KR101722054B1

KR101722054B1 - 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101722054B1
Application number: KR1020140066001A
Authority: KR
Inventors: 최무현
Original assignee: 최무현
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2017-03-31
Also published as: JP6668232B2; CA2917721A1; JP2017512051A; CN105683754A; CN105683754B; EP3015860A4; EP3015860A1; WO2014193193A1; KR20140141519A; CA2917721C

Abstract

본 발명은 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 상기 초복합체 형성을 통한 단량체의 효과 증폭 방법에 관한 것으로서, 구체적으로, 단량체(monomer)에 결속특이성(binding specificity)이 있는 결속도메인(binding domain)의 반복사슬을 유효성분으로 포함하여 반복사슬과 단량체의 복합체(complex)를 형성하고 이들 복합체 사이에 교차결속(cross-binding)이 일어나서 생성되는 초복합체(super-complex), 및 상기 초복합체에는 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 제공함으로써 신호 증폭 등의 단량체의 효과를 증폭하는 방법에 관한 것이다.

Description

반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이의 용도{super―complex formed by the cross―binding between the complexes of a repeat―chain and multiple monomers，and use thereof}

본 발명은 반복사슬과 단량체의 복합체 간의 교차결속에 의해 형성된 초복합체 및 이를 통한 단량체의 생물화학적 효과를 증폭하는 기술에 관한 것이다.

구체적으로, 단량체(monomer)에 결속(binding) 특이성이 있는 결속부위(binding domain)의 반복사슬을 유효성분으로 포함하여 반복사슬과 단량체의 복합체(complex)를 형성하고 이들 복합체 사이에 교차결속(cross-binding)에 의해 엉김체(aggregate)인 초복합체(super-complex)가 생성된다. 이런 초복합체에는 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 주어 단량체의 효과가 증폭되는 결과를 준다.

여기서, 반복사슬은 자연계에 존재하는 단량체에 대한 특이적 결속력이 있는 물질이나 결속력이 있는 일부의 도메인으로 만들 수 있고, 이런 결속체가 결속하는(bidinding) 단량체은 매우 다양하며, 그 예로는 리간드, 수용체, 항체, 효소 등이 있다. 반복사슬을 이용하여 다수의 단량체와 반복사슬의 복합체와 그 복합체들의 초복합체를 만들어 사용하면 단량체의 효과를 매우 크게 증폭시킬 수 있다. 이러한 단량체는 생물학적 화학적 작용기가 연결(linked), 접합(conjugated), 융합(fusion)되어 있을 수 있으며, 이 경우 그 작용기의 효과가 매우 크게 증폭될 수 있다.

단량체가 단량체의 표적(target) 물질을 탐지(detection)하기 위해 표적에 결속(binding)하고 그 탐지신호(detection signal)를 주는 경우에는 그 단량체의 효과인 탐지신호의 세기는 검출표적물질(target)의 농도 검출표적물질과 탐지탐침물질(detection probe) 사이의 결속도(binding affinity, 친화도), 탐침물질(probe)의 농도, 탐침물질의 신호(signal)의 세기 등에 의해 결정된다. 일반적인 경우에서는 탐침물질은 단량체이고, 검출표적물질은 단량체의 표적물질, 신호는 단량체의 효과에 해당한다.

항체를 이용한 검출 방법인 면역크로마토그래피법(Immunochromatographic assay)은 신속항원검사법(rapid antigen test), 시료의 흐름이 측선일 경우의 측선유동검사법(lateral flow test) 또는 간단히 스트립 검사법(strip test)라고도 불리우며 진단 키트 개발을 위해 광범위하게 응용되고 있다. 현재까지 보고된 면역크로마토그래피법을 이용한 진단분야로는 약물남용， 혈액 내 구성 성분, 박테리아 그룹 A 스트렙토코컬(group A streptococcal) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 사람의 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바이러스(간염 B 표면(hepatitis B surface) 항원 및 항체， 뎅기열 바이러스(Dengue virus), 인플루엔자(influenza), 기생충(말라리아 진단을 위한 플라스모디움 팔시파럼(plasmodium falciparum) 등이 있다. 면역크로마토그래피법은 사용이 간편하고 검사 소요시간이 5 내지 10분 이내로 매우 신속하며 실온에서도 보존성이 뛰어나고 검사비용이 저렴하다는 장점을 가지므로, 다양한 검사 목적으로 사용할 수 있는 질병 진단의 최적 기술이다.

이러한 면역크로마토그래피법의 발색체로서 콜로이드 골드(Colloidal gold)가 널리 사용되며, 이를 표지한 면역글로불린(immunoglobulin)은 질병 진단분야에서 매우 유용하게 사용되고 있다. 면역글로불린과 결합한 콜로이드 골드 입자들은 항원분자를 직접 검출하는데 응용되었다. 1981년 Leuvering 등은 졸 입자 면역분석(sol particle immunoassay, SPIA)이라 부르는 골드 입자 응집 분석(gold particle agglutination assay)을 개발하였으며, 이를 이용한 임신진단키트를 개발하였다. 이후 세균，바이러스，기생충 및 곰팡이성 질병 진단을 위해 골드(gold)를 이용한 멤브레인 검사법이 소개되었고, 이와 같은 신속 항원 면역검사법 역시 콜로이드 골드를 이용하여 사용이 간편하고 검사 소요시간이 10 내지 15분으로 매우 신속한 야외 진단방법으로서 개발되었다. 이러한 신속항원진단법은 사람의 전염병의 조기 차단뿐만 아니라 동물의 전염병의 조기 진단 및 차단에 사용될 수 있는 중요성을 갖는다.

현재 사용되고 있는 신속 항원 진단키트의 문제점은 급성질환 증상이 나타난 후 가급적 2~3일 이내에 검사해야만 유용한 결과를 나타난다는 것이다. 예를 들면, 바이러스 진단의 경우 증상 발현 3일 이후 바이러스가 급감함에 따라 신속 항원 진단키트에서 음성결과가 나타날 수 있다. 또한, 나이가 어린 환자인 경우 바이러스 농도의 감소 시기가 더 길어질 수 있어 증상 발현 후 5일 이후에 검체를 채취해 검사해도 유용하나, 성인 환자인 경우 시간이 지날수록 바이러스 농도가 급격히 감소하기 때문에 증상이 발현된 후 4~5일 이내로 검체를 채취해야 하는바, 나이에 따라 항원 진단이 제한적이다. 아울러, 기존의 신속 항원 진단시약 제품들의 민감도는 낮은 항원 농도의 시료에 대해 기대보다 낮은 수준이다. 세계적으로 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 신속진단시약이 출시되어 사용되고 있으며, 이들 제품의 민감도가 지속적으로 향상되고 있으나, 계절 질환에 대해서는 60~83%의 민감도를 보이며, 신종 스와인 바이러스에 대해서는 40~69% 수준의 민감도를 보인다. 미국내 시판 중인 'BinaxNow'와 벡튼 디킨슨사의 'EZ 플루 A+B', 퀴델사의 'Quickvue' 등 3 개 진단 테스트의 효능은, 시험 결과 H1N1 바이러스 검출 비율이 BinaxNow 가 40%로 가장 낮았고 Quickvue는 69%, EZ 플루 A+B 는 49%에 그쳤다(Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Evalulation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A (H1N1) virus: United States, 2009. Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58:826-829).

상기 기존 신속 항원 진단시약의 민감도가 낮은 이유는, 어린 나이의 감염자를 제외한 감염자의 신체 내 낮은 바이러스 양과 최상의 상태로 채취되지 못한 채취된 검체에 검사시에 필요한 충분한 양의 바이러스가 포함되어 있지 않았기 때문이다. 따라서, 바이러스에 감염된 상태일지라도 환자로부터 채취된 검체에 충분한 양의 항원이 포함되어 있지 않을 경우, 질병을 정확히 진단할 수 없으므로, 검체 안의 낮은 농도의 항원을 검출할 수 있는 방법 및 물질에 대한 연구가 필요하다.

기존에 본 발명자들은 항체-독소와 같은 단량체에 대해 항체의 Fab에 결속 특이성을 갖는 결속체의 반복사슬을 골격(matrix, scaffold)으로 이용하여, 단량체와 반복사슬의 복합체를 제작하여 단량체의 국부 농도(local concentration)을 높임으로써 단량체간의 충돌빈도를 높이고, 이로써 결합 가교의 생성을 촉진시켜 결합 가교 다량체의 수득률을 향상시키는 방법을 개발한바 있다(대한민국 등록특허번호 제 10-1161323호). 상기 발명은 단량체에 대해 결속 특이성을 갖는 결속체의 반복사슬을 이용하여 단량체들의 결합 가교의 생성을 촉진시켜 결합 가교 다량체를 대량으로 얻는 방법이지만, 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속체 반복사슬을 면역 분석에 이용하여 항체의 효과를 증폭시키는 방법은 현재까지 밝혀진 바 없다.

본 발명자들은 낮은 농도의 항원을 진단하고자 할 때, 이의 검출 민감도를 높이고자 연구하였으며, 항원 탐지에 쓰이는 방법인 웨스턴 블랏팅(western blotting), 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등에도 신호 증폭제로서 항체 단량체에 결속특이성이 있는 결속체 반복사슬을 사용하였을 때, 낮은 농도의 항원에 대하여 높은 민감도를 갖는 것을 확인하였으므로, 항체를 탐지 단량체로 이용하여 항원을 탐지하는 분석에 탐지 항체 단량체의 효과를 증폭하여 유용하게 활용할 수 있음을 밝혔다. 본 발명의 사상을 적용할 수 있는 단량체와 그에 결속하는 결속부위의 쌍은 자연에서 무수히 많은 경우가 있다.

본 발명의 목적은 항체, 수용체, 신호전달물질, 효소 등의 단량체(monomer)에 결속특이성(binding specificity)이 있는 결속도메인(binding domain)의 반복사슬을 유효성분으로 포함하여 반복사슬과 단량체의 복합체(complex)를 형성하고 이들 복합체 사이에 교차결속(cross-binding)이 일어나서 생성되는 초복합체(super-complex)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 초복합체에는 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 주어 단량체의 효과가 증폭되는 결과를 주기 때문에, 상기 초복합체를 이용하여 단량체의 효과를 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [1] ~ [13]을 제공한다.

[1] 본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계를 포함하는, 초복합체 생산용 반복사슬의 제조방법을 제공한다.

[2] 본 발명은 1) 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계; 및, 2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 상기 반복사슬에 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체를 혼합시켜 다수단량체/반복사슬 복합체를 제조하는 단계를 포함하는, 초복합체 생산용 다수단량체/반복사슬 복합체의 제조방법을 제공한다.

[3] 본 발명은 1) 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 상기 반복사슬에 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체를 혼합시켜 다수단량체/반복사슬 복합체를 제조하는 단계; 및, 3) 상기 단계 2)의 다수단량체/반복사슬 복합체들 간에 교차결속(cross-binding)을 형성시켜 상기 복합체들의 집단인 엉김체(aggregate)를 생성하는 단계를 포함하는 초복합체(super-complex)의 제조방법을 제공한다.

[4] 본 발명은 상기 [1]의 제조방법으로 제조된 반복사슬을 제공한다.

[5] 본 발명은 상기 [2]의 제조방법으로 제조된 다수단량체/반복사슬 복합체를 제공한다.

[6] 본 발명은 상기 [3]의 제조방법으로 제조된 초복합체(super-complex)를 제공한다.

[7] 본 발명은 단량체의 표적에, 상기 [4]의 반복사슬, 상기 [5]의 다수단량체/반복사슬 복합체 또는 상기 [6]의 초복합체를 혼합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 효과 증폭 방법을 제공한다.

[8] 본 발명은 생물화학적으로 작용하고자 또는 검출하고자 하는 표적에 특이적이고 한 개의 단량체 내에 반복사슬에 대해 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단량체, 및 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복사슬을 포함하는 생물화학적 작용, 검출, 분석, 진단, 치료 키트를 제공한다.

[9] 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 생물화학작용기 또는 검출기능기(biological and chemical effector group or detection functional group)를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)시키는 단계를 포함하는 반복사슬-생물화학작용기의 제조방법을 제공한다.

[10] 본 발명은 1) 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 생물화학작용기를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)시켜 반복사슬-생물화학작용기를 제조하는 단계; 및, 2) 상기 단계 1)의 반복사슬-생물화학작용기에 단량체를 혼합시켜 다수단량체/반복사슬-생물화학작용기의 복합체의 제조방법을 제공한다.

[11] 본 발명은 상기 [9]의 제조방법으로 제조된, 단량체 결속 도메인의 반복사슬-생물화학작용기를 제공한다.

[12] 본 발명은 상기 [10]의 제조방법으로 제조된, 다수단량체/반복사슬-생물화학작용기의 복합체를 제공한다.

