CN117964754A - 抗人转铁蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

转铁蛋白是人血清中的主要蛋白。本发明公开了两个抗人转铁蛋白的纳米抗体，以及用它们制备的检测生物体液中转铁蛋白的免疫层析试纸条。抗人转铁蛋白的纳米抗体在生物医药中有广泛的应用，不仅可以用于转铁蛋白的分离纯化，还可以用于免疫检测、临床诊断和药物治疗。

Description

抗人转铁蛋白的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术和生物医药领域，特别是将纳米抗体应用于蛋白纯化，应用于检测、诊断和治疗。

背景技术

人转铁蛋白（transferrin，TRF）是血浆中存在的转运铁的蛋白，负责转运由消化道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。转铁蛋白可逆性地结合铁和其他金属离子如铜、锌、钴等。转铁蛋白主要由肝脏合成，受铁供应调节，半衰期为7天。在人血液中含量丰富，正常成人的参考值为2.2-4.0 g/L。人转铁蛋白是单链糖蛋白，含糖量约6%。由678个氨基酸构成，分子量为76 kDa。

抗体对抗原具有特异性结合的能力，能够识别不同的蛋白和非蛋白抗原，在生物医药领域有广泛的应用，市场上有针对人转铁蛋白的抗体。在蛋白的分离纯化方面，抗体可以与层析介质偶联，做成分离目标蛋白的亲和层析柱，例如用抗转铁蛋白的抗体可以做成亲和层析柱来制备高纯度的转铁蛋白产品。在检测方面，食品安全监管需要及时检测农药残留和非法添加物。各种基于免疫层析原理的快速检测试纸条，由于简单、方便、快速、价廉，在食品安全监管上发挥了巨大作用。在临床诊断方面，免疫检测是重要的检测技术，具体的实例是目前广泛应用的新冠抗原检测，利用针对新冠病毒的核蛋白（N protein）的两个抗体，采用双抗夹心法，制备成免疫层析快速检测试纸条，定性或定量地检测新冠病毒的存在或多少。在治疗药物方面，抗体已经成为重要的药物种类，不仅抗体本身可以作为药物，而且抗体药物还包括了由抗体衍生的免疫毒素（immunotoxin）、抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate, ADC）、双特异性或多特异性抗体（bispecific antibody,multi-specific antibody），等。

抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体由免疫动物产生，是多种不同抗体的混合物，能识别不同的抗原表位。多克隆抗体各批次间的抗体组成不同，效价有差异。单克隆抗体由单一基因产生，克服了多克隆抗体的批间次差异的问题。但单克隆抗体存在以下特点和不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高。

纳米抗体是常规抗体的简化形式，源于在羊驼等动物的抗体中发现的一种只有重链的抗体。通过仅保留与抗原结合的单个结构域，构建成为大小在纳米级别的纳米抗体，又称为单域抗体，由单一基因产生。纳米抗体保留了常规抗体对抗原的高亲和性和高特异性，还有以下优点：单个结构域的稳定性高；能够在原核或真核细胞中高效表达；在原核细胞表达时，生长周期短、制备成本低；对人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障。纳米抗体在生物医药中得到了越来越广泛的应用，如获批上市的双特异性纳米抗体Ozoralizumab，利用抗人血清白蛋白的纳米抗体对白蛋白的高亲和性，来延长在体内的存留时间，同时利用另一个融合在一起的抗肿瘤坏死因子TNFα的纳米抗体，靶向药物作用分子，用于治疗类风湿性关节炎。

蛋白分离纯化，包括抗体蛋白的分离纯化，有巨大的需求。虽然原理上抗体可以用于制备分离纯化抗原蛋白的亲和层析柱，但由于常规抗体的稳定性差、生产成本高，用抗体制备的亲和层析柱至今并没有得到广泛的应用。以抗体蛋白的纯化为例，普遍用的还是蛋白A制备的亲和层析柱。

发明内容

本发明的目的在于提供抗人转铁蛋白的纳米抗体，该纳米抗体对与人转铁蛋白的结合具有高亲和力和特异性，可以用于制备分离纯化人转铁蛋白的亲和层析产品，可以用于制备人转铁蛋白相关的检测和诊断试剂产品和治疗药物，具有良好的应用前景。

本发明的第一方面提供了两个抗人转铁蛋白的纳米抗体，TT7和TT30。纳米抗体的互补决定区（Complementary Determining Region, CDR）是特异性识别抗原的关键结构。纳米抗体TT7的互补决定区分别由SEQ ID NO: 1对应其CDR1、SEQ ID NO: 2对应其CDR2、SEQ ID NO: 3对应其CDR3。同样的，纳米抗体TT30的互补决定区分别由SEQ ID NO: 4对应其CDR1、SEQ ID NO: 5对应其CDR2、SEQ ID NO: 6对应其CDR3。

