러나 본 발명의 범주내에-본 발명에 따라 적합한 경우-모든 인증 잔기(다른 하나 이상의 아미노산 잔기가 아님)가 인간화되어진 부분적으로 인간화된 나노바디를 제공함이 포함됨]; 전체적으로 인간화된 나노바디에서, 본 발명에 따라 적합한 경우, 인증 잔기의 위치에서의 모든 아미노산 잔기는 인간 VH3 서열에서 발생되는 아미노산 잔기일 것임을 알아야 함. 이러한 VHH 서열, 예컨대 적어도 하나의 인증 잔기를 갖는 부분적으로 인간화된 나노바디, 인증 잔기가 없는 부분적으로 인간화된 나노바디, 및 전체적으로 인간화된 나노바디 모두가 본 발명의 양태를 형성함은 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것임.)
ii) 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고, 여기서 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기(서열 번호 1∼22의 서열에서 X로 지시됨)는 무시되고;
iii) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열이거나 인간화된 나노바디일 수 있다. 상기 나노바디 서열은 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화될 수 있다. 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 다시 본원에 기재된 바와 같이 선택가능하게 추가로 적합하게 인간화될 수 있다.
[표 A-9a]
KERE, GLEW 및 P,R,S 103 그룹의 나노바디에 대한 대표적인 아미노산 서열(CDR은 XXXX로 지시됨)
Figure 112009080144011-pct00016
[표 A-9b]
Figure 112009080144011-pct00017
특별히, KERE 그룹의 본 발명의 나노바디는 하기 (일반) 구조식의 아미노산 서열일 수 있다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
상기 식에서,
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 하전된 아미노산 (본원에 정의된 바와 같음) 또는 시스테인 잔기이고, 위치 44는 바람직하게는 E이고;
ii) FR1은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-1O]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열
Figure 112009080144011-pct00018
iii) FR2는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-11]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW2 서열
Figure 112009080144011-pct00019
iv) FR3은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-12]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW3 서열
Figure 112009080144011-pct00020
v) FR4는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-13]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW4 서열
Figure 112009080144011-pct00021
vi) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디에서, 하나 이상의 추가의 인증 잔기는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다(예를 들면, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우).
또한, 상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열 또는 인간화된 나노바디일 수 있다. 상기 나노바디 서열이 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화된다. 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 선택가능하게는 다시 본원에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화될 수 있다.
골격구조 1에 관하여, 상기 개략된 아미노산 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생성된 경우, 제1의 4개의 아미노산 서열(즉, 카밧 번호매김에 따른 아미노산 잔기 1∼4)은 종종 상기 핵산을 생성하기 위해 사용되는 프라이머(들)에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, 제1의 4개의 아미노산 잔기는 바람직하게는 무시된다.
또한, 골격구조 1에 관하여, 아미노산 위치 27∼30은 카밧 번호매김에 따라 골격구조 영역의 일부인(CDR이 아님) 것으로 고려되고, 1000개 초과의 VHH 서열의 데이터베이스를 분석함으로써, 위치 27∼30이 위치 1∼26에서의 변이성에 비하여 훨씬 더 큰 변이성을 가지는 것(VHH 엔트로피 및 VHH 변이성으로 표현됨-표 A-5∼A-8 참조)으로 밝혀졌다. 이로 인하여, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, 위치 27∼30에서의 아미노산 잔기는 바람직하게는 또한 무시된다.
이러한 점에서, KERE 부류의 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단되는 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열일 수 있고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 45에서의 아미노산 잔기는 하전된 아미노산(본원에 정의된 바와 같음) 또는 시스테인 잔기이고, 위치 44는 바람직하게는 E이고;
ii) FR1은 카밧 번호매김에 따른 위치 5∼26 상에서 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-14]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열(아미노산 잔기 5∼26)
Figure 112009080144011-pct00022
iii) FR2, FR3 및 FR4는 KERE-부류의 나노바디의 FR2, FR3 및 FR4에 대해 본원에 언급된 바와 같고;
iv) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 더욱 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열 또는 인간화된 항체일 수 있다. 상기 나노바디 서열이 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화된다. 상기 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 선택가능하게는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화될 수 있다.
GLEW 부류의 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단되는 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열일 수 있고, 여기서
i) 바람직하게는, GLEW-부류의 나노바디가 비-인간화된 나노바디인 경우, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고;
ii) FR1은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-15]
GLEW-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열
Figure 112009080144011-pct00023
iii) FR2는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-16]
GLEW-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW2 서열
Figure 112009080144011-pct00024
iv) FR3은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-17]
GLEW-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW3 서열
Figure 112009080144011-pct00025
v) FR4는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-18]
GLEW-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW4 서열
Figure 112009080144011-pct00026
vi) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디에서, 하나 이상의 추가의 인증 잔기는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다(예를 들면, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우).
골격구조 1에 관하여, 다시 아미노산 동일성을 결정하기 위해 위치 1∼4 및 27∼30 상의 아미노산 잔기는 바람직하게는 무시됨은 숙련가에게 명백할 것이다.
이러한 점에서, GLEW 부류의 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단되는 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열일 수 있고, 여기서
i) 바람직하게는, GLEW-부류의 나노바디가 비-인간화된 나노바디인 경우, 위치 108에서의 아미노산 잔기는 Q이고;
ii) FR1은 카밧 번호매김에 따른 위치 5∼26 상에서 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-19]
KERE-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열(아미노산 잔기 5∼26)
Figure 112009080144011-pct00027
iii) FR2, FR3 및 FR4는 GLEW-부류의 나노바디의 FR2, FR3 및 FR4에 대해 언급된 바와 같고;
iv) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열 또는 인간화된 항체일 수 있다. 상기 나노바디 서열이 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화된다. 상기 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 선택가능하게는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화될 수 있다. 상기 나노바디에서, 하나 이상의 추가의 인증 잔기는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다(예를 들면, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우).
P, R, S 103 부류의 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단되는 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열일 수 있고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W와 상이하고;
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 또는 S이고, 보다 바람직하게는 R이고;
iii) FR1은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-20]
P,R,S 103-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열
Figure 112009080144011-pct00028
iv) FR2는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-21]
P,R,S 103-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW2 서열
Figure 112009080144011-pct00029
v) FR3은 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-22]
P,R,S 103-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW3 서열
Figure 112009080144011-pct00030
vi) FR4는 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-23]
P,R,S 103-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW4 서열
Figure 112009080144011-pct00031
vii) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디에서, 하나 이상의 추가의 인증 잔기는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다(예를 들면, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우).
골격구조 1에 관하여, 다시 아미노산 동일성을 결정하기 위해 위치 1∼4 및 27∼30 상의 아미노산 잔기는 바람직하게는 무시됨이 숙련가에게 명백할 것이다.
이러한 점에서, P,R,S 103 부류의 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역/서열에 의해 차단되는 4개의 골격구조 영역/서열로 구성된 아미노산 서열일 수 있고, 여기서
i) 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 W와 상이하고;
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 103에서의 아미노산 잔기는 P, R 또는 S이고, 보다 바람직하게는 R이고;
iii) FR1은, 카밧 번호매김에 따른 위치 5∼26 상에서 적어도 하나의 하기 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열이고:
[표 A-24]
P,R,S 103-군의 나노바디에 대한 대표적인 FW1 서열(아미노산 잔기 5∼26)
Figure 112009080144011-pct00032
iv) FR2, FR3 및 FR4는 P,R,S 103-부류의 나노바디의 FR2, FR3 및 FR4에 대해 언급된 바와 같고;
v) CDR1, CDR2 및 CDR3은 본원에 정의된 바와 같고; 바람직하게는 본원의 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 본원의 보다 바람직한 양태중 하나에 따라 정의된 바와 같다.
상기 나노바디는 예를 들면 VHH 서열 또는 인간화된 항체일 수 있다. 상기 나노바디 서열이 VHH 서열인 경우, 이들은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화될 수 있다. 나노바디가 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우, 이들은 선택가능하게는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화될 수 있다.
상기 나노바디에서, 하나 이상의 추가의 인증 잔기는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다(예를 들면, 이들이 VHH 서열 또는 부분적으로 인간화된 나노바디인 경우).
바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에서, 본 발명은 CDR 서열이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95% 이상의 아미노산 동일성, 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성을 갖는, 상기 기재된 바와 같은 나노바디에 관한 것이다. 아미노산 동일성의 정도는 예를 들면 상기 아미노산 서열 및 서열 번호 560∼621의 하나 이상의 서열 사이의 아미노산 동일성의 정도를 결정함으로써(본원에 기재된 방식으로) 결정될 수 있는데, 여기서 골격구조 영역을 형성하는 아미노산 잔기는 무시된다. 또한, 본 발명의 이러한 아미노산 서열은 본원에 추가로 기재된 바와 같을 수 있다.
본원에 이미 언급된 바와 같이, 본 발명의 바람직하지만 비제한적인 양태는 서열 번호 560∼621로 구성된 그룹, 또는 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 이상의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 나노바디에 관한 것이다.
또한, 상기 나노바디에서:
i) 임의의 아미노산 치환(이것이 본원에 정의된 바와 같은 인간화 치환이 아닌 경우)은 바람직하게는, 서열 번호 560∼621의 아미노산 서열과 비교하여, 보존적 아미노산 치환(본원에 정의된 바와 같음)이고/이거나;
ii) 그의 아미노산 서열은, 서열 번호 560∼621의 상응하는 아미노산 서열과 비교하여, 바람직하게는 단지 아미노산 치환만 함유하거나, 또는 그렇지 않으면 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산 결실 또는 삽입을 함유하고/하거나;
iii) CDR은 친화도 증진에 의해, 예를 들면 서열 번호 560∼621의 상응하는 아미노산 서열의 CDR로부터 출발하여 유도된 CDR일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디에서 CDR 서열 및 FR 서열은, 본 발명의 나노바디(및 이를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드)가:
-RANK-L에 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)(즉, 105∼1012 리터/몰 이상, 바람직하게는 107∼1012 리터/몰 이상, 보다 바람직하게는 108∼1012 리터/몰의 회합 상수(KA))로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 kon-속도로 결합하고/하거나;
-RANK-L에 1 s-1(t1 /2 = 0.69 s)∼10-6 s-1(다수일의 t1 /2에 의해 거의 비가역적 착체를 제공함), 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 koff-속도로 결합하도록 한다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디에 존재하는 CDR 서열 및 FR1 서열은 본 발명의 나노바디가 RANK-L에 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 결합하도록 한다.
본 발명의 비제한적인 하나의 양태에 따라서, 나노바디는 본원에 정의된 바와 같지만, 단 이는, 자연 발생 인간 VH 도메인의 상응하는 골격구조 영역, 특별히 DP-47의 상응하는 골격구조 영역과 비교하여, 적어도 하나의 골격구조 영역에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 비제한적인 하나의 양태에 따라서, 나노바디는 본원에 정의된 바와 같지만, 단 이는, 자연 발생 인간 VH 도메인의 상응하는 골격구조 영역, 특별히 DP-47의 상응하는 골격구조 영역과 비교하여, 적어도 하나의 인증 잔기(위치 108, 103 및/또는 45에서의 잔기가 포함됨)에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다. 대체적으로, 나노바디는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4에서, 특별히 FR2 및/또는 FR4중의 적어도 하나의 인증 잔기(다시, 위치 108, 103 및/또는 45에서의 잔기가 포함됨)에서 자연 발생 VH 도메인과 적어도 하나의 이러한 아미노산 차이를 가질 것이다.
또한, 본 발명의 인간화된 나노바디는 본원에 정의된 바와 같지만, 단 이는, 자연 발생 VHH 도메인의 상응하는 골격구조 영역과 비교하여, 적어도 하나의 골격구조 영역에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 비제한적인 한 양태에 따라서, 인간화된 나노바디는 본원에 정의된 바와 같지만, 단 이는, 자연 발생 VHH 도메인의 상응하는 골격구조 영역과 비교하여, 적어도 하나의 인증 잔기(위치 108, 103 및/또는 45에서의 잔기가 포함됨)에 적어도 "하나의 아미노산 차이"(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다. 대체적으로, 인간화된 나노바디는 적어도 하나의 FR2 및/또는 FR4, 특별히 FR2 및/또는 FR4중의 적어도 하나의 인증 잔기(위치 108, 103 및/또는 45에서의 잔기가 포함됨)에 자연 발생 VHH 도메인과 적어도 하나의 이러한 아미노산 차이를 가질 것이다.
본원의 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 나노바디의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이체, 변형체, 대립인자, 상동체 및 오쏠로그(ortholog)(본원에 총체적으로 "유사체"로 지칭됨), 및 특별히 서열 번호 560∼621의 나노바디의 유사체를 사용함은 본 발명의 범주내에 속한다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 따라서, "본 발명의 나노바디"라는 용어는 그의 가장 광범위한 의미에서 이러한 유사체를 또한 포함한다.
일반적으로, 이러한 아날로그에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 나노바디와 비교하여, 대체, 결실 및/또는 첨가될 수 있다. 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 하나 이상의 골격구조 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 만들어질 수 있다. 이러한 치환, 삽입 또는 결실이 하나 이상의 골격구조 영역에서 만들어질 경우, 이들은 하나 이상의 인증 잔기 및/또는 골격구조 잔기중의 하나 이상의 다른 위치에서 만들어질 수 있지만, 인증 잔기에서의 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 일반적으로 덜 바람직하다(이들이 본원에 기재된 바와 같은 적합한 인간화 치환이 아닌 경우).
비제한적 예에 의해, 치환은 예를 들면 보존적 치환(본원에 기재된 바와 같음)이고/이거나, 아미노산 잔기는 또다른 VHH 도메인중의 동일한 위치에서 자연 발생되는 또다른 아미노산 잔기에 의해 대체될 수 있지만(이러한 치환의 비제한적인 몇몇 예를 위해 표 A-5∼A-8을 참조함), 본 발명은 일반적으로 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 나노바디의 특성을 개선시키거나, 적어도 본 발명의 나노바디의 원하는 특성, 또는 이들의 균형 또는 조합을 너무 많이(즉, 나노바디가 그의 의도된 용도에 더 이상 적합하지 않을 정도로) 훼손시키지 않는 임의의 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이의 임의의 조합은 본 발명의 범주내에 포함된다. 숙련가는 일반적으로 적합한 치환, 결실 또는 삽입, 또는 이의 적합한 조합을, 본원의 개시내용에 기초하여, 선택가능하게는 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득된 나노바디의 특성에 대한 이들의 영향을 결정함을 포함하는 제한된 정도의 일상적 실험 이후에 결정하고 선택할 수 있다.
예를 들면, 나노바디 또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 숙주 유기체에 따라서, 이러한 결실 및/또는 치환은, 당분야의 숙련가가 할 수 있듯이, 번역후 개질(post-translational modification)을 위한 하나 이상의 부위(예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되도록 고안될 수 있다. 다르게는, 치환 또는 삽입은, 작용기의 부착(본원에 기재된 바와 같음)을 위한 하나 이상의 부위를 도입하도록 고안되어, 예를 들면 부위-특이적 페그화(다시, 본원에 기재된 바와 같음)를 허용할 수 있다.
상기 표 A-5∼A-8에 제시된 VHH 엔트로피 및 VHH 변이성에 대한 데이터로부터 알 수 있듯이, 골격구조 영역중의 몇몇 아미노산 잔기는 다른 잔기에 비하여 보다 더 보존적이다. 일반적으로, 본 발명이 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 바람직하게는 덜 보존적인 위치에서 만들어질 수 있다. 또한, 일반적으로, 아미노산 치환은 아미노산 결실 또는 삽입에 대해 바람직하다.
유사체는 바람직하게는 이들이 본 발명의 나노바디에 대해 본원에 정의된 바와 같은 친화도(KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)를 갖고 RANK-L에 결합할 수 있도록 한다.
유사체는 바람직하게는 이들이 본원에 기재된 바와 같은 나노바디의 바람직한 특성을 보유하도록 한다.
또한, 한 바람직한 양태에 따라서, 유사체는 서열 번호 560∼621의 하나의 나노바디와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 예컨대 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성의 정도를 갖고/갖거나; 바람직하게는 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 더 바람직하게는 5개 이하, 예컨대 4개, 3개, 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(본원에 정의된 바와 같음)를 갖는다.
또한, 유사체의 골격구조 서열 및 CDR은 바람직하게는 이들이 본원에 정의된 바람직한 양태에 따르도록 한다. 보다 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 유사체는 (a) 위치 108에서 Q; 및/또는 (b) 위치 45에서 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기, 바람직하게는 위치 44에서 E, 보다 바람직하게는 위치 44에서 E 및 위치 45에서의 R; 및/또는 (c) 위치 103에서 P, R 또는 S를 가질 것이다.
본 발명의 나노바디의 유사체의 한 바람직한 부류는 인간화된 나노바디를 포함한다(즉, 본 발명의 자연 발생 나노바디의 서열에 비하여). 본원에 언급된 배경에서 언급된 바와 같이, 이러한 인간화는 일반적으로 자연 발생 VHH의 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간 VH 도메인, 예컨대 인간 VH3 도메인에서 동일한 위치에서 발생되는 아미노산 잔기로 대체함을 포함한다. 가능한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 조합의 예는, 본원의 표, 본원에 인용된 배경에서 언급된 가능한 인간화 치환, 및/또는 나노바디의 서열과 자연 발생 인간 VH 도메인의 서열 간의 비교로부터 숙련가에게 명백할 것이다.
인간화 치환은 생성된 인간화된 나노바디가 본원에 정의된 바와 같은 나노바디의 바람직한 특성을 보유하도록, 보다 바람직하게는 이들이 선행 문단에서 유사체에 대해 기재된 바와 같도록 선택되어야 한다. 숙련가는 일반적으로 적합한 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을, 본원의 개시내용에 기초하여, 선택가능하게는 제한된 수의 가능한 치환을 도입하고 이렇게 수득된 나노바디의 특성에 대한 이들의 영향을 결정함을 포함하는 제한된 정도의 일상적 실험 이후에 결정하고 선택할 수 있다.
일반적으로, 인간화의 결과로서, 본 발명의 나노바디는 보다 "인간-유사"화되는 한편, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 나노바디의 바람직한 특성을 보유한다. 결과로서, 이러한 인간화된 나노바디는 상응하는 자연 발생 VHH 도메인에 비하여 수개의 이점, 예컨대 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 선택가능하게는 제한된 정도의 일상적 실험 이후에, 숙련가는 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 선택할 것이고, 이는 한편의 인간화 치환에 의해 제공된 바람직한 특성 및 다른 편 자연 발생 VHH 도메인의 바람직한 특성 사이의 원하는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성한다.
본 발명의 나노바디는 임의의 골격구조 잔기(들)에서, 예컨대 하나 이상의 인증 잔기(본원에 정의된 바와 같음)에서, 또는 하나 이상의 다른 골격구조 잔기(즉, 비-인증 잔기) 또는 이의 임의의 적합한 조합에서 적합하게 인간화될 수 있다. "P,R,S-103 그룹" 또는 "KERE 그룹"의 나노바디에 바람직한 인간화 치환은 L108로의 Q108이다. "GLEW 그룹"의 나노바디는 또한 L108로의 Q108 치환에 의해 인간화될 수 있으나, 단 적어도 하나의 다른 인증 잔기는 카멜리드(카멜화) 치환(본원에 정의된 바와 같음)을 함유한다. 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이, 인간화된 나노바디의 특별히 바람직한 한 부류는 GLEW 또는 GLEW-유사 서열을 위치 44-47에; P, R 또는 S(및 특별히 R)을 위치 103에, L을 위치 108에 갖는다.
인간화된 다른 유사체, 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 자체 공지된 임의의 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 유사체는 자연 발생 VHH 도메인을 코딩하는 핵산을 제공하고, 상응하는 원하는 아미노산 잔기에 대한 코돈으로 치환되어질 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 코돈을 치환하고(예를 들어, 부위-유도된 돌연변이생성 또는 적합한 미스매치 프라이머를 사용하는 PCR에 의해), 이렇게 수득된 핵산/뉴클레오티드 서열을 적합한 숙주 또는 발현 시스템에서 발현시키고; 선택가능하게는 이렇게 수득된 유사체를 단리 및/또는 정제하여 상기 유사체를 본질적으로 단리된 형태(예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같이)를 제공함으로써 수득될 수 있다. 이는 일반적으로 자체 공지된 방법 및 기법을 사용함으로써 수행될 수 있고, 이는 예를 들면 본원에 인용된 편람 및 문헌, 본원에 인용된 배경 기술 및/또는 본원의 추가의 기재내용으로부터 숙련가에게 명백할 것이다. 다르게는, 원하는 유사체를 코딩하는 핵산은 자체 공지된 방식으로(예를 들면 미리정의된 아미노산 서열에 의해 핵산 서열을 합성하기 위한 자동화된 장치를 사용하여) 합성될 수 있고, 이어서 본원에 기재된 바와 같이 발현될 수 있다. 또다른 기법은 하나 이상의 자연 발생 및/또는 합성 핵산 서열(각각 원하는 유사체의 일부를 코딩함)을 조합하고, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 조합된 핵산 서열을 발현시킴을 포함할 수 있다. 또한, 유사체는 자체 공지된 펩티드 합성을 위한 기법(예컨대, 본원에 언급된 기법)에 의해 적절한 아미노산 서열의 화학적 합성을 사용하여 제공될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 나노바디(이들의 유사체를 포함함)는 인간 VH 서열(즉, 아미노산 서열 또는 상응하는 뉴클레오티드 서열), 예컨대, 예를 들면 인간 VH3 서열, 예컨대 DP-47, DP-51 또는 DP-29로부터 출발하여, 즉 하나 이상의 카멜화 치환을 도입하여(즉, 상기 인간 VH 도메인의 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기를 VHH 도메인중의 상응하는 위치에서 발생하는 아미노산 잔기로 변화시켜), 본 발명의 나노바디의 서열을 제공하고/하거나 이렇게 수득된 서열에 나노바디의 바람직한 특성을 부여함으로써 고안되고/되거나 제조될 수 있다. 다시, 이는 일반적으로 이전 문단에 지칭된 다양한 방법 및 기법을 사용하고 출발 지점으로서 인간 VH 도메인을 위한 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 수행될 수 있다.
바람직한 비제한적인 몇몇 카멜화 치환은 표 A-5∼A-8로부터 유도될 수 있다. 또한, 하나 이상의 인증 잔기에서의 카멜화 치환이 일반적으로 하나 이상의 다른 아미노산 위치에서의 치환에 비하여 원하는 특성에 더 큰 영향을 미친다는 것은 분명할 것이지만, 이들 둘다 및 이의 임의의 적합한 조합은 본 발명의 범주내에 속한다. 예를 들면, 적어도 몇몇 원하는 특성을 이미 부여한 하나 이상의 카멜화 치환을 도입한 다음, 상기 특성을 추가로 개선시키고/시키거나 추가의 바람직한 특성을 부여하는 추가의 카멜화 치환을 도입하는 것이 가능하다. 다시, 숙련가는 일반적으로 적합한 카멜화 치환 또는 카멜화 치환의 적합한 조합을, 본원의 개시내용에 기초하여, 선택가능하게는 제한된 수의 가능한 카멜화 치환을 도입하고 나노바디의 바람직한 특성이 수득되거나 개선되는지의 여부(즉, 최초의 VH 도메인에 비하여)를 결정함을 포함하는 제한된 정도의 일상적 실험 이후에 결정하고 선택할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 이러한 카멜화 치환은 바람직하게는 적어도 생성된 아미노산 서열은 (a) 위치 108에서 Q를; 및/또는 (b) 위치 45에서 하전된 아미노산 또는 시스테인 잔기를, 바람직하게는 또한 위치 44에서 E를, 보다 바람직하게는 위치 44에서 E를, 위치 45에서 R을; 및/또는 (c) 위치 103에서 P, R 또는 S를; 및 선택가능하게는 하나 이상의 추가의 카멜화 치환을 적어도 함유한다. 보다 바람직하게는, 카멜화 치환은 이들이 본 발명의 나노바디 및/또는 이의 유사체(본원에 정의된 바와 같음), 예컨대 인간화된 유사체 및/또는 바람직하게는 선행 문단에 정의된 바와 같은 유사체를 생성하도록 한다.
다른 유사체 및 이를 코딩하는 핵산 서열이 제공되어, 예를 들면 나노바디의 안정성을 개선시킨다. 저장 동안, 면역글로불린의 나노바디 및 다른 유형은 특정 변형체를 다음의 결과로서 생성할 수 있다:
i) 전형적으로 단지 "접근가능한" 메티오닌에서 발생되는 산화 작용(들)(여기서, 산화는 항온처리 온도 및 시간에 병행하여 저장 동안 증가함);
ii) 존재할 경우 제1 글루탐산 잔기를 환화시켜 피로글루타메이트를 형성함;
iii) DG, DS, NG 또는 NS 모티프에서 단지 "접근가능한" 아스파르트산 또는 아스파라긴의 이성화(여기서, 이성화는 항온처리 온도 및 시간에 병행하여 저장 동안 증가함).
안정성 프로필(profile)이 개선된 본 발명의 나노바디의 변형체의 유사체가 생성될 수 있다. 이는, 예를 들면, 제한없이, Asp(D) 및 Asn(N)의 이성화를 방지하고, 예를 들어 CDR에서 Asp-Gly(DG), Asp-Ser(DS), Asn-Gly(NG) 및 Asn-Ser(NS)를 또다른 아미노산, 예컨대 예를 들어 Glu(E) 또는 Gln(Q)으로 대체하고; Met의 산화를 방지하고, 예를 들어 강압적으로 산화된 Met을 또다른 아미노산 예컨대 예를 들어 Ala 또는 Thr로 대체하고/하거나, N-말단 Glu를 다른 N-말단, 예를 들어 Asp로 대체함으로써 수행될 수 있다. 다시, 숙련가는 일반적으로 적합한 안정화 치환 또는 안정화 치환의 적합한 조합을, 본원의 개시내용에 기초하여, 선택가능하게는 제한된 수의 가능한 안정화 치환을 도입하고 나노바디가 여전히 RANK-L과 결합하는지의 여부 및 나노바디의 바람직한 특성이 수득되거나 개선되는지의 여부(즉, 최초의 VH 또는 VHH 도메인에 비하여)를 결정함을 포함하는 제한된 정도의 일상적 실험 이후에 결정하고 선택할 수 있다. 바람직한 안정화된 나노바디는 서열 번호 756에 나타나 있고, 여기서 CDR2중의 DS 모티프는 ES로 대체되어 다음의 CDR2: SITGSGGSTYYAESVKG(서열 번호 758)를 생성한다.
또한 본원의 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 나노바디의 부분 또는 단편, 또는 이의 2개 이상의 부분 또는 단편의 조합, 및 특별히 서열 번호 560∼621의 나노바디의 부분 또는 단편을 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 속한다. 따라서, 본 발명의 한 양태에 따라서, "본 발명의 나노바디"는 그의 가장 광범위한 의미에서 이러한 부분 또한 단편도 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 나노바디의 이러한 부분 또는 단편(이의 유사체가 포함됨)은, 본 발명의 상응하는 전장(full length) 나노바디(또는 이의 유사체)와 비교하여, N-말단 단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, C-말단 단부에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 하나 이상의 인접 내부 아미노산 잔기, 또는 이의 임의의 조합이 결실 및/또는 제거된 아미노산 잔기를 갖는다.
이러한 부분 또는 단편은 본 발명의 나노바디에 대해 본원에 정의된 바와 같은 친화도(본원에 추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)를 갖고 RANK-L에 결합하는 것이 바람직하다.
임의의 부분 또는 단편은, 본 발명의 상응하는 전장 나노바디의 아미노산 서열의 10개 이상의 인접 아미노산 잔기, 바람직하게는 20개 이상의 인접 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 30개 이상의 인접 아미노산 잔기, 예컨대 40개 이상의 인접 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 임의의 부분 또는 단편은, 적어도 하나의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 또는 적어도 이의 일부(특별히 적어도 CDR3 또는 적어도 이의 일부)를 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 임의의 부분 또는 단편은 이것이 적어도 하나의 CDR(바람직하게는 적어도 CDR3 또는 이의 일부) 및 적어도 하나의 다른 CDR(즉, CDR1 또는 CDR2) 또는 적어도 이의 일부 일부(바람직하게는 적합한 골격구조 서열(들) 또는 적어도 이의 일부에 의해 연결됨)를 포함한다. 보다 바람직하게는, 임의의 부분 또는 단편은 적어도 하나의 CDR(바람직하게는 적어도 CDR3 또는 이의 일부) 및 2개의 남은 CDR의 적어도 이의 일부(다시, 바람직하게는 적합한 골격구조 서열(들) 또는 적어도 이의 일부에 의해 연결됨)를 포함한다.
특별히 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에 따라서, 이러한 부분 또는 단편은, 예를 들면 국제 출원 WO 제03/050531호(Lasters et al)에 기재된 바와 같이, 적어도 본 발명의 상응하는 전장 나노바디의 CDR3, 예컨대 FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다.
이미 상기에 언급된 바와 같이, 2개 이상의 이러한 부분 또는 단편(즉, 본 발명의 동일하거나 상이한 나노바디로부터)을 조합하는 것, 즉 유사체(본원에 정의된 바와 같음)를 제공하고/하거나 본 발명의 나노바디의 추가의 부분 또는 단편(본원에 정의된 바와 같음)을 제공하는 것도 가능하다. 예를 들면 인간 VH 도메인의 하나 이상의 부분 또는 단편을 갖는 본 발명의 나노바디의 하나 이상의 부분 또는 단편을 조합하는 것도 가능하다.
한 바람직한 양태에 따라서, 이러한 부분 또는 단편은 서열 번호 560∼621의 나노바디와 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 예컨대 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 동일성의 정도를 갖는다.
이러한 부분 및 단편, 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 자체 공지된 임의의 방식으로 제공되고, 선택가능하게는 조합될 수 있다. 예를 들면, 이러한 부분 또는 단편은 본 발명의 전체-크기의 나노바디를 코딩하는 핵산에 종결 코돈을 삽입하고, 이어서 이렇게 수득된 핵산을 자체 공지된 방식(예를 들어 본원에 기재된 바와 같음)으로 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 다르게는, 이러한 부분 또는 단편을 코딩하는 핵산은 본 발명의 전체 크기의 나노바디를 코딩하는 핵산을 적합하게 제한하고, 이러한 핵산을 자체 공지된 방식으로 합성함으로써 수득될 수 있다. 부분 또는 단편은 자체 공지된 펩티드 합성을 위한 기법을 사용하여 제공될 수도 있다.
본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 또한 본 발명의 나노바디의 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 일반적으로 본 발명의 나노바디, 및/또는 본 발명의 나노바디를 형성하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질, 특별히 화학적 및/또는 생물학적(예를 들어 효소적)으로 개질하여 수득될 수 있다.
이러한 개질의 예, 뿐만 아니라 이러한 방식으로 개질될 수 있는 나노바디 서열내의 아미노산 잔기의 예(즉, 단백질 주쇄, 그러나 바람직하게는 측쇄상의), 이러한 개질을 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 기법, 및 이러한 개질의 유효한 용도 및 이점은 숙련가에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 개질은 하나 이상의 작용기, 부분구조 또는 잔기의 본 발명의 나노바디 내로의 또는 상으로의 도입(예를 들어 공유적 결합에 의해 또는 다른 적합한 방식으로), 및 특별히 본 발명의 나노바디에 하나 이상의 원하는 특성 또는 작용성을 부여하는 하나 이상의 작용기, 부분구조 또는 잔기의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 숙련가에게 명백할 것이다.
예를 들면, 이러한 개질은 본 발명의 나노바디의 반감기, 용해도 및/또는 흡수성을 증가시키고, 본 발명의 나노바디의 면역원성 및/또는 독성을 감소시키고, 본 발명의 나노바디의 원치않는 부작용을 제거 또는 약화시키고/시키거나, 본 발명의 나노바디 및/또는 폴리펩티드에게 다른 유리한 특성을 부여하고/하거나 이의 원치않는 특성을 감소시키거나, 전술된 2개 이상의 임의의 조합된 특성을 갖는 하나 이상의 작용기의 도입(예를 들어 공유적 결합에 의해 또는 다른 적합한 방식으로)을 포함할 수 있다. 이러한 작용기 및 이를 도입하는 기법의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로 상기 본원에 인용된 일반적 배경기술에서 언급된 모든 작용기 및 기법, 뿐만 아니라 약학적 단백질의 개질, 특별히 항체 또는 항체 단편(ScFv 및 단일 도메인 항체를 포함함)의 개질에 대해 자체 공지된 작용기 및 기법을 포함할 수 있고, 이를 위해 예를 들면 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]을 참조한다. 이러한 작용기는 예를 들면 본 발명의 나노바디에 직접(예컨대 공유적으로) 연결되거나, 다시 숙련가에게 명백한 바와 같이, 선택가능하게는 적합한 연결기 또는 이격자를 경유하여 연결될 수 있다.
약학적 단백질의 반감기를 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키기 위한 가장 널리 사용되는 기법중 하나는 적합한 약리학으로 허용가능한 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 일반적으로, 페그화의 임의의 적합한 형태, 예컨대 항체 및 항체 단편(제한되지 않지만 (단일)도메인 항체 및 ScFv가 포함됨)을 위해 당분야에 사용되는 페그화가 이용될 수 있고; 예를 들면 문헌[Chapman, Nat. Biotechnol, 54, 531-545 (2002); by Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), by Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003)] 및 WO 제04/060965호를 참조한다. 단백질의 페그화를 위한 다양한 시약은 또한 상업적으로 입수가능하고, 예를 들면 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)(미국 소재)로부터이다.
바람직하게는, 부위-유도된 페그화가, 특별히 시스테인-잔기를 경유하여 사용된다(예를 들면 문헌[Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)] 참조). 예를 들면, 이를 위해, PEG는 본 발명의 나노바디에서 자연 발생되는 시스테인 잔기에 부착되고, 본 발명의 나노바디는 PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하도록 개질되거나, PEG의 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 나노바디의 N- 및/또는 C-말단에 융합될 수 있고, 이들 모두 숙련가에게 자체 공지된 단백질 공학의 기법을 사용한다.
바람직하게는, 본 발명의 나노바디 및 단백질에 대하여, 5000 초과, 예컨대 10,000초과 및 200,000 미만, 예컨대 100,000 미만; 예를 들면 20,000∼80,000 범위의 분자량을 갖는 PEG가 사용된다.
또다른, 대체적으로 덜 바람직한 개질은 N-연결되거나 O-연결된 글리코실화를, 대체적으로 동시-번역 개질 및/또는 번역후 개질의 일부로서, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라서 포함한다.
