HU229204B1 - Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer - Google Patents

Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer Download PDF

Info

Publication number
HU229204B1
HU229204B1 HU0203628A HUP0203628A HU229204B1 HU 229204 B1 HU229204 B1 HU 229204B1 HU 0203628 A HU0203628 A HU 0203628A HU P0203628 A HUP0203628 A HU P0203628A HU 229204 B1 HU229204 B1 HU 229204B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
component
gly
fusion protein
proteins
Prior art date
Application number
HU0203628A
Other languages
English (en)
Inventor
Juerg Tschopp
Pascal Schneider
Nils Holler
Original Assignee
Apoxis Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7935052&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU229204(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Apoxis Sa filed Critical Apoxis Sa
Publication of HUP0203628A2 publication Critical patent/HUP0203628A2/hu
Publication of HU229204B1 publication Critical patent/HU229204B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153 or CD154

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)

Description

Rekombináns fúziós fehérjék őimerje, felmerje, tetramerje vagy pe»tawrje által ssfkoíott kimer vagy oligomcr
A találmány tárgyát képess iuzíós fehérje, aszal jellemezve, -hogy » íékoinbmáns fúziós fehérje A- és Skomponeast sartfen-az, ahol az A-komponess egy TNl-'-cítokfe extracelíuláns szegmense és· a ö-lomponens ÁCRP3Ö teteje muitimerfeálö és oiigosnerízáló szegmensét tartalmazza, amely harmadik molekula közreműködése nélkül multimert és oíigomert képez a fúziós fehérjéből. Előnyösen a találmány tárgyát képezik a rekombirsás» fúziós .fehérje bisserje vagy oligomctje, ások alkalmazása gyógyászati .készítmények gyártására, továbbá a gyógyászati készítmények. .A találmány tárgyát képezi továbbá Dl^S-szekveneia, amely a találmány szénád fúziós fehérjét kódol, expressziós vektor, amely a DiNS-szekvendét tartalmazza, valamint gazdasejt, amely az expressziós vektorral transzfektált,
A természetei· nagy -számban megtalálhatóak a fiziológiailag testként, ttimerkónt, tesranserként vagy peniaareckéot előforduló fehérjék. Az ilyen, oldatban dimert vagy makimért képező fehérjék felszínénél lapasztálhatő kölcsóoiíatások miatt végbemehet a fehérjék spontás aggregscíőja, vagy például akár olyan aggregáeiő is, amely kiueukfebg késleltetett, mivel az a környezet koneentóciójáíól lügg. Ennek okai a hidrofeb kölcsönhatások, hidrogénhidak kialakulása és/vagy a c<Wömó-erők.
Ezen felül bizonyos fehérjékben találhatóak olyas, szerkezed metivömok, amelyek specifikus, szopermásodfegos (teatadfeíedleges, „sapersecosdary”) szerkezetek kialakulásához- vezetnek, és ezáltal idézik elő a fehérje dímegei vagy multi-merjei kialakulását. A szupetmásodíagos szerkezetek kialakulása az: ilyen, átmérőkét vagy moitimereket képező fehérjék jellegzetes ammosav-szekveacíám alapul, A szupefeehkáhs ('fosott: fersd, „oofeíd coi/’h .hél'ixek kifejezésen érthetőnk, például olyan sznpersjásodbgos .szerkezeteket, amelyek fehérjék áímerízáciöját vagy multimcnaációját okozzák, olyan, kamfctenszhkas ö-hőlixek kölcsönhatásán kciusztül, amelyek minden, a szuperbelíkális formát kialakító fehérjében megtalálhatóak, A szuperhelikáhs hélix, mint a fehérjék mtermolekuláns „dimcnzáló. vagy multimcnzálő íteméaie” szerkezetét tekintve aznperhéltx, amely önmaga körül felcsavarodó két vagy több hélix. Az ilyen .«MW-cotZ-tspusú motívumok különösen az extracelluláris fehérjék dimerjeiben vagy maltimesjeter találhatóak, és különösen a kötószövetí fehérjékben vagy feliéi) ekomplexekben.
Beck és munkatársai .(Beck és mtsai., I Mól. Bioi. .256: 909-23 (1996)] például leír egy kötőszövet! fehérjét, as un. poiemáiríxfeherjét (CMP), amely homokímetré vagy tripla hélixszé való aggtegációja a szuperhclíkalís mintázaton alapul, és ahol az aggregáeiő három komplementer hélix (mindegyik egy polipeptid komponense) aggregáeiójáa alapul. Áz ilyen típusú, tripla hélixet alkotó amíaosav-szekvenciájára jellemző az (abcdefe.),,-heptádm:huázat. Itt az a- és á-pozíciókban rendszerint hösí poláros oldalíá&cok vannak, és ez lehetővé feszi a fent ismertetett sztsperheiikális szerkezet kialakulását, itt Iránom hélixhoi felépülő tripla héhxkéist. Ráadásul a technika állása szerint egy másik, extraeelitrlárís sstáhíxfelséfje (az oligomer porcmátrixfehétje, CéhfeF) esetében valójában őt hélix alkot ötfönatú („five coll'’) szuperbelíkális hélixei, ahol a helixek egymással kölcsönhatásban vannak, és igy pemamerek kialakítására alkalmasak fKsüava, Prcteins: Sttucture, Functíon and Genetícs, 24: 218-226 (1996)]; ('Malashkevicfe és mtsai., Science 274: 761-765 (1990)].
A fehérjék koílagéacsaládjába nem tartozó CéhfeR- és a O/F-máirrxfehérj-ék esetén kívül a kollagéncsaládba tartozó fehérjék esetében speeiSkns szerkezeti rauldmerizseiós jelenségek, mint például másod-harmadlagos szerkezetek kialakulása színién «lőferdol. itt a kollaaénszálak. szerkezetére a tropokollagén
Áktaszámtmk: 97122-13798/SG
1·
* X jellemző, amely három, hehkálisan csavart pclipeptidbol áh. A hajszái protofibrilfuniái szintén azuperbebkalis motívumot tartalmazó a-kerasto tripla helixébol alakúi ki, ez a hélix azonban balra csavarodó.
A lígandsook aviditásásak stövelése céljából Terskikh és munkatársai [Terskikh és mtsai., PNAS 94: 1663-166$ (199?)] javasolta olyan fúziós fehérjék alkalmazását, amely lígandamfonkciót hordozó rövid pepiidet és a CÖMP-ntá&ixíehérje szupethekká-Ms ddménjáí tartalmazta. Az ilyen pmtamerak megnövelt aviditását bizonyították, azonban magasabb readö aggregátumok nem áilithstóak elő ilyen módon.
Ráadásul a megfelelő tnoftimerképző szekvenciarészeik szekveneiahomológiája miatt a Clq-t az alkollagént (X), az tű-kollagém {VH),. a híbemálófebérjét, az AC&AHl-t, a belsőfhi szerkezeti fehérjéjét, a cerebellínt és a mdhsmermt a üiq-csaléd elnevezéssel egy fehétjecsaiádba sorolták [Ki-schore és Reid, Inmiosopharmacol. 42: 15-21 (1999)], amely családba tartozó fehérjék szerkezetileg dimerek vagy mulíimetek. A febérjecs&fádba tartozó, rnuitimerképzési karakterisztikával rendelkező fehérjék: között a komplementrendszerből ismeri Ülq-:febérje: szerkezetéi olyan monomerek jellemzik, amelyek mindegyike rendelkezik globuiáris, úgynevezett feídotuérnad és kollagésszerü hehfeáhs szekvenciatésszei. A monomerek a Ixdikális szekvenciarészen ttt alkotnak kimeri, adiea <:<>// tópia· bebxet. Hat ilyen Clq-trimer slagomért képez, ezáltal a féhérjetránerek oiigmaerizációja az egyedi szupefheldsális tripla hélixek közötti, kölcsönhatásokon alapul. Ennek eredményeképp a fehérjében vagy a m ulti meri képező-(oiigomeri képező) Clq-fehétjekompléx szerkezed elrendeződése egy ‘Mrágssdkoraak” nevezett szerkezetet, képez, ezáltal 18 globuiáris, C'ternnnáfisan elrendezett tejdomén felmerek által alkotott kexamerré kapcsolódik.
A Clq- fehérjéhez hasonló szerkezet látható az .9 Ü.975- feltét jé esetében is, amely szintén a C1 g-csaiádba tartozik íifu és mtsai., .1, Siói. Chere. 271(18): 10697-10703 (1996)], Ezt a szénnniehétjét az adipociták szekretálják, és ezek minden valoszméség szerint olyas tetramereh vagy trimerak, ahol, a clq-tohérjéhez hasonlóan, globuiáris C-termísális dóménak kapcsolódnak tripla feéflxekea keresztül, a kollagénekhez hasonlóan. Valószínűleg négy Ilyen íripla hóim végit! «Egomért képez, megfelelő köiesönhatásokon .keresztül. Shapiro és Scherer közleményében [Shapiro és Scherer, Üurreaí Biology 8: 335-338 (1998)] bemutatják az AC/í/C’Öhomotrimer szerkezetét, amelyet rőntgentósztallográítás analízissel határoztak, meg.
Ráadásul ismertek a technikában a kollekttncsalád olyan fehérjéi, amelyekre jellemző a kollagénszeri) dómén, nyakrégiő és ráadásul globuiáris, kmboxi -tormlnáhs lektinkőtődomén. A kcllektinek Sziológiás körülmények között szintén trimerek oEgometjeikéat fordulnak elő. Például a koliektinekhez· sorolt felszíni Asüdőtohérje (5/M) és a mannózkötő fehérje fedSE) a kollagénszerű doménjai kölcsönhatásai által alkot Ínfűért, és végül trímerek által alkotott hexamerekként fordulnak elő [Epstein és mtsai., Cttrrenf Öpitiion in Immuftológy, .8(1J: 29-35 (1996)]. Ennek megfelelően a koi-lektmek néven ismert' fehérjék multimerek (pl. felmerek) oKgotnerjeít (pl. hexamereket) alkotják.
A technika állasa szerint számos fehérje, amely jelátviteli molekulaként fejti ki fiziológiai hatását, osafc bizonyos, körülmények között továbbit biológiai jelet. Pékiául a membránhoz kötött biológiailag, azaz apoptotíkusan hatásos, árig az extraeelltáárís fehérjsszegmens (az án. Faxé) lehasitása után ez a ínembránhoz nem. kötött xhuvá-feshció többé nem gyakorol, apoptürikus hatást a célsejtekre. Schneider és munkatársai [Schneider és -mtsai., .1. Exp. Med., 1871 $): 1205-1213 <199$)] azt -állítják, hogy (a korábban ismertetett módon) a membránkötőtt Febérjeszegmensböl lehasítással nyeri «/•bsi-trimerek biológiai hatása -valójában fiziológiai funkciója szempontjából reaktiválható .keresztkötő antitestek .alkalmazásával. Ebből a célból olyan fózíős fehérjét készítettek, amely a Fást hímért képező doménjáfeót, egy rövid fcapesolószekvenciából és egy J/ag-jelölöΛ ««« ♦» címkéből (az egyhetes kőddai: DYKDDDDK leírható /kig-jelölőcimkáből) áh, azt expresszáhák, és az ilyen, nem szerkezeti. alapokén friinerlzáló (pl. nem specifikus másodlagos- szerkezeti kölcsönhatások által, amely másod-fearaadlagos szerkezetei eredményez) fúziós- fehérjét a í/ög-toidalék ellen termeltetctí antitestekkel' fcereszíköEésnefc vetették alá.
Az ilyen típusú, andgéakötéssei kercsztkötöh z/'ó.sí.-melektílák a nem kereszíköíőtt vFöví-trimerokhez viszonyítva jelentős mértékben megnövelt -specifikus apoptoíikus: aktivitást mutatnak. Ez az eljárás azonban, amelyet Sehneider és munkatársai dolgoztak ki, azzal a hátránnyal jár, hogy a rekomhínáns, nem raeínhr&okötőtt .fasl-fehénével, a trimerízálő doménnsl specifikus antitesteket ís kell alkalmaznunk, vagyis a biológiai aktivitás növekedése csak további motekuiatnAció biztosításával érhető el. Ráadásul a Scbneider és· ínankatársai által valószínő-sitett elmélettel nem lehetséges a maltimerek -egzakt módon beállított vagy meghatározható mértékű oíigomerizációi&nak biztosítása. Az antitestek ugyanis úgy fejtik ki hatásukat, hogy a .ΓαϊΔ-trimerek dimerekké, vagy akár az- ohgomerizált komplexek széles spektrumává asszoeiáiódhatnak, ahol, az óriási méretű .vfűvZ./antitest-aggregátumok ts előfordulhatnak. Mivel egzakt módon definiált, maximálisan hatásos termék kívánatos, végső soron az sáosá-aktivjtás Schnesder és munkatársai által feltételezett módon történő reaktsvátása és/vagy növelése nem megvalósítható.
A találmány központi célja ezért olyan vegyöletek előállítása, amelyek elkerniík a technika állása szerinti vegyületek hátrányait, előnyösen olyan vegyületek előállítása, amelyek megnövelt biológiai aktivitást matatnak, vagy a biológiai aktivitást reaktiváeiöját hajtják végre.
A találmány szerinti célt az 1, igénypont szerint a találmány tárgyát képező, nevezetesen rekomhínáns fúziós fehérjék dhnere, himere, teiramere vagy peníamere által alkotott olyan kimer vagy oligomer valósítja meg, amely rekembinans fúziós fehérje legalább egy A-korspenensí és legalább egy S-koorpoaettsí tartalmaz, altot az A-komponens biológiai funkcióval, közelebbről sötöfenkoíóval rendelkező fehérje vagy fehérjeszegmens, és a B-komponcns olyan fehérje vagy fehérjeszegmens, amely a biológiai funkcióval rendelkező rekombináns fúziós fehérje -dímerjék frimesjét, íetranrerjéí vagy pentamesjet dimerízálja vagy oligomerizálja úgy, hogy harmadik molekulám nem gyakorol hatást, vagy a fúziós fehérjét aggregálja htmerré vagy mulfimerré és ugyanakkor ezeket a dimereket és multímerekef dimerré vagy olígomerré kapcsolja össze, ágy. hogy harmadik molekulára nem gyakorol hatást.
A leírásban adimer, kimer, fetramer vagy peniamer kifejezéseket a multimer kifejezéssel vonjuk össze, és ezen két, három, négy vagy öt asszociált pelipeptidből (fehérjéből) álló fehésjekomplexeksí értünk. Ezzel szemben a következő szintű, magasabb rendű aggregátumokat, azaz két vagy több dímer, trimer, fetramer vagy peatamer aggregátumait a fenti értelemben himemek vagy oíigomemek nevezzük. Biológiai funkcióval rendelkező fehérje vagy íéhérjeszegmens alatt (a fúziós fehérje A-komponense) közelebbi-ól olyan fehérjéket értünk, amelyek ligandumfenkeiöt hordoznak, közelebbről értünk antitestekéi vagy receptorokat (pl. amelyek egy vagy több molekulával kolcsetthatásban vehetnek részt köfőpartnerkésf i, módosított aminosav-szekveneiákaí, például aminosav-szekveneíákat kovalens vagy nem kovalens módon kapcsolt (lehetőség szerint szerves kémiai természetűi)· hatóanyagokkal, antitesteket vagy paratópoí tartalmazó antitestszegmenseket, vagy akár hormonokat, például pepfidbormonokat. Közelcbferöl a találmány tárgyát képezik a fúziós -fehérje A-komponenseként jelátviteli fehérjék mninosav-szekveneiái, amelyek már monomerként aktívak, és amelyek hatása, megnövekszik a találmány tárgyát képező komplex komponenseként, vagy amelyek csak a találmány szerinti beindított otigomenzáció által válnak aktívvá, vagy kizárólag a találmány szerinti beindítod oligoraerizilció által válnak
φ» aktívvá (ami azt illeti, a fúziós fehérje A-komponenseként már trhnerként fordulnak elő)., Fiziológiailag membránhoz kötött szignálpepíidek, példáid a 'TNF-ctiokíöek esetében előnyösek azok a hasítási termékek, amelyek tartalmazzák a membránon kivüii, közelebbről az extracelluláris fehföjeszcgmeast. A. rekontbináns fúziós fehérje A-komponensként alkalmazhatóak azmtban antigénként öröködé atniaosav-szekvenciák is. Végűi szintén alkalmazhatóak A-komponensként receptorok, például a TNF-családba tartozó receptorok, például az l, típusú ueHibránfehérjck családjába tartozó fehérjék (pl. EhsA), vagy az ilyen receptorok szegmensei vagy származékai,. amelyek kötöfonkcióval is rendelkeznek (pl. kölcsönhatásba lépnek köíöpartnerként más molekulákkal},, és ezáltal ezekre a leírásban meghatározott értelemben a „ligandum” kifejezést alkalmazhatjuk. .Az ilyen, 'biológiai, receptorok fragraeasel iránt kötési képességgel rendelkező típusú (molekulák)' különösei! alkalmasak drogként történő alkalmazásra, ha a betegben található, komplementer biológiai Ugandám nem fiziológiai mértékű, nagy koncentrációkban van jelen,
A találmány egy előnyös megvalósítási, módja szerint az A-komponeosek tartalmazhatják a találmány szerinti ohgomerekben (azaz dimerekben, irrmerekben, íetramerekben vagy peníaxnerekben) található rmdshnerformákat, és lehetitek azonos A-kotnponensek (homodimerek vagy homomuítimerek oJigomerjei), vagy különböző A-kotnponensek (heterodimerek vagy heteromnittmerek oligomerjei). Ezáltal különböző A-komponensekkel rendelkező fehérjék, esetleg különböző biológiai fUttkciőkkai, ősszekapcaolhalóak oiigomerek dimerjeiben vagy muldmerieiben, a találmány szerinti megoldásnak megfelelően.. A bimerekben. vagy oligomerekben aggregált egyedi heterodimerek vagy heteromultimsrek szintén lehetnek azonosak vagy különbözőek, azaz a találmány szerinti kimer vagy oligomer állhat különböző heterodtmerekböl vagy hetórooligomerekbő!' Is..
Lehetséges azonban az is, hogy a megfelelő dimerben vagy multimerbeo a fúziós fehérjék a birner vagy oligomer alegységeként azonosak, másrészt azonban a bimer vagy oligomer egyedi alegységei különbözőképpen rendeződnek el (homodmierek, hemotrimerek, homotetramersk vagy homopentamerek. hetoxobimeijex vagy heterooligometjei}· Ezáltal például akar hat homoírimer, amelyek az A-komponens szempontjából különbözőek, asszociálódhat a találmány szerint trimerefc hexameijeivé. Ezáltal tipikus módon, pontosan modulált biológiai, aktivitások hozhatók leire a himeiben vagy az oligomerben az ,Α-kompenens kiválasztásával, elrendezésével a specifikus kombinálással és/vagy számának változtatásával. Ismert tény, hogy bizoayos biológiai .hatások a kívánt biológiai hatást, például sejtakíiváciöí, csak legalább két Ugandámon keresztül idézik elő (biológiai értelemben, és: nem a leírásban alkalmazott tágabb értelmezés szerint). Ezt kívánatos, például bizonyos ínierfeukinok kombinációja esetében, tekintettel a ϊ-sejt- vagy B-sejt-aktivátorként betöltött szerepükre. A találmány 'szerinti megoldásiján az ilyen tlpasú, csak kombinációban hatásos hatóanyagok eirendezhetöek a találmány tárgyát képező komplexben. Azonban az is elképzelhető, hogy a készítmények, például a megfelelő Akomponess szempontjából különböző obgomereket tartalmaznak.
A találmány más, előnyös megvalósítási módja szerint a rekombináns fúziós fehérjében az A-konrponens peptidhotinoxt,. növekedési faktor, citókin, mterieukin vagy ezek szegmense, előnyösen kötöképességgel rendelkező szegmens. Alkalmazhatóak azonban a fent ismertetett peptidek és/vagy fehérjék funkcionális származékai is a találmány tárgyát képező rekombináns fúziós fehérje A-kompooensekéni.
Biológiailag aktív fehérjék fehérjeszegmensei vagy peptidiei funkcionális származékaként leírhatók közelebbről azok a fehérjék, amelyek megtartják a biológiai teke lót, azonban ugyanakkor a megfelelő uativ szekvenciához viszonyítva szekveiteiakülöahségeket tartalmaznak. A szekvencíaeltérés lehet: egy vagy több inszefeió, delécíó vagy szubsztitúció, ami által a natív szekvencia és az alkalmazod származék között előnyösen legalább '?(>%-os a szekveneíafeetoöíógia, és különösen előnyösen legalább a 85%-os a szekvencsabomoiógia. Közelebbről azokat az wlnosav-szekvenciákat értjük a “funkcionális'származék” kifejezésen, amelyek a fiziológiai szekveneiákhoz viszonyítva konzsxvatív szubszdtüciókat tartalmaznak. Azokat a szubsztitúciókat nevezzük konzervatívnak, amelyek esetében az amínesav&fc azonos osztályba tartozó ananosavval vannak szubsziiíaálva, Közelebbről varrnak alifás oldsiiórtcökkal, pozitív vagy negatív töltéssel rendelkező oldalláucokkal, az oldal láncban aromás csoportokkal rendelkező atówavsk, vagy olyan aminosavak, amelyek oldal láncai lehetnek biárogénköfések részei, például oldalláneok bidroxídfankcíóval, Ez azt jelenti, hogy például poláros oldalláncú amínosavat egy másik, szintén poláros oldalláncú anuaosawal helyettssídmk, vagy példán; hidroföb eldallánccal. jellemzett amínosavat szintén ladreíoh oldalláncú ammosawat helyettesítünk, például szerint ítreoníní} treonínsal (szerínnelj, vagy leueínt (izoleacmt) tzoleueinnal (szerianel).
A találmány szerinti xsjegoklásb;»; Ugandámnak nevezünk minden molekulát, amely részt vesz. kötési reakciókban. Ligandum lehet tehát olyan fehérje·, amelyet normális esetben, receptorként írunk le. Az ilyen típusú receptor lehet „Ugandám” ís, a leírásban alkalmazott értelmezésben, azaz képes szignálmolefculához.kötődni.
A találmány szerinti megoldásban előnyösek a rekombináns fúziós fehérjék Printerjeinek oligornetjei, kölöoösen előnyösek a trímerek fetrameíjej (3x3 vagy 4x3), vagy a trímerek hexatnerjeí: (6x3).
Különösen előnyösek a rekotobtóm Iúzíös fehérjék áisnerje, trinterje íeíratnerje vagy pentamerje bimere vagy olígomere, ha s rekombináns- fúziós fehérje· A-fcosnpoaense a TNF-esaiádha tartozó citokin, a TNLcsaládba tartozó encián szegmense vagy a TNh-családba tartozó citokin vagy a megfelelő, TNF-családba tartozó citokinszegmens feakclonális· származéka. .Itt az alkalmazott TNF-cifökinek a megfelelő receptorokhoz kötődve a célsejtre például .apoptofíkas, pzoliferaiív vagy aktiváló hatást gyakorolnak. A TNF-cítokitdtétít alkalmazhatóuak tekintett fehérjék sess korlátozó listáját adjuk meg a kővetkezőkben: Cödóé, FasL, 7PAJL, TAT, OMÖZ, OK 3LÍAAL. LILLÁK. óm, Lí«fe?, ΙΟΓ, Cö?7fe 422% GfT&L. AFP/F FDA, FFGf és PAFF. A rekombináns fúziós fehérjék A-komponenseiként történő alkalmazásra előnyösek a fent ismertetett membránkötött 'THP-citctónek extraeelkriáris szegmensei KSlőaösen előnyösek ezek a hasítási termékek, bn az adott biológiai funkciójukat, különösen megfelelő· receptorhoz való kötődésüket megtartják. A fent ismertetett TNP'citokinek vagy TNF-dfókis-szegowsek fend értelemben vet; feakcionális származékai szintén alkalmazhatóak a rekombináns fúziós fehérjék.A-komponenseiként; A találmány különösen előnyös megvalósítási módja szerint a rekombináns fúziós fehérje A-kompoaensei a következőkben felsoroltak lelhetnek: ( 1.39-26 L anmnssavak), PTFAÍl (95-2fí 1. a,), ÓCÓMOL (116-261. a.) ésm- vagy FFAFa (77-235. a.).
