JP2004536056A - Rankアンタゴニストの療法使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新生骨の形成を必要とする多様な病的状態を、有効量のRANKアンタゴニストの投与により処置する方法を提供する。本発明方法に適したアンタゴニストには、RANKLを結合する可溶性RANKポリペプチド、RANK活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、RANKまたはRANKLに特異的な抗体、およびオステオプロテゲリンが含まれる。
Description
【技術分野】
【0001】
本出願は、35 U.S.C.§119のもとに米国仮特許出願No.60/291,919の優先権を主張し、その開示内容を本明細書に援用する。
発明の技術分野
本発明は一般に、新生骨の形成を必要とする病的状態におけるRANK/RANKL相互作用のアンタゴニストの療法使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
RANK(NF−κBの受容体アクチベーター)およびそのリガンド(RANKL)は、免疫応答および骨代謝において重要な役割を果たす受容体/リガンド対である。RANKおよびRANKLはネズミおよびヒトの両方においてクローニングおよび解明された(たとえばU.S.6,017,729、WO98/25958、EP0 873 998、EP0 911 342、U.S.5,843,678、WO98/46751およびWO98/54201参照)。
【0003】
RANKLはRANKだけでなく、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーであるオステオプロテゲリン(OPG)と呼ばれる天然RANKデコイタンパク質にも結合することが示されている(たとえばU.S.6,015,938およびWO98/46751参照)。OPGは可溶性分子であり、骨代謝におけるその役割はHofbauer et al.,J Bone Min Res 15(1):2−12(2000)に概説されている。RANK/RANKLおよびOPGの生物学的作用についての観点は、さらにたとえばSimonet et al.,Cell 89:309−319(1997);Kodaira et al.,Gene 230:121−27(1999);U.S.5,843,678;およびU.S.6,015,938に述べられている。RANKと対比してOPGは、”TNF関連アポトーシス誘導リガンド”、すなわち”TRAIL”として知られる第2結合パートナーをも結合する。TRAILはトランスフォームした多様なヒト細胞系においてインビトロでアポトーシスを誘導し、ヒト腫瘍の治療におけるその療法能について試験が行われている。OPGは、RANKLに結合してこれがRANKを結合するのを阻害することによりRANK活性を抑制する作用をもち、骨損失を特色とするさまざまな状態に対する療法薬として提唱されている(WO98/46751;WO01/03719;WO01/16299;WO01/17543;およびWO01/03719)。
【0004】
I型膜貫通タンパク質RANKは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである(たとえばU.S.6,017,729参照)。全長ヒトRANKポリペプチドは616個のアミノ酸をもつ。ヒトRANKLは、腫瘍壊死因子リガンドファミリーの317アミノ酸のタンパク質であり、シグナルペプチドを欠如し、短い細胞質ドメインおよびRANKと特異的に結合する細胞外領域をもつ、II型膜タンパク質である(たとえばU.S.6,017,729参照)。RANKLは”オステオプロテゲリン結合性タンパク質”、”破骨細胞形成(osteoclastogenesis)分化因子”および”TRANCE”とも呼ばれる(たとえばKodaira et al.,1999;Yasuda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:3597(1998);およびWong et al.,J.Biol.Chem.,273(43):28355−59(1998)参照)。
【0005】
RANKタンパク質は、種々のTNF受容体関連因子(TRAF)との相互作用により細胞内事象を起こさせる(たとえばGalibert et al.,J.Biol.Chem.,273(51):34120−27(1998);Darnay et al.,J.Biol.Chem.,273(32):20551−55(1998);およびWong et al.,1998参照)。たとえばRANKとそのリガンドRANKLの相互作用によりRANKがトリガーされると、TRAF仲介による細胞内事象が活性化し、その結果、免疫系の細胞において広範に用いられる遍在性転写因子である転写因子NF−κBがアップレギュレートされる。
【0006】
RANKは主に、上皮細胞、BおよびT細胞系、線維芽細胞、樹状細胞ならびに破骨細胞およびそれらの前駆体の表面に発現する。可溶形でも存在するRANKLは、主に造血組織、たとえば骨髄、胸腺および脾臓、ならびにT細胞および骨芽細胞系列の細胞に発現する。RANK/RANKL相互作用により仲介される信号は、骨再吸収に関与する細胞である破骨細胞の分化および機能の刺激に関係する(たとえばLancey et al.,Cell 93:165−76(1998);Yasuda et al.,1998参照)。このプロセスは、RANKLを発現する細胞と破骨細胞前駆体の直接接触に関係すると思われる。したがって、RANKL結合を遮断するオステオプロテゲリンまたは可溶形RANKを投与して破骨細胞活性を阻害し、これにより、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、リウマチ性関節炎、補綴具の緩みなどに関連する骨損失速度を低下させることができると提唱された(たとえばWO98/46751、WO99/58674、WO01/16299およびHofbauer et al.,2000参照)。
【0007】
RANKタンパク質に由来するRANKアンタゴニストのインビボ作用について幾つかの研究が報告された(たとえばUSP6,015,938およびWO98/46751参照)。そのほか、ヒト疾患のマウスモデルにおいて可溶性RANKの投与により骨破壊が低減したと報告されている(Oyajobi et al.,J Bone Min Res 15(suppl.1):S176,Abstract #1151(Sep.,2000);Oyajobi et al.,Cancer Res 61:2572−78(2001);Childs et al.,Abstract,Orthopedic Research Society,サンフランシスコ,2001参照)。
【0008】
骨疾患を治療するための療法は近年著しく改善された(Rodan and Martin,Science 289:1508−1514(2000)参照)。たとえば、骨沈着を促進するペプチドが同定された(WO00/75185)。しかし、新たな骨の形成が望ましい多様な病的状態に対するより良い療法を提供することが、依然として要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
発明の概要
本発明は、新たな骨の形成が要求される多様な病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の療法薬および組成物は、実際に骨損失が起きていない患者に骨形成を刺激するために投与できる。これらの療法薬が有益な患者には、以前に骨密度低下を生じたことがあるが現在は骨損失がみられない患者が含まれる。これらの処置が有益な患者には、その症状が骨密度低下を特色とするものではないにもかかわらず新たな骨の形成が要求される患者、たとえば外傷性傷害のため骨を失った事故被害者が含まれる。
【0010】
本発明の方法および組成物に使用するのに適したRANKアンタゴニストには、下記のものが含まれる:RANKを特異的に結合でき、かつRANKをトリガーしない抗体;RANKLを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの翻訳または転写を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;オステオプロテゲリンポリペプチド;およびRANKLを結合できる可溶性RANKポリペプチド。RANKアンタゴニストとして有用な可溶性RANKタンパク質は、RANKポリペプチドの細胞外領域のRANKL結合性部分を含むであろう;これには、RANKL結合能を保持する限り、対立遺伝子バリアントおよびムテイン(mutein、変異タンパク質)が含まれる。
【0011】
本発明の具体的態様には下記のものが含まれる。
本発明は、下記の患者にRANKアンタゴニストを投与する処置方法を提供する:急性敗血症性関節炎、骨軟化症(リケッチア症および壊血病を含む)、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷の病的状態のうちいずれかを伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者。RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。本発明方法に使用されるRANKアンタゴニストは、RANKがNF−κBを誘導する能力を阻害できるものである。RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質であり、RANKアンタゴニストは、下記のいずれかである:SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;またはSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチド。この方法の1態様において、患者は処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない。RANKアンタゴニストを投与している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターすることができる。本発明方法に使用するのに適したRANKアンタゴニストの1つは、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチド(ヒトRANKLの細胞外ドメイン)を特異的に結合できる抗体である。同様にRANKアンタゴニストとして使用するのに適したものは、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチドである。
【0012】
本発明の他の態様は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者を処置する方法を提供する。この方法では、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。この方法で使用するRANKアンタゴニストは、RANKがNF−κBを誘導する能力を阻害できるものである。RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質である。この方法において、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであり、該可溶性RANKポリペプチドはSEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性をもつ。本発明の1態様において、患者は処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない。この方法の他の態様において、可溶性RANKポリペプチドは、SEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその相補体とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされ、その際ストリンジェント条件は6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄を含む。1態様において、可溶性RANKポリペプチドはSEQ ID NO:10のアミノ酸33〜196を含む。さらに他の態様において、可溶性RANKポリペプチドはさらに、免疫グロブリンFcドメイン、FLAG(商標)タグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む。1態様において、可溶性RANKポリペプチドは免疫グロブリンFcドメインに共有結合している。本発明の1態様において、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:5のアミノ酸30〜433からなるRANK:Fc融合タンパク質であるか、あるいはこの融合タンパク質のバリアントであって、残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されたものである。処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【0013】
本発明は、人工関節レシピエント、骨移植片レシピエントおよび靭帯移植片レシピエントである患者を処置する方法であって、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含む方法をも提供する。その際、RANKアンタゴニストは下記のいずれかである:SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであって、SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有する可溶性RANKポリペプチド;SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;またはSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチド。たとえば、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含む可溶性RANKポリペプチドである。可溶性RANKポリペプチドをRANKアンタゴニストとして使用する場合、アンタゴニストタンパク質はさらに他の部分、すなわち免疫グロブリンFcドメイン、商標FLAGタグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせを含むことができる。本明細書の記載に従って使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列からなるもの、またはこのタンパク質のバリアントであって、残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されているものである。これらの患者を処置する際、1回目のアンタゴニストを、人工関節、骨移植片または靭帯移植片の外科移植の1カ月以内に投与する。この方法の1態様においては、処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の詳細な説明
本発明は、新生骨形成の必要性を特色とする病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。好ましくは患者はヒトであるが、本発明方法はペットおよび農場動物などの家畜を含めたいかなる動物にも適用できる。本明細書中で用いる”新生骨形成”とは、患者の1以上の骨における硬質石灰化骨組織の量の正味増加を意味する。本発明方法は、新生骨形成を刺激するのに有効な量のRANKアンタゴニストを、その必要がある患者に投与することを伴う。RANKアンタゴニストは、好ましくは患者と同一種の動物に由来するタンパク質である。”RANKアゴニスト”は、RANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を誘導する薬剤、たとえばNF−κB活性を誘導する薬剤である。本明細書中で用いる”RANKアンタゴニスト”は、RANKとRANKLの相互作用を遮断または低減する薬剤であり、これにはRANKまたはRANKLの合成を阻害する薬剤が含まれる。RANKアンタゴニストは、一般にRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を低減する。ある態様において、RANKアンタゴニストは可溶性RANKを含むか、あるいはRANKまたはRANKLに対する抗体であって、RANKとRANKLの相互作用を阻害もしくは遮断し、かつRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を刺激しない抗体を含む。他の適切なRANKアンタゴニストは、OPGまたはその可溶性誘導体であり、これには二量体またはより高次の多量体が含まれる。RANKアンタゴニストは、一般にRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性のうち少なくとも1つを阻害または遮断するであろう。
【0015】
たとえば膜結合もしくは可溶性RANKLとの接触またはアゴニスト作用性抗RANK抗体との接触によりRANKがトリガーされると、RANK仲介による細胞性応答が誘発される;これはRANKタンパク質の細胞質テイルのコンホメーション変化を誘導する受容体オリゴマー化により起きる。これらの細胞性応答には、免疫系の細胞に広く用いられる遍在性転写因子である転写因子NF−κBの活性化、c−jun N末端キナーゼ(JNK)の活性化、またはアクチベータータンパク質1(AP−1)の活性化を含めることができる;たとえばGalibert et al.,J Biol Chem 273:34120−27(1998)またはLee et al.,Molec Pharmacol 55:1536−45(2000)参照。破骨前駆細胞においてRANKがトリガーされると、前駆細胞から成熟破骨細胞への分化が誘導される。RANKが活性化されると、成熟破骨細胞の骨再吸収活性も高まる。RANK活性のアンタゴニストは、適切なアッセイ系、たとえば破骨細胞の生物学的活性を測定するアッセイにおいて、上記のようなトリガーされたRANKの表示(manifestation)のいずれかをそれらが阻害または阻止する能力により同定できる。
【0016】
推定RANKアンタゴニストがRANKと拮抗する活性をもつかを判定するアッセイを実施できる。ある分子がRANKと拮抗する能力は、たとえばRANKを発現する細胞においてNF−κBの量または活性を測定するアッセイ法(たとえばUSP6,017,729に記載)、またはJNKもしくはAP−1の量または活性を測定するアッセイ法(たとえばLee et al.(2000)に記載)によって容易に判定できる。NF−κBのアッセイにおいては、RANKを発現する細胞、たとえば293/EBNA細胞を用いる。293/EBNA細胞は、エプスタイン・バーウイルス核抗原−1をコードする遺伝子で293細胞系をトランスフェクションすることにより誘導した細胞系である。そのようなアッセイを実施するためには、293/EBNA細胞その他のRANK発現被験細胞を、推定RANKアンタゴニストの存在下または不存在下でRANKトリガーに曝露する。RANKトリガーは、RANKLもしくは可溶性RANKLを発現する細胞、またはRANK活性を増強する抗体であってよい。推定アンタゴニストに曝露した後、トリガーされた被験細胞におけるNF−κBの量または活性を測定する。RANKがトリガーされるのを推定アンタゴニストが阻害した場合、トリガーされた被験細胞におけるNF−κBの量または活性は増大しないであろう。推定RANKアンタゴニストに曝露した被験細胞において、その分子に曝露しなかった細胞より少量のNF−κBが検出されれば、その分子はRANKアンタゴニストであると判定される。あるいは、JNKまたはAP−1の活性化をRANK活性の尺度として利用できる。RANKアンタゴニスト活性を測定するのに適した他のアッセイ法には、たとえば酵素イムノアッセイ法もしくはドットブロット法、固定化もしくは細胞表面RANKLへの標識RANKの結合を漸増量のそのフラグメントの存在下で検出するアッセイ法、あるいは標識RANKLフラグメントの存在下で固定化もしくは細胞表面RANKへの結合を検出するアッセイ法が含まれる。そのような方法は当技術分野で周知である。
【0017】
ネズミRANKをコードするヌクレオチド配列の例をSEQ ID NO:1に示し;ヒトRANKをコードするヌクレオチド配列の例をSEQ ID NO:3に示し;対応する全長RANKポリペプチドをそれぞれSEQ ID NO:2および4に示す。ヒトRANKタンパク質は616個のアミノ酸残基をもち、一方ネズミRANKは625個のアミノ酸をもち、それぞれRANKLを結合できる細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。RANKの細胞質ドメインは、TRAF1、2、3、5および6を結合できる。ヒトRANKの細胞外ドメインはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213に相当し、ネズミRANKの細胞外ドメインはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214に相当する。ヒトRANKタンパク質は、SEQ ID NO:4の残基24〜33の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸29の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。ネズミRANKタンパク質は、SEQ ID NO:2の残基25〜35の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸30の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。
【0018】
ヒトおよびネズミRANKおよびRANKLをコードするDNAの単離がUSP6,017,729に記載されており、これを本明細書に援用する。本発明の実施に有用なRANKアンタゴニストには、RANKLを結合でき、かつSEQ ID NO:2またはNO:4に示すRANKタンパク質の細胞外領域のRANKL結合性部分をコードする核酸(またはその相補体)にストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされる、可溶性RANKポリペプチドが含まれる。そのようなRANKアンタゴニストは、療法薬として使用した場合に該タンパク質の合成、精製または臨床有効性を高めるヘテロロガスシグナルペプチドもしくは免疫グロブリンFc領域または他のいずれかの部分をさらに含むことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の選択方法は当技術分野で周知であり、多数の方法が記載されている。たとえばSambrook et al.(Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー;1989);p.9.50−9.57および11.45−11.57参照;これを本明細書に援用する)。一般に、複雑な核酸を標識ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、それらを使用前にアルカリ処理または機械的剪断によりフラグメント化して、長さ50〜600ヌクレオチドのフラグメントを得る。長さが約50ヌクレオチドを超えるプローブについては、ストリンジェント条件は融解温度(Tm)より20〜25℃低い温度でハイブリダイズすることにより達成され、一方、オリゴヌクレオチド(一般に長さ14〜30ヌクレオチド)については、ストリンジェント条件は一般に融解温度より5〜10℃低い温度でハイブリダイズすることを伴う(Sambrook et al.,p.11.45参照)。長さが約14ヌクレオチドを超えるプローブについては、Tmは式Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)を用いて妥当な精度で計算できる。式中、Nはハイブリッドデュプレックス中の塩基数であり、[Na+]はハイブリダイゼーション緩衝液のナトリウムイオン濃度である(1×SSCの[Na+]は0.165M)(Sambrook et al.,p.11.46参照)。ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを添加する場合、Tm(したがって最適ハイブリダイゼーション温度)は各1%ホルムアミドについて約0.63℃低下する(Sambrook et al.,p.9.51参照)。ターゲット核酸を固体支持体に固定する場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、たとえば6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄により達成できる。あるいは、ストリンジェント条件は、6×SSCプラス50%ホルムアミド中、42℃でのハイブリダイゼーション、続いて2×SSC中、室温(約22℃)での洗浄、次いで0.2×SSC中、68℃での洗浄により達成できる。