또다른 개질은 하나 이상의 검출가능한 표지 또는 신호-발생 기 또는 잔기를, 표지된 나노바디의 의도된 용도에 따라서 도입함을 포함한다. 이들을 부착하고, 사용하고, 검출하기에 적합한 표지 및 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면, 제한되지 않지만, 형광 표지(예컨대 플루오레세인(fluorescein), 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈데히드(o-phthaldehyde), 및 플루오레스카민(fluorescamine) 및 형광 금속, 예컨대 152Eu 또는 란탄계족으로부터의 다른 금속), 인광성 표지, 화학발광성(chemiluminescent) 표지 또는 생물발광성 표지(예컨대 루미날(luminal), 이소루미놀(isoluminol), 쎄로마틱 아크리디늄 에스터(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염, 옥살레이트 에스터, 디옥스에탄 또는 GFP 및 그의 유사체), 방사성-동위원소(예컨대 3H, 125I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe, 및 75Se), 금속, 금속 킬레이트 또는 금속성 양이온(예를 들면, 금속성 양이온, 예컨대 99 mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 및 68Ga, 또는 생체내, 시험관내에서, 또는 제자리 진단 및 이미지화에 사용하기에 특별히 적합한 다른 금속 또는 금속성 양이온(예컨대, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe), 뿐만 아니라 발색단 및 효소(예컨대 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 델타 -V-스테로이드 이성화효소, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오즈(triose) 포스페이트 이성화효소, 비오티나비딘 퍼옥시다아제(biotinavidin peroxidase), 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 아스파라기나아제(asparaginase), 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 글루코스-VI-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸콜린 에스테라아제(acetylcholine esterase))가 포함된다. 다른 적합한 표지는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 NMR 또는 ESR 분광기를 사용하여 검출될 수 있는 잔기가 포함된다.
본 발명의 이러한 표지된 나노바디 및 폴리펩티드는, 예를 들면, 특이적 표지의 선택에 따라, 시험관내, 생체내 또는 제자리 검정(자체 공지된 면역검정, 예컨대 ELISA, RIA, EIA 및 다른 "샌드위치 검정" 등이 포함됨)을 위해, 뿐만 아니라 생체내 진단 및 이미지화 목적을 위해 사용될 수 있다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 또다른 개질은, 예를 들면 상기 지칭된 금속 또는 금속 양이온중 하나를 킬레이트화하기 위한 킬레이트 기의 도입을 포함할 수 있다. 적합한 킬레이트 기로는, 예를 들면, 제한없이, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA: diethylenetriaminepentaacetic acid) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid)이 포함된다.
또다른 개질은 특이적 결합 쌍, 예컨대 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍의 한 부분인 작용기의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 작용기는 본 발명의 나노바디를 결합 쌍의 나머지 반에, 즉 결합 쌍의 형성을 통해, 결합되는 또다른 단백질, 폴리펩티드 또는 화학적 화합물에 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디는 비오틴에 컨쥬게이션되고(conjugated), 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이션된 또다른 단백질, 폴리펩티드, 또는 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이러한 컨쥬게이션된 나노바디는, 예를 들면 검출가능한 신호-생산 제제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이션되어 있는 진단 시스템에서, 수용체로서 사용될 수 있다. 이러한 결합 쌍은, 예를 들면 또한 본 발명의 나노바디를 담체, 예컨대 약학적 목적에 적합한 담체에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예는 문헌[Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000)]에 기재된 리포솜 배합물이다. 이러한 결합 쌍은 또한 본 발명의 나노바디에 치료 활성제를 연결시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 적용분야을 위해, 특별히 본 발명의 나노바디에 대한 표적을 발현시키는 세포를 사멸시키거나(예를 들어, 암의 치료), 이러한 세포의 성장 및/또는 증식을 감소 또는 저하시키고자 하는 적용분야를 위해, 본 발명의 나노바디는 또한 독소 또는 독성 잔기 또는 부분구조에 연결될 수 있다. 본 발명의 나노바디에 연결되어, 예를 들면 세포독성 화합물을 제공할 수 있는 독성 잔기, 화합물 또는 부분구조의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 상기 인용된 선행 기술 및/또는 본원의 추가의 기재내용에서 찾아볼 수 있다. 한 예는 WO 제03/055527호에 기재된 소위 ADEPT(등록상표) 기술이다.
다른 유효한 화학적 및 효소적 개질은 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 개질은 또한 조사 목적을 위해(예를 들어 기능-활성 상관관계를 연구하기 위해) 도입될 수 있다. 예를 들면 문헌[Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997)]을 참조한다.
바람직하게는, 유도체는 이들이 본 발명의 나노바디에 대해 본원에 정의된 친화도(본원에 추가로 기재된 바와 같이, KD-값(실제값 또는 겉보기값), KA-값(실제값 또는 겉보기값), kon-속도 및/또는 koff-속도, 또는 다르게는 IC50 값으로서 적합하게 측정되고/되거나 표현됨)로 RANK-L에 결합할 수 있도록 한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 나노바디로 본질적으로 구성되거나 이를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. "본질적으로 구성된다"는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 나노바디의 아미노산 서열의 아미노 말단 단부, 카복시 말단 단부, 또는 아미노 말단 단부 및 카복시 말단 단부 둘다에 첨가된 제한된 수의 아미노산 잔기, 예컨대 1∼20개의 아미노산 잔기, 예를 들면 1∼10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1∼6개의 아미노산 잔기, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산 잔기를 갖는 본 발명의 나노바디의 아미노산 서열과 정확히 동일하거나 본 발명의 나노바디의 아미노산 서열에 상응한다는 의미이다.
상기 아미노산 잔기는 나노바디의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 바꾸거나 달리 영향을 주거나 주지 않을 수 있고, 추가의 작용성을 나노바디에게 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 예를 들면, 이러한 아미노산 잔기는:
-예를 들면 이종기원의 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현의 결과로서, N-말단 Met 잔기를 포함할 수 있다;
-합성시 숙주 세포로부터의 나노바디의 분비를 이끄는 신호 서열 또는 리더(leader) 서열을 형성할 수 있다. 적합한 분비 리더 펩티드는 숙련가에게 명백할 것이고, 본원에 추가로 기재된 바와 같다. 대체적으로, 이러한 리더 서열은 나노바디의 N-말단에 연결되지만, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않는다;
-나노바디가 특정 유기체, 조직, 세포, 또는 세포의 부분 또는 격실로 유도되고/되거나 이에 침투하거나 진입하도록 허용하고,하거나, 나노바디가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포층, 종양, 예컨대 고형 종양, 또는 혈뇌-장벽을 침투하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 몇몇 비제한적인 예는 WO 제03/026700호 및 문헌[Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001)], [Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004)] 및 [Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001)]에 기재된 작은 펩티드 벡터("펩-트랜스 벡터(Pep-trans vectors)"), 및 문헌[Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003)]에 기재된 막 트랜스로케이터(translocator) 서열이다. 항체 단편의 세포내 표적화를 위한 C-말단 및 N-말단 아미노산 서열은 예를 들면 문헌[Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004)]에 기재되어 있다. 세포내 표적화를 위한 적합한 기법으로는, 아래에 언급된 바와 같이, 본 발명의 나노바디를 포함하는 소위 "인트라바디(intrabody)의 발현 및/또는 사용을 포함한다;
-예를 들면 서열 또는 잔기에 대한 친화도 기법을 사용하는, 나노바디의 정제를 허용하거나 촉진시키는 "태그(tag)", 예를 들면 아미노산 서열 또는 잔기를 형성할 수 있다. 이후, 상기 서열 또는 잔기는 제거되어(예를 들어 화학적 또는 효소적 분할에 의해) 나노바디 서열을 제공할 수 있다(이를 위해, 태그는 선택가능하게는 나노바디 서열에 분할가능한 연결기 서열을 경유하여 연결되거나, 분할가능한 잔기를 함유함). 이러한 잔기의 몇몇 바람직하지만 비제한적인 예는 다중 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc-태그(예를 들면 WO 제06/12282호의 서열 번호 31 참조)이다.
-작용화되고/되거나 작용기의 부착을 위한 부위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 적합한 아미노산 잔기 및 작용기는 숙련가에게 명백할 것이고, 제한되지 않지만, 본 발명의 나노바디의 유도체에 대해 본원에 언급된 아미노산 잔기 및 작용기가 포함된다.
또다른 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 그의 아미노 말단 단부, 그의 카복시 말단 단부, 또는 그의 아미노 말단 단부 및 그의 카복시 말단 단부 둘다에서 적어도 하나의 추가의 아미노산 서열에 융합되어, 즉 본 발명의 상기 나노바디 및 하나 이상의 추가의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 본 발명의 나노바디를 포함한다. 이러한 융합은 또한 본원에 "나노바디 융합"으로 지칭될 것이다.
하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 임의의 적합한 및/또는 원하는 아미노산 서열일 수 있다. 추가의 아미노산 서열은 나노바디의 (생물학적) 특성을 변화시키거나, 바꾸거나 달리 영향을 주거나 주지 않을 수 있고, 추가의 작용성을 나노바디에게 부가하거나 부가하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 추가의 아미노산 서열은 이것이 하나 이상의 원하는 특성 또는 작용성을 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드에게 부여하도록 한다.
예를 들면, 추가의 아미노산 서열은 또한 제2 결합 부위를 제공하고, 이러한 결합 부위는 임의의 원하는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프(제한되지 않지만, 본 발명의 나노바디가 유도되는 동일한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프, 또는 상이한 단백질, 폴리펩티드, 항원, 항원 결정자 또는 에피토프가 포함됨)로 유도될 수 있다.
이러한 아미노산 서열의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로 종래의 항체 및 이의 단편(제한되지 않지만 ScFv 및 단일 도메인 항체가 포함됨)에 기초한 펩티드 융합에 사용되는 모든 아미노산 서열이 포함된다. 예를 들면 문헌[Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005)]을 참조한다.
예를 들면, 이러한 아미노산 서열은, 본 발명의 나노바디 자체에 비하여, 본 발명의 폴리펩티드의 반감기, 용해도 또는 흡수성을 증가시키고, 면역원성 또는 독성을 감소시키고, 원치않는 부작용을 제거 또는 약화시키고/시키거나, 다른 유리한 특성을 부여하고/하거나 원치않는 특성을 감소시키는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 몇몇 비제한적인 예는 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민(예를 들면 제WO 00/27435호 참조) 또는 합텐성(haptenic) 분자(예를 들면, 항체를 순환시킴으로써 인식되는 합텐, 예를 들면 WO 제98/22141호 참조)일 수 있다.
특별히, 면역글로불린의 단편(예컨대 VH 도메인)을 혈청 알부민 또는 이의 단편에 연결시킴은 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 것이 당분야에 기재되어 있다. WO 제00/27435호 및 WO 제01/077137호를 참조한다. 본 발명에 따라서, 본 발명의 나노바디는 바람직하게는 혈청 알부민(또는 이의 적합한 단편)에 직접적으로 또는 적합한 연결기를 통해 연결되고, 특별히 본 발명의 폴리펩티드가 유전적 융합(단백질)로서 발현할 수 있도록 연결된 적합한 펩티드를 경유하여 연결된다. 한 구체적인 양태에 따라서, 본 발명의 나노바디는 적어도 혈청 알부민의 도메인 III 또는 이의 부분을 포함하는 혈청 알부민의 단편에 연결될 수 있다. 예를 들면 WO 제07/112940호(Ablynx N.V.)를 참조한다.
다르게는, 추가의 아미노산 서열은 혈청 단백질(예컨대, 예를 들면, 인간 혈청 알부민 또는 다른 혈청 단백질, IgG)에 대한 제2 결합 부위 또는 결합 단위를 제공하여, 혈청에서 증가된 반감기를 제공할 수 있다. 이러한 아미노산 서열로는, 예를 들면 아래에 기재된 나노바디, 뿐만 아니라 WO 제91/01743호, WO 제01/45746호 및 WO 제02/076489호에 기재된 작은 펩티드 및 결합 단백질, 및 WO 제03/002609호 및 WO 제04/003019호에 기재된 dAb가 포함된다. 또한 문헌[Harmsen et al, Vaccine, 23 (41); 4926-42, 2005]], 뿐만 아니라 EP 제0 368 684호, 뿐만 아니라 다음의 미국 가특허 출원 제60/843,349호(또한 PCT/EP2007/059475호 참조), 제60/850,774호(또한 PCT/EP2007/060849호 참조), 제60/850,775호(또한 PCT/EP2007/060850호 참조)(Ablynx N.V.)(본원에 언급됨) 및 2006년 12월 5일자로 출원된 "혈청 단백질에 결합가능한 펩티드"란 명칭의 미국 가특허 출원(Ablynx N.V.)(또한 PCT/EP2007/063348호 참조)을 참조한다.
이러한 아미노산 서열은 특별히 혈청 알부민(보다 특별히 인간 혈청 알부민) 및/또는 IgG(보다 특별히 인간 IgG)로 유도될 수 있다. 예를 들면, 이러한 아미노산 서열은 (인간)혈청 알부민으로 유도되는 아미노산 서열, 및 혈청 알부민의 FcRn로의 결합에 관여되지 않은 (인간)혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면 WO 제06/0122787호 참조) 및/또는 혈청 알부민의 도메인 III의 부분을 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합가능한 아미노산 서열(다시 예를 들면 WO 제06/0122787호 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면 WO 제08/028977호(Ablynx N.V.) 참조); 적어도 하나의 종의 포유동물, 특별히 적어도 하나의 종의 영장류(예컨대, 제한없이, 마카카 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특별히, 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스) 및/또는 레서스 원숭이(마카카물라타)) 및 개코원숭이(파피오 우르시너스), 다시 미국 가특허 출원 제60/843,349호 및 PCT/EP2007/059475호 참조)로부터의 혈청 알부민과 교차-반응성인 인간 혈청 알부민에 대한 아미노산 서열; pH 독립적 방식으로 혈청 알부민에 결합할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면 2006년 10월 11월자로 출원된, "Ph에 본질적으로 독립적인 방식으로 혈청 단백질에 결합하는 아미노산 서열, 이를 포함하는 화합물 및 이의 용도(Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and uses thereof)"란 명칭의 미국 가특허 출원 제60/850,774호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/059475호 참조) 및/또는 조건적 결합제인 아미노산 서열(예를 들면 2006년 10월 11일자로 출원된, "조건적 방식으로 원하는 분자에 결합하는 아미노산 서열(Amino acid sequences that bind to a desired molecule in a conditional manner)"이란 명칭의 미국 가특허 출원 제60/850,775호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/060850호 참조)일 수 있다.
또다른 양태에 따라서, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 종래의 4-쇄 항체(특별히 인간 항체) 및/또는 중쇄 항체의 하나 이상의 부분, 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 대체적으로 덜 바람직하지만, 본 발명의 나노바디는 종래의 (바람직하게는 인간)VH 또는 VL 도메인에, 또는 VH 또는 VL 도메인의 천연 또는 합성 유사체에, 다시 선택가능하게는 연결기 서열(제한되지 않지만 다른 (단일)도메인 항체, 예컨대 문헌[Ward et al.]에 기재된 dAb가 포함됨)을 경유하여 연결될 수 있다.
적어도 하나의 나노바디는 또한 하나 이상의 (바람직하게는 인간)CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인에, 선택가능하게는 연결기 서열을 경유하여 연결될 수 있다. 예를 들면, 적합한 CH1 도메인에 연결된 나노바디는, 예를 들면-적합한 경쇄와 함께-종래의 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 유사한 항체 단편/구조물을 생성하기 위해 사용될 수 있지만, 여기서 종래의 VH 도메인들중 하나((F(ab')2 단편의 경우), 또는 둘다는 본 발명의 나노바디로 대체되어 졌다. 또한, 2개의 나노바디는 CH3 도메인(선택가능하게는 연결기를 통해)에 연결되어 생체내의 반감기가 증가된 구조물을 제공할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 구체적인 한 양태에 따라서, 본 발명의 하나 이상의 나노바디는 하나 이상의 불변성 도메인(예를 들면, Fc 부분의 일부로서/이를 형성하기 위해 사용될 수 있는 2 또는 3개의 불변성 도메인), Fc 부분 및/또는 하나 이상의 항체 부분, 단편, 또는 도메인(본 발명의 폴리펩티드에 하나 이상의 이펙터(effector) 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합할 수 있는 능력을 부여함)에 연결될 수 있다(선택가능하게는 적합한 연결기 또는 힌지(hinge) 영역을 경유하여). 예를 들면, 이를 위하여, 제한없이, 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 항체, 예컨대 중쇄 항체(본원에 기재된 바와 같음), 보다 바람직하게는 종래의 인간 4-쇄 항체로부터의 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고/있거나; 예를 들면 IgG(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)로부터, IgE로부터 또는 또다른 인간 Ig 예컨대 IgA, IgD 또는 IgM으로부터 Fc 영역(의 일부)를 형성할 수 있다. 예를 들면, WO 제94/04678호는 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 인간화된 유도체(즉, 나노바디)를 포함하는 중쇄 항체를 기재하고 있고, 여기서 카멜리드 CH2 및/또는 CH3 도메인은 인간 CH2 및 CH3 도메인으로 대체되어 각각 나노바디 및 인간 CH2 및 CH3 도메인(그러나 CH1 도메인은 아님)을 포함하는 2개의 중쇄로 구성된 면역글로불린을 제공하고, 이러한 면역글로불린은 CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공된 이펙터 기능을 갖고, 이러한 면역글로불린은 임의의 경쇄의 부재하에 작용할 수 있다. 본 발명의 나노바디에 적합하게 연결되어 이펙터 기능을 제공할 수 있는 다른 아미노산 서열은 숙련가에게 명백할 것이고, 원하는 이펙터 기능(들)에 기초하여 선택된다. 예를 들면 WO 제04/058820호, WO 제99/42077호, WO 제02/056910호 및 WO 제05/017148호, 뿐만 아니라 상기 문헌[Holliger and Hudson], 및 예비-공개되지 않은, 2007년 12월 4일자로 출원된 "IgE로부터 유도된 단일 가변 도메인 및 Fc 부분을 포함하는 구조물(Constructs comprising single variable domains and an Fc portion derived from IgE)"란 명칭의 미국 가특허 출원(Ablynx N.V.)을 참조한다. 본 발명의 나노바디의 Fc 부분으로의 커플링은 또한 본 발명의 상응하는 나노바디와 비교하여 증가된 반감기를 유도한다. 몇몇 적용분야를 위해, 임의의 생물학적으로 유의한 이펙터 기능없이 증가된 반감기를 부여하는 Fc 부분 및/또는 불변성 도메인(즉, CH2 및/또는 CH3 도메인)의 사용이 또한 적합하거나 더 바람직하다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 하나 이상의 나노바디 및 하나 이상의 불변성 도메인을 포함하는 다른 적합한 구조물은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 CH3 도메인에, 선택가능하게는 연결기 서열을 경유하여 연결된 2개의 나노바디를 포함한다. 일반적으로, 증가된 반감기를 갖는 임의의 융합 단백질 또는 유도체는 바람직하게는 50 kD 초과의 분자량(신장 흡수에 대한 한계(cut-off) 값)을 갖는다.
또다른 구체적이지만 비제한적인 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 형성하기 위해, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열은 이량체로 자가-회합되는 경향이 감소된(또는 본질적으로 없는)(즉 종래의 4-쇄 항체에서 자연 발생된 불변성 도메인에 비하여) 자연 발생, 합성 또는 반합성 불변성 도메인(또는 이의 유사체, 변형체, 돌연변이체, 부분 또는 단편)에 연결될 수 있다(선택가능하게는 적합한 연결기 또는 힌지 영역을 경유하여). 이러한 단량체성(즉, 자가-회합되지 않은) Fc 쇄 변형체, 또는 이의 단편은 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 문헌[Helm et al., J Biol Chem 1996 271 7494]에는 본 발명의 폴리펩티드 쇄에 사용될 수 있는 단량체성 Fcε 쇄 변형체가 기재되어 있다.
또한, 이러한 단량체성 Fc 쇄 변형체는 바람직하게는 이들이 보충 또는 관련 Fc 수용체(들)에 여전히 결합가능하고/하거나(이들이 유도된 Fc 부분에 의존하여), 이들이 유도되는 Fc 부분의 이펙터 기능의 일부 또는 전부를(또는 의도된 용도에 여전히 적합한 감소된 정도로) 가질 수 있다. 다르게는, 본 발명의 이러한 폴리펩티드 쇄에서, 단량체성 Fc 쇄는 폴리펩티드 쇄에 증가된 반감기를 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이 경우 단량체성 Fc 쇄는 또한 이펙터 기능을 갖지 않거나 본질적으로 갖지 않는다.
본 발명의 2가/다가, 이특이적/다중특이적 또는 비파라토프성(biparatopic)/다파라토프성(multiparatopic) 폴리펩티드는 또한 Fc 부분에 연결되어, 예비-공개되지 않은, 2007년 12월 4일자로 출원된 "면역글로불린 구조물(Immunoglobulin constructs)"란 명칭의 미국 가특허 출원 제61/005,331호에 기재된 유형의 폴리펩티드 구조물을 제공할 수 있다.
추가의 아미노산 서열은 또한 합성시 숙주 세포로부터의 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드의 분비를 유도하는 신호 서열 또는 리더 서열을 형성할 수 있다(예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위해 사용된 숙주 세포에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 프리(pre)폴리펩티드, 프로(pro)폴리펩티드 또는 프리프로(prepro)폴리펩티드 형태를 제공하기 위함).
추가의 아미노산 서열은 또한 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드가 특정 기관, 조직, 세포, 또는 세포의 부분 또는 격실로 유도되고/되거나 침투하거나 진입하도록 허용하고/하거나, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩티드가 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포층, 종양, 예컨대 고형 종양, 또는 혈뇌-장벽을 침투하거나 가로지르도록 허용하는 서열 또는 신호를 형성할 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 제한되지 않지만, 예를 들면 상기 언급된 "펩트랜스" 벡터, 문헌[Cardinale et al.]에 기재된 서열, 및 본 발명의 나노바디 및 폴리펩티드를 발현 또는 생산하기 위해 사용될 수 있는 자체 공지된 아미노산 서열 및 항체 단편(소위 "인트라바디")이 포함되고, 예를 들면 WO 제94/02610호, WO 제95/22618호, US-A-제7004940호, WO 제03/014960호, WO 제99/07414호; WO 제05/01690호; EP 제1 512 696호; 및 문헌[Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag] 및 [Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170], 및 본원에 기재된 추가의 문헌에 기재된 바와 같다.
몇몇 적용분야를 위해, 특별히 본 발명의 나노바디가 유도되는 표적을 발현하는 세포를 사멸시키거나(예를 들어, 암의 치료에서), 이러한 세포의 성장 및/또는 증식을 감소 또는 저하시키도록 의도되는 적용분야를 위해, 본 발명의 나노바디는 또한 (세포)독성 단백질 또는 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 세포독성 폴리펩티드를 제공하기 위해 본 발명의 나노바디에 연결될 수 있는 상기 독성 단백질 및 폴리펩티드의 예는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 상기 인용된 선행 기술 및/또는 본원의 추가의 기재내용에서 찾아볼 수 있다. 한 예는 WO 제03/055527호에 기재된 소위 ADEPT(등록상표) 기술이다.
바람직하지만 비제한적인 한 양태에 따라서, 상기 하나 이상의 추가의 아미노산 서열은 적어도 하나의 추가의 나노바디를 포함하여, 적어도 2개, 예컨대 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 상기 나노바디는 선택가능하게는 하나 이상의 연결기 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 경유하여 연결될 수 있다. 2개 이상의 나노바디(이중 적어도 하나는 본 발명의 나노바디임)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 본원에서 본 발명의 "다가" 폴리펩티드로서 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩티드에 존재하는 나노바디는 또한 "다가 포맷"으로 존재하는 것으로 본원에 지칭될 것이다. 예를 들면 본 발명의 "2가" 폴리펩티드는, 선택가능하게는 연결기 서열을 경유하여 연결된 2개의 나노바디를 포함하는 한편, 본 발명의 "3가" 폴리펩티드는, 선택가능하게는 2개의 연결기 서열을 경유하여 연결된 3개의 나노바디를 포함하는 등이고; 여기서 폴리펩티드에 존재하는 적어도 하나의 나노바디 내지 폴리펩티드에 존재하는 모든 나노바디는 본 발명의 나노바디이다.
본 발명의 다가 폴리펩티드에서, 2개 이상의 나노바디는 동일하거나 상이하고, 동일한 항원 또는 항원 결정자(예를 들면 동일한 부분(들) 또는 에피토프(들), 또는 상이한 부분 또는 에피토프)로 유도될 수 있거나, 다르게는 상이한 항원 또는 항원 결정자, 또는 이의 임의의 적합한 조합으로 유도된다. 예를 들면, 본 발명의 2가 폴리펩티드는 (a) 2개의 동일한 나노바디; (b) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정자에 대한 제1 나노바디, 및 상기 단백질 또는 항원의 동일한 항원 결정자에 대한 제2 나노바디(이는 제1 나노바디와 상이함); (c) 단백질 또는 항원의 제1 항원 결정자에 대한 제1 나노바디, 및 상기 단백질 또는 항원의 또다른 항원 결정자에 대한 제2 나노바디; 또는 (d) 제1 단백질 또는 항원에 대한 제1 나노바디, 및 제2 단백질 또는 항원(즉, 상기 제1 항원과 상이함)에 대한 제2 나노바디를 포함할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 3가 폴리펩티드는, 예를 들면 제한없이, (a) 3개의 동일한 나노바디; (b) 항원의 제1 항원 결정자에 대한 2개의 동일한 나노바디 및 동일한 항원의 상이한 항원 결정자에 대한 제3 나노바디; (c) 항원의 제1 항원 결정자에 대한 2개의 동일한 나노바디 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제3 나노바디; (d) 제1 항원의 제1 항원 결정자에 대한 제1 나노바디, 상기 제1 항원의 제2 항원 결정자에 대한 제2 나노바디, 및 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제3 나노바디; 또는 (e) 제1 항원에 대한 제1 나노바디, 상기 제1 항원과 상이한 제2 항원에 대한 제2 나노바디, 및 상기 제1 및 제2 항원과 상이한 제3 항원에 대한 제3 나노바디를 포함할 수 있다.
적어도 2개의 나노바디(여기서 적어도 하나의 나노바디는 제1 항원(즉 RANK-L)으로 유도되고, 적어도 하나의 나노바디는 제2 항원(즉, RANK-L과 상이함)으로 유도됨)를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드는 또한 본 발명의 "다중특이적" 폴리펩티드로서 지칭될 것이고, 이러한 폴리펩티드에 존재하는 나노바디는 "다중특이적 포맷"으로 존재하는 것으로 본원에 지칭될 것이다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 "이특이적" 폴리펩티드는 제1 항원(즉, RANK-L)에 대한 적어도 하나의 나노바디 및 제2 항원(즉, RANK-L과 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 나노바디를 포함하는 폴리펩티드인 한편, 본 발명의 "삼특이적" 폴리펩티드는 제1 항원(즉, RANK-L)에 대한 적어도 하나의 나노바디, 제2 항원(즉, RANK-L과 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 나노바디 및 제3 항원(즉, RANK-L 및 제2 항원 둘다와 상이함)에 대한 적어도 하나의 추가의 나노바디를 포함하는 폴리펩티드이고, 이후 이와 같다.
따라서, 그의 가장 간단한 형태로, 본 발명의 이특이적 폴리펩티드는 RANK-L에 대한 제1 나노바디 및 제2 항원에 대한 제2 나노바디를 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 나노바디가 선택가능하게는 연결기 서열(본원에 정의된 바와 같음)을 경유하여 연결될 수 있는 본 발명의 2가 폴리펩티드(본원에 정의된 바와 같음)인 한편, 본 발명의 삼특이적 폴리펩티드는 그의 가장 간단한 형태로 RANK-L에 대한 제1 나노바디, 제2 항원에 대한 제2 나노바디, 및 제3 항원에 대한 제3 나노바디를 포함하고, 여기서 상기 제1, 제2 및 제3 나노바디가 선택가능하게는 하나 이상, 특별히 하나 더 많게, 특별히 2개의 연결기 서열을 경유하여 연결될 수 있는 본 발명의 3가 폴리펩티드(본원에 정의된 바와 같음)이다.
그러나, 상기 본원의 기재내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드가 RANK-L에 대한 적어도 하나의 나노바디, 및 RANK-L과 상이한 하나 이상의 항원에 대한 임의의 수의 나노바디를 포함할 수 있다는 점에서 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
더욱이, 본 발명의 폴리펩티드중의 다양한 나노바디의 특이적 순서 또는 정렬이 본 발명의 최종 폴리펩티드의 특성(제한되지 않지만, RANK-L, 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력이 포함됨)에 어떤 영향을 준다는 사실이 본 발명의 범주내에 포함되지만, 상기 순서 또는 정렬은 대체적으로 중요하지 않고, 선택가능하게는 본원의 개시내용에 기초한 몇몇 제한된 일상적 실험 이후에 숙련가에 의해 적합하게 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적인 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드를 참조할 경우, 이는 별도로 명확히 지시되지 않는 한 관련 나노바디의 임의의 순서 또는 정렬을 포함함을 주지해야 한다.
마지막으로, 본 발명의 폴리펩티드가 2개 이상의 나노바디 및 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(본원에 언급된 바와 같음)을 함유하는 것도 본 발명의 범주내에 속한다.
하나 이상의 VHH 도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드, 및 이의 제조를 위해, 또한 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001]; [Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302]; 뿐만 아니라 예를 들면 WO 제96/34103호 및 WO 제99/23221호를 참조한다. 본 발명의 몇몇 구체적인 다중특이적 및/또는 다가 폴리펩티드의 몇몇 다른 예는 본원에 언급된 특허 출원(Ablynx N.V.)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 다중특이적 폴리펩티드의 바람직하지만 비제한적인 한 예는 적어도 하나의 본 발명의 나노바디 및 증가된 반감기를 위해 제공된 적어도 하나의 나노바디를 포함한다. 이러한 나노바디는 예를 들면 혈청 단백질, 특별히 인간 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 티록신-결합 단백질, (인간)트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen), 면역글로불린, 예컨대 IgG, IgE 또는 IgM, 또는 WO 제04/003019호에 열거된 혈청 단백질에 대한 나노바디이다. 이들중, 혈청 알부민(특별히 인간 혈청 알부민) 또는 IgG (특별히 인간 IgG, 예를 들면 상기 문헌[Muyldermans]에 기재된 나노바디 VH-1)에 결합할 수 있는 나노바디가 특별히 바람직하다(예를 들면, 마우스 또는 영장류에서의 실험의 경우, 개별적으로 마우스 혈청 알부민(MSA: mouse serum albumin) 또는 상기 영장류로부터의 혈청 알부민에 대한 나노바디 또는 이와 교차-반응성인 나노바디가 사용될 수 있음. 그러나, 약학적 용도를 위해, 인간 혈청 알부민 또는 인간 IgG에 대한 나노바디가 대체적으로 바람직함). 증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 나노바디로는 WO 제04/041865호, WO 제06/122787호, 및 추가의 특허 출원(Ablynx N.V.), 예컨대 상기 언급된 특허 출원에 기재된 혈청 알부민에 대한 나노바디가 포함된다.
예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 증가된 반감기를 제공하는 몇몇 바람직한 나노바디로는 혈청 알부민의 FcRn으로의 결합에 관여되지 않는 (인간)혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있는 나노바디(예를 들면 WO 제06/0122787호 참조; 혈청 알부민의 도메인 III의 일부를 형성하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합가능한 나노바디(예를 들면 WO 제06/0122787호 참조); 증가된 반감기를 갖거나 제공할 수 있는 나노바디(예를 들면 본원에 언급된 미국 가특허 출원 제60/843,349호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/059475호 참조); 적어도 하나의 종의 포유동물, 특별히 적어도 하나의 종의 영장류(예컨대, 제한없이, 마카카 속으로부터의 원숭이(예컨대, 특별히, 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스) 및/또는 레서스 원숭이(마카카물라타)) 및 개코원숭이(파피오 우르시너스))로부터의 혈청 알부민과 교차-반응성인 인간 혈청 알부민에 대한 나노바디(예를 들면 미국 가특허 출원 제60/843,349호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/059475호 참조); pH 독립적 방식으로 혈청 알부민에 결합될 수 있는 나노바디(예를 들면 미국 가특허 출원 제60/850,774호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/060849호 참조) 및/또는 조건적 결합제인 나노바디(예를 들면 미국 가특허 출원 제60/850,775호(Ablynx N.V.) 참조; 또한 PCT/EP2007/060850호 참조)가 포함된다.
증가된 반감기를 제공하고 본 발명의 폴리펩티드에 사용될 수 있는 몇몇 특별히 바람직한 나노바디로는 WO 제06/122787호에 개시된 나노바디 ALB-1∼ALB-10(표 II 및 III 참조)가 포함되고, 이중 ALB-8(WO 제06/122787호에서 서열 번호 62)이 특별히 바람직하다.
적어도 하나의 본 발명의 나노바디 및 증가된 반감기를 제공하는 적어도 하나의 나노바디를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 서열 번호 694∼729 및 759∼760에 제시된다.
본 발명의 구체적이지만 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 하나 이상의 나노바디 이외에, 인간 혈청 알부민에 대한 적어도 하나의 나노바디를 함유한다.
일반적으로, 하나 이상의 본 발명의 나노바디를 함유하고 반감기가 증가된 본 발명의 임의의 폴리펩티드, 및 반감기가 증가된 본 발명의 나노바디 또는 이러한 폴리펩티드의 임의의 유도체는, 바람직하게는, 본 발명의 상응하는 나노바디 자체에 비하여, 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 이상 더 큰 반감기를 갖는다. 예를 들면, 반감기가 증가된 이러한 유도체 또는 폴리펩티드는, 본 발명의 상응하는 나노바디 자체에 비하여, 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 또는 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 더 초과하여 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 양태에서, 이러한 유도체 또는 폴리펩티드는 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상의 인간에서의 혈청 반감기를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 이러한 유도체 또는 폴리펩티드는 5일 이상(예컨대 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 폴리펩티드는 생체내 폴리펩티드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합가능하다.
본 발명의 폴리펩티드는 분해 및/또는 소거 또는 소실을 억제하는 분자에 결합함으로써 생체내에서 안정화되고, 이들의 반감기는 증가된다. 전형적으로, 이러한 분자는 생체내에서 그 자체로 긴 반감기를 갖는 자연 발생 단백질이다.