Ráadásai a találmány előnyös megvalósítási média szerint receptorokat (membránhoz kötött vagy sxttacelluiám),, különösen, a I'NF-citokinek családjába tartozó fehérjék receptorait, különösen a fent ismertetett TNF-eitokinek fiziológiai receptorait, vagy a receptorok szegmenseit vagy származékait alkalmazzuk a rekombináns fúziós fehérje A-komponeasekést Abfeaa az esetben, ha szegmenseket vagy receptorokat alkalmazunk A-konponenskést, ezek közelebbről az ilyen típusú receptorok fiziológiai fehétjeszefcveucíájának. olyan szegmensei, amelyek fiziológiailag membránon kívüli (extemembrán)^irendezödésüek. Az Ilyen típusú receptorok extracellulátis szegmenseit különösen figyelembe keli vennünk. Például a találmány szerinti megoldásban receptor, különösen a TNF-ciíokiacsaláába tartozó citokin kötő receptor (Fss/f, CDJfe CD4fe Gfírt, LVF-F? és/vagy 13/0-/(3) kőtödoménja (ifonséfilaí) elhelyezhető dimerizáló· immunglobulinon (dimerizáló Fcíragmensen), és ezek a -dimerek maguk bimerizáösatok vagy oligomerizáiii&híak bimer- vagy oligomerkomlexefcké a találmány szerinti megoldásban B-komponenscu keresztül, például dimerek vagy tnuiíinaerek himerlzálására vagy ollgooíerizálására való képességgel rendelkező ko-llagénszerü szegmensen keresztül. Ebből a célból például dhnerek vagy muiiimerek iet-ra-merjét (pl- az ACPR3Ő tetrsnserképzö· szegmensén keresztül), vagy dimerek vagy muhimerek peataerjét (pl a COMP-komplex monomerje megfelelő· szekveaelatószleíét Bkomponensként altedmazva)· tekintetbe vehetjük.
Λ találmány szerinti megoldásban a következő lehetőségek adottak: a rekombináns fúziós· fehérjéhez kiválasztott A-komponens, amely alkalmas a találmány szerinti oligomer komponenseként történő alkalmazásra, már oldatfórmában is dimerként vagy muitimerként fordul elő. Az ilyen esetben a 8-komponens csak fokozza az A-komponens dimerizáciöját vagy tnulíimerizációját, és alapvetően a rekombináns fúziós fehérje himerizáe-iójához vagy oligomerizáciöjához: vezet. Ez az eset valósai meg: például, ha A-kooxponensként, legalább egy TN.F-íigandmrtot vagy annak szegmense vagy származéka, amely már oldatban, tipikusan trimetizálf állapota, kerül oligomerizáh: állapotba fúziós- féhétj-e komponenseként (komponenseiként). Abban az esetben, azonban, ha az A-komponens mint olyan oldatba sem maist semmilyen, a felszíni kölcsönhatás által -közvetített dimerizáeióí vagy nmhiineri-záeiöi. a találmány szerinti megoldásban a B-komponensnek nemcsak az A~ kompoaens dlmetizáeióját vagy nruhimerizáeiéjás. kell biztosítania, hanem a dimerízáít vagy muitimerizáít rekombináns fúziós fehérje bönerizáeiöjáí vagy oíigomerizációját is. Ez szükséges tipikusan például abban az esetben, ha a rekorahitxám fúziós- fehérje A-kompenensót receptorok vagy azok szegmensei alkotják.
A leírásiján ismertetett találmány szerinti megoldásban rekombináns fúziós fehérjék dinsexjei, trimeijei, tetramesjei vagy pentsxnerjex által alkotóit bixnereket vagy oligomereket tárunk fel, ahol a fúziós fehérjékben az A-komponens előnyösen antigén vagy antigénszegroens. Szükséges, hogy irt virális, bakteriális vagy protozoaeredetű patogénekből származó tóítigástóket aiktsbnazzunk, Ezek lehetnek paíogén bármely tipikus antigénje, például fehésjeszegmeasek és/vagy specifikus ssénbidtátszetkezetek, -azonban ezek tipikusan a megfelelő patogének felszínt antigénjei vagy a patogének felszíni antigénjeinek olyan szegmensei, amelyek szintén antigén-tulajdonságokat mutatnak. Például az elképzelhető módon alkalmazható példák nem teljes- listája: hemagglutinia, neuranslmdáz, EAA/, ,/W?A ffi/s-andgétg gp!2P, vagy akár tipikus tamoraatigének.
A találmány előnyös· megvalósítási módja szerint a rekom bú-árt» fúziós fehérje -A-kompoxtense lehet olyan aminosav-szekveneia is, amely alkalmas, hordozóként receptor-agonista vagy receptor-antagonista számára. Például farmakológia! hatóanyagként aktív, kisméretű, szerves kémiai molekula tipikusan -lehet kovalens módón kapcsolva ilyen típusú anúnosav-szekveaciához kapcsolva, példán! neonjához vagy szerinhez étexkötéssel, amídkőtéssel vagy -észtenkötéssel. A találmány szerinti tnegoldásban például IS fúziós fehérje (pl. 3xó fúziós fehérje) nagyméretű oligomerkoa'spfexoíí bocsátjuk rendelkezésre, amelyek mindegyüké receptoragomstákkai vagy receptw-antagőnistákkal van ősszekapcsötei. ilyen módon lehetséges az ilyen típusú, szerves kémia) molekula megfelelő receptorokhoz való- hatásossága vagy aviditása jelentős mértékű növekedésének elérése, ha bimer vagy oligomer féhérjehordo-zón van elhelyezve, például humán vagy állatorvosi célú gyógyszerben hatóanyagként történő alkalmazásra.
A rekombináns fúziós fehérje B-komponense, amely a bimerbea vagy oílgomerben dimerízáfvs vagy oligomerizáíva lordul elő, tipikusan a -Clq-fehérjék: vagy a ko-llektíaek családjába tartozó fehérje. Különösen előnyösek a CI q-fehériék vagy a kollekíiitek családjába tartozó fehérjék a rekombfeúas fúziós fehéíjék .komponenseként, konkrétan B-komponenskéní, legalábbis akkor, ha dímerizáló/muhünerizáló szekvenciájuk -vagy bimerizálö'oiigonrerizá-ló szekvenciájuk a rekombináns fúziós fehérjében transzkripcióra vagy transzlációra kerül. A tőképpen gíoőulárjs fejdoménok (14. ábra), amelyeket tartalmaz a natív- monomerek szekvenciája,
ezáltal transzlációs termékként nem jelennek meg a .találmány tárgyát képező rekombináns fúziós fehérjében, és ezáltal nem összetevőik a fehérje B-kompottessének.. A -találmány szerinti. rekombináns. fúziós fehérje fent ismertetett B-komponense tipikusan átlapoló szekveneiájú, és ennek megfelelően dimerizáclős/multimerízációs vagy feímerizáció&ádigomerizáeiős funkcióval rendelkezik, sitivel a feni ismertetett fehérjecsaíádok fehérjéinek koílagéuszerü szegmensei, amelyeket B-kompouensként alkalmazunk, tipikus módon például tripla hélixek kialakításában vesznek részt, amelyek maguk rendelkeznek más tripla héiixekkeí bhrser vagy chgomer szerkezet kialakításának képességével.
Ezáltal tipikus módon a makimért és oligomert képező fúziós fehérje olyan B-kompoaensként a. Clqfehérjék vagy a koliektinek családfába tartozó fehérjék olyan doménjalt tartalmazzák, amelyek a dimerlzádós/multimerizációs, vagy bimerizációs/okgomerizációs jelenségekért felelősek, mig a megfelelő fejdománokat A-kosnpouessként más fehérjékkel vagy fehérjvszegmensekkeí helyettesítjük, amelyek szintén biológiai funkciót hajtanak végre. A „rekombmáús fúziós fehérje” kifejezési a leírásban minimálisan egy Akomponensre és nrimmáiisan egy B-kot»p<mensre értjük, amelyeket a rekombináns fúziós Fehérjében mesterségesen íuzfeuálíattank, azaz a találmány leírásában a fúziós fehérje alatt nem értünk természetes körülmények között előforduló fehérjét.
A Clq-esafádba vagy a .koikktleck családfába tartozó fehérjék funkcionális:, azaz bimetizáló vagy oligomerizáló származékai, vagy a fenti fehérjék szegmenseinek származékai szinté® alkalmazhatóak. Bkomponensként a ídkombináns fúziós fehérjék 'bimerekké vagy oiigomerekké való aggregáltatásában. Ebben az esetben- például a B-komponens tartalmazza a Cl q, az Α®Α, az ŐA-A (a tüdő felszíni A-fehérjéje), az ÓT-D (a tüdő felszíni I>~ fehérjéje), 8Ü (marbaerédetü 43-as· keífektsai és/vagy az rtÖAAJd febérjeszekvencíáját, vagy a térni fehérjék közül legalább az egyik fehérje bimerizálő vagy oligomertzálő szegmenseit, vagy e fehérjék vagy szegmenseik ntnfcciouáiis származékait vagy a funkcionális származék szegmenseit. Előnyösek a rekosnhmáns fúziós fehérjék kimérjél vagy öligomerjei, ha a rekombináns fúziós fehérje · B-komponenso a €lq~fehérje vagy az rtüKAJÖ-fehérfe fehárjeszegmense, különösen a humán eredetű vagy emlős· eredetű változat, még előnyösebb az egéreredetü változat, ami által az ilye® típusú, megfelelő fehéxjeszsgmens nem tartalmazza a natív Clqfehérje vagy az rtCEAdő-fehérje globulsris fejdomónjáí.
A találmány egy különösen előnyős megvalósítási módja szerint a találmány tárgyai képezik olyan rekombináns fúziós fehérjék dimerjei, íriaieriei, teksmerjei. vagy peatametjei áltól alkotott kimerek vagy oiigomerek, ahol a S-kömponens tartalmaz a 6A. ábrán-(bekeretezett szekvencia), vagy a 6B. ábrán bemutatok smdaosav-szekvmciát. vagy e szekvencia (szekvenciák) feukcíonális. származékát, és/vagy e szekvencia (szekvenciák)· szegmesét. Tipikus módon ez a szekvencia az «;rtíA?B.?Ö-felferje <m: „muríne, azaz egéreredefű) szegmense, például a 18-113. amioosavakaf tartalmazó szegmens, vagy a humán· eredetű, változat (AdCAPJŐ) szegmense, például a 38-1 OK amínosav. Közelebbről a taláhoány szerinti megoldásban ezáltal olyan Srizrós fehérjét biztosíthatunk, amely A- és B-komponense tartón eredetűek, így a terápiás alkalmazás során a lehetséges immtmreakelök kizárhafóak.
Különösen előnyösek a különböző gazdaszervezetekből származó szekvenciákat tartalmazó fúzié>s fehérjék dimerjei vagy umltinmrjet állal alkotod kimerek. Még előnyösebbek azok a találmány szerinti aggregátumok, .amelyek olyan, kánéra jellegű fúziós fehérjéből szárínazsak, ahol .az A-komponens és a B-komponens .különböző áliattípusbói származik. Előnyös lehet, ha az A-kompooens egérből, patkányból vagy más gerincesből, különösen emlősből származó aminosav-szekvencla, vagy annak funkcionális származéka, és a B~ komponens humán eredetű, vagy megfordítva. Például szintén előnyösek azok a találmány szerinti fehérjék, amelyek A-kompoaense vírusból, bátoraimból származó vagy protozoaereifelű szekvencia, amely humán eredetű ö-komponenssel van. kombinálva·. Ténnészetesea a találmány szerinti rŐ2iós· fehérje A-komponense és Bkomponense szekvenciái származhatnak ugyanabból az áíiaíiipushői.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós fehérje multimerizációja és/vagy cdxgomerízáöiója rövid ummosav-szekvescíáo keresztül megy végbe, amely több, mint 6 am «sósavból, előnyösen -8-2!)· aminosavfeól áll, amely a rekombináns feziós fehérében B~komponensként van jelen. Az oldatban dimerkénl' vagy midtlmerként előforduló fúziós fohésjék btmertzáctója vagy oügomerizáeiója, amely nem másod-h&rmadlagos szerkezeteken keresztül, hanem felszíni kölcsönhatásokon át, tipikus módon e rövid amioesavszekvenciákat érintve megy végbe, előnyösen diszuílídhidák kialakulásán alapul, amelyek lehetségesek a rekombináns .fúziós- fehérje specifikus amixuxsttV'S^ekvenciájábam Ez azt jelenti, hogy a B-komponens előnyösen tartalmaz legalább egy císzteim, amely exidativ körülmények között kovalens kapcsolatot létesíthet legalább egy másik dhaerben vagy multlmerbes a fúziós fehérje legalább egy ciszteinjével. Az előnyős esetre. amikor a ö-komponeas tartalmaz egy rövid, 8-20 amínosavat tartalmazó ammosav-szekvenciát, amely bimerizái vagy olígomerizál, a VDI.EGSTSfeGRQCAGiRl,-atítinosav-szekveocis tegybetös kóddal jelölve) említhető· példaként. Ez a lb ammosavlxil álló szekvencia a 11. pozícióban tartalmaz egy ciszteint, amely a dimexek vagy maltimerek között díszülildóidat képezhet.
A fenti 18 amínosavat tartsAmszó szekvenciák szegmensei vagy funkcionális száxxaazékal alkalmazhatóak B-komponensként, Itt közelebbről a VDLEGSTSNGRQSAGIRL-szekveaciát kell említenünk, amely biztosíthatja a fikriosfehétje-multlmerek bimerizációiáí vagy oügoxneri2áciöját, noha a II. pozícióba® a cisztein szerinre van cserélve,
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós fehérje lehet ágy elrendezve,, bogy magasabb rendű aggregátumok .alakulhatnak ki a fúziós fehérje dimetjei. vagy multimexjei által alkotott hímeteken vagy olígomereken felül. Az ilyen, magasabb .rendű aggregátumok,.amelyek két vagy több bimert vagy origómért tartalmaznak, előáll ithatósk például antitestekből keresztkőtóssek Az antitestek a találmány szerinti megoldásban afúziós fehérje (felterják) epitópjoí elleni armfestek, előnyösen a B-komponens- epitópja elleni antitestek. A fúziós fehérje A-komponense. és a B-komponense azonban együttesen .szintén rendelkezik további szekvenciarészekkel, amely a keresztkötö antitestek számára antigéneket szolgádat. Ezzel kapcsolatban a találmány szerinti tnegoidásibsR előnyösek az űn. toidalékszekveíiciák, például a _$ag-szekvencia, vagyis· a PYKDDDDKszekvencía, vagy például a dfe-toldstek is (amely néhány, egymást követő hiszíidtet tartalmaz).
A találmány szerinti megoldásba® specifikus preferenciákkal rendelkezik .különösen előnyös az olyan, magasabb rendű aggregátumok biztosítása, amely egynél több B-tagot tartalmazó rekombináns fúziós fehérje Btagjam keresztül alakul ki. Előnyösen a magasabb rendű aggregátumok kialakítása céljából a fúziós fehérje testaímaz Bl-komponenst oligomerek fei-mexjei kíalakfcásáxa,. és tegulább egy másik B-komponenst {előnyösen egy 82-komponenst), amely dpikusaa különbözik a Bf-konrponenstöl. A találmány tárgyát képző bűneiben vagy oíigomerben legalább .az egyik fúziós fehérjében megtalálható 82-komponeas biztosítja, hogy a felmerek vagy·· ohgomerek magasabb rendű aggregátumokat alakítsanak ki. Példáid a Bí-komponens lehet a Clqcsaíádha vagy a kollekímek. családjába, tartozó fehérje bimerizálő vagy oligomerizáló szegmense, a B2komponens pedig olyan szegmens, amely mérete 8 ás például 28 aminosav közé esik, és amely legalább egy í&zuifidhídat kialakít. Abban az cselben,, ha két különböző ofigomer között legalább egy di-szalfidh id kialakul.
a találmány szerinti magasabb randa aggregátnm, például. obgomer bimerje válik hozzáférhetővé.
Ráadásai előnyös az un. kapcsolőszskveacia beillesztése A-köntponens és B-komponens (komponensek) közé, vagy abban az esetben, ha több B-komponess- van a fefe feli-étjében, akkor kapcsolószekvencia beillesztése mi»immn két koxnpooetjs közé. Ezek a kapcsclószekvenciák lehetővé teszik a rekombínáns fúziós fehérjében a különböző funkcionális komponensek szerkezeti elfcöőmtéséí, és hordozhatnak „osuklőpánt” kóöjgrt's hinkclót, azaz tehetnek flexibilis szerkezeté aminosav-szekvenciák,
A szabadalmi leírásban általában feltárnak a találmány szerinti fexmereket vagy oligomereket, vagy magasabb rendé aggregátumokat, amely ekre jellemző a megnövekedőit biológiai 'hatásosság és/vagy komplementer fehérjékre vonatkoztatott megnövekedőit aviditás. Ilyen módon a találmány további tárgyaként feltárunk, olyan eljárásokat, amelyek a találmány szerinti értelemben Ixgamiuntfunkc.tóval rendelkező bíornoiekulák vagy drogok biológiai hatásossága és/vagy avidiíása megművelésére szolgálnak. Az ilyen típusú eljárásokra jellemző a kővetkező- komponensek rekombinációja; legalább egy A-bomponens, amely biológiai funkcióval rendelkező fehérjének vagy fehérjeszegxöeosnek felel üteg, és legalább egy B-koxapöaens, amely dimerizáló vagy snultimsrizálő, és bimerxzáió- vagy ohgonierízáló, ami által az A-komponem· biológiai aktivitása és/vagy avidiíása növekedését valósítjuk meg azáltal, hogy a rekotrihináns fúziós fehére végül bimeriz-ál vagy- maiíimerizál mrdtimerek és áinterek bixnerjeivé vagy ol'igomerjeivé való möiíi-merizáciőja és oligomerizációja által. Az eljárás különösen előnyős akkor, ha az A-kompo nens TNF-exIokxa, vagy 'TNF-cnokin-szegmens, ilyen fehéxje származéka vagy féhéíjeszegmense; Egy további, előnyős eljárás legalább egy A-komponensaék legalább egy B-koxnponenssei rekombínáns fúziós fehérjévé történő rekomhináelója, ami által a legalább egy A-komponens receptor, előnyösen a TNF-családba tartozó receptor vagy annak szegmense. Figyelembe véve az ilyen, találmány tárgyát képező- eljárásök előnyös megvalósítási módjait, a találmány előnyös megvalósítási módjait a fent ismerteteti btmerek vagy ollgomerek esetében analóg módon alkalmazzék.
A találmány tárgyát képező bimorek vagy olíg-omerek alkalmazhatóak drog -előállításában:, vagy betegségek vagy rendellenességek kezelésében orvosi alkalmazásokban, azaz humán gyógyászatban és állatgyógyászatban egyaránt. A találmány tárgyát képező, «innak megfelelően hímetekből vagy olígomerekböl kialakuló, magasabb rendű aggregátumok szintén alkalmasak drogként történő alkalmazásra vagy drog előállításában való alkalmazásra. Betegségek és rendellenességek széles köre kezelhető a találmány oltalmi körébe tartozó biswekkel, ohgomerekkel vagy magasabb rendű aggregátumokkal. Az -ilyen típusú bimerek, oligomerek vagy magasabb rendű aggregátumok alkalmazhatóak a kővetkező, sem korlátozó jellegű felsorolásban szereplő betegségek vagy rendellenességeik kezelésére szolgáló drogként: gyulladásos temlellenességek iéyeesisAömmn/öíy J&ordw), autoitnrmm jellegű rendellenességek, hiperapoptotikus vagy mpoapopmíikos reakciókon alapuló betegségek, neuródegeneratlv rendellenességek; alkalmazható azonban fertőző betegségek, tumorok és/vagy endokrinológiai rendellenességek kezelésére is. A fertőző betegségekre tekintettel blmerek és óligooserek alkalmazása bakteriális vagy protoeoonok által ökozott betegségek esetében, de különösen vírusfertőzés esetében hivatkoznunk kell arra, hogy paratópokat hordozó antitestek vagy szegmensei szegmensei különösen előnyösek A-komponensként a rekombínáns fúziós fehérjében. Blmerek, ollgomerek vagy nmgasabb rendű aggregátumai speciálisan alkalmasak akkor, ha a betegség kezeléséhez biológiailag aktív cttokixsek szükségesek, például többek kozott a nytiokrendszer (feoutiíiWte ri-aten;) tuxuoijat kezelésében.
Ráadásul a találmány tárgyát képező bimerek vagy ollgomerek alkalmazhatóak vakcinaként vagy vakcina előáll húsában fertőző betegségek elleni aktív vagy passzív immunizálásra is. Az aktív immunizálás esetében vakeinázásra alkalmas antigént alkateaKuok a rekombbiáns iúzíös fehérjében A-komponen-sként Közelebbről alkalmazhatóak baktériumok, vírusok vagy protozoonök, például piazmodiumok vagy trip&noszőmák felszíni antigénjei vagy felszíni antigénjei szegmensei. A legalább egy .A-kcmiponensí, vagyis a patogéa egy vagy több, áznom vagy különböző antigénjét tartalmazó rekotshináns fúziós fehérje bimesieit, oligomerjeií: vagy aggregátumait iartalmazó vakcina a kővetkező, nem korlátozó jellegű listában felsorolt betegségek ellent vakcmázásban alkalmazható: rubeóla, kanyaró, poliomielitisz, veszettség, tetanusz, diítéria, BCG, tuberkulózis, malária, sárgaláz, Hív vagy influenzavírusok, például rhúíovirasok által okozott betegségek, A találmány szerinti megoldásban a feitnerben vagy oligomerben, vagy a bimerek vagy ollgomerek által alkotott magasabb rendű aggregátumban különböző antigének kombinációja, is lehetséges, ami által az adott patogéahől származó, különböző antigének konxhinálhatőak a bimerben vagy az obgosnerben, vagy két vagy több pafogénből származó antigének kombiaáiixatóak a bimerben vagy az: oiigotnerben, vagy a magasabb rendű aggregátumban. Tipikus módon a fúziós fehérje tartalmazhat két vagy több Al -, A2-, AX-kosapoaenst, amely fúziós fehérje így a találmány tárgyát képező hímet vagy ob'gomer vagy magasabb rendű aggregátum komponense; vagy két vagy több fúziós fehérje, amelyek különbözőek az A-kompoueusre nézve, kombinálható bimerben vagy okgomefbea vagy magasabb rendű aggregátumban, legalább egy δ-komponensen keresztül.
Előnyösen drogként vagy vakcinaként alkalmazható készítmény tartalmazhat legalább kettő, a találmány tárgyát képező bimer- vagy ohgomertipust, vagy azok alkalmazhatóak drog vagy vakcina előállításában.
A találmány ogy tovább; előnyős megvalósítási módja .szerint a találmány tárgyát képező fúziós fehérje A~kompotteit.se immmxmoduíátot, jfeídául interleakírt (IL), közelebbről IL-2.
Ráadásul a ialúbríárty megvalósítási módja leírásában feltörjük a találmány tárgyát képező bimerek vagy oiigomerek immujiizálási és/vagy vakeinázási adjováíssként történő alkalmazását. Ismeri tétty. hogy sok, immunizálásban alkalmazott antigén a teztszemélyhen nem kielégítő hnmunreakciőí vált ki. Az odjuváw feladata az immunogén hatás növelése. Az ilyen típusú adjaváns alkalmazható a találmány tárgyát képező fúziós fehérje Akomponenseként, és ezáltal a találmány tárgyát képező bimer vagy ohgomer komponenseként. Például az Akomponens tartalmazhat a CD4ö-líga«dumböl tíAóeíJé) szánaazó aminosav-szekvenciát, vagy inierieukin, például az 1-12 interleukin egyike szekvenciáját vagy szekvenetarészét. A ü£Wá fiziológiai szerepe az inaktív B-sejf sejtciklusban történő transzformációjának szabályozása. Interiéukinok, például az ΪΙ.-4, tt-5, 11,-6 és/vagy o CD4ŐL kombinálható a találmány tárgyát képező bimerizóit vagy oligomerizált komplexben (bimerben vagy ollgomorbcn különböző rekombináns fúziós teltet jek), vágj· lehetitek készítmény komponensei (legalább két különböző típusú bitner vagy oligomer, amelyek mindegyike azonos, vagy különböző fúziós fehérjéből alakulhat ki), amely készítmény tipikusan tartalmaz legalább egy, előnyösen két vagy több különböző típusú, a találmány tárgyát képező bimeri vagy oligömert, Insímmogénnel íámanogénekkel) együtt.