[13] 본 발명은 단량체의 표적에, 상기 [12]의 다수단량체/반복사슬-생물화학작용기의 복합체를 혼합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 표적에 대한 생물화학 작용, 검출, 분석, 진단, 치료방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 다수의 단량체와 반복사슬은 결속을 통해 복합체를 형성하고, 이들 복합체들 사이에 교차결속이 일어나서 불용성 초복합체를 형성하며, 이는 고농도일 때 침전된다. 초복합체의 엉김, 침전 및 크기는 단량체와 반복사슬의 구조에 의존적이고, 반복사슬 내 결속도메인의 반복수는 복합체들 사이 교차결속에 영향을 주며, 단량체의 수용성 및 분자 크기는 복합체 사이의 교차결속의 기회에 영향을 준다. 이런 초복합체 형성은 상기 초복합체 내에 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 제공하므로, 단량체의 대표적 물질인 항체를 이용한 탐지신호와 작용효과, 치료효과의 증폭 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 발현 플라스미드의 제작 개요도로서, GR1 ~ 10까지의 내용을 나타낸 것이다. 도 1a는 pGR1 벡터를 이용하여 pGR2부터 pGR0까지 만들었으며, 같은 방법으로 pGR20까지 제작하였다. 각 플라스미드는 도메인 Ⅲ 사이에 하나의 G4S 링커가 있다. 도 1b는 pGR2-2, -3, -4 시리즈는 두 개의 도메인 Ⅲ 사이에 G4S 링커가 두 개, 세 개, 네 개가 있다.
도 2는 정제한 단백질 G 도메인 Ⅲ 반복사슬의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. 정제된 반복사슬은 16% SDS-PAGE로 분석하였다. 1번부터 13번 레인은 GR1, GR2, GR2-2, GR2-3, GR2-4, GR3, GR4, GR5, GR6, GR7, GR8, GR9, 및 GR10 이다.
도 3은 GR시리즈 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. 두 개의 수직 화살표는 disulfide-dimer(왼쪽) [Fab-ext-PE38]2과 monomer(오른쪽) Fab-ext-PE38의 피크를 각각 나타낸다. 오른쪽 표는 GR complex의 겉보기 분자량을 비교한 것이다. 단량체 monomer(■)와 이황화가교 이량체 disulfide-bridged dimer(●)의 겉보기 분자량을 나타내었다. 도식화한 그림은 Fab-ext-PE38의 GR3 또는 GR7과의 complex를 보여주는 것이다.
도 4는 GR2-2, -3, -4와의 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. A는 size-exclusion chromatography이다. 두 세로 화살표의 왼쪽은 [Fab-ext-PE38]2 피크이고 오른쪽은 Fab-ext-PE38 피크를 나타낸 것이다. B는 일션 프로파일은 Fab-ext-PE38와 GR2-2, -3, -4 사이의 복합체의 size-exclusion chromatography를 보여준다. 분획은 non-reducing 8% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다. 9 ~ 15.5까지의 용출 부피에 해당하는 분획을 분석하였다. 화살표(arrow)는 [Fab-ext-PE38]2을 나타낸 것이다. 화살촉(arrowhead)은 Fab-ext-PE38을 나타낸 것이다. C는 reducing 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분획을 전기영동 하였다. 화살표(arrow), 화살촉(arrowhead), 흰 화살표(open arrow)는 각각 Fd-ext-PE38, H6-L, 및 GR 단백질을 나타낸 것이다.
도 5는 [Fab-ext-PE38]2 및 Fab-ext-PE38의 혼합물에 대한 GR2 또는 GR3와의 복합체 분석결과를 나타낸 그림이다. A, 크기 배제 크로마토그래피이다. 395 ㎍의 [Fab-ext-PE38]2와 Fab-ext-PE38 혼합물을 GR2 또는 GR3 단백질과 섞어 주었다. 15 ㎍의 GR protein을 사용하였다. 세로 화살표와 숫자는 피크의 위치를 나타낸다. B, 용출된 분획의 SDS-PAGE이다. [Fab-ext-PE38]2 와 [Fab-ext-PE38] 혼합물을 컨트롤로 사용하였으며, Non-reducing 8% 아크릴아마이드 겔을 전기영동 하였다. 용출 부피가 7 ml에서 12.5 ml에 해당하는 같은 13 ~ 26 번 분획들을 서로 비교하였다. 검은 화살표(arrow)와 흰 화살표(open arrow)는 각각 [Fab-ext-PE38]2 과 Fab-ext-PE38을 나타낸다.
도 6은 Fab-PE38 단량체와 GR2-2, -3, -4를 섞은 단백질의 크기 배제 크로마토그램의 비교 결과를 나타낸 그림이다. Fab-PE38 단량체(오른쪽)와 이황화가교이량체(왼쪽)의 수직 화살표가 컨트롤이다. Fab-PE38 단량체와 GR2-2부터 2-4까지 섞은 것이 크로마토그램에 겹쳐 나타난다. 이는 생성된 복합체에 Fab-PE38 단량체가 두 개 들어있어서 단량체의 이량체 형태로 복합체가 형성되어 있음을 보여준다.
도 7은 GR 반복사슬들과 Fab-PE38 단백질의 복합체의 정제를 위한 크기배제 크로마토그래피 결과를 나타낸 그림이다. 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 최종적으로 단백질을 정제하였다. 모든 크로마토그램은 자외선 흡광도 280 nm에 의한 기록이다. 크로마토그램은 같은 용출부피가 되도록 같은 간격으로 겹처 배열 하였다. A는 GR1 ~ 6을 정제하기 위해 Hiload superdex-75 pg(26/60) 컬럼을 사용하였다. B는 GR7 ~ 10을 정제하기 위해 Hiload superdex-200 pg(26/60) 컬럼을 사용하였다. C는 antibody-toxin을 최종적으로 정제하기 위해 Hiload superdex-200 pg(26/60) 컬럼을 사용하였다.
도 8은 Fab-toxin 단량체와 GR10 또는 GR2-2, GR2-3, GR2-4 와의 복합체 내에서 환원산화 섞음 반응에 의한 Fab-toxin 단량체로 부터의 이황화가교 이량체 형성 결과를 8% 비환원 SDS-PAGE 로 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 제 1통로: 반응시작 시료인 Fab-toxin 단량체. 제 2통로: 상온에서 40mM 2-mercaptoethanol 로 30분간 환원시킨 시료. 제 3통로: 37°C에서 5mM glutathione oxidized form (GSSG) 으로 2시간 산화시킨 시료. 화살표는 위에서부터 환원산화 섞음 반응에 의해 생성된 이황화가교 이량체, Fab-toxin 단량체 및 Fd 사슬을 각각 가리킨다.
도 9는 기존의 웨스턴 블랏 시약을 사용한 GR10에 의한 웨스턴 블랏팅(western blotting) 화학루미니센스발광(chemiluminescence) 신호 증폭에 관한 그림이다; Lane A : 20 ㎍ of A431 whole cell lysate(WCL) : A431 전체 세포 용해물 20 ㎍; Lane 1 : 2 ㎍ of A431 WCL :A431 전체 세포 용해물 2 ㎍; Lane 2 : 1 ㎍ of A431 WCL :A431 전체 세포 용해물 1 ㎍; Lane 3 : 0.5 ㎍ of A431 WCL : A431 전체 세포 용해물 0.5 ㎍; GR10 treated Western blot : GR10이 처리된 웨스턴 블랏;및 GR10이 처리된 웨스턴 블랏은 기존의 웨스턴 블랏의 신호에 비해 32배로 증폭된 높은 신호을 준다.
도 10은 GR10 반복사슬에 의한 웨스턴 블럿 화학루미니센스 발광 신호의 증폭을 나타낸 그림이다. a는 생쥐 anti-β-actin 단일클론 항체와 GR10 복합체에 의해 초복합체가 17배의 높은 신호를 주는 결과이다. b는 A431 세포 맑은 용해물은 10% denaturing SDS-PAGE에서 분리한 후, PVDF 막으로 transfer 시켜서 초복합체가 니트로셀룰로오스 막과 비슷한 신호증폭 효과를 나타냄을 확인한 결과이다.
도 11은 GR10에 의한 ELISA 민감도의 증가를 확인한 결과를 나타낸 그림이다. a는 AGS 세포 용해물 1g이 각 웰에 코팅되었다. 1차 항체는 연속적으로 희석되었다. b는 1차 항체만으로 측정하였을 때와 비교하여 A450 흡광고가 몇 배 증가하였는가를 각각의 1차 항체 희석배율에 따라 초복합체를 형성하기 위해 넣어준 1차 항체와 GR10의 몰비율에 대하여 그래프를 나타낸 것이다. c는 1차 항체를 1:120 희석비율로 고정시키고, AGS 세포 용해물을 연속적으로 희석하여 96 웰 플레이트에 코팅하였다. d는 1차 항체만으로 측정하였을 때와 비교하여 A450 흡광도가 몇 배 증가하였는가를 각각의 코팅한 세포 용해물의 양에 따라 초복합체를 형성하기위해 넣어준 1차 항체와 GR10의 몰비율에 대하여 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 2차 항체의 연속 희석에 따른 신호증폭 효과를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 GR10에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가 효과를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 14는 GR1-FITC 접합체에 의한 인간 편평 암(human squamous carcinoma) A431 암세포주의 면역 형광탐색을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 15는 GR 반복사슬에 의한 신속항원검사의 검사선 항체와의 교차 결합을 보여준다.
도 16은 AR, LR, LAR 반복사슬에 의한 신속항원검사의 검사선 항체와의 교차 결합을 보여준다.
도 17은 GR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 18은 GR10에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 19는 GR15에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 20은 GR20에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 21은 AR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 22는 LR5에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 23은 LAR3에 의한 신속항원진단 키트의 검출 민감도 증가를 보여준다.
도 24는 GR10이 IgG와 초복합체를 형성하여 수용액에 녹지 않는 침전을 형성한 모습을 나타내는 그림이다. 왼쪽에서부터 각각 IgG대 GR10의 몰비가 1:1, 5:1, 10:1이 되도록 섞어주고 반응시킨 것이다.
도 25는 GR10이 GR1이나 GR2보다 IgG와 초복합체 형성으로 인한 침전이 많이 생기는 것을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 각 시료의 1/36을 비환원 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 확인하였다. 1번과 2번 줄은 각각 GR10과 IgG를 반응시킨 것의 침전물과 상층액이며, 3번부터 6번 줄까지 순서대로 각각 GR1, GR2 IgG를 반응시킨 것의 침전물과 상층액이다. 7, 8번 줄은 BSA와 IgG를 반응시킨 대조 시료이고 9, 10번 줄은 IgG만 있는 대조시료이다.
도 26은 GR이 IgG와 초복합체 형성으로 생긴 침전의 모습을 나타내는 그림이다. GR1 ~ 10을 IgG와 섞어서 반응시키고, 대조 시료로 BSA와 IgG 그리고 IgG만 단독으로 반응시킨 후 13000rpm, 20°C에서 30분 동안 원심 분리하였다. 그리고 마이크로 센트리퓨즈 튜브를 뒤집어서 육안으로 보이는 침전의 모습을 확인하였다. 동그라미는 형성된 침전물을 나타낸다.
도 27은 GR이 IgG와 초복합체 형성으로 생긴 침전을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 1번부터 20번 줄까지 순서대로 GR1~10을 IgG와 반응시킨 것의 침전물과 상층액이며, 21, 22번 줄은 BSA와 IgG를 반응시킨 대조 시료이고 23, 24번 줄은 IgG만 있는 대조 시료이다. 각 시료의 1/30씩 환원 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 확인하였다.
도 28은 GR10보다 큰 GR도 IgG와 초복합체를 형성할 수 있는지 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 1번부터 12번 줄까지 순서대로 GR1, 3, 5, 10, 15, 20을 IgG와 반응시킨 것의 침전물과 상층액이며, 13, 14번 줄은 IgG만 있는 대조 시료의 침전물과 상층액이다. 각 시료의 1/10씩 환원 15% SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 확인하였다.
도 29A는 GR에 의한 웨스턴블럿의 detection limit이 늘어나는 것을 GR을 사용하지 않았을 경우의 웨스턴블럿과 비교 대조하여 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 29B는 도 29의 A의 내용을 도식화 것이다.
도 30의 A는 같은 양의 항원이 존재할 때 GR로 웨스턴블럿의 chemiluminescence 시그널이 증폭되는 것을 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 30의 B는 도 30의 A를 그래프화한 것이다.
도 31의 A는 GR의 초목합체 형성을 통한 웨스턴블럿의 신호증폭을 다른 종류의 항원을 사용하여 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 31의 B는 다른 종류의 1차 항체를 사용해도 반복사슬에 의한 웨스턴블럿의 신호증폭이 가능하다는 것을 나타내는 그림이다.
도 32의 A는 모든 반복사슬이 웨스턴블럿을 증폭시키는 정도를 비교한 것이다. GR10, AR10, MAR5 (LAR5 사슬에서 L 이 다른 형태인 반복사슬)를 같은 조건에서 증폭시키는 정도가 얼마나 다른지 비교 확인한 결과를 나타내는 그림이다. 도 32의 B는 LR10을 적용한 웨스턴블럿 결과를 나타내는 그림이다.
도 33은 GR 시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 34는 AR 시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 35는 LR 시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 36은 MAR시리즈 단백질에 의한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합을 나타내는 그림이다.
도 37은 정제된 TR1, 3, 5, 10, 15, 20 (=GR1, 3, 5, 10, 15, 20) 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 분자를 비환원 SDS-PAGE에 의해 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 38은 정제된 GR5, GR10, GR15, GR20 (=TR5, TR10, TR15, TR20) 단백질 및 이에 접착된 Herceptin(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]2를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 SDS-PAGE에 의해 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 39는 GR 반복사슬 단백질과 [Herceptin(Fab)-ext-PE38] 단량체의 복합체의 SKBR3 세포 및 BT 474 세포에 대한 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 40은 GR 반복사슬 단백질과 [e23(Fab)-ext-PE38] 단량체의 복합체의 SKBR3 세포 및 BT 474 세포에 대한 세포독성 효과를 분석한 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "결속체 반복사슬"은 항체와 같은 단량체에 결속특이성이 있는 부위가 반복되어 만들어진 물질과 재조합 단백질을 의미하며, 상기 결속특이성이 있는 부위는 단량체에 대한 결속 도메인을 뜻하고, 이는 천연의 단백질의 경우에는 그 단백질의 부위중 일부 도메인 부위로서 단량체에 특이적으로 결속하는 도메인이다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "항체단량체"는 항체로부터 유래한 분자를 의미하고, 이에는 항체의 조각이나 그에 더하여 다른 단백질이나 기능성 생물-화학 분자를 융합시킨 분자를 의미하고, 이를 반복사슬과 혼합할 때의 분자를 '항체단량체'라고 의미한다. 자연의 항체는 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 가지고 있어 한 개의 중쇄와 한 개의 경쇄를 단위로 하였을 경우에는 이것의 이량체(dimer)로 볼 수 있으나 본 명세서에서는 자연의 통상의 항체를 반복사슬과 혼합할 경우에는 이를 항체단량체로 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "다수항체단량체/반복사슬 복합체"는 상기 항체 단량체와 이에 특이적으로 결속하는 결속체의 반복사슬을 접촉하여 제조한 복합체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "다수항체단량체/반복사슬 복합체의 초복합체"는 상기 항체 단량체와 이에 특이적으로 결속하는 결속체의 반복사슬을 접촉하여 제조한 복합체들 사이에 교차결속(cross-binding)을 하여 형성된 복합체들의 집단인 초복합체(super-complex)를 의미한다.

아울러, 본 발명에서 사용되는 용어 "항원/다수항체단량체/반복사슬 복합체"는 상기 다수항체단량체/반복사슬 복합체를 항원에 접촉하여 제조한 복합체를 의미한다.

