KR100970653B1 - 뇌암 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 뇌암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 뇌암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 뇌암 진단용 키트는 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 뇌암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 뇌암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 뇌암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 뇌암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39, 단백질 칩, 효소면역분석법, 면역크로마토그래피, 스트립

Description

뇌암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Brain Cancer}

본 발명은 뇌암 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 뇌암 진단용 기판 및 전기 기판을 포함하는 뇌암 진단용 키트에 관한 것이다.

현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 뇌암, 식도암, 대장암, 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다. 뇌암의 임상증세로는 두통, 간질발작, 구토, 운동마비, 물체가 겹쳐보이는 현상, 시력저하, 호르몬 이상, 청력 저하, 현기증, 언어장애 등이 있다. 일반적으로, 뇌암의 진단은 전술한 바와 같은 의심되는 자각증상이 나타나는 경우 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기 공명 단층촬영(MRI) 또는 뇌혈관 조영에 의해 이루어진다. 이러한 정밀검사를 통해 뇌암 진단을 하고 있지만, 상기 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어서 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 조기 발견 이 가능하고 좀더 간편하면서도 피검자에게 부담이 없는 검사방법의 개발이 계속 요구되어 왔다.

한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대해서 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되었는데, 일반적으로, 이들 진단방법은, 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행된다. 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성골수성백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성림프성백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암만을 진단할 수 있는 단점이 있고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.

상술한 종래의 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있으나, 뇌암에서는 적용된 바 없고 뇌암 환자에서만 특이적 발현되는 뇌암 특이적 항원 또한 보고된 바 없다.

따라서, 뇌암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 뇌암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되 었다.

이에, 본 발명자는 뇌암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 뇌암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 뇌암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 전기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 뇌암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 뇌암 진단용 기판을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 기판을 포함하는 뇌암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 뇌암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 뇌암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 뇌암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 뇌암의 발병여부를 확인할 수 있 으므로, 뇌암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 뇌암 진단용 기판은(ⅰ) 항-아포리포프로테인 C-II 항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 또는 2개의 항체; 및,(ⅱ) 전기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 뇌암 진단용 기판을 포함한다: 이때, 전기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 전기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 전기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 전기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 뇌암 진단용 키트는 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 뇌암 진단용 기판 및 전기 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있 는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호물질로서 사용할 경우에는 뇌암 진단용 키트에 전기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 뇌암 진단용 키트는 뇌암 진단용 기판으로서 전기 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 NC 막 또는 PVDF 막을 사용하고, 전기 뇌암 진단용 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).

도 1은 본 발명의 뇌암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 전기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-아포리포프로테인 C-II 항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 결과 표시부재로서 항-아포리포프로테 인 C-II 항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 항체가 고정된 다클론항체 밴드(판정라인, 3)와 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 4)가 부착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 뇌암 진단용 키트는, 뇌암 진단용 기판으로서 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 전기 뇌암 진단용 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 키트이다: 이때, 전기 마이크로플레이트는 항-아포리포프로테인 C-II 항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 항체가 부착되고, 전기 검출수단에는 전기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 전기 항-아포리포프로테인 C-II 항체, 항-연골 글리코프로테인-39 항체 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 뇌암 진단용 키트는, 뇌암 진단용 기판으로서 전기 뇌암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 전기 뇌암 진단용 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항 원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 전기 뇌암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 전기 항-아포리포프로테인 C-II 항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 전기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 전기 단백질 칩과 전기 항체에 각각 결합된 아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39를 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 전기 검출수단은 전기 뇌암 특이적 항원에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-아포리포프로테인 C-II 항체, 항-연골 글리코프로테인-39 항체 및 전기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 전기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP, RFP 또는 텍사스레드인 것이 바람직하다.

본 발명의 뇌암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 뇌암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 뇌암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 뇌암 특이 유전자의 선별

정상 뇌조직(BN) 6건, 뇌암조직(AB)19건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 37건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 13건, 정상폐조직(LN) 10건, 1기 폐암조직(LI) 71건, 정상 췌장조직(PN) 7건, 췌장암조직(PT) 8건 및 장액성 난소암조직(ovary cancer serous, OS) 24건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 전기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.