다중특이적인 본 발명의 폴리펩티드의 또다른 바람직하지만 비제한적인 예는 적어도 하나의 본 발명의 나노바디, 및 본 발명의 폴리펩티드를 특정한 조직, 세포, 또는 세포의 부분 또는 격실로 유도하고/하거나 본 발명의 폴리펩티드가 이에 침투하거나 진입할 수 있도록 허용하고/하거나, 생물학적 장벽, 예컨대 세포막, 세포층, 예컨대 상피 세포층, 종양, 예컨대 고형 종양, 또는 혈뇌-장벽을 침투하거나 가로지르도록 허용하는 적어도 하나의 나노바디를 포함한다. 이러한 나노바디의 예로는 원하는 기관, 조직 또는 세포의 특이적 세포-표면 단백질, 마커 또는 에피토프(예를 들면 종양 세포와 연관된 세포-표면 마커), 및 WO 제02/057445호 및 WO 제06/040153호에 기재된 단일-도메인 뇌 타게팅 항체 단편(이중 FC44(WO 제06/040153호의 서열 번호 189) 및 FC5(WO 제06/040154호의 서열 번호 190)가 가장 바람직한 예임)으로 유도되는 나노바디가 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드에서, 하나 이상의 나노바디 및 하나 이상의 폴리펩티드는 서로 직접적으로 연결되고/되거나(예를 들면 WO 제99/23221호에 기재된 바와 같음) 하나 이상의 적합한 이격자 또는 연결기, 또는 이의 임의의 조합을 경유하여 서로에게 연결될 수 있다.
다가 및 다중특이적 폴리펩티드에 사용하기에 적합한 이격자 또는 연결기는 숙련가에게 명백할 것이고, 일반적으로 아미노산 서열을 연결시키기 위해 당분야에 사용되는 임의의 연결기 또는 이격자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 연결기 또는 이격자는 약학적 용도를 위해 의도되는 단백질 또는 폴리펩티드를 작성하는데 사용하기에 적합하다.
몇몇 특별히 바람직한 이격자로는 항체 단편 또는 항체 도메인을 연결시키기 위해 당분야에 사용되는 이격자 및 연결기가 포함된다. 이들로는 상기 인용된 일반적 배경기술에 언급된 연결기, 뿐만 아니라 예를 들면 다이어바디 또는 ScFv 단편을 작성하기 위해 당분야에 사용되는 연결기가 포함된다(그러나, 이와 관련하여, 다이어바디 및 ScFv 단편에서, 사용된 연결기 서열은 적절한 VH 및 VL 도메인이 함께 완전한 항원-결합 부위를 형성하도록 허용하는 길이, 가요성 정도 및 다른 특성을 가져야 하는 반면, 각각의 나노바디는 그 자체로 완전한 항원-결합 부위를 형성하므로 본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 연결기의 길이 또는 가요성에 대해 특별한 제한이 없음을 주지해야 함).
예를 들면, 연결기는 적합한 아미노산 서열, 특별히 1∼50개, 바람직하게는 1∼30개, 예컨대 1∼10개 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 몇몇 바람직한 예로는 gly-ser 연결기, 예를 들면 (glyxsery)z 유형의 연결기, 예컨대 예를 들면 WO 제99/42077호에 기재된 바와 같은 (gly4ser)3 또는 (gly3ser2)3, 및 본원에 언급된 특허 출원(Ablynx)에 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 연결기(예를 들면 WO 제06/040153호 및 WO 제06/122825호 참조), 뿐만 아니라 힌지-유사 영역, 예컨대 자연 발생 중쇄 항체의 힌지 영역 또는 유사 서열(예컨대 WO 제94/04678호에 기재됨)일 수 있다.
몇몇 특히 바람직한 다른 연결기는 폴리-알라닌(예컨대 AAA), 뿐만 아니라 연결기 GS30(WO 제06/122825호의 서열 번호 85) 및 GS9(WO 제06/122825호의 서열 번호 84)이다.
다른 적합한 연결기는 일반적으로 유기 화합물 또는 중합체, 특별히 약학적 용도를 위해 단백질에 사용하기에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들면, 폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 항체 도메인을 연결시키기 위해 사용되어 왔고, 예를 들면 WO 제04/081026호를 참조한다.
사용된 연결기(들)의 길이, 가요성도 및/또는 다른 특성(중요하진 않지만, 대체적으로 ScFv 단편에 사용되는 연결기에 대해서와 같음)이 본 발명의 최종 폴리펩티드의 특성, 제한되지 않지만 예컨대 RANK-L, 또는 하나 이상의 다른 항원에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력에 어떤 영향을 미칠 수 있음은 본 발명의 범주내에 포함된다. 본원의 개시내용에 기초하여, 숙련가는 선택가능하게는 몇몇 제한된 일상적 실험 이후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 연결기(들)를 결정할 수 있을 것이다.
예를 들면, 다량체성 항원(예컨대 다량체성 수용체 또는 다른 단백질)에 대한 나노바디를 포함하는 본 발명의 다가 폴리펩티드에서, 연결기의 길이 및 가요성은 폴리펩티드에 존재하는 본 발명의 나노바디 각각이 다량체의 각각의 서브유닛 상의 항원 결정자에 결합하는 것을 허용하도록 하는 것이 바람직하다. 유사하게, 동일한 항원 상의 2개 이상의 상이한 항원 결정자(예를 들면 항원의 상이한 에피토프 및/또는 다량체 수용체, 채널 또는 단백질의 상이한 서브유닛)에 대한 나노바디를 포함하는 본 발명의 다중특이적 폴리펩티드에서, 연결기의 길이 및 가요성은 각각의 나노바디가 이의 의도된 항원 결정자에 결합하는 것을 허용하도록 하는 것이 바람직하다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 숙련가는 선택가능하게는 몇몇 제한된 일상적 실험 이후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 연결기(들)를 결정할 수 있을 것이다.
또한 사용된 연결기가 하나 이상의 다른 바람직한 특성 또는 작용성을 본 발명의 폴리펩티드에 부여하고/하거나, 유도체의 형성 및/또는 작용기의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 제공하는 것(예를 들면 본 발명의 나노바디의 유도체를 위해 본원에 기재된 바와 같음)은 본 발명의 범주내에 있다. 예를 들면, 하나 이상의 하전된 아미노산 잔기(상기 표 A-2 참조)를 함유하는 연결기는 개선된 친수성 특성을 제공할 수 있는 반면, 작은 에피토프 또는 태그를 형성하거나 함유하는 연결기는 검출, 동정 및/또는 정제를 위해 사용될 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 숙련가는 선택가능하게는 몇몇 제한된 일상적 실험 이후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 연결기(들)를 결정할 수 있을 것이다.
최종적으로, 2개 이상의 연결기가 본 발명의 폴리펩티드에 사용되는 경우, 이들 연결기는 동일하거나 상이할 수 있다. 다시, 본원의 개시내용에 기초하여, 숙련가는 선택가능하게는 몇몇 제한된 일상적 실험 이후에 본 발명의 특정 폴리펩티드에 사용하기 위한 최적의 연결기(들)를 결정할 수 있을 것이다.
대체적으로, 발현 및 생산의 간편성을 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드일 것이다. 그러나, 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드가 3개 이상의 나노바디를 포함하는 경우, 이들을 3개 이상의 "팔"(각각의 "팔"은 나노바디에 연결됨)을 갖는 연결기를 사용하여 연결시켜, "성상(star-shaped)" 구조물을 제공할 수 있다. 또한 대체적으로 덜 바람직하지만 원형 구조물을 사용할 수도 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 나노바디의 유도체와 본질적으로 유사한 본 발명의 폴리펩티드의 유도체를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드로 "본질적으로 구성된" 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다(여기서 "본질적으로 구성된"이란 말은 상기 본원에 지시된 바와 본질적으로 동일한 의미를 가짐).
본 발명의 한 양태에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산은, 본원의 추가의 개시내용으로부터 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 나노바디 및 폴리펩티드는 항체의 제조, 특별히 항체 단편(제한되지 않지만 (단일)도메인 항체 및 ScFv 단편)의 제조에 대해 자체 공지된 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드 및 핵산을 제조하기 위한 바람직하지만 비제한적인 몇몇 방법으로는 본원에 기재된 방법 및 기법이 포함된다.
숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 특히 유용한 한가지 방법은 일반적으로:
i) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체(또한 본원에 "본 발명의 숙주"로 지칭됨) 또는 또다른 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(또한 본원에 "본 발명의 핵산"으로 지칭됨)을 발현시키는 단계; 및 선택가능하게 후속되는
ii) 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함한다.
특별히, 이러한 방법은:
i) 본 발명의 숙주가 적어도 하나의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건하에 상기 본 발명의 숙주를 배양 및/또는 유지시키는 단계; 및 선택가능하게 후속되는
ii) 이렇게 수득된 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이중 가닥 DNA의 형태이다. 예를 들면, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 게놈성(genomic) DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예컨대 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현되기에 특히 적합한 코돈 이용성을 갖는 DNA)일 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따라서, 본 발명의 핵산은 본원에 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다.
본 발명의 핵산은 또한 벡터, 예컨대 플라스미드,코스미드(cosmid) 또는 YAC의 형태이고, 이에 존재하고/하거나, 이의 일부일 수 있고, 이는 다시 본질적으로 단리된 형태일 수 있다.
본 발명의 핵산은, 본원에 제공된 본 발명의 폴리펩티드를 위한 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여, 자체 공지된 방식으로 제조되거나 수득될 수 있고/있거나, 적합한 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 유사체를 제공하기 위해, 자연 발생 VHH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들면 부위-유도된 돌연변이생성을 거쳐, 상기 유사체를 코딩하는 본 발명의 핵산을 제공할 수 있다. 또한, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 핵산을 제조하기 위해, 또한 수개의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 나노바디를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 예를 들면 하나 이상의 연결기를 코딩하는 핵산이 함께 적합한 방식으로 연결될 수 있다.
본 발명의 핵산을 생성하기 위한 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 제한되지 않지만, 예를 들면 자동화된 DNA 합성; 부위-유도된 돌연변이생성; 2개 이상의 자연 발생 및/또는 합성 서열(또는 이의 2개 이상의 부분)의 조합; 끝이 절단된(truncated) 발현 생성물의 발현을 유도하는 돌연변이의 도입; 하나 이상의 제한 부위의 도입(예를 들어 적합한 제한 효소를 사용하여 쉽게 소화 및/또는 결찰되는 카세트(cassette) 및/또는 영역을 생성하기 위함), 및/또는 하나 이상의 "미스매치된" 프라이머를 사용하는 PCR 반응에 의한 돌연변이의 도입이 포함된다. 이들 및 다른 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 다시 표준 편람, 예컨대 상기 언급된 문헌[Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.], 뿐만 아니라 하기 실시예를 참조한다.
본 발명의 핵산은 또한, 당분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 유전자 구조물의 형태이고, 이에 존재하고/하거나 이의 일부일 수 있다. 일반적으로, 이러한 유전자 구조물은, 선택가능하게는 자체 공지된 유전자 구조물의 하나 이상의 요소, 예컨대 예를 들면 하나 이상의 적합한 조절 요소(예컨대 적합한 프로모터(들), 인헨서(들), 터미네이터(terminator)(들), 등) 및 본원에 지칭된 유전자 구조물의 추가의 요소에 연결되는 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함한다. 적어도 하나의 본 발명의 핵산을 포함하는 이러한 유전자 구조물은 또한 본원에 "본 발명의 유전자 구조물"로서 지칭될 것이다.
본 발명의 유전자 구조물은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 본 발명의 유전자 구조물은 또한 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 변형에 적합한 형태, 의도된 숙주 세포의 게놈 DNA내로 통합(integration)되기에 적합한 형태, 또는 의도된 숙주 유기체에서 독립적으로 복제, 유지 및/또는 승계(inheritance)하기에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 구조물은 벡터, 예컨대 예를 들면 플라스미드, 코스미드, YAC, 바이러스성 벡터 또는 트랜스포슨(transposon)의 형태일 수 있다. 특별히, 벡터는 발현 벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내에서(예를 들어 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템에서) 발현을 제공할 수 있는 벡터일 수 있다.
바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 유전자 구조물은
i) 적어도 하나의 본 발명의 핵산; 이에 작동적으로 연결된
ii) 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 선택가능하게는 적합한 터미네이터; 및 선택가능하게는 또한
iii) 자체 공지된 유전자 구조물의 하나 이상의 추가의 요소를 포함하고; 여기서, "조절 요소", "프로모터", "터미네이터" 및 "작동적으로 연결된"이란 용어는 당분야에서 그들의 일반적인 의미를 갖고(본원에 추가로 기재된 바와 같음); 여기서 유전자 구조물에 존재하는 상기 "추가의 요소"는 예를 들면 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선택 마커, 발현 마커/리포터(reporter) 유전자, 및/또는 변형 또는 통합(의 유효성)을 촉진시키거나 증가시킬 수 있는 요소일 수 있다. 이러한 유전자 구조물에 적합한 이들 및 다른 요소는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 사용된 구조물의 유형, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체, 본 발명의 원하는 뉴클레오티드 서열이 발현되는 방식(예를 들어 구조적(constitutive), 일시적(transient) 또는 유발적(inducible) 발현을 경유하여); 및/또는 사용된 변형 기법에 좌우될 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편(제한되지 않지만 (단일)도메인 항체 및 ScFv 단편이 포함됨)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 조절 서열, 프로모터 및 터미네이터가 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자 구조물에서, 상기 적어도 하나의 본 발명의 핵산 및 상기 조절 요소, 및 선택가능하게는 상기 하나 이상의 추가의 요소는 서로 "작동적으로 연결"되고, 이는 일반적으로 이들이 서로에 대해 작용적 관계임을 의미한다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리는 제어/조절할 수 있다면, 이러한 프로모터는 코딩 서열에 "작동적으로 연결"된 것으로 고려된다(여기서, 상기 코딩 서열은 상기 프로모터의 "제어하"에 있는 것으로 이해되어야 함). 일반적으로, 2개의 뉴클레오티드 서열이 작동적으로 연결되는 경우, 이들은 동일한 배향에 놓이고, 대체적으로 또한 동일한 판독 프레임에 있을 것이다. 필수적인 것은 아니지만, 이들은 대체적으로 본질적으로 인접할 것이다.
바람직하게는, 유전자 구조물의 조절 및 추가의 요소는 이들이 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 이들의 의도된 생물학적 기능을 제공할 수 있도록 한다.
예를 들면, 프로모터, 인헨서 또는 터미네이터는 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 "작동가능"해야 하고, 이는 (예를 들면) 상기 프로모터가 작동가능하게 연결된(본원에 정의된 바와 같음) 뉴클레오티드 서열, 예컨대 코딩 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리는 제어/조절할 수 있어야 함을 의미한다.
특별히 바람직한 몇몇 프로모터로는, 제한되지 않지만, 본원에 언급된 숙주 세포에서 발현하기 위한 자체 공지된 프로모터; 특별히 박테리아 세포에서 발현하기 위한 프로모터, 예컨대 본원에 언급되고/되거나 실시예에서 사용된 프로모터가 포함된다.
선택 마커는 -적절한 선택 조건하에-본 발명의 뉴클레오티드 서열로 (성공적으로)형질변환된 숙주 세포 및/또는 숙주 유기체가 (성공적으로)형질변환되지 않은 숙주 세포/유기체와 구별될 수 있도록 허용해야 한다. 이러한 마커의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 항생물질(예컨대 카나마이신(kanamycin) 또는 앰피실린(ampicillin))에 내성을 제공하는 유전자, 내온성을 제공하는 유전자, 또는 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 형질변환되지 않은 세포 또는 유기체의 생존에 필수적인 배지중의 특정 인자, 화합물 및/또는 (식품)성분의 부재하에 유지될 수 있도록 허용하는 유전자이다.
리더 서열은 -의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서- 원하는 번역후 개질을 허용가고/하거나, 전사된 mRNA가 세포의 원하는 부분 또는 세포기관으로 향하도록 해야 한다. 이러 서열은 또한 상기 세포로부터 발현 생성물이 분비되는 것을 허용할 수 있다. 따라서, 리더 서열은 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 작동가능한 임의의 프로-, 프리- 또는 프리프로-서열일 수 있다. 리더 서열은 박테리아 세포에서 발현하기 위해 필요하지 않을 수 있다. 예를 들면, 항체 및 항체 단편(제한되지 않지만 단일 도메인 항체 및 ScFv 단편)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 리더 서열은 본질적으로 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
발현 마커 또는 리포터 유전자는, -숙주 세포 또는 숙주 유기체에서- 유전자 구조물(상에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열)의 발현을 검출할 수 있도록 해야 한다. 발현 마커는 선택가능하게는 발현된 생성물의 편재화를, 예컨대 세포의 특정 부분 또는 세포기관 및/또는 다세포 유기체의 특정 세포(들), 조직(들), 기관(들) 또는 부분(들)에서 허용할 수 있다. 이러한 리포터 유전자는 또한 본 발명의 아미노산 서열과의 단백질 융합물로서 발현될 수 있다. 몇몇 바람직하지만 비제한적인 예로는 형광 단백질, 예컨대 GFP가 포함된다.
적합한 프로모터, 터미네이터 및 추가의 요소의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예로는 본원에 언급된 숙주 세포에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 것들, 특별히 박테리아 세포에서의 발현에 적합한 것들, 예컨대 본원에 언급된 것들 및/또는 하기 실시예에 사용된 것들이 포함된다. 프로모터, 선택 마커, 리더 서열, 발현 마커 및 본 발명의 유전자 구조물에 존재하는/사용되는 추가의 요소-예컨대 터미네이터, 전사 및/또는 번역 인헨서 및/또는 통합 인자-의 몇몇 (추가의) 비제한적인 예를 위해, 표준 편람, 예컨대 상기 언급된 문헌[Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.], 뿐만 아니라 WO 제95/07463호, WO 제96/23810호, WO 제95/07463호, WO 제95/21191호, WO 제97/11094호, WO 제97/42320호, WO 제98/06737호, WO 제98/21355호, US-A-제7,207,410호, US-A-제5,693,492호 및 EP 제1 085 089호를 참조한다. 다른 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 상기 인용된 일반적 배경기술 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다.
본 발명의 유전자 구조물은 일반적으로 본 발명의 뉴클레오티드 서열(들)을 상기 기재된 하나 이상의 추가의 요소에, 예를 들면 표준 편람, 예컨대 상기 언급된 문헌[Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.]에 기재된 기법을 사용하여 적합하게 연결시킴으로써 제공될 수 있다.
종종, 본 발명의 유전자 구조물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 자체 공지된 적합한 (발현)벡터에 삽입함으로써 수득될 것이다. 적합한 발현 벡터의 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예는 하기 실시예에 사용된 벡터, 뿐만 아니라 본원에 언급된 벡터이다.
본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 유전자 구조물은 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 형질변환시키기 위해, 즉 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 발현 및/또는 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 숙주 또는 숙주 세포는 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 임의의 적합한 진균류 세포, 원핵 세포 또는 진핵 세포, 또는 세포주 또는 임의의 적합한 진균류 유기체, 원핵 유기체 또는 진핵 유기체, 예를 들면:
-박테리아 균주, 제한되지 않지만 예를 들면 그램-음성(gram-negative) 균주, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주; 프로테우스(Proteus) 균주, 예를 들면 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 균주; 슈도모나스(Pseudomonas) 균주, 예를 들면 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 균주; 및 그램-양성(gram-positive) 균주, 예컨대 바실러스(Bacillus) 균주, 예를 들면 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 균주; 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주, 예를 들면 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans); 스타필로코커스(Staphylococcus) 균주, 예를 들면 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus) 균주; 및 락토코커스(Lactococcus) 균주, 예를 들면 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주;
-진균류 세포, 제한되지 않지만 예를 들면 트리코더마(Trichoderma), 예를 들면 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei); 뉴로스포라(Neurospora), 예를 들면 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 소르다르아(Sordaria), 예를 들면 소르다리아 마크로스포라(Sordaria macrospora); 아스퍼길러스(Aspergillus), 예를 들면 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스퍼길러스 소제(Aspergillus sojae); 또는 다른 섬유상 진균류 종으로부터의 세포;
-효모 세포, 제한되지 않지만 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces), 예를 들면 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae); 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) , 예를 들면 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 피키아(Pichia), 예를 들면 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica); 한세눌라(Hansenula), 예를 들면 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 예를 들면 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis); 아르슐라(Arxula), 예를 들면 아르슐라 아데니니포란스(Arxula adeninivorans); 야로위아(Yarrowia), 예를 들면 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 종으로부터의 세포;
-양서류 세포 또는 세포주, 예컨대 제노퍼스 우사이테스(Xenopus oocytes);
-곤충-유도된 세포 또는 세포주, 예컨대 인시류(lepidoptera)로부터 유도된 세포/세포주, 제한되지 않지만 예를 들면 스포돕테라(Spodoptera) SF9 및 Sf21 세포, 또는 드로소필라(Drosophila)로부터 유도된 세포/세포주, 예컨대 슈나이더(Schneider) 및 Kc 세포;
-식물 또는 식물 세포, 예를 들면 담배 식물; 및/또는
-포유동물 세포 또는 세포주, 예를 들면 인간으로부터 유도된 세포 또는 세포주, 포유동물로부터의 세포 또는 세포주, 제한되지 않지만 예를 들면 CHO-세포, BHK-세포(예를 들면, BHK-21 세포) 및 인간 세포 또는 세포주, 예컨대 HeLa, COS(예를 들면 COS-7) 및 PER.C6 세포;
뿐만 아니라 항체 및 항체 단편(제한되지 않지만 (단일)도메인 항체 및 ScFv 단편)의 발현 및 생산을 위해 자체 공지된 다른 숙주 또는 숙주 세포(이는 숙련가에게 명백할 것임)이다. 또한 본원에 상기 인용된 일반적 배경 기술, 뿐만 아니라 예를 들면 WO 제94/29457호; WO 제96/34103호; WO 제99/42077호; 상기 문헌[Frenken et al, (1998)]; [Riechmann and Muyldermans, (1999)]; [van der Linden, (2000); Thomassen et al., (2002)]; [Joosten et al., (2003)]; [Joosten et al., (2005)]; 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관에서, 예를 들면 예방학적 및/또는 치료학적 목적을 위해(예를 들어 유전자 치료법으로서) 도입되고 발현될 수 있다. 이를 위하여, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들면 따라서(예를 들어 리포솜을 사용하여) 또는 이들이 적합한 치료 벡터내로 삽입된 후(예를 들면 레트로바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 또는 파라보바이러스, 예컨대 아데노-연관된 바이러스로부터 유도된 후) 세포 또는 조직내로 도입될 수 있다. 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, 이러한 유전자 치료법은 본 발명의 핵산 또는 이를 코딩하는 적합한 유전자 치료 벡터를 환자, 또는 환자의 특정 세포 또는 특정 조직 또는 기관에 투여함으로써 환자의 신체내에서 제자리에 및/또는 생체내에서 수행될 수 있거나; 또는 적합한 세포(종종 치료될 환자의 신체, 예컨대 외식된 임파구, 골수 흡인 또는 조직 생검으로부터 취해짐)는 본 발명의 뉴클레오티드 서열로 시험관내에서 처리된 다음 환자의 신체내로 적합하게 (재)도입된다. 이들 모두는 숙련가에게 공지된 유전자 치료 벡터, 기법 및 전달 시스템를 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들면 문헌[Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y)]; [Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539]; [Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919]; [Anderson, Science 256 (1992), 808-813]; [Verma, Nature 389 (1994), 239]; [Isner, Lancet 348 (1996), 370-374]; [Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086]; [Onodera, Blood 91; (1998), 30-36]; [Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699]; [Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-292]; [Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51]; [Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716]; WO 제94/29469호; WO 제97/00957호, US 제5,580,859호; US 제5,5895466호; 또는 문헌[Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640]에 기재되어 있다. 예를 들면, ScFv 단편의 제자리 발현(Afanasieva et al, Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) 및 다이어바디의 제자리 발현(Blanco et al, J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003))은 당분야에 기재되어 있다.
세포에서 나노바디의 발현을 위해, 이들은 또한 소위 "인트라바디"로서 발현되고, 예를 들면 WO 제94/02610호, WO 제95/22618호 및 US-A-제7004940호; WO 제03/014960호; 문헌[Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag]; 및 [Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170]에 기재된 바와 같다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 예를 들면 유전자도입 포유동물에서의 유즙, 예를 들면 토끼, 소, 염소 또는 양의 유즙에서(포유동물내로의 유전자도입을 위한 일반적 기법을 위해 예를 들면 US-A-제6,741,957호, US-A-제6,304,489호 및 US-A-제6,849,992호 참조), 식물 또는 식물의 부분, 제한되지 않지만 예를 들면 이들의 잎, 꽃, 과일, 씨앗, 뿌리 또는 줄기(turber)(예를 들면 담배, 옥수수, 대두 또는 자주개자리(alfalfa))에서, 또는 예를 들면 누에 봄빅스 모리(Bombix mori)의 번데기에서 생산될 수 있다.
추가로, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 세포-유리 발현 시스템에서 발현 및/또는 생산될 수 있고, 이러한 시스템의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 바람직하지만 비제한적인 몇몇 예로는 맥아 시스템, 토끼 망상적혈구 용해물 또는 이. 콜라이(E. coli) 주베이(Zubay) 시스템에서의 발현이 포함된다.
상기 언급된 바와 같이, 나노바디 사용의 이점중 하나는 이에 기초한 폴리펩티드가 적합한 박테리아 시스템에서의 발현을 통해 제조될 수 있고, 적합한 박테리아 발현 시스템, 벡터, 숙주 세포, 조절 요소 등은 상기 인용된 문헌으로부터 숙련가에게 명백할 것이다. 그러나 본 발명은 그의 가장 광범위한 의미에서 박테리아 시스템에서의 발현에 제한되지 않음을 주지해야 한다.
바람직하게는, 본 발명에서, 약학적 용도에 적합한 형태로 본 발명의 폴리펩티드를 제공하는 (생체내 또는 시험관내)발현 시스템, 예컨대 박테리아 발현 시스템이 사용되고, 이러한 발현 시스템은 다시 숙련가에게 명백할 것이다. 또한 숙련가에게 명백한 바와 같이, 약학적 용도에 적합한 본 발명의 폴리펩티드는 펩티드 합성을 위한 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
산업적 규모로 생산하기 위해, 나노바디 또는 나노바디-함유 단백질 치료제의 (산업적) 생산을 위한 바람직한 이종기원의 숙주로는 대규모 발현/생산/발효, 특별히 대규모 약학적(즉, GMP 등급) 발현/생산/발효에 적합한 이. 콜라이, 피키아 파스토리스, 에스. 세레비지에(S. cerevisiae) 균주가 포함된다. 이러한 균주의 적합한 예는 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 균주 및 생산/발현 시스템은 또한 바이오비트룸(Biovitrum)(스웨덴 웁살라 소재)과 같은 회사에 의해 입수가능하다.
다르게는, 포유동물 세포주, 특별히 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포는 대규모 발현/생산/발효, 특별히 대규모 약학적 발현/생산/발효에 사용될 수 있다. 다시, 이러한 발현/생산/발효 시스템은 또한 상기 언급된 몇몇 회사에 의해 입수가능하다.
특정 발현 시스템의 선택은 특정 번역후 개질, 보다 구체적으로 글리코실화를 위한 요건에 부분적으로 좌우될 것이다. 글리코실화가 요망되거나 요구되는 나노바디-함유 재조합 단백질의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화할 수 있는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 할 것이다. 이와 관련하여, 수득된 글리코실화 패턴(즉, 부착된 잔기의 종류, 수 및 위치)가 발현에 사용된 세포 또는 세포주에 좌우됨은 숙련가에게 명백할 것이다. 바람직하게는, 인간 세포 또는 세포주가 사용되거나(즉, 본질적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 유도함) 또다른 포유동물 세포주가 사용되어 본질적으로 및/또는 기능적으로 인간 글리코실화와 동일하거나 적어도 인간 글리코실화와 유사한 글리코실화 패턴을 제공할 수 있다. 일반적으로, 원핵 숙주, 예컨대 이. 콜라이는 단백질을 글리코실화할 능력이 없고, 보다 하위 진핵생물, 예컨대 효모의 사용은 대체적으로 인간 글리코실화와 상이한 글리코실화 패턴을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 모든 이전의 숙주 세포 및 발현 시스템은, 수득될 원하는 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드에 따라서, 본 발명에 사용될 수 있음을 알아야 한다.
따라서, 본 발명의 비제한적인 한 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 본 발명의 또다른 비제한적인 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 비-글리코실화된다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 한 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 박테리아 세포, 특별히 대규모 약학적 생산에 적합한 박테리아 세포, 예컨대 상기 본원에 언급된 세포 균주에서 생산된다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 효모 세포, 특별히 대규모 약학적 생산에 적합한 효모 세포, 예컨대 상기 본원에 언급된 종의 세포에서 생산된다.
본 발명의 바람직하지만 비제한적인 또다른 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포, 특별히 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 보다 특별히 대규모 약학적 생산에 적합한 인간 세포 또는 인간 세포주의 세포, 예컨대 상기 본원에 언급된 세포주의 세포에서 생산된다.
숙주 세포에서의 발현이 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 경우, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 세포내로 생산될 수 있고(예를 들어 시토졸, 원형질막공간(periplasmic) 또는 봉입체(inclusion bodies) 내에서), 이어서 숙주 세포로부터 단리되고, 선택가능하게는 추가로 정제되거나; 또는 세포외로 생산되고(예를 들어 숙주 세포가 배양되는 배지내에서), 이어서 배지로부터 단리되고, 선택가능하게는 추가로 정제된다. 진핵 숙주 세포가 사용될 경우, 세포외 생산이 대체적으로 바람직한데, 그 이유는 이것이 수득된 나노바디와 단백질의 추가의 단리 및 다운스트림 처리과정을 상당히 촉진시키기 때문이다. 박테리아 세포, 예컨대 상기 언급된 이. 콜라이 균주는 정상적으로 소수 부류의 단백질, 예컨대 독소 및 용혈소를 제외하고는 단백질을 세포외로 배출하지 않고, 이. 콜라이에서의 분비 생산은 내막을 가로질러 원형질막공간으로 단백질을 전위시키는 것이다. 원형질막공간 생산은 시토졸 생산에 비하여 우수한 몇몇 이점을 제공한다. 예를 들면, 분비된 생성물의 N-말단 아미노산 서열은 특이적 신호 펩티다아제에 의해 분비 신호 서열이 분열된 이후 천연 유전자 생성물과 동일할 수 있다. 또한, 세포질에서에 비하여 원형질막공간에서 단백질분해효소 활성이 훨씬 낮은 것으로 나타난다. 또한, 단백질 정제는 원형질막공간에서의 보다 적은 오염 단백질에 기인하여 보다 더 단순하다. 또다른 이점은 원형질막공간이 세포질에 비하여 보다 산화적인 환경을 제공하므로 적절한 이황화 결합이 형성된다는 것이다. 종종 이. 콜라이에서 과발현된 단백질이 소위 봉입체라고 불리는 불용성 응집체에서 발견된다. 이들 봉입체는 시토졸 또는 원형질막공간에 위치될 수 있고; 이들 봉입체로부터 생물학적 활성 단백질을 회수하기 위해 변성/재접힘(refolding)이 요구된다. 치료학적 단백질을 비롯한 많은 재조합 단백질은 봉입체로부터 회수된다. 다르게는, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 원하는 단백질, 특별히 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 분비하도록 유전자적으로 개질된 박테리아의 재조합 균주가 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 비제한적인 한 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포내로 생산되고 숙주 세포, 특별히 박테리아 세포 또는 박테리아 세포중의 봉입체로부터 단리되는 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드이다. 본 발명의 비제한적인 또다른 양태에 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 세포외로 생산되고 숙주 세포가 배양되는 배지로부터 단리되는 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드이다.
이들 숙주 세포와 함께 사용하기에 바람직하지만 비-제한적인 몇몇 프로모터로는,
-이. 콜라이에서의 발현을 위해: lac 프로모터(및 이의 유도체, 예컨대 lacUV5 프로모터); 아라비노즈(arabinose) 프로모터; 파지 람다의 좌향(PL) 및 우향(PR) 프로모터; trp 오페론(operon)의 프로모터; 하이브리드(hybrid) lac/trp 프로모터(tac 및 trc); T7-프로모터(보다 구체적으로 T7-파지 유전자 10의 프로모터) 및 다른 T-파지 프로모터; Tn1O 테트라사이클린 내성 유전자의 프로모터; 외생성 조절 오퍼레이터(operator) 서열의 하나 이상의 카피를 포함하는 상기 프로모터의 조작된 변형체;
-에스. 세레비지에에서의 발현을 위해: 구성적: ADH1(알코올 탈수소효소 1), ENO(에놀라아제(enolase)), CYC1(시토크롬(cytochrome) c 이소-1), GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소), PGK1(포스포글리세레이트 키나아제), PYK1(피루베이트 키나아제); 조절됨: GAL1,10,7(갈락토즈 대사 효소), ADH2(알코올 탈수소효소 2), PHO5(산 포스파타아제), CUP1(구리 메탈로티오네인(copper metallothionein)); 이종기원: CaMV(콜리플라워 모자이크 바이러스(mosaic virus) 35S 프로모터);
-피키아 파스토리스에서의 발현을 위해: AOX1 프로모터(알코올 산화효소 I);
-포유동물 세포에서의 발현을 위해: 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV: 인간 cytomegalovirus) 조기반응(immediate early) 인헨서/프로모터; 2개의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열을 함유하여 프로모터가 Tet 리프레서(repressor)에 의해 조절되는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 조기반응 프로모터 변형체; 단순포진 바이러스(Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나아제(TK: thymidine kinase) 프로모터; 라우스 육종 바이러스 장기간 반복(RSV LTR: Rous Sarcoma Virus long terminal repeat) 인헨서/프로모터; 인간, 침팬지, 마우스 또는 래트로부터의 신장(elongation) 인자 1α(hEF-1α) 프로모터; SV40 초기(early) 프로모터; HIV-1 장기간 반복 프로모터; β-액틴(actin) 프로모터가 포함된다.