【0019】
RANKアンタゴニストとして使用するのに適したRANKL結合性可溶性RANKポリペプチドをコードする核酸の例には、下記のものが含まれる:SEQ ID NO:4のアミノ酸x〜yを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでxはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜33よりなる群から選択され、yはSEQ ID NO:4のアミノ酸196〜213よりなる群から選択される;SEQ ID NO:2のアミノ酸x〜yを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでxはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜35よりなる群から選択され、yはSEQ ID NO:2のアミノ酸197〜214よりなる群から選択される;ならびにこれらの核酸分子またはその相補体のいずれかにストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子、その際、ストリンジェント条件は6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄を伴う。
【0020】
本発明の1態様において、本発明のRANKアンタゴニストとして使用するための可溶性RANKをコードする核酸分子は、SEQ ID NO:1(ネズミRANK)のヌクレオチド91〜642またはSEQ ID NO:3(ヒトRANK)のヌクレオチド126〜677を含むであろう。これらの核酸分子によりコードされる可溶性RANKは、RANKLに確実に結合するのに十分な量のRANK細胞外領域が存在しかつ該タンパク質がRANK膜貫通領域を含有しない限り、全長RANKポリペプチドのいずれの目的部分に対応するものであってもよい。
【0021】
本発明の1態様においては、RANKLを結合でき、RANKタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性RANKタンパク質を含むRANKアンタゴニストを投与することにより、その必要がある患者を処置する。可溶性RANKは、本明細書に開示したヒトまたはネズミRANKポリペプチド例のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含むことができ、あるいはシグナルペプチドを除去した成熟形タンパク質を使用できる。
【0022】
本発明の1態様において、RANKLを結合できる可溶性RANKポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2または4に示した天然RANKタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列(それぞれSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214およびSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213)に対して少なくとも約70%同一である。他の態様において、可溶性RANKポリペプチドはRANKLを結合し、かつそのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2または4に示したRANKポリペプチドの細胞外領域に対して少なくとも約80%同一である。RANKLを結合でき、かつSEQ ID NO:2または4に示した天然形RANKのRANKL結合性部分に対して少なくとも約90%同一であるRANKポリペプチドも、有用である。同一性%は、コンピュータープログラム、たとえばDevereux et al.(Nucl.Acids Res.12:387,1984)に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)から入手できるGAPコンピュータープログラムを用いて決定できる。RANKタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はそのポリペプチド中に存在するRANKタンパク質部分に基づいて計算される。SEQ ID NO:2および4のネズミおよびヒトRANKタンパク質を本明細書の記載に従ってアラインすると、それらは約70%同一であることが分かる。
【0023】
本明細書の記載に従って使用するのに適したRANKポリペプチドには、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213またはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214を含むポリペプチドが含まれ、あるいはそのRANKL結合性フラグメントが含まれてもよい。患者がヒトである場合、可溶性RANKは好ましくはヒトRANKポリペプチドに由来する。ヒトRANKについて、SEQ ID NO:4の少なくともアミノ酸33〜196を含有するポリペプチドはRANKLを結合できる。有用なRANKアンタゴニストの1つは、SEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むポリペプチドである。所望により、SEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むRANKアンタゴニストを、二量体化を促進する他のタンパク質に融合させてもよい。
【0024】
可溶性RANKポリペプチドを含むRANKアンタゴニストは、細胞外ドメインのほかに他の部分を含有してもよいが、膜貫通領域は含有しない。ヒトおよびネズミRANKの膜貫通領域は、それぞれSEQ ID NO:4のほぼアミノ酸214からほぼアミノ酸234まで、およびSEQ ID NO:2のほぼアミノ酸215からほぼアミノ酸235までに位置する。したがって、本発明方法に適した可溶性RANKアンタゴニストには、たとえばRANK細胞内領域に直接融合したRANK細胞外領域を含むタンパク質、たとえばSEQ ID NO:4のほぼアミノ酸235に始まってアミノ酸616まで続くセグメントに直接融合したSEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むタンパク質、またはそのRANKL結合性部分が含まれる。
【0025】
所望により、組換えDNA法を用いて天然リーダーをヘテロロガスシグナルペプチドで置換することができる。RANKLを結合できる可溶性RANKは、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜33のアミノ末端からアミノ酸213まで続くヒトRANK部分を含むことができる。そのようなタンパク質部分を含むRANKL結合性フラグメントはRANKアンタゴニストとして有用であり、本明細書に記載するような種々の結合アッセイ法により同定できる。あるいは、当技術分野で既知のユニーク制限部位またはPCR法を用いて、RANKL結合活性を発現および分析しうる多数のトランケート形RANKをコードする核酸を調製できる。
【0026】
RANKのRANKL結合性バリアントおよび対立遺伝子は、USP6,017,729において提供された方法および試薬を用いて得ることができる。SEQ ID NO:4に示したアミノ酸配列とごくわずかに異なるヒトRANK対立遺伝子バリアントの単離が報告されている(WO98/54201)。たとえばこのWO98/54201のバリアントは、SEQ ID NO:4の残基192に相当する位置にアラニンの代わりにバリン、SEQ ID NO:4の残基513に相当する位置にセリンの代わりにイソロイシンをもつ。このRANKバリアントはTRAFを結合でき、かつNF−κBおよびJNKを刺激できる。USP6,017,729またはWO98/54201に記載されたヒトRANKタンパク質、あるいはRANKの他のいずれかのRANKL結合性ムテインまたは対立遺伝子バリアントを用いて、本発明においてアンタゴニストとして用いるための可溶性RANKタンパク質を誘導できる。RANKアンタゴニストとして用いる可溶性RANKの誘導にRANK類似体またはムテインを使用できる可能性は、たとえばUSP6,017,729の記載に従って、類似体またはムテインがRANKLを結合する能力を試験することにより判定できる。
【0027】
同様に療法薬として有用なものは、該タンパク質またはそれらのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体を含む可溶性RANKタンパク質、たとえば組換え体培養においてN末端またはC末端融合体として合成されるものである。たとえば結合ペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に該タンパク質の合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側にあるその機能部位への移動を指令する、該タンパク質のN末端領域にあるシグナル(またはリーダー)ポリペプチド配列(たとえば酵母α−因子リーダー)であってよい。タンパク質融合体は、RANKタンパク質および同族体の精製または同定を容易にするために付加したペプチド、たとえばポリ(His)を含むことができる。たとえばポリ(His)6タグを使用できる(SEQ ID NO:6)。本発明タンパク質のアミノ酸配列を同定用ペプチド、たとえばHopp et al.,Bio/Technology 6:1204,1988に記載のもの(FLAG商標)に結合させることもできる。抗原性の高いこのペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、迅速なアッセイおよび発現した組換えタンパク質の円滑な精製を可能にする。Hoppらの配列はウシ粘膜エンテロキナーゼによっても特異的に開裂し、精製タンパク質からペプチドを分離できる。
【0028】
可溶性RANKのほかに、そのような融合タンパク質はたとえば免疫グロブリンFcドメイン、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせなどの部分を含むことができる。RANKL結合性形の可溶性RANKを含む、本明細書に記載されたように使用するのに適した融合タンパク質は、組換え発現法により作製できる。そのような融合タンパク質は、二量体またはより高次の多量体形を形成してもよい。重合形はRANK活性阻害能が高い。重合可能な融合タンパク質の例には、二量体を形成しうるRANK:Fc融合タンパク質、およびジッパー部分の融合タンパク質(すなわちロイシンジッパー)が含まれる。他の有用な融合タンパク質は、当技術分野で既知の種々のタグを含むことができる。
【0029】
本発明の1態様において、アンタゴニストは、免疫グロブリンFc領域に結合した可溶性RANKを含む融合タンパク質である。ヒト患者を処置する場合、融合タンパク質のRANKおよびFc部分は、好ましくはヒト源に由来する。この目的に有用なFc領域は、ヒトIgG1免疫グロブリンに由来するものである。Fc領域のフラグメントおよびFcムテインも使用できる。たとえば、Fc領域のヒンジ部内の特定の残基がFcγRIへの高親和性結合にとって必須である。Canfield and Morrison(J.Exp.Med.173:1483(1991))は、U937細胞上に存在するFcγRIへのIgG3の高親和性結合にとってLeu(234)およびLeu(235)が必須であると報告している。同様な結果がLund et al.(J.Immunol.147:2657(1991);Molecular Immunol.29:53(1991))により得られた。そのような変異(単独または組合わせ)をIgG1のFc領域に形成して、FcRに対するIgG1の親和性を低下させることができる。用いるFc領域の部分によっては、鎖間ジスルフィド結合の形成により融合タンパク質を二量体として発現させることができる。抗体の重鎖と軽鎖の両方を含む融合タンパク質を作製する場合、4つものRANK領域を含むタンパク質オリゴマーを形成することができる。療法用組成物の調製に使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:5に示すものである。これは、ヒトRANKの細胞外ドメインをアミノ酸1〜213に、ヒトIgG1免疫グロブリン由来のFc領域をアミノ酸214〜443に含む。SEQ ID NO:5のアミノ酸1〜29はリーダー配列に相当し、哺乳動物細胞においてタンパク質が翻訳された後、離脱する。療法薬として使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質の例は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列からなるもの、またはSEQ ID NO:5のアミノ酸30〜443からなるものである。本発明の他の態様において療法薬として使用するRANK:Fc融合タンパク質の配列は、SEQ ID NO:5のアミノ酸30〜443と同一であって、ただし残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されている。
【0030】
本明細書の記載に従って使用するのに適した他の可溶性RANKタンパク質誘導体は、オリゴマー形成性ペプチド、たとえばジッパードメインに融合した可溶性RANKポリペプチドを含む。ロイシンジッパーは、幾つかのDNA結合性タンパク質中に最初に同定され、fos、junおよびc−mycタンパク質中に存在する(Landschulz et al.,Science 240:1759(1988))。”ジッパードメイン”は、これらの(および他の)タンパク質中に存在する、タンパク質の多量体化に関与する保存ペプチドドメインを表わすのに用いる用語である。ジッパードメインは、4または5個のロイシン、イソロイシンまたはバリン残基が他のアミノ酸の間に分布した繰返し7残基反復を含む。ジッパードメインの例は、酵母転写因子GCN4およびラット肝中にある熱安定DNA結合性タンパク質中にみられるものである(C/EBP;Landschulz et al.,Science 243:1681(1989))。核癌遺伝子fosおよびjunの生成物は、優先的にヘテロ二量体を形成するジッパードメインを含む(O’Shea et al.,Science 245:646(1989);Turner and Tjian,Science 243:1689(1989))。これらの目的に有用なジッパー部分は、たとえばUSP5,716,805に記載されている。
【0031】
本発明の他の態様において、RANKアンタゴニストはヒトOPGまたはそのRANKL結合性誘導体である。ヒトOPGをコードするヌクレオチド配列をSEQ ID NO:7に示し、対応するアミノ酸配列をSEQ ID NO:8に示す。本発明方法に使用するのに適したOPGポリペプチドには、USP6,369,027(その全体を本明細書に援用する)に記載のものが含まれる。本明細書の記載に従って用いられるOPGポリペプチドには、SEQ ID NO:8に示したアミノ酸配列の誘導体であって、ポリペプチドがRANKL結合能を保持した状態で1以上のアミノ酸を付加、欠失、挿入または置換したものが含まれる。たとえばOPGは、SEQ ID NO:8のアミノ酸残基186〜401のうち全部または一部の欠失またはカルボキシ末端トランケーション;OPGのシステインに富むドメインの全部または一部の欠失;およびシステインに富むドメインの1以上のアミノ酸の交換を含むことができる。1態様において、OPGは1〜約10個のアミノ酸が成熟アミノ末端(アミノ酸残基22の位置)から欠失し、かつ所望により1〜約216個のアミノ酸が成熟カルボキシ末端から欠失している。トランケート形タンパク質の分析により、OPGの生物学的活性はSEQ ID NO:8の残基22〜185にある約164個のアミノ酸を含有するOPG部分により保持されることが示された。したがって、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含むOPGポリペプチドを用いて、本明細書に記載する目的で投与しうる療法用組成物を調製できる。前記OPGポリペプチドのいずれも、免疫グロブリン分子のFc領域と融合させることができる。全長OPGは自然に二量体または三量体を形成し、これらは生物学的活性をもち、本発明の目的で投与できる。
【0032】
本明細書に記載する目的に有用な他のRANKアンタゴニストには、小型の有機分子が含まれる。
本発明のさらに他の態様においては、内因性RANKまたはRANKL遺伝子発現レベルを低下させるように設計されたアンタゴニストが用いられる。そのようなアンタゴニストは、RANKまたはRANKL mRNA転写体の翻訳を阻害または阻止する周知のアンチセンス法またはリボザイム法;およびRANK若しくはRANKL遺伝子の転写を阻害する三重らせん法を用いて調製される。そのような分子の製造および使用は当業者に周知である。
【0033】
RANKアンタゴニストとして有用なアンチセンスRNAおよびDNA分子は、ターゲティングする内因性mRNAにハイブリダイズして翻訳を阻止することにより、mRNAの翻訳を直接遮断する作用をもつ。これは、RANKまたはRANKL mRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)、たとえばU.S.6,171,860に記載の抗RANKアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成できる。有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、mRNAの5’末端に相補的なもの、たとえばAUG開始コドンまでを含めた5’側−非翻訳配列が含まれる。しかしながら、RANKもしくはRANKL遺伝子転写体の5’側もしくは3’側−非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチド、またはコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドも使用できる。アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドの長さでなければならず、好ましくは6〜約50ヌクレオチドの長さである。これらのオリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾形であってよい(一本鎖または二本鎖)。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、幾つかの異なるタイプのものであってもよい。これらには、ヌクレオチドの”ギャップ”セグメントが結合ヌクレオチドの5’側と3’側の”ウイング”セグメント間にある第1タイプ、および”ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’末端または5’末端のいずれかにある第2の”開末端”タイプが含まれる(たとえばUSP5,985,664参照)。オリゴヌクレオチドを、たとえば塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖において修飾して、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改良することができる。オリゴヌクレオチドが他の付加基(appended groups)、たとえばペプチド(たとえば宿主細胞受容体をインビボでターゲティングするためのもの)、または細胞膜輸送を促進する剤、またはハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤、または挿入剤を含んでもよい。
【0034】
RANKまたはRANKLを発現する細胞へ送達するために、アンチセンスDNAまたはRNAを組織または細胞誘導部位へ直接注入してもよく、あるいは目的細胞をターゲティングするように設計した修飾アンチセンス分子(たとえば、ターゲット細胞表面に発現する受容体または抗原を特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス)を全身投与してもよい。1方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下に置いた組換えDNA構築体で、ターゲット細胞をトランスフェクションすることができる。そのようなベクターは、転写されて目的アンチセンスRNAを生成する限り、エピソーム状態にとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。ベクターは、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で既知の他のものであってよい。
【0035】
RANKまたはRANKL mRNA転写体を接触開裂するように設計されたリボザイム分子も、RANKまたはRANKL mRNAの翻訳およびRANKまたはRANKLポリペプチドの発現を阻止するために使用できる(たとえばWO90/11364またはUSP5,824,519参照)。本発明においてRANKに療法拮抗するのに使用できるリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム(Haseloff and Gerlach,1988,Nature,334:585−591)、RNAエンドリボヌクレアーゼ(以下、”Cech型リボザイム”)、たとえば天然にテトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)にみられ(IVS、またはL−19 IVS RNAとして知られる)、広く記載されているもの(たとえばWO88/04300;Been and Cech,Cell,47:207−216(1986)参照)が含まれる。リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドからなってもよく(たとえば安定性、ターゲティングなどの改良のため)、RANKまたはRANKLポリペプチドをインビボで発現する細胞へ送達すべきである。好ましい送達方法は、強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でリボザイムをコードするDNA構築体の使用を伴い、したがってトランスフェクションした細胞は内因性RANKまたはRANKLメッセンジャーを破壊するのに十分な量のリボザイムを生成する。
【0036】