전기 선별된 5㎍의 RNA를 올리고(dT)24를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 전기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 polymerase in vitro 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 전기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 전기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 전기 수득한 혼성화반응용액과 전기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼합하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.

반응이 종결된 후, 전기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 전기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin IgG)를 처리하고, 전기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 전기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 1).

각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과

유전자	AB	MO	R	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
X96753	605	69	8.77	-104	-72	-65	-100	-84	69	-271	-177
U96769	565	67	8.43	-160	-350	-229	-223	-226	-463	67	-23
U33447	507	57	8.89	57	-31	-167	-77	-71	57	57	-113
M10612	12156	2411	5.04	2411	47	70	39	127	48	187	153
M83233	3852	818	4.71	265	757	818	750	464	438	299	421
L78833	1104	238	4.64	238	162	92	37	142	114	172	126
U76456	1876	219	8.57	219	121	123	113	71	122	125	101
U48250	3420	846	4.04	846	-77	-62	-53	-65	-81	112	75
Z11933	393	72	5.46	72	-37	-82	-41	-76	-54	50	-130
X54867	744	190	3.92	12	94	80	105	69	85	190	69
D78014	10388	2655	3.91	2321	2089	1002	587	1980	2655	691	2014
U42390	1298	413	3.14	413	158	152	72	290	214	-37	397
Z31560	5290	1723	3.07	1723	484	379	409	693	402	1386	446
Z19585	1457	477	3.05	114	64	-19	-70	38	-16	477	340
HG3495-HT3689	976	195	5.01	195	162	65	-26	-85	-97	105	-40
D13631	2267	763	2.97	413	164	153	156	335	763	91	242
U46006	1724	471	3.66	148	471	193	318	229	309	255	288
U78180	683	241	2.83	241	-118	-12	-4	-119	-101	-38	43
D10522	11520	4275	2.71	4138	2294	4275	2022	3277	2849	1074	2616
M21574	4577	1222	3.75	898	467	955	498	865	1222	852	1190
M57399	11002	4513	2.44	4513	740	228	167	433	498	447	433

유전자	AB	MO	R	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
D25304	2767	1183	2.34	750	319	320	297	571	1183	671	649
D87458	1390	602	2.31	602	-14	-21	-5	-7	-15	149	25
D82345	819	357	2.30	87	357	173	107	154	97	196	213
D76435	2045	386	5.30	351	228	69	63	148	36	386	137
HG2709-HT2805	298	136	2.19	136	65	35	31	52	112	-132	125
L14542	586	276	2.12	23	-3	-13	45	13	47	276	55
L20971	3292	1553	2.12	1553	201	243	303	592	1001	60	245
D87258	16110	7622	2.11	7622	3497	2002	1764	2376	2016	1531	4213
D16181	14527	7025	2.07	7025	40	54	46	46	-12	169	81
U48705	14188	6947	2.04	4272	6947	3685	3568	3349	1527	1323	3284
Y08374	9043	3220	2.81	2205	586	778	597	1413	3103	65	3220
D79990	5362	2166	2.48	2166	376	359	341	712	1712	323	485
M12529	48578	26048	1.86	26048	6295	2037	3200	11691	10415	811	8559
M96759	464	251	1.85	251	91	-40	18	9	34	80	37
L77730	1250	679	1.84	666	434	372	354	585	446	679	440
M55531	1496	819	1.83	666	422	330	448	530	360	819	545
X75756	512	214	2.40	219	132	75	61	105	204	53	59
U49857	4153	2282	1.82	2282	281	201	221	251	280	215	298
Z35309	368	203	1.81	181	-3	-40	-13	-28	-54	203	105
M16474	492	208	2.37	80	20	26	32	43	208	172	89
U64871	334	187	1.79	187	123	89	79	49	28	118	121
M74719	3893	2232	1.74	2232	984	905	706	1032	1513	573	1349