이들 숙주 세포와 사용하기에 바람직하지만 비제한적인 몇몇 벡터로는:
-포유동물 세포에서 발현하기 위한 벡터: pMAMneo(클론텍(Clontech)), pcDNA3(인비트로겐(Invitrogen)), pMClneo(스트라타겐(Stratagene)), pSG5(스트라타겐), EBO-pSV2-neo(ATCC37593), pBPV-1(8-2)(ATCC37110), pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224), pRSVgpt(ATCC37199), pRSVneo(ATCC37198), pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC37460) 및 1ZD35(ATCC37565), 뿐만 아니라 바이러스-기초 발현 시스템, 예컨대 아데노바이러스에 기초한 시스템;
-박테리아 세포에서의 발현을 위한 벡터: pET 벡터(노바겐(Novagen)) 및 pQE 벡터(퀴아겐(Qiagen));
-효모 또는 다른 진균류 세포에서의 발현을 위한 벡터: pYES2(인비트로겐) 및 피키아 발현 벡터(인비트로겐);
-곤충 세포에서의 발현을 위한 벡터: pBlueBacII(인비트로겐) 및 다른 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터;
-식물 또는 식물 세포에서의 발현을 위한 벡터: 예를 들면 콜리플라워 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스, 아그로박테리움(Agrobacterium)의 적합한 균주에 기초한 벡터, 또는 Ti-플라스미드에 기초한 벡터가 포함된다.
이들 숙주 세포와 사용하기에 바람직하지만 비제한적인 몇몇 분비 서열로는:
-박테리아 세포, 예컨대 이.콜라이에서 사용하기 위해: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB 등; TAT 신호 펩티드, 용혈소 C-말단 분비 신호;
-효모에서 사용하기 위해: α-교배 인자 프리프로-서열, 포스파타아제(pho1), 전화효소(Sue) 등;
-포유동물 세포에서 사용하기 위해: 표적 단백질이 진핵생물 기원인 경우 고유의 신호; 뮤린(murine) Igκ-쇄 V-J2-C 신호 펩티드 등이 포함된다.
본 발명의 숙주 또는 숙주 세포를 형질변환하기에 적합한 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 의도된 숙주 세포/숙주 유기체 및 사용되는 유전자 구조물에 좌우될 것이다. 다시 상기 언급된 편람 및 특허 출원을 참조한다.
형질변환후, 본 발명의 뉴클레오티드 서열/유전자 구조물에 의해 성공적으로 형질변환된 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 검출 및 선택하는 단계가 수행될 수 있다. 이는 예를 들면 본 발명의 유전자 구조물에 존재하는 선택가능한 마커에 기초한 선택 단계, 또는 본 발명의 아미노산 서열의 검출을 포함하는 단계(예를 들어 특이적 항체를 사용함)일 수 있다.
형질변환된 숙주 세포(이는 안정한 세포주 형태일 수 있음) 또는 숙주 유기체(이는 안정한 돌연변이주 또는 균주의 형태일 수 있음)는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다.
바람직하게는, 이들 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 이들이 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드을 발현하거나 (적어도)발현가능하도록 한다(예를 들어 적합한 조건하에)(숙주 유기체의 경우: 적어도 하나의 이의 세포 부분, 조직 또는 기관에서). 본 발명은 또한 추가로 세포 분열 또는 유성 또는 무성 생식에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 산물, 세대, 및/또는 자손을 포함한다.
본 발명의 아미노산 서열의 발현을 생산/수득하기 위해, 형질변환된 숙주 세포 또는 형질변환된 숙주 유기체는 일반적으로 본 발명의 (원하는)아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 발현/생산되는 조건하에 보존, 유지 및/또는 배양될 수 있다. 적합한 조건은 숙련가에게 명백할 것이고, 대체적으로 사용되는 숙주 세포/숙주 유기체, 뿐만 아니라 (관련)뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 조절 요소에 좌우될 것이다. 다시, 본 발명의 유전자 구조물에 대한 문단에서 상기 언급된 편람 및 특허 출원을 참조한다.
일반적으로, 적합한 조건으로는 적합한 배지의 사용, 적합한 식품 공급원 및/또는 적합한 영양소의 존재, 적합한 온도의 사용, 및 선택가능하게는 적합한 유도 인자 또는 화합물의 존재(예를 들어 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 유도성 프로모터의 제어하에 있는 경우)가 포함되고; 이들 모두는 숙련가에 의해 선택될 수 있다. 다시, 이러한 조건하에, 본 발명의 아미노산 서열은 구성적 방식으로, 일시적 방식으로, 또는 단지 적합하게 유도될 경우에만 발현될 수 있다.
또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드가 (우선) 미성숙 형태(상기 언급된 바와 같음)로 발생되고, 이는 이어서 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라서 번역후 개질을 거칠 수 있음이 숙련가에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는, 사용된 숙주 세포/숙주 유기체에 따라서 글리코실화될 수 있다.
이어서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 숙주 세포/숙주 유기체로부터 및/또는 상기 숙주 세포 또는 숙주 유기체가 배양되는 배지로부터, 자체 공지된 단백질 단리 및/또는 정제 기법, 예컨대 (예비용)크로마토그래피 및/또는 전기이동 기법, 차등 침전 기법, 친화도 기법(예를 들어 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드와 융합된 특이적인 분열가능한 아미노산 서열을 사용함) 및/또는 예비용 면역학적 기법(즉, 단리된 아미노산 서열에 대한 항체를 사용함)에 의해 단리될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는, 약학적 용도를 위해, 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제, 및 선택가능하게는 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물로서 제형화될 수 있다. 비-제한적 예에 의해, 이러한 제형은 경구 투여, 비경구 투여(예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 또는 정맥 주입에 의해), 국소 투여, 흡입, 피부 패치(patch), 이식물(implant), 좌제 등에 의한 투여에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 적합한 투여 형태-이는 투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있음-뿐만 아니라 이의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 숙련가에게 명백할 것이고, 추가로 본원에 기재되어 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 아미노산, 적어도 하나의 본 발명의 나노바디 또는 적어도 하나의 본 발명의 폴리펩티드 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 부형제(즉, 적합한 약학적 용도를 위해), 및 선택가능하게는 하나 이상의 추가의 활성 물질을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 제형화되고 투여될 수 있고, 이를 위해 예를 들면 상기 인용된 일반적 배경기술(특별히 WO 제04/041862호, WO 제04/041863호, WO 제04/041865호, WO 제04/041867호 및 WO 제08/020079호) 뿐만 아니라 표준 편람, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)], [Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)]; 또는 문헌[Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007](예를 들면 252면-255면 참조)을 참조한다.
예를 들면, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 종래의 항체 및 항체 단편(ScFv 및 다이어바디) 및 다른 약학적으로 활성인 단백질에 대해 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 제형화되고 투여될 수 있다. 이러한 제형 및 제조 방법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 비경구 투여(예를 들면 정맥내, 복막내, 피하, 근육내, 내강내(intraluminal), 동맥내 또는 척추관내(intrathecal) 투여) 또는 국소(즉, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 제제가 포함된다.
비경구 투여용 제제는 예를 들면 주입 또는 주사에 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 유화액일 수 있다. 이러한 제제에 적합한 담체 또는 희석제로는, 예를 들면, 제한없이, 멸균수 및 수성 완충액 및 용액, 예컨대 생리학적 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액(Ringer's solutions), 덱스트로즈 용액, 및 행크 용액(Hank's solution); 워터오일(water oil); 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 뿐만 아니라 광유, 동물유 및 식물유, 예를 들면 땅콩유, 대두유, 뿐만 아니라 이의 적합한 혼합물이 포함된다. 대체적으로, 수성 용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 전달 유전자 치료 방법을 사용하여 투여될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호를 참조하고, 이는 전체가 참고로 인용되 있다. 전달 유전자 치료 방법을 사용하여, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로 형질감염된 1차 세포는 추가로 표적 특이적 기관, 조직, 이식편, 종양 또는 세포에 조직 특이적인 프로모터로 형질감염되고, 추가로 아세포적으로 편재화된 발현을 위한 신호 및 안정화 서열로 형질감염될 수 있다.
따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는, 예를 들어, 경구적으로, 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle), 예컨대 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 전신적으로 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐내로 봉입되거나, 정제로 압축되거나, 환자 식이 식품에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 하나 이상의 부형제와 조합되고, 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제(troche), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁제, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용된다. 이러한 조성물 및 제제는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 0.1% 이상 함유해야 한다. 조성물 및 제제중 이들의 백분율은, 물론 다양할 수 있고, 편리하게는 소정의 단위 투여형의 약 2∼약 60중량% 이다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 양은 효과적인 투여량 수준이 수득될 수 있도록 한다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 다음을 함유할 수 있고: 결합제, 예컨대 고무 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대 자당, 과당, 락토즈 또는 아스파탐; 또는 풍미제, 예컨대 박하, 살리실산메틸, 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 단위 투여형이 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질에 더하여, 액체 담체, 예컨대 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅제로서 또는 그렇지 않으면 고체 단위 투여형의 물리적 형태를 개질시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐은 젤라틴, 밀납, 셸락(shellac) 또는 당류 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드, 감미제로서의 자당 또는 과당, 보존제, 염료, 메틸 및 프로필파라벤, 및 체리 또는 오렌지향과 같은 풍미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여형을 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양으로 약학적으로 허용가능하고 실절적으로 무독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 서방성 제제 및 장치내로 혼입될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제 및 제형에는 또한 본 발명의 구조물이 위 환경에 저항하여 소장으로 통과되도록 허용하는 장성(enteric) 코팅물이 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여용 제제 및 제형은 위장관의 임의의 원하는 부분으로 전달되기 위해 적합하게 제형화될 수 있다. 또한 적합한 좌제는 위장관내로 전달되기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복막내로 투여될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 용액 및 이의 염은 물에서, 선택가능하게는 무독성 계면활성제와 혼합되어 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴 및 이의 혼합물, 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 퉁상적인 조건하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주사 또는 주입에 적합한 약학적 투여형으로는, 멸균 주사가능 또는 주입가능 용액 또는 분산액(선택가능하게는 리포솜에 캡슐화됨)의 즉석 제조에 적용되는 활성 구성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말이 포함될 수 있다. 모든 경우에, 최종 투여형은 멸균성 유체이고 제작 및 저장 조건하에 안정하여야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스터, 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 리포솜의 형성, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미세물 작용은 다양한 항생제 및 항곰팡이제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살(thimerosal) 등에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면 당류, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서 사용함으로써 흡수가 연장될 수 있다.
주사가능한 멸균 용액은 필요한 양의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를, 필요할 경우 상기 나열된 다양한 다른 구성성분들과 적절한 용매내로 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법이고, 이는 활성 구성분 + 미리 멸균-여과된 용액에 존재하는 임의의 추가의 요망되는 구성성분의 분말을 산출한다.
국소 투여를 위해, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 순수한 형태로, 즉 이들이 액체인 경우에 적용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이들을 피부에 조성물 또는 제형으로서 피부학적으로 허용가능한 담체(이는 고체 또는 액체일 수 있음)와 함께 투여하는 것이 요망될 것이다.
유용한 고체 담체로는 미분된 고체, 예컨대 활석, 클레이, 미세결정질 셀룰로즈, 실리카, 알루미나 등이 포함된다. 유용한 액체 담체로는 물, 하이드록시알킬 또는 글리콜 또는 물-알코올/글리콜 블렌드가 포함되고, 여기서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 효과적인 수준으로, 선택가능하게는 무독성 계면활성제의 도움으로 용해되거나 분산될 수 있다. 방향제 및 추가의 항미생물제와 같은 보조제가 첨가되어 소정의 용도를 위한 특성을 최적화할 수 있다. 생성된 액체 조성물은 흡수 패드로부터 적용되거나, 밴드 및 기타 드레싱(dressing)을 함침하기 위해 사용되거나, 펌프-유형 또는 에어로졸 스프레이기를 사용하여 환부에 분사될 수 있다.
증점제, 예컨대 합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스터, 지방 알코올, 개질된 셀룰로즈 또는 개질된 광물은 또한 액체 담체와 함께 사용되어, 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한 펴바를 수 있는 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성할 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드를 피부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 유용한 피부학적 조성물의 예는 당분야에 공지되어 있고; 예를 들면, 미국 특허 제4,608,392호(Jacquet et al.), 미국 특허 제4,992,478호(Geria), 미국 특허 제4,559,157호(Smith et al.) 및 미국 특허 제4,820,508호(Wortzman)를 참조한다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 유용한 투여량은 이들의 시험관내 활성, 및 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교하여 결정될 수 있다. 마우스 및 기타 동물에서 유효 투여량의 인간으로의 외삽을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고; 예를 들면, 미국 특허 제4,938,949호를 참조한다.
일반적으로, 액체 조성물, 예컨대 로션에서 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 농도는 약 0.1∼25 중량%, 바람직하게는 약 0.5∼10 중량%이다. 반고체 또는 고체 조성물, 예컨대 겔 또는 분말에서의 농도는 약 0.1∼5 중량%, 바람직하게는 약 0.5∼2.5 중량%이다.
치료에 사용하기 위해 필요한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 양은 선택된 특정 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 투여 경로, 치료될 증상의 성질, 및 환자의 연령 및 증상에 따라 달라질 것이고, 궁극적으로 담당 의사 또는 임상학자의 재량일 것이다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편 또는 기관에 따라 좌우될 것이다.
원하는 용량은 편리하게 단일 용량으로 존재하거나, 적절한 간격으로, 예를 들면 1일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위 용량으로 투여되는 분할된 용량으로 존재할 수 있다. 하위-용량은 그 자체로, 예를 들어, 다수의 별개의 대충 이격된 투여로 추가로 분할될 수 있고; 예컨대 취입기로부터의 다중 흡입 또는 다수 방울의 눈으로의 적용이 있다.
투여 섭생은 장기간의 매일 치료를 포함할 수 있다. "장기간"은 적어도 2주, 바람직하게는, 수 주, 수 개월, 또는 수 년의 기간을 의미한다. 이러한 투여 범위에서의 필수적인 변형은 당분야의 숙련가에 의해 본원의 교시내용에 제공된 일상적 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA]을 참조한다. 투여량은 또한 임의의 복합적인 경우에 개인별 담당 의사에 의해 조정될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 골 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이고, 이러한 방법은 이러한 치료가 필요한 대상에게 약학적으로 허용가능한 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명과 관련하여, "예방 및/또는 치료"라는 용어는 질환을 예방 및/또는 치료함을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로 질환의 개시를 방지하고, 질환의 진행을 둔화시키거나 역전시키고, 질환과 연관된 하나 이상의 증후의 개시를 방지하거나 둔화시키고, 질환과 연관된 하나 이상의 증후를 감소 및/또는 경감시키고, 질환 및/또는 이와 연관된 임의의 증후의 위중성 및/또는 기간을 감소시키고/시키거나, 질환 및/또는 이와 연관된 임의의 증후의 위중성의 추가의 증가를 방지하고, 질환에 의해 야기되는 임의의 생리학적 손상을 방지, 감소 또는 역전시킴, 및 치료되는 환자에게 유리한 임의의 약리학적 작용을 포함한다.
치료되는 대상은 임의의 온혈동물일 수 있으나, 특별히 포유동물이고, 보다 특별히 인간이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 치료되는 대상은 특별히 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓거나 이에 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 RANK-L, 이의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 또는 신호와 연관된 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 필요한 대상에게 약학적으로 활성인 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다. 특별히, 본 발명은 RANK-L, 이의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 또는 신호를 조절함으로써 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 필요한 대상에게 약학적으로 활성인 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다. 특별히, 상기 약학적으로 효과적인 양은 RANK-L, 이의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 및 신호를 조절하기에 충분한 양; 및/또는 RANK-L, 이의 생물학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 또는 신호를 조절하기에 충분히 순환되도록 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드의 수준을 제공하는 양일 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 필요한 대상에게 약학적으로 활성인 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다.
보다 특별히, 본 발명은 본원에 열거된 질환 및 질병으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 필요한 대상에게 약학적으로 활성인 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 면역치료, 특별히 수동적 면역치료를 위한 방법에 관한 것으로 상기 방법은 본원에 언급된 질환 및 장애를 앓거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상에게 약학적으로 활성인 양의 본 발명의 아미노산 서열, 본 발명의 나노바디, 본 발명의 폴리펩티드, 및/또는 이를 포함한 약학적 조성물을 투여함을 포함한다.
상기 방법에서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드 및/또는 이를 포함한 조성물은, 사용된 특정 약학적 제형 또는 조성물에 따라, 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드 및/또는 이를 포함한 조성물은, 사용된 특정 약학적 제형 또는 조성물에 따라, 예를 들면 경구적으로, 복막내로(예를 들어 정맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 위장관을 우회하는 임의의 다른 투여 경로를 경유하여), 비강내로, 경피적으로, 국소적으로, 좌제의 의해, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 임상학자는 적합한 투여 경로 및 이러한 투여에 사용되는 적합한 약학적 제형 또는 조성물을, 예방되거나 치료되는 질환 또는 장애, 및 임상학자에게 공지된 다른 인자에 따라 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드 및/또는 이를 포함한 조성물은 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기에 적합한 치료 섭생에 따라 투여된다. 임상학자는 일반적으로, 예컨대 예방 또는 치료되는 질환 또는 장애, 치료되는 질환의 위중성 및/또는 이의 증후의 위중성, 사용되는 본 발명의 특정 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드, 특정 투여 경로 및 사용되는 약학적 제형 또는 조성물, 환자의 연령, 성별, 체중, 식이, 일반적 조건과 같은 요인, 및 임상학자에게 공지된 유사한 요인에 따라서, 적합한 치료 섭생을 결정할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 섭생은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드, 또는 이를 포함한 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 양 또는 용량으로 투여함을 포함할 것이다. 투여하기 위한 특정 양(들) 또는 용량은 임상학자에 의해, 다시 상기 인용된 요인들에 기초하여 결정될 수 있다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하기 위해, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 사용되는 본 발명의 특정 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드의 효능, 특정 투여 경로, 및 사용되는 특정 제형 또는 조성물에 따라, 일반적으로 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는, 1 그램∼0.01 마이크로그램/체중 kg/1일, 바람직하게는 0.1 그램∼0.1 마이크로그램/체중 kg/1일, 예컨대 약 1, 10, 100 또는 1000 마이크로그램/체중 kg/1일의 양으로, 연속적으로(예를 들어 주입에 의해), 단일 1일 용량으로서 또는 1일 동안 수회 분할된 용량으로서, 투여될 것이다. 임상학자는 일반적으로 본원에 언급된 요인들에 따라 적합한 1일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 특정한 경우에, 임상학자는 예를 들면 상기 인용된 요인들 및 그의 숙련된 판단에 기초하여 이러한 양으로부터 벗어나서 선택할 수 있음이 명백할 것이다. 일반적으로, 투여되는 양에 대한 몇몇 지침은, 본질적으로 동일한 경로를 경유하여 투여되는 동일한 표적에 대한 필적할만한 종래의 항체 또는 항체 단편에 대해 대체적으로 투여되는 양으로부터, 그러나 친화도/결합력, 유효성, 생물분포, 반감기 및 숙련가에게 공지된 유사 인자를 고려하여 수득될 수 있다
대체적으로, 상기 방법에서, 본 발명의 단일 아미노산 서열, 나노바디 또는폴리펩티드가 사용될 것이다. 그러나, 본 발명의 2개 이상의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드를 조합하여 사용하는 것은 본 발명의 범주내에 속한다.
본 발명의 나노바디, 아미노산 서열 및 폴리펩티드는 또한 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않는 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 화합물 또는 화학소와, 즉 조합 치료 섭생으로서 함께 사용될 수 있다. 다시, 임상학자는 상기 인용된 요인들 및 그의 숙련된 판단에 기초하여, 추가의 화합물 또는 화학소, 뿐만 아니라 적합한 조합 치료 섭생을 선택할 수 있을 것이다.
특별히, 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 및 폴리펩티드는 본원에 인용된 질환 및 장애를 예방 및/또는 치료하거나 이를 위해 사용될 수 있는 다른 약학적으로 활성인 화합물 또는 화학소와 함께 사용될 수 있고, 그 결과로서 상승 효과가 수득되거나 수득되지 않을 수 있다. 이러한 화합물 및 화학소의 예, 뿐만 아니라 이를 투여하기 위한 경로, 방법 및 약학적 제형 또는 조성물은 임상학자에게 분명할 것이다.
특별히, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열, 나노바디 및/또는 폴리펩티드, 및 골 형태학적 인자, 형질변환 성장 인자-β(TGF-β: transforming growth factor-β), 인터류킨-1(IL-1: interleukin-1) 저해제, IL-1ra, 키네레트(Kineret)(등록상표), TNFα 저해제, 가용성 TNFα 수용체, 엔브렐(Enbrel)(등록상표), 항-TNFα 항체, 레미케이드(Remicade)(등록상표), D2E7 항체, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬의 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 부갑상선 호르몬 관련 단백질의 유사체, 프로스타글란딘(prostaglandin), 비스포스포네이트, 알렌드로네이트(alendronate), 플루오르화물, 칼슘, 비-스테로이드성 항염증성 약물(NSAID: non-steroidal anti-inflammatory drug), COX-2 저해제, 셀레브렉스(Celebrex)(등록상표), 비옥스(Vioxx)(등록상표), 면역억제제, 메토트렉세이트(methotrexate), 레플루노마이드(leflunomide), 세린 단백질분해효소 저해제, 분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI: secretory leukocyte protease inhibitor), IL-6 저해제, IL-6에 대한 항체 또는 나노바디, IL-8 저해제, IL-8에 대한 항체 또는 나노바디, IL-18 저해제, IL-18 결합 단백질, IL-18에 대한 항체 또는 나노바디, 인터류킨-1 전환 효소(ICE: interleukin converting enzyme) 조절자, 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor), FGF 조절자, PAF 길항물질, 케라티노사이트 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), KGF-관련 분자, KGF 조절자, 세포간질 메탈로프로테나아제(MMP: matrix metalloproteinase) 조절자, 산화질소 신타아제(NOS: nitric oxide synthase) 조절자, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체의 조절자, 글루타메이트 수용체의 조절자, 지질다당류(LPS: lipopolysaccharide) 수준의 조절자, 노르아드레날린(noradrenaline), 노르아드레날린 유사체, 및 노르아드레날린 조절자(예를 들면, US 제2004/00335353호에 기재된 바와 같음)로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함할 수 있다.
2개 이상의 물질 또는 화학소가 조합 치료 섭생의 일부로서 사용되어야 할 경우, 이들은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 경유하여, 본질적으로 동일하거나 상이한 시간에(예를 들어 본질적으로 동시에, 연속적으로, 또는 교대 섭생에 따라) 투여될 수 있다. 이러한 물질 또는 화학소가 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되는 경우, 이들은, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 상이한 약학적 제형 또는 조성물로서, 또는 조합된 약학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다.
또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 화학소가 조합 치료 섭생의 일부로서 사용될 경우, 각각의 물질 또는 화학소는, 그 화합물 또는 화학소가 그 자체로 사용되는 경우와 동일한 양으로 동일한 섭생에 따라 투여될 수 있고, 이러한 조합된 사용은 상승 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 화학소의 조합된 사용이 상승 작용을 유도할 경우, 또한 투여되는 하나 이상 또는 모든 물질 또는 화학소의 양을 감소시키지만, 여전히 원하는 치료 작용을 달성할 수 있다. 이는 예를 들면 이들이 원하는 약학적 또는 치료학적 효과를 여전히 수득하면서 이들의 일반적 양으로 사용될 경우 하나 이상의 물질 또는 화학소의 사용과 연관된 임의의 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소하기 위해 유용할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 치료 섭생의 유효성은, 임상학자에게 명백한 바와 같이, 관여된 질환 또는 장애에 대해 자체 공지된 임의의 방식으로 결정되고/되거나 수행될 수 있다. 임상학자는, 적절한 경우 사항별에 근거(case-by-case basis)하여, 특별한 치료 섭생을 변경 또는 변화시켜, 원하는 치료 효과를 달성하고, 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소시키고/시키거나, 한편으로는 원하는 치료 효과를 달성하고 다른 한편으로는 원치않는 부작용을 방지, 제한 또는 감소시키는 적절한 균형을 달성할 수 있을 것이다.
일반적으로, 치료 섭생은 원하는 치료 효과가 달성될 때까지, 및/또는 원하는 치료 효과가 유지되는 한 수행될 것이다. 다시, 이는 임상학자에 의해 결정될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 골 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한, 및/또는 본원에 언급된 하나 이상의 치료 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
치료되는 대상은 온혈 동물일 수 있지만, 특별히 포유동물이고, 보다 특별히 인간이다. 숙련가에게 명백한 바와 같이, 치료되는 대상은 특별히 본원에 언급된 질환 및 질병을 앓거나 이에 걸릴 위험이 있는 사람일 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드를 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
보다 특별히, 본 발명은 골 질환 및 장애, 특별히 본원에 열거된 하나 하나 이상의 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
다시, 이러한 약학적 조성물에서, 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열, 나노바디 또는 폴리펩티드는 또한 적합하게는 본원에 언급된 바와 같은 하나 이상의 다른 활성 화학소와 조합될 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 나노바디(본원에 정의된 바와 같음) 및 본 발명의 폴리펩티드의 사용이 많이 바람직할 지라도, 본원의 기재내용에 기초하여, 숙련가라면 또한 RANK-L에 대한 다른 아미노산 서열, 특별히 (단일)도메인 항체, 뿐만 아니라 이러한 (단일)도메인 항체를 포함하는 폴리펩티드를 유사한 방식으로 고안 및/또는 생산할 수 있음이 명백할 것이다.
예를 들면, 본 발명의 나노바디에 대해 상기 언급된 하나 이상의 CDR을 이러한 (단일)도메인 항체 또는 다른 단백질 골격, 제한되지 않지만, 예를 들면 인간 골격 또는 비-면역글로불린 골격에 "이식"하는 것이 가능함은 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 CDR 이식에 적합한 골격 및 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 US-A-제7,180,370호, WO 제01/27160호, EP 제0 605 522호, EP 제0 460 167호, US-A-제7,054,297호, 문헌[Nicaise et al, Protein Science (2004), 13:1882-1891]; [Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2): 184-199]; [Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783]; [O'Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100]; [Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187] 및 [Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607], 및 본원에 인용된 추가의 문헌을 참조한다. 예를 들면, 마우스 또는 래트 CDR을 인간 골격구조 및 골격으로 이식하는 자체 공지된 기법이 유사한 방식으로 사용되어 본 발명의 나노바디의 하나 이상의 CDR 및 하나 이상의 인간 골격구조 영역 또는 서열을 포함하는 키메라성(chimeric) 단백질을 제공할 수 있다.
본 발명의 나노바디가 상기 언급된 바람직한 CDR 서열과는 다른 하나 이상의 CDR 서열을 포함할 경우, 이들 CDR 서열은 임의의 자체 공지된 방식으로, 예를 들면 나노바디(바람직함), 종래의 항체(특별히 인간 항체)로부터의 VH 도메인, 중쇄 항체, 종래의 4-쇄 항체(예컨대 종래의 인간 4-쇄 항체) 또는 다른 RANK-L에 대한 면역글로불린 서열로부터 수득될 수 있다. RANK-L에 대한 이러한 면역글로불린 서열은 자체 공지된 임의의 방식으로, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 즉 RANK-L에 의한 면역화에 의해, 또는 RANK-L에 의해 적합한 면역글로불린 서열의 적합한 라이브러리를 스크리닝함으로써, 또는 이의 임의의 적합한 조합에 의해 생성될 수 있다. 선택가능하게는, 이는 예컨대 랜덤 또는 부위-유도된 돌연변이생성 및/또는 자체 공지된 친화도 증진을 위한 다른 기법에 의해 수행된다. 이러한 면역글로불린 서열을 생성하기에 적합한 기법은 숙련가에게 명백할 것이고, 예를 들면 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에서 검토된 스크리닝 기법이 포함된다. 특정화된 표적에 대한 면역글로불린을 생성하는 다른 기법으로는, 예를 들면 나노클론 기술(예를 들면 공개된 미국 특허 출원 제2006-0211088호에 기재된 바와 같음), 소위 SLAM 기술(예를 들면 유럽 특허 출원 제0 542 810호에 기재된 바와 같음), 인간 면역글로불린을 발현하는 유전자도입 마우스의 사용 또는 공지된 하이브리도마(hybridoma) 기술(예를 들면 문헌[Larrick et al, Biotechnology, Vol.7, 1989, p. 934] 참조)이 포함된다. 모든 이들 기술은 RANK-L에 대한 면역글로불린을 생성하기 위해 사용될 수 있고, 이러한 면역글로불린의 CDR은 본 발명의 나노바디에서, 즉 상기 개략된 바와 같이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 CDR의 서열은 결정, 합성 및/또는 단리되고, 본 발명의 나노바디의 서열내로 삽입될 수 있고(예를 들어 상응하는 천연 CDR을 대체하도록), 이들 모두는 자체 공지된 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법을 사용하거나, 이러한 CDR(또는 이를 코딩하는 핵산)을 함유하는 본 발명의 나노바디는, 다시 본원에 언급된 기법을 사용하여, 새롭게 합성될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열, 나노바디, 폴리펩티드, 핵산, 유전자 구조물, 및 숙주 및 숙주 세포의 추가의 용도는 본원의 개시내용에 기초하여 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 제한없이, 본 발명의 아미노산 서열은 적합한 담체 또는 고체 지지체에 연결되어 RANK-L을 포함하는 조성물 및 제제로부터 이를 정제하기 위해 자체 공지된 방식으로 사용될 수 있는 배지를 제공할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지를 포함한 본 발명의 아미노산 서열의 유도체는 또한 마커로서 사용되어 조성물 또는 제제중의 RANK-L의 존재를 (정성적 또는 정량적으로)결정하거나, 세포 또는 조직의 표면상에 RANK-L이 존재하는지를 선택적으로 검출할 수 있다(예를 들면, 적합한 세포 분류 기법에 의해).
이제 본 발명은 하기 비제한적인 바람직한 양태, 실시예 및 도면에 의해 추가로 설명될 것이다:
[바람직한 양태]
1. RANK-L로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
2. 제1양태에 있어서, RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
3. 제1양태 또는 제2양태에 있어서, RANK-L 삼량체 상의 서브유닛간 수용체-결합 홈으로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
4. 제1양태 내지 제3양태중 어느 한 양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 조정하는 아미노산 서열.
5. 제4양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 아미노산 서열.
6. 제5양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 한편, RANK-L/OPG 상호작용을 감소 및/또는 저해하지 않는 아미노산 서열.
7. 제1양태 내지 제6양태중 어느 한 양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 아미노산 서열.
8. 제1양태에 있어서, RANKL-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
9. 제1양태 또는 제8양태에 있어서, RANKL-L의 OPG로의 결합을 조정하는 아미노산 서열.
10. 제9양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 저해 및/또는 방지하는 아미노산 서열.
11. 제10양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 아미노산 서열.
12. 제8양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 감소시키거나 저해하지 않는 아미노산 서열.
13. 제12양태에 있어서, RANK-L의 작용물질인 아미노산 서열.
14. 제1양태에 있어서, RANK-L 삼량체의 형성을 방지 및/또는 저해하는 아미노산 서열.
15. 제1양태에 있어서, 파골세포의 분화 및/또는 증식을 방지 및/또는 저해하는 아미노산 서열.
16. 제1양태에 있어서, 골 재형성을 조정하는 아미노산 서열.
17. 제1양태 내지 제16양태중 어느 한 양태에 있어서, TRAIL에 결합하지 않는 아미노산 서열.
18. 제1양태 내지 제17양태중 어느 한 양태에 있어서, TNF-알파에 결합하지 않는 아미노산 서열.
19. 제1양태 내지 제18양태중 어느 한 양태에 있어서, CD40 리간드에 결합하지 않는 아미노산 서열.
20. 제1양태 내지 제19양태중 어느 한 양태에 있어서, 관련된 TNF 계열 구성원에 결합하지 않는 아미노산 서열.
21. 제1양태 내지 제20양태중 어느 한 양태에 있어서, 본질적으로 단리된 형태인 아미노산 서열.
22. 제1양태 내지 제21양태중 어느 한 양태에 있어서, 대상에게 투여하기 위한 것이나 이러한 대상에서 자연 발생되지 않는 아미노산 서열.
23. 제1양태 내지 제22양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
24. 제1양태 내지 제23양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
25. 제1양태 내지 제24양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
26. 제1양태 내지 제25양태중 어느 한 양태에 있어서, 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
27. 제1양태 내지 제26양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열인 아미노산 서열.
28. 제1양태 내지 제27양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 접힘부를 포함하거나, 또는 적합한 조건하에 면역글로불린 접힘부를 형성할 수 있는 아미노산 서열.
29. 제1양태 내지 제28양태중 어느 한 양태에 있어서, 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
30. 제1양태 내지 제29양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
31. 제1양태 내지 제30양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
32. 제1양태 내지 제31양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린 서열, 카멜화된 면역글로불린 서열, 또는 예컨대 친화도 증진과 같은 기법에 의해 수득되어진 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
33. 제1양태 내지 제32양태중 어느 한 양태에 있어서, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VL-서열); 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VH-서열)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
34. 제1양태 내지 제33양태중 어느 한 양태에 있어서, 종래의 4쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되거나, 중쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
35. 제1양태 내지 제34양태중 어느 한 양태에 있어서, 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디(제한되지 않지만 VHH 서열이 포함됨)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
36. 제1양태 내지 제35양태중 어느 한 양태에 있어서, 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
37. 제1양태 내지 제36양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
38. 제1양태 내지 제37양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
39. 제1양태 내지 제38양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 622∼729, 759∼762 및 766∼773의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 폴리펩티드로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
40. 제1양태 내지 제39양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
41. 제1양태 내지 제40양태중 어느 한 양태에 있어서, RANK-L에 대해 결합하기 위한 적어도 하나의 결합 부위에 더하여, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대해 결합하기 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위를 함유하는 아미노산 서열.
42. a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기의 하나 이상의 연장부를 포함하는, RANK-L에 대한 아미노산 서열.
43. 제42양태에 있어서, 아미노산 잔기의 적어도 하나의 상기 연장부가 RANK-L에 대해 결합하기 위한 항원 결합 부위의 부분을 형성하는 아미노산 서열.
44. 제42양태에 있어서,
(i) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 하기 a), b) 또는 c)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 하기 d), e), f), g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하거나;
(ii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 d), e) 또는 f)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 a), b), c), g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하거나; 또는
(iii) 아미노산 잔기의 제1 연장부가 g), h) 또는 i)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응할 경우, 아미노산 잔기의 제2 연장부가 a), b), c), d), e) 또는 f)에 따른 하나의 아미노산 서열에 상응하도록,
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열;
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 439∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔 기의 2개 이상의 연장부를 포함하는 아미노산 서열.
45. 제44양태에 있어서, 아미노산 잔기의 적어도 2개의 연장부가 RANK-L에 대해 결합하기 위한 항원 결합 부위의 부분을 형성하는 아미노산 서열.
46. 제42양태 내지 제44양태중 어느 한 양태에 있어서, 아미노산 잔기의 3개 이상의 연장부를 포함하고, 여기서
아미노산 잔기의 제1 연장부가
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
아미노산 잔기의 제2 연장부가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
아미노산 잔기의 제3 연장부가
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열.