Az slyen típusú készítményben a bimer vagy obgomer vagy magasabb rendű aggregátumok felépülhetnek olya» fúziós fehérjékből, amelyek azonosak vagy killösbózóek az A-kotuponens (Á-komponensek) tekintetében. Ezáltal mindé®, kostinmiálő jellemzőkkel, és/vagy nnsnunrendszeri (ceiluláris vagy humorúim immunválasz) aktiváló jellemzőkkel rendelkező fiziológiai szekvenciát A-komponensként tekinthetünk. Ezek lehetnek fiziológiai vagy szintetikus vegyületek. Ilyen módón olyan készítményeket társuk fel, amelyek egy vagy több, a találmány tárgyát képező bimer- vagy oíigonterttpusi: tartalmaznak egy vagy több ísxnxnaogénnef i immtmogénekkel) együtt, ami által a találmány tárgyik képező bimer- vagy obgomertipus előnyösen úgy lehet elrendezve, hogy egynél több mmmmncdulátort / ínmxunnxodaiátor adiovánst tartalmazzon az ilyen típusú
öircíerizáU vagy nbgoamrlzák komplex, azaz a komplex hetereböner vagy heteroolrgomer legyen. Szükség szerint a találmány tárgyát képező feetenoblmer v&gy betetmoügomer egymás mellett tartalmazhat nemcsak egy vagy több fúziós fehérjét és mmmogént A-kon^oaeróós,. hanem legalább egy fejős fehérjét adjuváttsknníponenssel A-soniponenskéot, példáéi C&ZöL-t. Két vagy több különböző fúziós fehérje, amelyek mindegyike .különböző-adjeváns vagy iramusmrndiüáior-komponeM, szintén elképzelhető a találmány tárgyát képező· heterooligometben. Ea azt jelenti, hogy a találmány szerinti, megoldásban feltárunk a találmány tárgyát képező, ilyen faomoolsgotner- vagy hetetooiigomer-típtts, vagy a legalább egyféle heterooligome?- vagy bomooligomertipust tartalmazó keverékek humán vagy állatorvosi gyógyászaiban, drogként vagy vakcinaként történő alkalmazását.
A találmány szerint} megoldásban· előnyösen a hímeteket vagy oligometeket .alkalmazzuk a fent ismertetett betegségek vagy rendellenességek kezelésére szolgáló· drog előállítására, olyan módon, hogy azok alkalmasak legyenek parenterális beadásra, azaz: például szubkután, inframuszkuláris vagy intravénás beadásra, vagy akár orális vagy irtotsazálts beadásra. Simerek vagy ©ligonwek vagy ezek aggregátumai vakcinaként történőbeadása (vagy ilyen vakcina előállítása alapjaként történő alkalmazása). szintén parenterális vagy orális tonnában történik, azonban-szükség esetén ezek intranazálisan is alkalmazhatóak.
A találmány tárgyát képező kimerek vagy oiigotnerek és/vagy magasabb rendű aggregátumok alkalmazhatók magukban gyógyszerként vagy gyógyszer előállításában. Alkalmazhatóak azonban gyógyszerként más aktív hatóanyaggal együtt Is. A találmány tárgyát képező kimerek vagy oh gomerek és/vagy magasabb rendű aggregátumok kombioálhatóak gyógyászatilag elfogadott hordozókkal, segédanyagokkal vagy adalékanyagokkal is. Alkalmas előállítási útvonalakat tár fel Remlngton kiadványa (Remington's· Pharmaceutical Sciences, kiad.: Mack. Pub. Co., Easton PA {1989)1, amelyet teljes terjedelmében a leírás részének tekintünk. A parenterális beadás céljára .alkalmadnak tartott hordozóanyagok például: steril viz, steril NaCl-olöatok, políalkiiénglikoiok, hidrogénezett nalialro.ok és különösen biokompatibilis tejsavpolanetek, tejsav/giikolkopolimerek vagy polt-oxíeriléö/polr-oxtpsopilén-kop<ihmerek.
A találmány tárgyát képező bimerek. vagy oiigomereá vagy a megfelelő magasabb rendű aggregátumok szárién előnyösen alkalmazhatóak az r« v/a-o diagnosztika, vsgy például biokémiai tisztítási eljárások területén. Tekintetbe keli vernünk bimerek vagy oiigotnerek és/vagy ezek magasabb rendű aggregátumai tisztítási célú oszlopokon történő alkalmazását, ahol az oszlopokba töltjük az ilyen típusú komplexeket. Ez -azt jelenti, hogy a találmány szerinti megoldás leírásában lehatjuk az ilyen típusú komplexeket detektálási célokra is.
Ráadásai a találmány szerinti megoldásban leírásában feltárunk eljárásokat, amelyek olyan, specifikusan asszociált fehérjék előállítását szolgálják, ahol a fehérjék felszínükön kölcsönhatásaik által asszoc iálódnak, és ennek eredményeként oldatban dimerizáli vagy rmthímerizált formában találhatóak. Közelebbről a TNFchokinek esetében, vagy előnyösen az ilyen, oldatban trtmert képező citokiatipasok szolobilis szegmense esetében szükséges, hogy azokat meghatározott sztőehmmetóa (összetétel) szerint, tiszta frakcióban hozzáférhetővé tegyük. Különböző,.egymással asszociációra képes fehérjék, például három különböző TNF-ciioksn vagy ilyen TNF-cítokmek különböző szegmense egyszerű· koexpressztéja esetében a koexpresszáit lekérjék minden, statisztikailag. lehetséges eloszlása megtalálható- lesz. az .asszociált teaserben az expresszió utáin vagyis például a Pl-, P2- és P3 - fehérjékből a kívánt fehérje, azonban két fehérjéből, a Ei-böl, a P3-febétjéböl képződött tetőterek is, stb.
A találmány szerinte oligomerek. most alkalmazhatóak az eljárásnak megfelelően meghatározott, kívánt » » heteromultimerek, például TNí-'-citokinek vsgy Ilyen típusú TNF-eitoklaek szegmensei heterotríroerek elöállitásában. Ebből a célból különböző Fúziós fehérjéket aikohsnk meg és előnyösen gazdasejíben expresszáljuk. Az irt expresszált fúziós fehérjék rendelkeznek a fehérje δ-kompmens-íészéveí, amely heteroínulfimerekból homooligomersket képez, pékbfel báróin különböze láncból trénert képez, ami által azonos Pímerek blmsrizáln&k vagy ollgomerizátek. Előnyösen a feles fehérjék ilye» B-komponensei a komplement- vagy koilektm-íehérjecsaiádba tartozó fehérjék, példán! a Clq szekvencjarészeive? egyeznek meg, amelyek heterotrlmerekböí homohexamereket alkotnak. Bűnek következtében a ferós fehérjében olyan szekvencíaiészletet, amely a natív fehérjében. egy lánc heteFemultbnetbea való nmlEmerizációja célját szolgálja, B-kompouenskéut A-kensponenssei, például TNF-eiíokmnel kombinálunk, raig más fúziós fehérjékben, (amelyek a heteroüímerben fordulnak ele), mmdegyiket más A-kompenens-koínbinácíékknl, (például más TNE-cimkiu vagy szegmense), a natív fehérje másik szekvenciarészévei;, például C iq-fehérjével, heteromtrlnmertzáció céljából kombinálunk.
A különböző, heteroumkimer képzésére képes fóziós fehérjéket expresszáljuk, előnyösen gazdasejíbeu. A heteromuitlmexok bomoolígomemkké kombinálódnak, mivel a B-kowponeas csak azonos heteromuitsmerek olígomerizácíójára képes. A találmány szerinti megoldásban. például espresszálhatuak. három különböző fúziós fehérjét, mindegyiket különböző Λ-komponenssel, azaz előnyöset· különböző TNf-citoklnnel, amelyek mindegyike kombinálódik a Clq mnltimerizálö és ohgonterfeáló «-, jj- vagy y-lánea bármelyikével. Csak mindhárom TNF-citokist tartalmazó heferomultimer&k. találhatóak meg az asszociáló olígomerekben. Ezzel szemben különböző sztöchíometriájú (Összetételű) heteromnldmereket aetn találunk. Ez azt jelenti, hogy g találmány szerinti megoldásban a fóziós fehérjék egyszerű megválasztásával olyan terméket kaphatunk, amely sztödnometriájában (összetételében) specífíkus és felszökni eloszlás rá nem vonatkozik.
Ráadásul zz ilyen fejős fehérjék vagy eljárások alkalmazása előnyös olyan, adott: sztöclúomesriájó í Öszszetételű) heteromulómerék extrskcioja céljára, amelyek az A-komponens és a között kapcsolói tartalmaznak. A kapcsolók speciálisan előnyösek, ba azok tartalmaznak legalább egy proteolitikas hasítóbelyet, amely lehetővé •eszi, hogy a (heteromultimerekbó! képzett) bomooíigomeföen-komplexhen az A-komponens a Bkon-ponensböl lehasítható legyen. ilyen módon olyan irakeiőt kapunk, amely kizárólag a kívánt heteromalmnen, például a különböző TNT-citoklnsk heterotrimerjét tartalmazza. A kapcsolóban a proteohtíkus hasítási hely előnyösen a trombiü konszenzus-szekvenciája.
A találmány egy további tárgyát képezik olyan, itt Ismertetett fúziós fehérjék, amelyek alkalmasak dimerek vagy muhimerek himerizálására vagy multimerizáiására, amennyiben a rekombináns fúziós fehérje tartalmaz legalább egy A-komponensí és legalább egy B-komponeast, mai által az A-komponens tartalmaz biológiai funkcióval, közelebbről sütitesfekre vagy receptorokra, vagy antitestszegmensre vonatkozó feíolögisl funkcióval rendelkező fehérjét vagy fehérjeszegmenst, és a B-komponeus tartalmaz dimerizáló vagy muitimerizáló és bimerizálő vagy oligomerizáló fehérje szegmensét vagy annak funkcionális -származékát, amely tartozhat a Clq-fehérjék vsgy a. kollektinek családjába. Különösen .előnyösek sz olyast típusú fehérjék, amelyek, esetében a B-komponens tartalmazza a Clq-, SP-A-, SP-D-, BC-, CÍ.43- ős AOAW-fetójék muitimerizáló és/vagy oligomerizáló szegmensét. A férni fehérjék ilyen szegmense fekcíonális származéka szintén, alkalmazható a találmány szerinti megoldásban. Ebben az esetben, ira az A-komponens rendelkezik biológiai aktivitással, a föziós fehérje tipikusan tartalmaz olyan B-komponenst, amely kizárólag a fenti fehérjék aggregációért felelős szegmensét tartalmazó B-kompenenst tartalmaz, de előnyőseit nem tartalmazza azok glöbnlárís „fejdoménját”.
« κ
Az EDA-iigaíídorsi, közelebbről emiöseredetű változata, még közelebbről a humán eredetű változaís oligomeriznió kollagéöífoménja vagy oligomerizslö fragmense vagy iúokcioifelis származéka aminosavszekvenciáját tartalmazó szekvencia szintén a találmány tárgyai képező feziós fehérje B-komponensének tekinthető. B-komponensként még előnyösebben alkalmazható a humán eredetű £'£fl-fehérje 16Ö-242 atntnesavát tartalmazó· szekvenciaszegmens vagy funkcionális: származéka, példás! öagmease. Ez vonatkozhat előnyösen hexamerre.
A találmány egv további tárgyát képezik DNS-szekvencsák, amelyek a fenti fúziós fehérjéket kódolják. Az. ilyen tipusá .DNS-szekvenelákat expressziós vektorokban expresszáljak, ami által a megfelelő expressziós vektorok, amelyek tartalmaznak a találmány tárgyát képező fúziós fehérjét kódoló DNS-szekvouciát, szintén a találmány tárgyát képezik.
Ráadásai fúziós fehérjéket kódoló DNS-szekveneiákfcal tmmzfektá-lf gazdasejtek szintén a találmány tárgyát képezik. Különösen előnyösek azok a gazáasejtek, amelyek olyan expressziós vektorokkal vannak transzfökiálva, amelyek szintén tartalmaznak a találmány tárgyát képező· fúziós fehérjéi kódoló DNSszekvene iákat.
A találmány egy további tárgyát képezik receptorok. közelebbről olyan receptorok, amelyek a TNFcitofóncsalád jelátviteli ligandummoiekulálíi köti, és amelyek dimerizálva vagy mnltimenzálva fordulnak eló. Példád sz ilyen típusú receptor, annak származéka vagy a receptor vagy a származék sáegmese, különösen a receptor extmcélluláris régióját tartalmazó szegmens, ahol ismét a kötődőmén (kötődőmének) előnyös, a dimert vagy makimért képező fúziós fehérje A-konsponense leltet. A. dímerizáető megvtdósíthato immunglobulinok szegmenseivel, különösen Fc-fesgmenssel való kombinációval, míg a malíimerizáeió megvalósítható például ieltérjék megfelelő tnultimerááló· doménjaival való rekombinációval. Ebből a célból alkalmas például minden olyan felferfeszegmens, például amely másod-harssadlagos szerkezetek, példán! szuperbelrkális hélíxek, vagy tipikus kollagénszerü tripla bélizek kialakítása revén képez dinrereket vagy multímerékel (pl. CÁ/P, COAfP, kollagén, laramítt). A Clq-ssaládba vagy a. koifektmcsaiádba tartozó fehérjék szegmensei szintért tipikusan alkalmasak receptorok vagy receptorszegtnensek .dimerissációjára vagy multimerizáclójára. Például a TATreeeptorcsalád tagja, például a (vjs-receptor (Tasi?) extracellíii.áds szegmense Á-k.om.potiessként pentamer formában expresszálható B-komponensként a CÖMP megfelelő pentamerizálö dotnénjaival való rekombinációval. Itt előfordulhatnak fúziós fehérjék homodimerjst, beierodimerjei vagy hoteramultimegei, amelyek tartalmaznak receptort vagy receptorszegmenst.
A rekouibináns fehérje ilyen dimeijet vagy msltimeijei, amelyek A-komponcase tartalmaz receptort vagy recepíorszcgroetisl, szintén tekintetbe vehetők gyógyszerként vagy gyógyszer előállítása céljából.. Alkalmazásuk különösen akkor adódik, ha a megfelelő Irgandumkoaoentráeió extraceüulárís növekedése jelenik meg a klinikai tünetek kozott, itt magán a sejten a raembránkötőtt jelátviteli molekulák, például a TNE-odokinek, vagy a szoiubüls jelátviteli molekulák megnővekedeít koíteeatráeiója is szerepet játszhat. Az ilyen típusú mutesetek alkalmazása azonban általában szintén mindig kívánatos, h& a jelátviteli lánc aktivéé jóját, amelyet a megfelelő, tipikusan membránhoz kötött receptor vált ki, meg keli előznünk vagy csökkentettünk esősén, a találmáfiy tárgyát: képező, szoíubílis dimerek vagy multimerek alkalmazásával, amelyek „csapdába ejtik” a jelátviteli molekulákat, és amelyek a receptort vagy a recepíorszegmonst A-kompcneusk.éíü tartalmazó fúziós lekér; ek bö 1 állnak.
AjvőyeíkgzöáhráLa tsúfensav
Az 1. ábra bemutatja a. találmány tárgyát képező 2. sz. rekorsbluáns fúziós feltétje aminosavszekvenciáját -egyhetüs kóddal, amely oiigomer fomtáhan (2, í ííső-hexamer) van, azaz trimer bimetje. A ó/feví szefcvetónszegmesséi (193, vagy 139. itmínösavtől a 28 L. atnfeosavig) azonvsöjük A-komponsosként míg a specifikus. VDLEGS'TSNGRQC .AGIRL-szekvenciájú kapcsolót (amely végül bímerizál> B-kompo«ensként. Az 1. ábra tartalmazza az, I. sz. rekombináns füzsős fehérje amímssv-szekveaeíáját, amely a technika állása szerint •csak F#s&-trimer kompoxsensekent ferdéi elő, azaz nem rendelkezik B-kon^onenssel, amely a létező multimert, ebben az esetben a töméit bimerizálja vagy ollgomerizálja. A két fúziós fehérje (I. sz. és 2. sz.) rekombináns szegmenseit az 1. ábrán a szekvesciuadatok felett jelöltök a megfe lelő funkcionalitásukra tekintettel.
A 2, ábra A. 2.A. ábrás a találmány tárgyát képező 2. sz. fúziós fehérje géfelektrofotézise (SDS-PAGE) •eredményeit mutatjuk be, specifikus kapcsolöszekvenclával ©-komponens)·, redukáló ír) és sem redukáló (nr) körülmények kozott Nem redukáló körülmények között oldatban sz oiigomer a találmány szerinti 2. sz., hat polipeptidből állő natív komplexként etólóátk, mivel a találmány szerisí diszulfidhfd képződik két 2. sz. fúziós fehérje B-kompesesse között, amelyek mindegyike különböző trimersk komponensei. A kapott eredmény szerbi a találmány szermti oílgötner f ns£-h.esamer, amely molekulatömege megközelítőleg a monomerfbrmájú, találmány szerinti 2. sz. fifeiés fehérje molekulatömegének hatszorosa. Denaturáló körülmények között (pl. SDS-PAGE), a találmány szerinti fúziós fehérje redukáló hatóanyag nélkül dánéiként fut, amit két monomer között kialakuló diszulfidlűá okoz. Ezzel szemben redukáló és denaturáló körülmények között a találmány .szerinti 2. sz. fúziós Fehérje monomerjei futnak az SDS-géíen. A 2B. ábrás sematikusan bemutatjuk a találmány szerimi oligomert, itt találmány szertári 2. sz, feíésiehérje-trimer bimerjét» amint az 1, ábrán bemutattuk.
A 3. .ábrán a citetonikus mérési eljárás eredményeit matatjuk be Fítsö-trimerefc ía technika állása szerinti három fúziós fehérje, például az 1. ábra szerinti fúziós fehérje trimerjei·, ahol a fúziós fehérje nem tartalmaz Bkomponenst), vagy a 2.8, sematikusan bemutatott, találmány szerinti f osö-bimeréfc -(hexamer trimerek bímetjekéni) .koncentrációja függvényében, (feg-elfesn M2-antitesíek jelenlétében (», A) vagy távoílétében íp, A), A2ö- vagy dmAm-sejteken. A 491) nm-es méri optikai dsnxhás a sejtek életképességében mértéke (magas optikai deszkás a hozzáadott aayagok alacsony apoptotito Itatásának, és így a sejtek jobb életképességének felel meg). A őhső-üámerek találmány szerinti hinserj-ei (hexametek) (33 és 3D, mindenütt A) 3-lÖ-szer nagyobb apoptotikus hatást gyakorofeak az ^2d-s^tekre (3 A és 36 ábra) és Jtote-sejtekre (3C és 3D. ábra), mint a bimerízáló vagy oligomerlzató B-komponens nélküli fúziós fehérje (technika állása, 3A és 3C, mindenütt cs). További/ing-elleni antitestekkel,. amelyek az. 1. ábrán bemutatottak szerint az 1. sz. és 2, sz, fúziós tebéije.#ögazekveseiája elleni antitestek, és megnövelve például a találmány szeríxtti fúziós fehérje oligomerizáetós főkát további keroszikötéssel, az apoptotíkus hatás tovább növekedett minden preparátum esetében (3A-3D, ábrák, « vagy A).
A.4..ábra sí találmány szerinti fúziós fehérje aminosav-szeksenexáját mutat ja be, figyelembe véve a specifikus kapcsoíőtészben a C~»S szubsztitúciói (a 3. sz. faziós fehérje B-komponense) („szuper ífexí,”)· Lásd az 1. ábra leírását. Gélszőrésl kísértetekkel kimutattak, hogy a „szuper oldatban a találmány szerinti bimerizált formában vas! jelem hexamerkerA. Denaturáló körülmények között, az SDS-PAGE! során a találmány szerinti 3. sz. fúziós fehérjék még redukáló hatóanyagok iávollétében Is monomerként futnak, mivel nem alakulhat ki .diszulSdfetd a k&pesotórészbea a C—»S szubsztitúció míatt.
Az 5. ábrán a 3. ábra .analógiájára ,42ő- (5B. ábra) vagy Jyrto-sejtek (5D. ábra) 4. ábrát! bemutatott falálmány .szerinti 3. sz. fúziós fehérje („szuper Pasi,”)· aggregátumai hozzáadásakor méri életképességét mutatja
-Í5~ β » »·*
be, yiog-etiem M2-antitestek jelenlétében <·) vagy távoliétéhen (P>. A találmány szennti 3. sz. fúziós fehérje olyan apoptotíkus hutást fejt ki, amely legalább lOOő-szer nagyobb, mint a (kontrolieélokból alkahnazott) techmkn állása szerinti, bimertzáló vagy oligomerizáló B-kompooens ttéiküli fattl-írimerek (3A. ábra: dMsejtek, és 3C. ábra: JjíAzm-seifek). /'/«g-eHeni M2-antítestek hozzáadása (·) kissé megnövelheti az apoptotikus hatást rizö-seltekés/ar&sí-sejlek esetében is kétszeresére, előnyőseit 1.5-szőrösére, a.ffeg-elleal antitest nélküli preparátummal szemben, a .„szuper FssA” további, a találmány szerinti, magasabb rendű aggregátumokká való cligc-merízációja állal (56, és 5D. ábra), Ennek eredménye az, hogy az apoptózis kiváltásához szükséges oligonterizáéiés fok (irt óinterek bitnetje), ahol szükséges, a sejtfelszínen történő, a találmány szerinti 3, sz. fejős fehérje .specifikus, 8-kemponenseként alkalmazott kapcsolóján át történő oligomerlzáolórt keresztül hajtottunk végre, valójában már az optimum, és kissé növelhető a találmány szerinti, magasabb rendű aggregátumok segítségévei.
A őA, ábra, a találmány szerinti 4. sz. fúziós fehérje·, a áosZI-AÜ&Piiö fúziós fehérje amirtosavszekvenciáját mutatja be, ahol a 4, sz, fúziós fehérje (szekvenciájában az N-fentunáiisiól a C-terminálisig) tartalmaz /feg-szekveuciái, S-komponensként kapcsofeszekvenetái, az »t4Q?P3t?-fehérje 18-111. amiríosavá?: (m: egér), a íg'-kapcsolőt és a á/fos£ 139-231. amíttosavál A-komponensként.
A 66._____ábra egy további iüzlós fehérje. Tartalmazza a humán eredetű dOt/tid-figandujn kollagéríiloméoját (áriC/ri3Í9, 18-111. autinosavak), ahol ennek N-termírtáiisát a DYKTföDD&yZögtohlaiékkai, és a C-tertnmálisát humán eredetű firrL-fefeérjével (139-281. aminosav) feknxáltattak. A AdO?A?Ö C-terntHíálisa és a /?/'<»'£ közé, valamint a y&íg-toldalék és a A/OP3Ö N-terrninálisa közé (GEGQVQ.LQ) kapcsolöszekveneiát (MHVD) illesztettünk. Minden, fenti adatot az amirmsavak egybetüs .kódjával jelöltünk.
A űC. ábra görbe: a ,Aírix«-s«iiek ribsó-fehériével, a áACSriáöéFiiSÓ-fúzíósfehérjével történő bírálásának eredménye, /7og-eilsm bf2-arúitestek hozzáadásával (+-) és anélkül (-)·, 293-sejteket ünaszfektáliunk FősAfehérjével vagy áAA7éA3íA?|>ri.-füzió$febériévef, e fehérjéket expresszáituk, és -ezek feiüiúszóít (OPF/MSÁJ), /«rto-sejtekhez adtok. Az egymást követő kísérletek csökkend koncentrációit. mutatjuk be a 6C. ábra xtepgelyén, és a Jurto Γ-sejfök megfeleld életképesség? arányait a már leírt módon meghatároztok. A grafikon alapján világosim látszik, hogy a FósA-febénével inaktív a kemztkótő MJ-antitest nélkül (í), és csak az 312aniáíest keresztkötő hatása okoz cítotoxskos hatást. Ezzel szemben a talál mány szerinti fúziós fehére, konkrétan a ártÓTriAriiriőísA már az 3i2-&öíites; hozzá adása nélkül < A) mutatja a megfelelő hatást. Az M?-a»títest. hozzáadása alig képes a találmány szerinti fúziós febétjs hatásának, növelésére..