本发明的第二方面提供了如本发明的第一方面所述的两个抗人转铁蛋白的纳米抗体TT7和TT30的完整氨基酸序列。纳米抗体的氨基酸序列由大约110-130个氨基酸残基组成，有四个骨架区（FM1-4）和三个互补决定区（CDR1-3），按顺序交错排列构成。除了互补决定区对抗原的识别起决定性作用外，骨架区对互补决定区的空间结构有影响、进而影响对抗原的识别。因此，纳米抗体TT7和TT30的完整氨基酸序列也是决定抗原识别的重要结构基础。TT7的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，TT30的完整氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

本发明公布的两个抗人转铁蛋白的纳米抗体分别含有120和115个氨基酸残基，形成该纳米抗体的核心结构。在实际应用中，纳米抗体常以融合蛋白的形式存在，即在纳米抗体的核心结构的N末端或C末端加上氨基酸残基、多肽和蛋白，形成融合蛋白，在保留原本纳米抗体的亲和性和特异性的同时，赋予融合蛋白更多的特性和功能。例如：在其N端加上甲硫氨酸来引入基因表达的起始编码（ATG），或加上信号肽来将表达的蛋白导入周质空间（periplasmic space）；在其C末端与作为蛋白标签（如组氨酸标签、人流感血凝素标签）的多肽融合，使其能够用镍柱进行纯化、用抗人流感血凝素抗体进行鉴定；与荧光蛋白融合使得能够显色和显荧光用于示踪；与细胞毒蛋白融合成为免疫毒素（immunotoxins）用于治疗。

本发明的第三方面提供了由纳米抗体与多肽和蛋白融合所构建的纳米抗体融合蛋白。所述的纳米抗体为本发明的第一方面和第二发明所述的纳米抗体TT7和TT30。对纳米抗体在蛋白基因水平加以修饰、构建融合蛋白，是纳米抗体相对于常规抗体的明显优势，有成熟的分子生物学方法，也是常见的纳米抗体具体体现的形式。可以与纳米抗体融合的多肽和蛋白多种多样。

在一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括各种蛋白标签，如：组氨酸His标签（HHHHHH）、人流感病毒血凝素HA标签（YPYDVPDYA）、FLAG标签（DYKDDDDK）、和Myc标签（EQKLISEEDL）。

在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括各种荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、和红色荧光蛋白（RFP）。

在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括有酶催化活性的蛋白，如碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）、和发光酶（Luciferase）。

在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括有其他生物活性的蛋白，如麦芽糖结合蛋白（MBP）、谷胱甘肽转移酶（GST）、毒素蛋白、和抗体Fc片段。

本发明的第四方面提供了如本发明的第三方面所述的纳米抗体融合蛋白的具体实例。

优选地，编码纳米抗体TT7与组氨酸标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQID NO: 9所示，编码纳米抗体TT30与组氨酸标签构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ IDNO: 10所示。

优选地，编码纳米抗体TT7与麦芽糖结合蛋白构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 11所示，编码纳米抗体TT30与麦芽糖结合蛋白构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 12所示。

优选地，编码纳米抗体TT7与谷胱甘肽转移酶构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 13所示，编码纳米抗体TT30与谷胱甘肽转移酶构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 14所示。

本发明的第五方面提供了用修饰物加以修饰得到的纳米抗体衍生物，其包括本发明的第一方面和第二方面所述的纳米抗体、或本发明的第三方面和第四方面所述的纳米抗体融合蛋白。通过对本发明纳米抗体或纳米抗体融合蛋白加以修饰，可以赋予修饰后的纳米抗体衍生物更多的特性和功能。

在一些优选的实例中，修饰物以非共价键的方式修饰，如物理吸附。所述的修饰物包括胶体金、胶体银、和胶体碳。例如，用胶体金为修饰物，标记纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，产生的纳米抗体衍生物显红色，便于肉眼观察。在胶体金免疫层析试纸条上，以红色条带显示。

在另一些优选的实例中，修饰物以共价键的方式修饰。所述的修饰物包括各种表面有可修饰基团（氨基、羧基、巯基、羟基等）的微球，包括：彩色微球、荧光微球、聚合物微球、和磁微球。例如，用红色、蓝色或黑色微球为修饰物，标记纳米抗体或纳米抗体融合蛋白，产生的纳米抗体衍生物显红色、蓝色或黑色，肉眼可以观察；在免疫层析试纸条上，以红色、蓝色或黑色条带显示。再例如，用磁微球为修饰物，构建亲和磁珠，利用纳米抗体对人转铁蛋白的特异性结合能力，利用磁分离技术，使用磁场从悬浮液中直接将溶液中的人转铁蛋白用吸附于磁珠的方式分离出来。

在另一些优选的实例中，修饰物以共价键的方式修饰。所述的修饰物为各种表面有可修饰基团（氨基、羧基、巯基、羟基等）的层析填料（葡聚糖、琼脂糖）和过滤膜（纤维素膜、聚合物膜）。

