KR100355159B1 - 인간 에리스로포이에틴 수용체 단편 및 그에 대한 항체 - Google Patents

인간 에리스로포이에틴 수용체 단편 및 그에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역을 함유하는 융합단백질 발현용 대장균 재조합 플라스미드, 이러한 벡터로부터 생성되어 정제된 것으로서, 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역을 융합단백질의 나머지 부분으로부터 분리하기에 적합한 분해부위를 갖는 융합단백질, 정제된 세포외 영역 폴리펩타이드에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체, 에리스로포이에틴에 결합하는 정제된 인간 에리스로포이에틴 수용체 단편 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 물질, 조성물 및 방법들은 에리스로포이에틴 수용체에 대한 리간드 결합을 연구하고, 에리스로포이에틴 수용체를 정량하는 것 뿐아니라 수용체의 구조 및 신호전달체계를 이해하는데도 유용하다.

Description

인간 에리스로포이에틴 수용체 단편 및 그에 대한 항체{Human erythropoietin receptor fragment and antibodies thereto}
발명의 분야
본 발명은 정제된 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역(domain) 폴리펩타이드에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 에리스로포이에틴에 대한 친화성을 보유하고 있는 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역 폴리펩타이드, 그러한 폴리펩타이드를 제조하는데 사용하기에 적합한 DNA 서열, 및 그러한 폴리펩타이드를 인식하는 항체에 관한 것이다.
발명의 배경
에리스로포이에틴(Epo)은 포유동물의 신장 및 간에서 생성되는 분자량 34 킬로달톤(kDa)의 당단백 호르몬이다. Epo 는 미성숙 적혈구들의 증식 및 분화를 유도함으로써 조혈작용의 중심적인 역할을 수행한다. Epo 활성은 또한 글로빈 및 탄산탈수효소(carbonic anhydrase)를 포함한 다수의 적혈구계(erythroid)-특이유전자들의 활성화에 연관되어 있다(참조: Bondurant et al., Mol. Cell Biol. 5:675-683(1985); Koury et al., J. Cell. Physiol. 126: 259-265(1986)). 에리스로포이에틴 수용체(EpoR)는 따른 여러 성장인자 수용체들, 예를들어 인터루킨(IL)-3, IL-4 및 IL-6 수용체, 과립구 대식세포 콜로니-자극인자 (granulocyte macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF) 수용체 뿐아니라 프로락틴 및 성장호르몬 수용체를 포함하는 조혈/사이토킨/성장인자 수용체 계(family)의 일원이다(참조: Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 6934-6938 (1990)). 사이토킨 수용체 계의 일원들은 4개의 보존된 시스테인 잔기 및 세포막 통과부위의 바로 바깥쪽에 위치한 트립토판-세린-X-트립토판-세린 모티프(motif)를 함유한다. 그 보존된 서열들은 단백질간의 상호작용에 관여하는 것으로 생각되고 있다(참조: Chiba et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)).
최근에 EpoR cDNA 가 마우스의 간으로부터 분리되었으며(참조: Tojo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 148: 443-48 (1987)), 인간 태아의 간으로부터도 관리되었다(참조: Jones et al., Blood 76: 31-35 (1990); Winkelmann et al., Blood 76: 24-30 (1990)). 인간 cDNA 는 분자량이 대략 55kDa 이고 약 508 개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드 사슬을 코드화한다. 인간 EpoR 의 게노믹 클론도 분리되고 그 서열이 분석되었다(참조: Penny and Forget, Genomics 11:974-80 (1991); Noguchi et al., Blood 78: 2548-2556 (1991)). 코딩서열의 분석으로부터 시그날 펩타이드는 약 24 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있고, 세포외 영역에는 약 226 개의 아미노산 잔기가 존재하며, 약 23 개의 아미노산이 세포막중에 존재하고, 약 235 개의 아미노산이 세포내 영역에 존재하는 것으로 예측된다(참조: D'Andrea and Zon, J. Clin. Invest. 86: 681-687 (1990); Jones et al., Blood 76: 31-35 (1990); Penny and Forget, Genomics 11: 974-80 (1991)). 성숙인간 EpoR 단백질은 약 484 개의 아미노산으로 이루어져 있다. 인체의 적혈구계 미성숙 세포들(erythroid progenitor cells)은 모두 Epo 수용체를 포함하는 것으로 보인다. 미성숙 세포들이 성숙해짐에 따라 수용체와 Epo 와의 결합은 감소하며, 성숙이 완료되면 세망세포(reticulocytes) 상에서 Epo 수용체가 더 이상 검출되지 않는다(참조: Sawada et al., J. Clin. Invest. 80: 357-366 (1987); Sawada et al., J. Cell. Physiol. 137: 337(1988)). Epo 는 적혈구계 미성숙 세포들의 세포내 생활력(viability)을 유지시키며 그들로 하여금 세포분열 및 분화를 정상적으로 진행시킬 수 있도록 조절해준다. Epo 에 반응성인 적혈구계 미성숙 세포를 크게 두가지로 나눌 수 있는데, 그 중 하나가 방출(Burst)-형성유닛-적혈구계 세포(BFU-E)이고 다른 하나는 콜로니-형성유닛-적혈구계 세포(CFU-E)이다. 이 세포들의 Epo 수용체 수는 정상적인 BFU-E 및 CFU-E 에 대한 Epo 의 반응성과 매우 밀접하게 관련되어 있다. Epo 수용체 수는 인간 및 쥐 세포에서 CFU-E 단계에 최대치를 나타냈다가 점차 줄어드는 것으로 보인다(참조: Sawada et al., J. Clin. Invest. 80: 357-366 (1987); Landschulz et al., Blood 73: 1476-1486(1989)). Epo 가 제거된 후 Epo 수용체의 회복은 단백질 합성에 의존하는 것으로 보이는데, 이는 분해에 의해 Epo 수용체가 감소되며 EPo 가 제거되면 수용체가 새로 합성되어 증가됨으로서 그 양이 조절되고 있음을 암시한다(참조: Sawyer and Hankins, Blood 72: 132 (1988)). 거핵세포(megakaryocytes) 및 적혈구계 미성숙 세포상의 Epo 수용체에 대한 연구에 의하면, 조혈작용 및 혈소판 신생작용(thrombopoiesis)의 조절사이에 관련이 있으며, 여기에서 양쪽 세포타입에 의한 세포분열의 자극이 Epo 수용체 수에 의해 조절되는 것으로 생각되고 있다(Berridge et al., Blood 72: 970-977 (1988)). 비록 Epo 수용체는 클로닝되었지만, Epo 수용체에 대한 Epo 결합의 정확한 메카니즘 및그 후 어떻게 조혈작용과 관계하는지에 대해서는 알려져 있지 않다.