A. 7. ábra a 3. ábra analógiájára a SAíS-sejiek életképességét mutatja a bimerizálásra vagy oligomertzálásra képtelen FasA-trimerek hozzáadása utast -(összehasonlító kísérlet az 1. sz. fúziós fehérje alapján, az 1, ábrának megfelelően: 7A. ábra) és a találmány szerűid 4. sz. fúziós fehérje oligomerjei, itt tránerjei, tetramerieí, azaz dodekaaterjei, és a ő. ábrának megfelelően /fog-elleni Α/2-athitesfek jelenlétében (A> vagy távollétébea (Δ). Míg & találmány tárgyát nem képező FdsA-írimerek nem váltanak ki apoptorikus hatást a &.AíÓ-sei leken a /feg-saekvencíához való kötéssel oiígomerizálo antitestek hiányában (7A. ábra, (A)}, a salálmány szerinti 4. sz. ítizios fehétie dodekametje (trimerek te-ramerje) sejthalált Indukál megközelítőleg lö ng/’mi-es köoceatrácróbsűB (Sss~S ng/ml) <78-.. ábra). Ez egészen világosan látszik a 490 ras-eo mért OD-értékek csökkenésén keresztül Ez az apoptoukus aktivitás kissé növekedhet,, ha a találmány szerinti FíZvA-ACEFAF-as fúziós fehérjék találmány szerinti dodekarnerjeibez pmp;núfumáhozy;ö£-etiem Adz-aníhesteket adunk, azaz a
169 ♦ *· * találmány szerinti dodekamer gyakorlatilag aggregáeiós állapotot reprezentál az apoptotikm aktivitás szempontjából. Ezzel szemben a találmány szerinti magasabb rendű aggregátumokig való, megfelelő antitestekkel kiváltott további aggregáeiö nem képes további jeteös mértékó biológiai hatások előidézésére,
A 8. ábrán a találmány szerinti 5, sz. Snziős fehérje soKm-sav-szekvenciáját mutatjuk be (7R47I,ICri/7i.9). A fúziós tehene tartalmazza a hTfiAiL 95-251.. arniínisavait A.-komponeaskéot az zíC/őferé (18-111. a. sj oligomerizálő dojnénjával, mint B-koxnpooenssel koroblnálva. Ezáltal a találmány szerinti 5. sz. fúziós fehérje oldatban ohgomerként fordul elő, konkrétan trimerek tstramerjeként.
A 9. ábra a ,/fréÖÍAsejfek életképességéi: snulaíja a technika állása szerinti, hhnerízámős vagy oíigomerizáeiós képességgel nem rendelkező ERrité-trimerefe (fúziós fehérje az N-ferrninálisonTfeg-szekvenesa és a humán eredetű TRA1L 95-281. anrinosava), és a találmány szerinti 5. sz. fúziós fehérje, a 27öá/é~d€2?/Bö dodekametjei hozzáadása «tan (összehasonlító kísérlet, 9A. áhraj, *kfe-eífeni Mri&ohtestek jelenlétében (A) és távollétében (Δ). A 9. ábrán bemutatott kísérlet:megfigyelései megegyeznek a 7. álmán bemutatott kísérlet megállapításaival. kiig a ÍAri/í-trimerek. séta. gyakorolnak a 7E7?A7í?-sejíekre apopíosikus hatást: a ,/fegszekvenciához való kötéssel oligotnerizálö antitestek távollétében (9A. ábm, (A)}, a találmány szerétit 5. sz, fúziós fehérje dodekamerjei ebben a kísérletben is sejthalált kritikáinak megközelítőleg 100 ng/ml-es konceníráciöhan (vK^k) (9B. ábra sói)· Az oligomerizásiös tok további növelésével a -dodekamerek és afíagnntiíestek kombinált adása ráadásul a lalálmátty szerinti magasabb rendű aggregátumokat alakíthat ki, amelyek ebben az esetben a. íaiáljaóny szerinti oligotserekhez viszonyított megnövelt (legalább dzszerss) apoptózíst indukáló aktivitással rendelkeznek (9B. ábra, (<)).
A 10.. ábrán a találmány szerinti 6. sz, fúziós fehérje sminosav-szekveneiájás mutatjuk be riCí?E.?f?k A JATm-ACfeBad tamdmazsa az χιΤΕΡβ (m: egér) 77-235. anxiaosavát A-kotmxmenskéut, az mdCTJAot? (18-111, a.sj obgomerizálé dotnénjávsl, mint :B-kosnponeussei és (feg-szekvenmáv;d, 19termi-nálxsaa kapcsolóval kombinálva, fez azt jelenti, hogy a 6. sz. fúziós fehérje oldatban dodekamerkéní fordul elő, konkrétan mulsimerek (trimerek) oligomeneként (tetramerjekést).
All, ábra matatja be a sepprosiferáelós kísérletek: megállapításait. Itt a sejtproliferáeiő mértékeként meghatároztuk CJd-os sejtek ?;[H|-timiátn egéreredeíű C?ó-os sejtekbe történő beépülését a technika állása szerinti, B-ko:mponeust nem tartalmazó fúziós fehérje (ring- és kapcsosószekvencia az N-íenmaálisom ezután az egéteredeíü TNFo 77-235, ammosava) trimerjei koncentrációja inggvényében, azaz az wtTA’F«-trimer (11 A., ábra), vagy a 6. ábrán bemutatott, találmány szerinti 6. fúziós feliérje TArri-zl CBridí?) találmány szerimi dodekamerjeí (4x3) fcoooestráciöja függvényében. A ''[Hj-tsnidré beépülését mutatjuk beöiésszám/perc (epm) mértékegységben kifejezve, A kísérleteket /ogf-eSesá' Afí-ssílfestek jelenlétében (Á) vagy távollétében (Δ) hajtottuk végre. Rt a technika állása szerinti wWe csak kistnértékö prollferatív hatást gyakorolt a CTŐ-sejtekrea 2-es TNF-reeeptoréoz (reVfe-Bd) való kötés után (11 A. ábra).. Egyértelmű, megnövekedett proliferációs hatást csak aymg-eilem antitestek hozzáadása (A) mán figyelhettünk. meg, keresztkötö, és ezáltal oligomerizálő hatásán keresztül.
A 11B. ábrán ezzel szemben a trimerek találmány szerinti oligomerjei, iö a találmány szerinti 6. sz. fúziós fehérje dodekametje erős prollferatív hatást mutat, amelyet tuár 5 ng/ml koneentráídőríál megfigyelhetünk (Δ). A keresztköie, riog-elleni antitestek és a találmány szerinti dodekamerek (Á> kombinációja referenciaként ezzel szemben a preliferáló hatást csak kissé növeli, a találmány szerinti dodekamerek egyedüli hozzáadásához viszonyítva. Az eddigiekből látható, bogy a találmány szerinti olígomer, irt dodekatoer tormájában gyakorlatilag optimális pwliieratív hatással rendelkezik,
A 12. ábrán. a találmány szerimi 7. az, fezíós fehérje amtnosav-szekvenctáját mutatjuk be {CBJOL·· Aí.TéFA)), A. Cí)4ti(.-dtAF3ti tartalmazza a &ÜZXŰI- (fe; humán) 116-26l. ámmosávaít A-kemponssskórá az feC7iP3k' oligomeriaálé áoménjával (18-111, a. s.), snisí B-komponenssel kombinálva.
A 13. ábra a sejíproltferációs kísérletek megállapításait matatja he, pontosan ugyanúgy, mint all. ábra. Ebben az esetben azonban a 11. ábrával ellentétben- humán eredetű PS£-t (perifériás vérlimfóciták) 'alkalmaztunk. Az ábra bemutatja a hagyományos CWÖL seitproliferáriöra gyakorolt hatását, ahol a CD40L oldatban trimer formában van jelen és fcapesotówekveneiák, mint a 12. ábrán, ezt kővetően a áCW&L iő-261. aminosavai, oligomerizáló ö-feomponens nélkül; 13A, ábra), :a találmány szerimi 7. sz, fúziós fehérje.éí.N/éű'.y találmány szerinti deaekanierjeívei összehasonlítva, amint a 12, ábrán bemutatjuk {138. ábra). A ,ffúgelleai M?-anütestek távoli-étében (Δ) végrehajtott k-ísérieteket -azt; mutatják, hogy a CöAöó- trimerek gyakorlatilag -netn tejíenek ki proliferatív hatást, tata a 138. ábrást a AC£MÖ£ sokkal alacsonyabb koncentrációinál megfelelő proliferatív hatást detektáfetunk. A 138.. ábrás; az x-feagelyenaz „idssgstás’k azaz -nem az abszolút koncentráció van feltüntetve, mivel töményített felSlúszét adtunk, ameiy abszolút koncentrációja nem- volt ismert. Keresztkőtó, /feg-ellem antitestek és a találmány szerint! 7. sz. fúziós feltétje dödekametjet (A) referenciaként a snegteselő proliferatív hatás további (alacsonyabb koncentrációk irányában történő)' eltolódását okozták magasabb rendű aggregátumok kialakításán keresztül.
A 14. ábra az ol'igommzáít tnúltmwtek szerkezetének vázlatos bemutatása. A 14A. és 148. ábra a natív „felíérjefótegek” formáját mutatja, a már natív körülmények között oligomerízált szerkezetükkel (14A, áhra: fejdoméntrimerek hexametje,- -amely a Clq-kompiemeotíehérjét alakiba ki; 148. ábra: .fejdeméntrimerek teiramerje, amely az AOEtiö-ai, az udipoc-iták által termelt szérumfefeétjét alakítja ki). Ezáltal a Glq- vagy az dCSPJŐ-komplex natív monomerjei fejtiomépjai muittmerízáiódnak és oítgomerizáfódnak. Míg a Clq olíg-omerizá-lődó komplexe három különböző géntermékből alakul ki, az ACFPFv olígomerizá-lódó komplexe homoáekatner, azaz azonos, multimerizáíódott és oiigomerizálódoít géntermékek. A megfelelő, egyedi polipeptídláncok mindegyike, amelyeken a -fenti natív ofigomerizálédó komplexek alapulnak, rendelkezik, fejdoménnal, olyan székvencíarésszel, amely kodagén-triplahélixet alakit ki, és olyan szekvenciarésszel, amely 6 (Ciq-komplex)-vagy4 íAKAJÖ-komptox)-toilagén-triplabélixet 18-vagy 12 heii'xkoteggé ótígomerízál.
A.14C. ábra a találmány szerinti Slziós fehérje találmány szerinti oligomerízálődott multimetjét mutatja, be (pi. a 4. sz, fúziós fehérje·, amelyet a 6. ábrán nautatank be, ,ArA-4CEAfe!), amely négy trimerizált TNFhgantimnot (pl. a F«.rá-'TKF-l-igandumot), vagy TNF-ligaadem-szegmesst tartalmaz Á-komponensként, arnelv a találmány szerinti homodekametsé -oligomerizáiódik az ,4OP3£Mehérjé, mint BA'ompooens fcollagénszerú részem át, ameiy például a találmány szerinti fúziós fehérjében megtalálható.
A 15 A, ábra a találmány szerinti további fúziós fehégekonstrukciét, konkrétan a á£ZMZF«$£~fehérjét mutat he. itt a humán eredetű(Í68-242. aminosavak} szolgál B-komponeasként, amelyhez; (lög-cpitóp van fuzienálfeíva N-termmálínaa kapcsolón át, és amelyhez A-korapeness, azaz EAA (139-281, a.s., azaz a EEvA exiracellalárís doménja vagy -annak fiagmeuse) van csatolva szinté kapcsolón keresztül, 15 A. ábra, Á ialáimány szerinti tó'Dd/Fesi-fezióst^éij® hexatnerkést vas Jete (2x3), Az ££M~féhérje a TKF-család további tagja, amely szintén rendelkezik koltegéndomémxd (ISA. ábra, fent), valamint tratrszmembrán-dommnal és TKFdoménnal, és humán eredetű termája 391 aminosawt tsriítlwz.
A 1513, ábra a találmány szerinti h£7h-iAí«/.-luziósfehérjévoí végzet: vizsgálatokat mutatja be. A fúziós
18»» i
!»** ,ϊ <· «« íf * X β »« 99 fehérje előállássá céijábó) a tanán: eredetű öAi (160-242.. a. s.) kollagéttdöméniát a megfelelő láneinditök alkahnazásávaí amplifikáltuk,. és ezután -az N- és a C-tennmáiison a megfelelő szekvenciákkal fozícmáltattuk, azaz a /kíg-gnl és a humán eredetű Tasi extraeeHulárís tlontéajávai (139-281, a.s.), Λ 158. ábra mutatja, be a AmAn-/-sejtek fkisL-féhérjével és a kAGAAasi-mziősfehéíjévei történő titrálását, //sg-eileni Λβ-antltestek hozzáadásával és asélkűh 293-as sejteket, tranziens módon öwssfektáteídc Tösi-feltériévei vagy hAiAIZ/Asifehérjével és a fehérjéket expresszákuh, majd a sejtek felúiúszói; (ŐtP/WO#) Jarkni /-sejtekhez adtuk, Egytnásí követő kísérletek csökkenő koncentrációit tüntettük fel a IsB. ábra x-teagelyén, és a Jurkaf 'T-sejtek standard «líotealeitását meghatároztuk (a teszt leírását lásd másutt). A grafikon alapján egyértelmű, -hogy a búsé inaktív a keresztkötő M2~aatiftest nélkül (;u), és ebben az esetben csak az M2-antltest okoz eítotexifats hatást <»). Ezzel, szemben a találmány szerinti fúziós feltétje, konkrétan a Möé/íutsé előidézi a (eitotoxi'kus) hatást <-o .!. Ebben az -esetben az M2-ántítestek képesek tovább uövehü a találmány szerinti fúziós fehérje hatását (·).
Az alábbi Itat megvalósítási mód esetében a következő, a-£ kísérleti kőrijlményekre hlvatkoznsk, kivéve, ha az idézett helyeket található, alkalmas és megfelelő módosítások vonatkoznak rájuk:
A henrsgglaiimn szlgnálpephdjót kódoló DNS-fragmeas, beleértve az é'-rcgiö nem frauszlálódó régióit (CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTC CTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC) és a>gepitöpeí (GÁT TAC AAA GAC GAT GAC GAT AAA), a ksposolószekvenciát (GGA CCC GGA CAG CAG), a /bt? óo//, .Tiké es Sem/fí restrikciós helyeket klónoztak a módosítod .ACO?-vektor {/«Elírogw, AF Tétét, líoiiandia) Hindii és ZJőst?// restrikciós helyet közé, ahol a vektor 720-769. bázisait deletálíok -(/3030). A trimer/ösT exirressziója céliábö; a humán eredetű FaxL-t kódoló szekvencia 139-28;. annnosavát, amelyeket a
Así? és óvok? restrikciós helyek, kereteztek, aoxd.ifikáS.tak PCR reakcióban, és a módosított .ACfeífAvektorba klónoztak.
A hexanter íss£ céljára a 103-281. ammosavat kódoló szekvenciát mindkét vógóa &.10RI restrikciós hellyel kereteztük, és ráadásul az 5'-végen a GGCTT-kapesolószekveneiáviÁ és a 3'-végen stopkodonual (TAA) és a természetes, nem banszlálódó régióval (GAC AAG CAC TTT GGG ATT' CTT TCC ATT ATG ATT CTT TGT T AC AGG CAC CGA GAT GTT GAA GCC) láttok el, ős a .?G'9.?A-vektor /Tok? restrikciós helyére klónoztuk. A „szuper /AtéT-t (4. ábra, 3, sz, láziós fehérje) ágy állhottok elő, hogy a /3038-vektor kapesolószekvene iájába ponurjoíációi vittünk he, azaz. az ááefeí restrikciós hely 5'-oldalán, a CAGTGTGCTGszekvenciáí a CAGTCTGCAG-szekvsuciával helyettesítettük PCK-mutációs eljárások alkalmazásával, Ezután a Tus/-! (103-281 a.s.) a módosított ZóSóoó-ba klónoztuk a fem leírt módon.
A humán eredetű FFA/i... az egéreredeín 7A/« és a humán eredetű CCtéöá esetében az extracelluláris domének {/7C1/T: 95-281. a. s,, TATA: 77-2.35, a, s., CDTitéz 116-2Ó1. a.s,) 5'-végSkőn /'^/-restrikciós helyekkel, valamint stopkodonokkal ás épe? és &öF/ restrikciós helyekkel. PCR-reakcíóban amplíSfcáítnk ás PC#//· vektorba (.Ímdíragefi) klónoztuk. A ligandumok Címerként történő expressziója céljából először a yfegioldalékoí kódoló GAP T'A.C AAA GAC GAT GAC GAT AAA szekve-reiát, azután a GGA CCC GGA CAG GTG CAG szekvenciái illesztettük a ρξΤΕ-/ő-vektor (/338(7) tan/// és Asfe restrikciós helyei közé. Végül a hgandtanokut a j%88<9 ftí//5pe/-feagmeasként sznbklénoztuk,
A /tésT-ACAfGö expresszíós vektort a következő módon szerkesztettük meg. Az.ATó73/54-es FŐJ-klön révén az egéreredetu TG?iF8í/ 18-111. amiuosaváí kódoló szekvenciát, amelyet az AsíZ és a Fslí restrikciós
heiyek kereteztek, a trimsa FaR-s kődoló vektor fist/ restrikciós helyére klónoztuk: PCR-eljárásokkal (olyan módon, hogy a íuzioaáh Aófififetf restrikciós hely a kódoló szekvencia 5-oldalán legyen). Más TNF-eiiokxnek teOPMeal alkotott fúziós fehérjéi expressziójáí szolgáié vektorokat alkottunk meg úgy, hogy a óztóh-fiAkteóíí expressziós vektorban a megfelelő -szekvenciát helyettesítettük az adott ligandumszefcvenciával a Fa/ és Aeoi?/ restrikciós Hlyeken.
Stabil kiónofest alspiíottnak baktériumokban (Míó-ős törzs, pftep-F Q/age/s). a trimer IRMAO, 779/¾ és Cö-íÖZ. céljaira-. A megfelelő kiónokat eiőtenyésztésnek vetettük alá egy éjszakán át 37,:>C-on, ampicílliinnei (10(1 pg/mí) és kanarntcteael (50 ug/ml) kiegészített AS-tápíalsjöíi, és a tő tenyészet beoltására alkalmaztuk (1:5(1 hígítás, tenyésztés 37C-on), amelynél egy óra ekekével ex^Bvssziöt indukáltunk 0.5 M IPTG (RUMri) alkalmazásával, 6 órán át. A feakferímnekat centrtfugálással összegyűjtöttük, kétszer mostok jéghideg PBS-sel, „óimmá press”' (írsncia prés) alkalmazásával Ibisnek vetettük alá, és a iizátumos as oldhatatlan maradéktól eenirifegálással elválasztottuk. Stabil kiónokat alapítottunk minden Ói/xŐ-íehérjére nézve f/EO95-sejtetó»a 800 pgúrd ÓM/ó’-bán tőttefiő szelekcióval (lásd az idézed helyei, valamint; Schnetder és mtsai., í,. Exp. feled, i 19985.
A tritser és hexamer llgaadunrokat és a „szuper Fas/F-t a stabil klóitok feiüiúszöihól vagy a baktériismiíxáteresokből affinitása kmsnatogrsíia alkalmazásával tisztítottuk meg M2-agarózon (Ó/CAM, Svájci, 5ö saM citrái-NaOH (pH .2,.5) pallérral elaáltak év azonnal semlegesítettük.0.2 lérfogafctyi Tris-DCl-lel. A pufiért P8Ssel helyettesítettük iöntenyitőeszközőkben (Ce«n#o«-50, .4/ocon Co?»,, Hasion, TX, USA).
A fiös£ es az egéreredetu .4CSF39 íuaióját a következőképpen tisztítottuk.. A felülúszőfcd 50 M NaCldal ás l tuM CaCh-dal kevertük, és a pfi~t sósavval vagy NaOH-val 7.0-ra állítottuk. A rekombínáns fehérjét ezután Mh-agarözra Í.S7üA£-k Svájci kötöttük, és T8$-EDT.A-val (1.0 aM) eíuáltuk. A puffért PBS-sei helyettesítettük töményftőeszkőzőkben, A tisztított fehérjék koncentrációját bikiuousavas eljárással {Cróree Che/fFaF Co , Rockford, IL, USA) határoztuk meg, roarhaeredettl szétumalbumint alkalmazva. standardként, és a minták tisztaságát SDS-PAGE és Coovurivic-Afeíviésíéssei határoztuk meg.
A Ml, a TWti és a CD4ÖI riCTÍPÓömal alkotott feziós fehérjéit a megfelelő mérési eljárásokban dúsitött felüluszó tonnájában adagoltuk, -amelyet a következőképpen állítottunk elő: 2947-sejteket transzfektáltunk a megfelelő expressziós piazmidokkal a fcateium-foszfát-eljámsal. A sejteket a csapadékkal lő órán át inkuháltuk, a sejteket PBS -sel mostuk és 4 napon .át inkubáhak szérummentes tápkőzegbea (Ö/’TTMEM, Cíöoo S/í/..). A felülúszsok térfogatát húszadéra csökkentettük töméítyköeszközókbes, es a fehérje jelenlétét (fóstmíblottolással dlenŐfiktttk. A Tfifi/I-AC/fiMÖ és a 7;V7’d-riC£rUŐ esetében a fehérjék íitálúsait -a tisztított, trimer '/'FÁJL vagy 7 A Cd bírálásával hasonlítottuk össze a rekonsb-snáns fúziós fehérje megfelelő koncentrációjúnak meghatározása céljából, oj /1 AfedömtÁg,gé(p^??;pdiáóy fioojpWrfim
A különböző fúziós fehérjék méretét $uperdex~2ftff /fii79/30 (fiárovtíaom) alkalmazásával határoztuk meg. Rekombínáns fehérjét töltöttünk az oszlopra, a tróser- és a hexamerhgasdem esetében kataláz és ovalbmnin, az ACfifi/O fúziós fehérje esetében femtln és ovatumin belső standarddal 200 ui térfogatban, PBSsei eíuáltuk <0.5 mi/perc), és 0-25 ml-es frakciókat .gy&jtöttünk. A különböző frakciókban a fehérjék jeferslétei a triklómcetsavval történő kiesapús után ífefem-biöttolással határoztuk meg, A fehérjék méretét tiroglobultn (669 kDa), ferrít-ín (440 kDa), kataláz <262 kDa), aldoláz (158 kDa),. maxhaeredetü. szérut-natbunu-n <67 kDa),
-20· ovalbumm (43 kDa), kbat>tripszinogéa-A (25 kDa) és· ribonnkleáz-A (13.7) alkalmazásával határoztok mag,
Egéreredetű, A20-S.S B-lmdómasejfekel 5%· hömakúválí FCS-i tartalmazó Z>áf£M-ben tartótotok. A humán eredetű T-limfoblasztoma sejteket, JÍAóO7-sej;eket, R/AA-íéle ZturéttMimfómasejtoket tenyésztettünk 10% ECS-sel. kiegészített A/őlA-ben. A humán embrióból származó 293-as vesesejíefcet: 2% FCS-sei kiegészített, „mülu-jnateriáíis*' AWM-keverékbes (1:1) fenyésztetiók, Minden tápközeg tartalmazott atoibiottkumot (penicillint és sztreptomicint 5 ug/ml, neomiemt 10 ygjml koncentrációban), Az lL-2-fÜggő egéreredetú CTóos, eitetexikus T-sejtvoaaiat 10% FCS-sel. 1 tsM oátrium>pmmttid. 50 pM 2-merkspto-eíanollak lö mM HEPES-sel és· 10% kondicionált EL-4-sejtfelüidszóvsi kiegészített J&PMf-ben tenyésztettük,
A citotoslkus mérési eljárást alapvetően a Schneider és munkatársai. [Scnelder és mtsai., I, Bioi. Chem. 272: 18827-18833 (1997)] által leírtak alapján, hajtottuk végre, ötvenezer sejtet tnkubálttmk ló órás Időtartamban 100 ni tápközegbesi, ami által a tápközeg, a bemutatott hgandumkonceníráció tartalmazta, 1 ng/ml M2-antitesttel vagy anélkül (a 7Ά4& esetében 2 u.g/írd). Az életképességet (a sejtek túlélési arányát) .PMS/MTS (fenanztnmetoszulÖát-3'-[4,5-din}etjlriazol-2til]-5s(3-karfeoxűnetoxifeniÍ'j-2-(4-szulfe.fe«il-2H-tettaícóiünsó] (Aro/Ki/gu Corp., Madíson, Vél) alkalmazásával határoztok meg. A szín kialakulását a szükséges időtartamig engedtük (tipikusait 1-3 óra). Az &bszorhasrciát.49ö nm-en mértük.
•CD19-pozitiv sejteket szelektáltunk humán eredetű PBL-ből (perifériás vérlimíociták) OCí-válogato alkalmazásával, mágneses gyöngyökkel és tíszthottnk, mig CDIO-aegativ sejteket 3000 vad-dal besugározniuk. Százezer íiszlttott C.D19-pozí.tiv sejtet inkubáhunk 72 érán át 96-öregű lemezeken 100.000 sutokig, GDI 9negatív, besugárzott PBí.-iel 120 μί tápközegben (APA/Z, 10% FC5, antibiotikumok) a titráit, szolubííss C.D/ÖÍ, fúziós fehérjével, M2-sniitesiekkd vagy anélkül (lö pg/srsíi. Ezután a sejteket pulzusszerűert ó érán át '(Hjtúnidfnnel kezeltük, és a beépülést fol>«adékszeintillációs számlálóval mértük.
A találmány meg valósítási módjainak végrehajtásában alkalmazott eljárások leírására való· tekintettel 'Scseíder és munkatársai publikációján kívül részletes lúvatkozást alkalmazunk, és az idézett publikációkra a leírás részeként hivatkoznak.
L.ufegyalósisási.mód
Rekombináns fúziós fehérjét (2. sz.) expresszáltosrk,. atuely tartalmazta a bóhsó (h: humán.) 103-281. •atninosavait A-komponenskésr, és a ΙΘ3. nnmmsav N-termmálisán 18 aminosavat (VDEEGSTSNGRQCAGIRL, ún. specifikus kapcsoló) B-komponensként; Ráadásul ezután a DYKDDDDK /Zug-szekvenciát és a GPGíjVQLQ kapcsolóazekveueiát illesztettük a fúziós fehérje N-termínáhsáta .(a Bkomponens N4ermináibám) (1, ábra).
Összehasonlító vizsgálatok céljára fúziós febéíjét (1. sz.) expresszáitunk, amely szintén rendelkezik a Nterminálisát kővetően a fenti:/fog-szekvenciával, és a C-terminális után ugyanazzal a fcapesolószekveaesávaí, és ehhez 'kapcsolva a €-terminálisnál a «?así- 139-231. aminosavat Ennek megfelelően az 1. sz. fúziós fehérje u 2. sz, fúziós fehérjétől egy delécióban különbözik, amely a specifikus kapcsolót és a bóhzó 103-133. aminoMvát fedi le (1. ábra).
Az 1, sz, és a 2, sz. fúziós föltette vektorjai megszerkesztése az a. pontban leírt eljárásnak megfelelően történt, A fúziós fehérjék expressziöja és tisztítása a b, pontban lein eljárás szerint történt..