아울러, 본 발명에서 사용되는 용어 "항원/다수항체단량체/반복사슬 복합체의 초복합체"는 상기 다수항체단량체/반복사슬 복합체가 복합체들 사이에 교차결속 (cross-binding)을 하여 형성된 복합체들의 집단인 초복합체(super-complex)를 항원에 접촉하거나, 항원과 반복사슬의 혼합물을 먼저 만들고 이를 항체단량체에 가하여 항원의 존재 하에 반복사슬과 단량체가 초복합체를 형성하면서 항원과 결속하여 생성되는 항원과 초복합체의 결속체를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제조하는 단계를 포함하는 반복사슬의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 반복사슬과 다수의 단량체를 혼합시켜 다수단량체/반복사슬 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 다수단량체/반복사슬 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다수단량체/반복사슬 복합체들 간에 교차결속(cross-binding)을 형성시켜 상기 복합체들의 집단인 엉김체(aggregate)를 생성하는 단계를 포함하는 초복합체(super-complex)의 제조방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단량체는 단백질인 것이 바람직하고, 항체, 리간드 및 수용체, 그들의 조각, 그들의 재조합체, 그들의 유도체, 및 그들과 생물화학 기능기의 융합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 및 Fc 단편을 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 결속도메인은 단백질인 것이 바람직하고, 미생물 유래 단백질인 것이 더욱 바람직하며, 특히 연쇄상 구균(streptococcal)의 단백질 G, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A, 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)의 단백질 L, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 반복사슬에 있어서, 반복되는 결속도메인 사이에 각 도메인이 자유롭게 회전이 가능하게 하고 도메인 사이의 거리를 떨어지게 하는 유연한 링커 사슬을 포함시킬 수 있다. 이는 단량체가 결속할 때 단량체 상호 간의 충돌로 입체적 방해가 일어나 결속반응속도상수(binding reaction rate constant)가 작아져서 결속반응 평형상수(binding reaction equilibrium constant)가 작아지는 것을 방지하여 높은 결합반응평형(binding reaction equilibrium)을 얻을 수 있게 할 수 있다.

이런 결속도메인(binding domain)의 반복사슬은 결속도메인 사이의 유연한 링커(flexible linker)에 의해 사슬 내의 결속도메인이 자유로이 회전(rotation)할 수 있고 사슬의 굽힘(bending)이 가능하다. 따라서 반복사슬에 단량체를 접촉시켜 생성한 복합체 내에서 각각의 결속된 단량체도 회전자유도(rotational freedom)와 진동자유도(vibrational freedom, bending freedom)를 매우 크게 가지게 된다. 이런 각 결속된 단량체는 그 움직임이 제한된 회전 방향과 굽힘 각도에서만 가능한 것이 아니라 매우 큰 범위의 방향과 각도에서 움직임이 자유롭기 때문에 상호간의 충돌을 피할 수 있게 되어 여러 개의 단량체가 반복서슬에 동시에 결속하는 것이 가능해 진다. 유연한 링커 서열은 반복사슬의 결속도메인 사이의 공간을 충분히 크게 만들어 복합체 형성을 위해 접근해 오는 단량체들이 상호간에 입체적 장애를 받지 않으면서 반복사슬에 결속할 수 있게 해준다. 본 발명의 반복사슬에 사용될 수 있는 결속 도메인을 가지고 있는 천연의 단백질은 그 안의 결속도매인 사이에 이러한 유연성을 가지고 있지 않다. 천연의 단백질들은 그 안의 결속도매인 사이에 이러한 자유도를 허락하지 않으며, 다수단량체와의 복합체를 형성하기에는 접근하는 단량체나 이미 결속되어 있는 단량체에 이러한 높은 수준의 회전 자유도와 진동 자유도를 주지 못한다.

본 발명에 따른 반복사슬에 사용된 결속도메인은 천연의 단백질 분자의 조각이 바람직하며, 이런 조각은 천연의 전체 단백질에 비해 분자량이 작다. 이런 작은 분자량의 결속도메인을 이용하여 인공적 반복사슬을 만듦으로써 상기 결속도메인이 유래한 큰 분자량의 천연의 단백질 분자보다 결속도메인이 매우 많으면서 분자량은 작은 반복사슬을 제작하는 것이 가능하다. 이는 많은 양의 단량체가 작은 분자량의 반복사슬에 결속하는 것을 가능하게 한다. 결속도메인의 숫자가 많으면서 분자량이 작은 반복사슬은 그 생산과 정제가 용이하며, 이는 천연의 단백질로는 이루어 낼 수 없는 큰 장점이다. 본 발명에서는 결속 도메인의 반복횟수를 20번까지 반복되는 사슬을 제작하였으나, 이에 한정되지 않는다.

결속도메인의 숫자가 많으면서 분자량이 작은 반복사슬을 사용할 경우에는 천연의 분자에서는 얻어낼 수 없는 단량체의 단량체를 결속하는 분자(천연의 미생물 단백질 분자, 본 발명에서의 반복사슬)에 대한 결속비율(monomer to binding molecule ratio)을 매우 높게 얻어 단량체의 효과를 크게 증폭할 수 있다. 이러한 반복사슬은 그 분자량이 작기 때문에 인공적인 단백질 생산도 용이하다.

본 발명에 있어서, 단량체 내의 서로 다른 부위 a' 및 b'가 있고, 결속체에는 이들과 결속하는 부위 a, b 가 있을 때, 반복사슬은 a 와 b의 반복사슬, 단량체에는 a' 및 b'가 적어도 각각 한 개씩 또는 그 이상이 있어야 다수단량체/반복사슬의 복합체간의 초복합체의 형성이 가능하다.

본 발명에 있어서, 단량체는 (a'b') 의 형태로 한 개의 단량체에 a' 및 b'가 같이 존재해야하고, 반복사슬의 결속체에는 결속부의 a 및 b가 한 개의 결속체에 같이 존재하여 (ab)-(ab)-(ab)----(ab)의 형태로서 반복사슬을 이루거나, 또는 결속부위 a와 b가 서로 다른 결속체에 독립적으로 있어서 반복사슬을 a-b-a-b-a-b----a-b 형태로 독립적인 a 도메인과 b 도메인의 반복으로 이루어진 경우가 가능하다. 반복사슬에서의 독립적인 a 도메인과 b 도메인의 개수와 순서는 한정되지 않는다. 또한 a=b일 때는 단량체는 (a'a')이고 반복사슬은 (aa)-(aa)-(aa)--- 이거나 a-a-a-a-a-a------의 형태가 가능하다.

본 발명에 있어서, 교차결속(cross-binding)하는 복합체 형성을 위한 반복사슬은 서로 결합하는 결속도메인 c 및 d를 가질 수 있으며, 이는 다수단량체/반복사슬 결속과는 상관이 없는 독립적인 것일 수 있다. 만약 반복사슬이 c-a-a-a-------d로 구성되는 경우, 여기서 상기 단량체는 도메인 a에 결합하고, 복합체들 사이에 교차결속은 c에 대한 d의 결속을 통한 것이다. 예를 들면, c-a-a-a-----a-d...c-a-a-a-----a-d....c-a-a-a-----a-d와 같이 초복합체가 구성되어 질 수 있으며, 여기서 '....'는 반복사슬 사이에 교차결속이다. 이렇게 형성된 초복합체는 반복사슬에 결속된 단량체의 효과를 증폭시킬 수 있다. 이러한 경우의 반복사슬의 구조는 하나의 반복사슬 내의 c 및 d 도메인이 서로 결속하지 않기 위해 휘어지지 않게 단단해야 한다. 만약 한 개의 반복사슬 내의 c 와 d 도매인이 결속한다면, 다수단량체/반복사슬 복합체 사이의 교차결속이 일어날 확률이 매우 낮기 때문에 초복합체가 형성될 가능성도 매우 낮아지게 된다. 또한 단량체와 혼합하기 전에 한 개의 반복사슬의 c 가 다른 반복사슬의 d 에 결속하여서도 안 된다. 이러한 두 반복사슬간의 결속이 미리 일어난다면 반복사슬을 다루기가 매우 어려울 것이며, 단량체와의 복합체를 형성하기도 어려울 것이다.

또한, 본 발명은 단량체에 특이적으로 결속하며 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단일 종류의 결속도메인 또는 복수 종류의 결속도메인이 반복된 반복사슬을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 반복사슬에 다수의 단량체가 결속되어 제조된 다수단량체/반복사슬 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 다수단량체/반복사슬 복합체들 간에 교차결속(cross-binding)이 형성되어 상기 복합체들의 집단인 엉김체(aggregate)인 초복합체(super-complex)를 제공한다.

상기 단량체는 단백질인 것이 바람직하고, 항체, 리간드 및 수용체, 그들의 조각, 그들의 재조합체, 그들의 유도체, 및 그들과 생물화학 기능기의 융합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 및 Fc 단편을 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 결속도메인은 단백질인 것이 바람직하고, 미생물 유래 단백질인 것이 더욱 바람직하며, 특히 연쇄상 구균(streptococcal)의 단백질 G, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A, 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)의 단백질 L, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 단량체의 표적에, 본 발명에 따른 반복사슬, 다수단량체/반복사슬 복합체 또는 초복합체를 혼합시켜, 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 효과 증폭 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단량체의 표적에 대한 단량체의 효과를 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단량체의 표적은 항원, 항체, 펩티드(peptide), 단백질, 박테리아, 바이러스 및 진균, 또는 그들의 조각으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 박테리아는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; 결핵균) 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 바이러스는 인플루엔자, 구제역 바이러스, 인체유두종바이러스(human papilloma virus, HPV), 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, 간염 B 표면(hepatitis B surface) 항원 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단량체 효과의 측정은 단량체-표지체 접합체 또는 2차 탐지체(항체)-표지체 접합체 및 표지체의 표지기질을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 초복합체의 생성은 초복합체에 다수의 단량체가 들어 있으므로 단량체의 표적에 대한 생물학적 화학적 효과가 단량체에 비해 매우 높은 배수의 효과를 제공함으로써 신호 증폭과 같은 단량체의 효과를 증폭할 수 있다.

또한, 본 발명은 검출하고자 하는 표적에 특이적이고 한 개의 단량체 내에 두 개 이상의 결속부위를 갖는 단량체 다수, 및 상기 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복사슬을 포함하는 분석 키트를 제공한다.

상기 키트는,

1) 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복사슬;

2) 검출 표적과 특이적으로 결속하는 단량체;

3) 기질과의 반응에 의해 표지기능을 나타내는 표지체가 접합된 2차 탐침 접합체;

4) 상기 표지체와 표지 반응할 표지기질 용액;

5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및

6) 효소 표지반응 정지용액을 포함하는 것이 바람직하나, 상기 구성에 한정되지 않는다.

상기 키트는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 응집법(agglutination), 면역크로마토그래피(Immunochromatographic assay) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석을 수행할 수 있다.

상기 표지체는 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein), 퀀탐 닷(Quantum dot), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(beta-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase) 및 방사성 물질 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 발색기질은 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤자이딘(3,3', 5,5'-tetramethyl bezidine, TMB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조타이아졸린-6-설폰산)(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS), o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine, OPD), 디아미노벤자이딘(diaminobenzidine, DAB), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbasole), 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트/ 아이오도니트로테트라졸리움(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium, BCIP/INT), 뉴 푸친(New fuchin, NF) 및 패스트 레드 TR 염(fast red TR salts)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 검출기능기(detection functional group)를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)시키는 단계를 포함하는 반복사슬-검출기능기의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 검출기능기를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)시켜 반복사슬-검출기능기를 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 반복사슬-검출기능기에 단량체를 혼합시켜 다수단량체/반복사슬-검출기능기의 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 단량체에 결속하는 결속도메인의 반복사슬에 검출기능기(detection functional group)를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)되어 제조된, 단량체 결속 도메인의 반복사슬-검출기능기를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단량체 결속 도메인의 반복사슬-검출기능기에 다수단량체가 결속되어 제조된, 다수단량체/반복사슬-검출기능기의 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 단량체의 표적에, 본 발명에 따른 다수단량체/반복사슬-검출기능기의 복합체를 혼합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 단량체의 표적의 검출 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단량체의 표적에 대한 단량체의 검출 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 검출기능기는 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 텍사스레드(Texas Red)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단량체가 항체인 경우 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 및 Fc 단편을 포함하는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명을 암치료제 인 항체-독소 (antibody-toxin, immunotoxin)에 적용하여 암세포 특이 항체-독소의 초복합체를 생산하는 것이 가능하며, 이는 매우 약효능이 (drug efficacy) 뛰어나게 높은 항체-독소의 초복합체로서 세포살상 기능기를 매우 많은 량 암 표적 세포로의 전달을 가능하게 하여 암치료가 가능해진다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다.

단. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 단백질 G의 항체 접착 도메인 III 의 반복사슬 GR8 ~ GR20 , GR2 -2, -3, -4의 제조

단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(domain Ⅲ) 유전자를 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 받은 연쇄상구균(KCTC 3098)의 염색체 DNA(chromosomal DNA)로부터 얻었다. G4S 링커가 두 개의 도메인 Ⅲ 사이에 2번에서 4번까지 반복된 플라스미드 pGR2-2부터 pGR2-4를 제조하였다. 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(domain Ⅲ)를 가지고 있는 플라스미드인 pGR1(Y. Lee et al, Enhanced Formation of Disulfide-bridged Dimer(Fab-PE38)2 Utilizing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol. Chem. 285, 5127-5131)을 site-directed mutagenesis를 이용하여 도메인 Ⅲ의 끝 G4S 링커의 앞에 추가적인 AgeI 제한효소 자리를 넣어 pGR1-A을 제조하였다.