在另一些优选的实例中，修饰物以共价键的方式修饰。所述的修饰物为化学小分子，包括：药用化合物、生物素及其衍生物、染料分子、荧光化合物、和吖啶酯。

在另一些优选的实例中，修饰物以共价键的方式修饰。修饰的位点为纳米抗体表面自然分布的氨基酸残基，常用的修饰位点是赖氨酸残基上的氨基、和谷氨酸和天冬氨酸的羧基。例如：与异硫氰酸荧光素（FITC）反应，或活化的生物素反应，发生在纳米抗体的氨基上，得到荧光素标记的纳米抗体、或生物素化的纳米抗体。

在另一些优选的实例中，修饰物以共价键的方式修饰。修饰的位点为特别引进的氨基酸残基，做到定位、定向和定量修饰。可以在纳米抗体的N端、C端或其他特定部位引入特殊的可修饰化学基团，然后对其进行化学修饰。例如：引入一个或多个半胱氨酸残基得到蛋白表面独有的巯基，使修饰更方便、定位和定量更准确。

本发明的第六方面提供了一种免疫层析试纸条，其包括本发明的第一方面和第二方面所述的纳米抗体、本发明的第三方面和第四方面所述的纳米抗体融合蛋白、或本发明的第五方面所述的纳米抗体衍生物。所述免疫层析试纸条的关键构造包括样本垫、层析垫、和吸收垫，样本垫、层析垫、和吸收垫依次相互重叠粘贴在底板上。

在一些优选的实例中，免疫层析试纸条上还包括结合垫，位于样本垫和层析垫之间，吸附有胶体金标记的抗体或抗原。为金垫形式的免疫层析试纸条。

在另一些优选的实例中，免疫层析试纸条上没有结合垫；取而代之，胶体金标记的抗体或抗原放置在微孔杯中。为金杯形式的免疫层析试纸条检测方式。

在另一些优选的实例中，免疫层析试纸条以裸条的形式使用。试纸条有采样端（位于样本垫处），和手持端（位于吸收垫处）。采样端竖直插入样本中采样，一定时间后，取出放平。

在另一些优选的实例中，免疫层析试纸条放入卡壳里，以检测卡的形式使用。检测卡有加样孔（位于样本垫处）和观察窗（位于层析垫处）。样本直接滴入加样孔。

本发明的第七方面提供了免疫层析试纸条在定性和定量检测生物体液中的转铁蛋白的应用。所述的生物体液包括：血液、组织液、唾液、泪液、尿液、和粪便。检测时，生物体液样本加到样本垫上，与标记的抗体或抗原一道在层析垫上层析展开，流向吸收垫；通过观察层析垫上条带的深浅，对样本中的转铁蛋白进行定性或定量。

在一些优选的实例中，免疫层析试纸条上为胶体金标记的抗体或抗原，检测结果为肉眼可见的红色条带。

在另一些优选的实例中，免疫层析试纸条上为彩色微球（如红色、蓝色、或黑色）标记的抗体或抗原，检测结果为肉眼可见的彩色条带（如红色、蓝色、或黑色）。

在另一些优选的实例中，免疫层析试纸条上为荧光微球标记的抗体或抗原，检测结果为荧光条带。

在另一些优选的实例中，在层析垫上划上控制线（C线）和检测线（T线），在检测线上固定有转铁蛋白抗原。层析过程中，待测生物体液样本中的转铁蛋白与金标抗体结合，竞争性地抑制了金标抗体与固定在检测线上的转铁蛋白抗原的结合（竞争法），金标抗体在检测线处显色，因而检测线颜色的深浅反映了待测样本中转铁蛋白的量，可以定性地或定量地判定待测生物体液样本中的转铁蛋白的存在与否或多少。

在另一些优选的实例中，在层析垫上划上控制线和检测线，在检测线处固定有抗体。层析过程中，待测生物体液样本中的转铁蛋白与金标抗体结合，金标抗体、转铁蛋白与固定在检测线处的抗体形成三元复合物（双抗夹心法），金标抗体在检测线处显色，因而检测线颜色的深浅反映了待测样本中转铁蛋白的量，可以定性地或定量地判定待测生物体液样本中的转铁蛋白的存在与否或多少。

本发明的第八方面提供了本发明的第一方面和第二方面所述的纳米抗体、本发明的第三方面和第四方面所述的纳米抗体融合蛋白、或本发明的第五方面所述的纳米抗体衍生物，在制备可以用于检测转铁蛋白的试剂产品的用途。所述的检测试剂产品利用本发明纳米抗体的特异性结合人转铁蛋白的免疫反应。