-21-* * 4 *Χ «ί *> φ * * * ΧΦ»**»** ** **Φ «.« φ* (.« φ χ χ
A fisztltotí, 1. sz. fúziós fehérjét redukáló és aem redukáló körülmények között gél-elektroferézbrtek vetettük alá (2. abrak fe a megfelelő sávok molekulatömegét durván megúaíátoxfuk.
Végűi a d)-poní szerint tenyészted A2Q-a& és Jurkuf-acjteket összegyájteitük, fe az e, szerint estotoxikus mérés; eljárásnak vetettük alá. A mérést végrehajtottuk mindkét' sejívonalon (3, ábra), a fejmedzált fúziós fehérje (1) vagy fúziós fehérje trímeriei bímetje (azaz hexametje)· (2) növekvő koncentrációi melled, riug-elfeai M2antitesf jefeulétében vagy távolléléhea {S/GM4, fehs, Svájc), az ahszörbaaciát Ol>490 ntn-eu határoztuk meg, z^a^gyalóshásfenód
Rekombináns fúziós fehérjét (3. sz.) expresszálfunk, amely tartalmazta a riréaxá 103-281. aminosavaít Akonroosenskénf, és a 103, aminosav N-termináhsán 18 amirmsavat (VDLfiGSISNGRQSAGffJ.., fen specifikus kapcsoló) B-kompösensként. Ráadásul ezután a ÖYKDDD.BK /feg-szekveneiáf és a GPGQVQLQ kapcsolószekvenciát illesztettük a fúziós fehérje N-iesminálisára (a B-komponens N-tenaiuálisára) (4. ábra),
A 3, sz. és a I, sz. fúziós fehérje vektorjaí.megszerkesztése az I. megvalósítási módban leírt ellátásnak megfelelően történt. A fúziós fehérjék expressziója és tisztítása a h, pontban leírt eljárás szerint történt.
Végül κ d. pont szerint tenyésztett zl2d-as és yúrriőí-sejfeket összegyűjtöttük, és az e. szerint citotoxifeus mérési eljárásnak vetettük alá. A mérést végrehajtottuk mindkét .sej tvon&lon. (5. ábra), a tótnerizáit fúziós fehérje (3, sz.) növekvő korsoeí-foidöi tnehett,./fcg-slleöl Mz-ansitesf jelenlétében vagy távollétéhen (SAíAfel, Raeáx,
Svájc), az abszishandát 01)-==490 nm-en határoztuk meg.
l„^gj®l^teiS5Ód
Rekombináns fúziós fehérjét (4. sz.) expresszáhnnk, amely tartalmazta a éé-W, 139-281. aminosavat Akomponenskent, es az A-kosnpohens 139, ásmrtösává N-lenhinálmn először az LQ-ssekveneiával a kapcsolódimert, és még N-íermlnálisas.94 aminosavss szekvenciái a «,=?CáíRód-fehéijébö! (18-111. anúnossvsk), az ehgcmerizálő domént B-komponensként, Ráadásul ezután a DYK.DDDDK ring-szekvenciát és a GPGQVQUf kapcsolószekvenelát illesztettük a fúziós fehérje Nstemünálisáru<aB-k.o«ponenstö.| N-terminálisan) <6, ábra).
A 1. sz. fúziós fehérjét alkalmaztuk összehasonlító kísérletekhez.
A fúziós télié· jók expressziója és tisztítása a h. pontban leírt eljárásnak megfelelően történt.
Végül a d. pont szerint- tenyésztőn íáfeS AmAte-föle Simfemasejtefcet és a .únúsí-sejteket összegyűjtöttük, és az e, szerint citotoxikus mérési eljárásnak vetettük alá. A mérést végrehajtottuk mindkét sejtvonalon (7. ábra), a fúziós fehérje (I · sz.) írimerjei vagy a fúziós fehérje (4. sz.) oligomcrfeált írimerjei (dedekamerjei), azaz a. rekombináns fb-xú-zfCR/W (4x3) növekvő koncentrációi melleik .riag-elletú Mő-anrites; jelenlétében vagy távol-létében (Ú7GAÚ1, lásd feljebb), az ahszorbaneíút öi>=49ő nm-an határoztuk meg.
4:.msuyalófi;^iusód
Rekomhínáns fúziós feísérjét (5. sz.) expresszálteok, amely tartalmazta a RTíLtíí 95-281. mrtmosavuit Akomponenskéní, és sz A-komponens 95, ammosava N-temioálisfet először az LQ-szekvenciával a kapesolödhnerí, és még N-termhtelísan 94 aminosavas szekvenciát a. atACrizAúó-fehérjéhöl (18-111, aminosavak), az ohgomerizáló doméot R-komponenskénf. Ráadást·! ezután a DYKDDÖDK .riag-szekvenciáí és a GEGQVQLi-l kspcselószeRvenciáí illesztettük a fúziós fehérje N-ternúnábsára (a R-komponenstől N-terminálisaft) (8. ábra).
Összehasonlító kísérletek céljára olyan fúziós fehérjét expresszálfunk fa 8. ábrán nem mutatjuk he), amely oldatban trimerkénf fordul elő (e&d/ú-íritner). Ez sz Összehasonlító kísérleti fehérje (az hi-ferminálistól a C-terminális irányában) tartalmazta a /(«^-szekvenciát, a kapcsolót a GRGQVQLH-szekveneiávsI és végül a vy
Άώ*· * » <« ♦* *.» * X» * ♦ X Φ Φ X Φ * * ♦ »* *4 Φ* « * » * * * φ φ χ ♦: Φ φ hrpZJí-t (*>5-281. a.s.). Az 5. sz. fúziós fehérjével ellentétben a 8-komponens (η;,4ϋ.όΆ5ό: 18-111. a.s.) és a kapcsoló az .EQ-szekvenciával hiányzik.
A fúziós fehérjék expressziója és tisztítása a b. pontban leirt eljárásnak megíéielöen történt
Végül a d. pont szerint tenyésztett T-limfoblaszfeiua /«rte-sejtéket összegyűjtötték, és az e, szerint eiíotoxikus mérési eljárásnak vetettük alá. A mérést az ,4Cf?F3Ő--szekvencía nélküli fúziós feitérje (összehasonítást célból) trimerjeí, vagy a .fúziós fehérje (5. sz.) olígosterizálí trimerjeí, azaz a rekombínáns 2AA/L-A (28/130 (4x2) dodekamerjei növekvő-koncentrációi mellett végrehajtottak (9. ábra), /fog-elleni .MS-anulest jelenlétében vagy hivohéíóben (57(3404, lásd feljebb), az abszorfeanciát OD---49Ó nmrea határoztuk, meg.
Rekonúnnáns fóztós fehérjét (6. sz.) expresszáltunk, .amely tartalmazta az »iBVFa (m: egéreredeté) 77235. mmmssavar? A-komponensként, és az A-komponens 85. amínosava N-tettámáUsáá először az Ll> szekvenciával a kapc-solódimert, és még N-ienninábsaa 94 aminosavas szekvenciát a oo-lC^/YO-febérjéből (Idill. amisossvak), az olígotnerizáló áoxuént 8-komponensként. Ráadásul ezután a DYKDDDDK jfegszekvenciát és a GPGQYQLQ kapcsolószekvemdát illesztették a Sziós feberie N-termínálísára (a Bkomponsestöl N-temiinálisari) (10. ábra).
Összehasonlító kísérletek céljára olyan fúziós fehérjét exptesszáhunk (a 10. ábrán nem mutatjuk be), amely oldatban tómerként fordul elő (7A7öx-írimer). Ez az összehasonlító kísérleti fehérje (az N-termiaálistól a C-termísáks hányában) tartalmazta a /feg-szekvosciáí, a kapcsolót a GFGQVQI.H-szekvenciával és: végül az oAA/ó-t (77-2.35. a.s.). Az 6. sz. fúziós fehérjével dienfétben a B-kosupoaeas (fa,4o7?A3ó; 18-111, a.s.) és a kapcsoló az EQ-szekveaciával hiányzik,.
A fúziós fehérjék expressziója és tisztítása a h. pontban leírt eljárásnak megfelelően történt.
Az f. szerinti sejtproííteráeiós mérési eljárással növekvő koncentrációjú 7)V/«-triíner vagv 7ΑΆ«áCRAdö-ohgomer {TAfld-homodödekamerék) /lag-eilem hU-amítestek (S/GAói, lásd fent) jelenlétében vagy távcllésébex· Cfö-sejtekre gyakorolt hatását meghatároztuk,
Ebből a célból (77«-vejteket állúo-hmk elő 4 nappal a prohferáciős kísérlet előd, csökkentett koncentrációjú AI-Áfehiiászők jelenlétében (2,5%), A sejteket 96-öröga térálölemezeken ínkuháltuk (4Ö.00Ű sej-Vúreg) lő óráé át, a feV/A-ACREtü-otígomerek vagy az m'LVEa jelzett koncerstrácíóívaí, 2 gg/mí monoklonális M2antitest jelenlétében vagy távoiiétéhen és Αή-4-felűíászó nélkül. A sejteket további 6 órán át pulzusszerően kezeltük }(Hj-timidxn-nel (0.5 pCi/üreg), 3 ciklus fegyasztás-oívasziás ciklusnak vetettük alá, és. végül összegyűjtötték, A 3(Hj-limidin beépülését végül felyadékszrtnililáclős eljárással ellenőrizték (11. ábra).
Rekombtóns- fúziós fehérjéi (7. sz.) cxpresszáltuak, amely tartalmazta a áé?D4öó (h; humán) 116-261, amlsosavait A.-koxnpooenskéni, és tsz: A-komponens 95. arntaosava N-terrainslisán először az LQ-szekvenstiával a kapcsírtődöiteri, és sség N-texrox-náiísaa 94 amihosavas· szekvenciát a x»/íOK?JÓ-fehérjébői (IMII. mninosa··· vak), az oíigotnerizáló doniént R-kemponeaskéní. Ráadásai ezután a DYKDD13DK yiog-szekveucíát és a ídFGQVQLH kapcsolószekvencxár- illesztettük a Slziős fehérje hl-ícrmmálisára (a B-komponenstől Ntentúnáksas) (12. ábra).
Összehasonlító kísértetek céljaira oly fúziós fehérjét expresszáltank <a 12. ábrán nem mutatjuk be), amely oldatban ifimért képez .(.CFM)£-íríxaer). Ez az összeteonlítő kísérleti (eltérje tartalmazza (az Nremnaá&tól a C-teruünáhs irányban) a/Jog-szekvenciát, a GFöQVQtH- szekvenciát tartalmazó· kapcsolót és végül a áGD40£-t (1 1 ö-2ő1. a. s.). A 7. sz. fúziós fehérjével etedben a S-komponens (tsréCTréfeö: 18-1
Illés az
A fúziós fehérjék expresszíőja és tisztítása a b. pontban leirt eljárásnak megfelelően történt
Végül az £ szertan sejíprollferéciós mérést analóg. módon végrehajtottak PBL-ekea is, ahol C£W£trímert' vagy CZ>4ö£-ACfeE39-réigoniert -thomododekamef) adtunk/Eig-eDeai M2-antitestek jelenlétében vagy távol-íétében (53ÖA£4, lásd fest) (13. ábra),
7. megvalósítási mérd
A 7. megvalósítási mód olyas fúziós fehérjére vonatkozik, -amely multrmerízáíóáó és oltgoxnerizáiódő Akomponenst, és- B-komponensként. receptort tartalmaz.
A Briós fehérjét msxlosíteu PCR-J-vektorból álbioítck össze, felcserélhető modulok kővetkező <5’-3') sorrendben történő elrendezésével:
a) HrédréréEí/Amedul, amely a receptor exlracellulám étaiétijái tartalmazza (a -esetében az 1211. umlnosavakat; é/ré-iré-AA 1-239. a.s.; á£SAré-A2; 1-212 a,s; 6219.4/6--,95: 1-240 a.s.; kC&fŐ; 1-193 a.s, és ééT-WE 1 -70 a..s, a megelőző GCCACC-áToruá-szekvemiával, az S'-irányú nem traosziálődő régió 24 nokleotidját -ezek. elé helyezve); b) 14 aminosav mérető kapcsoló (PQPQPKPQPKPEE) óe/fól%e/-kazettábm [kővetkezőkben leírtak szerint: Trekish és mtsai., Proc, ,Nad. Acad. Sei USA 94: 1663 (1997)); e) oiigomenzác-iős .dómén ATro/kW-modnihan (OTT?; 187-401. a. s., itt óV-iTfrö-sek jelöljük; CMP: 451-493 GenBank '115555; CÖMP: 32- 7,5. GenBank:: 173595;:d> kombinált //Ay-.we-teidalékot és ^lopkodom tartalmazó .VoőKTW-kazetía. Az ólrgomerizácíós domént a GGCC- és az ARTFGGGS--.ajrdnosavvszekv'enciák keretezik az: N- és .a· G-ternnaálison. Minden konstrukció esetében kapcsolókat alkalmaztunk. -Az /fe-konstrukciók esetében ó/gCfe „kapocsrégiójáf', .a Cí/2- és C/75-doménjeif és stopkodonját klónoztuk SWZ<?fcr/-kazettaként, a korábban leírtak .szerint [Schneider és-mtsai., 1 Bioi. Chem. 272: 18827 (1997); Sehaetder és-mtsai., 5. Exp. Med. 137: }235 (1998)1. Stabil, é/eA-223-sól származó sejtvonalafcat alapítottunk a rekombináns fehérjék előállítása céljából 81)0 ng/ml GA/ő-cíd történő szelekció alkalmazásával. a korábban leírt eljárással (Schneíder és mtsai., (1947) ott idézvej.
2937-siWket trasszfektáitunk CaClj-éljárássri, a korábban. leírtak szerint [Schheider és mtsai., (1997) >ít idézve) és PSS-sei mostuk, majd 3 napon át ínkabáltuk szérummentes ÖPHA/SM-tápkŐzegben. A föiűlúszókat 30-szorosra tőményítettük, és fagyasztva tároltuk felhasználásig. A tömésyítert ÖPJWOd-tápközegben a Aíísfe-éXRö és fe/OíT fúziós fehérjék koncentrációját lfe&r«-blottokmr tőrfeoő títrálással határoztuk meg, tisztított Püs/CŰMP-í alkalmazva; sr-anárrrdként
Stabilan tran-szfektált 295-sejtek felülúszóit vittük íél M2-agatózra {ligasdumként}· vagy proamwtStpátíí'nsv-ra (Fo-fúziós fehérje), P:i-3S~se! mostuk és 50 mM ckrát-NaOH-val mostuk (pH 2.5), Az eluátumot Tris-HCl-fel (pH -8} semlegesítettük, és a pufiért cwimxur-JIMfenrity-itőuszkÖzben (,4mico«, Eastoa, Texas) PBS-m cseréltük, a CÖMP- és a GófP-fóziósfebérjéket /ZrTr<^?-kélát-oszlop<áíon tisztítottak. Ebből a célból stabilan transzfektált 393-sejteket 500 mM NaCÍ-dal és lö mM imidazőüal kiegészítettünk. 0.5 M ZuSÖ*.....tál (pH 2.5) burkok, PBS-sel equiliferálí oszlopra vittük fel. Az oszlopot PBS-sel mostuk, és a fehérjéket 5ö ssM
<Χ Λ
EDTA-t tartalmazó FBS-sel eluáítuk.. A puffért. PBS~re cseréltük, a koráblxia leírtak szerint,
FZ«g-F«sí-t és 67ug-?2/;í/£-í állítottak elő a korábbat? leírtak szerint [Schneider és mtsai., 1 Bioi. Chem. 272: 1882.7 D997); Thome és mtsál, Natúré 386: 517 (i997jj, Mindkét hivatkozás a találmány tárgyát feltáró leírás részét képezi. /Okg-CDá/ié-t (116-261. a.) expresszálhmk baktériumokban és M2-agarózon tisztítanak. a 77ug-r2DI/E esetében leírtak szerint. A fe:hérjekom:ers;róctót bikinotmvas -eljárással határoztuk meg, A taiaták tisztaságát SDS-PAöE aikatoazásával és éta??m:$.ta$/B<·:·· festéssel határoztuk meg.
öéipermeációs kromafográfía céljából a megfelelő mennyiségű fúziós fehérjét 200 pl térfogatban /771 /Ö-Moszlopra -(P&armacia} vittük fel, és FBS-sel elnáítnk 0,5 ml/pere sebességgel, az. abszoibaaetát 280nm-en mérve. .Az alábbiakban leírtak szerint az egyedi frakciókat .{0.25 ml.) citotoxikus fesztiekben vizsgállak, A molekulatömegek meghatározása céljából sz oszlopot -tírogiobulin (669 kDa), femtin. (44€> kDa), kataláz (262 kDa), akloláz (158 kDa), marhaeredetü széatmalbumia (67 kDa), csirkeeredeíő ovalhumih(43 kDa), kímoöipszinogén-A (25 kDa) és ribonukléáz-A (13.7) standard félfetjék alkalmazásával határoztuk meg.
FA
A kompetitiv FA«(Sá-ntéréseket a következők szériái: hajtottuk, végre. 96-Üregű £U&l-lemezeket receptőr/Fc-íüziós fehérjével burkoltak (0.2 pg/ml PBS-ben, 106 pl, 16 óra 25°C). Az öregeket 1 órán át, 37<;Οοη telítettük 5% magzati horjúszéntmot tartalmazó FBS-sel (blokkoló p-aífer). sCD4(*/. céljára a blokkoíópaffer 4% zsírmentes tejet és 0.05% 2We«-2Ö-at tartalmazó FBS- volt. A kompsíitiv Fc- vagy CDA/F-fúzáósfehérjékből sorozadügitást készítettünk 100 pl blokkoló pufferben 1 pg/ml p/o/ta-A jelenlétében vagy távóllétébeu. A iígandumokat állandó koncentrációban adtuk ísééí/.: 2 pg/ml, 36 nM; v7777h: 0.02' pg/ml, 6.36 mM; s/TbiS,: 6,1 pg/'ml, 1.4 nM; sCDAOL: 6,5 pg/ml,, 9.2 ηM, blokkoló pufferben), és a kötést 1 órán át, 3?o-C-o« hajtottuk végre. A kötött ligandumokat./Zug-elleni M2-andtesttel (1 pg&ní blokkoló paflertsen, 160 pl, 45 perc. 37°C), peroxidázzai konjugált, kecskeeredetS egéreíleni arrtitesítel (1:2900 blokkoló puffétben, 100 pl, 30 porc, 3762), és o-feniléndíamia-hidrokloríddal (0.3 mg/tsl, 50 mM eitrontsav, 1.00 m-M NívíHFCA, 0.61% I-LO:>) azonosítottuk. Az abszorbanciát 490 nm-es mértük.
A citotoxfcitási teszteket 96-üregü lemezeken hajtottuk végre 166 pl térfogatban, aiap-vetóen a Schneider és munkatársai (1997, ott idézve) által leírtak szerint. A ktmémeceptorékböl -sorozallugítást készítettünk az olyas mennyiségű citotoxlkus ligandumot tartalmazó · tápk-özegben, amely 95%-osnái nagyobb arányú sejthalál indukálására alkalaras. Ahol jelezzük, pro/DK-A-t alkalmaztask 1 pg/ml koncentrációban. s7A?sE-t alkalmaztunk 1 pg/sti M2 jelenlétében, és s73DÍZb~í 2 ug/m! .M2 jelenlétében. Nem alkalmaztak: hDfeantítestet .az ..sTA-Fa-val végrehajtott ktsértetsorozaíban. A sejteket 16 órás iaktihálásnak vetettük alá, és életképességüket PMS/MTSteszírendszersk ífenaszitaetoszvnfáí~3-(4,5-dÍ!Krti!rtazol-2-ílj-5-[3-karbcxÍ!netoxífo:íl]-E-í4-szul(6fen:l-2Htetmzőiinm, só Formában) (áO’omegu Corp., Madíson, Wí) alkalmazásával. határoztuk meg. Az ab&zt-nbaneíát 4§önm-en határoztuk meg. A különböző fúziós- fehérjék moláris koncentrációja jelzése céljából a becsült moíekuiatömegek (elméleti M.· +· 3 kDa /feltételezett N-kötött glíkán x multiplíeitás): Fos: Fc: CDJWF: CA/F: AV6W: 92, Ϊ72, 190 és 105 kDa. 7X4772?; Fe: CÖMF: CVF: ÓA-DFG: 86, 142, 82 és 93 kDa. 77W/; Fc: Ö3MF: (04 és 1:87 kDa. CD4Ö: re: OWF: 161 és 186 kDa. 7X477E2: Fc: 86 kDa, 7X4.02: Fc: 127 kDa. FDg-DDí/D F/^g-FVFo. F/ög-FD4Ő/„: 71,55,56 és 54fel>a.
♦ ♦
A BZAaw-méréseket CA/5-tnóáoshotí (katboxi-ttretd-dextrán) szenzorehip (BZdcom ÁB, Uppsala, Svédország) alkalmazásával hajtottak végre, 5 μΐ/pcfe áramlási sebesség mellett. A CV5-ebipefeet N-etü-N '-(3.óímeíilamiwpropilj-karboálímid és N-hitho-xiszukcmimtd 1 d arányú keveréke 50 μΙ -es dózisával aktiváltuk. Ezután 6 μΙ, 1 06 pg/ml-es/og-dlent tnoooklonálís M2-oldatot < 1.0 ®hí NaHCOjs, pH 5.3) juttattunk az aktivált felszínre. 1 M etauolauhn-HCl $6 μΙ-es dózisával feaküváitok a maradék hiároxiszukcinimid-észtert. Az tnimobdizslt M2-aadtest eljáráshoz szükséges mennyisége körülbelül 4600 egység volt. A FassZ.-F«s-fázíósíehérje és .a nMJ/-.F^A/£-/?2-fű-ziősfehéíje kölcsönhatásai analíziséhez állandó mennyiségű, jelölt ligandumot únmobilizáltunk az M2.-vel módosított felszínem Ennek megvalósítása céljából Fkíg-Fhsó. vagy .feÁg-Afe-fe/. (2.3 pg/ml) 7 μΙ-es .dózisát juttattuk a felszínre. Ez 100-156 egység kötéséhez vezetett Ezeu felül ezek. a körülmények feüaővé tették, hogy a ligandum· az M2-felszínről mfelmálts mértékben, disszociálton, -mivel lehetővé tettük az analízishez az ezt kővető elegendő- mértékű· reeeptorkötési. A receptor-füziósfehérje-kötést ezután ágy vizsgáltuk, hogy 15 pl tisztítóit · receptor-fáziósfehé^ét injektáltunk 1 és IÖÖ ng/ml közé eső koncentrációban, amely 106-150 egységnek, felelt meg. Az .asszociációs kinetikát 3 perces, és a disszocíációs· kinetikái 3-5 perces időtartamon ár mértük. Ezután a felszínt regeneráltuk (az M2-felszía;g) 50 mM citrát-HCi őönl-es dózisával. A kotést-regenerálást egymást követve- 3ö-szor ismételve hajtottak végre,, az immohilizáii M2-antitest kötési karakterisztikájának jelentős mértékű változása nélkül, A disszocíációs és asszociációs kinetikát a gyártó által rendelkezésünkre bocsátott anaífeísprograre segítségével vizsgáltuk, sz Alk-ArB és A--&=AB modell alkalmazásával.
Elsődleges, egérerededi hepatoeiták tenyésztése céljából ÓÁTBI/ö-egerekei. feláldoztunk. és az epevezeték feletti májrégióí azonnal el-tá-voll-tottuk, és „hepatocltarögzííö tápközeg-fcő (fi/AM) tettük. A májtégíoban először perfeziót hajtottunk végre az.errtrociták -eltávolítása céljából lő mi- 10 mM' Hepes-sel (4 mM CaClj)·, azután 12 ml 6,5 argóul kollagenáz-H-val Matmheim), ílepes-feen (4 mM CaCló, és ezután Képesben homogenizáltuk í Ac/A-cseszéljcn). A sejteket líepes-ben mostuk, azután centrifugáltuk (lööxg, 20 másodperc) és őö% iaotómás FíTCoZZ-oldatban {Fáörawíto), J/ÁM-ban reszusspetidáltuk, és újra centrifugáltuk (7ööxg, 2 perc)·. Minden, alkalmazott pufíer és iápközeg hőmérséklete 3?nC volt. Az ülepített .sejteket /BiáAban reszuszpendáltuk, számláltuk., lapos fenekű tníkrotitrálási lemezen elhelyeztük (ÍÖOOö/üreg, 260 pl) és lehetővé tettük a megfelelő kitapadást. A kísérleti keveréket (inhibitorok sorozathígításai), Mfesi-t (406 ng/ml-es, 7 nM végkonceatrációhars) és M2-elleoi antitestet (1 pg/ml végkonceniráció} hozzáadtuk, ós ezután a sejteket további 16 órán át mkubáltuk. A fehrlöszókat eltávolítottak, friss BAáAot (100 μΐ) adtunk, és az életképesség! PMS/MTS-tesztet a fent leírtak szerint végrehajtottuk.
Lapos fenekű mlkroffefálást lemezeket- burkoltunk topán -eredetű CÖJ JKÓő-elleni antitestekkel (10 pg/ml) PBS-ben, 3 órán át, 37”C-on. A lemezeket kétszer mostuk PBS-sél, egyszer ΒΒΑΒ /ő4Ő-tápkőzeggel. Azte-sejteket (5xlő' sejfc'ml, I öö pl) kevertünk az iöiuhitosokkal és elosztottuk az üregekben, azután centrifugáltuk (2'Ööxg, 3 pere), és 24 órán át 3‘AC-on inkubátek. A sejtek életképességét (490 nts-es OD) a fent leírtak szerint mértük. A specifikus sejt-védelmet (%-ban) a kővetkezőképp számítottak ki: [(anti-CD3*mfiíh.!t-or)-anriCö3]/((kítnüoll)-(im£í-CÖ-3)(s.l.OO.
Kevert leukoc hatenyészet előállítása céljából perferirthiányos vagy gZd-€257££/ő-egereket (K-2b) tenyésztetílmk gamma-sugárzott, (36 Gy) F«/6A7egerekböl (fi-fe) származó spléneciíákkal, 5 napon át Alkalmazás előtt a nem életképes sejteket ehávol holtuk a mintákból FRöF-pöpwc-oa {Fánmaekt Stoteck) történő gradrens-centíífngálással, A. jelölést & lent leírt eljárásoknak megfelelően hajtottak végre [Kataoka és mtsai,]. Röviden, -célsejteket (A2ö-sejteket) jelöltünk nátriummal {’lCr] {,&κρνΜ, Boston, MA) 1 órán át, azután háromszor mostuk 8FMÍ 2ó4Ö-ben, M£C-sejteket kevertünk a célsejtekkel (lő4 sejt/üreg.) U-iiregü míkrotítráíási. lemezeken, 40 pgí'mi F«s:Fc és Fits:COMF jelenlétében vagy távoöéfébe» 200 pl végtérfogaihan, és a lemezeket centrifugáltuk (2ÖOxg, 3 perc), 4 órás inkubálás után s felülüszokal eltávolítottak, és a rudioakíivitásukut megmértük. A specifikus 1'Air]-kibocsátást (%-ban) a kővetkező képlettet határoztak meg; ff kísérlet ϊ kibocsátás spontán kihocsátáss/lmaxhsális kibocsátás - spontán kibocsátás));; 100.
F4C5-jelölés céljából a Gödöú'Guféof ,ö7./~klónr (5xlf?$ sejt) 2 pg a54'0:COMP-al mkubáimk FdCSpnfíerben (FBS, 10% magzati botjószéruxn. és 0..02,% NaN?,.
F«.vCÖáéF-ot alkalmaztunk rtegattv kontrollként. A reccpíorA'óMA^-ot 1 pg V/í/ő wc-elleni antitesttel határoztuk meg, és azután F77G~el kezelt, kecskeeredctü, egérellem tajtitesttel kezeltük (1:100). Az. idkubálásokat 20 percen át 4°C-<sn, 50 pl FlCS-paíierben hajtottuk végre.
B-sejt-prohiérációs mérési eljárások céljára barnán eredetű perifériás vérsejtíirnfocíták (PBL) CGFFsejtekeí tisztítettenk mágneses gyöngyökkel, és a visszamaradó CD7Rsejteket besugárzásnak vetettük alá (3000 rád), lö5 db tisztított Cöí9'-sejteket kevertünk 10? db antológ, besugárzott PBI.-lel 120 pl, .rCödöZ.-·! (Idő og/rol, 1.8 nM). M2-antitestet·< 10 pg/mli és adós* esetben/wtem-d-t (1 ug/mi) tartalmazó tápközsggel, és a CWdó:Eé vagy C04Ő£:CöAÍF jelzett koncentrációival. Ezután a sejteket 72 órán át 9ő-öregü lemezeken tenyésztettük, pnlzusszerüeo 6 órán át 'íHl-tlmidinnd (IpCi/üreg) kezeltük, és a sejteket összegyűjtöttük, A '[H]-timidinbeépuiést folyadékszcimillációs számlálóval mértük.