2개의 프라이머 P3[5'-AGACCTTTAC GGTAACTCAA ACCGGTGGAG GCGGGTCCGG ATA-3'(서열번호: 1)]과 P4[5'-TATCCGGACC CGCCTCCACC GGTTTCAGTT ACCGTAAAGG TCT-3'(서열번호: 2)] 프라이머(primer)로 Quick-chage site-directed mutagenesis를 하였다. 상기 mutagenesis 후에 pGR1-A의 핵산 서열을 디데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다. 플라스미드 pGR1-A을 NdeI과 BspEI 제한효소로 잘랐고 여기서 나온 작은 fragment를 정제하였다. 또한 pGR1을 NdeI과 6 His tag자리 뒤에 있는 AgeI으로 잘랐다. pGR2-A은 pGR1을 NdeI과 AgeI으로 잘라 얻은 큰 fragment와 pGR1-A을 NdeI과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 fragment를 ligation하여 만들었다. 이 결과 나온 pGR2-A을 NdeI과 AgeI으로 절단하여 Protein G의 두 번째 도메인 Ⅲ와 그 앞에 G4S 링커가 남은 큰 fragment를 얻었다. 이 큰 fragment와 pGR1-A의 NdeI과 BspEI으로 절단하여 얻은 작은 fragment를 ligation하여 첫 번째 도메인 Ⅲ와 두 번째 도메인 Ⅲ 사이에 G4S가 두 개 있는 pGR2-2가 되도록 제조하였다. 계속해서 G4S 링커가 3개있는 pGR2-3과 G4S 링커가 4개있는 pGR2-4를 pGR2-2를 만들 때와 같은 방법으로 제조하였다.

GR8 ~ 20은 pGR1(Y. Lee et al, Enhanced Formation of Disulfide-bridged Dimer(Fab-PE38)2 Utilizing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol. Chem. 285, 5127-5131)의 논문에서와 같은 방법으로 제조하였다. 발현 플라스미드의 제작은 도 1과 같이 수행하였으며(도 1), 정제된 반복사슬은 16% SDS-PAGE 로 분석하였다(도 2).

< 실시예 2> Fab - toxin 단량체와 단백질 G 도메인 III 의 반복사슬 GR1 ~ GR10, GR2 -2, -3, -4와의 복합체에 대한 크기 배제 크로마토그래피( Size - exclusion chromatography) 분석 및 복합체 내에서의 이황화가교 이량체 형성 확인

면역글로불린에 접착하는 단백질 G의 도메인 Ⅲ는 IgG의 Fc와 Fab fragment에 모두 붙는다. 단백질 G의 면역글로불린 접착부위(도메인 Ⅲ)는 Fab fragment의 CH1에 붙는다고 보고되었다. 단백질 G의 도메인 Ⅲ의 second β-strand는 Fab의 CH1 도메인 seventh β-strand와 역평행하게 붙는다. 두 단백질 사이에 있는 β/β interaction은 CH1 도메인과 도메인 Ⅲ 사이에 다섯 개의 수소결합을 하게 해 준다. 이에 더하여 세 개의 수소결합이 더 있는데 이 또한 CH1 도메인의 주요 원자들과의 결합이다. 두 단백질 사이에 complex를 형성하면서 도메인 Ⅲ나 CH1 도메인의 구조에 어떠한 큰 변화는 나타나지 않는다.

도메인 Ⅲ가 반복된 반복사슬의 두 가지 다른 타입을 제조하였다. 우선, 도메인 Ⅲ사이에 하나의 G4S 아미노산이 있는 것을 제조하였다. 이 중에서 도메인 Ⅲ가 10번까지 반복된 반복사슬을 Fab-PE38 단량체와 association하여 복합체를 형성하였다. 사용한 반복사슬은 GR1부터 GR10이었다. 이 반복사슬과 단량체를 association하면 단량체가 다수가 붙어있는 단량체 2가, 3가 또는 4가의 복합체를 얻을 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 두 개의 도메인 Ⅲ 사이에 길이가 다른 G4S 링커를 가지는 반복사슬을 제조하였다. 이것은 Fab-PE38 단량체가 도메인 Ⅲ 반복사슬과 association하는데 링커에 따른 차이점을 알 수 있게 한다. 이런 반복사슬은 GR2-2, GR2-3, GR2-4이고, 각각 두 개의 도메인 Ⅲ 사이에 2개, 3개, 4개의 G4S 링커가 있었다. 이것은 두 개의 Fab-PE38 단량체가 반복사슬과 복합체를 형성하여 단량체의 이량체가 형성되는 적절한 길이를 알게 한다.

제조된 GR2-2, -3, -4를 이용해 비공유결합으로 형성된 복합체를 크기 배제 컬럼(size exclusion column)으로 분석하였다.

GR 시리즈 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 도 3에 나타내었다. 구체적으로, 크기 배제 크로마토그라피 분석을 Superdex-200TM HR 컬럼을 사용하였다. Fab-ext-PE38와 GR 시리즈의 association은 각각 다른 비율로 실행하였다. 715 ㎍ Fab-ext-PE38을 각각의 GR 단백질과 association시켰다. GR1 ~ 3에 대하여서는 Fab-ext-PE38과 GR 단백질을 2:1의 몰 비율로 혼합하였다. GR4 ~ 10에 대해서는 715 ㎍ Fab-ext-PE38과 각 28㎍의 GR 단백질을 혼합하였다. 모든 크로마토그램은 같은 용출부피에 맞추어 겹치게 표시하였다. 기준 물질로 사용된 [Fab-ext-PE38]2(D)와 Fab-ext-PE38(M)의 크로마토그램은 같은 조건하에서 elution하여 얻었다.

또한, GR2-2, -3, -4와의 complex의 Size-exclusion 크로마토그래피 결과를 도 4에 나타내었다.

또한, [Fab-ext-PE38]2 및 Fab-ext-PE38의 혼합물에 대한 GR2 또는 GR3와의 복합체 분석결과를 도 5에 나타내었다.

또한, Fab-PE38 단량체와 GR2-2, -3, -4를 섞은 단백질의 크기 배제 크로마토그램의 비교 결과를 도 6에 나타내었다.

또한, GR 반복사슬들과 Fab-PE38 단백질의 복합체의 정제를 위한 크기배제 크로마토그래피 결과를 도 7에 나타내었다.

또한, Fab-toxin 단량체와 GR10 또는 GR2-2, GR2-3, GR2-4 와의 복합체 내에서 환원 산화 섞음 반응에 의한 Fab-toxin 단량체로 부터의 이황화가교 이량체 형성 결과를 8% 비환원 SDS-PAGE 로 분석한 결과를 도 8에 나타내었다(도 3 내지 도 8).

그 결과, Fab-PE38 단량체 두 개가 각각의 반복사슬과 복합체를 만들며 모두 이량체가 형성됨을 알 수 있었다.

Fab-toxin 단량체로부터 환원산화 섞음 반응에 의해 형성된 이황화가교 이량체의 분률

Antibody-toxin bound to metal chelating bead	action of disulfide dimer
B3(Fab)-ext-PE38]	n.d.*
B3(Fab)-ext-PE38]:GR1	n.d.*
B3(Fab)-ext-PE38]:GR2	n.d.*
B3(Fab)-ext-PE38]:GR3	0.7
B3(Fab)-ext-PE38]:GR4	0.5
B3(Fab)-ext-PE38]:GR5	0.6
B3(Fab)-ext-PE38]:GR6	0.3
B3(Fab)-ext-PE38]:GR7	0.6
B3(Fab)-ext-PE38]:GR8	0.1
B3(Fab)-ext-PE38]:GR9	0.1
B3(Fab)-ext-PE38]:GR10	0.3
B3(Fab)-ext-PE38]:GR2-2	0.2
B3(Fab)-ext-PE38]:GR2-3	0.4
B3(Fab)-ext-PE38]:GR2-4	0.3

^*n.d(not determined): 관찰되지 않음.

< 실시예 3> 단백질 G 도메인 III 의 반복사슬 GR10 에 의한 웨스턴 블랏팅에서의 항체 신호 효과의 증폭 확인

cell signaling technology^®의 웨스턴 블로팅 프로토콜을 변형하여 사용하였으며, abcom^®의 직접 ELISA 프로토콜의 수정된 버전을 사용하였다.

용액 및 시약은 다음과 같이 준비하였다. 용액은 Milli-Q 또는 동등한 순도의 물을 사용하여 만들었다. 1) 1X SDS 샘플 버퍼 : 62.5 mM 트리스-HCl (25 ° C, pH 6.8), 2% W/V SDS, 10 % 글리세롤, 50 mM DTT, 0.01 % W/V 브로무페놀블루 또는 페놀레드. 2) 이동버퍼 : 25 mM 트리스베이스, 0.2 M 글라이신. 3) 10X 트리스 완충 식염수(TBS) : 10X TBS 1 리터의 준비 : 24.2 g 트리스베이스, 80g 염화나트륨, 염산으로 pH 7.6로 산도를 조정. (1X에서 사용) 4) 달걀 알부민 : (부피에 대한 무게 [W / V]). 5) 차단 완충용액 : 1X TBS, 0.1% 트윈-20과 2%의 W/V 닭 혈청 알부민. 6) 세척 완충요액 : 1X TBS, 0.1% 트윈-20 (TBS/T). 7) 1차 항체 : 산타크루즈 생명공학의 항-베타-액틴 마우스 항체. 8) 1차 항체 희석 완충용액 : 1X TBS, 0.1% 트윈-20과 2% W/V 닭 혈청 알부민. 9) 2차 항체 : 염소 항-마우스 베타 액틴 HRP. 10) 블라팅 막 : 니트로 셀룰로오스 막 (Wattman), PVDF 막 (PALL). 11) GR 재조합 단백질 : GR10. 12) 루미놀 용액 : 100 mM 트리스/HC pH8.8, 1.25 mM 루미놀, 2 mM 4IPBA, 5.3 mM 과산화수소. 13) 슈퍼 신호 펨토 최대 감도(Super signal femto maximum sensitivity) 시약(Thermo Scientific).

웨스턴 블럿팅을 다음과 같이 수행하였다. 우선, A431 또는 AGS 암세포주를 사용하여 세포 lysate를 준비한 후, 배양액을 흡입 제거하였다. 1X PBS로 세포를 세척한 후 PBS를 흡입 제거하였다. 그런 다음, 1X SDS 시료 완충용액을 가하여 세포를 용해시킨 후, 95 - 100 °C에서 5분 동안 시료에 열을 가한 다음, 5분 동안 소형 원심분리하여 시료를 가라앉혔다. 그런 다음, SDS-PAGE 젤(10 cm X 10 cm)에 올려 적재한 후 전기영동한 후, 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막에 전기이동시켰다.

막(membrane) 표면차단과 항체 결합반응은 다음과 같은 순서로 수행하였다. 용액의 부피는 10 cm x 10 cm(100 cm²)인 멤브레인에 대한 것이며, 다른 크기의 멤브레인에 따라 부피를 조정하였다.

막 표면차단은 우선, 전기이동 후 나이트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인을 실온에서 5 분간 적절한 부피의 TBS로 세척한 후, 멤브레인을 적절한 부피의 막표면 차단 버퍼에 넣고 실온에서 한 시간 동안 보온시킨 다음, TBS/T로 5분 동안 각각 세 번 세척하였다. 둘째로, 초복합체를 준비하였다. 우선, GR10과 1차 항체를 결과에 표시된 몰 비에 맞추어 혼합하여 37 ℃에서 1 시간에 보온시킨 후, 생성된 초복합체를 얼음에 넣어 사용할 때까지 보관하였다. 셋째로, 1차 항체와의 반응은 10 ml의 1차 항체 희석완충용액에 막과 1차 항체 또는 1차 항체와 반복사슬과의 복합체를 결과에 표시된 희석비율에 맞추어 넣고 상온에서 1시간 동안 보온시킨 후, TBS/T 15 ML로 5 분씩 세 번 세척한 다음, 1차 항체의 종에 적합한 HRP-접합된 2차 항체(1:2000)를 적절한 부피의 막 표면차단 완충용액과 섞은 후 부드럽게 교반하며 1시간 동안 실온에서 보온시켰다. 그런 다음, TBS/T 15ML로 5 분씩 세 번 세척한 후, 섹션D에 있는 검출 단계로 진행하였다. 마지막으로, 항원 단백질 검출은 우선, 루미놀 용액 또는 슈퍼신호 펨토 최대감도 시약(super signal femto maximum sensitivity reagent, Thermo Scientific)과 멤브레인을 부드럽게 교반하며 상온에서 보온시킨 후, 건조되지 않게 과하게 있는 현상용액을 따라 낸 다음, 플라스틱 랩으로 싸서 X-선 필름에 노출시켰다.

기존의 웨스턴 블랏 시약을 사용한 GR10에 의한 웨스턴 블랏팅(western blotting) 화학루미니센스 발광(chemiluminescence) 신호 증폭 결과를 도 9에 나타내었다(도 9).

또한, GR10 반복사슬에 의한 웨스턴 블럿 화학루미니센스 발광 신호의 증폭 결과를 도 10에 나타내었다(도 10). 구체적으로, GR10과 1차 항체의 초복합체 형성은 괄호 안에 표기된 몰 비에 따라 제조하였다. 1차 항체는 1:1000 희석된 농도로 사용하였으며, 초복합체도 같은 1차 항체 농도를 이용하여 제조하였다. 2차 항체로는 goat anti-mouse-HRP 접합항체를 두 실험 모두에 이용하였다. 1차, 2차 항체와 시료는 모두 실온에서 1시간 동안 보온시켰다. 실험의 모든 세포 용해물 시료는 10% denaturing SDS-PAGE로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 이동하였고, 이것을 세 조각으로 잘라 1차 항체로 탐지하였다. 민감도가 매우 높은 Thermo Supersignal Femto substrate를 현광발색 시약으로 사용하였다. 또한, A431 세포 맑은 용해물은 10% denaturing SDS-PAGE에서 분리하였고 PVDF 막으로 transfer 시켜서 초복합체가 니트로셀룰로오스 막과 비슷한 신호증폭 효과를 주는가를 알아보았다. 막은 처음에는 1차 항체만으로 탐지되고 2차 항체와 종래의 ECL 시약으로 발색하였고, 그 후 즉시 TBST 용액으로 세척한 다음 Supersignal Femto 기질로 발색하였다. 이 경우에는 신호의 증가와 동시에 매우 강한 배경잡음신호의 증가를 관찰하였다. 배경잡음신호는 2차 항체의 PVDF 막에 대한 비특이성 흡착과 Supersignal Femto 기질의 매우 높은 민감성 때문이다. 그 이후 SDS 와 2-mercaptoethanol을 사용하여 같은 막에서 항체들을 벗겨 낸 후, 1차 항체와 반복사슬을 혼합하여 만든 초복합체를 결속시킨 후, 2차 항체와 종래의 ECL 발색시약을 사용하여 검출하였다. 이 경우 초복합체는 종래의 방법에 비해 15배 높은 만감도를 주었으며, 이는 니트로셀룰로오스 막을 이용한 결과와 비슷한 결과를 나타내었다. 이 실험에서는 종래의 중간세기 민감도의 화학루미니센스 발광 기질을 사용하였으며, Haan and Behrmann (2007)의 방법에 따른 ECL 시약을 제조하여 사용하였다. 신호증폭 효과는 니트로셀룰로오스 막에서와 비슷하게 관찰되었으며, 증폭된 신호는 고민감도 Supersignal Femto substrate 를 사용했을 때와 비슷한 정도였으나 배경잡음신호의 동반 증가가 없는 깨끗한 신호의 증폭을 보여 주었다. PVDF 막에는 세포용해물 잘 붙기 때문에 중간세기 민감도의 발색기질로 적은 량의 시료의 검출이 가능하였다.