在一些优选的实例中，所述的检测试剂产品为免疫层析试剂盒。免疫层析试剂盒由本发明第六方面的免疫层析试纸条、和检测相关的试剂和耗材等组成。

在另一些优选的实例中，所述的检测试剂产品为酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒。

在另一些优选的实例中，所述的检测试剂产品为免疫比浊法试剂盒。

在另一些优选的实例中，所述的检测试剂产品为化学、电化学或生物发光的免疫检测试剂盒。

本发明的第九方面提供了本发明的第一方面和第二方面所述的纳米抗体、本发明的第三方面和第四方面所述的纳米抗体融合蛋白、或本发明的第五方面所述的纳米抗体衍生物，在制备可以用于纯化转铁蛋白的亲和介质产品的用途。所述的亲和介质产品同样也利用本发明纳米抗体的特异性结合人转铁蛋白的免疫反应。

在一些优选的实例中，所述的亲和介质产品为纳米抗体修饰的常用蛋白分离树脂，包括各种交联形式的琼脂糖（agarose）和葡聚糖（dextran），如4FF、CL-6B、G-50等。

在另一些优选的实例中，所述的亲和介质产品为纳米抗体修饰的天然和合成的高分子聚合材料，如酶标板、聚合物微球、和过滤膜状材料。所述高分子聚合材料含有可修饰基团（氨基、羧基、巯基、羟基等），便于与纳米抗体偶联。

在另一些优选的实例中，所述的亲和介质产品为纳米抗体修饰的磁性材料，包括各种包裹有可修饰基团（氨基、羧基、巯基、羟基等）的磁珠。

本发明的第十方面提供了本发明的第一方面和第二方面所述的纳米抗体、本发明的第三方面和第四方面所述的纳米抗体融合蛋白、或本发明的第五方面所述的纳米抗体衍生物，在制备在生物体内识别转铁蛋白的靶向物的用途。利用本发明纳米抗体对转铁蛋白的亲和性和特异性，通过将本发明纳米抗体与化学小分子或蛋白大分子连接，将有生物活性的化学小分子或蛋白大分子在生物体内靶向到转铁蛋白。转铁蛋白在血液里大量存在，靶向到转铁蛋白可以改变所载有的化学小分子或蛋白大分子在生物体内的时间和空间的分布，在特定的时间和空间展示其生物活性。

在一些优选的实例中，所述的靶向物为本发明纳米抗体与毒素蛋白的融合蛋白，称之为免疫毒素（immunotoxins）。所述毒素蛋白有很多，例如：细菌毒素（如白喉毒素）和植物毒素（如蓖麻毒素）。

在另一些优选的实例中，所述的靶向物为本发明纳米抗体与药用化合物的偶联蛋白，称之为药物-抗体偶联物（Drug-Antibody Conjugate, ADC）。所述药用化合物有很多，例如：具有抗肿瘤活性的喜树碱类的化合物（如伊立替康）。

在另一些优选的实例中，所述的靶向物为本发明纳米抗体与另一个或多个纳米抗体（或抗体的其他变异形式）的融合蛋白，称之为双特异性抗体或多特异性抗体（bi-specific antibody, multi-specific antibody）。例如：类似于双特异性抗体Ozoralizumab，利用对转铁蛋白的高亲和性，本发明纳米抗体可以与另一个纳米抗体融合，构建双特异性抗体，延长另一个纳米抗体在生物体内的存留时间。

附图说明

图1，纳米抗体TT7和TT30对人转铁蛋白抗原的亲和性分析结果。

图2，在不同浓度的纳米抗体TT30（0、2、20、200 mg/L）时，生物素标记的纳米抗体TT7对人转铁蛋白抗原的亲和性分析结果。

图3，免疫层析试纸条上，C为质控线，T为检测线。胶体金标记纳米抗体TT7，T线处划有转铁蛋白抗原。在不同浓度的转铁蛋白抗原（0、1、2、4、8 mg/L）时，观察得到的T线颜色深浅的变化。

图4，免疫层析试纸条上划有纳米抗体TT7或TT30，胶体金标记转铁蛋白抗原。在不同浓度的转铁蛋白抗原（0、10 mg/L）时，观察得到的T线颜色深浅的变化。

具体实施方式

在本发明的研究中，纳米抗体文库的库容量和多样性是淘选出高特异性、高亲和力纳米抗体的关键。本发明使用的文库由免疫羊驼（Alpaca，Vicugna pacos）得到，抗原采用的是人转铁蛋白。本发明采用固相淘选的方式，淘选过程中，聚苯乙烯塑料平板上包被人转铁蛋白抗原，用噬菌体展示的纳米抗体文库进行生物淘选。抗原的纯度、抗原的包被浓度、封闭液的种类和浓度、缓冲液的浓度、噬菌体投入量、结合时间以及洗脱时间等因素都会影响噬菌体颗粒的富集情况。本发明筛选过程采用不封闭和5%牛奶交替封闭手段、逐渐加大洗涤强度等方式来提高生物淘选的特异性，通过优化淘选条件以获得具有高特异性、高亲和力的纳米抗体。