47. 제46양태에 있어서, 아미노산 잔기의 적어도 3개의 연장부가 RANK-L에 대해 결합하기 위한 항원 결합 부위의 부분을 형성하는 아미노산 서열.
48. 제42양태 내지 제47양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 아미노산 서열의 CDR 서열이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95% 이상의 아미노산 동일성, 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성 갖는 아미노산 서열.
49. 제42양태 내지 제48양태중 어느 한 양태에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열의 RANK-L로의 결합을 교차-차단하는, RANK-L에 대한 아미노산 서열.
50. 제42양태 내지 제48양태중 어느 한 양태에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열에 의해 RANK-L로의 결합으로부터 교차-차단되는, RANK-L에 대한 아미노산 서열.
51. 제49양태 또는 제50양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 아미노산 서열의 능력이 비아코어 검정에서 검출되는 아미노산 서열.
52. 제49양태 또는 제50양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 아미노산 서열의 능력이 ELISA 검정에서 검출되는 아미노산 서열.
53. 제42양태 내지 제52양태중 어느 한 양태에 있어서, 본질적으로 단리된 형태인 아미노산 서열.
54. 제42양태 내지 제53양태중 어느 한 양태에 있어서, 대상에게 투여하기 위한 것이나 이러한 대상에서 자연 발생되지 않는 아미노산 서열.
55. 제42양태 내지 제54양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
56. 제42양태 내지 제55양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
57. 제42양태 내지 제56양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
58. 제42양태 내지 제57양태중 어느 한 양태에 있어서, 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
59. 제42양태 내지 제58양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열인 아미노산 서열.
60. 제42양태 내지 제59양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 접힘부를 포함하거나, 또는 적합한 조건하에 면역글로불린 접힘부를 형성할 수 있는 아미노산 서열.
61. 제42양태 내지 제60양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
62. 제42양태 내지 제61양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
63. 제42양태 내지 제62양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린 서열, 카멜화된 면역글로불린 서열, 또는 예컨대 친화도 증진과 같은 기법에 의해 수득되어진 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
64. 제42양태 내지 제63양태중 어느 한 양태에 있어서, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VL-서열); 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VH-서열)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
65. 제42양태 내지 제64양태중 어느 한 양태에 있어서, 종래의 4쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되거나, 중쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
66. 제42양태 내지 제65양태중 어느 한 양태에 있어서, 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디(제한되지 않지만 VHH 서열이 포함됨)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
67. 제42양태 내지 제66양태중 어느 한 양태에 있어서, 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
68. 제42양태 내지 제67양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
69. 제41양태 내지 제63양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
70. 제42양태 내지 제69양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
71. 제1양태 내지 제70양태중 어느 한 양태에 있어서, CDR 서열에 의해 형성된 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위 이외에, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대해 결합하기 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위를 함유하는 아미노산 서열.
72. 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
-CDR1은
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR2는
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR3은
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열.
73. 4개의 골격구조 영역(개별적으로 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(개별적으로 CDR1∼CDR3)으로 본질적으로 구성되고, 여기서
-CDR1은
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR2는
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR3은
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열.
74. 제72양태 또는 제73양태에 있어서, 상기 아미노산 서열의 CDR 서열이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95% 이상의 아미노산 동일성, 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성 갖는 아미노산 서열.
75. 제72양태 내지 제74양태중 어느 한 양태에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열의 RANK-L로의 결합을 교차-차단하는, RANK-L에 대한 아미노산 서열.
76. 제72양태 내지 제74양태중 어느 한 양태에 따른 적어도 하나의 아미노산 서열에 의해 RANK-L로의 결합으로부터 교차-차단되는, RANK-L에 대한 아미노산 서열.
77. 제75양태 또는 제76양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 아미노산 서열의 능력이 비아코어 검정에서 검출되는 아미노산 서열.
78. 제75양태 또는 제76양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 아미노산 서열의 능력이 ELISA 검정에서 검출되는 아미노산 서열.
79. 제72양태 내지 제78양태중 어느 한 양태에 있어서, 본질적으로 단리된 형태인 아미노산 서열.
80. 제72양태 내지 제79양태중 어느 한 양태에 있어서, 대상에게 투여하기 위한 것이나 이러한 대상에서 자연 발생되지 않는 아미노산 서열.
81. 제72양태 내지 제80양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
82. 제72양태 내지 제81양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
83. 제72양태 내지 제82양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
84. 제72양태 내지 제83양태중 어느 한 양태에 있어서, 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열.
85. 제72양태 내지 제84양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 아미노산 서열인 아미노산 서열.
86. 제72양태 내지 제85양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 접힘부를 포함하거나, 또는 적합한 조건하에 면역글로불린 접힘부를 형성할 수 있는 아미노산 서열.
87. 제72양태 내지 제86양태중 어느 한 양태에 있어서, 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
88. 제72양태 내지 제87양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종으로부터), 또는 합성 또는 반합성 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
89. 제72양태 내지 제88양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 면역글로불린 서열, 카멜화된 면역글로불린 서열, 또는 예컨대 친화도 증진과 같은 기법에 의해 수득되어진 면역글로불린 서열인 아미노산 서열.
90. 제73양태 내지 제89양태중 어느 한 양태에 있어서, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VL-서열); 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어 VH-서열)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
91. 제72양태 내지 제90양태중 어느 한 양태에 있어서, 종래의 4쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되거나, 중쇄 항체로부터 유도된 중쇄 가변 도메인 서열로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
92. 제72양태 내지 제91양태중 어느 한 양태에 있어서, 도메인 항체(또는 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb"(또는 dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열), 또는 나노바디(제한되지 않지만 VHH 서열이 포함됨)로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
93. 제72양태 내지 제92양태중 어느 한 양태에 있어서, 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
94. 제72양태 내지 제93양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
95. 제72양태 내지 제94양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
96. 제72양태 내지 제95양태중 어느 한 양태에 있어서, 인간화된 나노바디로 본질적으로 구성되는 아미노산 서열.
97. 제1양태 내지 제96양태중 어느 한 양태에 있어서, CDR 서열에 의해 형성되는 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위에 더하여, 다른 항원, 단백질 또는 표적에 대해 결합하기 위한 하나 이상의 추가의 결합 부위를 함유하는 아미노산 서열.
98. RANK-L로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
99. 제98양태에 있어서, RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
100. 제98양태 또는 제99양태에 있어서, RANK-L 삼량체 상의 서브유닛간 수용체-결합 홈으로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
101. 제98양태 내지 제100양태중 어느 한 양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 조정하는 나노바디.
102. 제101양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 나노바디.
103. 제102양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 한편, RANK-L/OPG 상호작용을 감소 및/또는 저해하지 않는 나노바디.
104. 제98양태 내지 제103양태중 어느 한 양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 나노바디.
105. 제98양태에 있어서, RANKL-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
106. 제98양태 또는 제105양태에 있어서, RANKL-L의 OPG로의 결합을 조정하는 나노바디.
107. 제106양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 저해하는 나노바디.
108. 제107양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 나노바디.
109. 제106양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 감소시키거나 저해하지 않는 나노바디.
110. 제109양태에 있어서, RANK-L의 작용물질인 나노바디.
111. 제98양태에 있어서, RANK-L 삼량체의 형성을 방지 및/또는 저해하는 나노바디.
112. 제98양태에 있어서, 파골세포의 분화 및/또는 증식을 방지 및/또는 저해하는 나노바디.
113. 제98양태에 있어서, 골 재형성을 조정하는 나노바디.
114. 제98양태 내지 제113양태중 어느 한 양태에 있어서, TRAIL에 결합하지 않는 나노바디.
115. 제98양태 내지 제114양태중 어느 한 양태에 있어서, TNF-알파에 결합하지 않는 나노바디.
116. 제98양태 내지 제115양태중 어느 한 양태에 있어서, CD40 리간드에 결합하지 않는 나노바디.
117. 제98양태 내지 제116양태중 어느 한 양태에 있어서, 관련된 TNF 계열 구성원에 결합하지 않는 나노바디.
118. 제98양태 내지 제117양태중 어느 한 양태에 있어서, 본질적으로 단리된 형태인 나노바디.
119. 제98양태 내지 제118양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
120. 제98양태 내지 제119양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
121. 제98양태 내지 제120양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
122. 제98양태 내지 제121양태중 어느 한 양태에 있어서, 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화도로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 나노바디.
123. 제98양태 내지 제122양태중 어느 한 양태에 있어서, 자연 발생 나노바디(임의의 적합한 종으로부터) 또는 합성 또는 반합성 나노바디인 나노바디.
124. 제98양태 내지 제123양태중 어느 한 양태에 있어서, VHH 서열, 부분적으로 인간화된 VHH 서열, 전체적으로 인간화된 VHH 서열, 카멜화된 중쇄 가변 도메인, 또는 예컨대 친화도 증진과 같은 기법에 의해 수득되어진 나노바디인 나노바디.
125. 제98양태 내지 제124양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 1∼22의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디.
126. 제98양태 내지 제125양태중 어느 한 양태에 있어서,
i) 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖고(여기서, 아미노산 동일성의 정도를 결정하기 위해, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시됨); 여기서
ii) 바람직하게는 카밧 번호매김에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 표 A-3에 언급된 인증 잔기로부터 선택되는 나노바디.
127. 제98양태 내지 제126양태중 어느 한 양태에 있어서,
-CDR1이
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR2가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고/되거나;
-CDR3이
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 나노바디.
128. 제98양태 내지 제129양태중 어느 한 양태에 있어서,
-CDR1이
a) 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열;
b) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
c) 서열 번호 188∼249의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR2가
d) 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열;
e) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
f) 서열 번호 312∼373 및 758의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되고;
-CDR3이
g) 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열;
h) 서열 번호 436∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
i) 서열 번호 439∼497의 적어도 하나의 아미노산 서열과 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 나노바디.
129. 제98양태 내지 제128양태중 어느 한 양태에 있어서, CDR 서열이 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열의 CDR 서열과 70% 이상의 아미노산 동일성, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산 동일성, 예컨대 95% 이상의 아미노산 동일성, 또는 더 본질적으로 100%의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디.
130. 제98양태 내지 제129양태중 어느 한 양태에 있어서, 부분적으로 인간화된 나노바디인 나노바디.
131. 제98양태 내지 제130양태중 어느 한 양태에 있어서, 전체적으로 인간화된 나노바디인 나노바디.
132. 제98양태 내지 제131양태중 어느 한 양태에 있어서, 서열 번호 560∼621로 구성된 군에서, 또는 서열 번호 560∼621의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 이상의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 나노바디.
133. 제98양태 내지 제131양태중 어느 한 양태에 있어서, 서열 번호 730∼757 및 765로 구성된 군에서, 또는 서열 번호 730∼757 및 765의 적어도 하나의 아미노산 서열과 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 보다 바람직하게는 95% 초과, 예컨대 99% 이상의 서열 동일성(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 인간화된 나노바디인 나노바디.
134. 제98양태 내지 제133양태중 어느 한 양태에 있어서, 서열 번호 560∼621로 구성된 군에서, 또는 서열 번호 730∼757 및 765로 구성된 군에서 선택되는 나노바디.
135. 적어도 하나의 제42양태 내지 제48양태 또는 제72양태 내지 제74양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 또는 제127양태 내지 제134양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디의 RANK-L로의 결합을 교차-차단하는, RANK-L에 대한 나노바디.
136. 적어도 하나의 제42양태 내지 제48양태 또는 제72양태 내지 제74양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 또는 제127양태 내지 제143양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디에 의해 RANK-L로의 결합으로부터 교차-차단되는, RANK-L에 대한 나노바디.
137. 제135양태 또는 제136양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 나노바디의 능력이 비아코어 검정에서 검출되는 나노바디.
138. 제135양태 또는 제136양태에 있어서, 교차-차단하거나 교차-차단되는 상기 나노바디의 능력이 ELISA 검정에서 검출되는 나노바디.
139. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 아미노산 서열 및/또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게는 하나 이상의 펩티드성 연결기를 통해 연결된 하나 이상의 다른 아미노산 결합 단위를 선택가능하게 추가로 포함하는 폴리펩티드.
140. 제139양태에 있어서, 상기 하나 이상의 결합 단위가 면역글로불린 서열인 폴리펩티드.
141. 제139양태 또는 제140양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
142. 제139양태 내지 제141양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 면역글로불린 서열인 폴리펩티드.
143. 제139양태 내지 제142양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
144. 제139양태 내지 제143양태중 어느 한 양태에 있어서, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 나노바디인 폴리펩티드.
145. 제139양태 내지 제144양태중 어느 한 양태에 있어서, 다가 구조물인 폴리펩티드.
146. 제139양태 내지 제145양태중 어느 한 양태에 있어서, 다파라토프성 구조물인 폴리펩티드.
147. 제139양태 내지 제146양태중 어느 한 양태에 있어서, 다중특이적 구조물인 폴리펩티드.
148. 제139양태 내지 제147양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드.
149. 제148양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 폴리펩티드.
150. 제149양태에 있어서, 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
151. 제149양태에 있어서, 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
152. 제149양태에 있어서, 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
153. 제149양태에 있어서, 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드.
154. 제149양태에 있어서, 증가된 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 나노바디인 폴리펩티드.
155. 제148양태 내지 제154양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체의 반감기에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 초과의 더 큰 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
156. 제148양태 내지 제155양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 또는 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 더 초과하여 증가된 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
157. 제148양태 내지 제156양태중 어느 한 양태에 있어서, 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상, 예를 들면 5일 이상(예컨대, 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 인간에서의 혈청 반감기를 갖는 폴리펩티드.
158. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 아미노산 서열 및/또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게는 하나 이상의 연결기를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위를 선택가능하게 추가로 포함하는 화합물 또는 구조물.
159. 제158양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
160. 제158양태 또는 제159양태에 있어서, 상기 하나 이상의 연결기가, 존재할 경우, 하나 이상의 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
161.제158양태 내지 제160양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 면역글로불린 서열인 화합물 또는 구조물.
162. 제158양태 내지 제161양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
163. 제158양태 내지 제162양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 면역글로불린 서열인 화합물 또는 구조물.
164. 제158양태 내지 제163양태중 어느 한 양태에 있어서, 상기 본 발명의 하나 이상의 아미노산 서열이 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
165. 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 여기서 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 나노바디인 화합물 또는 구조물.
166. 제158양태 내지 제165양태중 어느 한 양태에 있어서, 다가 구조물인 화합물 또는 구조물.
167. 제158양태 내지 제166양태중 어느 한 양태에 있어서, 다파라토프성 구조물인 화합물 또는 구조물.
168. 제158양태 내지 제167양태중 어느 한 양태에 있어서, 다중특이적 구조물인 화합물 또는 구조물.
169. 제158양태 내지 제168양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 증가된 반감기를 갖는 화합물 또는 구조물.
170. 제169양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 화합물 또는 구조물.
171. 제170양태에 있어서, 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
172. 제170양태에 있어서, 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
173. 제170양태에 있어서, 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
174. 제170양태에 있어서, 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 구조물.
175. 제170양태에 있어서, 증가된 반감기를 화합물 또는 구조물에 제공하는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 혈청 알부민(예컨대 인간 혈청 알부민) 또는 혈청 면역글로불린(예컨대 IgG)에 결합할 수 있는 나노바디인 화합물 또는 구조물.
176. 제169양태 내지 제175양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체의 반감기에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 초과의 더 큰 혈청 반감기를 갖는 화합물 또는 구조물.
177. 제169양태 내지 제176양태중 어느 한 양태에 있어서, 개별적으로, 상응하는 제1양태 내지 제978양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 또는 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 더 초과하여 증가된 혈청 반감기를 갖는 화합물 또는 구조물.
178. 제169양태 내지 제177양태중 어느 한 양태에 있어서, 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상, 예를 들면 5일 이상(예컨대, 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 인간에서의 혈청 반감기를 갖는 화합물 또는 구조물.
179. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 및/또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되는 1가 구조물.
180. 제179양태에 있어서, 상기 본 발명의 아미노산 서열이 도메인 항체, 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 단일 도메인 항체, 단일 도메인 항체로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, "dAb", dAb로서 사용하기에 적합한 아미노산 서열, 또는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 1가 구조물.
181. 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되는 1가 구조물.
182. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
183.제182양태에 있어서, 유전자 구조물의 형태인 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
184. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 발현하거나 적합한 환경에서 발현가능하고/하거나; 제182양태에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제183양태에 따른 유전자 구조물을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
185. 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물, 또는 제182양태 또는 제183양태에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
186. 제185양태에 있어서, 약학적 조성물인 조성물.
187. 제186양태에 있어서, 추가로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 보조제를 포함하고, 선택가능하게는 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 조성물인 조성물.
188. -적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또다른 적합한 발현 시스템에서, 제182양태에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제183양태에 따른 유전자 구조물을 발현시키는 단계; 및 선택가능하게 후속되는
-제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있도록 함), 또는 이렇게 수득된 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 단리 및/또는 정제하는 단계를 적어도 포함하는,
제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제186양태 또는 제187양태에 따른 약학적 조성물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있도록 함)을 생산하는 방법.
189. -적어도 하나의 제184양태에 따른 숙주 또는 숙주 세포가 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있도록 함), 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 발현 및/또는 생산할 수 있는 조건하에 상기 숙주 또는 숙주 세포를 배양 및/또는 유지시키는 단계; 및 선택가능하게 후속되는
-제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있도록 함), 또는 이렇게 수득된 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 단리 및/또는 정제하는 단계를 적어도 포함하는,
제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제186양태 또는 제187양태에 따른 약학적 조성물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 수득될 수 있도록 함)을 생산하는 방법.
190. a) 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계; 및
b) RANK-L에 결합할 수 있고/있거나 이에 대한 친화도를 갖고, 본 발명의 나노바디, 예를 들어 서열 번호 560∼621, 또는 본 발명의 인간화된 나노바디, 예를 들어 서열 번호 730∼757 및 765, 또는 본 발명의 폴리펩티드 또는 구조물, 예를 들어 서열 번호 622∼729, 759∼762 및 766∼773을 교차-차단하거나 이로 교차-차단되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 위하여 핵산 서열의 상기 세트, 콜렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 적어도 포함하는,
RANK-L에 대한 아미노산 서열을 스크리닝하기 위한 방법.
191. 약학적으로 활성인 양의 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물, 또는 제186양태 또는 제187양태에 따른 조성물을 필요한 대상에게 투여함을 포함하는, 적어도 하나의 골 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
192. 약학적으로 활성인 양의 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물, 또는 제186양태 또는 제187양태에 따른 조성물을 필요한 대상에게 투여함을 포함하는, RANK-L, 이의 생리학적 또는 약리학적 활성, 및/또는 RANK-L이 관여된 생물학적 경로 또는 신호와 연관된 적어도 하나의 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
193. 약학적으로 활성인 양의 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물, 또는 제186양태 또는 제187양태에 따른 조성물을 필요한 대상에게 투여함을 포함하는, 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물을 필요한 대상에게 투여함으로써 예방 및/또는 치료될 수 있는 적어도 하나의 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하기 위한 방법.
194. 약학적으로 활성인 양의 적어도 하나의 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물, 또는 제186양태 또는 제187양태에 따른 조성물을 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 면역치료를 위한 방법.
195. 적어도 하나의 골 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 및/또는 제191양태 내지 제194양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 방법에서 사용하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서, 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물의 용도.
196. 적어도 하나의 골 질환 또는 장애의 예방 및/또를 치료를 위한 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제179양태 내지 제181양태중 어느 한 양태에 따른 1가 구조물.
197. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디의 부분 또는 단편.
198. 제197양태에 있어서, RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
199. 제197양태 또는 제198양태에 있어서, RANK-L 삼량체 상의 서브유닛간 수용체-결합 홈으로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
200. 제197양태 내지 제199양태중 어느 한 양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 조정하는 부분 또는 단편.
201. 제200양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 부분 또는 단편.
202. 제201양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 한편, RANK-L/OPG 상호작용을 감소 및/또는 저해하지 않는 부분 또는 단편.
203. 제197양태 내지 제202양태중 어느 한 양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 부분 또는 단편.
204. 제197양태에 있어서, RANK-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
205. 제197양태 또는 제204양태에 있어서, RANKL-L의 OPG로의 결합을 조정하는 부분 또는 단편.
206. 제205양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 저해하는 부분 또는 단편.
207. 제206양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 부분 또는 단편.
208. 제205양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 감소시키거나 저해하지 않는 부분 또는 단편.
209. 제208양태에 있어서, RANK-L의 작용물질인 부분 또는 단편.
210. 제197양태에 있어서, RANK-L 삼량체의 형성을 방지 및/또는 저해하는 부분 또는 단편.
211. 제197양태에 있어서, 파골세포의 분화 및/또는 증식을 방지 및/또는 저해하는 부분 또는 단편.
212. 제197양태에 있어서, 골 재형성을 조정하는 부분 또는 단편.
213. 제197양태 내지 제212양태중 어느 한 양태에 있어서, TRAIL에 결합하지 않는 부분 또는 단편.
214. 제197양태 내지 제213양태중 어느 한 양태에 있어서, TNF-알파에 결합하지 않는 부분 또는 단편.
215. 제197양태 내지 제214양태중 어느 한 양태에 있어서, CD40 리간드에 결합하지 않는 부분 또는 단편.
216. 제197양태 내지 제215양태중 어느 한 양태에 있어서, 관련된 TNF 계열 구성원에 결합하지 않는 부분 또는 단편.
217. 제197양태 내지 제216양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
218. 제197양태 내지 제217양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
219. 제197양태 내지 제218양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 부분 또는 단편.
220. 제197양태 내지 제219양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 부분 또는 단편을 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게는 하나 이상의 연결기를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위를 선택가능하게 추가로 포함하는 화합물 또는 구조물.
221. 제220양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
222. 제220양태 또는 제221양태에 있어서, 상기 하나 이상의 연결기가, 존재할 경우, 하나 이상의 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
223. 제197양태 내지 제219양태중 어느 한 양태에 따른 부분 또는 단편, 또는 제222양태에 따른 화합물 또는 구조물을 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
224. 적어도 하나의 제197양태 내지 제219양태중 어느 한 양태에 따른 부분 또는 단편, 제220양태 내지 제222양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제223양태에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
225. 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열, 또는 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디의 유도체.
226. 제225항에 있어서, RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
227. 제226양태에 있어서, RANK-L 상의 RANK 수용체 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
228. 제226양태 또는 제227양태에 있어서, RANK-L 삼량체 상의 서브유닛간 수용체-결합 홈으로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
229. 제226양태 내지 제228양태중 어느 한 양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 조정하는 유도체.
230. 제229양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 유도체.
231. 제230양태에 있어서, RANKL-L의 RANK로의 결합을 저해 및/또는 방지하는 한편, RANK-L/OPG 상호작용을 감소 및/또는 저해하지 않는 유도체.
232. 제226양태 내지 제231양태중 어느 한 양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 유도체.
233. 제226양태에 있어서, RANKL-L 상의 OPG 결합 부위로 유도되고/되거나 이에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
234. 제226양태 또는 제233양태에 있어서, RANKL-L의 OPG로의 결합을 조정하는 유도체.
235. 제234양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 저해 및/또는 방지하는 유도체.
236. 제235양태에 있어서, RANK-L의 길항물질인 유도체.
237. 제234양태에 있어서, RANK/RANK-L 상호작용을 감소시키거나 저해하지 않는 유도체.
238. 제237양태에 있어서, RANK-L의 작용물질인 유도체.
239. 제226양태에 있어서, RANK-L 삼량체의 형성을 방지 및/또는 저해하는 유도체.
240. 제226양태에 있어서, 파골세포의 분화 및/또는 증식을 방지 및/또는 저해하는 유도체.
241. 제226양태에 있어서, 골 재형성을 조정하는 유도체.
242. 제226양태 내지 제241양태중 어느 한 양태에 있어서, TRAIL에 결합하지 않는 유도체.
243. 제226양태 내지 제242양태중 어느 한 양태에 있어서, TNF-알파에 결합하지 않는 유도체.
244. 제226양태 내지 제243양태중 어느 한 양태에 있어서, CD40 리간드에 결합하지 않는 유도체.
245. 제226양태 내지 제244양태중 어느 한 양태에 있어서, 관련된 TNF 계열 구성원에 결합하지 않는 유도체.
246. 제226양태 내지 제245양태중 어느 한 양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
247. 제226양태 내지 제246양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
248. 제226양태 내지 제247양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
249. 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물의 유도체.
250. 제249양태에 있어서, RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
251. 제249양태 또는 제250양태에 있어서, 10-5∼10-12 몰/리터 이하, 바람직하게는 10-7∼10-12 몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10-8∼10-12 몰/리터의 해리 상수(KD)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
252. 제249양태 내지 제251양태중 어느 한 양태에 있어서, 102 M-1s-1∼약 107 M-1s-1, 바람직하게는 103 M-1s-1∼107 M-1s-1, 보다 바람직하게는 104 M-1s-1∼107 M-1s-1, 예컨대 105 M-1s-1∼107 M-1s-1의 결합 속도(kon-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
253. 제249양태 내지 제252양태중 어느 한 양태에 있어서, 1 s-1∼10-6 s-1, 바람직하게는 10-2 s-1∼10-6 s-1, 보다 바람직하게는 10-3 s-1∼10-6 s-1, 예컨대 10-4 s-1∼10-6 s-1의 해리 속도(koff-속도)로 RANK-L에 특이적으로 결합할 수 있는 유도체.
254. 제225양태 내지 제253양태중 어느 한 양태에 있어서, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 또는 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물 자체의 반감기에 비하여 1.5배 이상, 바람직하게는 2배 이상, 예컨대 5배 이상, 예를 들면 10배 이상 또는 20배 초과의 더 큰 혈청 반감기를 갖는 유도체.
255. 제225양태 내지 제254양태중 어느 한 양태에 있어서, 상응하는 제1양태 내지 제97양태중 어느 한 양태에 따른 아미노산 서열 자체, 제98양태 내지 제138양태중 어느 한 양태에 따른 나노바디 자체, 제139양태 내지 제157양태중 어느 한 양태에 따른 폴리펩티드, 또는 제158양태 내지 제178양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물 자체에 비하여 1 시간 초과, 바람직하게는 2 시간 초과, 보다 바람직하게는 6 시간 초과, 예컨대 12 시간 초과, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 더 초과하여 증가된 혈청 반감기를 갖는 유도체.
256. 제225양태 내지 제255양태중 어느 한 양태에 있어서, 약 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 보다 바람직하게는 48 시간 이상, 보다 더 바람직하게는 72 시간 이상, 예를 들면 5일 이상(예컨대, 약 5∼10일), 바람직하게는 9일 이상(예컨대 약 9∼14일), 보다 바람직하게는 약 10일 이상(예컨대 약 10∼15일), 또는 약 11일 이상(예컨대 약 11∼16일), 보다 바람직하게는 약 12일 이상(예컨대 약 12∼18일 이상), 또는 14일 초과(예컨대 약 14∼19일)의 인간에서의 혈청 반감기를 갖는 유도체.
257. 제225양태 내지 제256양태중 어느 한 양태에 있어서, 페그화된 유도체인 유도체.
258. 제225양태 내지 제257양태중 어느 한 양태에 따른 하나 이상의 유도체를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되고, 선택가능하게는 하나 이상의 연결기를 통해 연결된 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위를 선택가능하게 추가로 포함하는 화합물 또는 구조물.
259. 제258양태에 있어서, 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 부분구조 또는 결합 단위가 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
260. 제258양태 또는 제259양태에 있어서, 상기 하나 이상의 연결기가, 존재할 경우, 하나 이상의 아미노산 서열인 화합물 또는 구조물.
261. 제225양태 내지 제257양태중 어느 한 양태에 따른 유도체, 또는 제258양태 내지 제260양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물을 코딩하는 핵산.
262. 적어도 하나의 제225양태 내지 제257양태중 어느 한 양태에 따른 유도체, 또는 제258양태 내지 제260양태중 어느 한 양태에 따른 화합물 또는 구조물, 또는 제261양태에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
도 1: 실시예 3.2에 기재된 바와 같은, TNFα, TRAIL, CD40L 및 RANK-L에 의한 경쟁 ELISA의 결과. A: RANKL6 나노바디의 결합; B: RANKL9 나노바디의 결합; C: RANKL13 나노바디의 결합; D: RANKL15 나노바디의 결합; E: RANKL18 나노바디의 결합.
도 2: 실시예 4.3에 기재된 바와 같은, 1가 또는 3가 항-RANK-L 나노바디에 의한 세포-기초 경쟁 결합 검정의 결과. A: RANKL13 및 RANKL130 나노바디에 의한 저해; B: RANKL15 및 RANKL150 나노바디에 의한 저해; C: RANKL18 및 RANKL180 나노바디에 의한 저해. 실선: 1가 나노바디; 긴 점선: 3가 이특이적 나노바디; 짧은 점선: 무관한 나노바디.
도 3: 인간 파골세포의 분화에 미치는 나노바디의 영향. 결과는 TRACP 5b 값으로 제시된다. 이 그룹은: BL = 기선(Baseline)(첨가된 화합물이 없음); C = 대조표준(100 ng/㎖ OPG); A1 = 0.05 nM; A2 = 0.3 nM; A3 = 1 nM; A4 = 3 nM; A5 = 10 nM; A6 = 50 nM; A7 = 250 nM. 모든 그룹의 결과를 원-웨이(one-way) ANOVA를 사용 하여 기선 그룹의 결과와 별도로 비교하였다. 별표는 기선과 비교된 통계적으로 유의적인 저해 효과를 나타낸다. 모든 나노바디는 용량-의존적으로 파골세포 분화를 저해한다(***p<0.001). 3-A: RANKL60; 3-B: RANKL130; 3-C: RANK-L180.
도 4: (A) 나노바디의 투여시의 기선의 변화율(%)로서 표시되는 혈청 NTx 수준(검출 제한 미만의 값은 포함되지 않음). (B) 작은 분자 이반드로네이트(IBN: Ibandronate) 또는 음성 대조표준 나노바디 ALB-1의 투여시의 기선의 변화율(%)로서 표시되는 혈청 NTx 수준.
도 5: 나노바디의 투여시의 기선의 변화율(%)로서 표시되는 혈청 BAP 수준.
도 6: 야생형 분자 RANKL13(서열 번호 572) 및 인간 생식계열 VH3-23(서열 번호 763)의 처음 97개 아미노산 잔기로의 인간화된 RANKL13hum5(서열 번호 755)의 정렬. 인간화된 aa 잔기는 적색으로 지시되는 한편, CDR1, 2 및 3은 녹색으로 강조된다.
도 7: 알파스크린 검정에서 RANKL13, RANKL13hum5 및 RANKL 13hum5_D62E의 효능에 대한 분석.
도 8: RANK-L130NT 및 RANKL 008a의 고정화된 RANK-L로의 결합. 알부민의 존재하에 RANK-L 130NT(담청색) 및 Rank-L 008a(분홍색)의 고정화된 Rank-L로의 결합.
도 9: RANKL18hum6의 결합에 대한 이중인화 센서그램(superimposed sensorgram). RANKL18hum6: 50O nM RANKL18hum6의 120초 동안의 결합. 혼합물: 50O nM RANKL18hum6의 120초 동안의 결합 이후, 50O nM의 RANKL18hum6 및 RANKL13hum5를 함유한 혼합물을 주입함.
도 10: RANKL13hum5의 결합에 대한 이중인화 센서그램.
RANKL13hum5: 50O nM RANKL13hum5의 120초 동안의 결합. 혼합물: 50O nM RANKL13hum5의 120초 동안의 결합 이후, 50O nM의 RANKL13hum5 및 RANKL18hum6를 함유한 혼합물을 주입함.
도 11: RAW264.7 세포의 RANK-L 유도된 분화의 저해.
RAW264.7 세포(2000 세포/웰)를 RANKL008a(●), RANKL003p(■), 또는 무관한 나노바디(▲)의 희석 시리즈와 함께 항온처리하고, 7.5 ng/㎖의 RANK-L로 분화를 유도하였다. 4일 후, 상청액중 타르트레이트-내성 산 포스파타아제 활성을 측정하였다. 2중 측정값의 평균 ± s.e.가 제시되어 있다. 양성 대조표준(즉, 나노바디가 없음)은 ○를 사용하여 지시되고; 음성 대조표준(즉, RANK-L이 없음)은 (□)를 사용하여 지시된다.
도 12: RANK-L과 RANK 상호작용의 저해.
RANKL008a(●), RANKL003p(▲) 또는 오스테오프로테게린(▼)의 희석 시리즈를 7.5 ng/㎖의 RANK-L 및 200 ng/㎖의 RANK-Fc와 함께 항온처리하였다. 혼합물을 항-Fc 나노바디 PMP02로 코팅된 96-웰 플레이트로 옮겼다. 결합된 잔여 RANK-L을 검출하였다.
도 13: RANKL008a의 인간 혈청 알부민으로의 결합.
96-웰 플레이트를 HSA로 코팅하였다. 차단후, RANKL008a의 희석 시리즈를 적 용하였다. 결합된 RANKL008a를 양고추냉이 퍼옥시다아제 표지된 2가 나노바디로 검출하였다.
도 14: RANKL008a의 HSA 및 RANK-L로의 이작용성 결합.
A) 마이크로타이터(Microtiter) 플레이트를 뉴트라비딘(neutravidin)으로 코팅하고, 이후 비오티닐화된(biotinylated) RANK-L을 결합시켰다. 웰을 RANKL008a의 희석 시리즈와 함께 항온처리하였다. 결합된 RANKL008a를 양고추냉이 퍼옥시다아제 표지된 알부민으로 검출하였다. 2중 측정값의 평균 ± s.e.; B) 마이크로타이터 플레이트를 HSA로 코팅하고, 이후 RANKL008a의 희석 시리즈를 적용하였다. 결합된 RANKL008a를 비오티닐화된 RANK-L로, 이어서 양고추냉이 퍼옥시다아제 표지된 스트렙타비딘으로 검출하였다.
도 15: RANKL008a(8-A), RANKLOO1p(8-B) 또는 RANKL003p(8-C) 나노바디의 정맥내 또는 피하 투여(3 mg/kg)시의 혈청 NTx 수준(검출 제한 미만의 값은 포함되지 않음).
도 16: RANKL008a(9-A), RANKLOO1p(9-B) 또는 RANKL003p(9-C) 나노바디의 투여(0.3 mg/kg; 0.03 mg/kg)시의 혈청 NTx 수준(검출 제한 미만의 값은 포함되지 않음).