本発明に有用な他のRANKアンタゴニストには、RANKまたはRANKLに特異的な抗体が含まれる。RANKアンタゴニストとして用いられる抗体は、それらのターゲットと特異的に免疫反応する。すなわちそれらは抗体の抗原結合性部位によりターゲットタンパク質に結合し(非特異的ではなく)、無関係なタンパク質に有意に結合することはない。したがって、RANKの特異的な抗体はRANKを結合するが、たとえば検出可能なほどにはRANKLに結合しないであろう。同様に、RANKLに特異的な抗体は検出可能なほどにはRANKに結合しないであろう。特異的結合性抗体は、ターゲットRANKまたはRANKLポリペプチド、たとえば本明細書に記載するもの、またはそのサブ部分、同族体およびバリアントを特異的に認識して結合するであろう。RANKまたはRANKLに特異的なアンタゴニスト抗体は、それぞれ内因性RANKまたはRANKLを結合し、したがってその各コグネイトへの結合に用いられる内因性ターゲットポリペプチドの量が減少するであろう。
【0037】
アンタゴニスト性抗RANK抗体が膜結合RANKの細胞外ドメインと結合すると、RANKの生物学的活性はトリガーされないであろう。したがって、たとえばそのような抗体はRANK発現細胞においてNF−κB活性の増大を誘導しないであろう。
【0038】
本発明方法に使用するのに適したRANKアンタゴニストには、RANKLに特異的な抗体が含まれる。そのような抗体は、本明細書に記載の方法または当技術分野でルーティンな他の方法により調製できる。ヒトRANKLをコードする核酸例のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:9に示し、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をSEQ ID NO:10に示す。ヒトRANKLは、推定47アミノ酸の細胞内ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸1〜47に相当)、21アミノ酸の膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸48〜68に相当)、および249アミノ酸の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317に相当)を含む。ヒトRANKLのRANK結合性ドメインは、EQ ID NO:10のほぼアミノ酸162からほぼアミノ酸317に相当する。SEQ ID NO:10のアミノ酸配列をもつ精製ポリペプチドまたはそのサブ部分を用いて、RANKLと特異的に結合してそれがRANKに結合する能力を遮断するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生できる。本発明の抗体を産生するのに用いられるRANKLポリペプチドを、所望により合成または精製を容易にする他の部分、たとえばロイシンジッパー、免疫グロブリンのFcドメイン、ポリ(His)6、FLAG(登録商標)、または他のタグと融合させてもよい。本発明の1態様において、抗RANKL抗体は、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317(RANKLの細胞外ドメインに相当)を含むポリペプチド中に存在するエピトープを指向する。RANKL特異的抗体がRANKLへの結合を遮断する能力は、いずれか簡便なアッセイ法、たとえばUSP6,242,2213に記載のもの、またはRANKLに曝露されたRANK発現細胞が仲介する生物学的活性を測定するいずれかのアッセイ法により判定できる。
【0039】
本発明の1態様において、抗体産生に用いられるRANKLポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ前記RANKLタンパク質のアミノ酸配列に対して約70%同一であり、本発明の他の態様において、それらは約80%同一であり、本発明のさらに他の態様において、それらは前記RANKLポリペプチドに対して約90%同一である。同一性%は、コンピュータープログラム、たとえばDevereux et al.(Nucl.Acids Res.12:387,1984)に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)から入手できるGAPコンピュータープログラムを用いて決定できる。RANKLタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はRANKLに由来するポリペプチド部分に基づいて計算される。
【0040】
同様に本発明の療法薬として使用するのに適したものは、そのような抗体の生物学的活性フラグメントである。たとえば抗体の生物学的活性フラグメントは、無傷の抗体と対比してトランケートしているが、それのターゲットを特異的に結合する能力およびそのターゲットとそれのコグネイトとの相互作用を遮断する能力は保持された、抗体タンパク質である。抗体の抗原結合性フラグメントにはFabおよびF(ab’)2フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。これらは常法により調製できる。
【0041】
本発明による療法用組成物に有用な抗体には下記のものが含まれるが、これらに限定されない:ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAB)、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、およびこれらのいずれかのエピトープ結合性フラグメント。ヒトRANKまたはRANKL中に存在するがネズミRANKまたはRANKL中には存在しないエピトープに特異的な、RANKアンタゴニストとして使用するモノクローナル抗体を選択できる。ネズミおよびヒトRANKの両方を結合する、またはネズミおよびヒトRANKLの両方を結合するモノクローナル抗体も、本発明の療法のためのRANKアンタゴニストとして使用できる。目的とする特異性をもつモノクローナル抗体を得る方法は当技術分野で周知であり、たとえばUSP6,017,729に記載のものである。本明細書に記載するRANKおよびRANKLポリペプチド、フラグメント、バリアントおよびRANK融合ポリペプチドを、RANKまたはRANKLと特異的に免疫反応する抗体の産生に際し免疫源として使用できる。
【0042】
RANKアンタゴニストの合成
精製した可溶形RANK、OPG、アンタゴニスト作用抗体、およびその同族体若しくは類似体などのタンパク質を含むRANKアンタゴニストは、そのアンタゴニストをコードするDNAの組換え転写生成物を発現するのに適した宿主/ベクター系を培養し、次いでこれを培地または細胞抽出物から精製することにより製造される。好ましくは少なくとも1つの発現制御配列に機能可能な状態で結合した本発明の単離核酸を含む宿主細胞は”組換え宿主細胞”であり、”形質転換”されたと言われる。モノクローナル抗体は標準法により調製できる。
【0043】
ポリペプチドであるRANKアンタゴニストを組換え発現させるために、そのアンタゴニストをコードする単離核酸を、発現制御配列、たとえばpDC409ベクター(Giri et al.,1990,EMBO J.,13:2821)または誘導体pDC412ベクター(Wiley et al.,1995,Immunity 3:673)に機能可能な状態で結合させることができる。pDC400系列のベクターは、一過性哺乳動物発現系、たとえばCV−1または293細胞に有用である。あるいは、単離核酸をpDC312、pDC316またはpDC317ベクターのような発現ベクターに結合させることができる。pDC300系列のベクターはすべて、SV40複製起点、CMVプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー、ならびにSV40ポリAおよび終止シグナルを含み、安定な哺乳動物発現系、たとえばCHO細胞またはそれらの誘導体に有用である。あるいは、内部ポリアデニル化シグナル、たとえばWO01/27299に記載のものをもつベクターを用いて、アンタゴニストをコードする核酸を発現させることができる。他の発現制御配列およびクローニング技術、たとえばpMT2またはpED発現ベクター(Kaufman et al.,1991,Nucleic Acids Res.19:4485−4490;およびPouwels et al.,1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,ニューヨーク州エルゼビル)およびGATEWAYベクター(Life Technologies;メリーランド州ロックビル)を用いて、ポリペプチドを組換え法で製造することもできる。GATEWAY系では、attB配列でフランキングされた本発明の単離核酸をインテグラーゼ反応によりGATEWAYベクター、たとえばattP配列を含むpDONR201と組み換えることができる。これにより、本発明の単離核酸を含むGATEWAY系のエントリーベクターが得られる。このエントリーベクターを、さらに他の適切に調製した発現制御配列、たとえば前記のpDC400およびpDC300系列のものと組み換えることができる。多数の適切な発現制御配列が当技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般法は、R.Kaufman,Methods in Enzymology 185:537−566(1990)にも記載されている。本明細書中で用いる”機能可能な状態で結合した”とは、適切な分子(たとえばポリメラーゼ)が存在するとき核酸がコードするポリペプチドが発現する状態で、本発明の核酸と発現制御配列が構築体、ベクターまたは細胞内に配置されていることを意味する。本発明の1態様として、核酸および/または発現制御配列がたとえば形質転換もしくはトランスフェクションまたは他の適切な方法で導入された組換え宿主細胞またはその子孫において、少なくとも1つの発現制御配列が本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。本発明の他の態様として、少なくとも1つの発現制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能な状態で結合して組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれている。本発明の他の態様においては、インビトロまたは組換え宿主細胞において、少なくとも1つの発現制御配列がトランス作用因子、たとえば転写因子の作用により、本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。
【0044】
RANKアンタゴニスト活性をもつポリペプチドの組換え発現に適した宿主細胞として、多数のタイプの細胞を使用できる。適切な哺乳動物宿主細胞には、たとえば下記のものが含まれる:COS−7系のサル腎細胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,Cell,23:175,1981)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞系、McMahan et al.(EMBO J.,10:2821,1991)に記載のアフリカミドリザル腎細胞系CV1由来のCV1/EBNA細胞系(ATCC CCL 70)、ヒト腎293細胞、ヒト上皮A431細胞、ヒトColo205細胞、形質転換した他の霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織、一次外植片のインビトロ培養により得られた細胞株、HL−60、U937、HaKまたはジャーカット細胞。あるいは、下等真核細胞、たとえば酵母、または原核細胞、たとえば細菌において、ポリペプチドを産生させることができる。適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)株、カンジダ(Candida)属spp、ピキア(Pichia)属spp、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の酵母株が含まれる。適切と思われる細菌株には、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の細菌株が含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌において調製する場合、機能性RANKアンタゴニストを得るためには、それらにおいて産生されるポリペプチドを、たとえば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により修飾する必要があるかもしれない。そのような共有結合は既知の化学的方法または酵素法により達成できる。
【0045】
ポリペプチドは、本発明の単離核酸を1以上の昆虫発現ベクター内で適切な制御配列に機能可能な状態で結合させ、昆虫発現系を用いることによっても製造できる。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系に関する材料および方法はキットの形で市販されている;たとえばInvitrogen、米国カリフォルニア州サイディエゴ(MaxBac(登録商標)キット)。そのような方法は、Summers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)、およびLuckow and Summers,Bio/Technology 6:47(1988)に記載されるように、当技術分野で周知である。
【0046】
本明細書に開示する核酸構築体に由来するRNAを用いる無細胞翻訳系も、ポリペプチドの製造に使用できる。
本発明のポリペプチドは、形質転換した宿主細胞を組換えポリペプチドの発現を支持するのに適した培養条件下で培養することにより製造できる。次いで得られた発現ポリペプチドをそのような培養から(すなわち培地または細胞抽出物から)既知の精製法、たとえば種々の塩類による選択的沈殿、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製できる。ポリペプチドの精製法には下記のものも含まれる:ポリペプチドに結合する剤を収容したアフィニティーカラム;コンカナバリンA−アガロース、ヘパリン−toyopearl(登録商標)もしくはChibacromブルー3GAセファロース(登録商標)などのアフィニティー樹脂上での1以上のカラム工程;フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルなどの疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う1以上の工程;あるいはRANKアンタゴニストの1以上のエピトープを特異的に結合する抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー。
【0047】
ポリペプチドRANKアンタゴニストを収穫するには、組換えタンパク質を培地中へ分泌する系からの上清をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットにより濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物を適切な精製マトリックスに付与できる。たとえば適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合したカウンター構造タンパク質またはレクチンもしくは抗体分子であってよい。あるいは、アニオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基をもつマトリックスまたは支持体を使用できる。マトリックスは、タンパク質精製に慣用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他のタイプのものであってよい。あるいは、カチオン交換工程を採用できる。適切なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーも本発明タンパク質の精製手段となる。
【0048】
アフィニティークロマトグラフィーは、RANKアンタゴニストおよびその同族体を精製するための有用な方法である。たとえば免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現するRANKは、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。さらに、オリゴマー形成性ジッパードメインを含むRANKタンパク質は、そのオリゴマー形成性ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製できる。RANKタンパク質に対するモノクローナル抗体も、当技術分野で周知の方法を用いるアフィニティークロマトグラフィー精製に有用である。リガンドを用いて、可溶性RANKタンパク質または他のRANKアンタゴニストのアフィニティー精製用アフィニティーマトリックスを調製することもできる。
【0049】
最後に、疎水性RP−HPLC媒体、たとえばペンダントメチル基その他の脂肪族基をもつシリカゲルを用いる1以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程を採用して、RANKアンタゴニストをさらに精製することができる。適切な方法には、Urdal et al.(J.Chromatog.296:171,1984)に記載の方法と類似のものが含まれる。以上の精製工程の幾つかまたは全部を多様な組み合わせで用いて、均質な組換えタンパク質を得ることもできる。
【0050】
細菌培養において産生された組換えタンパク質は、通常はまず細胞ペレットからの抽出、続いて濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程のうち1以上により単離される。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を採用できる。組換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞は、好都合な任意の方法で破壊できる。これには凍結−融解の繰返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。本発明タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を著しく簡単にする。
【0051】
組換え培養において合成されたタンパク質は、培養から本発明タンパク質を回収するために採用した精製工程に応じた量および性質の細胞成分(タンパク質を含む)の存在を特色とする。これらの成分は通常は酵母、原核細胞、またはヒト以外の高等真核細胞に由来するものであり、約1重量%未満程度の無害な汚染物質量で存在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養によれば、普通はタンパク質に付随する他のタンパク質(自然界で起源種中にみられる)を含まない本発明タンパク質を製造できる。
【0052】
療法
本発明は、新たな骨の形成を必要とする患者を処置する療法を提供する。これには、骨移植片レシピエント、靭帯移植片レシピエント、人工関節レシピエント、骨折患者、脊髄損傷を伴う患者、および癌の放射線療法コースを終了した患者が含まれるが、これらに限定されない。後者の患者には、本質的に癌が治癒した患者、すなわちRANKアンタゴニストによる処置を開始する時点で悪性組織を検出できない患者が含まれる。本発明の1態様においては、処置する時点では骨密度低下を生じていないが、骨損傷の早期修復または骨間隙の充填のために新生骨形成が必要である患者に療法を施す。RANKアンタゴニストによる処置が有益な他の患者には、急性敗血症性関節炎(ライター症候群を含む)、骨関節炎、骨軟化症(リケッチア症および壊血病を含む)、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病およびランゲルハンス細胞組織球増殖症などの症状を伴う患者が含まれる。これらの状態を処置するのに適したRANKアンタゴニストには、本明細書に記載する種々の可溶性RANKポリペプチドおよびRANKまたはRANKLに特異的な抗体が含まれる。使用できる他のRANKアンタゴニストには、オステオプロテゲリン、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【0053】
毎年数百万人の患者が骨移植を必要とする。そのような患者には、骨格欠損(先天性欠損を含む)を伴う患者、関節の損傷または不安定さを安定化するために関節癒合を必要とする患者、および骨の一部が失われて置換を要するほど骨損傷が著しい患者が含まれる。骨移植片レシピエントには、修正関節手術、骨腫瘍切除または口腔/顎顔面手術のため1以上の骨に間隙のある患者も含まれる。本発明の1態様において、骨移植患者には、処置の時点で異常な高レベルの破骨細胞活性がみられない患者、すなわち異常な速度の骨損失がみられない患者が含まれる。そのような患者には、たとえば事故被害者、癌の治療に成功してもはや癌を伴わない患者、美粧上の理由で自発的に骨再構築を受けている者、および骨格欠損の修正のため手術を受けている者が含まれる。骨格欠損を伴う患者には、たとえば先天的に骨変形した患者、骨関節炎を伴う患者、およびポリオウイルス感染症から回復した患者が含まれる。
【0054】
骨移植のためには、外科医が骨または合成材料を罹患領域に適合するように造形し、健康な骨を移植材料に対してピンまたはネジで適所に保持する。宿主の骨形成細胞が移植片中へ浸潤し、これにより新生骨、血球および軟組織が移植片マトリックスを充填して移植片を宿主骨へ接続するのに伴って、それらの内植を支持する構造枠組みが提供される。骨移植が成功すると最終的には、移植片を接続した宿主骨へ浸潤移植片が中実癒合を示すであろう。こうして移植片マトリックスの充填と既存の宿主骨への移植片癒合の両方により、新生骨が形成される。したがって骨移植片レシピエントには、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明により提供されるRANKアンタゴニストによる処置が有益であろう。
【0055】
同様に宿主骨への人工関節の固定は新生骨形成を必要とする処置であり、したがって人工関節の移植手術を受けた患者の処置には本発明の療法処置が有用である。人工関節は、たとえば骨関節炎、すなわち関節軟骨の変性や辺縁骨の肥大および滑膜の変化を特色とする症状を伴う患者にしばしば付与される。約20%の人工関節レシピエントが、20年の間に摩耗−挫滅による骨分解の結果、次第に人工関節が緩むのを経験している。ただし本発明の療法は、移植後、長く経ってから起きる補綴具の緩みに起因する骨損傷の軽減ではなく、移植したばかりの補綴具の組込みおよび固定を促進することを目標とする。本発明の処置は、補綴具設置の途中または直後に施される。本発明により処置する人工関節レシピエントに、1回目のRANKアンタゴニストを手術当日または人工関節移植後1〜6日以内または移植後1〜4週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に補綴具が患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。通常このプロセスは移植手術後、約1〜6か月以内に終了する。
【0056】
本発明の1態様においては、骨移植を受けた患者に、移植片マトリックスの浸潤および接続した宿主骨への移植片の中実癒合を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。人工関節レシピエントには、宿主骨および/または宿主腱もしくは靭帯への人工関節の結合を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。そのような患者に、移植片または補綴具の移植手術の前、途中もしくは直後、あるいは手術後に移植片の浸潤および中実癒合または補綴具結合が起きている期間の任意の時点で、RANKアンタゴニストを投与できる。