천연의 원료로부터 얻을 수 있는 EpoR 의 양은 극도로 소량이므로 Epo 수용체(EpoR)의 특성을 조사하는 것이 용이치 않다. 따라서, 조혈작용을 유도시키는 Epo와 그의 수용체와의 작용메카니즘은 여전히 미지의 상태이다(참조: D'Andrea and Zon, J. Clin. Invest. 86: 681-687 (1990)). 최근에 이 메카니즘은 백혈병유발에 있어서 성장인자와 그 수용체들과의 작용; 즉 변형된 조혈 성장인자와 그의 수용체들이 종양유발 및 백혈병유발에 관여할지도 모른다는 사실을 이해하는데 있어서 커다란 흥미를 유발시키고 있다(참조: Dunbar et al., Science 245: 1493-1496 (1989); Li et al., J. Virol. 57: 534-538 (1986)).
특정 세포형의 Epo 반응성 및 세포형의 Epo 친화성사이의 관련에 대한 여러 연구들이 상호 일치하지 않는 결과를 보고하고 있다. 이 연구들은 상응하는 플라스미드 벡터로부터 유래된 몇 개의 비-천연 아미노산 서열을 함유하는 재조합 Epo 또는 EpoR 을 사용하였다(참조: Berridge et al., Blood 72: 970-977 (1988); Harris et al., J. Biol. Chem. 267: 15205-09 (1992)). 이들 재조합 Epo 또는 EpoR 분자의 삼차원 구조적 변화 및/또는 다른 특징들이 천연 단백질의 특성을 변화시켰을 수도 있다. 따라서, 외부의(예를들어, 벡터) 아미노산 서열이 섞이지 않은, 실질적으로 순수한 Epo 수용체 단편을 얻을 수 있다면 이는 상당한 진보를 의미한다. 비록, 그러한 단편이 기능적 활성을 보유하고 있는지 여부를 예측할 수는 없지만, 그럼에도 불구하고 Epp 가 Epo 수용체의 세포외 영역에 결합하므로 순수한 세포외 영역 단편은 특히 유용할 것이다.
발명의 요약
카르복시 말단 근처에 트롬빈 분해부위를 갖는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 첫 번째 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 필수적으로 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 cDNA 코드화 서열중 뉴클레오티드 73 내지 750 (SEQ ID NO: 4 에서 열거됨)을 두 번째 뉴클레오티드 서열로 함유하는 발현 벡터가 개시되어 있다. Epo 수용체 cDNA 의 코드화 서열 단편은 단백질분해 절단부위의 3'쪽 (다운스트림)에 위치하고 있으며, 단백질분해 절단부위와 해독 리딩프레임(reading frame)이 동일하다. Epo 수용체 cDNA 의 코드화 서열 단편은 첫 번째 폴리뉴클레오티드 서열에 인접하여 해독되도록 배열되어 있다.
발현벡터에 의해 생성된 폴리펩타이드를 필수구성요소로 함유하며 트롬빈 분해부위를 갖는 첫 번째 세그먼트 및 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질 중 대략 25 내지 250 의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4 에서 열거됨)을 필수구성요소로 함유하는 두 번째 세그먼트로 구성된 순수한 융합단백질이 개시되어 있다. 두 번째 세그먼트는 첫 번째 세그먼트의 카르복시 말단에 공유적으로 결합되어 있다. 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질 서열중 대략 25 내지 250 의 아미노산 서열을 필수구성요소로 함유하는 순수한 단백질은 융합단백질을 트롬빈으로 절단함으로써 분리생성할 수 있다.
순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드의 세포외 영역에 대한 친화성을 갖는 항체가 개시되어 있다. 이 항체는 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질 서열중 대략 25 내지 250 의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드에 대해 친화성을 나타낸다.