도 17: 나노바디와 다른 TNF 계열 구성원 TNFα 및 TRAIL, 및 마우스 RANK-L의 교차-반응성.
실시예 1: RANK -L 차단 나노바디의 동정
1.1 면역화
2마리의 라마(제115번 및 제116번)를 표준 프로토콜에 따라 9회 근육내 주사(100 또는 50 μg/용량/1주 간격으로)하여 면역화시켰고, 이때 라마 제116번 및 라마 제115번에서 처음 5회 주사를 위해 인간 RANK-L[알&디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재] 및 마우스 RANK-L(알&디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)를 교대로 주사하였다. 라마 제115번에서의 마지막 4회 주사는 단지 인간 RANK-L로 하였다. 항원 둘다는 스티뮨(Stimune)[세디-디아그노스틱스 비.브이.(Cedi-Diagnostics B.V.), 네델란드 레리스타드 소재]에서 제형화하였다. 3주째, 혈청을 수거하여 인간 및 마우스 RANK-L에 대한 항체 역가를 ELISA에 의해 한정하였다. 간단히, 96-웰 맥시소프(Maxisorp) 플레이트[눈크(Nunc), 독일 비스바덴 소재]를 인간 또는 마우스 RANK-L로 코팅하였다. 희석된 혈청 샘플을 차단 및 첨가한 후, 항-RANK-L 나노바디의 존재를 HRP(양고추냉이 퍼옥시다아제) 컨쥬게이션된 염소 항-라마 면역글로불린[베틸 래보레이토리즈 인코포레이션(Bethyl Laboratories Inc.), 미국 텍사스주 몽고메리 소재], 및 기질 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)[피어스(Pierce), 미국 일리노이주 락포드 소재] 존재하에서의 후속적인 효소 반응에 의해 입증하였다. OD450nm은 양쪽 동물에서 인간 및 마우스 RANK-L에 대해 1을 초과하였다.
1.2 라이브러리 작성
피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 혈청 샘 플로부터 말초 혈액 단핵 세포를 제조하였다. 그 다음, 전체 RNA를 이들 세포로부터 추출하고, RT-PCR을 위한 출발 물질로서 사용하여 나노바디 코딩 유전자 단편을 증폭시켰다. 이들 단편을 하우스 메이드(house made) 파지미드 벡터내로 클로닝하였다. 파지를 표준 방법에 따라 제조하고(예를 들면 선행 기술 및 본원에 인용된 출원인에 의해 출원된 출원을 참조함), 추가의 사용을 위해 4℃에서 여과 살균한 후 저장하였다.
1.3 선택
라마 제115번 및 제116번으로부터 수득된 파지 라이브러리를 상이한 선택 전략을 위해 사용하였다.
첫번째 선택에서, 1, 0.1, 0.01 μg/㎖의 비오티닐화된 hRANK-L(마우스 골수종 NSO 세포주에서 발현됨)(알&디 시스템스, 미국 미네아폴리스 소재)을 뉴트라비딘 코팅된 고체 상 위에 포획하였다. 파지 라이브러리와 함께 항온처리하고 대규모로 세척한 후, 결합된 파지를 트립신(1 mg/㎖)으로 특이적으로 용출하였다.
두번째 선택에서, 가용성 비오티닐화된 hRANK-L(알&디 시스템스, 미국 미네아폴리스 소재)(1 nM, 100 pM, 10 pM)을 파지 라이브러리와 함께 항온처리하였다. 대규모로 세척한 후, 비오티닐화된 hRANK-L을 뉴트라비딘 코팅된 고체 상 위에 포획하였다. 결합된 파지를 트립신(1 mg/㎖)으로 특이적으로 용출하였다.
세번째 선택에서, hRANK-L(이. 콜라이에서 발현됨)[페프로텍(Peprotech), 영국 런던 소재]을 맥시소프 96-웰 플레이트(눈크, 독일 비스바덴 소재) 상으로 1, 0.1, 0.01 μg/㎖로 코팅하였다. 파지 라이브러리와 함께 항온처리하고 대규모로 세척한 후, 결합된 파지를 트립신(1 mg/㎖)으로 특이적으로 용출하였다.
모든 선택에서, 다량으로 관찰되었다. 선택으로부터의 결과물을 하나의 푸울(pool)로서 하우스 메이드 발현 벡터내로 재클로닝하였다. 콜로니를 따서 96 딥 웰 플레이트(1 ㎖ 부피)에서 성장시키고, 나노바디 발현을 위해 IPTG를 첨가하여 유도하였다. 원형질막공간 추출물(부피: ∼80 ㎕)을 표준 방법에 따라 제조하였다(예를 들면 선행 기술 및 본원에 인용된 출원인에 의해 출원된 출원을 참조함).
1.4 알파스크린 검정에서 RANK -L 차단 나노바디에 대한 스크리닝
원형질막공간 추출물을 RANK 알파스크린 검정에서 스크리닝하여, 발현된 나노바디의 차단 능력을 평가하였다. 이 검정은 생물학적 분자에 컨주게이션될 수 있는 도너 및 억셉터 비이드(Donor and Acceptor bead)의 사용에 기초한다. 분자간의 생물학적 상호작용이 비이드를 근접하게 옮기면, 도너 비이드 중의 광감작제에 의해 680 nm에서의 레이저 여기시 생성되는 여기된 단일선 산소 분자가 확산되어 후속적으로 520-620 nm에서 발광하는 형광발색단을 추가로 활성화시키는 억셉터 비이드 중의 화학발광체와 반응한다. 나노바디가 RANK-L의 RANK로의 결합을 저해하면, 형광 산출물이 감소할 것이고, 존재하는 나노바디의 양은 형광량에 역비례할 것이다.
인간 RANK-L을 비오틴[시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재] 및 비오틴아미도헥산산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스터 소듐 염(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 비오티닐화시켰다. RANK-huFc 키메라[알렉시스 바이오케미칼스(Alexis, Biochemicals), 스위스 라우센 소재]를 제조업체 (퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)의 지시에 따라 수용체 비이드에 커플링시켰다. 항-hRANK-L 나노바디의 무효화 능력을 평가하기 위해, 원형질막공간 추출물의 희석 시리즈를 비오티닐화된 인간 RANK-L과 함께 예비-항온처리하였다. 이 혼합물에 억셉터 비이드 및 스트렙타비딘 도너 비이드를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 680 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 사용하여 엔비전 멀티라벨 플레이트 리더(EnVision Multilabel Plate Reader)(퍼킨 엘머) 상에서 플레이트를 판독함으로써 형광성을 측정하였다. 형광 신호의 감소는 비오티닐화된 RANK-L의 RANK 수용체로의 결합이 원형질막공간 추출물에서 발현된 나노바디에 의해 차단됨을 지시한다.
이러한 스크리닝으로부터, 저해 나노바디를 선택하고 스크리닝하였다. 서열화 분석은 12개의 고유의 나노바디 및 10개의 나노바디 계열을 나타내었다. 상응하는 서열은 표 C-1 및 표 B-1에 도시되어 있다. 비-저해성 나노바디의 서열은 표 B-2에 제시되어 있다.
실시예 2: 알파스크린 검정 및 ELISA 에서 21개 RANK -L 차단 나노바디의 특징화
2.1 나노바디 발현 및 정제
실시예 1에 기재된 스크리닝으로부터 선택된 20개의 저해성 나노바디를 추가로 정제하고 특징화하였다. 선택된 나노바디를 50 ㎖의 배양 부피에서 c-myc, His6-태깅된 단백질로서 이.콜라이에서 발현시켰다. 발현을 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하고, 4시간 동안 37℃에서 지속하였다. 세포 배양물을 회전시킨 후, 원형 질막공간 추출물을 펠릿의 동결-해동에 의해 제조하였다. 이들 추출물을 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC: immobilized metal affinity chromatography)에 대한 출발 물질로서 사용하였다. 나노바디를 150 mM 이미다졸로 칼럼으로부터 용출하고, 후속적으로 PBS에 대해 투석하였다.
2.2 나노바디는 맥시소프 96-웰 플레이트 상에 코팅된 가용성 hRANK -L에 결합한다
먼저, 비오티닐화된 hRANK-L(200 ng/㎖)을 뉴트라비딘 코팅된 96-웰 플레이트 상에 포획하였다. 이를 위해 2 μg/㎖의 뉴트라비딘을 4℃에서 하룻밤 코팅시켰다. 플레이트를 300 ㎕의 PBS로 5회 세척한 다음, 300 ㎕의 1% 카제인/PBS으로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단 후, 비오티닐화된 RANK-L(200 ng/㎖)을 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS로 대규모로 세척한 후, 1% 카제인/PBS 중에 500 nM에서 출발하여 160 pM으로 희석된 다양한 농도의 나노바디를 웰에 첨가하고, 플레이트 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 결합된 나노바디를, 1차 마우스 항-myc 항체 및 2차 항 마우스-HRP 컨주게이트(conjugate)[다코(DAKO), 덴마크 글로스트러프 소재]의 후속적인 항온처리에 의해, TMB-H2O2(피어스, 미국 일리노이주 락포드 소재) 기질 칵테일(cocktail)을 사용하여 검출하였다. 반응을 H2SO4에 의해 중지시키고, OD를 450 nm에서 판독하였다. 모든 나노바디는 플레이트 상에 코팅된 hRANK-L에 용량-의존적 방식으로 결합하였다. 계산된 ED50 값은 표 C-2에 제시되어 있다.
나노바디의 동일한 패널을 또한 인간 RANK-L에 대해 기재된 바와 유사한 실험장치로(상기 참조) 뮤린 RANK-L로의 결합에 대해 분석하였다. 단지 나노바디 RANKL3만 뮤린 RANK-L에 용량-의존적 방식으로 대략 600 pM의 ED50으로 결합하였다.
2.3 나노바디는 알파스크린에서 RANK -L의 그의 컨주게이트 수용체 RANK 로의 결합을 차단한다
인간 RANK-L을 비오틴(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 비오틴아미도헥산산 3-설포-N-하이드록시석신이미드 에스터 소듐 염(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 비오티닐화시켰다. RANK-huFc 키메라(1 nM)(알렉시스 바이오케미칼스, 스위스 라우센 소재)를 제조업체(퍼킨 엘머, 미국 매사추세츠주 왈탐 소재)의 지시에 따라 억셉터 비이드에 커플링시켰다.
50 nM로부터 출발하여 1 pM까지의 항-RANK-L 나노바디의 희석 시리즈를 100 pM 비오티닐화된 RANK-L과 함께 30 분 동안 실온에서 예비-항온처리하였다. 이 혼합물에 억셉터 비이드 및 스트렙타비딘 도너 비이드를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 680 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 사용하여 엔비전 멀티라벨 플레이트 리더(퍼킨 엘머) 상에서 플레이트를 판독함으로써 형광성을 측정하였다.
모든 나노바디와 비오티닐화된 RANK-L의 예비항온처리는 520 nm에서 형광 강도를 감소시켰고, 이는 나노바디가 RANK-L의 RANK로의 결합을 용량-의존적 방식으로 효과적으로 저해할 수 있음을 입증한다. 계산된 IC50 값은 표 C-3에 제시되어 있고, RANKL9에 대한 137 pM으로부터 RANKL23에 대한 3530 pM까지 다양하다.
실시예 3: RANKL 6, 9, 13, 15, 18의 결합 특이성
3.1 RANKL 6. 9. 13. 15. 18은 세포막 발현된 인간 및 사이노몰구스 RANK -L에 특이적으로 결합한다
인간 및 사이노몰구스 원숭이의 RANK-L을 인간 배아 신장 세포(HEK293T; Wullaert et al. 2007, J. Biol. Chem. 282: 81-90)에서 전장 막-결합 단백질로서 발현시켰다. 나노바디의 세포 표면 발현된 RANK-L로의 결합을 세포의 FACS 분석에 의해 하기 기재된 바와 같이 평가하였다.
인간 배아 신장 세포(HEK293T)를 10% 소 태아 혈청(FBS: fetal bovine serum), 2 nM L-글루타민, 0.4 mM 소듐 피루베이트로 보충된 둘베코의 변형된 이글스배지(Dulbecco's modified Eagles's medium)에서 성장시켰다. HEK293T 세포를, 전장 인간 또는 전장 사이노몰구스 RANK-L을 발현하는 플라스미드에 의해 푸진(Fugene)6(등록상표) 및 옵티멤(Optimem)[로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals), 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재]을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 일시적으로 형질감염시켰다. 48 시간 후, 형질감염된 세포를 FACS 분석하였다. 형질감염체를 FACS 완충액(PBS + 10% FBS)중 5E+06/㎖의 최종 농도로 96-웰 플레이트에 식종(seeding)하고, 다양한 농도의 나노바디(hRANK-L 형질감염체를 위해 2 nM, 400 pM, 80 pM, 16 pM, 3,2 pM; 사이노몰구스 RANK-L 형질감염체를 위해 2 nM, 400 pM)와 함께 1 시간 동안 4℃에서 항온처리 하였다. 이어서 세포를 3회 FACS 완충액으로 세척하였다. 결합된 나노바디를 1차 마우스 항 Myc 항 체의 후속적인 항온처리(30 분 동안 4℃에서(2 μg/㎖)) 및 염소 항 마우스-피코에리트린(PE: Phycoerythrin)[잭슨 래보레이토리즈(Jackson Laboratories)]의 2차 항온처리(추가의 30 분 동안 4℃에서)에 의해 검출하였다. 최종적으로, 세척 후, 세포를 PBS + 10% FBS + TO-PRO(등록상표)-3(5 nM)[몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)(등록상표), 인비트로겐, 벨기에 메렐베케 소재]에 재현탁시키고, 평균 PE 형광성으로 표시되는 세포 표면 형광성을 유세포분석에 의해 측정하였다. 모든 나노바디는 시험된 모든 농도에서 HEK293T 세포 상에서 발현된 인간 RANK-L 및 사이노몰구스 RANK-L 둘다에 대해 용량-의존적 결합을 나타내었다(표 C-4). 400 pM 나노바디와 HEK293T 형질감염체의 항온처리 혼합물로의 40 nM 가용성 인간 RANK-L의 첨가가 세포로의 개별적 나노바디의 결합을 폐기시키므로, 결합은 특이적이었다(데이터는 제시되지 않음).
3.2 RANKL 6. 9. 13. 15. 18은 TNF 계열 구성원 TNF α. CD40 리간드 ( CD40L ) 또는 TRAIL 에 결합되지 않는다
인간 OPG는 종양 괴사 인자-연관된 아포토시스 유도 리간드(TRAIL: tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand)에 약하게 결합되는 것으로 보고되고 있다. RANK-L 아미노산 서열은 TRAIL의 서열과 34%의 유사성을 나타낸다.
경쟁 ELISA에서, 항-RANK-L 나노바디가 TNF 계열 구성원 TNFα, TRAIL 및 CD40L에 결합하지 않는 것으로 나타났다. RANK-L을 실시예 2에 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트 상으로 코팅하였다. 나노바디 RANKL 6, 9, 13, 15 및 18(1 nM)을 다양한 농도의 RANK-L, TNFα, CD40L 또는 TRAIL(대략 100 nM∼40 pM)과 함께 예비 항온처리하고, 이후 이들을 플레이트에 첨가하였다. 나노바디의 RANK-L 코팅된 플레이트로의 결합은 단지 외부에서 첨가된 RANK-L에 의해서만 저해되었고, 다른 리간드의 첨가에 의해 영향받지 않았다(도 1).
실시예 4: 3가 이특이적 항- RANKL 나노바디 대 1가 대응물의 무효화 활성
4.1 3가 이특이적 항- RANK -L 나노바디의 작성 및 발현
RANKL3, RANKL6, RANKL9, RANKL13, RANKL15 및 RANKL18을 또한 3가 이특이적 항-RANK-L 나노바디로서 발현시켰다. 3가 분자(예를 들어 RANKL6-ALB1-RANKL6)는 항-RANK-L 나노바디에 상응하는 2개의 빌딩 블럭(building block), 및 항 인간 혈청 알부민(HSA: Human Serum Albumin) 나노바디 빌딩 블럭(ALB-1; 서열 번호 790)에 상응하는 이들 중간의 제3 빌딩 블럭으로 구성된다. 개개의 빌딩 블럭을 Gly/Ser(GGGGSGGGS; 서열 번호 792) 연결기에 의해 융합시켰다. 이들 3가 이특이적 항-RANK-L 나노바디의 서열은 표 B-3에 제시되어 있다. 이들 구조물을 c-myc, His6-태깅된 단백질로서 이. 콜라이에서 발현시키고, 후속적으로 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromotagraphy)에 의해 배지로부터 정제하였다.
4.2 알파-스크린에서 RANK -L의 RANK 로의 결합에 대한 3가 나노바디에 의한 저해
5종의 3가 나노바디(RANKL30: RANKL3-ALB1-RANKL3, RANKL60: RANKL6-ALB1-RANKL6, RANKL90: RANKL9-ALB1-RANKL9, RANKL130: RANKL13-ALB1-RANKL13, RANKL150: RANKL15-ALB1-RANKL15, RANKL180: RANKL18-ALB1-RANKL18)를 알파-스크린 검정에서 이들의 1가 대응물과 비교하여, 이들이 RANK-L의 이의 동족 수용체로의 결합을 차단할 수 있는지의 여부에 대해 평가하였다.
알파스크린을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표 C-5에 제시된 바와 같이, 모든 3가 나노바디는, 상응하는 1가 분자에 비하여 증가된 효능을 갖고 용량 의존적 방식으로 RANK-L의 RANK 수용체로의 결합을 차단하였다.
4.3 HEK293T 세포 막 상에서 발현된 RANK 로의 RANK -L의 결합에 대한 항-RANK-L 나노바디에 의한 저해
HEK293T 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 푸진6을 사용하여 전장 RANK를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 24 시간 후, 60 ㎕(7.5xlO3 세포)의 분취액을 FMAT 시스템 384-웰 플레이트[피이 바이오시스템스(PE Biosystems), 미국 캘리포니아주 소재]에 도말하고, 24시간 동안 접착시켰다. 하룻밤 접착시킨 후, 플레이트를 가볍게 두드려 배양 상청액을 제거하였다. 경쟁적 스크리닝을 개시하기 위해, 20 ㎕의 ALEXA647-표지된 인간 RANK-L(200 pM의 최종 농도)을 PBS + 10% BSA(FMAT 완충액)에 희석시키고, 상이한 1가 및 3가 나노바디의 20 ㎕의 희석 시리즈(200 nM∼0.075 pM)를 세포-함유 FMAT 시스템 384-웰 플레이트(피이 바이오시스템스, 캘리포니아 소재)에 첨가하였다. 10 시간의 항온처리 후, 플레이트를 스캐닝하였다. 생세포에 의한 믹스-앤-리드(mix-and-read) 검정을 가능하게 하는 형광 거시-공초점(macro-confocal) 생물학적 결합 작용 분석기인 8200 세포 검출 시스템(Cellular Detection System)[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재]에 의해 세포 표면 형광성을 측정하였다
표 C-6 및 도 2로부터 나노바디가 RANK-L의 그의 수용체로의 결합을 용량 의존적 방식으로 차단하고, 3가 포맷이 1가 분자에 비하여 증가된 효능을 나타냄을 알 수 있다.
4.4 HEK293T 세포에서의 RANK -L 유도된 NF - KB 활성화에 대한 항- RANK -L 나노 바디에 의한 저해
RANK-L 자극된 파골세포생성(osteoclastogenesis)은 NF-κB 활성화와 연관되어 있다. 필시, RANK-L은 가장 흔한 이량체, p50/p65를 활성화시킨다(Wei et al. 2001, Endocrinology 142(3): 1290-1295). 파골세포생성에서 NF-kB p50 및 p52의 중요한 역할은, RANK-L에 반응하여 RANK-발현 파골세포 전구체가 TRAP+ 파골세포로 분화하는데 NF-KB p50 및 p52가 필수적인 것으로 보고하는 문헌[Xing et al.,2002, J Bone Miner. Res. 17(7): 1200-1210]에 제시되어 있다. 더욱이, 보고에 따르면 p50 및 p52 2중 넉 아웃(knock out) 마우스는 성숙한 파골세포를 생성하지 못하므로 심각한 골화석증이 진행된다(Franzoso et al. 1998, Genes & Development 11: 3482-3496). 모두 함께, RANK-L 유도된 NF-κB 활성화는 성숙한 파골세포의 형성에 중요하다.
RANK-L 유도된 NF-κB 활성화에 미치는 나노바디의 효과를 평가하기 위해, HEK293T 세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 NF-κB 리포터(reporter) 유전자 플라스미드 및 β-갈락토시다아제를 코딩하는 플라스미드(이는 형질감염 유효성을 보 정하기 위해 사용됨)로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 96-웰 플레이트에 식종하였다. 또다른 24 시간 후, 세포를 처리되지 않은 채로 두거나 일정량의 인간 RANK-L(300 ng/㎖) 및 다양한 양의 지시된 항-RANK-L 나노바디(200 nM∼대략 10 pM)의 존재하에 항온처리하였다. 6 시간 후, 세포를 용해시켰다; 루시퍼라아제(Luc: luciferase) 및 β-갈락토시다아제 활성을 2중-광 키트(Dual-light kit)[트로픽스(Tropix)/어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재]에 의해 제조업체의 지시에 따라 검정하였다. Luc 값을 β-갈락토시다아제 값에 대해 정규화하여 형질감염 유효성에서의 차이에 대해 보정하였다. 표 C-7에서 알 수 있듯이, 모든 항-RANK-L 나노바디는 RANK-L 유도된 NF-κB 활성화를 용량-의존적 방식으로 저해한다. 계산된 IC50 값은 3가 나노바디가 상응하는 1가 분자에 비하여 더 유효함을 나타낸다.
실시예 5: 나노바디에 의한 파골세포 형성의 저해
인간 파골세포의 시험관내 분화에 미치는 3종의 나노바디 RANKL60, RANKL130 및 RANKL180의 영향을 조사하였다.
골 박편에서 파골세포를 배양하는 방법은 문헌[Boyde and co-workers, 1984; Br. Dent J. 156: 216-220] 및 [Chambers and Horton, 1984; J. Pathol. 144: 295-6]에 최초로 기재되었다. 최초로, 현미경하에 타르트레이트-내성 산 포스파타아제(TRACP: tartrate-resistant acid phosphatase)-양성 다핵 세포의 수를 계산함으로써 파골세포의 수를 결정하였다. 이후, 분비된 TRACP 5b 활성이 마우스 파골세포 배양물중 파골세포의 수를 반영함이 입증되었다(Alatalo et al., 2000; Clin. Chem. 46: 1751-4). 분비된 TRACP 5b 활성은 파골세포의 수와 상당히 관련된 반면, TRACP 5b는 이들이 성숙한 다핵 파골세포로 분화되기 이전에는 TRACP-양성 다핵 파골세포 전구체 세포에 의해 분비되지 않았다. 따라서, 분비된 TRACP 5b는 성숙한 다핵 파골세포의 수에 대한 신뢰성이 높은 마커이다.
인간 파골세포 분화 검정을 셋업하였고, 이때 인간 골수로부터 유도된 CD34+ 파골세포 전구체를, M-CSF 및 RANK-리간드를 비롯한 적절한 성장 인자의 존재하에 7일 동안 배양하여, 이들이 성숙한 골-재흡수 파골세포로 분화하도록 허용하였다(Rissanen et al., 2005; Circulation 112: 3937-46).
인간 골수-유도된 CD34+ 줄기 세포를 배지에 현탁하고, 96-웰 조직 배양 플레이트에서 소의 골 박편에 부착시켰다. 배지는 파골세포 분화에 우호적인 적정량의 중요한 성장 인자, 예컨대 M-CSF 및 RANK-리간드를 함유하였다. 세포를 CO2 항온처리기에서 95% 공기 및 5% 이산화탄소의 습윤된 대기하에 37℃에서 항온처리하였다. 7일째 파골세포 분화가 완료되면, 타르트레이트-내성 산 포스파타아제 이소형 5b 활성(TRACP 5b)을, 형성된 파골세포의 수의 지표로서, 본트랩(BoneTRAP)(등록상표) 검정[아이디에스 리미티드(IDS Ltd), 영국 볼던 소재] 및 빅토르2(VICTOR2)(등록상표) 멀티라벨 카운터(Multilabel Counter)(퍼킨 엘머, 미국 매사츠세츠주 왈탐 소재)에 의해 배지로부터 측정하였다.
각 나노바디의 7가지 상이한 농도를 본 연구에서 시험하였고, 범위는 0.05 nM∼250 nM였다. 나노바디가 없는 기선 그룹 및 참조 분자를 갖는 대조 그룹을 각 세포 배양액에 포함시켰다. 파골세포생성의 저해제인 오스테오프로테게린을 참조 분자로서 사용하여, 시험 시스템이 파골세포 분화의 저해를 검출할 수 있음을 입증하였다.
기선 TRACP 5b 값은 높았고, 참조 저해제 OPG는 파골세포 분화를 상당히 저해하였는데, 이는 검정이 성공적으로 수행되었고 신뢰성 높은 결과가 수득되었음을 지시한다(도 3). 모든 3종의 나노바디가 용량 의존적으로 인간 파골세포 분화를 저해하였다. 모든 화합물은 3.0 nM 이상의 농도에서 통계적으로 유의적인 저해를 나타내었다. 저해 프로필은 모든 3종의 나노바디에 대해 유사하였다.
실시예 6: 나노바디와의 상호작용에 관여된 RANK -L 상의 잔기에 대한 동정
6.1 인간/마우스 하이브리드의 작성
RANK-L 분자 상의 나노바디의 결합 부위를 동정하기 위해, 나노바디의 인간 RANK-L-특이적 결합을 활용하였다. 나노바디 RANKL3을 제외하고, 수득된 나노바디는 마우스 RANK-L과 상호작용하지 않았다. 인간 RANK-L 상의 종-특이적 상호작용에 관여된 잔기를 동정하기 위해, 다음과 같이 AA' 및 CD 루프에 인간/마우스 치환을 함유한 3종의 인간/마우스 하이브리드를 고안하였다:
AA' 루프:
인간/마우스 하이브리드 1: T174D175를 각각 A 및 S로 치환하였다.
CD 루프 :
인간/마우스 하이브리드 2: D231L232를 각각 S 및 V로 치환하였다.
인간/마우스 하이브리드 3: A233TE235를 각각 P 및 TD로 치환하였다.
표 C-8에 제시된 프라이머를 사용하여 중첩 PCR에 의해 인간/마우스 하이브리드를 생성하였다. 후속적으로 앰플리콘(amplicon)을 Xho1/Xba1 제한 단편으로서 발현 벡터, pCIneo[프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨 소재]에서 클로닝하였다.
6.2 나노바디의 RANK -L 인간/마우스 하이브리드로의 결합
hRANK-L 또는 인간/마우스 하이브리드를 코딩하는 발현 벡터로 HEK293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 나노바디(다양한 농도: 250 nM, 50 nM, 10 nM, 2 nM, 0.4 nM, 0.08 nM, 16 pM)의 세포 표면 발현된 RANK-L로의 결합을 상기 기재된 바와 같이 세포의 FACS 분석에 의해 검정하였다. 결합 결과의 개요가 표 C-9에 제시되어 있다.
인간/마우스 교차-반응성 RANKL3 나노바디의 결합은 상이한 하이브리드 분자의 발현 및 보정 접힘에 대한 대조표준으로 작용하였다. 표 C-9에서 알 수 있듯이, RANKL3은 3종의 상이한 하이브리드 분자에 결합한다.
인간-특이적 나노바디와의 결합 결과는 다음과 같이 요약될 수 있다:
-루프 AA'는 나노바디와의 종-특이적 상호작용에 관여되지 않는다.
-루프 CD는 나노바디와의 상호작용에 중요하다.
-나노바디는 이들의 CD 루프와의 상호작용에 있어서 관찰된 차이에 기초하여 상이한 부류로 세분될 수 있다.
o RANKL13, RANKL15: CD-루프의 N-말단 부분 및 C-말단 부분의 돌연변이는 상호작용을 폐기한다.
o RANKL9 및 RANKL18: CD-루프의 C-말단 부분의 돌연변이는 상호작용을 폐기한다. CD-루프의 N-말단 부분은 상호작용에 관여되지 않는다.
o RANKL6: CD-루프의 N-말단 부분의 돌연변이는 상호작용을 폐기한다. CD-루프의 C-말단 부분의 돌연변이는 상호작용에 관여되지 않는다.
실시예 7: 사이노몰구스 원숭이에서의 약물동력학 및 약력학
5마리의 수컷 및 5마리의 암컷 사이노몰구스 원숭이를 5개의 그룹으로 나누었고, 각각의 그룹은 1마리의 수컷 및 1마리의 암컷으로 구성되었다. 개개의 수컷의 월령은 39∼42 개월인 한편, 암컷의 월령은 33∼44 개월에 달하였다. 동물의 초기 체중은 개개의 수컷의 경우 2.5∼2.7 kg이고, 개개의 암컷의 경우 2.2∼2.6 kg으로 다양하였다.
나노바디 RANKL131(서열 번호 643)에 더하여 나노바디 RANKL130(서열 번호 715) 및 RANKL180(서열 번호 729)을 시험하였다. RANKL131은 2개의 연결기-상호연결된 RANKL13 빌딩 블럭으로만 구성된 2가 나노바디에 상응한다. RANKL131을 포함시켜 PK 및 PD 둘다에 대한 알부민-결합 포맷의 영향을 완전히 평가하였다. ALB-1(서열 번호 790)은 음성 대조표준으로서 포함되었고, 작은 분자 이반드로네이트[엘케이티 래보레이토리즈 인코포레이션(LKT Laboratories, Inc), 미네소타주 세인트 폴 소재]는 양성 대조표준으로서 작용하였다. 표 C-1O에 기재된 바와 같이 동물들에게 투여하였다.
나노바디 수준, 항체 분석, 및 골 교체 마커 혈청 N-텔로펩티드(혈청 N-Tx) 및 BAP(골-특이적 알칼리성 포스파타아제)의 분석을 위해 혈청 샘플을 취하였다. 또한 N-텔로펩티드(뇨 N-Tx) 및 크레아티닌의 분석을 위해 뇨를 수거하였다.
7.1 약물동력학
나노바디 RANKL130, RANKL180 및 RANKL131의 농도를 다음과 같이 혈장에서 결정하였다: 96-웰 마이크로타이터 플레이트(맥시소프, 눈크, 독일 비스바덴 소재)를 4℃에서 100 ㎕의 뉴트라비딘(2 μg/㎖, 피어스, 일리노이주 락포드 소재)으로 코팅하였다. 웰을 흡인시키고 30 분 동안 실온에서 300 ㎕의 수퍼블럭(SuperBlock)(등록상표)T20 PBS(피어스, 일리노이주 락포드 소재)로 차단하였다. PBS-0.05% 트윈(Tween)20에 의한 3회의 세척 단계 후, 비오티닐화된 RANKL(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 0.5 μg/㎖)은 100 ㎕를 600 rpm에서 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 항온처리함으로써 포획되었다. 이러한 항온처리 단계 후, 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. 시험 샘플의 표준 QC 및 예비희석액을 비-코팅된(폴리프로필렌) 플레이트에서 100% 사이노몰구스 원숭이 혈장중에 준비하고, 600 rpm에서 진탕시키면서 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 샘플 및 표준물의 1/10 희석액(사이노몰구스 원숭이 혈장의 최종 농도는 10%임)을 코팅된 플레이트로 옮기고, 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 플레이트를 정제된 인-하우스(in-house) 토끼 항-나노바디 다클론성 항체(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1 μg/㎖)와 함께 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP: horse radish peroxidase) 표지된 다클론성 염소 항-토끼[PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1/5000, 다코사이토메이션(DakoCytomation), 덴마크 글로스트럽 소재]를 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 시각화를 수행하고, 기질 완충액에 1/3로 희석된, 100 ㎕의 증강된 가용성 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(esTMB, SDT, 벨기에 브루셀 소재)으로 10분 동안 빛을 가렸다. 기질 완충액은 60% Na2HPO2(100 mM) 및 40% 구연산(100 mM)의 조성물이였다. 10분 후, 착색 반응을 100 ㎕의 1N HCl로 중지시켰다. 테칸(Tecan) ELISA 판독기에서 10 초간 진탕시킨 후 450 nm에서 흡광도를 결정하고, 620 nm에서 배경 흡광도에 대해 보정하였다. 각각의 샘플에서의 농도를 S자형 표준 곡선에 기초하여 결정하였다.
RANKL130 및 RANKL180 혈장 농도에 대한 프로필은 3상성(triphasic) 방식으로 감소하는 것으로 보였다. 투여 후 처음 2.5일 째에, 초기의 짧은 배열 상(겉보기 알파 상 t1/2
Figure 112009080144011-pct00033
0.5 일)이 존재하고, 이후 주된 보다 느린 제2 상(겉보기 베타 상) 및 짧은 최종 상(겉보기 감마 상)(말단 기울기에서의 변화를 특징으로 함)이 이어진다.
RANKL130 및 RANKL180이 주사된 모든 개체의 개별적 혈장 농도-시간 프로필에 대해, 예비-프로그램화된 모델 201에 의해 윈놀린 프로페셔널 소프트웨어 버전 5.1(WinNonlin Professional Software Version 5.1)[파르사이트 코포레이 션(Pharsight Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재] 내에서 비-구획 약물동력학적 분석(NCA: non-compartmental pharmacokinetic analysis)을 수행한다. RANKL131이 주사된 모든 동물의 개별 혈장 농도-시간 프로필을 예비-프로그램화된 모델 202로 분석하였다. 혈장 농도-곡선하의 면적(AUC: area under the plasma concentration-curve) 및 유도된 PK-매개변수를 선형-업/로그 다운(linear-up/log down) 사다리꼴 규칙에 의해 계산하였다. 계산된 약물동력학적 매개변수에 대한 개요는 표 C-11 및 표 C-12에 제시되어 있다.
나노바디에 대한 유의적인 항체 역가가 RANKL130, RANKL131 및 RANKL180 코호트(cohort)로부터 6마리 동물중 4마리에서 검출된다. 항체를 발전시킨 4마리의 동물이 3종의 상이한 코호트로부터 기원하므로(cyno1m, cyno3m, cyno4f, cyno6f), 이는 나노바디-의존성이 아니다.
7.2 약력학
유형 I 콜라겐의 가교결합된 N-텔로펩티드(NTx)의 발견은 인간 골 재흡수의 특이적 생화학적 마커를 제공하였다. NTx 분자의 생성은 골에서 파골세포에 의해 중재되고, 이는 뇨 및 혈청에서 분해의 안정한 최종-생산물로서 발견된다.