【0057】
さらに、靭帯移植を受けた患者においてRANKアンタゴニストを用いて骨への靭帯結合を増強する。これには膝傷害後に十字靭帯移植を必要とする患者が含まれるが、これに限定されない。成功すると、移植した靭帯は最終的に宿主骨に結合する。そのような結合には新生骨を含めた新生組織の形成が必要である。したがって、靭帯移植片の移植手術の前、途中もしくは直後、または手術後に宿主骨への移植片の結合が起きている期間の任意の時点で、RANKアンタゴニストの投与により靭帯移植片を処理できる。
【0058】
骨移植片または靭帯移植片レシピエントに、1回目のRANKアンタゴニストを手術当日または移植後1〜6日以内または移植後1〜4週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に移植片が浸潤を受けて患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。浸潤/結合プロセスは一般に手術後、約1〜6か月以内に終了する。
【0059】
前記療法の処理が十分であるかを、理学検査または種々のラジオグラフィー法[通常のX線撮影、ラジオグラフィーイメージ増強、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴イメージング(MRI)が含まれる]または他の任意の手段で担当医がモニターする。
【0060】
歯周再構築療法を用いて歯周骨欠損または歯周傷害を修復し、あるいは新生骨形成を必要とする頭蓋顎顔面手術を強化することができる。さらに、歯槽裂を修復するための骨移植は長い間、唇および歯槽の片側性および両側性披裂を伴う者の治療と一体であった。本発明の療法薬を投与すると、そのような患者における歯周再構築を促進できる。
【0061】
脊髄損傷後にはしばしば全身骨損失が起きる。この骨損失は、股関節または四肢の骨を含めた骨折しやすい脆弱骨の発生をもたらす可能性がある。そのような患者は、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明のRANKアンタゴニストによる処置が有益となる可能性がある。本発明の1態様においては、脊髄損傷を受けた患者に新生骨形成を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。RANKアンタゴニストは、そのような患者に傷害直後に、またはその後の任意の時点で投与でき、そのような傷害の治療に用いられる理学療法または他の投薬と組み合わせて投与できる。
【0062】
本発明はさらに、放射線療法に伴う骨損失を生じた癌患者の骨再生療法を提供する。放射線療法に伴う骨損失は、腫瘍の存続がない状態でも起きる。すなわち腫瘍の除去に成功した場合ですら骨損失が起きる可能性がある。このタイプの骨損失は頭頸部癌の放射線治療に伴うことが多いが、他のタイプの癌についても起きる可能性がある。この状態の処置には、放射線療法コースが終了した後のRANKアンタゴニスト投与を伴い、この状態の管理に用いられる他の処置、たとえば骨移植と併用してもよい。
【0063】
前記の各療法について、新生骨形成を増強するのに有効な量および頻度でアンタゴニストを投与する。
併用療法
本発明は、RANKアンタゴニストと、種々の可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカイン、または他の破骨細胞/骨芽細胞調節分子、または骨損失の再生を必要とする患者の処置に用いられる他の薬物との共投与をも考慮する。”共投与”には、組合わせの各成分による同時または逐次処置、および薬物を交互に使用する方式、または1成分を長期間投与し、他の成分を間欠的に投与する方式が含まれる。そのような他の薬物には、たとえばビスホスホナート、または1種類より多いRANKアンタゴニストの共投与による使用が含まれる。共投与される薬物の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない:抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、DMARD、種々の全身化学療法、ならびに非ステロイド系抗炎症薬、たとえばCOX IまたはCOX II阻害薬。
【0064】
有用な組合わせには、RANKアンタゴニストと炎症反応に関連するサイトカインTNFαのアンタゴニストとの共投与が含まれる。TNFαを単独で用いて前記状態のいずれも処置でき、あるいはRANKアンタゴニストと併用してもよい。使用できるTNFα阻害薬には、たとえばTNFα受容体(TNFR)の細胞外領域を含む可溶性タンパク質が含まれ、これらはTNFR IまたはIIその他のTNFRから誘導できる。これらの目的に有用なTNFα阻害薬はエタネルセプト(etanercept)である。これはp75 TNFα受容体の細胞外部分2分子の二量体であり、各分子は235アミノ酸のTNFR由来ポリペプチドがヒトIgG1の232アミノ酸Fc部分に融合したものからなる。エタネルセプトは現在Immunex Corporationから商品名ENBREL(登録商標)で販売されており、一般に週1〜3回、皮下注射により25もしくは50mg/回の均一用量または5〜12mg/m2の用量で投与される。他の適切なTNFα阻害薬には、TNFαに対する抗体(ヒト化抗体を含む)が含まれる。RANK阻害薬との共投与に用いるヒト化抗体の例は、インフリキシマブ(infliximab)(CentocorがREMICADE(登録商標)として販売)であり、これはキメラIgG1κモノクローナル抗体である。他の適切な抗TNFα抗体には、ヒト化抗体D2E7およびCDP571、ならびにEP 0 516 785 B1、U.S.5,656,272、EP 0 492 448 A1に記載の抗体が含まれる。さらにTNFαは、TNFαの競合阻害薬として作用するTNFα由来ペプチド(たとえばU.S.5,795,859またはU.S.6,107,273に記載のもの)、エタネルセプト以外のTNFα−IgG融合タンパク質、たとえばp55 TNFα受容体の細胞外部分を含有するもの、IgG融合タンパク質以外の可溶性TNFR、または内因性TNFαレベルを低下させる他の分子、たとえばTNFα変換酵素の阻害薬(たとえばU.S.5,594,106参照)、またはペントキシフィリンもしくはサリドマイドなどの小分子の投与により阻害できる。
【0065】
同様に、炎症性サイトカインIL−1の阻害薬を単独で用いて前記のいずれかの状態を処置でき、あるいはRANKアンタゴニストと共投与できる。適切なIL−1阻害薬には、たとえば下記のものが含まれる:IL−1の受容体結合性ペプチドフラグメント、IL−1(IL−1αもしくはIL−1βまたは他のIL−1ファミリーメンバー)に対する抗体、IL−1受容体I型に対するアンタゴニスト抗体、ならびにIL−1に対する受容体の全部もしくは一部を含む組換えタンパク質またはそのバリアント:遺伝子修飾によるムテイン、多量体形および徐放性製剤を含む。他の有用なIL−1アンタゴニストには、IL−1raポリペプチド、IL−1β変換酵素(ICE)阻害薬、IL−1結合形のI型IL−1受容体およびII型IL−1受容体、ならびにIL−1トラップとして知られる療法薬が含まれる。IL−1raポリペプチドには、US5,075,222に記載される形のIL−1ra、ならびにU.S.5,922,573、WO91/17184、WO92 16221およびWO96 09323に記載の修飾形およびバリアントが含まれる。IL−1β変換酵素(ICE)阻害薬には、PCT特許出願WO91/15577;WO93/05071;WO93/09135;WO93/14777およびWO93/16710;ならびにEP 0 547 699に記載のものを含めたペプチジルおよび小分子ICE阻害薬が含まれる。非ペプチジル化合物には、WO95/26958、U.S.5,552,400、U.S.6,121,266およびDolle et al.,J.Med.Chem.39:2438−2440(1996)に記載のものが含まれる。他のICE阻害薬は、USP6,162,790、6,204,261、6,136,787、6,103,711、6,025,147、6,008,217、5,973,111、5,874,424、5,847,135、5,843,904、5,756,466、5,656,627、5,716,929に記載されている。IL−1結合性形のI型IL−1受容体およびII型IL−1受容体はU.S.4,968,607、US4,968,607、US5,081,228、U.S.Re 35,450、U.S.5,319,071および5,350,683に記載されている。IL−1トラップはWO018932に記載されている。
【0066】
さらに、適切なIL−1アンタゴニストには、抗体分子とIL−1アンタゴニスト分子の両方の部分を含むキメラタンパク質が含まれる。そのようなキメラ分子は単量体、二量体またはより高次の多量体を形成してもよい。他の適切なIL−1アンタゴニストには、IL−1シグナリング受容体IL−1R I型に競合結合できるIL−1由来のペプチドが含まれる。
【0067】
本発明方法は、IL−1(特にIL−1β)を結合してIL−1信号伝達を遮断し、これによりIL−1(特にIL−1β)の前炎症作用および免疫調節作用を妨害する形のII型IL−1受容体を使用できる。U.S.5,350,683には、II型IL−1受容体ポリペプチドが記載されている。有用な形のII型IL−1受容体ポリペプチドには、IL−1(特にIL−1β)結合能を保持したトランケート形可溶性フラグメントが含まれる。IL−1アンタゴニストとして有用な可溶性のII型IL−1受容体分子には、たとえば天然分子の膜貫通領域を欠如し、かつIL−1(特にIL−1β)を結合しうる、天然II型IL−1受容体の類似体またはフラグメントが含まれる。
【0068】
II型IL−1受容体に由来するアンタゴニスト(たとえばIL−1βを結合する可溶形)はIL−1に対して細胞表面のIL−1受容体と競合し、したがってIL−1が細胞に結合するのを阻害し、これによりその生物学的活性を発現するのを阻止する。可溶性II型IL−1受容体、またはIL−1もしくはIL−1βのフラグメントの結合は、ELISAその他の好都合なアッセイ法によりアッセイできる。注射する場合、成人1人当たりの可溶性II型IL−1受容体の有効量は1〜20mg/m2、好ましくは約5〜12mg/m2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は5〜100mg/回、より好ましくは20〜50mg/回であろう。
【0069】
本発明の実施に適した可溶性II型IL−1受容体ポリペプチドまたはフラグメントを第2ポリペプチドと融合させて、キメラタンパク質を形成してもよい。そのようなキメラタンパク質の1態様において、第2ポリペプチドはキメラタンパク質による二量体、三量体またはより高次の多量体の自然形成を促進するものであってよい。これらはIL−1分子を結合して、IL−1シグナリングを促進する細胞結合受容体への結合を阻止することができる。アンタゴニストとして用いるキメラタンパク質は、抗体分子と可溶性II型IL−1受容体の両方の部分を含有するタンパク質であってよい。
【0070】
さらに、本発明により投与される療法薬は、骨細胞の移動、増殖および分化を促進する合成または天然生物材料を罹患骨へ局所適用するのと併用できる。
骨密度モニタリングのためのアッセイ法
本明細書に記載する種々の処置を施す際、処置の開始時および処置の途中で患者の骨密度を測定することにより、処置の充足度をモニターするのがしばしば好都合である。そのような患者において、骨密度を標準法により測定する。これには、たとえば単一光子吸光光度法、二光子吸光光度法、二エネルギーX線吸光光度法、定量コンピューター断層撮影法およびラジオグラフィー吸光光度法が含まれる。モニタリングに有用な方法は二エネルギーX線吸光光度法である。同一骨の反復骨密度測定により、医師は処置中の骨形成速度を推定でき、したがってRANKアンタゴニスト投与の量および頻度を調整して骨形成を最適化できる。有効なRANKアンタゴニスト投与方式では、たとえば少なくとも2%、より好ましくは少なくとも5%、最も好ましくは少なくとも10%以上の骨密度増大が誘導されるであろう。
【0071】
処置期間中、骨形成が増大すると期待され、したがって任意の好都合な間隔で骨密度を反復測定することにより処置の充足度をモニターできる。たとえば、1週間毎、2週間毎、3週間毎、1カ月毎、3カ月毎、またはより長い月毎、もしくはより少ない頻度で密度を測定してもよい。
【0072】
投与様式
療法用として、RANKアンタゴニストを個体、好ましくはヒトに、適応症に適切な様式で処置のために投与する。全身投与は、一般に骨成長の全般的促進が必要な適応症の処置、たとえば脊髄傷害患者または放射線療法レシピエントを処置する際に適切である。あるいは、RANK/RANKLアンタゴニストを局所適用できる。これは移植片レシピエントに適切であるが、これらの患者を所望により全身処置してもよい。そのような患者には、RANKアンタゴニストを所望により手術の時点で移植片に直接適用してもよい。局所投与の手段には、たとえば局所注射、またはこの目的に適した徐放性マトリックス(多数が知られている)と混和もしくは重合したアンタゴニストの適用が含まれる。
【0073】
本発明はさらに、多数の疾患を処置するための医薬の製造における、RANKアンタゴニストおよびRANKアンタゴニストと共投与される薬物の使用を提供する。RANKアンタゴニストおよび他の薬物を配合して、有効量のアンタゴニストを含む療法用組成物にすることができる。本発明の1態様においては、RANKアンタゴニスト活性をもつ精製した可溶性タンパク質を生理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物の形で、療法薬を投与する。そのようなキャリヤーは、用いる投与量および濃度でレシピエントに対し無毒性のものである。医薬組成物に用いるRANK/RANKL相互作用の阻害薬をポリエチレングリコール(PEG)、金属イオンと複合体形成させ、あるいはポリマー化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどに取り込ませ、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層もしくは多層ビヒクル、赤血球ゴーストまたはスフェロプラストに取り込ませることができる。PEGと複合体形成したタンパク質は、既知の方法、たとえばUSP5,849,860、USP5,766,897に記載の方法、または他の適切な方法で調製できる。リポソーム形成に適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム配合物の調製は当業者が容易になしうるものであり、たとえばUSP4,235,871;USP4,501,728;USP4,837,028;USP4,737,323;およびUSP5,858,397に開示されている。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え、したがって意図する用途に従って選択されるので、キャリヤーの特性は選択する投与経路に依存するであろう。
【0074】
本発明の1態様においては、徐放形のRANKアンタゴニストを使用する。本発明方法に使用するのに適した徐放形には、溶解速度の遅い生体適合性ポリマー(たとえばU.S.6,036,978に記載のアルギナート微粒子)に封入された、徐放性ポリマー(局所適用ヒドロゲルを含む)と混和した、および/または生体適合性半透過性移植片に取り込ませた、可溶性RANKポリペプチド、オステオプロテゲリンおよびアンタゴニスト性抗RANKまたは抗RANKL抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【0075】
1回当たりのRANKアンタゴニスト投与量は、使用するアンタゴニストおよび投与様式に応じて異なるであろう。アンタゴニストが可溶性RANKであり、注射により投与される場合、成人1人当たりの有効量は0.5〜20mg/m2、好ましくは5〜12mg/m2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は5〜100mg/回であろう。皮下注射により投与される均一量の用量範囲例は、5〜25mg/回、25〜50mg/回および50〜100mg/回である。特に慢性症状には選択した量を反復投与できる。あるいは、処置の進行に伴って1回当たりの量を増減してもよい。小児患者(4〜17歳)に適切な投与方式は、0.4mg/kg、最大量25mg、週1回以上の皮下注射を伴う。RANKまたはRANKLに対する抗体をRANKアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲には0.1〜20mg/kg、0.75〜7.5mg/kgおよび1〜10mg/kg(体重)が含まれる。ヒト化抗体、すなわち抗体分子の抗原結合性部分のみがヒト以外の供給源に由来する抗体が望ましい。抗体を注射(静脈内注入を含む)により投与できる。適量は試験により決定できる。投与の量および頻度は、もちろん処置される適応症の性質および重症度、目的とする応答、患者の状態などの要因に依存するであろう。
【0076】
通常、RANKアンタゴニストを含む医薬組成物の調製は、療法用タンパク質と、緩衝剤、酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物(ブドウ糖、ショ糖またはデキストリンを含む)、キレート化剤、たとえばEDTA、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤とを混和することを伴う。中性緩衝化食塩水または同種血清アルブミンは、適切な希釈剤の例である。好ましくは、適切な賦形剤溶液(たとえば無菌の水またはショ糖溶液)を希釈剤として用いて、製品を凍結乾燥品として配合する。本発明の1態様は、凍結乾燥RANKアンタゴニストを投与単位の形で包装することを伴い、これを再構成すると1包装当たり1〜3回分が得られる。
【0077】
本発明の化合物は、所望により一般的な無毒性の医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位剤形で、経口、非経口、舌下、吸入、噴霧、直腸または局所投与できる。局所投与には、経皮投与、たとえば経皮パッチまたはイオントフォレーゼ器具の使用も含まれる。注射が好ましい投与経路であり、これには非経口注射が含まれる。非経口注射には、皮下、髄腔内、クモ膜下、眼窩内、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内への注射および注入法が含まれる。RANKアンタゴニストを含む組成物を、ボーラス注射または連続注入により投与できる。有用な全身投与経路は皮下注射および静脈内点滴である。
【0078】
本発明の他の態様においては、RANKアンタゴニストを発現するように遺伝子修飾した細胞を用いる。たとえば可溶性RANKまたはRANKアンタゴニスト活性をもつ他のタンパク質をコードするDNAを、患者の身体から採取した細胞に導入し、次いでその細胞を患者に戻す。DNAは、アンタゴニストの発現を促進する形で、すなわちコード領域を細胞での発現のために機能可能な状態で適切な調節要素に結合させて、レシピエント細胞に導入される。DNAを適切なベクター、たとえばレトロウイルスもしくはアデノウイルスベクターにより、またはリポソームに封入して導入できる。この薬物投与様式に適した細胞には、罹患組織へ戻る細胞、たとえば骨髄細胞(造血前駆細胞を含む)が含まれる。他の同様な態様においては、RANKアンタゴニストをコードするDNAの導入によりアンタゴニストを発現するように細胞系を修飾し、次いでその細胞を患者に導入する。そのような細胞は、RANKアンタゴニストの安定発現または一過性発現を促進するDNA構築体で形質転換できる。あるいはアンタゴニストをコードするDNAをリポソームに封入して患者に導入できる。これを全身投与するか、あるいは罹患組織へ局所投与することができる。
【0079】
処置すべき疾患の種々の動物モデルが当技術分野で知られている;したがって、RANKアンタゴニストの最適な投与量および投与経路を判定するためのルーティン実験を、まず動物モデルに、次いでヒト患者に適用できる。新生骨が高品質であって正常な骨と類似するように、投与方式を調整するのが適切であろう。個々の患者に対する具体的な投与方式は、用いる具体的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物組合わせ、および患者の症状の重症度を含めた多様な要因に依存するであろう。最適結果を得るのに必要な投与量および投与頻度は、担当医が調整するであろう。
【0001】
本出願は、35 U.S.C.§119のもとに米国仮特許出願No.60/291,919の優先権を主張し、その開示内容を本明細書に援用する。
発明の技術分野
本発明は一般に、新生骨の形成を必要とする病的状態におけるRANK/RANKL相互作用のアンタゴニストの療法使用に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
RANK(NF−κBの受容体アクチベーター)およびそのリガンド(RANKL)は、免疫応答および骨代謝において重要な役割を果たす受容体/リガンド対である。RANKおよびRANKLはネズミおよびヒトの両方においてクローニングおよび解明された(たとえばU.S.6,017,729、WO98/25958、EP0 873 998、EP0 911 342、U.S.5,843,678、WO98/46751およびWO98/54201参照)。
【0003】
RANKLはRANKだけでなく、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーであるオステオプロテゲリン(OPG)と呼ばれる天然RANKデコイタンパク質にも結合することが示されている(たとえばU.S.6,015,938およびWO98/46751参照)。OPGは可溶性分子であり、骨代謝におけるその役割はHofbauer et al.,J Bone Min Res 15(1):2−12(2000)に概説されている。RANK/RANKLおよびOPGの生物学的作用についての観点は、さらにたとえばSimonet et al.,Cell 89:309−319(1997);Kodaira et al.,Gene 230:121−27(1999);U.S.5,843,678;およびU.S.6,015,938に述べられている。RANKと対比してOPGは、”TNF関連アポトーシス誘導リガンド”、すなわち”TRAIL”として知られる第2結合パートナーをも結合する。TRAILはトランスフォームした多様なヒト細胞系においてインビトロでアポトーシスを誘導し、ヒト腫瘍の治療におけるその療法能について試験が行われている。OPGは、RANKLに結合してこれがRANKを結合するのを阻害することによりRANK活性を抑制する作用をもち、骨損失を特色とするさまざまな状態に対する療法薬として提唱されている(WO98/46751;WO01/03719;WO01/16299;WO01/17543;およびWO01/03719)。
【0004】
I型膜貫通タンパク質RANKは、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーである(たとえばU.S.6,017,729参照)。全長ヒトRANKポリペプチドは616個のアミノ酸をもつ。ヒトRANKLは、腫瘍壊死因子リガンドファミリーの317アミノ酸のタンパク質であり、シグナルペプチドを欠如し、短い細胞質ドメインおよびRANKと特異的に結合する細胞外領域をもつ、II型膜タンパク質である(たとえばU.S.6,017,729参照)。RANKLは”オステオプロテゲリン結合性タンパク質”、”破骨細胞形成(osteoclastogenesis)分化因子”および”TRANCE”とも呼ばれる(たとえばKodaira et al.,1999;Yasuda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:3597(1998);およびWong et al.,J.Biol.Chem.,273(43):28355−59(1998)参照)。