实施例一、噬菌体展示文库的淘选：按照结合、洗涤、洗脱及扩增的方式，对噬菌体展示文库进行亲和淘选，采用人转铁蛋白抗原包被，通过不封闭与5%牛奶交替封闭的方法来降低非特异性吸附。淘选的具体步骤如下。在八连孔酶标条的孔中分别加入100 μL浓度为10 μg/mL（1 μg/孔）的人转铁蛋白抗原，37 °C包被2小时。弃去上清，用0.05% PBST洗涤酶标条5次。封闭时，每孔加入200 μL 5%牛奶，37 °C封闭2小时。弃去封闭液，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL噬菌体文库悬液（库容为8×10⁹pfu，滴度为1×10⁹cfu/mL），室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL 0.2 MGly-HCl洗脱缓冲液（pH 2.2）进行洗脱，室温静置洗脱10分钟后将洗脱液收集至1.5 mL离心管中。加入120 μL 1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）进行中和，涡旋混匀，取20 μL保存作为测定滴度样本，剩下的样本全部进行扩增后用于下一轮淘选。

实施例二、阳性克隆的鉴定：从测定滴度的平板上随机挑取单菌落进行噬菌体的拯救纯化，之后采用ELISA方法进行阳性克隆的鉴定。具体步骤如下。在八连孔酶标条的孔中分别加入100 μL浓度为10 μg/mL（1 μg/孔）人转铁蛋白抗原，37°C包被2小时。弃去上清，PBST洗涤酶标条5次。每孔加入200 μL 5%牛奶，并另外多做一条作为阴性对照，37°C封闭2小时。PBST洗涤酶标条5次。每孔加入100 μL扩增后的单克隆噬菌体悬液，室温摇床震荡孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100 μL 兔抗人流感血凝素（HA）一抗，室温摇床震荡孵育1小时。PBST洗板5次。每孔加入100 μL 羊抗兔二抗，室温摇床震荡孵育45分钟。PBST洗板5次，在纸上将酶标条内的液体尽可能拍干。每孔加入100 μL TMB显色液，显色至合适深度的颜色。每孔加入100 μL 1 M的HCl溶液终止反应，然后立即用酶标仪读取OD₄₅₀数值。将阳性样本送测序，确定纳米抗体的氨基酸序列。TT7和TT30是在淘选和优化过程中得到的两个阳性克隆。

实施例三、构建纳米抗体TT7和TT30与组氨酸标签的融合蛋白：市售有多个质粒（特别是pET系列质粒，如pET-14b，pET-15b，pET-16b，pET-19b，pET-20b，pET-21a-d，pET-22b，pET-23a-d，等）可以用于引入组氨酸标签。将纳米抗体TT7和TT30的DNA序列用限制性内切酶NdeI和XhoI切为基因片段，插入到pET23a质粒中，在纳米抗体的C末端引入了组氨酸标签，便于重组蛋白用镍柱分离纯化和ELISA鉴定。所得的融合蛋白的DNA序列如SEQ IDNO: 9或10所示。

实施例四、构建纳米抗体TT7和TT30与麦芽糖结合蛋白的融合蛋白：市售有多个质粒可以用于构建与麦芽糖结合蛋白融合的融合蛋白，如：pMAL-p5E，pMAL-p5G，pMAL-c4X，pMAL-c5E，pMAL-c5X等，可以根据实际情况选用。我们选用pMAL-c5E，将纳米抗体TT7或TT30的DNA序列首末端引入NdeI和EcoRI位点序列，插入pMAL-p5E的NdeI和EcoRI位点，所得的融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 11或12所示。

实施例五、构建纳米抗体TT7和TT30与谷胱甘肽转移酶的融合蛋白：市售有多个质粒可以用于构建与谷胱甘肽转移酶融合的融合蛋白，如：pGEX-2TK，pGEX-4T1，pGEX-4T2，pGEX-4T3，pGEX-5X1，pGEX-5X2，pGEX-5X3，pGEX-6P1，pGEX-6P2，pGEX-6P3，等，可以根据实际情况选用。我们选用pGEX4T1，将纳米抗体2p或4p的DNA序列首末端引入BamHI和XhoI位点序列，插入pGEX4T1的BamHI和XhoI位点，所得的融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 13或14所示。