7.2. A 7. megvalósítási mód eredményei Ismert tény,. Ixogy az olyat? fúziós fehérje, amely receptor extmcelíuláris doménját tartalmazza fgG Fejrészével fúziouáhaiva (mceptortFc), a technika állása szerint, recsptor-hgandnm kölcsönhatások vizsgálatánál alkalmas gátlőszerként. A találmány 7. megvalósítási módjában a tísztífod .Fű.stF’c-fuziésiéhérie méretét kizárási kromatográfía alkalmazásával vizsgáltuk, és azt állapítottuk meg, hogy a vári reseneiós idővel rendelkező, egyetlen csúcs ekíálődott. A Fovőb-íúziósfebétjéí tartalmazó frakciók rendelkeztek sejthalállal szembeni védőképességgel a szoiubsSis ő'ö.ső Gőbső) letális dózisának kitett ,42ő-sejtek esetében, azonban a védohatás mértéke (50%-ig) rendkívül alacsony volt, fsa figyelembe vesszük, hogy a öziífeé aránya a Fdső-al szemben körülbelül 1000 volt.
Gyenge védöhaíást figyeltünk meg néhányszor az .elnátum korai frakcióiban, amely valószínűleg kevés, nem detektálható, nagy molekalaiőmegü Fö.vFc-komplexet tartalmazott A találosány szerint felismertük azt, hogy :a fúziós, léhéfje ilyet! magasabb rendű aggregátumai a FasZ· által indukált sejthalál hatásos ír-hifcítirraikém iraihamak. Ezáltal az aggregéit· Fas;Fc ilyen molekalatöf?tegű Irakclóját kezdőiben az immunglobulint keresztúrit;) hatóanyag,, a proíein-Λ hozzáadásával képeztük. Már az olyan: körülmények között is, ahol az injektált F«$:Fc csak körülbelül 10%-a mozgott a korai frakciókban, nyilvánvaló vök, hogy nagy molekulatömegú FzKFe-koxnpíes. a Fosó által indukált crtötoxieítás hatékony antagonistája, Ezzel szemben azt tapasztaltak, hogy a többi Fa$:;Fe-&akctó még dinsefként eluálódoft, és a sejteknek csak részleges védelmet nyújtott tízszeres koncentrációja ellenére. A taláínsáay szerint a 7, megvalósítási mód eredményei azt mutatják, hogy a magasabb .'>7 v ,: ,*· * χ * χ » * ♦ *» < < < 4 * V Μ rendű Eúsfeo-aggregátuotok.alapvetően megnövelik a specifikus vddóakwnást.
Ezáltal a firnős fehérjék találmány szerinti olyan komplexen hoztuk létre a fend megállapítások alapján, amelyek a Eusö-hoz viszonyítva jobb avídliási mulattak, és amelyek javítják az inhíbitorteakferisztikáí sz elígonjerizáciős fok növelése révén. A íaláhaány szerinti: fúziós fehérjék. például olyan fúziós fehérjék, amelyekben a TNF-családba tartozó· receptorok, például a Fan, Ώόί/1-S7, IF7&-F2, FF-í/L-FF 777F-F4 vagy Cödó cxtraceliuláris doménjél: fezionáliatjuk akár az ágymvezett oligomer porcfelkojével (CÖMP; a fúziós fehérjéket: receptor:COA/P-oak nevezzük} vagy az úgynevezett poreraálrixfehetjével (CAfP, a fúziós fehérje: recepterCA/F) 14 aminosav hosszúságú kapcsolóval. Ezek a mátrix fehérjék és megfelelő doméojok rendelkezik azzal a natív tulajdonsággal, hogy petitemen illetve felmer eoífed cöú szerkezetet képezhet. A fenti fúziós fehérjéket (valamint a recepior:/fe-íúziés fehérjéket kontrollként} etnióssredeíú sejtekben expressxáiíuk, és fémkeiásvagy petteím-A-oszlopokon afíuntási krontatográfiúnak vetettük alá. A 7. megvalósítási mód szerint a Fa#receptorokat és a :77?,4/E-í?.7-t szántén a TNP-családba tartozó oszteoprotegrin-rehérje (receptorakV-ÖFví} Cteműaálís dimerízációs doménjálroz kapcsoltuk,
A CÖkfekpal vagy CMP-vd fuzionált receptorok oiigotnetizúlótiteií a poliakrilareid-géten nem redukáló körülmények közötti lassú mozgásuk alapján. A EusvC'ÖA.íf·’' és a Efírtíö:A2-Cá7F a gélpentjeációs kromatográfia során jói definiált csúcsokban eluáiódotf, amelyek molekulatömege Róriiiheliií 400 és 170 kDa volt. A molekulatömegek a fúziós fehérje pentamerjének és írimegének felel meg. Ezáltal a 7, megvalösítúsí mód kísérleteiből szí a következtetést vonhatjuk le, hogy a fenti máfeixféhérjék szuperfeehkáiís ohgomerízáciős detnénja aggregációa karakterisztikáját a TNF-receptorcs&iád fehérjéivel í vagy felterjedoménjaival} való fúzió nem akadályozza meg.
A őteeCÖAíF fúziós fehérje a E'«s:.Fr?-:te: kisebb K;í--t adott, amikor a fezjós fehérjék kompetfeióbau voltak az alkalmazóit ökíoFc·-fehér ével az sFteíó-ketésért. Ezzel: az ereihnénnyeí Összhangban 0,77 nM-os disszocíáciás állandót mértünk a Xb.s£-/fes:CX)AfP-kölcsöifeaíásra, és ez fe-9-szer kisebb volt a Eusfec összehasonlító értékeinél. A tesztelt sejtvonaíak nagy többsége esetében kionífattek, hogy a ífe.vCöAíF gátlóakímtása körúlbeiui Ιθ-20-szor nagyobb, mim a dimer éfestóe-fúzlósfehérje aktivitása, míg a Fú.$:/fe keresztkőtö fehérje (pr&~ fUi«-,4} által képzett aggregátumai (Ao,nE’o'F,4i értékei a FastCÖMP és a /wrFc értékei közé esett. A dimer óferfefe tTFö-fúzíósfehérie védőhntása a dímer Ehs:E<?-Rompfex aktivitásával volt összehasonlítlrafe, A teimer Fas'Z’AZP az xFoxf, által közvetített Ifzist megközelítőleg, olyan hatékonyan gátolta, mint a EastFAPri, azaz 5ször kevésbé hatékony, mint a jfezzCDA/E'· A Fax:COMP aktivitása jó, vagy jobb volt, mint a /fesi-blokkoló Aok-A 4119 és 7.-15 monoklonáks antitesteké. A E«a^-komplexszel összehasonlítva .tfezoCÖMF kiemelkedően magas gátló aktivitást: kitűnt az egéreredetű, elsődleges hepaioc dákkal vagy ukíiváoió-indukáit modellrendszere, a Cfe-elleni antitesttel aktivált Aí?xm-seltekke! végzett kísérletekből is. Mindhárom kísérlet közepes véclőszimef adott a. Fas:Fc/P<$ esetében. Ráadásul azt vizsgáltak, hogy a Fax:Cí?A7P alkahnas-e a CEE-ekert expresszálődő ,fh.xí.-tistesáti-ik gátlására. Az Adó-sejthalál a 4 órás fesztrendszerben kizárólag a perferístól és a rtöxó-föggo jelátviteli rénkcióutaktőí függött, mivel azok a CíX-ek, amelyek hiányosak perforinra és Xbxó-ra nézve, nem gyakoroltok hatást ezekre a sejtekre. Ehhez hasonló kísérletben az sejteket perforinra hiányos sejtek elpusztították éppúgy, mini a Ensö-hkinyos CTT-ek, met az várható volt. A E«s:ke és a XanCdáóE specifikusan nyújtott válaoíilyeo mértékű védelmet azoknak a sejteknek, amelyek periorinhíányos €2T-ek hatásának voltak kitéve.
Az sCD4ö£-nek, és a találmány szerinti CD7ö;Fc--nek,. CZAkhEkvEzl-nak vagy CZ.teY7XXhfeP-sak kom-28 petitiv fifi/Sd-vai mért affinitását ősszehasoafitva az affinitás (3Ö-szoros) növekedését figyeltük meg a. pentamefiválí receptor esetében,, míg a írefiírérévfof esetében közepes fd-szoros) hatás lépett lel. A CÖ4ÖÍieljátjét konstitutív módon expresszálö .réráat-ereöetű /2/. /-ss sejtvonalat alkalmaztuk a COdd-fóziosfehéíje £Aé2AÍeiöiésl vizsgálataiban oljgomerlzácíós célokra mintaként, annak eldöntésére, hogy a CD4Ö-.COMP szintén alkalmas-e a membránhoz kötött CD40L felismerésére. feiemös mértékű jelólódés; figyeltünk meg a találmány tárgyát képező CD4fí:C()MjP esetébem ami azt jelzi, hegy a CZMfe-OÖMP valóban képes a natív, nem processzált CD4V.L megkötésére. A CZ>dőX-fú?ióslébérje· specifikus aktivitásának biológiai rendszerben történő vizsgálata céljából megkíséreltük a B-sejt-receptor elleni, antitesttel stimulált, barnán eredetű B-sejtek Ü/3AUfiiggő proíiferáclőjának gátlását. A CIferé/fo sem és a C/foréforéffil sem volt alkalmas a B-sejt-reeepfor elleni antitesttel .stimulált, humán eredetű B-sejtek preliferáciőjánafc gátlására, még nagy dózisokban adva sem. Ezzel szemben a találmány tárgyát képező CZW&CöásS* alkalmas volt a ptolifetáció gátlására viszonylagosan alacsony dózisok mellett is.
Összegzésképp a találmány megvalósítása során tett megfigyelésekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a Atzsé által indukált apoptözis· kompentív inhibitorokkal való gátlása mértéke· as oligomerízáció fokától függően növekedett, és a különböző inhibitorok viszonylagos aktivitásai (a megfelelő ÍC^-értékek arányában kifejezve) viszonylag állandóak maradtak a különböze sejtvonslak esetében. A találmány tárgyát képező foívüóZWfojafc a Aösffifohez viszonyított, .niegnővekedett gátlósktiviíása valószínűleg nagyobb aviőításának eredménye. Hasonló eredményeket kaptunk a találmány tárgyát képező Cödfodíziósféhérfe aktivitása esetében. A találmány tárgyát képező üfiMö: Cöá/F határozottan sokkal jobb sz elsődleges 8 -sejtek Céf/öl-mdukált gátlásában ré iáira·. Érmek megfelelően a 7. megvalósítási mód eredményei azt mutatják, hogy az olyan receptorok esetében, mint például a .trés' és Ccfeö, amelyek natív körülmények között ligandamjaikra vonatkozó közepes affinitással jellemezheíóek, alacsony, nanomoláris tartományba eső disszöciáeiós állandókat érhetünk el, hu azok magas fokú olígomerizáelóval jellemezhető fúziós fehérjék komponensek amint az a találmány tárgyát
SZEKVENCIALISTA <21 öv χ <21lv láb <212> PR2 <213> Mesterséges szekvencia <22öv <223> A mazffisvséges srEífovoncfo; leírása; FasL-Triiner <22 öv <221> DOfeAlré <222 v ;l!.,Í8;
<223.> Flag <233 >
<221 > ÖÖÍ2A2B <222> iá;., íló;
<22 2 > Kapcsoló
'220> '221' GíiaAlh '222> í 1 7) ,, <iSS>) '222;· bsmanFasL aa; 133-281 -29- ♦.» ♦ * Φ * < « * 4» «
<4 00> 1
asp 2 Tyr Lys Asp Asp ΐ?· Asp Asp k; V !'- Gly Pro 10 GL y Gia Var Gia Los 15 Gin
Gre Lys Lys Gin Lea Arg Lys Var Ars his Lee Thr siy ny s Sor l’s
20 25 30
Ss:: Ara Ser •Pót: Pro Leó Gl a Trp Gin Asp T5r Tyr Gly lle Vei Lee
88 40 h)
Lan Sor e i y Vei Lys <y< Lys Lys Giy 'Giy Len Vei iío Asn Gia Tar
<0 55 h 0
Gíy £ :< Len Tyr Tito Vei Tyr Sor Lys Vei Tyr Phe 7 ' Ara Giy Gia Se Cys Cx '’>
V ·.·' Asn Asn Los; Pro Le a / '·.· Sor Fis Lys Val. ry;r hét Arg Asn S o r Lys 1 V Tyr
85 00 35
Pro Sík Asp Let: Vsí hot: hat. -<> r a Gly Lys Gat: Get Ser Tyr Cys Thr
100 105 110
Thr <<y Gír: Get Trp Aia Arg Ser Sor Tyr Lón: Giy Aia Vei Phe Asn
1 15 120 Í25
Fen Thr Sor Aia Asp Kis Les Tyr Val Asn Vei Sor Gin Lan Se r Lee
130 182 -¾ v
Vo3 Asn Phe G re. Gin Sor Gin Thr Phe Phe W.y Los Tyr- Lys; Lea
LÍ5 150 B.5:
<210> 2 <211> 212 <212> 771?
<223> sosrerséges szekvencia <220>
<223> A. riesterséges srekvarcia Leírása: FisL-Gesaser ..-:222 ' <22i> GGAA1L <22 2 > íi).< 18) <223> rlag < 220..<221.' DGGA1G <222-' (y) , > :ri·:
•<223' Kapcsoló<22 0>
<22í> OCAATh
-30* * ♦ χ « * * * * * ψ «· A ♦ * * * * * *♦ X Λ A V X <O2> íOOoOi <225> Specifikus kapcsoké <220 OGhAlh <222> Í35i . ,30;
<223> PaíaanFesL aa ÍQ3~13S <220 >
<22O OOMArh <2:22 a O. }. 0132 <223.> hu;??aaAasL as 139-221 <<32.> 2
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 30 Arc Gly ura Var. Gla .Le a Gin
1 5 lö 15
val AíSp Leu u r a 31 y Ser Tar Ser Asa Gly Arg 33 a Gys Ars aO.y He
20 25 30
Arc Leu Gla Les rhe 2:0 Leu Gin Lys Gr s Les Alá Glu Le a Arg Gla
33 10 4 5
Ser Thr Se:;' Gin hű? a Kis Thr Alá Ser Ser LS:U Glu Lys 3 La O.e 3ry
50 55 00
Sas 2 :o 3;:?.?? Fro Arc Pro Glu Lys Lys Glu Les Arc sys Var Alá His
05 VQ 25 80
kés Tar Gly ay.'S Ser As a Ser Arc Sec he ér c Les ele Trp Glu A:? a
22 90 95
O Tyr fis Val has Les Ser Gly hal Lys Tyr :,ys Lys Gly Giy
100 105 1.0
Li? a Ol 1 le Asn 3 is Thr 03 y Le a Tyr Phe Val Tyj:· Se::' Lys Val Tyr
OS 120 12 5
Aae ary g 1 y 31a Se r Gye Aen Asa Leu Óra Les Ser H1 s Lys Var Tyr
232 02 OO
Met .Arg Aaa ser Lys Tyr Pro Sin Asp Leu Va.l her her Gla Giy Lys
1.45 OO ISO 1.80
he 2 heh Ser Tyr Cy;5 Thr Tar Giy 31a Met Trp Ara Arc Ser S e r Tv r
05 1Ό OS
Les -- ü y Aia kai The Aaa Leu rér Sor Ara Asp Sl e Leu Tyr Va.l Asn
150 125 190
kai Ser GO Les Ser- Les sár Asa Phe Gua Glu Ser G:La Tér Aae Aae
195 200 205
Gly Lee Tyr Lys Le a
10 <210> 3 <30 0 20
X «
-31<'212> ART <213?· Te ;;·a re ege ?· e z e?:.vencia <') > e \ <223> A rí;aa??e:r séges? azekvssiaie le Mása: S-apezMasL <220 <220 MSIN <222?· MM . MO <22 H?- Mag <220 <220- GGAA1G
MM MM. M IM <223> Vapasaié <220 <221?- GOGAIS <222?- MM.. MM <22 ;·?- Spécii:;. Vsa képeseié <220>
MM D0MAM7 <222 > MM . . <75;
<223?· naKaacasl as 103-123:
<220 <22 Μ D0MA15
12221- Mii· , . 52131 ♦•ft » * V V »
..-· M MM ·> ssasd'asL a a 133-2 Ml
<100 : > 3
Asp Tvr Lys Asp Asp Asp Asp Lys' 2.1 y Pra ALy G1;? Val GM Les Gi i?
1 5 13 15
Val Asp sev Als Oly Ser TAr Ser Aan Gl.y Arg Gin Ser Al a Gly Ile
20 M 30
Arc se s. Gln 'Lee Ms Ms Les Air? SVA Air? Let? Al a GI s Sas Arg MM
35 M M
Ser Var Ser Gin MM Ars TMr- Alá Ser Ser- Se;.· Alá Lys Gin Ile Gly
53 M 80
Ms 2re Ser Arc :··-··-·?· V r a MM Lys Lya ei?? Ser? Ara bV ?' Ve? 1 Alá 3: is
b5 0 75 83
Lm:?;· Tirr ·,·· Lys Ser Asa Ser Are Ser: Meri: Ír a Ser; GTa Trp GM. a e
85 38 35
Th·: Tyr- Ily L!e Vei Lse Les Se.r MM ve 1 sys: Tyr Lys Lys Gly Gly
MO 1OS· 113
Leu Va I Ile Áss GM Var e.l y Les Tyr Lile Val Tyr Ser Lys Val. Tyr
115 120 • :25
Aha Arc 180 oly Gin Se r CVS Áss, 135 ?! SS Lesi Arc Lee Ser 14 0 Kis Lys Hal Tyr
Olt Arc Áss Lys Tyr Arc Gin Asp Les Hal Met Kei K1U Gly Lys
US 150 155 160
Kel. Met Ser Tyr Gye, Tl>r TAr oly Gin (fel Trp A.l a Arp Sex? ):?? Tyr
165 .7 0 175
Hoc Oly Alá Vei :í?h^ Asn Lee The Ser Alá Asp His Len Tyr Va 1 A s n
) (30 (35 190
V í:i Se r Gin Les. S^r Les Vai Asn Ane Glu oly Ser Gin Tn:t? Pás Fáé
105 200 205
Gly Lee lyr Lys Lg:U
Ο <210 ο 3 <211c 252 <212c FAT <213 c Meser sá qes scs ksencia < Zz a c <22 3> A ?íííSS t é r s iess 8;:.akv«scia lei. vásár FasL~ACR23G' <2 20c <221> DOHAIN <222> (1)..(8) <223> Fiat) <22 0>
<221> G0KA1K <222> (0)..(15) <2232' Kapcsoló <22í)>
<22 ic DOHAIN '222c (11),.(108) <22 3 c cceseAOSFrO sa 18-111 <220>
<221> FOKAIK <222> ÜOO) . .(110) <223> Kapcsoló <22 Oc <221.0 DOHAIN <222o (111) , . (252 5 <2230 nonanRasL aa 130-220.
cTOöo 0
Asp l'yr Lys Asp Asp Asp As;p Dos Oly Arc oly Gin ¥»I Gin Le.u Hls 1 c 10 ló
Gin Asp Asp Vei 20 Thr Thr Thr Gin Gin η ;; Len ALa len Alá len 30 iá i
LrC Őre Lys χ.? x y Thr CVS Alá Gly Trp Get Alii Gly ile irt: Gly His
2.5 4 3 45
Pro Oly 2 is Gly Tkr 8r c Gly Arg Asp SÍ y Axg Asp Giy The? Őre
50 55 60
n < y Gin Lys Gly Gin lys < i y A.sp Alá gg y Len len Gly 8r e .nys G1 y
65 2 0 75 50
Gin T2.r G.ry Asp Val Gly Met. Thr Gly ALa Gin G.Ly Pro Arc n.r y Lhe
05 80 05
Pro Gly Thr Pro Gly Arc lys Gly Gin Őrt Gr y Gin len Gin G.i n Lys
103 LOS 110
Oys Gin i.eu Arg Lys vei Alá his. Len The Gi y lys Ser Asn Ser Arg
115 1 . 20· 125
Ser Get One Len Gin Trp Gin Asp Thr Tyr Gly Tle len Len Se r: Gly
133 125 140
Val Gye Tyr Lys Lys Gly <> i y Len Va 1 ile Aa n Gl;í Thr G;.y löm Tyr
115 ISO 155 1 5 3
22« Vei Tyr Ser hys Val Tyr The Arc GTy Gin Ser Cys A;>r· A.s.n len
165 LL; 125
Gto 2« Ser His lys Val Tyr Get Arg ASA Ser Lys Tyr Pro Gin Asp
133 185 130
Len Val Get Lfeh Gin Gly Lys Gefc. Get Ser Tyr Gys Thr Thr Gly Gin
135 oo 205
Mer: Trp Ai;; Arg Ser Ser- Tyr Len Gly Alá Lel 22;e Asn Thr Ser
213 115 <20
A'La Asp Has Len Tyr Lei Asn Vá 1 Ser Gin len Ser- lem Val Ara: The
225 230 235 24 3
Gin Gin Ser Gin Thr Oh a Éhe Gly Len. Tyr Lys ien
245 220 <213:> 5 <21!> 296 <212 > TAT <213> Mesterséges szekvencia < 220:-<223:> A eeslörséees szekvencia leírása; TOALL-.ACHIOS <22S>
<22is LÖGAIL <22 2 > 11;.....;öl <22 2> elás <22 8 :>
-34<22i> DOMAiG <222> ;95,.0161 <223> Kapcsoló <220>
<<<'.:·· DDMAIN <222> (17 5..1103} <223> ooaaeACSPaO ss 18-111 <220>
<221> LÁMÁI ü <222 > 11093 - . 11 llöl
215 5c üapesolö <2 2 0>
< 225.?· DOHAIN <222?- ( 11 1-..:5236} <222.·· 5hapaoTRAll< aa 32-281
C-Olö > 55
Asp 1 Tv r lys Asp Asp y. Asp Asp rys Gly Pro 10
G1 a A:?p Asp Val 20 Tor T51r Tor Giu Gla 25 .Lee
Pro Pro .lys 35 Giy Tor Gye Aia Gly 40 Trp: He 5:
Pro GJ.y 52 His Asn G.ly Tor Prc Gly Arg Asp
Gly 05 Gla L v - y Gla lys 71 Gly Asp Aia Giy
Gio Thr Giy Asp Val. 8 5 Gly ütet T50 r en. y Aia 30
Pro Gly Tor Pro 5.60 Gly Arg lys Gr V Gla 105 Pro
Gla Giu Tor 115 Ha Ser Tor Vei Gla 120 Glo Lys
Ica 5 Var 133 Arg: Gla Arg Gly Pro 155 5 Gio Arg Vei
Arg 115 Gly Ara Sor Asn Thr 150 lan Ser Ser Pro
n.C:; .Lea Gly Arg l..ys 115 He Aon Ser Trp Gla 5Í7O
sor P55e 1-S.i Ser 180 Aon Leó üls Lao Arg 1 855:
Gio Lys Gly Pho Tyr· Tyr He Tyr- Ser Gin
G l.y Gi.o 112. Gio Ica His 15 el a Pro Alá lea Va l Pro 530
Ha Gly Ile- Pro Giy ül:? 15
GLy Arg Asp Giy Thr Pro 06 lati Lse Gly Pro Lys Gly 75 Sö
Gla Gly Pró Arg Giy Phe
Giy Gla Len Gin Tor Sor 116
Gla -53la Asn lie Ser Prc
5
Aia Aia lie Tor Giy TTrr 14Ü
Asn Ser lys Asn Gin 51ye 111 100 Sas Se:? Arg Sor Giy His
175 oly Gin Ica Val He His í 90
Thr Tyr Phe Arg Phe Gin ♦ ·
-35♦
ΦΦΧ
135 200: £65 * ♦* ♦ X» « ♦
-♦·*♦ ΦΦ ♦ Φ + **»
0)0; GOl 251? 1 la cys 1)1 a Asn Ite Lys 2 IS Asn asp Lys· K< Gin 03 Mse Val Cl n Tyr
1.0; űyr Lys Tyr Ό Kar Tys 2ro Asp ere Ha Le-u Len Mát Lys Ser
•\ ·*> :<·. 231; 235 240
nis Asp AS!’· Kar Cys Trp Ser Lys Asp Al.a Óin Tyr Gly Les Tyr Ser
24 5 250 255
II <5 <yr Gin Oly Gly 1O; :Oe G1 a Lee Lys 0:1.1.; As n asp Arc Oe Oe
266 260 270
Val S r Va I Tas Asn GIa Kis La n Öle Asp: MeC Asp < i s el n al a Ser
75 2 Síi 26 5
21; s Vhe ο i y Alá The Lai; Va .1 Oly
230 235 <213> 6 <210 2 63 <212> 222 <216> LíasLsrséges srekranc la <220 <223» A nesrareépes sseLrencis leírása; TOFs-ACSTsO <220» <220 KSO <222 > (1)..2 65 <210 L'laa
0:20 <2 2 1» ilOMATK <222» (3),,016) <223» Kapcsaié <ζ / ,z ( ' . }>· <220- 200212 <222» !O) , . 066) <22 0 E<seKKOÜ aa 16-111 <220 <221» Í30MAIK <220 (01200 <22 6» Kaesselé <220» <221» KOKAIN <222» (111):,.(262) <2:23» laoesaOFa aa 71-235 <120 6
Asn Tvr lys Asp asp Aaa asp lys Oly Lro Gly Gin Va l 01» Vsa Rí a
Μ »Κ*« φ φφ ♦♦ « * » Φ * 9» *'♦ * * ♦ * Φ ♦ ♦ Φ * ·· * Φ * * «**φ
1 5 1.2 15
e To Lop Aso Pál Tar 'Tör Tar Grl.U 2,1a hao Ara Pro Alá leo 0 Pál Pro
Pro Pro Lys r o Gly Tar Cys Alá Gly G h Trp· Get ara Gly lle Pro oly His;
35 40 15
Pro Gly Kló Asn 21 y Tör Pro G: T y Ar ρ Asp Gly .Arg Asp Gly Thr Pro
Sö 55 90
oly ölő Lys; a.-.iy ol.o l,ys Gly í'k.'sJZj Alá oly Leó 1,00 oly P r o Lys Gly
85 23 75 53
21 o Tör oiy Asp Pál Gly Get Thr ÖT y AJ.·:; Glo: 2,1 y Pro Arg oly Phe
SS PL 25
Pro or v Tör Pro Gly Arg Lys Gly Gla. Pro 21 y 0,00 l,so 21r; Thr Le o
lön 135 11Ö
Thr Len Arg Ser Por Ser Gla Asa Ser Por Asp Lys Pro Pál Ara Pás
115 123 115
Var. 7 a 1 Alá Aso Kis; Gin Pál Glu Sl.a Gla Lee G1 a Lao Por Gla Arg
133 135 12 3
Ala Asa Alá oeo ,ΕΌ O Ara A s & loy Mer .Asp Leó. ry s^ Asp Asa Gin Len
14 5 2 50 T55 153
Val Pál Pro ;Ό» ’,< Asp 21 y len Tyr Leó Pál Tyr Ser Gla Pál Leó Phe
• 55 1PS 12 5
Lys oly Gla Gly Cys Pro Asp Tyr Pai Leó j.tO o Tör His: Thr: Tel Ser
133 155 ISO
Arg Phe Alá Ilii Sr; r Tyr 21a Glo Lys Pál Asa Leó Leó Per Ara Var
1Ö3 2 09 2ÖS
Lys; Ö a r Pro ílys: Pro ays: Asp Thr Pro 2,1» Gr y Alá Gl.y Les Lys; Pro
215 215 223
Trp Tyr Glo Pro lle Tyr Loo Gly Gly Pali Phe Gin Len 21o Lys Gly
22:5 230 255 243
Asr; o la Leó Se r Alá G1 o Pe;l .Asa La; o Pro Lys; Tyr Leó Asp Phe Alá
115 253 255
21 o Ser 21 y Gla var Tyr Phe ©ly Pel lle Ara. l,eo
2® 235
<.21Q> ?
<211> 255 <!.'.,?,·· ΡΡ.ΐ <213,·- Mesterséges ssekeencia <221.>
<2233 A rest.er ség:so: sneAveacia leírásai 2949L--AGRP35 <22 0>
<222> POMAlh * φφφ«
ΦΦ **> ·*♦ ΦΦ χ·χ
X φ φ X Φ Φ )
ΦΦ Φφ ΦΧ φ
Φ X Φ Φ * # *Φ ΦΧ ΦΦ ΦΦΦφ
<222> ί1ί,,·85
<2 2 3? F.Líiq <220< <221< DOMA7M <522< ;9)..íiSí <223> Kapcsoló <220.>
<221 .> ΤΟΜΑΪΝ
<22 2> (27 ; - . <2.0237
<223'·> JSOUseACKPBO a a 3.8· -111
<2 2 ΟΡ- ΡΟ 21 < PQGA1M <222> 7107} ... Illő; <2 2 3> Kapcsoló <22Ö> <221> DOMA1M <222> 1111} -... 7255/ -.27./2 har.aaGGl6L aa ,:-/:,/0/,. γ Ti 6- -261
Asp Tyx Lys Asp Asp Asp Asp r,ys osy Pro Gly \a ΐ.ϊά Fai GlT ha a 91 s
1 5 10 15
Kis Asp Asp ólai Thr Tfer Th Κ- Gia öla Tea ,Lla Pro Als 1:0 a Fal Pro
20 25 30:
Arc Arc Ly.'s oly Thr Gvs ΑΙ a Gly Trp Mel Ala Gly lls Pro Gly Kis
35 40 4 5
Pro Gly His Asa Gly TTr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Tar Pro
50 55 60
Qly Glo Lys Gly Gin Lys Gly Asp· Ala Gly Lee Tea Gly Pro sys ai y
65 0 75, 20
Glu Thr Gly Aap Fal Gly Mar Thr Gly Ala a / a Gly Pro Arg ' ::J. V Phe
SS 99
Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Sir Pro Λ:(Λ y 61 a Tea Gin y Asp
löh 105 110
Gin Asn- Pro Gin lle .Alis Ala í-ÍTs 51:1 lle Ser 61a Ala Sex: Ser· Lys
115 12Ö 125
Thr Thr Sas Fal Tea Gin Trp A2..S Gia Tys Gly Tyr Thr Mai Ser Asn
155 135 110
Áss Tea Val Thr' Tea Gra &,£; Π Gly Lys ί;:·Χ Γϊ Lea Thr Fai Lye Arg Gin
14 5 150 155 160
Gly Toa Tyr Tyr The Tyr Al :3 Gin Va1 Th.r Piro Gye Ser A 3;': Arg Gra
165 175 : 7 7
Azé Ser Ser Gin Aló Erő Fhs Iln Alá Ssrr lton Gye XíSív Lys ISO Ser Ere
uo IS 5
Gly Arg Aha Gin Arg Ile has Leu Arg Alá. Alá Asrs Thr Kis Gaz Ser
1SS 253 205
AU Lys Ere Cys Gly Cin Cin Ser Xle Kis hon Gly Gly Val Ebe Girt
210 213 220
Len Glr: Pro Gly Alá Ser Val Ebe; Val Áss Val Thr Asp Erei Sor Gin
225 233 235 240
Val Sor Kis Gly Thr Gly éhe Thr Ser Eh<® Gly Lort Len Lys Lem
.243 230 253