【0005】
RANKタンパク質は、種々のTNF受容体関連因子(TRAF)との相互作用により細胞内事象を起こさせる(たとえばGalibert et al.,J.Biol.Chem.,273(51):34120−27(1998);Darnay et al.,J.Biol.Chem.,273(32):20551−55(1998);およびWong et al.,1998参照)。たとえばRANKとそのリガンドRANKLの相互作用によりRANKがトリガーされると、TRAF仲介による細胞内事象が活性化し、その結果、免疫系の細胞において広範に用いられる遍在性転写因子である転写因子NF−κBがアップレギュレートされる。
【0006】
RANKは主に、上皮細胞、BおよびT細胞系、線維芽細胞、樹状細胞ならびに破骨細胞およびそれらの前駆体の表面に発現する。可溶形でも存在するRANKLは、主に造血組織、たとえば骨髄、胸腺および脾臓、ならびにT細胞および骨芽細胞系列の細胞に発現する。RANK/RANKL相互作用により仲介される信号は、骨再吸収に関与する細胞である破骨細胞の分化および機能の刺激に関係する(たとえばLancey et al.,Cell 93:165−76(1998);Yasuda et al.,1998参照)。このプロセスは、RANKLを発現する細胞と破骨細胞前駆体の直接接触に関係すると思われる。したがって、RANKL結合を遮断するオステオプロテゲリンまたは可溶形RANKを投与して破骨細胞活性を阻害し、これにより、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、リウマチ性関節炎、補綴具の緩みなどに関連する骨損失速度を低下させることができると提唱された(たとえばWO98/46751、WO99/58674、WO01/16299およびHofbauer et al.,2000参照)。
【0007】
RANKタンパク質に由来するRANKアンタゴニストのインビボ作用について幾つかの研究が報告された(たとえばUSP6,015,938およびWO98/46751参照)。そのほか、ヒト疾患のマウスモデルにおいて可溶性RANKの投与により骨破壊が低減したと報告されている(Oyajobi et al.,J Bone Min Res 15(suppl.1):S176,Abstract #1151(Sep.,2000);Oyajobi et al.,Cancer Res 61:2572−78(2001);Childs et al.,Abstract,Orthopedic Research Society,サンフランシスコ,2001参照)。
【0008】
骨疾患を治療するための療法は近年著しく改善された(Rodan and Martin,Science 289:1508−1514(2000)参照)。たとえば、骨沈着を促進するペプチドが同定された(WO00/75185)。しかし、新たな骨の形成が望ましい多様な病的状態に対するより良い療法を提供することが、依然として要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
発明の概要
本発明は、新たな骨の形成が要求される多様な病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の療法薬および組成物は、実際に骨損失が起きていない患者に骨形成を刺激するために投与できる。これらの療法薬が有益な患者には、以前に骨密度低下を生じたことがあるが現在は骨損失がみられない患者が含まれる。これらの処置が有益な患者には、その症状が骨密度低下を特色とするものではないにもかかわらず新たな骨の形成が要求される患者、たとえば外傷性傷害のため骨を失った事故被害者が含まれる。
【0010】
本発明の方法および組成物に使用するのに適したRANKアンタゴニストには、下記のものが含まれる:RANKを特異的に結合でき、かつRANKをトリガーしない抗体;RANKLを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの翻訳または転写を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;オステオプロテゲリンポリペプチド;およびRANKLを結合できる可溶性RANKポリペプチド。RANKアンタゴニストとして有用な可溶性RANKタンパク質は、RANKポリペプチドの細胞外領域のRANKL結合性部分を含むであろう;これには、RANKL結合能を保持する限り、対立遺伝子バリアントおよびムテイン(mutein、変異タンパク質)が含まれる。
【0011】
本発明の具体的態様には下記のものが含まれる。
本発明は、下記の患者にRANKアンタゴニストを投与する処置方法を提供する:急性敗血症性関節炎、骨軟化症(リケッチア症および壊血病を含む)、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷の病的状態のうちいずれかを伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者。RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。本発明方法に使用されるRANKアンタゴニストは、RANKがNF−κBを誘導する能力を阻害できるものである。RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質であり、RANKアンタゴニストは、下記のいずれかである:SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;またはSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチド。この方法の1態様において、患者は処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない。RANKアンタゴニストを投与している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターすることができる。本発明方法に使用するのに適したRANKアンタゴニストの1つは、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチド(ヒトRANKLの細胞外ドメイン)を特異的に結合できる抗体である。同様にRANKアンタゴニストとして使用するのに適したものは、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチドである。
【0012】
本発明の他の態様は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者を処置する方法を提供する。この方法では、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。この方法で使用するRANKアンタゴニストは、RANKがNF−κBを誘導する能力を阻害できるものである。RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質である。この方法において、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであり、該可溶性RANKポリペプチドはSEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性をもつ。本発明の1態様において、患者は処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない。この方法の他の態様において、可溶性RANKポリペプチドは、SEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその相補体とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされ、その際ストリンジェント条件は6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄を含む。1態様において、可溶性RANKポリペプチドはSEQ ID NO:10のアミノ酸33〜196を含む。さらに他の態様において、可溶性RANKポリペプチドはさらに、免疫グロブリンFcドメイン、FLAG(商標)タグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む。1態様において、可溶性RANKポリペプチドは免疫グロブリンFcドメインに共有結合している。本発明の1態様において、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:5のアミノ酸30〜433からなるRANK:Fc融合タンパク質であるか、あるいはこの融合タンパク質のバリアントであって、残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されたものである。処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【0013】
本発明は、人工関節レシピエント、骨移植片レシピエントおよび靭帯移植片レシピエントである患者を処置する方法であって、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含む方法をも提供する。その際、RANKアンタゴニストは下記のいずれかである:SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであって、SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有する可溶性RANKポリペプチド;SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;またはSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチド。たとえば、RANKアンタゴニストはSEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含む可溶性RANKポリペプチドである。可溶性RANKポリペプチドをRANKアンタゴニストとして使用する場合、アンタゴニストタンパク質はさらに他の部分、すなわち免疫グロブリンFcドメイン、商標FLAGタグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせを含むことができる。本明細書の記載に従って使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列からなるもの、またはこのタンパク質のバリアントであって、残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されているものである。これらの患者を処置する際、1回目のアンタゴニストを、人工関節、骨移植片または靭帯移植片の外科移植の1カ月以内に投与する。この方法の1態様においては、処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の詳細な説明
本発明は、新生骨形成の必要性を特色とする病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。好ましくは患者はヒトであるが、本発明方法はペットおよび農場動物などの家畜を含めたいかなる動物にも適用できる。本明細書中で用いる”新生骨形成”とは、患者の1以上の骨における硬質石灰化骨組織の量の正味増加を意味する。本発明方法は、新生骨形成を刺激するのに有効な量のRANKアンタゴニストを、その必要がある患者に投与することを伴う。RANKアンタゴニストは、好ましくは患者と同一種の動物に由来するタンパク質である。”RANKアゴニスト”は、RANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を誘導する薬剤、たとえばNF−κB活性を誘導する薬剤である。本明細書中で用いる”RANKアンタゴニスト”は、RANKとRANKLの相互作用を遮断または低減する薬剤であり、これにはRANKまたはRANKLの合成を阻害する薬剤が含まれる。RANKアンタゴニストは、一般にRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を低減する。ある態様において、RANKアンタゴニストは可溶性RANKを含むか、あるいはRANKまたはRANKLに対する抗体であって、RANKとRANKLの相互作用を阻害もしくは遮断し、かつRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性を刺激しない抗体を含む。他の適切なRANKアンタゴニストは、OPGまたはその可溶性誘導体であり、これには二量体またはより高次の多量体が含まれる。RANKアンタゴニストは、一般にRANKをトリガーするのに関連する生物学的活性のうち少なくとも1つを阻害または遮断するであろう。
【0015】
たとえば膜結合もしくは可溶性RANKLとの接触またはアゴニスト作用性抗RANK抗体との接触によりRANKがトリガーされると、RANK仲介による細胞性応答が誘発される;これはRANKタンパク質の細胞質テイルのコンホメーション変化を誘導する受容体オリゴマー化により起きる。これらの細胞性応答には、免疫系の細胞に広く用いられる遍在性転写因子である転写因子NF−κBの活性化、c−jun N末端キナーゼ(JNK)の活性化、またはアクチベータータンパク質1(AP−1)の活性化を含めることができる;たとえばGalibert et al.,J Biol Chem 273:34120−27(1998)またはLee et al.,Molec Pharmacol 55:1536−45(2000)参照。破骨前駆細胞においてRANKがトリガーされると、前駆細胞から成熟破骨細胞への分化が誘導される。RANKが活性化されると、成熟破骨細胞の骨再吸収活性も高まる。RANK活性のアンタゴニストは、適切なアッセイ系、たとえば破骨細胞の生物学的活性を測定するアッセイにおいて、上記のようなトリガーされたRANKの表示(manifestation)のいずれかをそれらが阻害または阻止する能力により同定できる。
【0016】
推定RANKアンタゴニストがRANKと拮抗する活性をもつかを判定するアッセイを実施できる。ある分子がRANKと拮抗する能力は、たとえばRANKを発現する細胞においてNF−κBの量または活性を測定するアッセイ法(たとえばUSP6,017,729に記載)、またはJNKもしくはAP−1の量または活性を測定するアッセイ法(たとえばLee et al.(2000)に記載)によって容易に判定できる。NF−κBのアッセイにおいては、RANKを発現する細胞、たとえば293/EBNA細胞を用いる。293/EBNA細胞は、エプスタイン・バーウイルス核抗原−1をコードする遺伝子で293細胞系をトランスフェクションすることにより誘導した細胞系である。そのようなアッセイを実施するためには、293/EBNA細胞その他のRANK発現被験細胞を、推定RANKアンタゴニストの存在下または不存在下でRANKトリガーに曝露する。RANKトリガーは、RANKLもしくは可溶性RANKLを発現する細胞、またはRANK活性を増強する抗体であってよい。推定アンタゴニストに曝露した後、トリガーされた被験細胞におけるNF−κBの量または活性を測定する。RANKがトリガーされるのを推定アンタゴニストが阻害した場合、トリガーされた被験細胞におけるNF−κBの量または活性は増大しないであろう。推定RANKアンタゴニストに曝露した被験細胞において、その分子に曝露しなかった細胞より少量のNF−κBが検出されれば、その分子はRANKアンタゴニストであると判定される。あるいは、JNKまたはAP−1の活性化をRANK活性の尺度として利用できる。RANKアンタゴニスト活性を測定するのに適した他のアッセイ法には、たとえば酵素イムノアッセイ法もしくはドットブロット法、固定化もしくは細胞表面RANKLへの標識RANKの結合を漸増量のそのフラグメントの存在下で検出するアッセイ法、あるいは標識RANKLフラグメントの存在下で固定化もしくは細胞表面RANKへの結合を検出するアッセイ法が含まれる。そのような方法は当技術分野で周知である。
【0017】
ネズミRANKをコードするヌクレオチド配列の例をSEQ ID NO:1に示し;ヒトRANKをコードするヌクレオチド配列の例をSEQ ID NO:3に示し;対応する全長RANKポリペプチドをそれぞれSEQ ID NO:2および4に示す。ヒトRANKタンパク質は616個のアミノ酸残基をもち、一方ネズミRANKは625個のアミノ酸をもち、それぞれRANKLを結合できる細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。RANKの細胞質ドメインは、TRAF1、2、3、5および6を結合できる。ヒトRANKの細胞外ドメインはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213に相当し、ネズミRANKの細胞外ドメインはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214に相当する。ヒトRANKタンパク質は、SEQ ID NO:4の残基24〜33の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸29の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。ネズミRANKタンパク質は、SEQ ID NO:2の残基25〜35の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸30の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。
【0018】
ヒトおよびネズミRANKおよびRANKLをコードするDNAの単離がUSP6,017,729に記載されており、これを本明細書に援用する。本発明の実施に有用なRANKアンタゴニストには、RANKLを結合でき、かつSEQ ID NO:2またはNO:4に示すRANKタンパク質の細胞外領域のRANKL結合性部分をコードする核酸(またはその相補体)にストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされる、可溶性RANKポリペプチドが含まれる。そのようなRANKアンタゴニストは、療法薬として使用した場合に該タンパク質の合成、精製または臨床有効性を高めるヘテロロガスシグナルペプチドもしくは免疫グロブリンFc領域または他のいずれかの部分をさらに含むことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の選択方法は当技術分野で周知であり、多数の方法が記載されている。たとえばSambrook et al.(Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー;1989);p.9.50−9.57および11.45−11.57参照;これを本明細書に援用する)。一般に、複雑な核酸を標識ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、それらを使用前にアルカリ処理または機械的剪断によりフラグメント化して、長さ50〜600ヌクレオチドのフラグメントを得る。長さが約50ヌクレオチドを超えるプローブについては、ストリンジェント条件は融解温度(Tm)より20〜25℃低い温度でハイブリダイズすることにより達成され、一方、オリゴヌクレオチド(一般に長さ14〜30ヌクレオチド)については、ストリンジェント条件は一般に融解温度より5〜10℃低い温度でハイブリダイズすることを伴う(Sambrook et al.,p.11.45参照)。長さが約14ヌクレオチドを超えるプローブについては、Tmは式Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)を用いて妥当な精度で計算できる。式中、Nはハイブリッドデュプレックス中の塩基数であり、[Na+]はハイブリダイゼーション緩衝液のナトリウムイオン濃度である(1×SSCの[Na+]は0.165M)(Sambrook et al.,p.11.46参照)。ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを添加する場合、Tm(したがって最適ハイブリダイゼーション温度)は各1%ホルムアミドについて約0.63℃低下する(Sambrook et al.,p.9.51参照)。ターゲット核酸を固体支持体に固定する場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、たとえば6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄により達成できる。あるいは、ストリンジェント条件は、6×SSCプラス50%ホルムアミド中、42℃でのハイブリダイゼーション、続いて2×SSC中、室温(約22℃)での洗浄、次いで0.2×SSC中、68℃での洗浄により達成できる。
【0019】
RANKアンタゴニストとして使用するのに適したRANKL結合性可溶性RANKポリペプチドをコードする核酸の例には、下記のものが含まれる:SEQ ID NO:4のアミノ酸x〜yを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでxはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜33よりなる群から選択され、yはSEQ ID NO:4のアミノ酸196〜213よりなる群から選択される;SEQ ID NO:2のアミノ酸x〜yを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでxはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜35よりなる群から選択され、yはSEQ ID NO:2のアミノ酸197〜214よりなる群から選択される;ならびにこれらの核酸分子またはその相補体のいずれかにストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子、その際、ストリンジェント条件は6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄を伴う。
【0020】
本発明の1態様において、本発明のRANKアンタゴニストとして使用するための可溶性RANKをコードする核酸分子は、SEQ ID NO:1(ネズミRANK)のヌクレオチド91〜642またはSEQ ID NO:3(ヒトRANK)のヌクレオチド126〜677を含むであろう。これらの核酸分子によりコードされる可溶性RANKは、RANKLに確実に結合するのに十分な量のRANK細胞外領域が存在しかつ該タンパク質がRANK膜貫通領域を含有しない限り、全長RANKポリペプチドのいずれの目的部分に対応するものであってもよい。
【0021】
本発明の1態様においては、RANKLを結合でき、RANKタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性RANKタンパク質を含むRANKアンタゴニストを投与することにより、その必要がある患者を処置する。可溶性RANKは、本明細書に開示したヒトまたはネズミRANKポリペプチド例のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含むことができ、あるいはシグナルペプチドを除去した成熟形タンパク質を使用できる。
【0022】