实施例六、纳米抗体TT7和TT30在大肠杆菌中的表达和纯化：取1 μL构建好含有纳米抗体目的基因的pET23a质粒加入到50 μL大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，冰上放置30分钟后，放入42°C水浴锅中热激60秒。冰上放置5分钟后，向菌液中加入450 μL SOC培养液。混匀后，置于37°C摇床200 rpm震荡培养复苏1小时。然后，吸取200 μL菌液涂布到LB/Amp固体平板上，将液体吹干后，将平板倒置放入37°C培养箱中培养过夜。第二天从过夜培养的平板上挑取单克隆，置于5 mL LB/Amp培养液中，37°C摇床200 rpm震荡培养8 小时后，将菌液全部转移至330 mL TB+磷酸盐+Amp培养液中，30°C摇床200 rpm培养过夜。第三天将菌液离心收集后，用1×磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 7.4）进行重悬，然后将其进行超声破碎。条件为150 w的75%即112.5 W，破碎5秒，间歇20秒。然后4°C，20,000 rpm离心20分钟后，分别收集超声上清与超声沉淀，超声上清置于-20 °C保存。通过对超声沉淀进行变性复性来获取浓度及纯度更高的蛋白。用10 mL 2 M尿素溶液重悬超声沉淀样本，加入2 M尿素溶液至40 mL洗涤包涵体。4°C，8,000 rpm，离心10分钟。用10 mL 8 M尿素溶液重悬洗涤后的沉淀，加8 M尿素溶液至35 mL溶解包涵体，将其置于室温摇床80 rpm振荡小时。然后将它们通过4°C，10,000 rpm离心20分钟。收集上清液（含变性目的蛋白）并保留沉淀。蛋白变性后通过透析进行复性，采用阶梯降低尿素浓度进行透析，取15 mL 8 M 尿素变性上清液（目的蛋白样本）快速加入15 mL 1×PBS，使得8 M尿素溶液浓度降为4 M。用600 mL 2 M尿素溶液进行透析（4°C冰箱中搅拌透析液）1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 mL 1 M尿素溶液，然后透析过夜。第二天倒掉200 mL透析液，加入200 mL PBS，继续透析1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 mL PBS，继续透析1小时。倒掉200 mL透析液，加入200 mL PBS，继续透析1小时。透析结束后收样，复性后蛋白溶液通过4°C，10000 rpm离心25分钟。收集上清，收集到的上清液即为复性后蛋白溶液。经变性复性后的纳米抗体，经过蛋白电泳后表明C末端带有标签的纳米抗体TT7和TT30相对分子质量在15-20 kDa之间，与理论分子质量相符，且纯化后的条带无明显杂带，表明两种纳米抗体纯度较高。

实施例七、纳米抗体TT7和TT30对转铁蛋白抗原的亲和力检测：起始浓度为20 μg/mL的人转铁蛋白抗原，三倍梯度稀释为八个浓度。在八孔酶标条中，每孔分别加入100 μL不同浓度的人转铁蛋白，37°C培养箱中包被2小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入200 μL 5% milk，将其置于37°C培养箱中封闭30分钟。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL纳米抗体TT7或TT30（20 μg/mL）；室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，每孔分别加入100 μL 针对标签的特异抗体，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL稀释度为1:5000的羊抗鼠二抗，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，在吸水纸上尽量地拍干酶标条。然后每孔分别加入100 μL TMB显色液，显色时间根据显色的情况把握，一般为5-10 分钟。达到合适的显色深度后则每孔加入100 μL 1 M HCl终止反应，终止反应后立刻通过酶标仪读取OD₄₅₀的数值，最后通过Microsoft excel进行数据分析与作图。ELISA的结果如图1所示，纳米抗体TT7和TT30的EC50值分别为338 μg/L与269 μg/L，亲和力表现较好。

实施例八、纳米抗体TT7的生物素化修饰：准确称量NHS-Biotin试剂，使用DMSO将其溶解为10 mM溶液，取出已纯化好的TT7或TT30蛋白样本，使用PBS（20 mM，pH 7.4）将其稀释成浓度为1 mg/mL，以8:1的摩尔比加入上述NHS-Biotin试剂，然后将其置于室温50 rpm摇床上振荡孵育1小时。上述样本生物素化后需要经过脱盐纯化处理，使用葡聚糖凝胶（Sephadex G-25 Resin）柱进行纯化，纯化时使用PBS对纯化柱进行平衡，平衡后加入生物素化蛋白样本，使用考马斯亮蓝R-250对流出液体进行检测，当流出液体遇考马斯亮蓝变蓝时，即刻收集流出液，收集完后使用PBS对纯化柱进行冲洗，最后加入20%乙醇保存纯化柱。上述纯化收集后即为制备好的生物素化的纳米抗体（TT7-Biotin）。

实施例九、纳米抗体TT7与TT30的相互竞争检测：起始浓度为20 μg/mL的人转铁蛋白抗原，三倍梯度稀释为八个浓度。在八孔酶标条中，每孔分别加入100 μL不同浓度的人转铁蛋白，37°C培养箱中包被2小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入200μL 5% milk，将其置于37°C培养箱中封闭30分钟。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次。每孔分别加入100 μL纳米抗体TT30（0, 2, 20, 200 mg/L）与TT7-Biotin（1 mg/L）的1:1混合物；室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，每孔分别加入100 μL稀释度为1:20,000的SA-HRP，室温摇床震荡孵育1小时。弃去上清，0.05% PBST洗涤酶标条5次，在吸水纸上尽量地拍干酶标条。然后每孔分别加入100 μL TMB显色液，显色时间根据显色的情况把握，一般为5-10 分钟。达到合适的显色深度后则每孔加入100 μL 1 M HCl终止反应，终止反应后立刻通过酶标仪读取OD₄₅₀的数值，最后通过Microsoft excel进行数据分析与作图。ELISA的结果如图2所示，生物素标记的纳米抗体TT7-Biotin的EC50值为57 μg/L，亲和力表现较好。在加入抗体TT30后，对TT7-Biotin的亲和性显示显著影响，表明TT7与TT30结合在转铁蛋白抗原的相互重叠的表位。