Claims (7)

  1. SZABADALMI ÍÖÉKYPONTOK
    1, Fúziós fehérje, asasl^feiasít, hegy a sstatúmáos feziős fehérje A- és B-tempösószt tartalmaz, afeol az Á-taapoaesss egy WtMfe gsrtaáeUahhis szagatextsa és a B«tax$pömW ACMF33 fehérje mubimerizáló fe oSgowdzáiő mgrosát tambrt&zza, amely harmadik mefekufe kőwaSködáse né&sl mshbtort és oKgemeri képez a hfeífe fehérjéből
  2. 2- Áz 1 > igéerygtop: szedet fűzsás fehérje, hogy a B-karnpísimz olyan srsrrssössv'ssfeveaefel tartahtsaz, amely az nrACKElb URH amisossvataak a ÚA ábrás bemutatott szrfctozaréjá, vsgy a &ACRF
  3. 3Ö 1 §'1Ö3 mmossvaraafc a éB ébrén bemutatott szekvenciája.
    X- Az l. vagy 2. igfetyprtotok fefenrdyiks szemű Sfekfe fehérje, íísenéyefeéwg'rK, fesgy sz Á-kömgööúsá TW<.fe>kfe~xzegmaasf amely a kővetkező csoportból választott; CIMÖL, Fást, TBAll,,. INF«á> CD3BL. OX4ÖL, BAKU TOK, Un, Ustö, ΠΟΗΧ CD27L, 41-BB, GiTRE, AFRO, EDA, VBG! és BAFF.
  4. 4. Az 1-3, ígásypöutök bérsnelyhto azmídű fedés fehérje, <zr®d /elámesve, hogy az Á-kömpeom TKFdtökin-szegtoesss, amely a követető aeepöhixh választott; hFast (AA 139-231), feFRÁIL (AA §5-231), bemOL (AA 1L6-26 0, és to vágy feíNF (AA 77-235).
  5. 5, Az l fe. igóaypsmtok bétrrxéyrke szerinti. fedés fehérje, orndjdbvsezvs’, kegy a rekornbfeéns fedés fehérje A- és B-kompoaeas között kapíÍsnifeekvvrxtd tartalmaz.
    é, Az I -5. igésypmdek. bfoxdyifee «mait mkombmte fedés fehérjék bhntsje vsgy tOtgrortorje,
  6. 7. DNS-szekvsróa, raxn/yéfeíerx?, hegy a DNS-szekveusia i-5, igénypernek bámdyike szersnn feziós fehérjéi kódol
  7. 8. Expressziós vektor, am/yefcrezw, hegy az xapszeszáés vektor 7, igénypotB szedrét IlfeG-szekveneíéi tartalmaz, §, Cfezdssejh «</Asmzw, begy 4 gszássejt a 8, igénypont zzermű sspretosdés vektorral bxnszfckfek,
    1 9, A ö. igényperé szemű bruxsrék vagy felgeroesek alkalmazása gyógyászati kéeafertény gydrésdo.
    Π, A S. igénypont szerinti kimerek vagy aílgommsk alkalmazása IspeűsxBamtmttertkus mtűdleamógek» autóimmá» állapotok, hiper- vagy hrpnaprrptlkps rvatoelfersssségeksrr aiapfeé betegségek, festéséi betegségek, kötözésen vbvafertésés, tumoros oregboiegertések, kfeénésss a hnrfehkns módszer hrnsnrjm édvsgy endokrin renőetfenességek kezelésére szolgáló gyógyászán' készítmény gyártására.
    *8 * * fc fc** fc $
    fcfc
    1% A 6, igénypont ssmsti binwek vagy oligpnwefc sikfemaaósa pamnwáüs vagy s>ctife sífegsdósó gyógytag fezítinény gyártását».
    fc' vfc Φί, fc.fc * fc: ♦· * fc fc * fcfc *χ a * fc fc fc fc fc fc fcfc fcfc fcfcfc
    B, A ő, igénypont saasioti bimetok vagy oligommk atotaszása ős Gw diagnózisra,
    14. Gyógyászati tósdönény, <sssti föfeszava, hogy a gyógyfeari tesdlmány smahnaasa s 6, igénypont sastisái rekfsstiföáos fezkti fehérjék fcáaegét vagy oMgOttsejjéi.
HU0203628A 1999-12-30 2000-12-20 Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer HU229204B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19963859A DE19963859A1 (de) 1999-12-30 1999-12-30 Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
PCT/EP2000/013032 WO2001049866A1 (de) 1999-12-30 2000-12-20 Bi- oder oligomer eines di-, tri-, quattro- oder pentamers von rekombinanten fusionsproteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0203628A2 HUP0203628A2 (en) 2003-02-28
HU229204B1 true HU229204B1 (hu) 2013-09-30