유전자	AB	MO	R	BN	OS	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
D13168	622	358	1.74	287	39	87	88	65	358	260	87
D87119	4467	2587	1.73	1603	2587	551	1219	1183	1481	228	1434
L11373	26171	15571	1.68	15571	3497	1476	1215	2575	3689	2969	3244
U43328	164	99	1.66	58	60	17	30	4	-41	99	78
X00588	465	285	1.63	29	90	127	121	285	85	50	84
U70981	161	88	1.83	28	52	14	18	27	-24	88	16
X75958	5187	3230	1.61	3230	28	42	68	26	121	268	160
U46744	385	247	1.56	247	-121	-149	-115	-66	-106	-17	-59
D25248	1041	667	1.56	480	460	667	539	497	506	303	608
M14676	11455	7383	1.55	7383	1608	1133	1115	2056	2527	1983	1810
Z27113	6916	3646	1.90	2960	3269	3531	3646	3103	2166	1673	2564
D25217	2740	1813	1.51	1813	139	104	148	104	159	142	91
D63476	3245	2226	1.46	1893	1629	2226	1739	1673	1703	1425	1344
V00594	22373	15708	1.42	15708	3163	1467	4271	5265	11116	9286	11867
L48513	6217	3624	1.72	2304	2048	2336	2085	3624	2350	505	1656
M15856	4518	3212	1.41	378	273	401	258	1116	3212	405	326
U37146	5300	4133	1.28	4133	2962	2233	1493	3660	3335	1640	2895

상기 표 1에서, AB는 뇌암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 전기 AB를 MO로 나눈 비율을 의미한다.