혈청 NTx 및 뇨 NTx를 제조업체의 지시에 따라 면역검정에 의해 검정함으로써 나노바디에 의해 유도된 골 재흡수에서의 변화를 평가하였다[오스테오마크(Osteomark)(등록상표)NTx 혈청, 오스테오마크(등록상표)NTx 뇨, 왐폴 래보레이토리즈(Wampole Laboratories)].
RANKL130 및 RANKL180은 혈청 NTx 수준에서의 신속한 감소를 야기시켰다(도 4). 이들 두 시험 그룹에서의 최대 저해는 적어도 40일까지 지속되었다. 혈청 NTx 수준은 cyno 1m 및 cyno 6f의 경우 출발하여 40일 정도에 기선으로 되돌아 왔다. cyno 2f 및 5m에서는, 기선으로의 회귀가 각각 45일 및 52일째 개시되었다. cyno 1m 및 cyno 6f에 대해 보여진 덜 우호적인 프로필은 이들 동물에서 관찰된 면역원성에 의해 설명될 수 있다.
cyno 3m 및 cyno 4f에서 RANKL131에 의해 유도된 혈청 NTx 프로필의 억제는, 이 수준이 8일에 기선으로 되돌아가므로, 일시적이었다.
1달에 1회 투여된 작은 분자 약물 이반드로네이트는 기선 수준에 비하여 대략 50%의 전체 저해를 유도하였다.
뇨 NTx 수준을 16일까지 RANKL130, RANKL131 및 RANKL180 코호트에 대해 측정하였다. 뇨 NTx는 혈청 NTx와 유사한 경향을 보여주었다.
메트라(Metra)(등록상표)BAP 면역검정을 사용하여 조골세포 활성의 정량적 측정 및 지시자로서 혈청에서 골-특이적 알칼리성 포스파타아제(BAP: bone-specific alkaline phosphatase) 활성을 검정함으로써 골 형성에서의 변화를 평가하였다.
실시예 8: 나노바디의 인간화
야생형 나노바디의 인간화 버전을 PCR 중첩 연장 방법에 의해 올리고뉴클레오티드로부터 조립하였다. 실시예 2, 3 및 4에 기재된 바와 같이 알파스크린 및 생화학적 세포 검정에서 결합 능력 및 무효화 활성에 대해 평가된 RANKL6, 9, 13, 15 및 18의 상이한 가능한 변형체의 서열이 표 B-5에 제시되어 있다.
RANKL13
항-RANKL 나노바디 RANKL13(서열 번호 572)의 아미노산 서열을 인-하우스 서열 시험/정렬(query/alignment) 도구에 의해 인간 생식계열 VH 서열 데이터베이스로 블라스팅하였다(blast)(도 6). 인간 생식계열 VH3-23(DP-47; 서열 번호 763-764)은 가장 관련된 서열을 제시하였다. 나노바디 RANKL13은 인간 생식계열 VH3-23의 최초 97개의 아미노산 잔기에 대해 80개의 동일한 아미노산 및 7개의 가외의 보존적 아미노산 치환을 나타낸다. 8개의 아미노산 잔기(적색으로 지시됨)를 인간화를 위해 치환하여 RANKL13hum5(서열 번호 755)를 제조하였다.
RANKL13의 인간화 과정에서, 5종의 RANKL13 버전(RANKL13basic, RANKL13hum1, RANKL13hum2, RANL13hum3 및 RANKL13hum4)을 작성하였다. RANKL13basic은 4개의 치환기를 함유한다: A14P, E44G, V78L 및 Q108L. 이들 변화에 더하여, 추가의 치환을 huml-4 버전: RANKL13hum1: R27F; RANKL13hum2: R30S; RANKL13hum3: A49S; RANKL13hum4: S91Y에 도입하였다. 모든 버전을 알파스크린 검정에서 시험하고 RANK-L로의 결합을 표면 플라스몬 공명에 의해 분석하였다.
모든 버전을 알파스크린 검정에서 시험하였다. 알파스크린에서 계산된 IC50 값으로부터, 유도된 돌연변이가 야생형 RANKL 13에 비하여 인간화된 RANKL 13의 효능에 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다(표 C-13).
나노바디 RANL13의 인간화된 버전의 결합 동력학을 또한 표면 플라스몬 공명(비아코어 3000)에 의해 분석하였다. 인간 가용성 RANK-L은 활성화를 위해 EDC/NHS를 사용하고 실활을 위해 HCl을 사용하여 아민 커플링을 경유하여 CM5 센서 칩에 공유 결합되었다. 나노바디 결합을 1가지 농도(100 nM)에서 평가하였다. 각각의 나노바디를 4분 동안 45 ㎕/분의 유속으로 주사하여 칩-결합된 항원으로 결합시켰다. 이어서, 나노바디가 없는 결합 완충액을 동일한 유속으로 칩 상으로 보내어 결합된 나노바디의 자발적 해리를 허용하였다. 상이한 나노바디에 대해 수득된 센서그램으로부터 koff-값(kd)을 계산하였고, 이는 표 C-13에 나타나 있다. 해리 속도 상수(kon 또는 ka), 및 또한 KD 값은, 단지 1가지 농도의 나노바디를 사용하여 결합모델을 정합(fitting)하였으므로, 단지 암시적이었다. 표 C-13에서 알 수 있듯이, 모든 인간화된 나노바디는 야생형 나노바디 RANKL13과 비교하여 필적할만한 해리 속도 상수/오프(off) 속도를 나타내었다.
모두 함께, 알파스크린 데이터 및 비아코어 분석에 따르면 개개의 인간화된 버전에서 도입된 돌연변이의 결합 또는 효능에 대해 상당한 효과를 나타내지 않았다. 최종 인간화된 버전, RANKL13hum5에서, 모든 인간화 돌연변이를 조합하였다. 표 C-13에서 알 수 있듯이, RANKL13hum5는 야생형 RANKL13과 유사한 효능 및 결합 친화도를 나타낸다.
RANKL18
RANKL18의 인간화 과정에서, 6종의 RANKL18 버전(RANKL18basic RANKL18hum1, RANKL18hum2, RANKL18hum3, RANKL18hum4 및 RANKL18hum5)을 작성하였다. RANKL18basic은 4개의 치환기를 함유한다: A14P, E44G, V78L 및 Q108L. 이들 변화 에 더하여, 추가의 치환을 hum1-5 버전에 도입하였다: RANKL18hum1: R27F; RANKL18hum2: G49S; RANKL18hum3: G60A; RANKL18hum4: P77T 및 V78L; RANKL18hum5: G94A. 모든 버전을 알파스크린 및 비아코어에서 시험하였다(표 C-13).
알파스크린에서 계산된 IC50 값으로부터 RANKL18basic, RANKL18hum3 및 RANKL18hum5에 도입된 돌연변이가 야생형 RANKL18에 비하여 이들 버전의 효능에 영향을 미치지 않았음을 알 수 있다(표 C-13). RANKL18hum1 및 RANKL18hum2에서의 인간화 돌연변이는 효능에 적당히 영향을 주는 반면, RANKL18hum4에서의 2중 돌연변이는 나노바디의 효능을 완전히 폐기하였다. 이러한 결과에 기초하여, 2종의 추가의 돌연변이체, RANKL 18hum6 및 RANKL 18hum7를 작성하고 분석하였다. RANKL18hum6은 RANKL18basic, RANKL18hum3 및 RANKL18hum5에서의 인간화 돌연변이를 조합한다. RANKL18hum7은 RANKL18hum6의 모든 돌연변이를 V78L 치환과 함께 포함한다. 표 C-13은 RANKL18hum6이 야생형 RANKL18과 유사한 효능 및 결합 친화도를 나타냄을 보여준다. RANKL18hum7은 약간 덜 효과적이고, RANK-L로의 결합 친화도를 약하게 감소시켰다.
실시예 9: RANKL13hum5D62E 돌연변이체의 분석
RANKL13hum5의 1차 서열에 대한 분석은 이성화를 위한 잠재적 부위로서, 및 이에 따라 분자의 화학적 불안정성에 대한 잠재적 근원으로서의 D62를 확인하였다. 이러한 가능성을 시험하기 위해, RANKL13hum5 분자, 및 잠재적 이성화 부위가 글루탐산 잔기(E)로 대체된 돌연변이체, RANKL13hum5_D62E(서열 번호 756)로 안정성 검정을 수행하였다.
RANKL13hum5에서의 D62E 돌연변이는 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하는 중첩 PCR에 의해 도입되었다: RevRANKL13hum5D62(CCTCCCTTTGACGGATTCCGCGTAATACGT; 서열 번호 797) 및 FwRANKL13hum5D62E(ACGTATTACGCGGATTCCGTCAAAGGGAGG; 서열 번호 798). RANKL13hum5 또는 RANKL13hum5_D62E를 코딩하는 cDNA 둘다를 SfiI/BstEII 단편으로서 pUC119로부터 유도된 발현 벡터(이는 LacZ 프로모터, 앰피실린 또는 카베니실린(carbenicillin)에 대한 내성 유전자, 다중클로닝 부위 및 gen3 리더 서열을 포함함)에서 클로닝하였다. 나노바디 코딩 서열을 갖는 프레임(frame)에서, 벡터는 나노바디의 3' 말단에서 2개의 종결 코돈(codon)을 코딩하였다.
생산을 위해, RANKL13hum5 및 RANKL13hum5_D62E 구조물을 50 ㎖의 TB/0.1% 글루코스/카나마이신에 접종하고, 현탁액을 하룻밤 37℃에서 항온처리하였다. 5 x 400 ㎖의 배지에 1/100의 수득된 하룻밤의 예비 배양액을 접종하였다. 배양액을 추가로 37℃ 및 250 rpm에서 OD600>5가 될 때까기 접종하였다. 배양액을 1 mM IPTG로 유도하고, 추가로 4 시간 동안 37℃ 및 250 rpm에서 항온처리를 지속하였다. 배양액을 20분 동안 4500 rpm에서 원심분리하고, 이후 상청액을 버렸다. 펠릿을 -20℃에서 저장하였다.
정제하기 위해, 펠릿을 해동시키고 20 ㎖의 d-PBS에 재현탁시키고, 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 그런 다음, 현탁액을 8500 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 원형질막공간 추출물로부터 세포 찌꺼기를 제거하였다. 나노바디를 양이온 교환[소스(Source) 30S 칼럼, 세척완충액: 10 mM 시트르산 pH 4.0; 용출 완충액 10 mM 시트르산/1M NaCl pH 4.0]을 통해 정제한 다음, 크기 배재 크로마토그래피[수퍼덱스(Superdex) 75 힐로드(Hiload) 16/60 칼럼; d-PBS에서]하였다. OD 280 nm를 측정하고, 농도를 계산하였다. 샘플을 -20℃에서 저장하였다.
RANKL13hum5 및 RANKL 13hum5_D62E를 이들의 결합 능력 및 무효화 활성에 대해 실시예 2에 기재된 바와 같이 알파스크린에서 분석하였다. RANKL13hum5에서 RANK13 및 D62E 돌연변이의 인간화는 나노바디의 효능을 간섭하지 않았다. RANKL13, RANKL13hum5 및 RANKL13hum5_D62E는 알파스크린 검정에서 측정된 경우 유사한 효능을 나타내었다(도 7).
실시예 10: 최적 효능을 위하여 2가 분자에서의 연결기 길이의 크기에 대한 결정
RANKL13
상이한 연결기 길이를 갖는 일련의 2가 분자를 작성하였다. RANKL131(RANKL13-9GS-RANKL13; 서열 번호 643) 및 RANKL133(RANKL13-30GS-RANKL13; 서열 번호 766)은 개별적으로 9GS 또는 3OGS 연결기를 함유한다. 분자 둘다를 알파스크린 검정 및 FMAT 검정에서 시험하고, 1가 RANKL13 및 3가 이특이적 RANKL130과 비교하였다. 계산된 IC50 값은 표 C-14에 제시되어 있다. 두 검정에 따르면, 9GS 연결기가 RANKL130에 대해 결정된 것과 유사한 효능을 수득하기에 충분하다.
RANKL18
상이한 연결기 길이를 갖는 일련의 2가 분자를 작성하였다:
RANKL181biv:RANKL18-9GS-RANKL18(서열 번호 657)
RANKL182biv:RANKL18-20GS-RANKL18(서열 번호 693)
RANKL183biv:RANKL18-3OGS-RANKL18(서열 번호 767)
RANKL18hum6Bi_25:RANKL18Hum6-25GS-RANKL18Hum6(서열 번호 768)
RANKL18hum6Bi_30:RANKL18Hum6-30GS-RANKL18Hum6(서열 번호 769)
모든 분자를 알파스크린 검정 및 FMAT 검정에서 시험하고, 1가 RANKL18 및 3가 RANKL180과 비교하였다. 계산된 IC50 값은 표 C-14에 제시되어 있다. 두 검정에 따르면, 30GS 연결기가 RANKL180에 대해 결정된 것과 유사한 효능을 수득하기 위해 필요하다.
RANKL9
상이한 연결기 길이를 갖는 일련의 2가 분자를 작성하였다:
RANKL91biv:RANKL9-9GS-RANKL9(서열 번호 636)
RANKL92biv:RANKL9-20GS-RANKL9(서열 번호 672)
RANKL93biv:RANKL9-30GS-RANKL9(서열 번호 770)
RANKL94biv:RANKL9-15GS-RANKL9(서열 번호 771)
모든 분자를 알파스크린 검정 및 FMAT 검정에서 시험하고, 1가 RANKL9 및 3가 RANKL90(서열 번호 708)과 비교하였다(표 C-14). 두 검정에 따르면, 15GS 연결기가 RANKL90에 필적할 만한 효능에서의 전이를 유도하기에 충분하다.
실시예 11: 상이한 포맷의 인간화된 나노바디의 작성 및 생산
2가 및 3가 이특이적 항-RANKL 나노바디를 RANKL13hum5 및 RANKL18hum6으로 부터 작성하였다. 상응하는 나노바디 ID를 갖고 상이하게 포매팅된 인간화된 나노바디에 대한 개요는 표 C-15에 나타나 있다.
11.1 3가 이특이적 나노바디
3가 이특이적 분자(RANKL008a 및 RANKLOlOa)는, 인간화된 항-RANKL 나노바디에 상응하는 2개의 빌딩 블럭, 및 이들 중간에 항-인간 혈청 알부민 빌딩 블럭(ALB-12; 서열 번호 791)에 상응하는 제3의 인간화된 나노바디 빌딩 블럭을 갖는다. 개개의 빌딩 블럭을 Gly/Ser(GGGGSGGGS; 서열 번호 792) 연결기로 융합시킨다.
RANKL008a를 이. 콜라이에서 발현시키고 배지 및 원형질막공간 추출물로부터 정제하였다. 나노바디를 맵셀렉트 엑스트라(MabSelect Xtra)[지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재] 상에서 포획하였다. 완충액-B(10O mM 글리신 pH 2.5)으로 용출하였다. 분별물을 1.5 M 트리스(pH 7.5)로 중화하고 1/10 PBS에 대해 투석하였다. 후속적으로 샘플을 소스 15S 칼럼(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에 의해 양이온 교환하였다.
RANKLOlOa를 pPICZ알파A(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드 소재)내로 클로닝하고, 피키아 파스토리스에서 형질변환시켰다. 콜로니를 250 ㎖의 BCGM 배지에 희석시키고, 3O℃에서 성장시켰다. 20-25의 OD600에서, 배양액을 원심분리하고, 펠릿을 80 ㎖의 BMCM 배지에 재현탁시켰다. 100% 메탄올의 첨가로 발현을 유도하였다. 나노바디를 맵셀렉트 엑스트라(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재) 상에서 포획함으로써 배지로부터 포획하였다. 10O mM 글리신 pH 2.5 완충액중의 용출 분별물을 1.5M 트리스 pH 7.5로 중화시키고 1/10 PBS에 대해 투석하였다. 샘플을 양이온 교환(소스 30S 칼럼)에 의해 추가로 정제하였다. 최종적으로, 크기분별(sizing) 단계를 수퍼덱스 75 26/60 칼럼에서 수행하였다.
11.2 페그화된 나노바디
2가 RANKL13hum5 및 RANKL18hum6을 작성하였다. 구조물을 이. 콜라이에서 발현시켰다. 정제 및 페그화를 다음과 같이 실행하였다:
2가 나노바디를 단백질 A 친화도 크로마토그래피(맵셀렉트 엑스트라(등록상표))를 통해 정제하였다. 100 mM 글리신 pH 2.5에 의해 용출한 후, 수집된 샘플을 1.5 M 트리스 pH 7.5로 즉시 중화시켰다. 양이온 교환 단계(소스 15S 칼럼) 후, 나노바디(등록상표)를 함유한 분별물을 비브아스핀(Vivaspin)(5 kD)을 통해 농축하고, DTT를 10 mM의 최종 농도로 첨가하고 하룻밤 항온처리하였다. SEC에 의해 유리 DTT를 제거한 후, PEG[3-말레이미도프로프리온아미드, 1,3-비스(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 개질된 2-글리세롤), 평균 MW 40,000; 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics), 캘리포니아주 산 카를로스 소재]를 5 몰 과량으로 첨가하고, 하룻밤 항온처리하였다. 페그화된 나노바디를 페그화되지 않은 나노바디/유리 PEG로부터 매크로캅 에스피(MacroCap SP) 양이온 교환(완충액: 25 mM Na-아세테이트 pH5 + 0.5% 플루로닉(pluronic))을 통해 분리하였다. 결합된 단백질을 완충액(1 x PBS + 0.5% 플루로닉)으로 선형 구배로 용출하였다.
11.3 HSA 융합
HSA 융합 단백질, RANKL004h 및 RANKLOO6h는, 개별적으로, C-말단이 HSA에 융합되어 있는 2가 RANKL13hum5-9GS-RANKL13hum5 및 RANKL18hum6-30GS-RANKL18hum6 에 상응한다.
RANKL004h의 생성을 위해, 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 RANKL13hum5를 증폭시켰다:
Figure 112009080144011-pct00034
후속적인 앰플리콘(amplicon)을 적절한 제한 효소로 분해하고(N-말단 단편: BbsI/XhoI, 및 C-말단 단편: BbsI/AvrII), XhoI/AvrII 개방된 pPICZ알파A-HSA 벡터내로 클로닝하였다. 이러한 벡터는 전장 인간 혈청 알부민에 대한 코딩 서열을 함유한다.
RANKLOO6h의 생성을 위해, 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 RANKL18hum6을 증폭시켰다:
Figure 112009080144011-pct00035
앰플리콘을 적절한 제한 효소로 분해하고(N-말단 단편: BamHI/XhoI, 및 C-말단 단편: BamHI/AvrII), XhoI/AvrII 개방된 pPICZ알파A-HSA 벡터내로 클로닝하였다. 이러한 벡터는 전장 인간 혈청 알부민을 함유한다.
플라스미드를 피키아 파스토리스로 형질변환시켰다. 콜로니를 250 ㎖의 BCGM 배지에 희석시키고 20℃에서 성장시켰다. 100% 메탄올의 첨가로 발현을 유도하였다. 나노바디를 맵셀렉트 엑스트라(지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재) 상에서 포획하는 단계, 및 포로스(Poros)50HQ 및 수퍼덱스200 XK26/60에 의한 추가의 폴리싱(polishing) 단계에 의해 배지로부터 정제하였다.
실시예 12: 알파스크린 및 FMAT 검정에서 포매팅된 인간화된 나노바디의 특징화
12.1 알파스크린 및 FMAT 검정에서 RANKL13hum5 에 기초한 포맷의 효능
3가 이특이적 나노바디 RANKL008a, 페그화된 나노바디 RANKLOO1p 및 HSA 융합 단백질 RANKL004h를 알파스크린 검정 및 FMAT 검정에서 시험하고, 1가 RANKL13hum5 및 야생형 3가 이특이적 RANKL130과 비교하였다. 계산된 IC50 값은 표 C-16에 제시되어 있다. 검정 둘다에서 RANKL008a, RANKLOO1p 및 RANKL004h는 RANKL130과 필적할 만한 유사한 효능을 나타내었다.
12.2 알파스크린 및 FMAT 검정에서 RANKL18hum6 에 기초한 포맷의 효능
3가 이특이적 나노바디 RANKLOlOa 및 페그화된 나노바디 RANKL003p를 알파스크린 검정 및 FMAT 검정에서 시험하고, 1가 RANKL18hum6 및 야생형 3가 이특이적 RANKL180과 비교하였다. 계산된 IC50 값은 표 C-16에 제시되어 있다. 검정 둘다에 서 RANKLOlOa 및 RANKL003p는 RANKL180와 필적할 만한 유사한 효능을 나타내었다.
12.3 항-인간 혈청 알부민 나노바디 빌딩 블럭을 갖는 RANKL13 의 결합 동력학에 대한 알부민의 영향
야생형 RANKL130NT(RANKL13-ALB-1-RANKL13) 및 인간화된 RANKL008a(RANKL13hum5-ALB-12-RANKL13hum5)로 실험을 수행하였다. 이 실험에서, 10O nM 용액을 고정화된 RANK-L이 있는 칩 상으로 통과시켰다. 도 8에서 알 수 있듯이, 알부민의 부재하의 센서그램은 두 분자(야생형 및 인간화된 분자)에 필적할만하고, 이는 두 분자가 고정화된 RANKL과 유사한 방식으로 상호작용함을 제안한다. 후속적으로 혼합물을 제조하고(50O nM HSA와 10O nM의 나노바디), 칩 상으로 통과시켰다. 신호가 착체의 경우 유의적으로 더 높았기 때문에, 항-인간 혈청 알부민 나노바디 빌딩 블럭을 갖는 야생형 및 인간화된 변형체 둘다는 RANK-L 및 알부민에 동시에 결합할 수 있는 것으로 결론지었다.
12.4 RANKL13hum5 및 RANKL18hum6 의 에피토프 매핑( mapping )
과거에, RANKL13hum5 및 RANKL18hum6이 중첩 에피토프에 결합한다는 사실을 지지하는 실험 데이터를 만들었다. 이 관찰은 비아코어 실험에서 확인되었다. 이들 에피토프 매핑 실험에서, RANKL 센서 칩을 우선 제1 나노바디로 포화시켰다(50O nM의 농도). 120 초 후, 해리가 일어났거나, 동일한 농도의 제1 나노바디 및 시험될 500 nM의 나노바디를 함께 함유하는 혼합물을 120초 동안 주사하였다. 도 9에 RANKL18hum6에 대한 센서그램이, 도 10에 RANKL13hum5에 대한 센서그램이 제시되어 있다. 표면을 우선 RANKL13hum5 또는 RANKL18hum로 포화시킨 후 혼합물의 주사시에 신호에서 단지 약간의 증가가 관찰되었고, 이는 RANKL13hum5 및 RANKL18hum6이 중첩 에피토프에 결합함을 나타낸다.
12.5 RAW264 .7 세포의 RANK -L 유도된 분화에 대한 포매팅된 인간화된 나노바디에 의한 저해
RAW264.7 세포(ATCC)를 10% FBS가 함유된 DMEM에 유지시켰다. 세포를 10% FBS, 0.1% 소듐 피루베이트, 1% 비필수 아미노산이 함유된 페놀 레드 부재하의 알파MEM에 재현탁시키고, 96-웰 플레이트에 2000 세포/웰로 식종하였다. 포매팅된 인간화된 나노바디의 희석 시리즈를 웰에 첨가하였다. 7.5 ng/㎖의 RANKL[페프로텍(Peprotech), 뉴저지주 록키 힐 소재]에 의해 파골세포-유사 세포로의 분화를 유도하였다. 4일 후 기질로서의 파라니트로페닐포스페이트를 사용하여 총 타르트레이트-내성 포스파타아제 활성을 상청액에서 측정하였다(도 11).
12.6 RANK -L과 RANK 의 상호작용에 대한 포매팅된 인간화된 나노바디에 의한 저해
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 하룻밤 4℃에서 항-Fc 나노바디 PMP02로 코팅하고, 수퍼블럭(Superblock) T20(PBS) 차단 완충액으로 차단하였다. 상이한 농도의 포매팅된 인간화된 나노바디를 200 ng/㎖의 RANK-Fc 및 5 ng/㎖의 RANK-L로 예비항온처리하고, 이후 혼합물을 코팅된 웰로 옮겼다. 결합된 RANK-L을 1 시간 동안 실온(RT)에서 10% 수퍼블럭 T20(PBS) 차단 완충액이 함유된 PBS중의 인간 TRANCE/RANKL/TNFSF11 비오티닐화된 친화도 정제된 다클론성 항체(알&디 시스템스, 미네소타주 미네아폴리스 소재)의 1/100 희석액으로 검출하고, 이후 양고추냉이 퍼 옥시다아제 표지된 스트렙타비딘(10% 수퍼블럭 T20(PBS) 차단 완충액이 함유된 PBS에서 1/5000)과 함께 30 분 동안 항온처리하였다. 시각화를 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 과산화수소로 수행하고, 이후 착색 반응을 1N HCl로 중지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 결정하였다. RANK-L과 RANK의 상호작용에 대한 인간화된 나노바디에 의한 저해는 도 12에 제시되어 있다.
12.7 인간 혈청 알부민으로의 RANKL008a 의 결합
96-웰 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인간 혈청 알부민(HSA, PBS중 20 μg/㎖)으로 코팅하였다. 웰을 흡인시키고, 수퍼블럭 T20(PBS) 차단 완충액으로 차단하였다. 웰을 1 시간 동안 실온에서 RANKL008a의 희석 시리즈와 함께 항온처리하였다. 후속적으로, 결합된 RANKL008a를 양고추냉이 퍼옥시다아제에 커플링된 2가 나노바디로 검출하였다. 시각화를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다(도 13).
12.8 HSA 및 RANK -L로의 RANKL008a 의 이작용성 결합
2종의 상이한 ELISA 포맷을 적용하여 HSA 및 RANK-L로의 RANKL008a의 동시적 결합을 측정하였다.
제1 포맷에서, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 하룻밤 4℃에서 뉴트라비딘(2 μg/㎖, PBS)으로 코팅하고, 수퍼블럭 T20(PBS) 차단 완충액으로 차단하였다. 웰을 비오티닐화된 RANK-L(PBS중 0.5 μg/㎖)과 함께 항온처리하고, 이후 RANKL008a의 희석 시리즈를 적용하였다. 결합된 RANKL008a를 양고추냉이 퍼옥시다아제 표지된 알부민[진텍스(Genetex), 텍사스주 산 안토니오 소재; 1/6000]으로 검 출하였다.
제2 포맷에서, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 하룻밤 4℃에서 HSA(10 μg/㎖, PBS)로 코팅하고, 수퍼블럭 T20(PBS) 차단 완충액으로 차단하였다. 후속적으로, RANKL008a의 희석 시리즈를 적용하였다. 실온에서 1 시간 항온처리한 후, 결합된 RANKL008a를 비오티닐화된 RANK-L(5 ng/㎖)에 의해 검출하고, 이어서 양고추냉이 퍼옥시다아제 표지된 스트렙타비딘(1/2000)과 항온처리하였다. 시각화를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다(도 14-B).
실시예 13: Balb /c 마우스에서 단일 정맥내 또는 피하 투여후 포매팅된 인간화된 나노바디의 약물동력학
일시주사(bolus) 용량의 100 μg의 나노바디 각각을 수컷 Balb/c 마우스(8∼12 주령)(n = 3)에 꼬리에 정맥내로 또는 피하로 투여하였다. 일련의 시점에서, 혈액 샘플을 수집하였다.
상이한 나노바디의 검출을 다음과 같이 수행하였다:
맥시소브 마이크로타이터 플레이트(눈크, 독일 비스바덴 소재)를 1 시간 동안 실온(RT에서) PBS 완충액중의 5 μg/㎖의 뉴트라비딘(피어스, 일리노이주 락포드 소재) 용액 100 ㎕로 코팅하였다. 코팅 후, 플레이트를 4 초 동안 흡인시키고, 30 분 동안 실온에서 수퍼블럭 T20[써모 사이언티픽 피어스 프로테인 리써치 프로덕츠(Thermo Scientific Pierce Protein Research Products), 일리노이주 락포드 소재]으로 차단하였다(300 ㎕/웰). 플레이트를 0.05% 트윈20이 함유된 PBS로 3회 세척하였다. 차단 후, 비오티닐화된 인간 RANKL(0.25 μg/㎖, lOO㎕/웰)을 1 시간 동안 실온에서(600 rpm) 포획하였다. 나노바디 표준물의 희석 시리즈(PBS/0.1% 카제인에서 제조됨)를 100% 풀링된(pooled) 블랭크(blank) 마우스 혈청[하란(Harlan), 영국 옥슨 소재]내로 넣은 다음, 0.1% 카제인이 함유된 PBS로 추가로 1/10로 희석하여(별도의 코팅되지 않은 플레이트 눈크에서), 10% 풀링된 마우스 혈청으로 구성된 최종 샘플 매트릭스를 생성하였다. 혈청 샘플을 동일한 방식으로 처리하였다. 모든 예비-희석액을 30 분 동안 실온에서(600 rpm) 코팅되지 않은 플레이트에서 항온처리하였다. 포획 단계 후, 코팅된 플레이트를 3회 세척하고(0.05% 트윈20 함유 PBS), 각 샘플 희석액의 분취량(100 ㎕)을 코팅된 플레이트로 옮기고 1시간 동안 실온에서(600 rpm) 결합되도록 하였다. 샘플을 항온처리한 후, 플레이트를 3회 세척하고(0.05% 트윈20 함유 PBS), 1시간 동안 실온에서 100 ㎕의 인-하우스 다클론성 토끼 항-나노바디 항체(1 μg/㎖, PBS/0.1% 카제인에서)와 함께 항온처리하였다. 이어서 플레이트를 3회 세척하고(0.05% 트윈20 함유 PBS), 염소 항-토끼 HRP(다코사이토메이션, 덴마크 글로스트럽 소재)의 100 ㎕의 1/2000 희석액(0.1% 카제인 함유 PBS중)과 함께 항온처리하였다. 30 분 동안 실온에서(600 rpm) 항온처리한 후, 플레이트를 3회 세척하고(0.05% 트윈20 함유 PBS), 10분 동안 암실에서 100 ㎕의 es(HS)TMB(HRP 완충액중 1/3 희석액; SDT, 벨기에 브루셀스 소재)와 함께 항온처리하였다. 10 분 후, 반응을 100 ㎕의 HCl(1N)로 중지시켰다. 5분 후, 각각의 웰의 흡광도를 450 nm에서 측정하고[테칸 선라이즈(Tecan Sunrise) 분광광도계; 스위스 매인도르프 소재], 620 nm에서 배경 흡광도에 대해 보정하였다. 가변성 기울기를 갖는 S자형 표준 곡선에 기초하여 각 혈청 샘플에서의 농도를 결정하였다.
정맥내 투여 후, 각각의 마우스의 혈청 농도-시간 프로필에 대해 윈놀린 프로페셔널 소프트웨어 버전(WinNonlin Professional Software Version) 5.1[파르사이트 코포레이션(Pharsight Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재] 내에서 예비-프로그램화된 모델 번호 7에 의해 2-구획 약물동력학적 분석을 수행하였다. 개별 나노바디에 대해 계산된 매개변수는 표 C-17에 제시되어 있다.
피하 투여 후, 각각의 마우스의 혈청 농도-시간 프로필에 대해 윈놀린 프로페셔널 소프트웨어 버전 5.1(파르사이트 코포레이션, 미국 캘리포니아 주 마운틴 뷰 소재) 내에서 예비-프로그램화된 모델 번호 3(지체 시간이 없음) 또는 4(지체 시간이 있음)에 의해 1-구획 동력학적 분석을 수행하였다. 개별 나노바디에 대해 계산된 매개변수는 표 C-18에 제시된 바와 같다.
실시예 14: 사이노몰구스 원숭이에서 포매팅된 인간화된 나노바디의 약물동력 학 및 약력학
암컷 사이노몰구스 원숭이를 17개의 그룹으로 할당하였고, 각각의 그룹은 대략 24월령의 3마리의 개체로 구성되었다.
동물에게 표 C-19에 기재된 바와 같이 투여하였다. 나노바디 RANKL008a, RANKLOO1p 및 RANKL003p를 상이한 용량으로 투여하였다(3 mg/kg; 0.3 mg/kg; 0.03 mg/kg). 나노바디 ALB-8은 음성 대조표준으로서 작용하였다. 작은 분자의 이반드로네이트를 양성 대조표준으로서 포함하였다. 나노바디 수준의 결정, 항체 분석, 및 골 교체 마커 혈청 N-텔로펩티드(혈청 N-Tx)의 분석을 위해 혈청 샘플을 취하였다.
14.1 약물동력학
RANKL008a의 농도를 혈장에서 다음과 같이 결정하였다:
96-웰 마이크로타이터 플레이트(맥시소프, 눈크, 독일 비스바덴 소재)를 하룻밤 4℃에서 100 ㎕의 뉴트라비딘(2 μg/㎖, 피어스, 일리노이주 락포드 소재)으로 코팅하였다. 웰을 흡인시키고, 30 분 동안 실온에서 300 ㎕의 수퍼블럭(등록상표)T20 PBS(피어스, 일리노이주 락포드 소재)에 의해 차단하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 비오티닐화된 RANKL(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 0.5 μg/㎖, 인-하우스)을, 600 rpm에서 진탕시키면서 100 ㎕를 1 시간 동안 실온에서 항온처리함으로써 포획하였다. 이러한 항온처리 단계 후, 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. 시험 샘플의 표준 QC 및 예비희석액을 비-코팅된(폴리프로필렌) 플레이트에서 100% 사이노몰구스 원숭이 혈장중에 준비하고, 600 rpm에서 진탕시키면서 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1/10 희석액(사이노몰구스 원숭이 혈장의 최종 농도는 10%임)을 코팅된 플레이트로 옮기고, 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 플레이트를 정제된 인-하우스 토끼 항-나노바디 다클론성 항체(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1 μg/㎖, 인-하우스, 배치 번호 15/05/06)와 함께 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 표지된 다클론성 염소 항-토끼(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1/5000, 다코사이토메이션, 덴마크 글로스트럽 소재; 제품 번호. P0448) 를 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 시각화를 수행하고, 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(esTMB, SDT, 벨기에 브루셀 소재)으로 10분 동안 빛을 가렸다. 이 기질은 기질 완충액에 1/3로 희석되었다. 기질 완충액은 60% Na2HPO2(100 mM) 및 40% 구연산(100 mM)의 조성물이였다. 10분 후, 착색 반응을 100 ㎕의 1N HCl로 중지시켰다. 테칸 ELISA 판독기에서 10 초간 진탕시킨 후 450 nm에서 흡광도를 결정하고, 620 nm에서 배경 흡광도에 대해 보정하였다. 각각의 샘플에서의 농도를 S자형 표준 곡선에 기초하여 결정하였다.