< 실시예 4> 단백질 G 도메인 III 의 반복사슬 GR10 에 의한 간접 효소면역측정법( enzyme - linked immunosorbent assay , ELISA )에서의 항체 신호 효과 증폭 확인

간접 ELISA는 다음과 같이 수행하였다.

용액 및 시약은 다음과 같이 사용하였다. Milli-Q 또는 동등하게 정제된 물로 모든 용액을 만들었다. 1) 중탄산염/탄산염 코팅 버퍼 (100 mM) 항원 또는 항체를 well에 고정하기 위해 코팅 버퍼에 희석하였다: 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3, 1000 ml 증류수 pH 9.6. 2) PBS. 3) 차단 용액 : 1 % BSA 혈청을 포함하는 PBS. 4) 세척 용액: 0.05% (v/v) Tween20 세제를 포함하는 PBS. 5) 항체 희석 버퍼 : 1차 및 2차 항체의 비특이적 결속을 줄이기 위해 1X 블로킹 솔루션에 희석하여 사용함.

마이크로플래이트에 항원 코팅은 우선, A431 또는 AGS 세포주를 세포 용해물을 준비하는데 사용하였고, 탄산염 코팅 버퍼로 최종 농도가 20 ㎍/ml이 되게 세포 용해물을 희석하였다. 그런 다음, 마이크로플레이트 ?? 상단부에 파이펫으로 희석한 용해물 50 μl를 가하여 코팅한 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 하루 밤 4°C에 보온시킨 다음, 코팅 용액을 제거한 후, 200 μL PBS로 웰을 두 번 세척하였다. 코팅 용액이나 세척 용액의 제거는 싱크대에 플레이트를 가볍게 뒤집어 흔들어 제거하였다. 남아 있는 용액은 종이 타월에 플레이트를 가볍게 두드려 제거하였다.

막 표면 차단은 우선, 웰 당 1 % BSA/PBS의 블로킹 버퍼 200 μL를 가하여 코팅된 ?痼? 나머지 단백질 결속 자리를 차단한 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 최소 2 시간 동안 보온시킨 다음, PBS로 플레이트를 두 번 세척하였다. 항체 반응은 우선, 블로킹 버퍼에 사용하기 직전에 지정된 농도로 희석된 1차 항체 또는 초복합체 100 μl를 넣은 후, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 1 시간 동안 보온시켰다. 그런 다음, PBS로 플레이트 두 번 세척한 후, 블로킹 버퍼에 사용하기 직전에 최적의 농도로 희석한 2차 항체-HRP 100 μl를 첨가한 다음, 플레이트 뚜껑을 덮고 실온에서 1 시간 동안 보온한 후, PBS로 플레이트 두 번 세척하였다.

검출은 우선, 멀티채널 파이펫으로 ?拷떪? TMB 기질 용액을 100 μl씩 첨가한 후, 충분한 발색 후 (30 분) 각 ?沽? 반응정지용액을 100 μL씩 첨가한 다음, 플레이트 리더로 각 웰의 흡광도(광밀도)를 측정하였다.

GR10이 크게 ELISA의 민감도를 향상시키는 결과를 도 11에 나타내었다(도 11). 구체적으로, 두 개의 서로 다른 ELISA 실험에서 ELISA 신호의 상당한 증폭이 단클론 항-β-액틴 항체와 GR10의 초복합체가 1차 항체로 사용했을 때 관찰되었다. AGS 세포 lysate는 일반 세포배양 시험용 96well 플레이트에서 섭씨4℃에서 하룻밤 동안 보온하였고, ELISA는 표준 절차에 따라 수행하였다. GR10과 1차 항체의 초복합체는 괄호 안에 표시된 몰비에 따라 미리 형성하였다. 1차 항체는 마우스 단클론 항-β-액틴 항체를 사용하였다. 2차 항체인 염소 항-마우스-HRP 접합체가 두 실험 모두에 사용 되었다. 1차와 2차 항체는 모두 상온T에서 1시간 동안 반응시켰다. 기질인 TMB는 상온에서 30 분 동안 반응시켰다.

2차 항체의 연속 희석에 따른 신호증폭 효과를 도 12에 나타내었다(도 12). 일차 항체와 GR10의 초복합체가 크게 ELISA의 신호를 증가시키고, 2차 항체의 시험된 희석의 범위에 꽤 일정한 것을 보여주었다. 이 ELISA 실험에서 마우스 단클론 항-β-액틴 항체와 GR10의 초복합체를 1차 항체로 사용했을 때 ELISA 신호의 상당한 증폭이 관찰되었다. A431 세포 용해물을 사용하였다. GR10과 1차 항체의 복합물은 1:10의 몰 비율에 따라 미리 만들었다. 2차 항체로는 염소 항-마우스-HRP 결합체가 사용되었다. A431 세포 용해물 1g 이 각 ?沽? 코팅되었다. 1차 항체는 10배씩 연속적으로 희석되었다. 표기된 1차 항체의 고정된 희석비율에서, 2차 항체는 연속적으로 2배씩 희석되었다.

< 실시예 5> 단백질 G 도메인 III 의 반복사슬 GR10 에 의한 인플루엔자( influenza ) 신속 항원 진단 키트(Rapid Antigen Test)의 민감도 증진 확인

항체를 이용한 가장 대표적인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트에 GR10을 사용하여 이의 민감도 증진을 관찰하였다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트(SD사)또는 녹십자사의 키트를 사용하였으며, 키트에는 항원 완충용액, 점적기, 튜브, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완충용액을 점적기(Dropper)의 선 부분까지 빨아들인 후 항원 완충용액을 튜브(Tube)에 넣고, 항원 샘플을 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 혼합하였다. 이때, 항원 완충용액에 GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.

그 결과, 기존에 시판중인 신속항원 진단 키트의 항원 희석용액에 GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR10이 없는 경우에 비하여 항원이 1000배 까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 13).

< 실시예 6> 항체에 대한 표지 시약으로 GR 단백질을 이용한 암세포주의 면역 형광 탐색

GR1에 형광 색소인 플루오레세인 이소티오시안산(Fluorescein isothiocyanate, FITC)를 접합한 형태의 단백질을 제작(GR1-FITC)하여 배양 암세포주 A431(human squamous carcinoma)의 면역 형광염색에 사용하였다. 1차 항체는 마우스(mouse) 항-LC3 항체를 사용하였고, 이에 대한 이차 항체 대신 제작된 GR1-FITC를 탐지에 사용하였다. 형광 탐지된 세포는 또한 F-액틴(F-actin)에 대해 로다민-팔로이딘(Rhodamine-phalloidin)(sigma aldrich)을 이용하여 염색하였으며 형광현미경으로 ?u색 정도를 관찰하였다.

그 결과, 사용된 단백질의 양은 2차 항체-형광발색기 접합체의 경우보다 GR1-FITC 접합체를 사용하였을 경우 훨씬 적은 양의 단백질을 사용하였으며 선명하게 발색된 형광 염색 영상을 얻어낼 수 있었다(도 14).

따라서, GR1-FITC 와 같이 GR 단백질에 탐지 기능기를 연결, 접합, 융합시키면 모든 항체에 사용이 가능하며, 이에 각각의 항체에 탐지 기능기를 접합시킬 필요가 없는 것을 알 수 있었다. 또한 GR 단백질은 매우 작은 분자이기 때문에 생산이 용이하고 다루기도 매우 쉬운 것을 알 수 있었다.

< 실시예 7> 포도상 구균 ( Staphylococcus aureus )의 단백질 A의 항체 접착 도메인( domain B)의 반복사슬 발현 플라스미드의 제작

단백질 A(protein A)의 도메인 B(domain B)의 DNA 서열을(표 7-1) 인공 합성하여 벡터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아[Bioneer Corporation] 로부터 받아 대장균 DH5α을 형질전환 하여 클로닝하였다.

상기 플라스미드를 NdeI과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을(245bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pGR1 (pTR1)의 벡터 부분에 클로닝하여 단백질 A의 도메인 B를 1개 가지고 있는 pAR1을 제작하였다. 그런 다음, 상기 도메인 B의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다.

각 도메인 B 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서(spacer)로 있다. 단백질 A의 도메인 B가 2번 반복되어 있는 pAR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pAR1 (표 2) 을 다시 NdeI과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, 도메인 B 및 두개의 G4S를 암호화하는 245bp의 작은 단편을, NdeI과 AgeI으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pAR2를 NdeI과 AgeI로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 245 bp 단편과 붙여 단백질 A의 도메인 B가 3번 반복되어 있는 pAR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 A의 도메인 B가 5번까지 반복된 플라스미드(pAR5)를 제조하였다.

단백질 A(protein A)의 도메인 B(domain B) 염기서열

단백질 A의 도메인 B의 염기서열

5'-CATATGCATCATCATCATCACCACACCGGTTCTCAAGCCCCAAAAGCCGACAATAAATTTAATAAAGAGCAGCAGAACGCGTTTTATGAAATCTTGCATCTGCCGAATCTGAATGAAGAACAACGTAACGGATTCATTCAGAGCCTTAAAGATGATCCTAGTCAGTCCGCTAACTTACTCGCAGAAGCTAAGAAACTGAATGATGCACAGGCGCCGAAGGGAGGGGGTGGATCCGGTGGTGGCGGCTCCGGATAAGAATTC-3'(서열번호: 3)

* 밑줄 친 부분: 코딩 서열(coding sequence)

본 발명에서 사용된 플라스미드 및 단백질

플라스미드	단백질 명칭	참고문헌
pLR1~5	LR1~5: (His)₆-(B1-G₄S-G₄S)_n, n=1~5. ^{a, b, c.}	본 명세서

^aG4S; GGGGS의 아미노산 서열(서열번호: 4);

^b(His)6: 6개의 히스티딘 태그(6xHistidine tag); 및

^cB: 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 단백질 A의 도메인 B.

이전에 보고된 방법(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402)을 이용하여, 상기 반복사슬 컨스트럭트로 부터 단백질을 과발현시켰다.

순수한 용해물을 Ni2+-킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피( Ni2+-chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다.

< 실시예 8> 펩토스트렙토커스 ( Peptostreptococcus magnus ) 의 단백질 L의 항체 접착 도메인( domain B1) 의 반복사슬 발현 플라시미드의 제작

단백질 L(protein L)의 도메인 B1(domain B1)의 DNA 서열을(표 4) 인공 합성하여 벡터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아[Bioneer Corporation] 로부터 받아 대장균 DH5α을 형질전환 하여 클로닝하였다.

상기 플라스미드를 NdeI과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을(299bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pGR1 (pTR1)의 벡터 부분에 클로닝 하여 단백질 L의 도메인 B1을 1개 가지고 있는 pLR1을 제작하였다. 그런 다음, 상기 도메인 B1의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다.

각 도메인 B1 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서(spacer)로 있다. 단백질 L의 도메인 B1이 2번 반복되어 있는 pLR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pLR1(표 5) 을 다시 NdeI과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, 도메인 B1 및 두개의 G4S를 암호화하는 299bp의 작은 단편을, NdeI과 AgeI으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pLR2를 NdeI과 AgeI로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 299 bp 단편과 붙여 단백질 L의 도메인 B1이 3번 반복되어 있는 pLR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 L의 도메인 B1이 5번까지 반복된 플라스미드(pLR5)를 제조하였다

단백질 L(protein L)의 도메인 B1(domain B1) 염기서열

단백질 L의 도메인 B1의 염기서열

5'-CATATGCATCACCATCACCATCATACCGGTATCAAGTTCGCCGGTAAAGAAGAAACGCCGGAAACCCCTGAGACAGACAGTGAAGAGGAAGTGACAATAAAAGCAAATCTGATTTTCGCCAACGGGTCAACCCAGACGGCCGAATTCAAAGGGACATTTGAAAAAGCAACTTCTGAGGCTTATGCATACGCGGACACTCTGAAGAAGGATAATGGTGAATATACCGTAGATGTTGCTGATAAAGGTTATACCCTGAATATTAAATTTGCGGGTGGCGGCGGCGGAAGCGGTGGCGGAGGTTCCGGATAAGAATTC-3'(서열번호: 5)

* 밑줄 친 부분: 코딩 서열(coding sequence)

본 발명에서 사용된 플라스미드 및 단백질

^aG4S; GGGGS의 아미노산 서열(서열번호: 4);

^b(His)6: 6개의 히스티딘 태그(6xHistidine tag); 및

^cB1: 펩토스트렙토커스(Peptostreptococcus) 단백질 L의 도메인 B1.

순수한 용해물을 Ni2+-킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피 ( Ni2+-chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다.

< 실시예 9> 펩토스트렙토코커스( Peptostreptococcus magnus )의 단백질 L의 항체 접착 도메인 ( domain B1) 과 포도상 구균( Staphylococcus aureus )의 단백질 A의 항체 접착 도메인( domain B)의 반복사슬 발현 플라시미드의 제작

단백질 L(protein L)의 도메인 B1(domain B1)의 DNA 서열을 인공 합성하여 벡터에 넣은 플라스미드를 (주)바이오니아[Bioneer Corporation]로부터 받아 pLR1을 만들었다.

상기 플라스미드 pLR1을 NdeI과 BspEI으로 잘라 얻은 작은 DNA 조각을(299bp) 정제한 후, 상기와 같은 효소로 자른 pAR1(protein A의 도메인 B 포함)의 벡터 부분에 클로닝 하여 단백질 L의 도메인 B1 1개와 단백질 A의 도메인 B 1개를 연결하여(B1-B) 가지고 있는 pLAR1을 제작하였다. 그런 다음, 상기 도메인 B1(protein L의 도메인 B1)과 B(protein A의 도메인 B)의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다.