고체상 시약 및 그 고체상 시약에 작동적으로 결합되어 있는 항체를 함유하는 면역분석 조성물이 개시되어 있다. 또한, 고체상 시약 및 그 고체상 시약에 작동적으로 결합되어 있는 순수한 단백질을 함유하는 면역분석 조성물이 개시되어 있다.
전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질중 대략 25 내지 250의 아미노산 서열을 필수구성요소로 함유하며 실질적으로 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드를 수득하는 방법이 개시되어 있다. 실질적으로 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드는 에리스로포이에틴에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다. 상기 방법은 융합단백질로부터 폴리펩타이드를 절단할 수 있는 조건하에 트롬빈을 사용하여 융합단백질을 처리함으로써 분해 혼합물을 형성하고; 분해 혼합물을 폴리펩타이드와 고체상 시약과의 결합을 허용하는 조건하에 에리스로포이에틴과 결합되어 있는 고체상 시약에 가하여 폴리펩타이드-고체상 조성물을 형성하고; 폴리펩타이드-고체상 조성물을 세척하여 결합하지 않은 물질을 제거하고; 실질적으로 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드를 폴리펩티이드-고체상 조성물로부터 용출시키는 과정을 포함한다.
제 1 도는 발현벡터 pGEX-2T 내로 삽입된 인간 에리스로포이에틴 수용체 cDNA의 5' 코드화 서열중 약 678bp를 함유하는 플라스미드 pJYL26을 도식적으로 나타낸 것이다. 제 1 도는 또한, pJYL26 으로부터 발현되는 재조합 융합단백질EpoRex-th를 나타내고 있다.
제 2a 도는 EpoRex-th를 발현하는 대장균 세포 추출액을 글루타치온 친화성 칼럼 상에서 정제하여 회수한 분획의 280nm 에서의 흡광도(A280)를 나타낸다. 제 2b 도는 트롬빈 처리된 EpoRex-th를 에리스로포이에틴 친화성 크로마토그래피에 적용한 결과 회수된 Epo-bp 를 함유하는 분획의 A280을 나타낸다.
제 3 도는 트롬빈에 의한 EpoRex-th의 절단을 보여주는 쿠마시 블루 염색된 폴리아크릴아미드 겔 사진이다.
제 4 도는 Epo-bp 에 대한 양의 체내에서 생성된 항-Epo-bp 항체의 결합을 보여주는 웨스턴블롯이다.
제 5 도는 포지되지 않은 Epo 의 존재 및 부재하에, Epo-bp 에 대한 다양한 농도의 인간125I-Epo 의 결합을 나타낸다.
제 6 도는 트립신으로 Epo-bp를 절단한 후 관찰되는 폴리펩타이드 밴드를 보여주는 쿠마시 블루 염색된 폴리아크릴아미드 겔 사진이다.
재조합 인간 Epo 및 전체 길이 인간 Epo 수용체 cDNA 클론을 이용할 수 있음에도 불구하고, Epo 와 Epo 수용체간의 상호작용 또는 적혈구계 미성숙 세포의 증식 및 분화에 포함된 신호전달 메카니즘에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
플라스미드 발현벡터는 그 벡터내로 삽입되어 클로닝된 코드화서열로부터 단백질을 발현시킬 수 있도록 해준다. 일반적으로 발현벡터는 숙주세포에서 벡터의선별 및 유지를 가능하게 해주는 선택가능한 마커 및 복제오리진을 포함하는 동시에 삽입된 유전자에 융합시키기에 적합한 폴리펩타이드의 고발현을 유도할 수 있는 유도성 조절인자를 포함한다. 벡터의 단백질분해 절단부위 서열의 다운스트림 쪽에 편리한 제한부위를 설계하여 넣는 것이 선호된다. EpoR 코드화서열 단편에 융합시키는데 선호되는 폴리펩타이드는 카르복시 말단에 트롬빈 분해부위를 갖는 글루타치온 S-전이효소이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 발현벡터는 EpoR 의 세포외 영역을 융합단백질의 일부로 발현시키며, 그 후에 융합단백질을 절단함으로써 순수한 EpoR 의 세포의 영역을 제조할 수 있다. EpoR 의 세포외 영역을 코드화하는 서열은 이 서열을 적합한 리딩프레임으로 발현벡터에 삽입시킬 수 있는 어떠한 방법을 이용하여서도 벡터내로 삽입될 수 있다. 예를들어, 첫 번째 프라이머는 세포외 영역의 5' 말단의 코드화서열에 상응하고 두 번째 프라이머는 세포외 영역의 3' 말단의 코드화서열에 상보적인 한 쌍의 중합효소 연결반응(PCR) 프라이머들이 합성되도록 한다. 선호되는 이 프라이머들은 목적하는 표적 서열의 말단에 상응하는 프라이머들의 측면부위에 편리한 제한효소 부위를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 이 프라이머들은 전체길이 인간 EpoR cDNA 주형(template)으로부터 EpoR 의 세포외 영역을 증폭시키는데 사용된다. 생성된 PCR 산물은 그후 발현벡터내로 클로닝된다. 양 말단에 동일한 제한효소 부위를 갖기 보다는 서로다른 제한효소 부위를 갖도록 PCR 프라이머들을 합성하는 것이 바람직하다. PCR 산물의 양 말단에 서로다른 제한효소 부위가 존재하면 인간 EpoR 의 코딩서열 단편을 센스(sense)방향으로 삽입시키는 것이 촉진된다.
숙주세포의 배양물중에서 재조합 플라스미드 발현벡터로부터 발현을 유도함으로써 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역을 일부분으로 함유하는 융합 단백질의 고발현이 이루어진다. 이하에서, EpoRex-th 는 융합단백질을 의미하고, Epo-bp 는 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역 단백질을 의미한다. 형질전환된 대장균 배양물로부터 적당한 방법으로 세포 단백질 추출물을 제조하는 것이 바람직하다. EpoRex-th 는 상기 추출물로부터 바람직한 방법을 사용하여 원하는대로 정제해낼 수 있다. 예를들어, 추출물을 Epo-bp 코딩서열의 업스트림(upstream) 융합단백질 부위와 결합할 수 있는 칼럼에 통과시키면, 융합단백질은 칼럼에 결합하는 반면 추출물중의 다른 단백질들은 완충액으로 세척하는 과정에서 칼럼으로부터 용출되므로 칼럼 매트릭스에 융합단백질만이 결합되며, 그 후에 완충액 조건을 변화시킴으로써 고순도의 EpoRex-th를 용출시킬 수 있다.
Epo-bp 는 정제된 EpoRex-th를 적당한 방법으로 절단함으로써 순수하게 정제할 수 있다. 예를들어, 업스트림 폴리펩타이드 및 Epo-bp 사이의 절단부위는 시아노겐 브로마이드에 민감하거나, 또는 부위-특이적 프로테아제 절단에 민감하다. 바람직한 실시예에서, 트롬빈 분해부위는 업스트림 폴리펩타이드의 내부이면서 업스트림 폴리펩타이드 코딩서열의 카르복시 말단에 위치한 편리한 제한클로닝 부위의 5' 쪽에 위치하도록 설계한다.
절단된 Epo-bp 폴리펩타이드 세그먼트는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 등전 포커싱(isoelectric focusing), 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 정제기술을 이용하여 업스트림 폴리펩타이드 세그먼트로부터분리될 수 있다. 또한, 적당한 정도의 순도를 얻기 위하여 필요에 따라 한가지 이상의 정제기술을 사용할 수도 있다. 바람직한 정제기술은 친화성 크로마토그래피이다. 예를들어, 프로테아제로 처리한 융합단백질 혼합물을 Epo 와 결합된 아가로오스 비이드로 충진된 칼럼에 적용할 수 있다. 절단된 Epo-bp 세그먼트는 Epo-아가로오스에 결합하는 반면, 업스트림 폴리펩타이드 세그먼트는 칼럼을 통과할 것이므로, 그 후에 액체상의 pH를 낮추어줌으로써 Epo-bp를 용출시킨다.
본 발명의 실시예에서, 인간 EpoR(hEpoR)의 아미노산 25 내지 250을 코드화하는 서열은 pGEX-2T(Pharmacia, Mechanicsburg, PA) 내로 클로닝된다. pGEX-2T 는 글루타치온 S-전이효소(GST)를 코드화하는 서열과 작동적으로 연결된 IPTG 유도성 프로모터를 함유한다. GST 코딩서열의 3' 말단에는 정확한 리딩프레임으로 트롬빈 분해부위가 존재하며, 또한 GST 에 공유적으로 결합되도록 코딩서열을 삽입시킬 수 있는 편리한 클로닝 부위가 있다.
hEpoR 의 25 내지 250 아미노산 서열을 함유하는 PCR 산물은 적당한 DNA 주형, 예를들어 전체 길이 인간 Epo cDNA 로부터 제조된다. 세포외 영역 코딩서열의 5' 말단 및 BamH1 부위를 함유하는 PCR 프라이머를 제조하고, 세포외 영역 코딩서열의 3' 말단에 상보적인 서열 및 EcoR1 부위를 함유하는 PCR 프라이머를 제조한다. pGEX-2T 내에서 BamH1 부위는 EcoR1 부위의 5'쪽에 GST 코딩 서열과 관련되도록 위치한다. PCR 산물을 pGEX-2T 내로 클로닝하고, 예측되는 크기의 플라스미드를 갖는 형질전환된 대장균 콜로니를 확인한다.
아미노 말단 GST 세그먼트 및 카르복시 말단 EpoR 의 세포외 영역 세그먼트를 함유하는 융합단백질은 IPTG 로 전사(transcription) 유도시킴으로써 형질전환된 대장균내에서 발현시킨다. IPTG 는 융합단백질 코딩서열의 업스트림에 위치한 lac 프로모터에 대한 억제를 해제시킨다. 일정량의 융합단백질이 축적되기에 충분한 시간동안 발현시킨 후, 세포를 파쇄하고 적당한 방법으로 조추출물을 수득한다. 조추출물 혼합물은 융합단백질 외에도 다른 많은 세포 단백질들을 함유한다. 융합단백질, EpoRex-th 는 목적에 따라 추출물로부터 정제될 수 있다.
바람직한 실시예에서, EpoRex-th를 글루타치온(GSH)이 결합된 아가로오스 비이드로 충진된 칼럼에 통과시킨다. GSH 는 GST의 기질이므로, EpoRex-th 의 GST 세그먼트가 높은 친화력으로 고착된 GSH 에 결합할 것이다. 따라서, 융합단백질은 칼럼에 결합되는 반면, 실질적으로 추출물중의 모든 다른 단백질들은 결합하지 않을 것이다. 세척을 완료한후, 환원된 GSH를 액체상에 첨가함으로써 EpoRex-th 를 칼럼으로부터 용출시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서, EpoRex-th를 트롬빈으로 분해함으로써 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역 폴리펩타이드를 얻을 수 있다. 그 결과 생성된 GST 및 Epo-bp를 함유하는 분해 혼합물은 Epo 친화성 칼럼에 적용되어진다. Epo-bp 는 그의 리간드인 Epo 에 결합하는 반면, GST 는 칼럼을 통과한다. 적당한 용출완충액, 예를들어 0.1M 글리신(pH 3.0)을 사용함으로써 Epo-bp 를 순수한 형태로 용출시킬 수 있다.
인간 에리스로포이에틴 수용체의 세포외 영역에 대한 항체는 정제된 폴리펩타이드를 동물의 면역시스템에 노출시킴(presentation)으로써 제조한다. 예를들어,정제된 Epo-bp를 랫트, 마우스, 토끼, 또는 양과 같은 동물에 피하주사, 근육주사, 또는 복강주사로 주입시킬 수 있다. 추가항원자극은 필요에 따라 간격을 두고 주사함으로써 수행할 수 있다. 항원이 주입된 동물의 면역시스템에 의해 Epo-bp 에 대한 순환 항체가 생성되며, 이들 항체는 혈액, 바람직하게는 혈청으로부터 회수할 수 있다. 항-Epo-bp 혈청은 웨스턴 블롯, ELISA 분석법 등과 그외에 다양한 분석법으로 Epo-bp를 검출하는데 이용될 수 있다. 예를들어, 정제된 Epo-bp 제제, 박테리아 또는 진핵세포 추출물, 시험관내 세포배양물로부터의 진핵세포, 혈청시료, 또는 개인으로부터 채취한 생체조직이나 세포로부터 Epo-bp 를 검출할 수 있다. 항-Epo-bp 항체는 Epo-bp 뿐아니라 온전한 인간 EpoR 의 세포외 영역을 인식할 것으로 예측된다. Epo-bp 에 의해 유도되는 모노클로날 항체는 당분야의 공지방법으로 제조할 수 있다(참조: D'Andrea et al., Blood 75: 874-80(1990); Goldwasser et al., U.S. Patent No. 4,558,005; Harlow and Lane, Antibolies-Lab Manual, Cold Spring Harber Laboratory, 1988).
Epo-bp 에 의해 유도된 항체는 바람직하게 EpoR 의 세포외 영역에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는다. 예를들어, 정제된 Epo-bp 10㎍ 을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고 1:2000 의 희석배율로 항-Epo-bp 혈청에 노출시켰을 경우, 정제된 Epo-bp를 주사한 동물의 혈청은 웨스턴 블롯에서 Epo-bp 에 대한 검출 가능한 결합력을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 EpoR의 정제된 세포외 영역은 비-인간 또는 비-Epo 수용체 아미노산 서열을 전혀 함유하지 않는 최초의 순수한 인간 Epo 수용체 단편이다.본 명세서에 개시된 실험들은 이 단편이 인간 Epo 에 특이적으로 결합하는 능력을 보유함을 입증시켜준다. 본 발명의 단백질 및 항체들은 Epo 및 Epo 수용체사이의 상호작용을 이해하는데 유용하다. 본 발명의 정제된 Epo-bp 는 또한, Epo 수용체의 구조를 연구하고 적혈구계 미성숙 세포들의 분화 및 증식 메카니즘을 조절하는데 포함된 인자들을 확인하는데 유용하다. 더구나, 본 발명은 Epo 및 Epo 수용체를 확인하고 정량하는 것 뿐아니라, 악성 혈액질환 및 특수 혈관관계 질병을 이해하는 데도 유용하다. 즉, 적혈구용적(hematocrit) 및/또는 헤모글로빈 수치의 증감이 혈압에 영향을 주거나 기타 순환계 문제를 야기시킬 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 참조함으로써 좀더 잘 이해될 수 있으나, 하기 실시예는 단순히 예시적인 것이므로 특허청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위를 이들 실시예로 한정해서는 안된다.
실시예 1
재료
클루타치온(GSH)-아가로오스, pGEX-2T 발현벡터 및 세파텍스 G-50 은 파마시아(Pharmacia; Mechanicsburg, PA)로부터 구입하였다. PCR 시약은 퍼킨-엘머세투스(Perkin Elmer Cetus; Norwalk, CT)로부터 구입하고 아피겔(Affigel) 15는 바이오라드(BioRad: Richmond, CA)로부터 구입하였다. 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제, 제한효소들 및 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)는 BRL Gibco(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. Geneclean Π는 Bio 101, La Jolla, CA 로부터 구입하였다. 니트로셀룰로오스는 Schleicher ＆ Schuell Co. (Keene, NH)로부터 구입하였다. 화학발광(Chemiluminescence; ECL) 시약 및125I-Epo 는 아머샴(Amersham; Arlington Heights, IL) 로부터 구입하고 표지되지 않은 Epo 는 Chugai-Upjohn(Rosemont, IL)로부터 증여받았다. 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP), 트롬빈, 트립신 및 트리톤 X-100은 시그마 화학회사(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 바이오틴화된(biotinylated) 토끼 항-양 항체 및 아비딘(avidin)-호울스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제는 피어스사(Pierce Co.; Rockford, IL)로부터 구입하였다. 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체(EpoR)의 cDNA 제제인 LAP37 은 예일대학(New Haven, CT)의 버나드 지. 포겟(Bernard G. Forget) 박사로부터 제공받아 사용하였다. 기타의 모든 시약들은 시약등급의 것을 사용하였다.
실시예 2
EpoR cDNA 재조합 벡터의 작제
인간 Epo 수용체의 세포외 영역 코딩서열을 함유하는 PCR 산물 및 플라스미드 벡터 pGEX-2T로부터 재조합 플라스미드 발현벡터 pJYL26을 작제하였다. 플라스미드의 작제방법은 하기에 설명하였다.
PCR 증폭은 전체 길이 인간 EpoR cDNA 인 LAP37을 주형으로 사용하여 수행하였다. 5'-센스 프라이머로는 5'-TTGGATCCGCGCCCCCGCCTAAC-3'을 사용하였다. 이 프라이머는 5' 말단에 BamH1 링커서열을 갖고 있으며, 그 뒤에 전체 길이 인간 EpoR 단백질의 아미노산 25 내지 29를 코드화하는 서열이 따르도록 하였다. 3'-안티센스 프라이머로는 5'-TGAATTCGGGGTCCAGGTCGCT-3'을 사용하였다. 이 프라이머는 EcoR1 링커를 갖고 있으며, 그 뒤에 전체 길이의 EpoR의 아미노산 226 내지 222를 코드화하는 서열에 상보적인 서열이 따르도록 하였다. 퍼킨 엘머-세투스 PCR키트를 사용하고, LAP37 cDNA 0.1㎍, 각 프라이머 20pM, dNTP 혼합물(dGTP, dCTP, dTTP 및 dATP) 1.25mM, Taq 중합효소 0.5㎕ 및 PCR 키트에 공급된 10x 완충액을 혼합하여 PCR을 수행하였다. 프로그래밍이 가능한 PTC-100 열조절기(M.J. Research, Inc. Watertown, MA)를 사용하여 94℃에서 1분간 변성시키고, 55℃에서 1 분간 어닐링(annealing)시킨 다음, 72℃에서 1.5분간 연장시키는 과정을 25회 반복수행하여 증폭시켰다.
PCR 산물(약 600bp) 및 pGEX-2T(약 4.9kb)의 크기를 Seakem 1% 및 Nusieve 아가로오스(FMC Bioproducts, Rockland, ME) 2%를 혼합하여 만든 겔을 1x TA 완충액(총 1ℓ중에 트리스염기 242g 및 아세트산 57.1㎖함유하는 50x TA) 중에서 Hae Π스탠다드와 함께 이동시켜 확인하였다. PCR 산물 및 pGEX-2T를 둘다 제조자의 지시(참조: Bio 101, La Jolla, CA)에 따라 Geneclean Π방법으로 겔 슬라이스로부터 정제하였다. PCR 산물 및 pGEX-2T의 농도를 OD260 에서의 흡광도로 측정하였다. 그 후, 결찰을 수행하기 전에 양 DNA 를 37℃에서 4시간동안 BamH1 및 EcoR1 으로 분해시켰다. 분해산물들을 Seakem 1% 및 Nusieve 2% 아가로오스겔 상에서 분석하였다. PCR 산물 및 pGEX-2T 단편을 둘다 겔로부터 절단해내고 Geneclean Π방법에 의해 다시 정제하였다.
PCR 산물 및 pGEX-2T를 각각 1㎍/㎕로 함유하는 혼합물에서 결찰을 수행하였다. 혼합물을 45℃에서 5 분간 배양하고 0℃로 냉각시켰다. 그 후, 10x 박테리오파아지 T4 DNA 완충액 1㎕, 10x 박테리오파아지 DNA 리가아제 1㎕, 10mM ATP를 가하여 총부피가 10㎕로 되게한 다음, 전체 혼합물을 16℃의 순환수조내에서 하룻밤동안 배양하였다. 생성된 결찰물은 크기 스탠다드, pGEX-2T, PCR 산물, 및 결찰산물(PCR 산물 + pGEX-2T)을 1% 아가로오스 겔의 각 레인(lane)에 적하시키고 1x TA 완충액중에서 100 볼트로 이동시킨 전기영동에 의해 확인하였다. 결찰산물은 약 5.5kb 인 것으로 확인되었다. 그 후, 결찰혼합물 함유분획으로 대장균 균주 JM109 를 형질전환시켰다(결찰혼합물 20㎍ / JM109 200㎕). 형질전환을 위해, 대장균 혼합물을 조심스럽게 위아래로 흔들어 혼합한 후 빙욕중에서 30분간 배양하고 정확히 90초간 42℃에서 배양하였다. 그 다음에 혼합물을 빙욕중에서 1 내지 2 분간 냉각시키고 LB 배지(1ℓ중에 박토-트립톤 10g, 박토-이스트 5g, NaCl 10g 함유, pH 7.5, 멸균) 500㎕를 첨가하였다. 37℃에서 45분간 배양한 후, LB 혼합물을 LB/Amp 아가 페트리 플레이트상에 50, 75, 125, 150 및 300㎖의 양으로 유포시켰다. 아가 페트리 플레이트는 1ℓ LB 배지당 15g 의 아가(멸균) 및 100㎍의 암피실린을 함유하는 20 내지 30㎖ 의 LB/Amp 배지로 제조된 것이다. 대조군 LB/Amp플레이트는 온전한 pGEX-2T, 분해된 pGEX-2T 및 PCR 산물만으로 준비하였다. 플레이트들은 벤치상에서 1 내지 2 시간동안 습기를 흡수하도록 한 뒤 거꾸로하여 37℃에서24시간동안 배양하였다. 성장한 콜로니들을 격자모양으로 칸을 나눈 플레이트에 심고 다시 37℃에서 24시간동안 배양하는 한편, 또다른 세트와 모든 콜로니들을 LB/Amp 배지 각 5㎖ 중에서 하룻밤동안 배양하였다.
각 콜로니로부터 미니프렙(miniprep)법으로 DNA를 추출하였다. 각 클로니를 LB/Amp 배지 (50㎍/㎖ Amp 저장액의 2㎕/㎖) 5㎖와 함께 느슨하게 마개를 닫은 15㎖ 플라스틱 시험관에 넣고 격렬하게 흔들리는 37℃ 인큐베이터중에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 각 배양물 1.5㎖를 4℃, 14,000 ×g 에서 3분간 마이크로원심분리하여 펠렛으로 만들고 STET 93㎕ 및 라이소자임(lysozyme) 저장액 17㎕(STET: 5% 수크로오스 + 5% 트리톤 X-100 + 50mM Tris, pH 8.0 + 50mM EDTA, pH 8.0, 4℃ 보관; 라이소자임 저장액: 5mg/㎖, 냉동기에 저장)중에 재현탁시켰다. 그 후, 재현탁된 혼합물을 실온에서 10분간 방치하고 2 분간 끓인다음, 4℃, 14,000g에서 15분간 마이크로원심분리하였다. 펠렛을 멸균 이쑤시게로 제거하고, RNAse(100mg/㎖) 2㎕를 상등액에 가한 다음 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양후, 빙-냉각된 이소프로판올 110㎕를 가하고 혼합물을 4 회 위아래로 흔든다음 4℃, 14,000g에서 15분간 펠렛으로 만들었다. 펠렛(DNA)을 약 1㎖의 70% 에탄올로 세척하여 잔류된 STET 및 기타 불순물들을 제거하고 다시 4℃, 14,000g에서 15분간 원심분리하였다. 펠렛을 1 내지 2 시간동안 공기중에서 건조시킨 다음 멸균된 dH2O 25㎕ 중에 재현탁시켰다.
추출된 DNA를 TA 완충액중의 0.8% 아가로오스 겔상에서 염색선이 겔 길이의4/5 만큼 이동될 때까지 100 볼트로 전개시켜 확인하였다. 겔을 실온에서 15분간 조용히 진탕하면서 에티듐브로마이드(0.5㎍/㎖)로 염색하고 dH2O 로 15분간 탈염(destaining)시켰다. DNA 밴드를 UV 라이트하에 조사하였다. 예측된 크기의 DNA 를 갖는 배양물을 EcoR1 및/또는 EcoR1 + BamH1 으로 절단한 다음 TA 완충액중의 1% 아가로오스 겔에서 전개시켜 조사하였다. EcoR1 및 BamH1 절단은 시료혼합물을 DNA 2㎍당 EcoR1 또는 BamH1 1㎍의 비율로 제한효소와 혼합하고 제한효소 키트에 포함되어 있는 10x 반응완충액 1㎕와 혼합하여 총부피 10㎕가 되도록한 다음 37℃의 수조에서 2시간동안 배양함으로써 수행하였다. EcoR1 및 EcoR1 + BamH1 으로 절단한 DNA 크기를 1% 아가로오스 겔에서 조사한 다음, 약 5.5kb 크기의 플라스미드를 갖는 하나의 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니내의 플라스미드를 pJYL26 이라 명명하였다. pJYL26 의 다이아그램은 제 1 도 상단에 나타내었다.
실시예 3
EpoRex-th 융합단백질의 정제
본 실시예는 두 개의 세그먼트로 구성된 융합단백질의 생성 및 정제를 기술하고 있다. 첫 번째 세그먼트는 카르복시 말단에 트롬빈 분해부위를 갖는 폴리펩타이드 GST 이고, 트롬빈 분해부위에서 첫 번째 세그먼트에 융합되어 있는 두 번째 세그먼트는 인간 Epo 수용체의 세포외 영역이다. GST 및 Epo-bp를 함유하는 융합단백질 EpoRex-th 는 GSH-아가로오스 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다.