本発明の1態様において、RANKLを結合できる可溶性RANKポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2または4に示した天然RANKタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列(それぞれSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214およびSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213)に対して少なくとも約70%同一である。他の態様において、可溶性RANKポリペプチドはRANKLを結合し、かつそのアミノ酸配列はSEQ ID NO:2または4に示したRANKポリペプチドの細胞外領域に対して少なくとも約80%同一である。RANKLを結合でき、かつSEQ ID NO:2または4に示した天然形RANKのRANKL結合性部分に対して少なくとも約90%同一であるRANKポリペプチドも、有用である。同一性%は、コンピュータープログラム、たとえばDevereux et al.(Nucl.Acids Res.12:387,1984)に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)から入手できるGAPコンピュータープログラムを用いて決定できる。RANKタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はそのポリペプチド中に存在するRANKタンパク質部分に基づいて計算される。SEQ ID NO:2および4のネズミおよびヒトRANKタンパク質を本明細書の記載に従ってアラインすると、それらは約70%同一であることが分かる。
【0023】
本明細書の記載に従って使用するのに適したRANKポリペプチドには、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜213またはSEQ ID NO:2のアミノ酸1〜214を含むポリペプチドが含まれ、あるいはそのRANKL結合性フラグメントが含まれてもよい。患者がヒトである場合、可溶性RANKは好ましくはヒトRANKポリペプチドに由来する。ヒトRANKについて、SEQ ID NO:4の少なくともアミノ酸33〜196を含有するポリペプチドはRANKLを結合できる。有用なRANKアンタゴニストの1つは、SEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むポリペプチドである。所望により、SEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むRANKアンタゴニストを、二量体化を促進する他のタンパク質に融合させてもよい。
【0024】
可溶性RANKポリペプチドを含むRANKアンタゴニストは、細胞外ドメインのほかに他の部分を含有してもよいが、膜貫通領域は含有しない。ヒトおよびネズミRANKの膜貫通領域は、それぞれSEQ ID NO:4のほぼアミノ酸214からほぼアミノ酸234まで、およびSEQ ID NO:2のほぼアミノ酸215からほぼアミノ酸235までに位置する。したがって、本発明方法に適した可溶性RANKアンタゴニストには、たとえばRANK細胞内領域に直接融合したRANK細胞外領域を含むタンパク質、たとえばSEQ ID NO:4のほぼアミノ酸235に始まってアミノ酸616まで続くセグメントに直接融合したSEQ ID NO:4のアミノ酸30〜213を含むタンパク質、またはそのRANKL結合性部分が含まれる。
【0025】
所望により、組換えDNA法を用いて天然リーダーをヘテロロガスシグナルペプチドで置換することができる。RANKLを結合できる可溶性RANKは、SEQ ID NO:4のアミノ酸1〜33のアミノ末端からアミノ酸213まで続くヒトRANK部分を含むことができる。そのようなタンパク質部分を含むRANKL結合性フラグメントはRANKアンタゴニストとして有用であり、本明細書に記載するような種々の結合アッセイ法により同定できる。あるいは、当技術分野で既知のユニーク制限部位またはPCR法を用いて、RANKL結合活性を発現および分析しうる多数のトランケート形RANKをコードする核酸を調製できる。
【0026】
RANKのRANKL結合性バリアントおよび対立遺伝子は、USP6,017,729において提供された方法および試薬を用いて得ることができる。SEQ ID NO:4に示したアミノ酸配列とごくわずかに異なるヒトRANK対立遺伝子バリアントの単離が報告されている(WO98/54201)。たとえばこのWO98/54201のバリアントは、SEQ ID NO:4の残基192に相当する位置にアラニンの代わりにバリン、SEQ ID NO:4の残基513に相当する位置にセリンの代わりにイソロイシンをもつ。このRANKバリアントはTRAFを結合でき、かつNF−κBおよびJNKを刺激できる。USP6,017,729またはWO98/54201に記載されたヒトRANKタンパク質、あるいはRANKの他のいずれかのRANKL結合性ムテインまたは対立遺伝子バリアントを用いて、本発明においてアンタゴニストとして用いるための可溶性RANKタンパク質を誘導できる。RANKアンタゴニストとして用いる可溶性RANKの誘導にRANK類似体またはムテインを使用できる可能性は、たとえばUSP6,017,729の記載に従って、類似体またはムテインがRANKLを結合する能力を試験することにより判定できる。
【0027】
同様に療法薬として有用なものは、該タンパク質またはそれらのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体を含む可溶性RANKタンパク質、たとえば組換え体培養においてN末端またはC末端融合体として合成されるものである。たとえば結合ペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に該タンパク質の合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側にあるその機能部位への移動を指令する、該タンパク質のN末端領域にあるシグナル(またはリーダー)ポリペプチド配列(たとえば酵母α−因子リーダー)であってよい。タンパク質融合体は、RANKタンパク質および同族体の精製または同定を容易にするために付加したペプチド、たとえばポリ(His)を含むことができる。たとえばポリ(His)6タグを使用できる(SEQ ID NO:6)。本発明タンパク質のアミノ酸配列を同定用ペプチド、たとえばHopp et al.,Bio/Technology 6:1204,1988に記載のもの(FLAG商標)に結合させることもできる。抗原性の高いこのペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、迅速なアッセイおよび発現した組換えタンパク質の円滑な精製を可能にする。Hoppらの配列はウシ粘膜エンテロキナーゼによっても特異的に開裂し、精製タンパク質からペプチドを分離できる。
【0028】
可溶性RANKのほかに、そのような融合タンパク質はたとえば免疫グロブリンFcドメイン、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせなどの部分を含むことができる。RANKL結合性形の可溶性RANKを含む、本明細書に記載されたように使用するのに適した融合タンパク質は、組換え発現法により作製できる。そのような融合タンパク質は、二量体またはより高次の多量体形を形成してもよい。重合形はRANK活性阻害能が高い。重合可能な融合タンパク質の例には、二量体を形成しうるRANK:Fc融合タンパク質、およびジッパー部分の融合タンパク質(すなわちロイシンジッパー)が含まれる。他の有用な融合タンパク質は、当技術分野で既知の種々のタグを含むことができる。
【0029】
本発明の1態様において、アンタゴニストは、免疫グロブリンFc領域に結合した可溶性RANKを含む融合タンパク質である。ヒト患者を処置する場合、融合タンパク質のRANKおよびFc部分は、好ましくはヒト源に由来する。この目的に有用なFc領域は、ヒトIgG1免疫グロブリンに由来するものである。Fc領域のフラグメントおよびFcムテインも使用できる。たとえば、Fc領域のヒンジ部内の特定の残基がFcγRIへの高親和性結合にとって必須である。Canfield and Morrison(J.Exp.Med.173:1483(1991))は、U937細胞上に存在するFcγRIへのIgG3の高親和性結合にとってLeu(234)およびLeu(235)が必須であると報告している。同様な結果がLund et al.(J.Immunol.147:2657(1991);Molecular Immunol.29:53(1991))により得られた。そのような変異(単独または組合わせ)をIgG1のFc領域に形成して、FcRに対するIgG1の親和性を低下させることができる。用いるFc領域の部分によっては、鎖間ジスルフィド結合の形成により融合タンパク質を二量体として発現させることができる。抗体の重鎖と軽鎖の両方を含む融合タンパク質を作製する場合、4つものRANK領域を含むタンパク質オリゴマーを形成することができる。療法用組成物の調製に使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質は、SEQ ID NO:5に示すものである。これは、ヒトRANKの細胞外ドメインをアミノ酸1〜213に、ヒトIgG1免疫グロブリン由来のFc領域をアミノ酸214〜443に含む。SEQ ID NO:5のアミノ酸1〜29はリーダー配列に相当し、哺乳動物細胞においてタンパク質が翻訳された後、離脱する。療法薬として使用するのに適したRANK:Fc融合タンパク質の例は、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列からなるもの、またはSEQ ID NO:5のアミノ酸30〜443からなるものである。本発明の他の態様において療法薬として使用するRANK:Fc融合タンパク質の配列は、SEQ ID NO:5のアミノ酸30〜443と同一であって、ただし残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されている。
【0030】
本明細書の記載に従って使用するのに適した他の可溶性RANKタンパク質誘導体は、オリゴマー形成性ペプチド、たとえばジッパードメインに融合した可溶性RANKポリペプチドを含む。ロイシンジッパーは、幾つかのDNA結合性タンパク質中に最初に同定され、fos、junおよびc−mycタンパク質中に存在する(Landschulz et al.,Science 240:1759(1988))。”ジッパードメイン”は、これらの(および他の)タンパク質中に存在する、タンパク質の多量体化に関与する保存ペプチドドメインを表わすのに用いる用語である。ジッパードメインは、4または5個のロイシン、イソロイシンまたはバリン残基が他のアミノ酸の間に分布した繰返し7残基反復を含む。ジッパードメインの例は、酵母転写因子GCN4およびラット肝中にある熱安定DNA結合性タンパク質中にみられるものである(C/EBP;Landschulz et al.,Science 243:1681(1989))。核癌遺伝子fosおよびjunの生成物は、優先的にヘテロ二量体を形成するジッパードメインを含む(O’Shea et al.,Science 245:646(1989);Turner and Tjian,Science 243:1689(1989))。これらの目的に有用なジッパー部分は、たとえばUSP5,716,805に記載されている。
【0031】
本発明の他の態様において、RANKアンタゴニストはヒトOPGまたはそのRANKL結合性誘導体である。ヒトOPGをコードするヌクレオチド配列をSEQ ID NO:7に示し、対応するアミノ酸配列をSEQ ID NO:8に示す。本発明方法に使用するのに適したOPGポリペプチドには、USP6,369,027(その全体を本明細書に援用する)に記載のものが含まれる。本明細書の記載に従って用いられるOPGポリペプチドには、SEQ ID NO:8に示したアミノ酸配列の誘導体であって、ポリペプチドがRANKL結合能を保持した状態で1以上のアミノ酸を付加、欠失、挿入または置換したものが含まれる。たとえばOPGは、SEQ ID NO:8のアミノ酸残基186〜401のうち全部または一部の欠失またはカルボキシ末端トランケーション;OPGのシステインに富むドメインの全部または一部の欠失;およびシステインに富むドメインの1以上のアミノ酸の交換を含むことができる。1態様において、OPGは1〜約10個のアミノ酸が成熟アミノ末端(アミノ酸残基22の位置)から欠失し、かつ所望により1〜約216個のアミノ酸が成熟カルボキシ末端から欠失している。トランケート形タンパク質の分析により、OPGの生物学的活性はSEQ ID NO:8の残基22〜185にある約164個のアミノ酸を含有するOPG部分により保持されることが示された。したがって、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含むOPGポリペプチドを用いて、本明細書に記載する目的で投与しうる療法用組成物を調製できる。前記OPGポリペプチドのいずれも、免疫グロブリン分子のFc領域と融合させることができる。全長OPGは自然に二量体または三量体を形成し、これらは生物学的活性をもち、本発明の目的で投与できる。
【0032】
本明細書に記載する目的に有用な他のRANKアンタゴニストには、小型の有機分子が含まれる。
本発明のさらに他の態様においては、内因性RANKまたはRANKL遺伝子発現レベルを低下させるように設計されたアンタゴニストが用いられる。そのようなアンタゴニストは、RANKまたはRANKL mRNA転写体の翻訳を阻害または阻止する周知のアンチセンス法またはリボザイム法;およびRANK若しくはRANKL遺伝子の転写を阻害する三重らせん法を用いて調製される。そのような分子の製造および使用は当業者に周知である。
【0033】
RANKアンタゴニストとして有用なアンチセンスRNAおよびDNA分子は、ターゲティングする内因性mRNAにハイブリダイズして翻訳を阻止することにより、mRNAの翻訳を直接遮断する作用をもつ。これは、RANKまたはRANKL mRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)、たとえばU.S.6,171,860に記載の抗RANKアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成できる。有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、mRNAの5’末端に相補的なもの、たとえばAUG開始コドンまでを含めた5’側−非翻訳配列が含まれる。しかしながら、RANKもしくはRANKL遺伝子転写体の5’側もしくは3’側−非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチド、またはコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドも使用できる。アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドの長さでなければならず、好ましくは6〜約50ヌクレオチドの長さである。これらのオリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNA、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾形であってよい(一本鎖または二本鎖)。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオシドは、幾つかの異なるタイプのものであってもよい。これらには、ヌクレオチドの”ギャップ”セグメントが結合ヌクレオチドの5’側と3’側の”ウイング”セグメント間にある第1タイプ、および”ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の3’末端または5’末端のいずれかにある第2の”開末端”タイプが含まれる(たとえばUSP5,985,664参照)。オリゴヌクレオチドを、たとえば塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖において修飾して、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改良することができる。オリゴヌクレオチドが他の付加基(appended groups)、たとえばペプチド(たとえば宿主細胞受容体をインビボでターゲティングするためのもの)、または細胞膜輸送を促進する剤、またはハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤、または挿入剤を含んでもよい。
【0034】
RANKまたはRANKLを発現する細胞へ送達するために、アンチセンスDNAまたはRNAを組織または細胞誘導部位へ直接注入してもよく、あるいは目的細胞をターゲティングするように設計した修飾アンチセンス分子(たとえば、ターゲット細胞表面に発現する受容体または抗原を特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス)を全身投与してもよい。1方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下に置いた組換えDNA構築体で、ターゲット細胞をトランスフェクションすることができる。そのようなベクターは、転写されて目的アンチセンスRNAを生成する限り、エピソーム状態にとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。ベクターは、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で既知の他のものであってよい。
【0035】
RANKまたはRANKL mRNA転写体を接触開裂するように設計されたリボザイム分子も、RANKまたはRANKL mRNAの翻訳およびRANKまたはRANKLポリペプチドの発現を阻止するために使用できる(たとえばWO90/11364またはUSP5,824,519参照)。本発明においてRANKに療法拮抗するのに使用できるリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム(Haseloff and Gerlach,1988,Nature,334:585−591)、RNAエンドリボヌクレアーゼ(以下、”Cech型リボザイム”)、たとえば天然にテトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)にみられ(IVS、またはL−19 IVS RNAとして知られる)、広く記載されているもの(たとえばWO88/04300;Been and Cech,Cell,47:207−216(1986)参照)が含まれる。リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドからなってもよく(たとえば安定性、ターゲティングなどの改良のため)、RANKまたはRANKLポリペプチドをインビボで発現する細胞へ送達すべきである。好ましい送達方法は、強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でリボザイムをコードするDNA構築体の使用を伴い、したがってトランスフェクションした細胞は内因性RANKまたはRANKLメッセンジャーを破壊するのに十分な量のリボザイムを生成する。
【0036】
本発明に有用な他のRANKアンタゴニストには、RANKまたはRANKLに特異的な抗体が含まれる。RANKアンタゴニストとして用いられる抗体は、それらのターゲットと特異的に免疫反応する。すなわちそれらは抗体の抗原結合性部位によりターゲットタンパク質に結合し(非特異的ではなく)、無関係なタンパク質に有意に結合することはない。したがって、RANKの特異的な抗体はRANKを結合するが、たとえば検出可能なほどにはRANKLに結合しないであろう。同様に、RANKLに特異的な抗体は検出可能なほどにはRANKに結合しないであろう。特異的結合性抗体は、ターゲットRANKまたはRANKLポリペプチド、たとえば本明細書に記載するもの、またはそのサブ部分、同族体およびバリアントを特異的に認識して結合するであろう。RANKまたはRANKLに特異的なアンタゴニスト抗体は、それぞれ内因性RANKまたはRANKLを結合し、したがってその各コグネイトへの結合に用いられる内因性ターゲットポリペプチドの量が減少するであろう。
【0037】
アンタゴニスト性抗RANK抗体が膜結合RANKの細胞外ドメインと結合すると、RANKの生物学的活性はトリガーされないであろう。したがって、たとえばそのような抗体はRANK発現細胞においてNF−κB活性の増大を誘導しないであろう。
【0038】
本発明方法に使用するのに適したRANKアンタゴニストには、RANKLに特異的な抗体が含まれる。そのような抗体は、本明細書に記載の方法または当技術分野でルーティンな他の方法により調製できる。ヒトRANKLをコードする核酸例のヌクレオチド配列をSEQ ID NO:9に示し、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をSEQ ID NO:10に示す。ヒトRANKLは、推定47アミノ酸の細胞内ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸1〜47に相当)、21アミノ酸の膜貫通ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸48〜68に相当)、および249アミノ酸の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317に相当)を含む。ヒトRANKLのRANK結合性ドメインは、EQ ID NO:10のほぼアミノ酸162からほぼアミノ酸317に相当する。SEQ ID NO:10のアミノ酸配列をもつ精製ポリペプチドまたはそのサブ部分を用いて、RANKLと特異的に結合してそれがRANKに結合する能力を遮断するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生できる。本発明の抗体を産生するのに用いられるRANKLポリペプチドを、所望により合成または精製を容易にする他の部分、たとえばロイシンジッパー、免疫グロブリンのFcドメイン、ポリ(His)6、FLAG(登録商標)、または他のタグと融合させてもよい。本発明の1態様において、抗RANKL抗体は、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317(RANKLの細胞外ドメインに相当)を含むポリペプチド中に存在するエピトープを指向する。RANKL特異的抗体がRANKLへの結合を遮断する能力は、いずれか簡便なアッセイ法、たとえばUSP6,242,2213に記載のもの、またはRANKLに曝露されたRANK発現細胞が仲介する生物学的活性を測定するいずれかのアッセイ法により判定できる。
【0039】
本発明の1態様において、抗体産生に用いられるRANKLポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ前記RANKLタンパク質のアミノ酸配列に対して約70%同一であり、本発明の他の態様において、それらは約80%同一であり、本発明のさらに他の態様において、それらは前記RANKLポリペプチドに対して約90%同一である。同一性%は、コンピュータープログラム、たとえばDevereux et al.(Nucl.Acids Res.12:387,1984)に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ(UWGCG)から入手できるGAPコンピュータープログラムを用いて決定できる。RANKLタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はRANKLに由来するポリペプチド部分に基づいて計算される。