각 도메인 B1(protein L의 도메인 B1), B(protein A의 도메인 B) 사이에는 (G4S)2 서열의 10개의 아미노산 서열이 스페이서(spacer)로 있다. 단백질 L의 도메인 B1와 단백질 A의 도메인 B 연결된 LA서열(B1-B)이 2번 반복되어 있는 pLAR2를 제작하기 위하여 상기 결과물인 플라스미드 pLAR1(표 6) 을 다시 NdeI과 BspEI로 잘랐다. 그런 다음, B1-(G4S)2-B-(G4S)2 (B1-B)를 암호화하는 521 bp 작은 단편을, NdeI과 AgeI으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pLAR2를 NdeI과 AgeI로 자른 다음, 얻어진 큰 단편을 521 bp 단편과 붙여 LA서열이 3번 반복되어 있는 pLAR3를 얻었다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 L의 도메인 B1과 단백질 A의 도메인 B가 3번까지 반복된 플라스미드(pLAR3)를 제조하였다.

단백질 LA(protein LA)의 도메인 B1-B(domain B1-B) 염기서열

단백질 LA 의 도메인 B1-B 염기서열

5'-CATATGCATCACCATCACCATCATACCGGTATCAAGTTCGCCGGTAAAGAAGAAACGCCGGAAACCCCTGAGACAGACAGTGAAGAGGAAGTGACAATAAAAGCAAATCTGATTTTCGCCAACGGGTCAACCCAGACGGCCGAATTCAAAGGGACATTTGAAAAAGCAACTTCTGAGGCTTATGCATACGCGGACACTCTGAAGAAGGATAATGGTGAATATACCGTAGATGTTGCTGATAAAGGTTATACCCTGAATATTAAATTTGCGGGTGGCGGCGGCGGAAGCGGTGGCGGAGGTTCCGGTTCTCAAGCCCCAAAAGCCGACAATAAATTTAATAAAGAGCAGCAGAACGCGTTTTATGAAATCTTGCATCTGCCGAATCTGAATGAAGAACAACGTAACGGATTCATTCAGAGCCTTAAAGATGATCCTAGTCAGTCCGCTAACTTACTCGCAGAAGCTAAGAAACTGAATGATGCACAGGCGCCGAAGGGAGGGGGTGGATCCGGTGGTGGCGGCTCCGGATAAGAATTC-3'(서열번호: 6)

* 밑줄 친 부분: 코딩 서열(coding sequence)

본 발명에서 사용된 플라스미드 및 단백질

플라스미드	단백질 명칭	참고문헌
pLAR1~3	LAR1~3: (His)₆-(B1-G₄S-G₄S-B-G₄S-G₄S)_n, n=1~3. ^a,b,c,d	본 명세서

^aG4: GGGG의 아미노산 서열(서열번호: 7);

^b(His)6: 6개의 히스티딘 태그(Histidine tag);

^cB1: 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 단백질 L의 도메인 B1; 및

^dB: 포도상 구균(Staphylococcal) 단백질 A의 도메인 B.

이전에 보고된 방법(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402)을 이용하여, 상기 반복사슬 컨스트럭트를 과발현시켰다.

순수한 용해물을 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다.

< 실시예 10> 신속 항원 진단 키트(Rapid Antigen Test)를 이용한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결합

항체를 이용한 가장 대표적인 검출법인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트를 이용하여 항원을 가하지 않은 상태에서 반복서열을 가하여 형성되는 골드항체와의 복합체 또는 초복합체가 검출선 항체와 교차결합을 하여 골드항체가 검출 되는지를 관찰하였다. 이렇게 나타나는 검출선은 반복사슬/골드항체의 복합체 또는 초복합체 내의 반복사슬의 항체 결합 도메인 중 비어 있는 자리가 검출선 항체에 교차결합하여 나타나는 것이다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트와 녹십자 인플루엔자 항원 진단 키트를 사용하였으며, 키트에는 항원 완충용액, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완충용액 뚜껑을 열고, 항원 완충용액을 튜브(Tube)에 넣고, GR, AR, LR, LAR 반복사슬 시리즈를 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 혼합하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.

SD 스트립의 경우, 항원 완충용액에 GR4, GR5, GR7 GR10, GR15 GR20 단백질을 각각 10ug과 1ug을 단순 희석하는 것으로 밴드가 나타나 교차결합이 일어나는 것을 볼 수 있으며 녹십자 스트립의 경우에는 1ug 경우 SD스트립보다 더 강한 색의 검출선이 나타나는 것을 볼 수 있다. 그러나 0.1ug에서는 두 스트립 모두 밴드가 보이지 않으므로 항원이 없는 상태에서 검출선이 검출되지 않는 반복사슬의 량임을 알 수 있었다. 이 반복사슬의 량은 항원을 가하여 검출하였을 때 반복사슬이 항원검출에 주는 영향을 시험해 볼 때 사용할 량으로 적절한 것이다(도 15).

SD 스트립 상에서 AR5, LR3, LR5, LAR1, LAR2, LAR3도 골드항체가 검출선에 나타나는 것을 볼 수 있다. 그러나 녹십자 키트의 경우에는 LR 시리즈에서는 아무 밴드도 나타나지 않는 것을 볼 수 있다. 이것은 LR의 항체 결속도메인이 항체의 경쇄 중에서 카파 경쇄 (kappa light chain)에 만 결속하기 때문이며, 녹십자 키트의 항체가 카파 경쇄로 이루어진 항체가 아니기 때문이다. 그리고 모든 반복사슬에 대해 반복사슬의 사용 량이 0.1ug에서는 SD와 녹십자 스트립 모두에서 밴드가 관찰 되지 않으므로 항원 검출에 대한 반복사슬의 영향을 시험하는 실험에 사용될 량으로 적절하다(도 16).

< 실시예 11> 반복사슬의 인플루엔자( influenza ) 신속 항원 진단 키트( Rapid Antigen Test )의 신호증폭에 대한 영향

항체를 이용한 가장 대표적인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트에 GR, AR, LR, LAR 시리즈 단백질을 사용하여 이의 민감도 증폭을 관찰하였다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트를 사용하였으며, 키트에는 추출액, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 추출액 뚜껑을 열고, 추출액을 튜브(Tube)에 떨어뜨렸고, Antigen(H1N1)을 추출액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 혼합하였다. 이때, 항원 희석용액에 GR, AR, LR, LAR 시리즈 단백질을 항원과 함께 단순 희석하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.

그 결과, GR5 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR5이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-7까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 17).

GR10 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR10이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-8까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 18).

GR15 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR15이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-9까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 19).

GR20 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 GR20이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-10까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 20).

AR5 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것은 AR5이 없는 경우와 비교하였을 때 효과가 없음을 알 수 있다(도 21).

LR5 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 LR5이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-6까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 22).

LAR3 단백질을 항원과 함께 단순 희석하는 것으로 LAR3이 없는 경우에 비하여 항원이 10^-8까지 희석될 때까지 항원이 검출되었다(도 23).

< 실시예 12> 반복사슬 GR , AR , LR , LAR 과 IgG 사이의 초복합체 침전 형성 관찰

IgG 용액은 Equitech Bio,사의 Mouse IgG 파우더를 PBS에 녹인 후 이용하였다. PBS에 녹인 IgG 용액은 로커 위에서 2시간 동안 rocking해준 후, 원심분리기를 이용 21000rpm, 4℃에서 2시간 동안 원심 분리하여 용액 내에 완벽하게 녹지 않은 IgG 입자를 제거하였다. GR1 ~ 20과 IgG는 모두 BCA 단백질 정량법(Bicinchoninic Acid protein assay)을 통하여 정량하여 원하는 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. GR1 ~ 20 용액과 IgG 용액을 정량만큼 마이크로 센트리퓨즈 튜브에 섞어준 후 상온에서 하룻밤(Overnight) 동안 결속하도록 보관하였다. 13000rpm, 20°C에서 30분 동안 원심 분리하였다. 이때 침전이 가능한 초복합체가 많이 형성되었다면 육안으로 침전의 관찰이 가능하다. 마이크로 파이펫을 이용하여 상층액을 모두 제거한 후, 75% 에탄올 500㎕을 첨가하였다가 다시 제거하는 방법으로 마이크로 센트리퓨즈 튜브 벽면에 남아있는 용액을 모두 세척하였다. 남아있는 75% 에탄올을 모두 증발시켜 제거한 후 SDS-PAGE에 전기영동 하여 관찰하였다.

그 결과, IgG대 GR10의 몰비(mole ration)가 1:1, 5:1, 10:1이 되게 혼합해주었을 때, 1:1이나 10:1으로 섞어준 경우보다 5:1이 되게 섞어준 경우에서 침전이 더 많이 형성되는 것을 관찰 하였다(도 24).

IgG와 GR10를 5:1 비율로 섞어준 후, 들어간 GR10 질량과 같은 질량의 GR1과 GR2를 섞어서 반응 시켜 주었을 때 GR10이 들어간 경우가 GR1, GR2가 있는 경우에 비해 침전이 많이 형성되는 것을 육안으로, 그리고 SDS-PAGE결과에서 모두 관찰 하였다(도 25). 같은 질량만큼 넣어준 경우에는 반응액에 존재하는 항체 결속 도메인 DIII 의 전체 몰 수는 같지만 GR10의 경우에는 DIII 10개가 반복되어 연결된 한 개의 사슬형태로 있고, GR2의 경우에는 2개가 반복되어 연결된 한 개의 사슬로 있다. GR 단백질의 총량을 같게 하여 도메인 DIII 의 총량이 같은 량 존재할 때 GR1이나 GR2 보다 GR10이 더 긴 반복사슬의 형태이기 때문에 초복합체 형성을 더 잘한다는 것을 알 수 있다.

또한, IgG와 GR10의 몰비가 5:1이 되게 하고, GR1 ~ 9를 GR10과 같은 질량만큼 가하여 각각 IgG와 섞어서 반응시켜주었다. 이때 섞어준 후 IgG의 최종농도는 400μg/ml이었다. GR3부터 GR10까지 침전이 생성되는 것을 육안으로 관찰할 수 있었다(도 26). 또한 SDS-PAGE를 통해서도 같은 결과를 볼 수 있었다(도 27). 이를 통해 GR3부터 복합체 사이의 교차결합으로 인하여 침전 가능한 초복합체의 형성이 일어나 는 것을 확인할 수 있었다.

IgG만 있는 대조 시료의 경우에는 침전이 형성되지 않았고, 또한 GR이 아닌 BSA를 넣어준 대조시료에서도 침전 형성이 관찰되지 않았으므로, 형성되는 침전물이 이종단백질의 유입으로 인한 단백질 용해도의 감소로 인한 것이 아니라 반복사슬에 의한 분자량이 큰 초복합체의 형성으로 인하여 침전이 형성된 것임을 알 수 있다.

GR10보다 도메인 DIII 의 반복횟수가 더 큰 경우의 초복합체의 형성을 확인 하기 위해 IgG와 GR10의 몰비가 5:1이 되게 하고, GR1, 3, 5, 15, 20를 GR10과 같은 질량만큼 가하여 각각 IgG와 섞어서 반응시켜주었다. GR1과 IgG의 경우만을 제외하고 나머지는 모두 침전이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. SDS-PAGE 에서도 GR3부터 GR20까지는 모두 침전이 형성되는 것으로 확인 가능하였다(도 28). 이를 통해 GR10보다 큰 GR15나 GR20 또한 IgG와 침전 가능한 초복합체를 형성한다는 것을 알 수 있다.

IgG의 최종 농도를 낮추어 가면서 같은 실험을 실행하였을 때 25μg/ml이하로 IgG의 최종 농도가 내려갔을 때 더 이상 GR에 의해 육안으로 관찰 가능한 침전이 형성되지 않았다. 이를 통해 초복합체 형성을 통한 침전의 형성은 IgG의 농도에 의존한다는 것을 알 수 있다. 또한 위와 같은 방법으로 GR뿐만 아니라 AR1, 3, 5, LR1, 3, 5, LAR1, 2, 3도 IgG와의 몰비가 5:1이 되게 하여 반응을 시켰다. 이 때, IgG의 최종 농도는 500μg/ml이었고, GR과는 달리 AR, LR, LAR의 경우에는 모두 침전이 관찰 되지 않았다. 이 반복사슬들은 IgG와 결속하여 육안으로 관찰 가능한 불용성인 침전을 형성하지 않는다는 것을 알 수 있다.

< 실시예 13> 단백질 G의 항체 접착 도메인 III 반복사슬과 형광 단백질 GFP 를 융합한 유전자의 플라스미드 제작 및 발현

연쇄상 구균(Streptococcus) 단백질 G의 도메인 Ⅲ가 반복 사슬로 있는 플라스미드 GR1, GR5, GR10에 형광 단백질을 발현하는 GFP DNA 시퀀스(표 8)를 유전자 융합하여 GR1-GFP, GR5-GFP, GR10-GFP 플라스미드를 제조하였다.

GR1과 GFP 시퀀스를 overlap 할 수 있는 PCR 프라이머(표 9, 표 10)를 제작하였다. 먼저 GR1 플라스미드를 주형으로 하고 GR1 forward, reverse 프라이머로 PCR 하여 PCR product 1을 얻었다.

GFP 플라스미드를 주형으로 하고 GFP forward, reverse 프라이머로 PCR하여 PCR product 2를 얻었다. product 1,2를 모두 넣어 주형으로 쓰고 GR1 forward 프라이머와 GFP reverse 프라이머로 PCR 하였다.

GR1과 GFP는 G4S 링커로 연결되어 있다. GR1과 GFP가 융합되어 증폭된 조각들은 제한효소 Nde1과 EcoR1으로 잘라(950bp) 같은 제한효소로 자른 벡터(vector)에 넣었다. 이 플라스미드의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법으로 확인하였다.

완성된 GR1-GFP 플라스미드를 제한효소 Nde1과 Age1으로 잘라 벡터로 쓰고, GR4 플라스미드를 Nde1과 BspE1으로 잘라 얻은 작은 조각을 벡터에 넣으면 GR5-GFP 플라스미드가 만들어졌다.