实施例十、胶体金标记纳米抗体TT7，和胶体金标记的抗体在免疫层析试纸条上显示条带：取1 mL胶体金加入到1.5 mL离心管中，分别加入4、8、12 μL 2% K₂CO₃混匀，再加入10 μg 1 mg/mL的纳米抗体TT7充分混匀，室温静置标记5分钟，加入10 μL 10% BSA溶液充分混匀，室温静置封闭5分钟，观察它们的颜色与状态。颜色为酒红色，肉眼观察颜色不好区分优劣，故将它们置于13000 rpm离心10分钟，弃去上清后加入50 μL复溶液重悬金标抗体沉淀并混匀，即为标记好的金标抗体。取2 μL加入到96孔板微孔中，加入100 μL PBS充分混匀样本，放入之前准备好的转铁蛋白抗原划膜的试纸条，静置5 分钟后取出平放于桌面观察并记录结果。测试结果显示，金标TT7在试纸条上显示明显的红色条带，表现最好的为金标TT7加入的2% K₂CO₃的量为4 μL。

实施例十一、彩色微球标记纳米抗体TT7，和微球标记的抗体在免疫层析试纸条上显示条带：取12 μL 的彩色乳胶微球（黑色，200 nm，4% 固含量）加入到1 mL MES缓冲液（50mM，pH 6.0）中，用超声波清洗仪超声分散，离心（离心力＞15000）10分钟，小心弃去上清，加入1 mL MES缓冲液重悬微球样本沉淀并充分混匀洗涤微球，离心（离心力＞15000）10分钟，小心弃去上清。加入1 mL 的MES重悬微球样本沉淀并充分混匀，加入4 μL 的10 mg/mL的sulfo-NHS溶液（MES缓冲液溶解）混匀，再加入2 μL 10 mg/mL的EDC溶液（MES缓冲液溶解）混匀，置于室温60 rpm摇床振荡孵育20分钟。离心（离心力＞15000）5分钟，小心弃去上清，加入1 mL MES缓冲液洗涤1次。加入1 mL MES缓冲液重悬微球样本沉淀并超声混匀，加入16μg 抗体TT7混匀，置于室温60 rpm摇床振荡孵育4 小时，离心（离心力＞15000）10分钟，小心弃去上清。加入1 mL 1% BSA溶液（50 mM HEPES缓冲液，pH 8.0溶解）重悬微球样本沉淀并混匀洗涤一次，离心后弃去上清，加入1 mL 1% BSA溶液重悬微球样本沉淀并超声混匀，置于室温60 rpm摇床振荡封闭1小时，离心（离心力＞15000）10分钟，小心弃去上清。加入1mL 1% BSA溶液重悬微球样本沉淀并混匀洗涤一次，离心后弃去上清，加入1 mL 1% BSA溶液重悬微球样本沉淀并超声混匀，即为微球标记好的抗体TT7。取2 μL 微球标记的抗体TT7加入到酶标板微孔中，加入100 μL PBS充分混匀，放入转铁蛋白划膜的试纸条，静置5分钟后取出平放于桌面，观察并记录结果。结果显示，黑色微球标记的TT7样本在对应抗原的试纸条上可以显示出明显黑色条带。

实施例十二、金标抗体的转铁蛋白免疫层析试纸条的制备与测试：取40 μL胶体金标记的纳米抗体TT7加入到400 μL稀释液中混匀，放入结合垫整条浸润，将其置于干燥间中干燥。从50°C恒温箱中取出T线划有转铁蛋白的层析垫（NC膜），将层析垫贴在PVC底板上，再将吸收垫、上述有金标抗体的结合垫、和样本垫，依次贴在PVC底板上，裁切成80 mm长和4mm宽的试纸条备用。在酶标板微孔中加入200 μL 浓度分别为0、1、2、4、8 mg/L的转铁蛋白抗原样本，上述试纸条放入微孔10秒后取出，平放于桌面上静置10分钟，观察并记录结果。测试结果显示，随着加入的转铁蛋白浓度的增加，试纸条上的T线降低减弱；当加入的转铁蛋白浓度为1 mg/L时，C线与T线相等；当加入的转铁蛋白浓度为2、4、8 mg/L时，C线强于T线，显示为阳性（见图3）。故该参数制备的试纸条检出限在1-2 mg/mL。