Family

ID=7935052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0203628A HU229204B1 (hu) 1999-12-30 2000-12-20 Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer

Country Status (19)

Country Link
US (6) US7385032B2 (hu)
EP (2) EP1985706A3 (hu)
JP (1) JP5031165B2 (hu)
KR (1) KR100767980B1 (hu)
CN (1) CN100385002C (hu)
AT (1) ATE397076T1 (hu)
AU (1) AU783833B2 (hu)
BR (1) BRPI0017054B1 (hu)
CA (1) CA2395632C (hu)
CY (1) CY1108195T1 (hu)
DE (2) DE19963859A1 (hu)
DK (1) DK1246925T3 (hu)
ES (1) ES2307550T3 (hu)
HU (1) HU229204B1 (hu)
IL (2) IL150215A0 (hu)
PL (1) PL204277B1 (hu)
PT (1) PT1246925E (hu)
WO (1) WO2001049866A1 (hu)
ZA (1) ZA200205069B (hu)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
US20030095967A1 (en) * 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20050100548A1 (en) * 2001-07-24 2005-05-12 Biogen Idec Ma Inc. BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
JPWO2001090382A1 (ja) * 2000-05-26 2004-04-30 持田製薬株式会社 Ｆａｓリガンド融合蛋白質
GB0015426D0 (en) * 2000-06-24 2000-08-16 Univ Southampton Method for generating soluble highly multimeric proteins
WO2002074795A2 (en) * 2001-01-18 2002-09-26 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Oligomeric complexes of chimeric proteins with enhanced immunogenic potential
DE10122140A1 (de) * 2001-05-08 2002-11-28 Apotech Res & Dev Ltd Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere
EP1456651B1 (en) * 2001-11-30 2008-05-07 National Research Council Of Canada Self-assembly molecules
AU2002333502A1 (en) 2002-02-10 2003-09-04 Apoxis Sa Fusion constructs containing active sections of tnf ligands
AU2003221256A1 (en) * 2002-02-21 2003-09-09 Biogen Idec Ma Inc. Use of bcma as an immunoregulatory agent
WO2003095489A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-20 Apoxis S.A. Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same
FR2840307B1 (fr) * 2002-05-30 2006-07-07 Centre Nat Rech Scient Nouvelles molecules multimeriques, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de medicaments
DE10247755B4 (de) * 2002-10-14 2006-01-19 Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine
US20070010658A1 (en) * 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CA2520254A1 (en) * 2003-03-26 2004-10-07 Apogenix Gmbh Treatment of viral infections
SI2298347T1 (sl) * 2003-05-06 2016-03-31 Biogen Hemophilia Inc. Himerni proteini s faktorjem strjevanja krvi za zdravljenje hemostatske motnje
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050143297A1 (en) * 2003-05-26 2005-06-30 Jean-Pierre Rosat Method for the administration of ligands, agonists of ligands of the TNF family with reduced toxicity
EP1481686A1 (en) * 2003-05-26 2004-12-01 Apoxis SA Use of multimeric ligands of the TNF family with reduced toxicity for treating cell proliferative diseases
US20050287118A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-29 Epitomics, Inc. Bacterial plasmid with immunological adjuvant function and uses thereof
DE102004014983A1 (de) 2004-03-26 2005-10-20 Univ Stuttgart Rekombinante Polypeptide der Mitglieder der TNF Ligandenfamilie und deren Verwendung
ATE482268T1 (de) * 2004-10-01 2010-10-15 Topotarget Switzerland Sa Ex-vivo-spülverfahren für autologe transplantationen mittels löslicher fasl-moleküle
FR2879202B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-23 Centre Nat Rech Scient Cnrse Nouveaux ligands multimeriques de cd40, leur procede de preparation et leur utilisation pour la preparation de medicaments
WO2006077232A2 (en) * 2005-01-20 2006-07-27 Apoxis Sa Multimeric soluble fas ligand for eliminating alloreactive t lymphocyte in allogenic harmatopoietic stem-cell transplantation transplantation
JP5164167B2 (ja) 2005-08-30 2013-03-13 ユニバーシティー オブ マイアミ 免疫調節性腫瘍壊死因子受容体２５（ｔｎｆｒ２５）のアゴニスト、アンタゴニスト及び免疫毒素
US20090081157A1 (en) * 2006-01-09 2009-03-26 Richard Syd Kornbluth Immunostimulatory Combinations for Vaccine Adjuvants
WO2007117339A2 (en) * 2006-01-11 2007-10-18 The United States Of America As Respresented By The Secretary Of The Navy Adhesin-enterotoxin chimera based immunogenic composition against entertoxigenic escherichia coli
EP3072903B1 (en) * 2007-07-10 2017-10-25 Apogenix AG Tnf superfamily collectin fusion proteins
DK2604693T3 (en) 2008-07-21 2016-05-30 Apogenix Gmbh Single-chain TNFSF molecules
AU2009308707A1 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. LIGHT targeting molecules and uses thereof
JP5844158B2 (ja) 2009-01-09 2016-01-13 アポゲニクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
WO2010102518A1 (zh) * 2009-03-13 2010-09-16 北京表源生物技术有限公司 一种融合蛋白多聚体
US8486421B2 (en) 2009-06-09 2013-07-16 Children's Hospital Medical Center Antigen-norovirus P-domain monomers and dimers, antigen-norovirus P-particle molecules, and methods for their making and use
CA2806840C (en) 2009-08-03 2019-08-27 Eckhard R. Podack Method for in vivo expansion of t regulatory cells
US10822396B2 (en) 2009-12-15 2020-11-03 MuHyeon CHOE Repeat-chain for the production of dimer, multimer, multimer complex and super-complex
EP2518078B1 (en) * 2009-12-15 2020-05-20 Choe, Muhyeon Method for manufacturing dimers and multimers by increasing the production of bond bridges in a complex of multiple monomers and repeating chains of an affinity domain of a type specifically binding to protein monomers
US8932575B2 (en) 2010-09-21 2015-01-13 University Of Miami Compositions and methods for inducing migration by dendritic cells and an immune response
WO2012040266A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 University Of Miami Gene-based adjuvants and compositions thereof to increase antibody production in response to gene-based vaccines
AU2012222833B2 (en) * 2011-03-03 2017-03-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
NZ700025A (en) * 2012-02-15 2018-07-27 Biocon Ltd A process for detection and optional quantification of an analyte
US9562077B2 (en) * 2012-07-11 2017-02-07 Children's Hospital Medical Center Protein complex system for increased immunogenicity and functionality, and methods making and use
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
KR20150136047A (ko) 2013-01-09 2015-12-04 유니버시티 오브 마이애미 TL1A-Ig 융합 단백질을 사용한 T 조절 세포의 조절을 위한 조성물 및 방법
CA2899089C (en) 2013-03-15 2021-10-26 Biogen Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
AU2014233114B2 (en) 2013-03-15 2018-03-08 Richard S. Kornbluth Composition comprised of antigen linked to a TNF SuperFamily ligand
WO2014179494A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Colorado State University Research Foundation Sensors and assays for ubiquitin or ubiquitin-like proteins
KR101722054B1 (ko) * 2013-05-30 2017-03-31 최무현 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이의 용도
US9321803B2 (en) 2013-07-12 2016-04-26 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for inhibiting norovirus infection
CN104299540A (zh) * 2013-07-15 2015-01-21 驰众信息技术（上海）有限公司 广告互动播放系统及其广告机终端
NO2776305T3 (hu) 2014-04-23 2018-01-27
JP2014218510A (ja) * 2014-08-11 2014-11-20 アポゲニクスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテルハフツングＡｐｏｇｅｎｉｘ ＧｍｂＨ 三量体形成融合タンパク質
CN104356233B (zh) * 2014-10-11 2017-09-29 中国科学院微生物研究所 一种人热休克蛋白gp96的scFv抗体及其制备方法与应用
WO2016112983A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 Biontech Ag Cytokine fusion proteins
US10689449B2 (en) 2015-01-20 2020-06-23 Igm Biosciences, Inc. Multimeric death domain-containing receptor-5 (DR5) antibodies and uses thereof
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
EP3292143B1 (en) 2015-05-04 2019-08-21 Apogenix AG Single-chain cd40-receptor agonist proteins
MX2018001787A (es) * 2015-08-12 2018-06-06 Medimmune Ltd Proteinas de fusion del ligando de la proteina relacionada con el receptor de factor de necrosis tumoral inducido por glucorticoides (gitrl) y usos de las mismas.
AU2016342420B2 (en) 2015-10-23 2020-10-01 Apogenix Ag Single-chain LIGHT receptor agonist proteins
WO2017068192A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Apogenix Ag Single-chain cd27-receptor agonist proteins
CA3002741A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Apogenix Ag Single-chain gitr-receptor agonist proteins
WO2017072080A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Apogenix Ag Single-chain tl1a receptor agonist proteins
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
CN109312000A (zh) 2016-03-30 2019-02-05 Ab生物科学有限公司 重组静脉内免疫球蛋白(rIVIG)组合物及其生产和使用方法
JP2019528689A (ja) 2016-08-11 2019-10-17 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ 免疫調節化合物
US11015205B2 (en) * 2016-12-22 2021-05-25 Leibniz-Institut für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung (IPK) Oligomeric vaccines from plants by S-Tag-S-protein fusions
EP3600397A4 (en) 2017-03-28 2021-01-27 Children's Hospital Medical Center NOROVIRUS PARTICLE VACCINES AND THEIR MANUFACTURING AND USE PROCEDURES
WO2018178074A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules specific for a costimulatory tnf receptor
EP3678699A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 University Of Oslo Vaccine molecules
CN112552415B (zh) * 2021-02-22 2021-06-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用
AU2022280269A1 (en) * 2021-05-27 2023-11-30 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd A super-trail molecule comprising two trail trimers
WO2024003353A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Transgene Fusion protein comprising a surfactant-protein-d and a member of the tnfsf

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859330A (en) * 1989-12-12 1999-01-12 Epitope, Inc. Regulated expression of heterologous genes in plants and transgenic fruit with a modified ripening phenotype
US5763733A (en) * 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5869330A (en) * 1995-06-05 1999-02-09 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA encoding a novel serum protein produced exclusively in adipocytes
US6046310A (en) * 1996-03-13 2000-04-04 Protein Design Labs., Inc. FAS ligand fusion proteins and their uses
US6165476A (en) * 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
BR9810917A (pt) * 1997-07-18 2000-08-15 Zymogenetics Inc Polipeptìdeo isolado, proteìna de fusão, vetor de expressão, célula cultivada, processo para produzir um polipeptìdeo, composição farmacêutica, anticorpo, proteìna de ligação, polinucleotìdeo isolado, e, sonda de oligonucleotìdeo ou iniciador
JP4057127B2 (ja) * 1998-02-19 2008-03-05 セイコーエプソン株式会社 アクティブマトリックス基板及びアクティブマトリックス基板の製造方法並びに液晶装置
JP2002504342A (ja) * 1998-02-19 2002-02-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 一価ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、多価ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、ならびに多量体ｍｈｃ結合ドメイン融合タンパク質および接合体、そしてそれらのための使用
US7300774B1 (en) * 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
JP2003501027A (ja) * 1999-05-27 2003-01-14 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 脂肪細胞補体関連タンパク質同族体ｚａｃｒｐ５
BR0013231A (pt) * 1999-08-09 2002-07-23 Lexigen Pharm Corp Complexos citocina-anticorpo múltiplos
DE19963859A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen

Also Published As

Publication number Publication date
DE50015185D1 (de) 2008-07-10
PT1246925E (pt) 2008-08-11
CA2395632C (en) 2012-08-28
ES2307550T3 (es) 2008-12-01
WO2001049866A1 (de) 2001-07-12
CN1526020A (zh) 2004-09-01
EP1985706A3 (de) 2009-05-13
US20040235117A1 (en) 2004-11-25
KR20020089319A (ko) 2002-11-29
PL358456A1 (en) 2004-08-09
US7385032B2 (en) 2008-06-10
CY1108195T1 (el) 2014-02-12
EP1246925B1 (de) 2008-05-28
CA2395632A1 (en) 2001-07-12
ZA200205069B (en) 2004-03-24
PL204277B1 (pl) 2009-12-31
KR100767980B1 (ko) 2007-10-18
AU2367301A (en) 2001-07-16
DE19963859A1 (de) 2001-07-12
IL150215A (en) 2008-11-26
US20090053252A1 (en) 2009-02-26
EP1985706A2 (de) 2008-10-29
US20130202552A1 (en) 2013-08-08
BR0017054A (pt) 2003-01-07
US20150004129A1 (en) 2015-01-01
CN100385002C (zh) 2008-04-30
BRPI0017054B1 (pt) 2017-04-04
JP5031165B2 (ja) 2012-09-19
US20120009211A1 (en) 2012-01-12
IL150215A0 (en) 2002-12-01
DK1246925T3 (da) 2008-09-01
JP2003518949A (ja) 2003-06-17
HUP0203628A2 (en) 2003-02-28
AU783833B2 (en) 2005-12-08
EP1246925A1 (de) 2002-10-09
US20030053984A1 (en) 2003-03-20
ATE397076T1 (de) 2008-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229204B1 (hu) Rekombináns fúziós fehérjék dimerje, trimerje, tetramerje vagy pentamerje által alkotott bimer vagy oligomer
US10576162B2 (en) Bifunctional polypeptides
KR20150065725A (ko) 세포 투과성 펩티드, 그를 포함한 컨쥬게이트 및 그를 포함한 조성물
CN101698852B (zh) 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
JP2011102322A (ja) 毒性が低下したｔｎｆファミリーのリガンド、リガンドのアゴニストの投与方法
KR20150083600A (ko) 혈뇌장벽 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
EP2658867B1 (en) Non-natural mic proteins
WO2012091756A1 (en) Non-natural mic proteins
KR101260421B1 (ko) Ｃｔｌａ４ 및 ｉｌ２１ｒ 을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물
WO2004069857A2 (en) “peptides, compositions and uses thereof”

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees