KR100970651B1

KR100970651B1 - 난소암 진단용 키트

Info

Publication number: KR100970651B1
Application number: KR1020080028936A
Authority: KR
Inventors: 남명진
Original assignee: 남명진
Priority date: 2007-11-01
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2010-07-15
Also published as: KR20090044967A

Abstract

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 난소암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 난소암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 난소암 진단용 키트는 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 난소암 진단용 기판 및 상기 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 본 발명의 난소암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 난소암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 난소암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1 및 미드카인, 단백질 칩, 효소면역분석법, 면역크로마토그래피, 스트립

Description

난소암 진단용 키트{A Kit for Diagnosis of Ovarian Cancer}

본 발명은 난소암 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 피검자의 혈액시료에서 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 난소암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 난소암 진단용 키트에 관한 것이다.

난소암은 자궁경부암과 유방암 다음으로 여성들에게 많이 발생하는 암으로서, 종양이 생겨도 초기에는 거의 아무런 자각증상이 없기 때문에 다른 장기로 전이가 된 후에야 발견되는 경우가 많다. 초기에는 거의 아무런 증상이 없으나, 다른 기관으로 암이 전이되면서 하복부에서 응어리가 만져지고 방광이 압박되어 자주 소변을 보게 되며, 복수가 차거나 흉수가 고여 숨이 차는 증세가 나타나는 경우가 대부분이다. 따라서, 난소암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기진단의 필요성이 요구되는데, 일반적으로, 난소암의 진단은 산부인과에서 초음파, X선을 이용한 CT, MRI 등의 화상진단을 통해 이루어진다. 이들 방법에 의하여, 질병의 병변이 발견되는 경우, 정밀한 조직검사를 통해서 진단하여 비교적 정확한 검사결과를 얻을 수도 있으나, 상기 진단방법은 환자에게 고통이 따르는 불편함이 있어서 피검자들이 이를 꺼려하는 실정이다. 따라서, 보다 간편하고도 신속하게 진단할 수 있는 검사방법의 개발이 요구되어 왔다.

한편, 암과 같이 유전적인 변이가 발생하는 질환에 대해서 유전자를 이용하여 진단하는 방법이 개발되었는데, 일반적으로 이들 진단방법은 암으로 의심이 되는 조직으로부터 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR)에 의하거나, 상기 조직으로부터 RNA를 추출하여 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현 분석을 통해 수행된다. 전자는 주로 염색체전위(chromosome translocation)에 의하여 발병하는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)이나 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia: ALL) 등의 특정암만을 진단할 수 있는 단점이 있고, 후자는 조직검사, 내시경검사 또는 CT촬영 등의 종래의 암진단방법이 선행되어야 한다는 단점이 있다.

상술한 종래의 암 진단법의 단점을 극복하기 위하여, 암특이적 항원을 검출하여 진단하는 방법이 개발되고 있는데, 상기 암특이적 항원의 대표적인 예로는 암태아성 항원(carcinoembryogenic antigen: CEA)을 들 수 있다. CEA는 직장-결장암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간암 및 췌장암 환자에서 그 수치가 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 CEA를 검출하는 방법을 통한 암진단 키트도 다수 개발되었는데, 대한민국 특허 제 151823호에는 CEA에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체가 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 395206호에는 CEA에 대한 단클론항체를 포함한 초고속 간암, 대장암, 전립선암 진단 스트립이 개시되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같이 CEA는 난소암은 물론 다른 암 조직에서도 발현되므로, 난소암 특이적 항원이라 할 수 없으므로, 난소암 특이적 항원을 검색하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 몇 종류의 항원 단백질이 검색되었으나, 이들은 정상적인 조직에서 일정수준을 유지하다가 난소암이 발병한 후에 발현수준이 급격히 향상되기 때문에, 이들을 사용할 경우, 난소암을 효과적으로 진단할 수 없다는 문제점이 있었다.

따라서, 난소암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 난소암을 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자는 난소암 특이적 항원을 선별하고, 이에 대한 항체를 이용하여 신속하고 정확하게 난소암을 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 난소암 조직에서 특이적으로 발현되어 혈액으로 분비되는 단백질을 선별하였으며, 상기 단백질을 피검자의 혈액시료에서 검출할 경우, 난소암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액시료에서 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 난소암 진단용 기판을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 기판을 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 피검자의 혈액시료에서 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 난소암 진단용 기판 및 상기 기판을 포함하는 난소암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 난소암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도 난소암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 난소암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

본 발명의 난소암 진단용 기판은(ⅰ) 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 8개의 항체; 및,(ⅱ) 상기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 난소암 진단용 기판을 포함한다: 이때, 상기 고체상 지지체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride) 막, 유리기판, 폴리스티렌판, 실리콘기판 또는 금속판인 것이 바람직하며, NC 막 또는 유리기판인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항체는 특별히 이에 제한되는 것은 아니 나, 다클론항체 또는 단클론항체를 사용하는 것이 바람직하고, 단클론항체를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 상기 항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합, 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합 등의 방법에 의하여 상기 고체상 지지체에 부착되는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 난소암 진단용 키트는 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 난소암 진단용 기판 및 상기 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다: 이때, 검출수단은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체 또는 상기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 상기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체 등을 사용함이 바람직하다. 특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광물질(예를 들어, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등) 등을 사용함이 바람직하고, 효소를 신호물질로서 사용할 경우에는 난소암 진단용 키트에 상기 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 일실시태양에 의하면, 본 발명의 난소암 진단용 키트는 난소암 진단용 기판으로서 상기 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 NC 막 또는 PVDF 막을 사용하고, 상기 난소암 진단용 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 상기 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체를 사용하는 면역크로마토그래피 스트립이다(참조: 도 1).

도 1은 본 발명의 난소암 진단용 면역크로마토그래피 스트립에 대한 개념도이다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 샘플패드(1), 면역반응부재로서, 금입자가 각각 결합된 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터(2), 결과 표시부재로서 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 고정된 다클론항체 밴드(판정라인, 3)와 대조용 이차항체 밴드(대조라인, 4)가 부착된 NC 막(5) 및 흡수패드(6)가 접착용 플라스틱 백킹(7)상에 장착된 형태로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 난소암 진단용 키트는, 난소암 진단용 기판으로서 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 부착된 마이크로플레이트를 사용하고, 상기 난소암 진단용 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 상기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) 키트이다: 이때, 상기 마이크로플레이트는 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 부착되고, 상기 검출수단에는 상기 단백질에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 상기 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체, 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 효소가 결합된 이차항체가 포함되며, 효소에 의하여 발색반응을 일으키는 시약이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시태양에 의하면, 본 발명의 난소암 진단용 키트는, 난소암 진단용 기판으로서 상기 난소암 특이적 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 단백질 칩을 사용하고, 상기 난소암 진단용 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단으로서 상기 난소암 특이적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 상기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체를 사용하는, 형광면역분석키트이다: 이때, 기판으로 사용되는 단백질 칩은 상기 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항 체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 부착된 유리기판, 금속판 또는 실리콘기판으로 구성되며, 상기 단백질 칩을 포함한 형광면역분석키트는 상기 단백질 칩과 상기 항체에 각각 결합된 인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1 및 미드카인을 검출할 수 있는 검출수단을 포함한다. 상기 검출수단은 상기 난소암 특이적 항원에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 항-인히빈 베타 B 항체, 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-칼리크레인 7 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체, 항-미드카인 항체 및 상기 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질이 결합된 이차항체로 구성된다. 상기 형광물질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Cy-3, Cy-5, FITC, GFP, RFP 또는 텍사스레드인 것이 바람직하다.

본 발명의 난소암 진단용 키트는, 피검자의 혈액시료만으로도, 난소암의 발병여부를 확인할 수 있으므로, 난소암의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 난소암 특이 유전자의 선별

정상 뇌조직(BN) 6건, 뇌의 1기 성상세포종(astrocytoma) 조직(BA I) 19건, MSS(microsatellite stability) 대장암조직(CMSS) 37건, MSI(microsatellite instability) 대장암조직(CMSI) 13건, 정상폐조직(LN) 10건, 1기 폐암조직(LI) 71건, 정상 췌장조직(PN) 7건, 췌장암조직(AP) 8건 및 장액성 난소암 조직(ovary cancer serous, OS) 24건의 시료를 각각 수득하고, Trizol(Life Technologies, USA)을 이용하여 상기 수득한 시료로부터 RNA를 추출하였으며, 컬럼(RNesay spin column, Qiagen, USA)을 사용하여 정제하여, 18S와 28S rRNA가 유사하게 발현되는 RNA 만을 선별하였다.

상기 선별된 5㎍의 RNA를 올리고(dT)₂₄를 프라이머로 사용한 cDNA 합성키트(cDNA synthesis kit, Superscript Choice System; Life Technologies, USA)에 적용하여 cDNA를 합성한 후, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 T7 polymerase in vitro 전사 시스템(T7 Megascript kit, Ambion, USA)를 이용하여 cRNA를 합성하였다. 이때, 상기 cRNA는 바이오틴-11-CTP와 바이오틴-16-UTP(Enzo, USA)를 이용하여 표지하였다. 이어, 상기 표지된 cRNA 15㎍을 절편화용액(40mM Tris-acetate, pH 8.1, 100mM potassium acetate, 30mM magnesium acetate)으로 처리하고, 94℃에서 30분간 반응시켜서, 30 내지 50 염기의 크기가 되게 무작위적으로 절편화시켰다. 그런 다음, 청어 정자 DNA(Promega, USA) 0.1mg/ml와 아세틸화된 BSA(Life Technologies, USA) 500g/ml를 포함하는 혼성화 반응용액(hybridization cocktail, 100mmol/L MES, 1mol/L NaCl, 20mmol/L EDTA, 0.01%(v/v) Tween 20) 300㎕를 94℃의 온도로 5분동안 가열한 후, 냉각시키고, 상온에서 16,000g로 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 혼성화 반응용액과 상기 절편화된 cDNA 10㎍을 혼합하고, 7129개의 유전자를 확인할 수 있는 마이크로어레이(HuGeneFL Array, Affymetrix, USA)에 적용한 후, 45℃에서 16시간 동안 혼성화반응을 수행하였다.

반응이 종결된 후, 상기 마이크로어레이를 세척하고, 스트렙타비딘 용액(streptavidin-phycoerythrin, Molecular Probes, USA)으로 염색한 다음, 6x SSPE 완충용액(sodium chloride, sodium phosphate, EDTA)으로 세척하였다. 이어, 상기 세척된 마이크로어레이에 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin IgG)를 처리하고, 상기 스트렙타비딘 용액으로 다시 염색한 후, 6X SSPE로 다시 세척하였다. 그런 다음, 상기 마이크로어레이를 스캐너(GeneArray Scanner, Affymetrix, USA)로 스캔한 후, 이미지분석기(GeneChip software, Affymetrix, USA)를 사용하여 결과 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 1).

각종 조직에서의 특정 유전자 발현비율 측정결과

유전자	AO	MO	R	BN	BA I	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
X03635	2481	185	13.41	-61	-46	-35	-42	105	90	185	77
U19147	762	108	7.06	108	13	4	27	86	11	58	23
U17280	558	41	13.61	41	-100	-58	-54	-152	-127	-47	-68
X51630	1593	158	10.08	-6	32	100	74	52	93	158	57
U66838	921	193	4.77	193	39	-38	-19	-17	-6	91	11
U85707	1416	346	4.09	65	205	106	26	160	346	229	121
U71207	1187	239	4.97	104	158	95	76	239	57	148	108
X99350	374	32	11.69	-67	32	-165	-182	30	-35	-159	-100
U65011	1805	266	6.79	28	5	40	38	246	-43	266	300
M31682	352	-89	-3.96	-337	-226	-305	-466	-89	-230	-235	-133
M76732	1286	373	3.45	138	76	120	77	70	77	373	335
J05428	1597	543	2.94	40	54	225	263	88	29	543	534
M19309	1084	229	4.73	187	-20	6	229	92	-13	16	59
X57129	317	10	37.1	-231	-214	-108	-34	10	-82	-248	9
M60752	919	282	3.26	151	79	282	139	106	-9	189	177
U09550	386	142	2.72	7	27	97	34	-8	-78	142	77
X63187	13409	5228	2.56	73	31	1223	222	5228	1594	233	2546
L33881	3482	1473	2.36	927	589	1164	437	1473	1208	296	1255
S74445	989	423	2.34	256	150	104	49	162	32	423	65
Z71389	418	186	2.25	47	73	11	-5	58	186	109	-13
U40434	4308	1821	2.37	7	-33	344	354	1821	753	206	1718
X17360	1230	449	2.74	190	404	293	387	297	191	449	117
M74093	1224	574	2.13	235	145	531	574	283	59	32	89
D49394	345	157	2.20	89	-8	-15	-25	157	-128	35	101
U82319	536	267	2.01	57	77	82	79	117	88	267	115
U37519	1154	470	2.46	470	214	288	273	431	160	323	311
M74587	505	265	1.91	130	171	107	131	208	41	265	249
M97676	2538	1374	1.85	1022	850	660	614	641	696	1374	798
X56199	683	372	1.84	268	321	263	76	372	190	155	117
X15357	1416	786	1.80	178	289	284	299	362	786	352	398
U14550	930	518	1.80	78	146	97	336	204	518	66	125
D28137	6433	3351	1.92	867	1563	1994	2096	3351	3056	679	2970
L33404	1112	631	1.76	185	115	199	102	233	114	631	435
X83425	4551	2604	1.75	880	1107	681	512	2604	2304	2058	1723
M59979	1597	109	14.65	-107	19	34	-67	43	109	-225	-56
L22548	1931	942	2.05	180	812	634	562	867	529	304	942
U25165	2530	1404	1.80	902	1071	1059	1198	1327	1223	993	1404
S72869	495	241	2.05	241	133	191	199	241	196	121	145
D86425	836	404	2.07	127	230	373	327	250	148	404	401
M19720	615	284	2.17	-85	13	284	209	168	100	225	-120
X16665	1346	686	1.96	534	594	457	495	686	645	346	527
U90551	1339	645	2.08	163	193	362	446	645	251	156	449
X84373	1714	1067	1.61	657	818	296	1067	839	805	181	732

유전자	AO	MO	R	BN	BA I	CMSS	CMSI	LI	LN	PN	PT
S39329	302	195	1.55	81	28	39	48	8	-9	195	-45
X76029	626	273	2.29	160	148	107	97	273	53	97	209
U72066	1993	1321	1.51	569	593	940	1321	1194	823	631	960
D31763	595	406	1.47	203	306	406	382	304	346	142	184
Y00815	4070	2813	1.45	1711	1551	2289	1772	2813	1553	745	1307
M55210	3692	1987	1.86	368	195	316	264	1987	480	132	1227
U66036	662	478	1.38	107	29	208	177	288	87	162	478
D45906	1542	1155	1.34	76	736	977	1155	591	856	605	907
X00129	1167	757	1.54	757	3	585	84	131	427	224	353
X69962	410	321	1.28	292	207	321	239	160	209	114	88
Z80781	188	148	1.27	-31	-22	148	110	66	11	79	74
U50327	1588	1211	1.31	669	968	1211	994	1014	656	185	675
M94250	1829	1371	1.33	1017	1133	1133	909	1371	927	353	654
U47414	800	561	1.43	439	476	455	428	561	429	220	428
U14528	928	753	1.23	152	485	753	548	239	420	128	122
D16350	446	372	1.20	49	44	278	228	215	188	372	252
X76180	7378	6167	1.20	117	-21	3051	4440	6167	2901	2258	3630

상기 표 1에서, AO는 난소암 조직에서의 특정 유전자 발현비율의 평균값을 나타내고, MO는 다른 조직 중에서의 해당 유전자의 발현비율 중 최고치를 나타내며, R은 상기 AO를 MO로 나눈 비율을 의미한다.

또한, 상기 표 1에서, 유전자 X03635는 에스트로겐 수용체 1(estrogen receptor 1)을, U19147은 G 항체 1(G antigen 1)을, U17280은 스테로이도제닉 급성 조절 단백질(steroidogenic acute regulatory protein)을, X51630는 빌름스 종양 1(Wilms tumor 1)을, U66838은 싸이클린 A1(cyclin A1)을, U85707은 메이스 1 유사체(Meis 1 homolog)를, U71207은 눈 결여 유사체 2(eyes absent homolog 2)를, X99350은 포크헤드 박스 J1(forkhead box J1)을, U65011은 흑색종의 발현 항체(expressed antigen in melanoma)를, M31682는 인히빈 베타 B(inhibin, beta B)를, M76732는 엠에스에이치 호메오박스 유사체 1(msh homeo box homolog 1)을, J05428은 UDP 글리코실트랜스퍼라제 패밀리 2의 폴리펩티드 B7(UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B7)을, M19309는 트로포닌 T1(troponin T1)을, X57129는 H1 히스티딘 패밀리의 멤버 2(H1 histone family, member 2)를, M60752는 H2A 히스티딘 패밀리의 멤버 A(H2A histone family, member A)를, U09950은 난관의 당단백질의 일종인 뮤신 9(mucin 9)을, X63187은 잠재적인 난소암 마커(putative ovarian carcinoma marker)를, L33881은 단백질 키나제 C(protein kinase C)를, S74445는 세포의 레티노인산 결합 단백질 1(cellular retinoic acid-binding protein 1)을, Z71389는 디펜신 베타 2(defensin, beta 2)를, U40434는 메소텔린(mesothelin)을, X17360은 호메오박스 D4(homeo box D4)를, M74093은 싸이클린 E1(cyclin E1)을, D49394는 5-히드록시트립타민 수용체 3A(5-hydroxytryptamine receptor 3A)를, U82319는 YDD19 단백질(YDD19 protein)을, U37519는 알데하이드 탈수소효소 8(aldehyde dehydrogenase 8)을, M74587은 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 1(insulin-like growth factor binding protein 1)을, M97676은 엠에스에이치 호메오 박스 유사체 1(msh homeo box homolog 1)을, X56199는 핵 수용체 서브패밀리 1의 그룹 I의 멤버 3(nuclear receptor subfamily 1, group I, member 3)을, X15357은 구아닐레이트 사이클라제 A(guanylate cyclase A)를, U14550는 시알릴트랜스퍼라제(sialyltransferase)를, D28137은 골수성 기질세포의 항원 2(bone marrow stromal cell antigen 2)를, L33404는 칼리크레인 7(kallikrein 7)을, X83425는 루테란 혈액형 그룹(Lutheran blood group)을, M59979는 프로스타글란딘-엔도페록사이드 합성효소 1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1)을, L22548은 XVIII형 콜라겐의 알파 1(collagen, type XVIII alpha 1)을, U25165는 유약 X 정신지체자의 상염색체 유사체 1(fragile X mental retardation, autosomal homolog 1)을, S72869는 싸이로이드-1을 검출할 수 있는 프로브(probe for thyroid-1)을, D86425는 니도겐 2(nidogen 2)를, M19720은 골수구종증 바이러스 암 유전자의 유사체 1(myelocytomatosis viral oncogene homolog 1)을, X16665는 호메오박스 B2(homeo box B2)를, U90551은 H2A 히스톤 패밀리의 멤버 L(H2A histone family, member L)을, X84373은 핵 수용체 반응 단백질 1(nuclear receptor interacting protein 1)을, S39329는 칼리크레인 2(kallikrein 2)를, X76029는 뉴로메딘 U(neuromedin U)를, U72066은 망막아세포종 결합 단백질 8(retinoblastoma-binding protein 8)을, D31763은 징크 핑거 단백질 33a(zinc finger protein 33a)을, Y00815는 수용체 유형의 단백질 타이로신 포스파타아제 F(protein tyrosine phosphatase, receptor type, F)를, M55210은 라미닌 감마 1(laminin gamma 1)을, U66036은 설포트랜스퍼라제 패밀리의 싸이토솔릭 1C의 멤버 1(sulfotransferase family, cytosolic, 1C, member 1)을, D45906은 LIM 도메인 키나제 2(LIM domain kinase 2)를, X00129는 레티놀 결합 단백질 4(retinol-binding protein 4)를, X69962는 유약 X 정신지체 인자 1(fragile X mental retardation factor 1)을, Z80781은 히스톤 H2B 유사 이에스티(ESTs, similar to histone H2B)를, U50327은 단백질 키나제 C의 기질 80K-H(protein kinase C substrate 80K-H)을, M94250은 미드카인(midkine)을, U47414는 싸이클린 G2(cyclin G2)를, U14528은 용질 캐리어 패밀리 26의 멤버 2(solute carrier family 26, member 2)을, D16350은 쥐의 고혈압 연관 단백질의 유사체(rat hypertension-associated protein homolog)를, X76180은 나트륨 채널의 비전압성 게이트 1 알파(sodium channel, nonvoltage-gate 1 alpha)를 각각 의미한다.

상기 표 1에서 보듯이, 상기 유전자들은 난소암 조직에서의 발현정도가 정상 난소조직은 물론, 다른 암조직에서의 발현정도보다 월등히 높다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 웨스턴 블롯분석

상기 실시예 1에서 검출한 난소암 특이적 발현 유전자 중 세포외로 분비되는 단백질을 암호화하는 유전자를 선별하고, 이들 유전자에 의하여 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 난소암 환자, 정상인 및 다른 암환자로부터 수득한 혈액시료에 대한 웨스턴 블롯분석을 수행하였다. 상기 단백질은 인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 1, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1, 레티놀 결합 단백질 4 및 미드카인이다. 먼저, 실시예 1의 정상조직 및 암조직을 제공한 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 상기 분리된 혈청을 각각 6개의 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하고, 각각 전기적인 방법에 의해 PVDF(polyvinylidenefluoride, Millipore, USA) 막으로 전이시켰다. PVDF 막으로 전이된 단백질의 비특이적 반응을 줄이기 위해, 차단완충액(3% bovine serum albumin, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 12-14시간 동안 상기 PVDF 막을 차단시켰다. 이어, 상기 차단된 PVDF 막에 항-인히빈 베타 B 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-뮤신 9 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-디펜신 베타 2 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 1 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-칼리크레인 7 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-니도겐 2 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-뉴로메딘 U 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-라미닌 감마 1 토끼 다클론항체(Biocat, Germany), 항-레티놀 결합 단백질 토끼 다클론항체(Biocat, Germany) 4 및 항-미드카인 토끼 다클론항체(Biocat, Germany)를 각각 1:200(v/v)의 농도로 상기 차단완충액에 희석하여 처리하고, 2시간 동안 상온에서 교반하여 반응시켰다. 그런 다음, PBST(0.05% Tween 20 in PBS)로 10분동안 3회 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 염소 IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:200(v/v)로 희석시킨 차단완충액을 상기 세척된 PDVF막에 처리하고, 상온에서 45분간 교반하여 반응시켰다. 이어, PBST로 10분간 3회 세척한 다음, ECLTM kit(Amersham, UK)를 이용하여 화학발광반응을 일으키고, 이를 PhosphaImager(Fuji, Japan)로 분석하였다.

그 결과, 인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1 및 미드카인은 난소암 환자의 혈액에서만 뚜렷하게 검출되었고, 다른 암환자의 혈액에서는 검출되지 않거나 또는 미량이 검출된 반면, 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 1 및 레티놀 결합 단백질 4는 난소암 환자의 혈액뿐만 아니라, 다른 암환자의 혈액에서도 뚜렷하게 검출됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1 및 미드카인이 난소암 환자에서 특이적으로 발현되어 혈액으로부터 검출될 수 있는 바, 이들을 난소암 진단의 유용한 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 스트립의 제작 및 분석

다음과 같은 과정를 통하여, 도 1에 도시된 바와 같이 항-인히빈 베타 B 다클론항체, 항-뮤신 9 다클론항체, 항-디펜신 베타 2 다클론항체, 항-칼리크레인 7 다클론항체, 항-니도겐 2 다클론항체, 항-뉴로메딘 U 다클론항체, 항-라미닌 감마 1 다클론항체 및 항-미드카인 다클론항체를 포함하는 난소암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-1: 샘플패드의 제작

셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×1.2cm 크기로 절단하여, 샘플패드(2)로 사용하였다.

실시예 3-2: 각각의 다클론항체-금접합체 및 유리섬유(glass fiber: GF) 필터의 제작

혈액시료내의 난소암 특이적 항원과 본 발명에 포함된 상기 항-인히빈 베타 B 다클론항체, 항-뮤신 9 다클론항체, 항-디펜신 베타 2 다클론항체, 항-칼리크레인 7 다클론항체, 항-니도겐 2 다클론항체, 항-뉴로메딘 U 다클론항체, 항-라미닌 감마 1 다클론항체 및 항-미드카인 다클론항체간의 면역반응이 일어나는 부분인 유리섬유(GF) 필터(2)는 그의 표면상에 전기 다클론항체와 금입자의 접합체인 다클론항체-금접합체가 고정되어 있으며, 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

염화금을 시트르산 나트륨 용액으로 환원시켜 40nm 크기의 금입자를 532nm에서 흡광도가 10±1이 되도록 제조하였다. 상기 염화금 용액에 상술한 각각의 다클론항체를 10㎍/㎖되게 부착시키고, PEG(polyethylene glycol) 용액으로 금입자를 안정화시켜서, 각각의 다클론항체-금접합체를 제조하였다.

한편, 유리섬유 필터(1.0㎝ x 0.8㎝, Millpore, USA)를 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 상기 제조된 각각의 다클론항체-금접합체를 각각 적셔서 37℃에서 건조하였다.

실시예 3-3: NC 막의 제조

NC 막(nictrocellulose membrane, Millipore, USA)을 적당한 크기(0.8㎝ x 5㎝)로 자르고, 다시 0.2cm 폭으로 4등분한 다음, 각 막 하단에서 약 1.6㎝ 되는 지점에 대조라인으로서 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG, Santa-Cruz, USA)를 PBST에 1:50 농도로 희석하여 직선으로 처리하였다. 이어, 상기 대조라인에서 하단 방향으로 0.8㎝ 되는 지점에 상기 난소암 특이적 항원의 검출결과 판정라인으로서 상술한 항-인히빈 베타 B 다클론항체, 항-뮤신 9 다클론항체, 항-디펜신 베타 2 다클론항체, 항-칼리크레인 7 다클론항체, 항-니도겐 2 다클론항체, 항-뉴로메딘 U 다클론항체, 항-라미닌 감마 1 다클론항체 및 항-미드카인 다클론항체를 PBST에 1:50(v/v)으로 희석하여 각각 직선으로 처리한 다음, 37℃에서 건조시켜 막 표면상에 대조라인과 검출결과 판정라인이 구비된 NC 막(4)을 제조하였다.

실시예 3-4: 흡수(absorbent) 패드의 제조

흡수패드(7)는 면역반응 후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하는데, 셀룰로오스 필터(Millipore, USA)를 0.8cm×3cm의 크기로 절단하여 사용하였다.

실시예 3-5: 접착용 플라스틱 백킹

각 패드들을 지지하기 위한 부분으로, 상용 플라스틱 플레이트(Millipore, USA)를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹(7) 위에 상기 실시예 3-1에서 제작한 샘플패드(1)를 놓고, 그 위에 상기 실시예 3-2에서 제작한 상술한 항-인히빈 베타 B 다클론항체, 항-뮤신 9 다클론항체, 항-디펜신 베타 2 다클론항체, 항-칼리크레인 7 다클론항체, 항-니도겐 2 다클론항체, 항-뉴로메딘 U 다클론항체, 항-라미닌 감마 1 다클론항체 및 항-미드카인 다클론항체-금접합체가 각각 부착된 유리섬유 필터(2)를 상기 순서대로 좌로부터 우로 나란히 병렬로 연결한 다음, 상기 실시예 3-3에서 제작한 NC 막(5) 및 상기 실시예 3-4에서 제작한 흡수패드(6)를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 0.1㎝ 가량 부분적으로 겹쳐지도록 배열 및 조립하여 접착 고정시키고, 멤브레인의 아래에 흡수지(Millipore, USA)를 부착시켜 난소암 진단용 면역 크로마토그래피 스트립을 제조하였다.

실시예 3-6: 혈액 표본에 대한 분석

정상인 5명, 대장암 환자 7명, 췌장암 환자 5명, 난소암 환자 5명, 뇌암 환자 3명으로부터 혈액을 채취한 다음, 상기 제작된 면역 크로마토그래피 스트립의 흡수패드에 각각 3ml씩 떨어뜨린 다음, 5분이 경과 후 발색여부를 관찰하였다.

그 결과, 난소암 환자에서 수득한 혈액시료만이 상기 면역 크로마토그래피 스트립의 각 항체의 판정라인에서 발색됨을 확인하였는 바, 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립이 난소암 환자를 특이적으로 진단하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4: 단백질 칩의 제작 및 이를 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

실시예 4-1: 단백질 칩의 제작

상기 항-인히빈 베타 B 다클론항체, 항-뮤신 9 다클론항체, 항-디펜신 베타 2 다클론항체, 항-칼리크레인 7 다클론항체, 항-니도겐 2 다클론항체, 항-뉴로메딘 U 다클론항체, 항-라미닌 감마 1 다클론항체 및 항-미드카인 다클론항체를 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스 위에 배열시켰다. 먼저, 상기 항체들을 부착시키기 전에, 상기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크로스링커인 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 1mg/ml의 농도로 5분간 전처리하고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이어, 상기 항체들을 PBST에 각각 1:50, 1:100, 1:200 및 1:400(v/v)의 농도로 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 상기 항체들을 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 상기 폴리-L-리신으로 코팅된 현미경용 슬라이드 글라스에 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적하여 배열하였다. 상기 슬라이드 글라스는 항체의 종류와 희석농도에 따라서 16개의 구획으로 나누었으며, 각 구획은 면적 1mm2에 48개의 점으로 구성되도록 하였다. 그런 다음, 상기 항체들이 배열된 상기 슬라이드 글라스를 습실(humid chamber)에서 37℃의 조건으로 1시간 동안 방치하여 상기 항체들과 결합시킨 후, 꺼내어 건조하였다. 이어, 상기 슬라이드 글라스를 100% 냉각 아세톤에 1분간 담궈 항원이 슬라이드 글라스에 견고하게 결합되도록 한 후, 다시 꺼내어 건조하였다.

실시예 4-2: 단백질 칩을 이용한 무작위적 표본에 대한 분석

상기 실시예 4-1에서 제조된 단백질 칩을 상기 실시예 2에서 사용된 차단완충액에 침지하여 10분간 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 난소암 내시경 촬영결과 폴립이 발견된 암발병 여부가 불분명한 12명의 피검자의 혈액시료를 각각 상기 세척된 단백질 칩 상에 1ml씩 떨어뜨려 상온에서 15분간 정치하고, PBST로 3회 세척하였다. 상기 세척된 단백질 칩을 상기 차단완충액에 침지하여 15분간 정치한 다음, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 항-인히빈 베타 B 다클론항체(T1), 항-뮤신 9 다클론항체(T2), 항-디펜신 베타 2 다클론항체(T3), 항-칼리크레인 7 다클론항체(T4), 항-니도겐 2 다클론항체(T5), 항-뉴로메딘 U 다클론항체(T6), 항-라미닌 감마 1 다클론항체(T7) 및 항-미드카인 다클론항체(T8)를 상기 차단완충액에 각각 1:200의 농도로 희석한 후, 혼합한 항체혼합액 1ml을 상기 세척된 단백질 칩에 떨어뜨려 상온에서 15분간 반응시키고, PBST로 3회 세척하였다. 이어, 상기 다클론 항체가 처리된 단백질 칩 상에, 상기 차단완충액에 1:400으로 희석한 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G(Anti-rabbit IgG(H+L), F(ab')2, FITC, Goat, Roche Applied Science, USA) 1ml을 가하여 15분간 상온에서 정치한 후, PBST로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 FITC가 결합된 항-토끼 IgG 염소 면역글로불린 G가 처리된 단백질 칩을 상온에서 건조시켜, 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 상기 단백질 칩의 형광발색반응 정도를 측정하고, 분위수-표준화(quantile-normalization)를 통하여 분석하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 정상인으로 판명된 피검자의 혈액시료를 사용하였다.

단백질칩을 이용한 피검자에 대한 난소암 진단

실험군	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8
대조군	71.4	69.2	61.2	87.4	67.8	54.2	35.4	29.7
1	69.5	58.9	68.3	63.3	68.2	63.3	28.1	28.6
2	174.6	201.4	189.7	181.2	154.3	114.2	87.6	97.6
3	69.9	67.8	67.5	84.4	64.1	64.5	26.3	27.1
4	81.2	74.3	69.3	78.5	69.2	67.8	29.1	24.2
5	89.4	72.4	64.2	73.1	72.4	63.2	30.2	33.2
6	65.8	81.4	89.7	81.2	54.2	14.3	37.4	37.8
7	79.0	70.2	59.3	78.5	71.5	57.3	25.4	27.3
8	76.3	68.2	61.3	75.3	64.2	65.4	29.1	24.4
9	74.1	71.4	64.3	74.1	67.4	71.2	22.6	28.9
10	177.6	154.1	164.3	164.0	163.1	166.3	95.1	60.8
11	89.4	84.1	65.9	34.0	65.3	61.3	38.4	21.4
12	71.5	67.3	61.3	72.5	65.1	71.8	25.3	25.3

상기 표 2에서 보듯이, 2명의 혈액시료(실험군 2 및 10)에서는 인히빈 베타 B, 뮤신 9, 디펜신 베타 2, 칼리크레인 7, 니도겐 2, 뉴로메딘 U, 라미닌 감마 1 및 미드카인에 대한 형광발색정도가 정상인의 혈액시료에 비하여 두 배 이상 증가하였다. 상기 두 명의 피검자에 대하여 CT 촬영 등 정밀검사를 수행한 결과, 두 명 모두 난소암 환자임이 판명되었다.

도 1은 본 발명에 따른 난소암 진단용 키트의 일실시태양인 난소암 진단용 면역크로마토그래피 스트립의 개념을 모식적으로 나타내는 그림이다.

Claims

(ⅰ) 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 내지 6개의 항체; 및,

(ⅱ) 상기 항체가 부착된 고체상 지지체를 포함하는 난소암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

고체상 지지체는 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidenefluoride)막, 폴리스티렌판, 유리기판, 실리콘기판 또는 금속판인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

항체는 다클론항체 또는 단클론항체인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 기판.
제 1항에 있어서,

항체는 수소결합, 알데히드에 의한 결합 또는 폴리-L-리신 및 연결체에 의한 결합에 의하여 고체상 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 기판.
제 1항의 난소암 진단용 기판 및 상기 난소암 진단용 기판의 항체에 결합한 난소암 특이적 항원을 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는, 난소암 진단용 키트.
제 5항에 있어서,

검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체-금접합체인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
제 5항에 있어서,

검출수단은 기판의 항체와 결합한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 일차항체 및 상기 일차항체에 특이적으로 결합하는 이차항체-신호물질의 복합체인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
제 7항에 있어서,

신호물질은 형광물질, 발광물질, 방사성 동위원소 또는 효소인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
제 8항에 있어서,

형광물질은 Cy-3, Cy-5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 텍사스레드(Texas Red)인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
제 8항에 있어서,

효소는 HRP(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase) 또는 루시퍼라제(luciferase)인 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
제 10항에 있어서,

효소에 의하여 발색반응을 일으키는 발색시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는

난소암 진단용 키트.
(ⅰ) 샘플패드;

(ⅱ) 금입자가 각각 결합된 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 고정된 유리섬유(glass fiber: GF) 필터;

(ⅲ) 항-뮤신 9 항체, 항-디펜신 베타 2 항체, 항-니도겐 2 항체, 항-뉴로메딘 U 항체, 항-라미닌 감마 1 항체 및 항-미드카인 항체가 고정된 다클론항체 밴드인 판정라인과, 대조용 이차항체 밴드인 대조라인이 부착된 NC 막;

(ⅳ) 흡수패드; 및,

(ⅴ) 접착용 플라스틱 백킹을 포함하는, 난소암 진단용 면역크로마토그래피 스트립..