또한, 상기 표 1 에서, 유전자 X96753는 콘드로이틴 황산염 프로티오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4(melanoma-associated))를, U96769는 콘드로어드헤린(chondroadherin)을, U33447G는 단백질-쌍 수용체 17(protein-coupled receptor 17)을, M10612는 아포리포프로테인 C-II(apolipoprotein C-II)를, M83233은 전사인자 12(transcription factor 12(HTF4, helix-loop-helix transcription factors 4))를, L78833은 GTP-결합 단백질 Rho7(GTP-binding protein Rho7)을, U76456은 메탈로프로티나제 4의 조직 저해제(tissue inhibitor of metalloproteinase 4)를, U48250 단백질 키나제 C 결합 단백질 2(protein kinase C binding protein 2)를, Z11933은 POU 도메인, 클래스 3, 전사인자 2(POU domain, class 3, transcription factor 2)를, X54867 킬러세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 C, 멤버 1(killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 1)을, D78014는 디하이드로피리미디나제 유사단백질 3(dihydropyrimidinase-like 3)을, U42390은 삼중 기능성 도메인(triple functional domain(PTPRF interacting))을, Z31560 Y염색체의 성 결정부분 박스 2(SRY(sex determining region Y)-box 2)를, Z19585는 트롬보스폰딘 4(thrombospondin 4)를, HG3495-HT3689는 콜라겐, 타입 IX, 알파 1(collagen, type IX, alpha 1)을, D13631은 락/Cdc42 구아닌 교환인자6(Rac/Cdc42 guanine exchange factor(GEF) 6)을, U46006은 시스테인과 글리신 풍부 단백질 2(cysteine and glycine-rich protein 2)을, U78180은 뉴런의 아밀로이드-민감 양이온채널 2(amiloride-sensitive cation channel 2, neuronal)를, D10522는 미리스토일레이티드 알라닌 풍부 단백질 키나제 C 기질(myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate(MARCKS, 80K-L))을, M21574는 혈소판 유도 성장인자 수용체, 알파 폴리펩티드(platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide)를, M57399는 플리오트로핀(pleiotrophin(heparin binding growth factor 8, neurite growth-promoting factor 1))을, D25304는 락/Cdc42 구아닌 교환인자 3(Rac/Cdc42 guanine exchange factor(GEF) 3)을, D87458는 KIAA0282 단백질(KIAA0282 protein)을, D82345는 티모신, 베타(신경아세포종 세포에서 확인됨)(thymosin, beta, identified in neuroblastoma cells)를, D76435는 Zic 패밀리 멤버 1(Zic family member 1(odd-paired Drosophila homolog))을, HG2709-HT2805는 NIMA-연관 키나제 1(NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 1)을, L14542는 킬러세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 C, 멤버 3(killer cell lectin-like receptor subfamily C, member 3)을, L20971은 포스포디에스터라제 4B(phosphodiesterase4B)를, D87258은 세린 프로테아제 11(protease, serine, 11(IGF binding))을, D16181은 말초 수초 단백질 2(peripheral myelin protein 2)를, U48705는 디스코이딘 도메인 수용체 패밀리, 멤버 1(discoidin domain receptor family, member 1)을, Y08374는 키티나제 유사 단백질 1인 연골 글리코프로테인-39(chitinase 3-like 1, cartilage glycoprotein-39)를, D79990은 라스 연락 도메인 패밀리 2(Ras association(RalGDS/AF-6) domain family 2)를, M12529는 아포지방단백질 E(apolipoprotein E)를, M96759는 망막 외측 분절막 단백질 1(retinal outer segment membrane protein 1)을, L77730은 아데노신 A3 수용체(adenosine A3 receptor)를, M55531은 용질 수송 패밀리 2, 멤버 5(solute carrier family 2(facilitated glucose transporter), member 5)를, X75756 단백질 키나제 C(protein kinase C, mu)를, U49857은 씨-포스 프로모터의 전사 활성체(transcriptional activator of the c-fos promoter)를, Z35309는 아데닐레이트 싸이클라제 8(adenylate cyclase 8(brain))을, M16474는 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase)를, U64871G는 단백질-쌍 수용체 19(protein-coupled receptor 19)를, M74719는 전사인자 4(transcription factor 4)를, D13168은 엔도텔린 수용체 타입 B(endothelin receptor type B)를, D87119는 GS3955 단백질(GS3955 protein)을, L11373은 프로토카드헤린 감마 서브패밀리 C3(protocadherin gamma subfamily C, 3)을, U43328은 연골연결 단백질1(cartilage linking protein 1)을, X00588은 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor(avian erythroblastic leukemia viral(v-erb-b) oncogene homolog))를, U70981은 인터루킨 13 수용체, 알파 2(interleukin 13 receptor, alpha 2)를, X75958은 뉴로트로픽 타이로신 키나제(neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2)를, U46744는 디스트로브레빈, 알파(dystrobrevin, alpha)를, D25248은 액틴 필라멘트 연관 단백질(actin filament associated protein)을, M14676은 SRC, FGR, YES와 관련된 FYN 종양 유전자(FYN oncogene related to SRC, FGR, YES)를, Z27113은 RNA 중합효소 II 폴리펩티드 F(polymerase(RNA) II(DNA directed) polypeptide F)를, D25217은 KIAA0027 단백질(KIAA0027 protein)을, D63476은 PAK-상호작용 교환인자 베타(PAK-interacting exchange factor beta)를, V00594는 메탈로타이아닌 2A(metallothionein 2A)를, L48513은 파라옥소나제 2(paraoxonase 2)를, U37146은 핵 수용체 코-리프레서 2(nuclear receptor co-repressor 2)를 각각 의미한다.

전기 표 1에서 보듯이, 전기 유전자들은 뇌암조직에서의 발현정도가 정상 뇌조직은 물론, 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 웨스턴 블롯 분석

전기 60개의 뇌암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하여 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 뇌암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 전기 단백질은 아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39이다.

먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 전기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하고, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(polyvinylidenefluoride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해, 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 전기 PVDF 막을 차단시켰다. 이어, 전기 차단된 PVDF 막에 항-아포리포프로테인 C-II 토끼 다클론항체(Biocat, Germany) 및 항-연골 글리코프로테인-39 토끼 다클론항체(Biocat, Germany)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 전기 차단완충액에 희석하여 처리하고, 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horse raddish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 전기 세척된 PDVF막에 처리하고, 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.

그 결과, 아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39의 경우 뇌암 환자의 혈액에서만 뚜렷하게 검출되었다.

따라서, 아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39가 뇌암에서 특이적으로 발현되는 단백질로서 뇌암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 스트립의 제작 및 분석

다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체를 포함한 뇌암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-1: 샘플패드의 제작

셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여, 샘플패드(2)로 사용하였다.