RANKLOO1p 및 RANKL003p를 다음과 같이 결정하였다:
96-웰 마이크로타이터 플레이트(맥시소프, 눈크, 독일 비스바덴 소재; 제품 번호. 430341)를 하룻밤 4℃에서 100 ㎕의 뉴트라비딘(2 μg/㎖, 피어스, 일리노이주 락포드 소재)으로 코팅하였다. 웰을 흡인시키고, 30 분 동안 실온에서 300 ㎕의 수퍼블럭(등록상표)T20 PBS(피어스, 일리노이주 락포드 소재)에 의해 차단하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척한 후, 비오티닐화된 RANKL(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 0.5 μg/㎖, 인-하우스)을, 600 rpm에서 진탕시키면서 100 ㎕를 1 시간 동안 실온에서 항온처리함으로써 포획하였다. 이러한 항온처리 단계 후, 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. 시험 샘플의 표준 QC 및 예비희석액을 비-코팅된(폴리프로필렌) 플레이트에서 100% 사이노몰구스 원숭이 혈장중에 준비하고, 600 rpm에서 진탕시키면서 30 분 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20 + 10% 사이노몰구스 원숭이 혈장중 샘플의 1/10 희석액(사이노몰구스 원숭이 혈장의 최종 농도는 10%임)을 코팅된 플레이트로 옮기고, 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 플레이트를 정제된 인-하우스 토끼 항-나노바디 다클론성 항체(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1 μg/㎖, 인-하우스)와 함께 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-0.05% 트윈20으로 3회 세척 단계를 거친 후, 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 표지된 다클론성 염소 항-토끼(PBS-0.1% 카제인-0.05% 트윈20중 1/2000, 다코사이토메이션, 덴마크 글로스트럽 소재)를 600 rpm에서 진탕시키면서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 시각화를 수행하고, 100 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(희석되지 않은 esTMB, SDT, 벨기에 브루셀 소재)으로 10분 동안 빛을 가렸다. 10분 후, 착색 반응을 100 ㎕의 1N HCl로 중지시켰다. 테칸 ELISA 판독기에서 10 초간 진탕시킨 후 450 nm에서 흡광도를 결정하고, 620 nm에서 배경 흡광도에 대해 보정하였다. 각각의 샘플에서의 농도를 S자형 표준 곡선에 기초하여 결정하였다.
모든 원숭이의 개별 혈장 농도-시간 프로필에 대해 윈놀린 프로페셔널 소프트웨어 버전 5.1(파르사이트 코포레이션, 미국 캘리포니아 주 마운틴 뷰 소재)에 의해 비-구획 약물동력학 분석(NCA: non-compartmental pharmacokinetic analysis)을 수행하였다. 예비-프로그램화된 모델 200 또는 201을 각각 피하 및 정맥내 투여 후에 사용하였다. AUC 및 유도된 PK-매개변수를 선형-업/로그 다운 사다리꼴 규칙에 의해 계산하였다. 계산된 약물동력학적 매개변수에 대한 개요는 표 C-20∼표 C-23에 제시되어 있다.
14.2 약물동력학
혈청 NTx를 면역검정에 의해 제조업체의 지시에 따라 검정함으로써 나노바디에 의해 유도된 골 재흡수의 변화를 평가하였다[오스테오마크(Osteomark)(등록상표)NTx 혈청, 왐폴 래보레이토리즈].
도 15 및 16은 상이한 양으로 정맥내 또는 피하로 투여된 상이한 나노바디에 대한 혈청 NTx 농도-시간 플롯을 나타낸다.
농도-시간 데이터를 합리적으로 특징짓기 위해 최소한으로 필요한 약물동력학적 함수에 각각의 나노바디의 모든 혈장 농도-시간 프로필을 동시에 정합하였다. 유의적인 면역원성이 방지된 원숭이의 혈장 농도-시간 프로필만이 분석에 포함되었다. 중심 구획으로부터의 선형 및 비선형 클리어런스(clearance)를 갖는 2-구획 약물동력학적 모델이 용량 및 시간 의존적 약물동력학을 특징으로 하는 것으로 발견되었다. 교대로, 이들 나노바디-특이적 약물동력학적 함수를 약물동력학적 모델에 대한 입력 함수로서 사용하여, 혈청 NTx 교대에 대한 생체내 효능(IC50) 및 고유 활성(Imax)을 평가하였다.
혈청 NTx 교대에 대한 각각의 나노바디의 고유의 활성(Imax) 및 효능(IC50)을 간접적 응답 모델에 의해 설명하였다. 간접적 응답 모델을 NTx의 0차 생산 속도(Kin)에 대한 혈청 NTx의 반감기(t1 /2 = 0.693/kout) 및 나노바디-매개된 저해[힐(Hill) 함수]에 의해 매개변수화 하였다. 나노바디는 Imax, IC50 및 형상 인자 n 에 의해 매개변수화된 힐 식에 의해 Kin을 저해하는 것으로 추정되었다. 각각의 나노바디의 경우, PD 매개변수의 단일 세트이 평가되었으나, 단 교체 매개변수(Kin, Kout)가 각각의 용량 수준에 대해 다양하도록 허용되는 RANKL003p는 제외되었다.
모든 나노바디의 수득된 약물동력학적 매개변수는 표 C-24에 제시되어 있다. 모든 3종의 나노바디는 유사한 고유 활성을 갖고 혈청 NTx의 거의 완벽한 저해(Imax
Figure 112009080144011-pct00036
90)를 중재하였지만, 이들의 효능은 유의적으로 상이하였다. RANKL008a는 혈청 NTx 합성의 가장 유효한 저해제로 밝혀졌고, 그 뒤로 RANKLOO1p 및 RANKL003p이다. RANKL003p는 RANKL008a에 비하여 10배 낮은 효능을 나타내었다. 평균 혈청 NTx 반감기는 대략 1.6 시간이었다.
실시예 15: RANKL130 , RANKL180 , RANKL008a , RANKLOO1p 및 RANKL003p 의 TNF 계열 구성원 TNF α, CD40 리간드 ( CD40L ) 및 TRAIL 과의 교차-반응성
항-RANK-L 나노바디의 TNF 계열 구성원 TNFα, TRAIL 또는 마우스 RANK-L과의 교차-반응성을 경쟁 ELISA에서 시험하였다. 인간 RANK-L을 실시예 2에 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 나노바디(100 pM)를 다양한 농도의 인간 RANK-L, 마우스 RANK-L, TNFα 또는 TRAIL(10 nM∼13.7 pM)과 함께 예비항온처리하고, 이후 이들을 플레이트에 첨가하였다. 나노바디의 RANK-L 코팅된 플레이트로의 결합은 단지 외부에서 첨가된 RANK-L에 의해 저해되었고, 다른 리간드의 첨가에 의해 영향받지 않았다(도 17).
실시예 15. 항- RANK -L 나노바디의 투여는 난소적출된 사이노몰구스 원숭이에 서 골 손실을 예방하고 강도 및 품질을 유지시킨다
골다공증은 낮은 골 질량 및 골 조직의 미세구조적(microarchitectural) 악화, 및 결과적인 골 무름의 증가 및 골절되기 쉬움을 특징으로 한다. 에스트로겐 결핍은 폐경후 골다공증의 낮은 골 질량의 특징의 원인이 된다. 따라서, 에스트로겐 결핍은 골다공증 치료를 연구하기 위한 골 손실 동물 모델로서 사용되어져 왔다.
난소적출(OVX) 또는 모의수술후 1개월째, 난소적출된 사이노몰구스 원숭이(cyno)(9∼16 세)를 비히클 또는 항-RANK-L 나노바디로 16 개월 동안 치료한다. 모의 대조표준을 비히클로 처리한다. 항-RANK-L 나노바디의 투여시 골 재흡수 및 골 무기질 밀도(BMD: bone mineral density)에 대한 효과를 분석한다.
동물을 희생시킨 후, 생체외 DXA 및 pQCT 스캔을 손상되지 않은 오른족 대퇴골, L3-L4 척추체, 및 L5-L6 척추 5mm 해면 중심에 대해 수행한다. 대퇴골 본체 및 상박골 피층(cortical beams)을 3 지점에서 구부리고, 대퇴골 경부를 자르고, 요추 견본을 압착시킴으로써 파괴 시험을 수행한다.
조직학적 수준에서 골 교체에 미치는 항-RANK-L 나노바디의 영향, 및 이들의 골 강도와의 관계를 다음과 같이 분석한다: 장골 및 늑골 생검(6 개월 및 12 개월째), 및 동물을 희생시키기 전에 2중 형광색소 표지를 주사한다. 이들 생검, 경골본체, 및 대퇴골 근위부 및 L2 척추골중 해면조직 골에 대해 조직형태측정을 수행한다.
실시예 16. VHH - Fc 융합물의 작성 및 분석
RANK-L에 대한 나노바디를 적합한 벡터에서 클로닝하여 인간 IgG1 또는 인간 IgG2의 CH1 결실된 Fc 부분으로의 유전자 융합물을 생성한다. 나노바디를 Fc에 연결시키는 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG2로부터 유도된다.
플라스미드 구조물을 진핵 세포주에서 형질감염시키고, Fc 융합물은 배양 상청액으로 분비된다. 생성물을 정제하고 쿠마시(Coomassie) 염색 겔 상에서 분석한다. 대표적 서열은 표 B-6(서열 번호 774-789)에 나타나 있다. 나노바디-융합물을 FMAT 경쟁 결합 검정, NF-κB 리포터 검정 및 TRACP 5b 파골세포 분화 검정에서 시험한다.
[표 B-1a]
RANK-L에 대한 바람직한 나노바디(RANK/RANK-L 상호작용에 대한 저해제)
Figure 112009080144011-pct00037
[표 B-1b]
Figure 112009080144011-pct00038
[표 B-1c]
Figure 112009080144011-pct00039
[표 B-1d]
Figure 112009080144011-pct00040
[표 B-2]
RANK-L에 대한 바람직한 나노바디(RANK/RANK-L 상호작용에 대한 비-저해제)
Figure 112009080144011-pct00041
[표 B-3a]
RANK-L에 대한 2가 나노바디
Figure 112009080144011-pct00042
[표 B-3b]
Figure 112009080144011-pct00043
[표 B-3c]
Figure 112009080144011-pct00044
[표 B-3d]
Figure 112009080144011-pct00045
[표 B-3e]
Figure 112009080144011-pct00046
[표 B-3f]
Figure 112009080144011-pct00047
[표 B-3g]
Figure 112009080144011-pct00048
[표 B-4a]
RANK-L에 대한 3가 이특이적 나노바디
Figure 112009080144011-pct00049
[표 B-4b]
Figure 112009080144011-pct00050
[표 B-4c]
Figure 112009080144011-pct00051
[표 B-4d]
Figure 112009080144011-pct00052
[표 B-4e]
Figure 112009080144011-pct00053
[표 B-5a]
RANK-L에 대한 인간화된 나노바디
Figure 112009080144011-pct00054
[표 B-5b]
Figure 112009080144011-pct00055
[표 B-5c]
Figure 112009080144011-pct00056
[표 B-6a]
RANK-L에 대한 인간화된 나노바디의 구조물
Figure 112009080144011-pct00057
[표 B-6b]
Figure 112009080144011-pct00058
[표 B-6c]
Figure 112009080144011-pct00059
[표 B-6d]
Figure 112009080144011-pct00060
[표 B-7]
인간 혈청 알부민에 대한 나노바디
Figure 112009080144011-pct00061
[표 B-8]
나노바디 구조물에서 사용된 연결기
Figure 112009080144011-pct00062
[표 C-1a]
실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 항-RANK-L 나노바디 서열(나노바디 서열은 계열로 분류됨. 고유 서열이 지시됨)
Figure 112009080144011-pct00063
[표 C-1b]
Figure 112009080144011-pct00064
[표 C-2]
ELISA에서 항-RANK-L 나노바디에 의해 수득된 ED50 값
Figure 112009080144011-pct00065
[표 C-3]
알파스크린 검정에서 항-RANK-L 나노바디에 의해 수득된 IC50 값
Figure 112009080144011-pct00066
[표 C-4]
나노바디의 막-결합된 인간 및 사이노몰구스 RANK-L로의 용량-의존적 결합(PE 평균 형광성)
Figure 112009080144011-pct00067
[표 C-5]
알파스크린에서 1가 및 3가 이특이적 항-RANK-L 나노바디의 비교
Figure 112009080144011-pct00068
[표 C-6]
세포 기초된 경쟁 결합 검정에서 1가 및 3가 이특이적 항-RANK-L 나노바디의 비교
Figure 112009080144011-pct00069
[표 C-7]
NF-카파B 수용체 유전자 검정에서 항-RANK-L 나노바디의 효능
Figure 112009080144011-pct00070
[표 C-8]
실시예 6에 기재된 바와 같은 인간/마우스 하이브리드의 구조물에 사용되는 프라이머
Figure 112009080144011-pct00071
[표 C-9]
실시예 6에 기재된 바와 같은 RANK-L의 인간/마우스 하이브리드 상의 RANK 나노바디의 결합
Figure 112009080144011-pct00072
[표 C-10]
실시예 7에 기재된 바와 같은 약물동력학 및 약력학 연구에서 동물의 투여량
그룹 동물 ID 투여량 및 투여 경로 단일/반복됨
RANKL130 1m 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
2f 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
ANKL131 3m 15 mg/kg(주입 8 시간) 단일
4f 15 mg/kg(주입 8 시간) 단일
RANKL180 5m 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
6f 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
ALB1 7m 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
8f 10 mg/kg(정맥내 일시주사) 단일
이반드로네이트 9m 0.15 mg/kg(정맥내 일시주사) 반복됨(1개월마다)
10f 0.15 mg/kg(정맥내 일시주사) 반복됨(1개월마다)
[표 C-11]
실시예 7에 기재된 바와 같은 사이노몰구스 원숭이 연구에서 약물동력학적 매개변수에 대해 수득된 값
매개변수1 cyno 1m cyno 2f cyno 5m cyno 6f
Vss _ pred(㎖/㎏) 67.7 71.1 67.1 55.4
CL_ pred(㎖/일/㎏) 7.71 7.91 5.86 5.08
MRTinf _ pred(일) 8.79 8.98 11.5 10.9
t1 /2λ z1(일)2 6.75 6.81 8.74 9.28
λz1 _ 하위값-λz1 _ 상위값(일) 1-39 2-51 4-51 1-32
R2 t1 /2λ z1 0.992 0.998 0.993 0.982
t1 /2 λ z2(일)3 3.10 3.29 2.53 2.21
λz2 _ 하위값-λz2 _ 상위값(일) 39-58 51-72 58-72 36-51
R2 t1 /2λ z2 0.994 0.985 0.991 0.984
AUC0 ∼39일 1287 - 1693 -
AUC0 ∼51일 - 1260 - 1909
AUC최종일(㎍·일/㎖) 1297 1264 1707 1970
%AUCextrap _ pred 0.0117 0.0033 0.0046 0.0112
AUCinf _ pred(㎍·일/㎖) 1297 1264 1708 1970
AUCinf _ pred/D(㎏·일/㎖) 0.130 0.126 0.171 0.197
1 모든 매개변수는 비-구획 모델링에 의해 계산되었다.
2 겉보기 베타 상에 대해 계산된 반감기
3 겉보기 감마 상에 대해 계산된 반감기
[표 C-12]
실시예 7에 기재된 바와 같은 사이노몰구스 원숭이 연구에서 약물동력학적 매개변수에 대해 수득된 값
매개변수1 cyno 3m cyno 4f
Vss _ pred(㎖/㎏) 488 775
CL_ pred(㎖/일/㎏) 2433 3355
MRTinf _ pred(일) 0.200 0.231
t1 /2λz(일) 0.787 0.843
λz1 _ 하위값-λz1 _ 상위값(일) 1.0-4.0 1.0-4.0
R2 t1 /2λz 0.970 0.918
AUC최종일(㎍·일/㎖) 6.14 4.45
%AUCextrap _ pred 0.380 0.493
AUCinf _ pred(㎍·일/㎖) 6.16 4.47
AUCinf _ pred/D(㎏·일/㎖) 0.0004 0.0003
1 모든 매개변수는 비-구획 모델링에 의해 계산되었다.
[표 C-13]
알파스크린 및 비아코어 3000에서 인간화된 RANK-L 나노바디의 활성
Figure 112009080144011-pct00073
[표 C-14]
알파스크린 및 FMAT에서 상이한 나노바디 구조물의 활성
Figure 112009080144011-pct00074
[표 C-15]
인간화된 나노바디로 제조된 상이한 구조물
Figure 112009080144011-pct00075
[표 C-16]
알파스크린 및 FMAT에서 인간화된 나노바디의 상이한 구조물의 활성
Figure 112009080144011-pct00076
[표 C-17]
수컷 Balb/c 마우스에서 단일 정맥내 투여(100 ㎍/동물)후의 나노바디의 기본 약물동력학적 매개변수
Figure 112009080144011-pct00077
[표 C-18]
수컷 Balb/c 마우스에서 단일 피하 투여(100 ㎍/동물)후의 나노바디의 기본 약물동력학적 매개변수
Figure 112009080144011-pct00078
[표 C-19]
실시예 14에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 사용된 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도
Figure 112009080144011-pct00079
[표 C-20]
실시예 14에 기재된 바와 같은 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 정맥내 일시주사 투여 후 RANKL008a의 기본 약물동력학적 매개변수
3 ㎎/㎏ 0.3 ㎎/㎏ 0.03 ㎎/㎏
매개변수 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
Vss _ pred(㎖/㎏) 65.8 4.3 74.2 12.8 85.3 7.9
CL_ pred(㎖/일/㎏) 8.33 1.71 14.0 0.6 50.8 11.0
MRTinf _ pred(일) 8.07 1.37 5.29 0.68 1.72 0.31
t1 /2λ z1(일)1 7.28 0.07 5.83 0.27 - -
λz1 _ 하위값(일) - - - - - -
λz1 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z1 - - - - - -
t1 /2λ z2(일)2 1.65 1.42 1.28 0.58 1.18 0.20
λz2 _ 하위값(일) - - - - - -
λz2 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z2 - - - - - -
AUC최종일(㎎·일/㎖) 370 74 19.5 3.0 0.546 0.186
%AUCextrap _ pred 0.0510 0.0584 2.10 3.26 11.7 14.2
AUCinf _ pred(㎎·일/㎖) 370 74 20.0 3.4 0.609 0.140
AUCinf _ pred/D(㎏·일/㎖) 0.124 0.025 0.0716 0.0034 0.0203 0.0047
1 겉보기 베타 상에 대해 계산된 반감기
2 겉보기 감마 상에 대해 계산된 반감기
[표 C-21]
실시예 14에 기재된 바와 같은 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 정맥내 일시주사 투여 후 RANKL001p의 기본 약물동력학적 매개변수
3 ㎎/㎏ 0.3 ㎎/㎏ 0.03 ㎎/㎏
매개변수 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
Vss _ pred(㎖/㎏) 60.4 4.6 73.3 4.3 67.5 0.9
CL_ pred(㎖/일/㎏) 8.69 0.82 15.0 1.5 41.3 4.5
MRTinf _ pred(일) 6.95 0.13 4.90 0.51 1.64 0.18
t1 /2λ z1(일)1 5.14 0.15 4.11 0.44 - -
λz1 _ 하위값(일) - - - - - -
λz1 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z1 - - - - - -
t1 /2λ z2(일)2 1.28 0.63 1.95 0.39 1.11 0.09
λz2 _ 하위값(일) - - - - - -
λz2 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z2 - - - - - -
AUC최종일(㎎·일/㎖) 346 31 19.7 2.0 0.670 0.095
%AUCextrap _ pred 0.0191 0.0072 1.65 1.18 3.95 1.97
AUCinf _ pred(㎎·일/㎖) 346 31 20.0 1.9 0.697 0.092
AUCinf _ pred/D(㎏·일/㎖) 0.115 0.010 0.0669 0.0065 0.0244 0.0026
1 겉보기 베타 상에 대해 계산된 반감기
2 겉보기 감마 상에 대해 계산된 반감기
[표 C-22]
실시예 14에 기재된 바와 같은 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 정맥내 일시주사 투여 후 RANKL003p의 기본 약물동력학적 매개변수
3 ㎎/㎏ 0.3 ㎎/㎏ 0.03 ㎎/㎏
매개변수 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
Vss _ pred(㎖/㎏) 33.1 1.8 31.1 3.9 32.5 5.9
CL_ pred(㎖/일/㎏) 4.49 0.04 5.93 0.60 14.9 2.9
MRTinf _ pred(일) 7.38 0.34 5.25 0.50 2.21 0.37
t1 /2λ z1(일)1 5.75 1.10 4.57 0.24 - -
λz1 _ 하위값(일) - - - - - -
λz1 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z1 - - - - - -
t1 /2λ z2(일)2 1.39 0.12 2.06 0.37 1.52 0.24
λz2 _ 하위값(일) - - - - - -
λz2 _ 상위값(일) - - - - - -
R2 t1 /2λ z2 - - - - - -
AUC최종일(㎎·일/㎖) 647 32 50.2 4.9 1.88 0.42
%AUCextrap _ pred 3.21 5.50 1.37 0.19 9.19 2.03
AUCinf _ pred(㎎·일/㎖) 669 5 50.9 4.9 2.06 0.42
AUCinf _ pred/D(㎏·일/㎖) 0.223 0.002 0.170 0.016 0.0688 0.0140
1 겉보기 베타 상에 대해 계산된 반감기
2 겉보기 감마 상에 대해 계산된 반감기
[표 C-23]
실시예 14에 기재된 바와 같은 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 피하 투여 후 나노바디의 기본 약물동력학적 매개변수
Figure 112009080144011-pct00080
[표 24]
실시예 14에 기재된 바와 같은 암컷 사이노몰구스 원숭이에서 RANKL008a, RANKL001p 및 RANKL003p의 약물동력학적 매개변수(±SE)
Figure 112009080144011-pct00081
SEQUENCE LISTING <110> Ablynx N.V. <120> Amino acid sequences directed against RANK-L and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders <130> P07-009-PCT-1 <160> 814 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KERE-class Nanobody <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (50)..(54) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (87)..(91) <223> CDR <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Pro Phe Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Ser Val 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 50 55 60 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Val Tyr Arg Cys Tyr Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95 Gln Val Thr Val Ser Ser 100 <210> 2 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95 Gln Val Thr Val Ser Ser 100 <210> 5 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KERE-class Nanobody <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (50)..(54) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (87)..(91) <223> CDR <400> 5 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys 50 55 60 Gln Thr Val Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr 85 90 95 Gln Val Thr Val Ser Ser 100 <210> 6 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KERE-class Nanobody <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (50)..(54) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> 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Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 50 55 60 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Val Tyr Tyr Cys Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ser Gln Gly Thr 85 90 95 Gln Val Thr Val Ser Ser 100 <210> 18 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GLEW-class Nanobody <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (50)..(54) <223> CDR <220> <221> misc_feature <222> (87)..(91) <223> CDR <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 50 55 60 Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Met Tyr Tyr Cys Gln Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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Gly 20 <210> 101 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW1 sequence <400> 101 Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 <210> 102 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 102 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 103 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 103 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 104 Trp Val Arg Arg Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 105 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser 1 5 10 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 106 Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 107 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 107 Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu His Glu Phe Val Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 108 Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Thr Glu Leu Val Ala 1 5 10 <210> 109 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 109 Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 110 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 110 Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW2 sequence <400> 111 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Phe Val Ser 1 5 10 <210> 112 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW3 sequence <400> 112 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW3 sequence <400> 113 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asp Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 114 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW3 sequence <400> 114 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Glu Met Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Trp Cys Gly Ala 20 25 30 <210> 115 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW3 sequence <400> 115 Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Ser Asn Arg Asn Met Ile Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 20 25 30 <210> 116 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody 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103-class Nanobody FW4 sequence <400> 120 Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW4 sequence <400> 121 Leu Arg Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW4 sequence <400> 122 Gly Asn Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 123 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW4 sequence <400> 123 Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW4 sequence <400> 124 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 125 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> P,R,S 103-class Nanobody FW4 sequence <400> 125 Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 126 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 126 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 127 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 127 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 128 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser 20 25 30 <210> 129 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 129 Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Gly 20 25 30 <210> 130 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 130 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Gly 20 25 30 <210> 131 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 131 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Tyr Ser 20 25 30 <210> 132 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 132 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Pro Val Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 133 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 133 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 134 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 134 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 135 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 135 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 136 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 137 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 137 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Met Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 138 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 138 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 139 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 139 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser 20 25 30 <210> 140 <211> 30 <212> 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Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Thr 20 25 30 <210> 145 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 145 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 146 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 146 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Arg Thr Phe Asn 20 25 30 <210> 147 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 147 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Ser Arg 20 25 30 <210> 148 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 148 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Thr 20 25 <210> 149 <211> 30 <212> PRT <213> 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<220> <223> FR1 sequences <400> 158 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 159 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 159 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Gly Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 160 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 160 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 161 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 161 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Arg 20 25 30 <210> 162 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR1 sequences <400> 162 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser 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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 260 265 270 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 275 280 285 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 290 295 300 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 305 310 315 320 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 325 330 335 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 350 <210> 790 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody sequence <400> 790 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 791 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nanobody sequence <400> 791 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 792 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence <400> 792 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 793 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence <400> 793 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 794 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence <400> 794 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 795 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence <400> 795 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 796 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker sequence <400> 796 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 797 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 797 cctccctttg acggattccg cgtaatacgt 30 <210> 798 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 798 acgtattacg cggattccgt caaagggagg 30 <210> 799 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 799 aaggctagag tacttaatac ga 22 <210> 800 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 800 cttatcatgt ctgctcgaag c 21 <210> 801 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 801 gggaaccaga tgggatggag gcggcattaa tagtgagatg ag 42 <210> 802 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 802 ctcatctcac tattaatgcc gcctccatcc catctggttc cc 42 <210> 803 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 803 ccattagttg aagatactct gtagccacgc ttcctgaagt ttcatg 46 <210> 804 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 804 catgaaactt caggaagcgt ggctacagag tatcttcaac taatgg 46 <210> 805 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 805 ccattagttg aagatagtct gtaggtaggt ctcc 34 <210> 806 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 806 ggagacctac ctacagacta tcttcaacta atgg 34 <210> 807 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 807 gaagtaggat ggacgatgac aaacccgcga agacttttct ggtggcggga gcgaggtgca 60 gctggtgga 69 <210> 808 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 808 gttctatcgg gaagacttag aacctccgcc gcctgaggag acggtgacca g 51 <210> 809 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 809 gggtatctct cgagaaaaga gaggtgcagc tggtggagtc tggg 44 <210> 810 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 810 tctcttctcc taggtctttg aatctgtggg cgacttcaga tttatgagca tctgaggaga 60 cggtgaccag 70 <210> 811 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 811 gggtatctct cgagaaaaga gaggttcagc tagtggaatc a 41 <210> 812 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 812 cacctccgga tcctccacct ccgctacctc cacctccact gccacctcca cctgaggaga 60 cggtgaccag 70 <210> 813 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 813 ggtggaggat ccggaggtgg aggtagcgga ggtggaggct caggaggtgg aggcagtgag 60 gttcagctag tggaa 75 <210> 814 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer sequence <400> 814 tctcttctcc taggtctttg aatctgtggg cgacttcaga tttatgagca tctgaggaga 60 cggtgaccag 70

Claims (262)

  1. 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제(RANK-L: Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligand)에 대해 유도되거나(directed) 이에 특이적으로 결합할 수 있는 2 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디를 포함하는 폴리펩티드로서,
    상기 2 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디는 4개의 기본골격 영역(각각 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1∼CDR3)으로 구성되고,
    CDR1은 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열 중 하나이며,
    CDR2는 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열 중 하나이며,
    CDR3은 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열 중 하나이며, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3는 표 A-1a 내지 A-1e에 기재된 클론에 관한 DR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열의 조합으로 이루어진 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디가 RANK-L의 RANK로의 결합을 조절, 저해 또는 방지하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2 이상의 아미노산 서열 또는 나노바디가 파골세포의 분화 또는 증식을 방지 또는 저해하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2가 폴리펩티드 또는 3가 폴리펩티드인 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2 이상의 아미노산 서열이 도메인 항체, 단일 도메인 항체, "dAb" 또는 나노바디(VHH 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않음)를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2 이상의 나노바디가 VHH 서열, 부분적으로 인간화된 VHH 서열, 전체적으로 인간화된 VHH 서열, 카멜화된 중쇄 가변 도메인, 및 친화도 증진(affinity maturation)과 같은 기법에 의해 얻어진 나노바디로 구성되는 군에서 선택된 1 이상인 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2 이상의 아미노산 서열이 서열 번호 560∼621, 730∼757 및 765의 1 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디를 포함하고, 이때 아미노산 동일성의 정도 결정에 있어, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 2 이상의 아미노산 서열이
    i) 서열 번호 560∼621, 730∼757 및 765의 1 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디를 포함하고, 이때 아미노산 동일성의 정도 결정에 있어, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고,
    ii) 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 따른 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 위치에 있는 1 이상의 아미노산 잔기는 표 A-3에 언급된 인증(Hallmark) 잔기로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
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  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 560∼621로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 나노바디를 포함하는 것인 폴리펩티드.
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  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 730∼757 및 765로 구성된 군에서 선택되는 인간화된 나노바디인 2 이상의 나노바디를 포함하는 것인 폴리펩티드.
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  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 622∼729, 759∼762 및 766∼773로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중특이적(multispecific) 구조물인 폴리펩티드.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적인 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가적으로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1 이상의 다른 결합 단위가, 추가적인 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드에 비하여 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 것인 폴리펩티드.
  23. 제21항에 있어서, 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 혈청 단백질 또는 이의 단편, 혈청 단백질에 결합할 수 있는 결합 단위, Fc 부분, 및 혈청 단백질에 결합할 수 있는 펩티드로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
  24. 제21항에 있어서, 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
  25. 제21항에 있어서, 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 1 이상의 다른 결합 단위가 혈청 알부민 또는 혈청 면역글로불린에 결합할 수 있는 결합 단위로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
  26. 제21항에 있어서, 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 1 이상의 다른 결합 단위가 도메인 항체, 단일 도메인 항체, "dAb", 또는 혈청 알부민 또는 혈청 면역글로불린에 결합할 수 있는 나노바디로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
  27. 제21항에 있어서, 1.5배 이상 더 크거나 1 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 상기 1 이상의 다른 결합 단위가 서열 번호 790∼791로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    추가적인 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 5배 이상 더 크거나, 또는
    추가적인 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드의 혈청 반감기에 비하여 6 시간 초과로 증가된 혈청 반감기를 폴리펩티드에 제공하는 1 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 추가적으로 포함하는 것인 폴리펩티드.
  29. 제1항 또는 제2항에 있어서, 12 시간 이상 인간에서 혈청 반감기를 갖는 것인 폴리펩티드.
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 694∼729 및 759∼760으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  31. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
  32. 제31항에 있어서, 유전자 구조물의 형태인 것인 핵산 또는 뉴클레오티드 서열.
  33. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 발현하거나, 적합한 환경에서 이를 발현할 수 있고, 제31항의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제32항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 숙주 또는 숙주 세포.
  34. - 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 또는 또다른 적합한 발현 시스템에서, 제31항의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 또는 제32항에 따른 유전자 구조물을 발현시키는 단계; 또는
    - 숙주 또는 숙주 세포가 제1항 또는 제2항의 1 이상의 폴리펩티드(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 얻을 수 있음)를 발현 또는 생산할 수 있는 조건하에 상기 숙주 또는 숙주 세포를 배양 또는 유지시키는 단계로서, 상기 숙주 또는 숙주 세포는 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 발현하거나, 적합한 환경에서 이를 발현할 수 있거나, 또는 제31항의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 제32항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 것인 단계를 적어도 포함하고, 이후 경우에 따라서
    - 그 결과 얻어지는 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드(이는 이를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 얻을 수 있음)를 단리 또는 정제하는 단계를 포함하는,
    제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 발현으로 얻을 수 있는, 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드의 제조 방법.
  35. 1 이상의 골 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한, 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제 또는 보조제를 추가로 포함하고, 경우에 따라 1 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 화합물을 포함하는 것인 약학 조성물.
  37. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한 것인 폴리펩티드.
  38. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1 이상의 골 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 것인 폴리펩티드.
  39. 4개의 기본골격 영역(각각 FR1∼FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1∼CDR3)으로 구성된 아미노산 서열 또는 나노바디로서,
    CDR1은 서열 번호 188∼249의 아미노산 서열 중 하나이며,
    CDR2는 서열 번호 312∼373 및 758의 아미노산 서열 중 하나이며,
    CDR3은 서열 번호 436∼497의 아미노산 서열 중 하나이며, 및 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3는 표 A-1a 내지 A-1e에 기재된 클론에 관한 DR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열의 조합으로 이루어진 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  40. 제39항에 있어서, RANK-L의 RANK로의 결합을 조절, 저해 또는 방지하는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  41. 제39항에 있어서, 파골세포의 분화 또는 증식을 방지 또는 저해하는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  42. 제39항에 있어서, 도메인 항체, 단일 도메인 항체, "dAb" 또는 나노바디로 구성되는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  43. 제39항에 있어서, 상기 나노바디가 VHH 서열, 부분적으로 인간화된 VHH 서열, 전체적으로 인간화된 VHH 서열, 카멜화된 중쇄 가변 도메인, 또는 친화도 증진(affinity maturation)과 같은 기법에 의해 얻어진 나노바디로 구성되는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  44. 제39항에 있어서, 서열 번호 560∼621, 730∼757 및 765의 1 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디로 구성되고, 이때 아미노산 동일성의 정도 결정에 있어, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
  45. 제39항에 있어서,
    i) 서열 번호 560∼621, 730∼757 및 765의 1 이상의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 나노바디로 구성되고, 이때 아미노산 동일성의 정도 결정에 있어, CDR 서열을 형성하는 아미노산 잔기는 무시되고,
    ii) 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 따른 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108 위치에 있는 1 이상의 아미노산 잔기는 표 A-3에 언급된 인증(Hallmark) 잔기로부터 선택되는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
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  50. 제39항에 있어서, 서열 번호 560∼621로 구성된 군에서 선택되는 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
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  53. 제39항에 있어서, 서열 번호 730∼757 및 765로 구성된 군에서 선택되는 인간화된 나노바디인 것인 아미노산 서열 또는 나노바디.
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