【0040】
同様に本発明の療法薬として使用するのに適したものは、そのような抗体の生物学的活性フラグメントである。たとえば抗体の生物学的活性フラグメントは、無傷の抗体と対比してトランケートしているが、それのターゲットを特異的に結合する能力およびそのターゲットとそれのコグネイトとの相互作用を遮断する能力は保持された、抗体タンパク質である。抗体の抗原結合性フラグメントにはFabおよびF(ab’)2フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。これらは常法により調製できる。
【0041】
本発明による療法用組成物に有用な抗体には下記のものが含まれるが、これらに限定されない:ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAB)、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、およびこれらのいずれかのエピトープ結合性フラグメント。ヒトRANKまたはRANKL中に存在するがネズミRANKまたはRANKL中には存在しないエピトープに特異的な、RANKアンタゴニストとして使用するモノクローナル抗体を選択できる。ネズミおよびヒトRANKの両方を結合する、またはネズミおよびヒトRANKLの両方を結合するモノクローナル抗体も、本発明の療法のためのRANKアンタゴニストとして使用できる。目的とする特異性をもつモノクローナル抗体を得る方法は当技術分野で周知であり、たとえばUSP6,017,729に記載のものである。本明細書に記載するRANKおよびRANKLポリペプチド、フラグメント、バリアントおよびRANK融合ポリペプチドを、RANKまたはRANKLと特異的に免疫反応する抗体の産生に際し免疫源として使用できる。
【0042】
RANKアンタゴニストの合成
精製した可溶形RANK、OPG、アンタゴニスト作用抗体、およびその同族体若しくは類似体などのタンパク質を含むRANKアンタゴニストは、そのアンタゴニストをコードするDNAの組換え転写生成物を発現するのに適した宿主/ベクター系を培養し、次いでこれを培地または細胞抽出物から精製することにより製造される。好ましくは少なくとも1つの発現制御配列に機能可能な状態で結合した本発明の単離核酸を含む宿主細胞は”組換え宿主細胞”であり、”形質転換”されたと言われる。モノクローナル抗体は標準法により調製できる。
【0043】
ポリペプチドであるRANKアンタゴニストを組換え発現させるために、そのアンタゴニストをコードする単離核酸を、発現制御配列、たとえばpDC409ベクター(Giri et al.,1990,EMBO J.,13:2821)または誘導体pDC412ベクター(Wiley et al.,1995,Immunity 3:673)に機能可能な状態で結合させることができる。pDC400系列のベクターは、一過性哺乳動物発現系、たとえばCV−1または293細胞に有用である。あるいは、単離核酸をpDC312、pDC316またはpDC317ベクターのような発現ベクターに結合させることができる。pDC300系列のベクターはすべて、SV40複製起点、CMVプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー、ならびにSV40ポリAおよび終止シグナルを含み、安定な哺乳動物発現系、たとえばCHO細胞またはそれらの誘導体に有用である。あるいは、内部ポリアデニル化シグナル、たとえばWO01/27299に記載のものをもつベクターを用いて、アンタゴニストをコードする核酸を発現させることができる。他の発現制御配列およびクローニング技術、たとえばpMT2またはpED発現ベクター(Kaufman et al.,1991,Nucleic Acids Res.19:4485−4490;およびPouwels et al.,1985,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,ニューヨーク州エルゼビル)およびGATEWAYベクター(Life Technologies;メリーランド州ロックビル)を用いて、ポリペプチドを組換え法で製造することもできる。GATEWAY系では、attB配列でフランキングされた本発明の単離核酸をインテグラーゼ反応によりGATEWAYベクター、たとえばattP配列を含むpDONR201と組み換えることができる。これにより、本発明の単離核酸を含むGATEWAY系のエントリーベクターが得られる。このエントリーベクターを、さらに他の適切に調製した発現制御配列、たとえば前記のpDC400およびpDC300系列のものと組み換えることができる。多数の適切な発現制御配列が当技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般法は、R.Kaufman,Methods in Enzymology 185:537−566(1990)にも記載されている。本明細書中で用いる”機能可能な状態で結合した”とは、適切な分子(たとえばポリメラーゼ)が存在するとき核酸がコードするポリペプチドが発現する状態で、本発明の核酸と発現制御配列が構築体、ベクターまたは細胞内に配置されていることを意味する。本発明の1態様として、核酸および/または発現制御配列がたとえば形質転換もしくはトランスフェクションまたは他の適切な方法で導入された組換え宿主細胞またはその子孫において、少なくとも1つの発現制御配列が本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。本発明の他の態様として、少なくとも1つの発現制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能な状態で結合して組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれている。本発明の他の態様においては、インビトロまたは組換え宿主細胞において、少なくとも1つの発現制御配列がトランス作用因子、たとえば転写因子の作用により、本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。
【0044】
RANKアンタゴニスト活性をもつポリペプチドの組換え発現に適した宿主細胞として、多数のタイプの細胞を使用できる。適切な哺乳動物宿主細胞には、たとえば下記のものが含まれる:COS−7系のサル腎細胞(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.,Cell,23:175,1981)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞系、McMahan et al.(EMBO J.,10:2821,1991)に記載のアフリカミドリザル腎細胞系CV1由来のCV1/EBNA細胞系(ATCC CCL 70)、ヒト腎293細胞、ヒト上皮A431細胞、ヒトColo205細胞、形質転換した他の霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織、一次外植片のインビトロ培養により得られた細胞株、HL−60、U937、HaKまたはジャーカット細胞。あるいは、下等真核細胞、たとえば酵母、または原核細胞、たとえば細菌において、ポリペプチドを産生させることができる。適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)株、カンジダ(Candida)属spp、ピキア(Pichia)属spp、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の酵母株が含まれる。適切と思われる細菌株には、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の細菌株が含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌において調製する場合、機能性RANKアンタゴニストを得るためには、それらにおいて産生されるポリペプチドを、たとえば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により修飾する必要があるかもしれない。そのような共有結合は既知の化学的方法または酵素法により達成できる。
【0045】
ポリペプチドは、本発明の単離核酸を1以上の昆虫発現ベクター内で適切な制御配列に機能可能な状態で結合させ、昆虫発現系を用いることによっても製造できる。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系に関する材料および方法はキットの形で市販されている;たとえばInvitrogen、米国カリフォルニア州サイディエゴ(MaxBac(登録商標)キット)。そのような方法は、Summers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)、およびLuckow and Summers,Bio/Technology 6:47(1988)に記載されるように、当技術分野で周知である。
【0046】
本明細書に開示する核酸構築体に由来するRNAを用いる無細胞翻訳系も、ポリペプチドの製造に使用できる。
本発明のポリペプチドは、形質転換した宿主細胞を組換えポリペプチドの発現を支持するのに適した培養条件下で培養することにより製造できる。次いで得られた発現ポリペプチドをそのような培養から(すなわち培地または細胞抽出物から)既知の精製法、たとえば種々の塩類による選択的沈殿、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製できる。ポリペプチドの精製法には下記のものも含まれる:ポリペプチドに結合する剤を収容したアフィニティーカラム;コンカナバリンA−アガロース、ヘパリン−toyopearl(登録商標)もしくはChibacromブルー3GAセファロース(登録商標)などのアフィニティー樹脂上での1以上のカラム工程;フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルなどの疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う1以上の工程;あるいはRANKアンタゴニストの1以上のエピトープを特異的に結合する抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー。
【0047】
ポリペプチドRANKアンタゴニストを収穫するには、組換えタンパク質を培地中へ分泌する系からの上清をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットにより濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物を適切な精製マトリックスに付与できる。たとえば適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合したカウンター構造タンパク質またはレクチンもしくは抗体分子であってよい。あるいは、アニオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基をもつマトリックスまたは支持体を使用できる。マトリックスは、タンパク質精製に慣用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他のタイプのものであってよい。あるいは、カチオン交換工程を採用できる。適切なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーも本発明タンパク質の精製手段となる。
【0048】
アフィニティークロマトグラフィーは、RANKアンタゴニストおよびその同族体を精製するための有用な方法である。たとえば免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現するRANKは、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。さらに、オリゴマー形成性ジッパードメインを含むRANKタンパク質は、そのオリゴマー形成性ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製できる。RANKタンパク質に対するモノクローナル抗体も、当技術分野で周知の方法を用いるアフィニティークロマトグラフィー精製に有用である。リガンドを用いて、可溶性RANKタンパク質または他のRANKアンタゴニストのアフィニティー精製用アフィニティーマトリックスを調製することもできる。
【0049】
最後に、疎水性RP−HPLC媒体、たとえばペンダントメチル基その他の脂肪族基をもつシリカゲルを用いる1以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程を採用して、RANKアンタゴニストをさらに精製することができる。適切な方法には、Urdal et al.(J.Chromatog.296:171,1984)に記載の方法と類似のものが含まれる。以上の精製工程の幾つかまたは全部を多様な組み合わせで用いて、均質な組換えタンパク質を得ることもできる。
【0050】
細菌培養において産生された組換えタンパク質は、通常はまず細胞ペレットからの抽出、続いて濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程のうち1以上により単離される。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を採用できる。組換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞は、好都合な任意の方法で破壊できる。これには凍結−融解の繰返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。本発明タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を著しく簡単にする。
【0051】
組換え培養において合成されたタンパク質は、培養から本発明タンパク質を回収するために採用した精製工程に応じた量および性質の細胞成分(タンパク質を含む)の存在を特色とする。これらの成分は通常は酵母、原核細胞、またはヒト以外の高等真核細胞に由来するものであり、約1重量%未満程度の無害な汚染物質量で存在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養によれば、普通はタンパク質に付随する他のタンパク質(自然界で起源種中にみられる)を含まない本発明タンパク質を製造できる。
【0052】
療法
本発明は、新たな骨の形成を必要とする患者を処置する療法を提供する。これには、骨移植片レシピエント、靭帯移植片レシピエント、人工関節レシピエント、骨折患者、脊髄損傷を伴う患者、および癌の放射線療法コースを終了した患者が含まれるが、これらに限定されない。後者の患者には、本質的に癌が治癒した患者、すなわちRANKアンタゴニストによる処置を開始する時点で悪性組織を検出できない患者が含まれる。本発明の1態様においては、処置する時点では骨密度低下を生じていないが、骨損傷の早期修復または骨間隙の充填のために新生骨形成が必要である患者に療法を施す。RANKアンタゴニストによる処置が有益な他の患者には、急性敗血症性関節炎(ライター症候群を含む)、骨関節炎、骨軟化症(リケッチア症および壊血病を含む)、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病およびランゲルハンス細胞組織球増殖症などの症状を伴う患者が含まれる。これらの状態を処置するのに適したRANKアンタゴニストには、本明細書に記載する種々の可溶性RANKポリペプチドおよびRANKまたはRANKLに特異的な抗体が含まれる。使用できる他のRANKアンタゴニストには、オステオプロテゲリン、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【0053】
毎年数百万人の患者が骨移植を必要とする。そのような患者には、骨格欠損(先天性欠損を含む)を伴う患者、関節の損傷または不安定さを安定化するために関節癒合を必要とする患者、および骨の一部が失われて置換を要するほど骨損傷が著しい患者が含まれる。骨移植片レシピエントには、修正関節手術、骨腫瘍切除または口腔/顎顔面手術のため1以上の骨に間隙のある患者も含まれる。本発明の1態様において、骨移植患者には、処置の時点で異常な高レベルの破骨細胞活性がみられない患者、すなわち異常な速度の骨損失がみられない患者が含まれる。そのような患者には、たとえば事故被害者、癌の治療に成功してもはや癌を伴わない患者、美粧上の理由で自発的に骨再構築を受けている者、および骨格欠損の修正のため手術を受けている者が含まれる。骨格欠損を伴う患者には、たとえば先天的に骨変形した患者、骨関節炎を伴う患者、およびポリオウイルス感染症から回復した患者が含まれる。
【0054】
骨移植のためには、外科医が骨または合成材料を罹患領域に適合するように造形し、健康な骨を移植材料に対してピンまたはネジで適所に保持する。宿主の骨形成細胞が移植片中へ浸潤し、これにより新生骨、血球および軟組織が移植片マトリックスを充填して移植片を宿主骨へ接続するのに伴って、それらの内植を支持する構造枠組みが提供される。骨移植が成功すると最終的には、移植片を接続した宿主骨へ浸潤移植片が中実癒合を示すであろう。こうして移植片マトリックスの充填と既存の宿主骨への移植片癒合の両方により、新生骨が形成される。したがって骨移植片レシピエントには、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明により提供されるRANKアンタゴニストによる処置が有益であろう。
【0055】
同様に宿主骨への人工関節の固定は新生骨形成を必要とする処置であり、したがって人工関節の移植手術を受けた患者の処置には本発明の療法処置が有用である。人工関節は、たとえば骨関節炎、すなわち関節軟骨の変性や辺縁骨の肥大および滑膜の変化を特色とする症状を伴う患者にしばしば付与される。約20%の人工関節レシピエントが、20年の間に摩耗−挫滅による骨分解の結果、次第に人工関節が緩むのを経験している。ただし本発明の療法は、移植後、長く経ってから起きる補綴具の緩みに起因する骨損傷の軽減ではなく、移植したばかりの補綴具の組込みおよび固定を促進することを目標とする。本発明の処置は、補綴具設置の途中または直後に施される。本発明により処置する人工関節レシピエントに、1回目のRANKアンタゴニストを手術当日または人工関節移植後1〜6日以内または移植後1〜4週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に補綴具が患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。通常このプロセスは移植手術後、約1〜6か月以内に終了する。
【0056】
本発明の1態様においては、骨移植を受けた患者に、移植片マトリックスの浸潤および接続した宿主骨への移植片の中実癒合を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。人工関節レシピエントには、宿主骨および/または宿主腱もしくは靭帯への人工関節の結合を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。そのような患者に、移植片または補綴具の移植手術の前、途中もしくは直後、あるいは手術後に移植片の浸潤および中実癒合または補綴具結合が起きている期間の任意の時点で、RANKアンタゴニストを投与できる。
【0057】
さらに、靭帯移植を受けた患者においてRANKアンタゴニストを用いて骨への靭帯結合を増強する。これには膝傷害後に十字靭帯移植を必要とする患者が含まれるが、これに限定されない。成功すると、移植した靭帯は最終的に宿主骨に結合する。そのような結合には新生骨を含めた新生組織の形成が必要である。したがって、靭帯移植片の移植手術の前、途中もしくは直後、または手術後に宿主骨への移植片の結合が起きている期間の任意の時点で、RANKアンタゴニストの投与により靭帯移植片を処理できる。
【0058】
骨移植片または靭帯移植片レシピエントに、1回目のRANKアンタゴニストを手術当日または移植後1〜6日以内または移植後1〜4週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に移植片が浸潤を受けて患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。浸潤/結合プロセスは一般に手術後、約1〜6か月以内に終了する。
【0059】
前記療法の処理が十分であるかを、理学検査または種々のラジオグラフィー法[通常のX線撮影、ラジオグラフィーイメージ増強、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴イメージング(MRI)が含まれる]または他の任意の手段で担当医がモニターする。
【0060】
歯周再構築療法を用いて歯周骨欠損または歯周傷害を修復し、あるいは新生骨形成を必要とする頭蓋顎顔面手術を強化することができる。さらに、歯槽裂を修復するための骨移植は長い間、唇および歯槽の片側性および両側性披裂を伴う者の治療と一体であった。本発明の療法薬を投与すると、そのような患者における歯周再構築を促進できる。
【0061】
脊髄損傷後にはしばしば全身骨損失が起きる。この骨損失は、股関節または四肢の骨を含めた骨折しやすい脆弱骨の発生をもたらす可能性がある。そのような患者は、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明のRANKアンタゴニストによる処置が有益となる可能性がある。本発明の1態様においては、脊髄損傷を受けた患者に新生骨形成を促進するのに有効な量および頻度でRANKアンタゴニストを投与する。RANKアンタゴニストは、そのような患者に傷害直後に、またはその後の任意の時点で投与でき、そのような傷害の治療に用いられる理学療法または他の投薬と組み合わせて投与できる。
【0062】
本発明はさらに、放射線療法に伴う骨損失を生じた癌患者の骨再生療法を提供する。放射線療法に伴う骨損失は、腫瘍の存続がない状態でも起きる。すなわち腫瘍の除去に成功した場合ですら骨損失が起きる可能性がある。このタイプの骨損失は頭頸部癌の放射線治療に伴うことが多いが、他のタイプの癌についても起きる可能性がある。この状態の処置には、放射線療法コースが終了した後のRANKアンタゴニスト投与を伴い、この状態の管理に用いられる他の処置、たとえば骨移植と併用してもよい。
【0063】
前記の各療法について、新生骨形成を増強するのに有効な量および頻度でアンタゴニストを投与する。
併用療法
本発明は、RANKアンタゴニストと、種々の可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカイン、または他の破骨細胞/骨芽細胞調節分子、または骨損失の再生を必要とする患者の処置に用いられる他の薬物との共投与をも考慮する。”共投与”には、組合わせの各成分による同時または逐次処置、および薬物を交互に使用する方式、または1成分を長期間投与し、他の成分を間欠的に投与する方式が含まれる。そのような他の薬物には、たとえばビスホスホナート、または1種類より多いRANKアンタゴニストの共投与による使用が含まれる。共投与される薬物の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない:抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、DMARD、種々の全身化学療法、ならびに非ステロイド系抗炎症薬、たとえばCOX IまたはCOX II阻害薬。
【0064】