실시예 3-2: 다클론항체-금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작

혈액시료내의 뇌암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 전기 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체간의 면역반응이 일어나는 부분인 유리섬유(GF) 필터(2)는 그의 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체인 다클론항체-금접합체가 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 전기 염화금 용액에 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체를 각각 10㎍/㎖되게 가하고, PEG(polyethyleneglycol) 용액으로 금입자를 안정화시켜서 다클론항체-금접합체를 제조하였다.

한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 전기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.

실시예 3-3: NC 막의 제조

NC 막(nictrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자르고, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하였다. 이어, 상기 대조라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 전기 뇌암 특이적 항원의 검출결과 판정라인으로서 본 발명에 포함된 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인과 검출결과 판정라인이 구비된 NC 막(4)을 제조하였다.

실시예 3-4: 흡수(absorbent) 패드의 제조

흡수패드(7)는 면역반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.

실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹

각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7) 위에 전기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 전기 실시예 3-2에서 제작한 각각의 다클론항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결한 다음, 전기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 전기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 췌장암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석

정상인 5명, 대장암 환자 7명, 췌장암 환자 4명, 난소암 환자 4명, 뇌암 환자 5명으로부터 혈액을 채취한 다음, 전기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.

그 결과, 뇌암 환자에서 수득한 혈액시료만이 상기 면역 크로마토그래피 스트립의 각 항체의 판정라인에서 발색됨을 확인하였는 바, 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립이 뇌암 환자를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 단백질 칩의 제작 및 이를 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

실시예 4-1: 단백질 칩의 제작

전기 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다.

먼저, 전기 항체들을 부착시키기 전에, 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 전기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 전기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 전기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 전기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였다. 그런 다음, 전기 항체들이 배열된 전기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 전기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.

실시예 4-2: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

상기 실시예 4-1에서 제조된 단백질 칩을 상기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 여기에 뇌암의 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 각각 상기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 상기 세척된 단백질 칩을 상기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-아포리포프로테인 C-II 다클론항체(T1) 및 항-연골 글리코프로테인-39 다클론항체(T2)를 상기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 상기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 상기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 상기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG(H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 상기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.

단백질칩을 이용한 피검자에 대한 뇌암 진단

실험군	T1	T2
대조군	71.4	69.2
1	69.5	58.9
2	74.6	201.4
3	69.9	67.8
4	81.2	74.3
5	89.4	72.4
6	325.8	201.4
7	79.0	70.2
8	76.3	68.2
9	74.1	71.4
10	77.6	54.1
11	289.4	184.1
12	71.5	67.3

상기 표 2에서 보듯이, 2명의 혈액시료(실험군 6 및 11)에서는 아포리포프로테인 C-II 및 연골 글리코프로테인-39에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀검사를 수행한 결과, 두 명 모두 뇌암 환자임이 판명되었다.

도 1은 본 발명에 따른 뇌암 진단용 키트의 일실시태양인 뇌암 진단용 면역크로마토그래피 스트립의 개념을 모식적으로 나타내는 그림이다.

Claims (12)

1. 항-아포리포프로테인 C-II 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 뇌암 진단용 기판.
2. 제 1항에 있어서,

   고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 기판.
3. 제 1항에 있어서,

   항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 기판.
4. 제 1항에 있어서,

   항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 기판.
5. 제 1항의 뇌암 진단용 기판 및 전기 뇌암 진단용 기판의 항체에 결합한 뇌암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 뇌암 진단용 키트.
6. 제 5항에 있어서,

   검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 키트.
7. 제 5항에 있어서,

   검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 전기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 키트.
8. 제 7항에 있어서,

   신호물질은 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 키트.
9. 제 8항에 있어서,

   형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는

   뇌암 진단용 키트.
10. 제 8항에 있어서,

    효소는 HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는

    뇌암 진단용 키트.
11. 제 10항에 있어서,

    효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는

    뇌암 진단용 키트.
12. (ⅰ) 샘플패드;

    (ⅱ) 금입자가 결합된 항-아포리포프로테인 C-II 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터;

    (ⅲ) 항-아포리포프로테인 C-II 항체가 고정된 다클론항체 밴드인 판정라인과, 대조용 이차항체 밴드인 대조라인이 부착된 NC 막;

    (ⅳ) 흡수패드; 및,

    (ⅴ) 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는, 뇌암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.

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