같은 방법으로 GR1-GFP 플라스미드를 제한효소 Nde1과 Age1으로 잘라 벡터로 쓰고, GR9 플라스미드를 Nde1과 BspE1으로 잘라 벡터에 넣으면 GR10-GFP 플라스미드가 만들어졌다. 만들어진 플라스미드의 DNA 서열을 다이데옥시 DNA 서열 검사법으로 확인하였다.

이전에 보고된 방법을 이용하여, 단백질을 과발현시켰다(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402). 용해물을 Ni² ⁺-킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(Ni² ⁺-chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다.

형광단백질 GFP의 염기서열

5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA-3' (서열번호: 8)

GR1 Forward 프라이머 시퀀스

5'-GCC CAT ATG CAT CAC CAT CAC-3' (서열번호: 9)

GR1 Reverse 프라이머 시퀀스

5'-GCC CTT GCT CAC CAT TCC GGA GGA CCC GCC TCC ACC-3' (서열번호: 10)

GFP Forward 프라이머 시퀀스

5'-GCC TCC GGA ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3' (서열번호: 11)

GFP Reverse 프라이머 시퀀스

5'-GCC GAA TTC TTA CTT GTA CAG CTC GTC-3' (서열번호: 12)

< 실시예 14> 반복사슬 GR , AR , LR , LAR 에 의한 웨스턴블럿 분석법에서의 항체 신호 효과의 증폭 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 웨스턴블럿을 진행하였다.

도 29a에서는 GR에 의한 웨스턴 블럿의 detection limit이 늘어나는 것을 GR을 사용하지 않았을 경우의 웨스턴블럿과 비교 대조하여 확인하였다. GR5, 10, 15, 20를 사용하였고, 도면에 표시된 몰 비 대로하여 실험을 진행하였다. 반복사슬(Repeat chain)의 길이가 달라지면 최적의 비율이 달라짐을 확인하였다. 그리고 반복사슬의 길이가 길어질수록 증폭이 많이 되어 민감도가 늘어나는 것 또한 확인하였다. GR20의 경우 최대 8배 더 민감해졌다(도 29a). 도 29b은 도 29a의 내용을 도식화한 것으로 검출 가능한 최저 항원의 량을 비교한 것이다(도 29b).

도 30의 A에서는 같은 양의 항원이 존재할 때 GR로 웨스턴블럿의 화학루미센스( chemiluminescence) 신호가 증폭되는 것을 확인하였다. GR20의 경우 primary Ab와 복합체인 초복합체의 형성으로 최대 42배가량 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 30). 도 30의 B는 도 30의 A를 그래프화한 것이다(도 30).

도 31의 A에서는 GR의 초복합체 형성을 통한 웨스턴블럿의 신호 증폭을 다른 종류의 항원을 사용하여 보여준 것이다. 기존에 사용했던 bovine tissue lysate 대신 A431 whole cell lysate를 사용하여서 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 31).

도 31의 B는 다른 종류의 1차 항체를 사용해도 반복사슬에 의한 웨스턴블럿의 신호 증폭이 가능하다는 것을 보여주었다. 이때의 경우는 anti-β-actin mouse monoclonal antibody가 아닌 anti-E-cadherin mouse monoclonal antibody를 사용하였다(도 31).

도 32의 A는 모든 반복사슬이 웨스턴블럿을 증폭시키는 정도를 비교한 것이다. GR10, AR10, MAR5 (LAR5 사슬에서 L이 다른 형태인 반복사슬)를 같은 조건에서 증폭시키는 정도가 얼마나 다른지 비교 확인하였다. AR10과 MAR5 를 비교하면 한가지의 도메인(A)을 10번 반복한 AR10 보다 두 가지의 도메인(A와 M)을 5번 반복하였을 때 증폭효과가 좋아 졌음을 볼 수 있다(도 32).

도 32의 B는 LR10을 적용한 웨스턴블럿 결과이다. 다른 반복사슬과 다르게 LR의 경우는 증폭 효과가 크게 나타나지 않았다(도 32).

< 실시예 15> 신속 항원 진단 키트(Rapid Antigen Test)를 이용한 반복사슬과 골드항체의 복합체 또는 초복합체의 검출선 항체와의 교차결속

항체를 이용한 가장 대표적인 검출법인 인플루엔자 신속 항원 진단 키트를 이용하여 항원을 가하지 않은 상태에서 반복서열을 가하여 형성되는 골드항체와의 복합체 또는 초복합체가 검출선 항체와 교차결속을 하여 골드항체가 검출되는지를 관찰하였다. 이렇게 나타나는 검출선은 반복사슬/골드항체의 복합체 또는 초복합체 내의 반복사슬의 항체 결속 도메인 중 비어 있는 자리가 검출선 항체에 교차결속 하여 나타나는 것이다. SD 바이오라인 인플루엔자 항원 진단 키트 와 녹십자 인플루엔자 항원 진단 키트를 사용하였으며, 키트에는 항원 완충용액, 검체 체취용 면봉 및 스트립이 포함되어 있다. 상기 항원 완충용액 뚜껑을 열고, 항원 완충용액을 튜브(Tube)에 넣고, GR, AR, LR, MAR 반복사슬 시리즈를 항원 완충용액이 들어있는 튜브에 넣고 5회 이상 혼합하였다. 스트립을 튜브에 넣고 10분 ~ 15분 후에 결과를 판독하였다.

GR에 의한 골드라인의 여부를 보게 되면 GR5, GR10, GR15, GR20의 경우 각각 모든 스트립에 대하여 골드라인을 확인 할 수 있고(도 33), AR의 경우에는 AR10 에서 모든 스트립에 대하여 골드라인이 나타난 것을 볼 수 있다. AR5의 경우는 어떠한 농도에서도 골드라인이 형성되지 않았다(도 34). LR의 경우 SD 스트립에서 LR5와 LR10에 대하여 골드라인이 형성되었으나 녹십자 스트립에서는 모든 LR 단백질에 대하여 교차결속이 이루어 지지 않았다. 이는 녹십자사의 항체의 VL이 LR단백질이 결속하는 카파사슬이 아니기 때문이다(도 35). MAR(LAR5 사슬에서 L 이 다른 형태의 L인 반복사슬)은 SD스트립의 경우 MAR1, MAR5, MAR10 대하여 골드라인이 관찰되었으나 녹십자의 스트립의 경우에는 MAR5, MAR10에 대해서만 골드라인이 관찰 되었으며. 두 스트립간 골드라인 양상에 차이가 있고 SD스트립이 녹십자 스트립보다 훨씬더 강한 골드라인을 형성하였다(도 36). 이것은 MAR에 포함되어 있는 L 결속도메인의 검출선 항체와의 결속 여부로 설명할 수 있는데, 스트립상의 검출선 항체가 L 결속도메인이 결속할 수 있는 VL 카파 사슬의 향체인가의 여부에 따라 양상이 달라진 것이다. 검출선 항체가 VL 카파를 갖고 있지 않는 녹십자 스트립에서의 MAR10 골드라인은 MAR10에 포함되어 있는 protein A domain B 로부터 제초된 A 결속도메인의 결속으로만 형성되어 골드라인이 SD스트립 보다 약하게 나타난 것이다.

또한 각각의 도메인이 1개 들어 있는 GR1, AR1, LR1 에 대해서는 모든 스트립에 대하여 골드라인이 형성되지 않았다. 도메인 1개로는 골드항체와의 검출선 항체 사이의 교차결속이 불가능하기 때문이다.

< 실시예 16> GR N (1, 5, 10, 15, 20), AR N (1, 5, 10), LR N (1, 5, 10), MAR N (1, 5, 10)에 의한 간접효소면역측정법( enzyme - linked immunosorbent assay , ELISA )에서의 항체 신호효과 증폭

Bovine tissue lysate를 최종농도가 100 ng/ml이 되도록 Coating buffer에 희석하였다. 마이크로타이터(microtiter) 플레이트(plate)의 웰에 상기 희석된 용해물 50 ㎕를 파이펫팅(pipetiing)하여 희석된 용해물로 코팅하였다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 4℃에서 하룻밤 동안 보온하였다. 그런 다음, 코팅 용액을 제거하고, 200 ㎕ 인산완충식염수로 플레이트를 두 번 세척하였다. 상기 용액 또는 세척액(세제인 0.1% (v/v) 트윈 20(Tween 20)이 포함된 인산완충식염수)은 싱크대에 플레이트를 털어서 제거하였고, 남아있는 방울은 종이 수건에 가볍게 두드려서 제거하였다. 플레이트를 블로킹하기 위해, 차단 용액(Blocking solution)(3% 소 혈청 알부민(BSA), 인산완충식염수)을 200 ㎕ 첨가하여 코팅된 웰에 남아있는 단백질-결합 부위를 차단하였다. 뚜껑을 덮고 상온에서 2 시간 동안 보온한 후, 인산완충식염수로 플레이트를 두 번 세척하였다. 사용 전에 즉시 희석 완충액과 1차 항체(마우스 항-액틴 항체(mouse anti-actin antibody (Santacruz biotech)) 또는 1차 항체 및 반복서열 단백질들의 복합체 100 ㎕를 첨가하였다. 뚜껑을 덮고 상온에서 2 시간 동안 보온하였고, 인산 완충액으로 플레이트를 두 번 세척하였다. 또한 사용 전에 즉시 희석 완충액과 산양 항-마우스 항체-HRP( Goat anti-mouse beta actin-HRP antibody)를 1:2000으로 100㎕를 첨가하였다. 뚜껑을 덮고 상온에서 1 시간 동안 보온하였고, 인산 완충액으로 플레이트를 두 번 세척 후 HRP의 기질인 TMB를 100㎕ 첨가하였고 상온에서 20분 동안 보온하였으며 이 후 2M 황산을 100 ㎕ 주입 후 플레이트 리더기에서 450 nm로 리딩하였다.

GR의 경우 GR5, GR10, GR15, GR20에서 신호증폭을 확인할 수 있었으며, GR5는 1차 항체와 GR5의 1:2 몰 비에서 신호증폭에 있어 가장 효과적인 복합체가 형성되는 것을 볼 수 있었으며 증폭량은 보통 항체 신호보다 6배 높았다. GR10의 경우 GR5와 동일하게 1차 항체와 GR10의 1:2 몰비 에서 복합체가 형성되었으며 증폭량은 9.8배 높았으며, GR15와 GR20은 1:1/2 에서 복합체가 형성되었으며 증폭량은 각각 10.5, 12.9배 높았다(표 11). AR과 MAR의 경우 AR10과 MAR10 에서 각각 몰비 1:2에서 1.8배, 1:1에서 1.6배의 증가를 나타내었다. 반면에 LR는 어느 경우에서도 증폭효과가 나타나지 않았다. 그 이유는 본 연구에 사용한 1차 항체의 VL이 카파사슬이 아니기 대문에 증폭현상이 관찰되지 않은 것이다.

또한 각각의 도메인이 1개 들어 있는 GR1, AR1, LR1 에 대해서는 모든 몰비에 대하여 신호증폭이 관찰되지 않았다. 그 이유는 도메인 1개로는 복합체사이의 교차결속으로 초복합체의 형성이 불가능하기 때문이다.

GRN (1, 5, 10, 15, 20), ARN (1, 5, 10), LRN (1, 5, 10), MARN (1, 5, 10)에 의한 간접효소면역측정법에서의 항체 신호 측정

샘플	A450 Value	Fold increase
IgG only	0.188	1.0
IgG+GR1	0.207	1.1
IgG+GR5	1.128	6.0
IgG+GR10	1.842	9.8
IgG+GR15	1.974	10.5
IgG+GR20	2.425	12.9
IgG+AR1	0.195	1.0
IgG+AR5	0.183	1.0
IgG+AR10	0.338	1.8
IgG+LR1	0.190	1.0
IgG+LR5	0.189	1.0
IgG+LR10	0.188	1.0
IgG+MAR1	0.191	1.0
IgG+MAR5	0.190	1.0
IgG+MAR10	0.300	1.6

< 실시예 17> 단백질 G의 Domain III 반복사슬 재조합 단백질과 B3( Fab )- ext - PE38 들이 접착된 복합체로부터 [B3( Fab )- ext - PE38 ] ₂ 의 제조

정제된 TR1, 3, 5, 10, 15, 20 (= GR1, 3, 5, 10, 15, 20) 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]₂를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 분자를 비환원(도 37) SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드(metal chelating sepharose bead)에 10℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 40 μl의 금속 킬레이팅 세파로스 비드[100 mM TrisHCl(pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반응 혼합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실온에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 100 mM TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원하였다. B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기를 환원시키는데 필요한 2-멀캅토에탄올의 농도를 결정하기 위해 수행한 예비실험에서, B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기의 완전한 환원은 20 ~ 40 mM의 2-멀캅토에탄올의 첨가에 의해 이루어졌다. 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 보온하였다. 상기 산화 반응 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 생성율을 분석하였다. 또한, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서, TR과 산화 환원 과정을 거친 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 밴드(도 37, Lane4)의 강도를 TR 없이 산화 환원을 거친 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 밴드(도 37, Lane5)의 강도로 나눈 값을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 증가율을 산출하였다(표 12).