有用な組合わせには、RANKアンタゴニストと炎症反応に関連するサイトカインTNFαのアンタゴニストとの共投与が含まれる。TNFαを単独で用いて前記状態のいずれも処置でき、あるいはRANKアンタゴニストと併用してもよい。使用できるTNFα阻害薬には、たとえばTNFα受容体(TNFR)の細胞外領域を含む可溶性タンパク質が含まれ、これらはTNFR IまたはIIその他のTNFRから誘導できる。これらの目的に有用なTNFα阻害薬はエタネルセプト(etanercept)である。これはp75 TNFα受容体の細胞外部分2分子の二量体であり、各分子は235アミノ酸のTNFR由来ポリペプチドがヒトIgG1の232アミノ酸Fc部分に融合したものからなる。エタネルセプトは現在Immunex Corporationから商品名ENBREL(登録商標)で販売されており、一般に週1〜3回、皮下注射により25もしくは50mg/回の均一用量または5〜12mg/m2の用量で投与される。他の適切なTNFα阻害薬には、TNFαに対する抗体(ヒト化抗体を含む)が含まれる。RANK阻害薬との共投与に用いるヒト化抗体の例は、インフリキシマブ(infliximab)(CentocorがREMICADE(登録商標)として販売)であり、これはキメラIgG1κモノクローナル抗体である。他の適切な抗TNFα抗体には、ヒト化抗体D2E7およびCDP571、ならびにEP 0 516 785 B1、U.S.5,656,272、EP 0 492 448 A1に記載の抗体が含まれる。さらにTNFαは、TNFαの競合阻害薬として作用するTNFα由来ペプチド(たとえばU.S.5,795,859またはU.S.6,107,273に記載のもの)、エタネルセプト以外のTNFα−IgG融合タンパク質、たとえばp55 TNFα受容体の細胞外部分を含有するもの、IgG融合タンパク質以外の可溶性TNFR、または内因性TNFαレベルを低下させる他の分子、たとえばTNFα変換酵素の阻害薬(たとえばU.S.5,594,106参照)、またはペントキシフィリンもしくはサリドマイドなどの小分子の投与により阻害できる。
【0065】
同様に、炎症性サイトカインIL−1の阻害薬を単独で用いて前記のいずれかの状態を処置でき、あるいはRANKアンタゴニストと共投与できる。適切なIL−1阻害薬には、たとえば下記のものが含まれる:IL−1の受容体結合性ペプチドフラグメント、IL−1(IL−1αもしくはIL−1βまたは他のIL−1ファミリーメンバー)に対する抗体、IL−1受容体I型に対するアンタゴニスト抗体、ならびにIL−1に対する受容体の全部もしくは一部を含む組換えタンパク質またはそのバリアント:遺伝子修飾によるムテイン、多量体形および徐放性製剤を含む。他の有用なIL−1アンタゴニストには、IL−1raポリペプチド、IL−1β変換酵素(ICE)阻害薬、IL−1結合形のI型IL−1受容体およびII型IL−1受容体、ならびにIL−1トラップとして知られる療法薬が含まれる。IL−1raポリペプチドには、US5,075,222に記載される形のIL−1ra、ならびにU.S.5,922,573、WO91/17184、WO92 16221およびWO96 09323に記載の修飾形およびバリアントが含まれる。IL−1β変換酵素(ICE)阻害薬には、PCT特許出願WO91/15577;WO93/05071;WO93/09135;WO93/14777およびWO93/16710;ならびにEP 0 547 699に記載のものを含めたペプチジルおよび小分子ICE阻害薬が含まれる。非ペプチジル化合物には、WO95/26958、U.S.5,552,400、U.S.6,121,266およびDolle et al.,J.Med.Chem.39:2438−2440(1996)に記載のものが含まれる。他のICE阻害薬は、USP6,162,790、6,204,261、6,136,787、6,103,711、6,025,147、6,008,217、5,973,111、5,874,424、5,847,135、5,843,904、5,756,466、5,656,627、5,716,929に記載されている。IL−1結合性形のI型IL−1受容体およびII型IL−1受容体はU.S.4,968,607、US4,968,607、US5,081,228、U.S.Re 35,450、U.S.5,319,071および5,350,683に記載されている。IL−1トラップはWO018932に記載されている。
【0066】
さらに、適切なIL−1アンタゴニストには、抗体分子とIL−1アンタゴニスト分子の両方の部分を含むキメラタンパク質が含まれる。そのようなキメラ分子は単量体、二量体またはより高次の多量体を形成してもよい。他の適切なIL−1アンタゴニストには、IL−1シグナリング受容体IL−1R I型に競合結合できるIL−1由来のペプチドが含まれる。
【0067】
本発明方法は、IL−1(特にIL−1β)を結合してIL−1信号伝達を遮断し、これによりIL−1(特にIL−1β)の前炎症作用および免疫調節作用を妨害する形のII型IL−1受容体を使用できる。U.S.5,350,683には、II型IL−1受容体ポリペプチドが記載されている。有用な形のII型IL−1受容体ポリペプチドには、IL−1(特にIL−1β)結合能を保持したトランケート形可溶性フラグメントが含まれる。IL−1アンタゴニストとして有用な可溶性のII型IL−1受容体分子には、たとえば天然分子の膜貫通領域を欠如し、かつIL−1(特にIL−1β)を結合しうる、天然II型IL−1受容体の類似体またはフラグメントが含まれる。
【0068】
II型IL−1受容体に由来するアンタゴニスト(たとえばIL−1βを結合する可溶形)はIL−1に対して細胞表面のIL−1受容体と競合し、したがってIL−1が細胞に結合するのを阻害し、これによりその生物学的活性を発現するのを阻止する。可溶性II型IL−1受容体、またはIL−1もしくはIL−1βのフラグメントの結合は、ELISAその他の好都合なアッセイ法によりアッセイできる。注射する場合、成人1人当たりの可溶性II型IL−1受容体の有効量は1〜20mg/m2、好ましくは約5〜12mg/m2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は5〜100mg/回、より好ましくは20〜50mg/回であろう。
【0069】
本発明の実施に適した可溶性II型IL−1受容体ポリペプチドまたはフラグメントを第2ポリペプチドと融合させて、キメラタンパク質を形成してもよい。そのようなキメラタンパク質の1態様において、第2ポリペプチドはキメラタンパク質による二量体、三量体またはより高次の多量体の自然形成を促進するものであってよい。これらはIL−1分子を結合して、IL−1シグナリングを促進する細胞結合受容体への結合を阻止することができる。アンタゴニストとして用いるキメラタンパク質は、抗体分子と可溶性II型IL−1受容体の両方の部分を含有するタンパク質であってよい。
【0070】
さらに、本発明により投与される療法薬は、骨細胞の移動、増殖および分化を促進する合成または天然生物材料を罹患骨へ局所適用するのと併用できる。
骨密度モニタリングのためのアッセイ法
本明細書に記載する種々の処置を施す際、処置の開始時および処置の途中で患者の骨密度を測定することにより、処置の充足度をモニターするのがしばしば好都合である。そのような患者において、骨密度を標準法により測定する。これには、たとえば単一光子吸光光度法、二光子吸光光度法、二エネルギーX線吸光光度法、定量コンピューター断層撮影法およびラジオグラフィー吸光光度法が含まれる。モニタリングに有用な方法は二エネルギーX線吸光光度法である。同一骨の反復骨密度測定により、医師は処置中の骨形成速度を推定でき、したがってRANKアンタゴニスト投与の量および頻度を調整して骨形成を最適化できる。有効なRANKアンタゴニスト投与方式では、たとえば少なくとも2%、より好ましくは少なくとも5%、最も好ましくは少なくとも10%以上の骨密度増大が誘導されるであろう。
【0071】
処置期間中、骨形成が増大すると期待され、したがって任意の好都合な間隔で骨密度を反復測定することにより処置の充足度をモニターできる。たとえば、1週間毎、2週間毎、3週間毎、1カ月毎、3カ月毎、またはより長い月毎、もしくはより少ない頻度で密度を測定してもよい。
【0072】
投与様式
療法用として、RANKアンタゴニストを個体、好ましくはヒトに、適応症に適切な様式で処置のために投与する。全身投与は、一般に骨成長の全般的促進が必要な適応症の処置、たとえば脊髄傷害患者または放射線療法レシピエントを処置する際に適切である。あるいは、RANK/RANKLアンタゴニストを局所適用できる。これは移植片レシピエントに適切であるが、これらの患者を所望により全身処置してもよい。そのような患者には、RANKアンタゴニストを所望により手術の時点で移植片に直接適用してもよい。局所投与の手段には、たとえば局所注射、またはこの目的に適した徐放性マトリックス(多数が知られている)と混和もしくは重合したアンタゴニストの適用が含まれる。
【0073】
本発明はさらに、多数の疾患を処置するための医薬の製造における、RANKアンタゴニストおよびRANKアンタゴニストと共投与される薬物の使用を提供する。RANKアンタゴニストおよび他の薬物を配合して、有効量のアンタゴニストを含む療法用組成物にすることができる。本発明の1態様においては、RANKアンタゴニスト活性をもつ精製した可溶性タンパク質を生理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物の形で、療法薬を投与する。そのようなキャリヤーは、用いる投与量および濃度でレシピエントに対し無毒性のものである。医薬組成物に用いるRANK/RANKL相互作用の阻害薬をポリエチレングリコール(PEG)、金属イオンと複合体形成させ、あるいはポリマー化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどに取り込ませ、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層もしくは多層ビヒクル、赤血球ゴーストまたはスフェロプラストに取り込ませることができる。PEGと複合体形成したタンパク質は、既知の方法、たとえばUSP5,849,860、USP5,766,897に記載の方法、または他の適切な方法で調製できる。リポソーム形成に適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム配合物の調製は当業者が容易になしうるものであり、たとえばUSP4,235,871;USP4,501,728;USP4,837,028;USP4,737,323;およびUSP5,858,397に開示されている。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え、したがって意図する用途に従って選択されるので、キャリヤーの特性は選択する投与経路に依存するであろう。
【0074】
本発明の1態様においては、徐放形のRANKアンタゴニストを使用する。本発明方法に使用するのに適した徐放形には、溶解速度の遅い生体適合性ポリマー(たとえばU.S.6,036,978に記載のアルギナート微粒子)に封入された、徐放性ポリマー(局所適用ヒドロゲルを含む)と混和した、および/または生体適合性半透過性移植片に取り込ませた、可溶性RANKポリペプチド、オステオプロテゲリンおよびアンタゴニスト性抗RANKまたは抗RANKL抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【0075】
1回当たりのRANKアンタゴニスト投与量は、使用するアンタゴニストおよび投与様式に応じて異なるであろう。アンタゴニストが可溶性RANKであり、注射により投与される場合、成人1人当たりの有効量は0.5〜20mg/m2、好ましくは5〜12mg/m2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は5〜100mg/回であろう。皮下注射により投与される均一量の用量範囲例は、5〜25mg/回、25〜50mg/回および50〜100mg/回である。特に慢性症状には選択した量を反復投与できる。あるいは、処置の進行に伴って1回当たりの量を増減してもよい。小児患者(4〜17歳)に適切な投与方式は、0.4mg/kg、最大量25mg、週1回以上の皮下注射を伴う。RANKまたはRANKLに対する抗体をRANKアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲には0.1〜20mg/kg、0.75〜7.5mg/kgおよび1〜10mg/kg(体重)が含まれる。ヒト化抗体、すなわち抗体分子の抗原結合性部分のみがヒト以外の供給源に由来する抗体が望ましい。抗体を注射(静脈内注入を含む)により投与できる。適量は試験により決定できる。投与の量および頻度は、もちろん処置される適応症の性質および重症度、目的とする応答、患者の状態などの要因に依存するであろう。
【0076】
通常、RANKアンタゴニストを含む医薬組成物の調製は、療法用タンパク質と、緩衝剤、酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物(ブドウ糖、ショ糖またはデキストリンを含む)、キレート化剤、たとえばEDTA、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤とを混和することを伴う。中性緩衝化食塩水または同種血清アルブミンは、適切な希釈剤の例である。好ましくは、適切な賦形剤溶液(たとえば無菌の水またはショ糖溶液)を希釈剤として用いて、製品を凍結乾燥品として配合する。本発明の1態様は、凍結乾燥RANKアンタゴニストを投与単位の形で包装することを伴い、これを再構成すると1包装当たり1〜3回分が得られる。
【0077】
本発明の化合物は、所望により一般的な無毒性の医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位剤形で、経口、非経口、舌下、吸入、噴霧、直腸または局所投与できる。局所投与には、経皮投与、たとえば経皮パッチまたはイオントフォレーゼ器具の使用も含まれる。注射が好ましい投与経路であり、これには非経口注射が含まれる。非経口注射には、皮下、髄腔内、クモ膜下、眼窩内、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内への注射および注入法が含まれる。RANKアンタゴニストを含む組成物を、ボーラス注射または連続注入により投与できる。有用な全身投与経路は皮下注射および静脈内点滴である。
【0078】
本発明の他の態様においては、RANKアンタゴニストを発現するように遺伝子修飾した細胞を用いる。たとえば可溶性RANKまたはRANKアンタゴニスト活性をもつ他のタンパク質をコードするDNAを、患者の身体から採取した細胞に導入し、次いでその細胞を患者に戻す。DNAは、アンタゴニストの発現を促進する形で、すなわちコード領域を細胞での発現のために機能可能な状態で適切な調節要素に結合させて、レシピエント細胞に導入される。DNAを適切なベクター、たとえばレトロウイルスもしくはアデノウイルスベクターにより、またはリポソームに封入して導入できる。この薬物投与様式に適した細胞には、罹患組織へ戻る細胞、たとえば骨髄細胞(造血前駆細胞を含む)が含まれる。他の同様な態様においては、RANKアンタゴニストをコードするDNAの導入によりアンタゴニストを発現するように細胞系を修飾し、次いでその細胞を患者に導入する。そのような細胞は、RANKアンタゴニストの安定発現または一過性発現を促進するDNA構築体で形質転換できる。あるいはアンタゴニストをコードするDNAをリポソームに封入して患者に導入できる。これを全身投与するか、あるいは罹患組織へ局所投与することができる。
【0079】
処置すべき疾患の種々の動物モデルが当技術分野で知られている;したがって、RANKアンタゴニストの最適な投与量および投与経路を判定するためのルーティン実験を、まず動物モデルに、次いでヒト患者に適用できる。新生骨が高品質であって正常な骨と類似するように、投与方式を調整するのが適切であろう。個々の患者に対する具体的な投与方式は、用いる具体的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物組合わせ、および患者の症状の重症度を含めた多様な要因に依存するであろう。最適結果を得るのに必要な投与量および投与頻度は、担当医が調整するであろう。
Claims (22)
- その必要がある患者を処置する方法であって、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
(a)RANKアンタゴニストはRANKがNF−κBを誘導する能力を阻害でき、RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質であり;
(b)患者は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者よりなる群から選択され;
(c)RANKアンタゴニストは、SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;RANKまたはRANKL mRNAを開裂するリボザイム;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;およびSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できるOPGポリペプチド、よりなる群から選択される、前記方法。 - 患者が処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない、請求項1に記載の方法。
- 処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項1に記載の方法。
- RANKアンタゴニストが、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体である、請求項1に記載の方法。
- RANKアンタゴニストが、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- その必要がある患者を処置する方法であって、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
(a)RANKアンタゴニストはRANKがNF−κBを誘導する能力を阻害でき、RANKはSEQ ID NO:4のアミノ酸1〜616からなるタンパク質であり;
(b)RANKアンタゴニストは、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであり、該可溶性RANKポリペプチドは、SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有し;
(c)患者は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者よりなる群から選択される、前記方法。 - 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:3に示すヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその相補体とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされ、その際ストリンジェント条件が6×SSC中、63℃でのハイブリダイゼーション、および3×SSC中、55℃での洗浄を含む、請求項6に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:10のアミノ酸33〜196を含む、請求項6に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドがさらに、免疫グロブリンFcドメイン、FLAG(商標)タグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む、請求項6に記載の方法。
- 追加部分が免疫グロブリンFcドメインを含む、請求項9に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:5のアミノ酸30〜433からなる、請求項10に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:5のアミノ酸30〜433からなり、ただし残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されている、請求項10に記載の方法。
- 患者が処置開始前の少なくとも1カ月間、骨密度低下を生じたことがない、請求項6に記載の方法。
- 処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項6に記載の方法。
- その必要があるヒト患者を処置する方法であって、RANKアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
(a)RANKアンタゴニストは、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを結合できる可溶性RANKポリペプチドであってSEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドに対して少なくとも90%の同一性を有する可溶性RANKポリペプチド;SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含むRANKポリペプチドを特異的に結合できる抗体;RANKまたはRANKL mRNAの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド;RANKまたはRANKL mRNAを開裂するリボザイム;SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体;およびSEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できるOPGポリペプチドよりなる群から選択され;
(b)患者は、人工関節レシピエント、骨移植片レシピエントおよび靭帯移植片レシピエントよりなる群から選択され;
(c)1回目のアンタゴニストを、人工関節、骨移植片または靭帯移植片の外科移植の1カ月以内に投与する、前記方法。 - 処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項15に記載の方法。
- RANKアンタゴニストが、SEQ ID NO:10のアミノ酸69〜317を含むRANKLポリペプチドを特異的に結合できる抗体である、請求項15に記載の方法。
- RANKアンタゴニストが、SEQ ID NO:8のアミノ酸22〜185を含み、かつSEQ ID NO:10のアミノ酸1〜317からなるRANKLポリペプチドを結合できる、OPGポリペプチドである、請求項15に記載の方法。
- RANKアンタゴニストが、SEQ ID NO:4のアミノ酸33〜196を含む可溶性RANKポリペプチドである、請求項15に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドがさらに、免疫グロブリンFcドメイン、FLAG(商標)タグ、少なくとも約6個のHis残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む、請求項19に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列からなる、請求項20に記載の方法。
- 可溶性RANKポリペプチドが、SEQ ID NO:5のアミノ酸30〜433からなり、ただし残基352のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基354のロイシンがメチオニンにより置換されている、請求項20に記載の方法。
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