实施例十三、金标抗原的转铁蛋白免疫层析试纸条的制备与测试：从50°C恒温箱中，取出干燥过夜的划有纳米抗体TT7和TT30的层析垫（NC膜），将层析垫贴在PVC底板上，再将吸收垫和样本垫贴在PVC板上，将其裁切成80 mm长和4 mm宽的试纸条备用。使用胶体金标记转铁蛋白抗原时，取10 mL胶体金加入到15 mL离心管中，加入50 μL 2% K₂CO₃混匀，加入100 μg转铁蛋白充分混匀，室温静置标记10分钟；然后加入100 μL 2% BSA充分混匀，室温静置封闭10分钟；使用15000 rpm离心20分钟后弃去上清，加入100 μL复溶液重悬并充分混匀金标抗原沉淀，即为标记好的金标抗原。取0.5 μL金标抗原加入到酶标板板微孔中，加入100 μL PBS充分混匀。分别放入纳米抗体TT7和TT30划线的试纸条，静置5分钟后取出平放于桌面，观察并记录结果。测试结果显示，TT7与TT30划线的试纸条上的条带显色均明显。取0.5 μL金标抗原加入到酶标板微孔中，加入100 μL浓度分别为0、5、10、100 mg/L的转铁蛋白抗原。放入纳米抗体TT7划线的试纸条，静置5分钟后取出平放于桌面，观察并记录结果。测试结果显示，结果显示使用10 mg/L的转铁蛋白，试纸条的条带即明显变浅，出现明显的竞争。分别取0.5 μL金标抗原加入到酶标板微孔中，加入100 μL浓度分别为0、10 mg/L的转铁蛋白，放入纳米抗体TT7和TT30划线的试纸条，静置5分钟后取出平放于桌面，观察并记录结果。测试结果显示，使用10 mg/L的转铁蛋白，纳米抗体TT7和TT30划线的试纸条上的条带都明显变浅，出现明显的竞争（见图4）。

实施例十四、琼脂糖标记纳米抗体TT7：琼脂糖4FF（1 mL）用水洗涤两遍抽干，加入1.2 mL聚乙二醇二缩水甘油醚、1.2 mL DMSO、80 μL 0.8 M NaOH水溶液，活化温度40℃，220 rpm震荡反应3小时。过滤抽干，用20%乙醇洗涤5次，每次1 mL，用水洗两次，每次2 mL，后抽干。向上述抽干的活化的琼脂糖4FF，加5 mL 0.1 M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10.5）溶解，加纳米抗体TT7 1 mL (5 mg/mL)，在200 rpm摇床上振荡，37℃偶联12小时。过滤抽干，用PBS洗后抽干。用20%乙醇浸泡保存。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.抗人转铁蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-3所示或SEQ ID NO: 4-6所示。

2.权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO: 8所示。

3.纳米抗体与多肽或蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽或蛋白的融合部分：组氨酸His标签、人流感血凝素HA标签、FLAG标签、Myc标签、绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、发光酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、和抗体Fc片段。

4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的融合部分为：（a）组氨酸蛋白标签，（b）麦芽糖结合蛋白，或（c）谷胱甘肽转移酶；编码所述的纳米抗体融合蛋白的核酸序列分别由SEQ ID NO: 9-14所示。

5.权利要求1或2所述的纳米抗体、或权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白经修饰物修饰产生的纳米抗体衍生物，其特征在于：（a）是与修饰物非共价键结合形成的纳米抗体衍生物，所述修饰物包括胶体金、胶体银、或胶体碳；或（b）是与修饰物共价键结合形成的纳米抗体衍生物，所述修饰物包括彩色微球、荧光微球、聚合物微球、磁微球、琼脂糖、葡聚糖、纤维素、过滤膜、和化学小分子；所述化学小分子包括药用化合物、生物素、染料分子、荧光化合物、和吖啶酯。

6.免疫层析试纸条，其特征在于，（a）含有权利要求1或2所述的纳米抗体，权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白，或权利要求5所述的的纳米抗体衍生物；和（b）由样本垫、层析垫、和吸收垫组成。

7.权利要求6所述的免疫层析试纸条在体外定性或定量检测生物体液中的转铁蛋白的用途，所述生物体液包括血液、组织液、唾液、泪液、尿液、和粪便。

8.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备转铁蛋白检测试剂产品的用途，所述检测试剂产品包括免疫层析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、免疫比浊法试剂盒、和化学、电化学和生物发光试剂盒。

9.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备转铁蛋白亲和介质产品的用途，所述亲和介质产品包括修饰的聚合物微球、磁微球、琼脂糖、葡聚糖、纤维素、和过滤膜。

10.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备在生物体内识别转铁蛋白的靶向物的用途，所述靶向物中包括免疫毒素，抗体-药物偶联物、和双特异性或多特异性抗体。