그 결과, [B3(Fab)-ext-PE38]₂는 B3(Fab)-ext-PE38 단독, TR1과의 복합체 2가지의 시료에서 증가되지 않았다. TR3, 5, 10, 15, 20 복합체 내에서의 단량체 간의 높아진 충돌 상호작용은 이황화결합으로 가교 결합된 이량체의 상당한 증가된 생산을 나타내었다. TR3, TR5, TR10, TR15, TR20 복합체의 시료에서 [B3(Fab)-ext-PE38]2의 수득 증가 배율은 각각 4.6배, 3.4배, 16.7배, 3.5배 및 2.7배를 나타내었다. [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 보온에 의해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이로써 TR 단백질에 접착되는 B3(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복사슬을 통해 쉽게 가까이 근접하여 함께 접착되어 있음을 알 수 있었다

[B3(Fab)-ext-PE38]₂의 수득 증가 배율

항체-독소	수득 증가 배율 (배)
B3(Fab)-ext-PE38	검출되지 않음
B3(Fab)-ext-PE38: TR1	검출되지 않음
B3(Fab)-ext-PE38: TR3	4.6
B3(Fab)-ext-PE38: TR5	3.6
B3(Fab)-ext-PE38: TR10	16.7
B3(Fab)-ext-PE38: TR15	3.5
B3(Fab)-ext-PE38: TR20	2.7

< 실시예 18> 단백질 G의 Domain III 반복사슬 재조합 단백질과 Herceptin ( Fab )- ext -PE38들이 접착된 복합체로부터 [ Herceptin ( Fab )- ext - PE38 ] ₂ 의 제조

정제된 GR5, GR10, GR15, GR20 (= TR5, TR10, TR15, TR20) 단백질 및 이에 접착된 Herceptin(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]₂를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드(metal chelating sepharose bead)에 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다(도 38, lane 1). 40 μl의 금속 킬레이팅 세파로스 비드[100 mM TrisHCl (pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반응 혼합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실온에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 100 mM TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원하였다(도 38, lane 2). 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 보온하였다(도 38, lane 3). 상기 산화 반응 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도 계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]2의 생성율을 분석하였다(표 13). 구체적으로, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서, TR과 산화 환원을 거친 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]2의 밴드(Lane4)의 강도를 TR 없이 산화 환원 과정을 거친 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]2의 밴드(Lane5)강도로 나눈 값을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 증가율을 산출하였다(표 13). Herceptin(Fab)-ext-PE38환원 단독(도 38, Lane2), Herceptin(Fab)-ext-PE38 산화 단독(도 38, Lane 3) 및 Herceptin(Fab)-ext-PE38 단독(-TR)을 음성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, [Herceptin(Fab)-ext-PE38]₂는 TR5과의 복합체, TR10 과의 복합체, TR15와의 복합체 및 TR20와의 복합체의 시료에서 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]단독 (-TR) 시료 보다 각각 2.3배, 2.3배, 1.7배 그리고 3.3배 검출되었다. TR5, TR10, TR15, TR20복합체 내에서의 단량체간의 높아진 충돌 상호작용은 이황화결합으로 가교 결합된 이량체의 상당한 증가된 생산을 나타내었다. [Herceptin(Fab)-ext-PE38]₂의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 보온에 의해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이로써 TR 단백질에 접착되는 Herceptin(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복사슬을 통해 쉽게 가까이 근접하여 함께 접착되어 있음을 알 수 있었다.

[Herceptin(Fab)-ext-PE38]₂의 증가율

항체-독소	중가율
Herceptin(Fab)-ext-PE38 + no TR	1.0
Herceptin (Fab)-ext-PE38 + TR5	2.3
Herceptin (Fab)-ext-PE38 + TR10	2.3
Herceptin (Fab)-ext-PE38 + TR15	1.7
Herceptin (Fab)-ext-PE38 + TR20	3.3

< 실시예 19> GR 반복사슬 단백질과 [ Herceptin ( Fab )- ext - PE38 ] 단량체의 복합체의 세포 독성 효과 확인

Herceptin(Fd)-ext-PE38, H6-Herceptin(L), e23(Fd)-ext-PE38및 H6-e23(L) 봉입체(inclusion body)의 과발현, 제조 및 재접힘(refolding)은 이전에 보고된 방법과 같이 수행하였다(J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402). GR protein과의 association 후 세포 독성 효과를 확인하기 위해 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]과 GR5 ~ 20의 association을 진행하였다.

구체적으로 [Herceptin(Fab)-ext-PE38]과 TR5 ~ 20, [e23(Fab)-ext-PE38]과 TR5 ~ 20을 1시간 동안 37℃ 배양 후 농도별로 유방암세포에 처리하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 그리고 CCK-8 solution을 배지의 1/10 만큼 처리하고 37℃에서 4시간 반응시켜 그 효과를 관찰하였다(도 39 및 도 40, 및 표 14 및 표 15).

SKBR3 세포주에서의 결과, TR5과의 복합체, TR10 과의 복합체, TR15와의 복합체 및 TR20와의 복합체의 시료에서 Herceptin(Fab)-ext-PE38 단독 시료보다 각각 2.8배, 2.2배, 1.7배, 2.3배 높은 세포독성 효과를 보여주었으며, e23(Fab)-ext-PE38 단독시료 보다 각각 4.5배, 1.4배, 2.4배, 1.7배 높은 세포독성 효과를 보여주었다. BT474 세포주에서의 결과, TR5과의 복합체, TR10 과의 복합체, TR15와의 복합체 및 TR20와의 복합체의 시료에서 Herceptin(Fab)-ext-PE38 단독 시료보다 각각 1.9배, 2.8배, 3.4배, 2.9배 높은 세포 독성 효과를 보여주었으며, e23(Fab)-ext-PE38 단독시료 보다 각 각 3.8배, 5배, 23배, 11.3배 높은 세포 독성 효과를 보여주었다.

SKBR3 cell line		BT 474 cell line
Herceptin(Fab)-PE38 + no GR	1.0	Herceptin(Fab)-PE38 + no GR	1.0
Herceptin(Fab)-PE38 + GR5	2.8	Herceptin(Fab)-PE38 + GR5	1.9
Herceptin(Fab)-PE38 + GR10	2.2	Herceptin(Fab)-PE38 + GR10	2.8
Herceptin(Fab)-PE38 + GR15	1.7	Herceptin(Fab)-PE38 + GR15	3.4
Herceptin(Fab)-PE38 + GR20	2.3	Herceptin(Fab)-PE38 + GR20	2.9

SKBR3 cell line		BT 474 cell line
e23(Fab)-PE38 + no GR	1.0	e23(Fab)-PE38 + no GR	1.0
e23(Fab)-PE38 + GR5	4.5	e23(Fab)-PE38 + GR5	3.8
e23(Fab)-PE38 + GR10	1.4	e23(Fab)-PE38 + GR10	5.0
e23(Fab)-PE38 + GR15	2.4	e23(Fab)-PE38 + GR15	23.0
e23(Fab)-PE38 + GR20	1.7	e23(Fab)-PE38 + GR20	11.3

<110> CHOE, MuHyeon <120> super-complex formed by the cross-binding between the complexes of a repeat-chain and multiple monomers, and use thereof <130> 14p-05-51 <150> KR 10-2013-0061869 <151> 2013-05-30 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3 Primer <400> 1 agacctttac ggtaactcaa accggtggag gcgggtccgg ata 43 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 Primer <400> 2 tatccggacc cgcctccacc ggtttcagtt accgtaaagg tct 43 <210> 3 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of Protein A Domain B <400> 3 catatgcatc atcatcatca ccacaccggt tctcaagccc caaaagccga caataaattt 60 aataaagagc agcagaacgc gttttatgaa atcttgcatc tgccgaatct gaatgaagaa 120 caacgtaacg gattcattca gagccttaaa gatgatccta gtcagtccgc taacttactc 180 gcagaagcta agaaactgaa tgatgcacag gcgccgaagg gagggggtgg atccggtggt 240 ggcggctccg gataagaatt c 261 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4S <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of Protein L Domain B1 <400> 5 catatgcatc accatcacca tcataccggt atcaagttcg ccggtaaaga agaaacgccg 60 gaaacccctg agacagacag tgaagaggaa gtgacaataa aagcaaatct gattttcgcc 120 aacgggtcaa cccagacggc cgaattcaaa gggacatttg aaaaagcaac ttctgaggct 180 tatgcatacg cggacactct gaagaaggat aatggtgaat ataccgtaga tgttgctgat 240 aaaggttata ccctgaatat taaatttgcg ggtggcggcg gcggaagcgg tggcggaggt 300 tccggataag aattc 315 <210> 6 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of Domain B1-Domain B of protein LA <400> 6 catatgcatc accatcacca tcataccggt atcaagttcg ccggtaaaga agaaacgccg 60 gaaacccctg agacagacag tgaagaggaa gtgacaataa aagcaaatct gattttcgcc 120 aacgggtcaa cccagacggc cgaattcaaa gggacatttg aaaaagcaac ttctgaggct 180 tatgcatacg cggacactct gaagaaggat aatggtgaat ataccgtaga tgttgctgat 240 aaaggttata ccctgaatat taaatttgcg ggtggcggcg gcggaagcgg tggcggaggt 300 tccggttctc aagccccaaa agccgacaat aaatttaata aagagcagca gaacgcgttt 360 tatgaaatct tgcatctgcc gaatctgaat gaagaacaac gtaacggatt cattcagagc 420 cttaaagatg atcctagtca gtccgctaac ttactcgcag aagctaagaa actgaatgat 480 gcacaggcgc cgaagggagg gggtggatcc ggtggtggcg gctccggata agaattc 537 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G4 <400> 7 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 8 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of Fluorescence GFP <400> 8 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 720 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of GR1 <400> 9 gcccatatgc atcaccatca c 21 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of GR1 <400> 10 gcccttgctc accattccgg aggacccgcc tccacc 36 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence of GFP <400> 11 gcctccggaa tggtgagcaa gggcgag 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence of GFP <400> 12 gccgaattct tacttgtaca gctcgtc 27

Claims

삭제
삭제
1) 한 개의 단량체에 존재하는 두 개 이상의 결속부위 각각에 특이적이고 상호독립적인 친화력에 의해 결속하는, 단일 종류의 결속도메인(binding domain)을 반복적으로 연결하거나 또는 두 종류 이상의 복수의 결속도메인을 반복적으로 연결한 반복사슬을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 하나의 단량체내에 상기 반복사슬에 특이적이고 상호독립적인 친화력에 의해 결속하는 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체들을 혼합시켜 다수의 단량체가 한 개의 상기 반복사슬에 결속한 단일복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)로부터 제조된 어느 하나의 단일복합체에 포함된 단량체를 다른 단일복합체에 포함된 반복사슬의 결속도메인의 비어있는 결속부위에 결속시켜 단일복합체간에 교차결속(cross-binding)을 형성시키는 단계를 포함하는 단일복합체들이 서로 연결된 초복합체(super-complex)를 제조하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단량체는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단량체는 항체, 리간드, 수용체 또는 그들의 조각, 또는 그들의 재조합체, 또는 그들과 생물학적 활성을 갖는 독소, 효소, 호르몬, 수송체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 지질, 폴리사카라이드, 알칼로이드, 샤페론, 코엔자임, 코팩터, 리포프로틴, 바이러스, 바이러스의 조각, 레진, 형광물질, 발색물질, 리포좀, 마이쎌 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나와의 융합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 항체는 항체의 조각, Fab 단편, Fab 단편을 포함하는 단편, Fv 단편, Fv 단편을 포함하는 단편, Fc 단편, 또는 Fc 단편을 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 결속도메인은 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 결속도메인은 미생물 단백질로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 결속도메인은 연쇄상 구균(streptococcal)의 단백질 G, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A 및 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)의 단백질 L로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 3항의 제조방법으로 제조된, 초복합체(super-complex).
제 12항의 초복합체내의 단량체의 표적에 제 12항의 초복합체를 혼합시켜 상기 단량체의 표적에 결속된 초복합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 단량체의 표적에 대한 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 13항에 있어서, 단량체의 표적에 대한 반응성 또는 결합력을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 단량체의 표적은 항원, 항체, 펩티드(peptide), 단백질, 박테리아, 바이러스 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 15항에 있어서, 상기 박테리아는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis; 결핵균) 및 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 15항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자, 구제역 바이러스, 인체유두종바이러스(human papilloma virus, HPV), 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 14항에 있어서, 단량체 효과의 측정은 2차 탐지체(항체)-표지체 접합체 및 표지체의 생물화학 표지기능을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 18항에 있어서, 상기 표지체는 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 형광물질(fluorescein), 퀀탐 닷(Quantum dot), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 루시퍼라아제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(beta-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinesterase), 방사성 물질 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
제 18항에 있어서, 상기 표지체의 발색기질은 3,3', 5,5'-테트라메틸 벤자이딘(3,3', 5,5'-tetramethyl bezidine, TMB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조타이아졸린-6-설폰산)(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS), o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine, OPD), 디아미노벤자이딘(diaminobenzidine, DAB), 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbasole), 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트/ 아이오도니트로테트라졸리움(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium, BCIP/INT), 뉴 푸친(New fuchin, NF) 및 패스트 레드 TR 염(fast red TR salts)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단량체의 반응성 또는 결합력 증폭 방법.
검출하고자 하는 표적에 특이적으로 결속하는 단량체, 및 상기 단량체에 내의 두 개 이상의 결속부위에 특이적이고 상호독립적인 친화력에 의해 결속하는 단일 종류의 결속도메인 또는 두 종류이상의 복수의 결속도메인을 반복적으로 연결한 반복사슬을 포함하는 분석 키트.
제 21항에 있어서, 상기 키트는,
1) 단량체에 결속 특이성이 있는 결속도메인의 반복사슬;
2) 표적과 특이적으로 결속하는 단량체;
3) 기질과의 반응에 의해 표지 기능을 나타내는 표지체가 접합된 2차 탐침;
4) 상기 표지체와 표지 반응할 표지기질 용액;
5) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및
6) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 키트는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 응집법(agglutination), 면역크로마토그래피(Immunochromatographic assay) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
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1) 한 개의 단량체에 존재하는 두 개 이상의 결속부위 각각에 특이적이고 상호독립적인 친화력에 의해 결속하는, 단일 종류의 결속도메인을 반복적으로 연결하거나 또는 두 종류 이상의 복수의 결속도메인을 반복적으로 연결한 반복사슬에 검출기능기(detection functional group)를 연결(linked), 접합(conjugated) 또는 융합(fusion)시키는 단계를 포함하는 반복사슬-검출기능기를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 하나의 단량체내에 상기 반복사슬에 특이적이고 상호독립적인 친화력에 의해 결속하는 결속부위를 두 개 이상 갖는 단량체들을 혼합시켜 다수의 단량체가 한 개의 상기 반복사슬-검출기능기에 결속한 단일복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)로부터 제조된 어느 하나의 단일복합체에 포함된 단량체를 다른 단일복합체에 포함된 반복사슬의 결속도메인의 비어있는 결속부위에 결속시켜 단일복합체간에 교차결속(cross-binding)을 형성시키는 단계를 포함하는 단일복합체들이 서로 연결된 초복합체(super-complex)를 제조하는 방법.
제 26항에 있어서, 상기 검출기능기는 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 텍사스레드(Texas Red)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 26항의 제조방법으로 제조된, 초복합체(super-complex).
표적 항원에 제 30항의 초복합체를 혼합시켜, 초복합체내의 단량체의 표적에 초복합체를 결속시키는 단계를 포함하는 표적 검출 방법.
제 31항에 있어서, 단량체의 표적에 대한 단량체의 검출 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 검출 방법.