재조합 벡터 pJYL26에 의해 형질전환된 대장균을 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB 배지 400㎖중에 37℃에서 격렬하게 진탕하면서 하룻밤동안 배양하였다. 다음날, 배양물을 새 LB/Amp 배지 4ℓ로 희석시키고 90분간 배양한 다음, 여기에 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)를 1mM 되도록 첨가하였다. IPTG로 4 시간동안 유도한 후에 세포를 4℃, 3,000g 로 15분간 원심분리하여 펠렛으로 만들고, 용해완충액(50mM 소듐포스페이트, pH 7.4, 10mMβ-머캅토에탄올(βME), 10mM EDTA, pH 8.0, 1mM PMSF 및 1mM DFP) 160㎖ 중에 재현탁시킨 다음, 고체 라이소자임 160mg을 첨가하였다. 60cc 주사기를 사용하여 용해된 세포 현탁액을 18, 21 및 23 게이지(gauge)의 바늘을 3번씩 통과시켜 균질화시키고 얼음위에서 30분간 방치하였다. 드라이아이스/메탄올 동결 및 37℃에서의 해동과정을 3 회 반복하고 약하게 초음파처리한 다음, 트리톤 X-100을 1% 되도록 첨가하였다. 4℃, 15kg 에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
GSH-아가로오스 칼럼은 팽윤된 GSH-아가로오스 비이드를 10배 베드-부피(bed-volume)의 포스페이트-완충된 식염수(PBS: 16mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4, pH 7.4, 3M NaCl의 과량의 염)로 3회 세척하여 방부제 및 용출성 덱스트란을 아가로오스로부터 제거함으로써 준비하였다. 그 후, 칼럼을 5 베드-부피의 등장성 PBS로 평형시켰다. IPTG 유도된 추출물을 칼럼에 적용하고 칼럼을 5 베드-부피의 PBS 로 2 회 세척하여 GSH-아가로오스에 친화성을 갖지 않는 모든 단백질들을 용출시켰다. 그 후, 5 베드-부피의 용출 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0 중에 5mM 환원된 GSH 함유)을 가하여 EpoRex-th 를 1.0㎖의 분획으로 용출회수하고 각 분획의 A280을 측정한 결과를 제 2a 도에 나타내었다. 분회 18 내지 23 이 EpoRex-th 단백질을 함유하는 것으로 나타났으므로 이들 분획을 합하였다. 4ℓ의 세포배양물로부터 평균 2mg 의 EpoRex-th를 수득하였다.
실시예 4
Epo-bp 의 정제
제 1 도 하단에 도식화한 바와 같이, EpoRex-th 는 트롬빈-특이적 단백질분해 절단부위를 함유하고 있다. 트롬빈은 제 1 도에 나타낸 바와 같이 -CTG GTT CCG CGT GGA TCC- 서열이 코드화하는 아미노산 서열 Leu Val Pro Arg Gly Ser 부위를 특이적으로 분해한다(참조: Smith and Johnson, Gene 67: 31-40(1988)). Epo-bp 세그먼트로부터 GST 세그먼트를 절단해내기 위하여 EpoRex-th 를 트롬빈과 함께 배양한 다음, 하기 기술한 바와 같이 Epo-아가로오스 친화성 칼럼을 이용하여 두 개의 세그먼트를 각각 분리하였다.
가장 효과적인 트롬빈 분해 범위를 찾기 위하여 다양한 농도의 트롬빈에 대해 시험하였다. 정제된 EpoRex-th 를 실온 또는 37℃, PBS 완충액(pH 7.4) 중에서 1 시간동안 EpoRex-th 60㎍ 당 각각 0.0125, 0.125, 0.6 또는 2.4㎍의 비율의 트롬빈과 배양한 다음, 그 결과를 폴리아크릴아미드 겔(12.5%) 전기영동으로 분석하였다. 쿠마시 블루로 염색한 다음, 융합단백질 EpoRex-th (55kDa), Epo-bp (29kDa) 및 GST (26kDa)에 해당하는 밴드들을 관찰하였다. EpoRex-th 의 완전분해를 위한 트롬빈 농도는 0.6㎍으로 선택되었으며, 그 결과는 제 3 도에 나타내었다.
트롬빈으로 분해하기 위하여, EpoRex-th 60㎍을 트롬빈 0.6㎍과 함께 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 혼합물을 트리스 완충된 식염수(TBS) 또는 PBS 로 평형시킨 에리스로포이에틴-아가로오스 칼럼에 적용하였다. Epo-bp를 0.1M 글리신 완충액(pH 3.0)으로 용출시켰으며, 0.5㎖씩의 분획을 미리 2M Tris-HCl(pH 7.5) 0.5㎖씩을 함유하고 있는 시험관에 받았다. Epo-bp 의 최고농도치 피크에 해당하는 14 내지 19 분획을 합한 다음, 이후의 실험을 위하여 4℃의 TBS 또는 PBS 중에서 하룻밤동안 투석하였다. 4ℓ의 세포배양물로부터 대략 200㎍의 Epo-bp를 수거하였다.
Epo-아가로오스 비이드를 사용하여 Epo-아가로오스 칼럼을 준비하였다. Epo-아가로오스 비이드는 4℃의 0.1M 3(N-모폴리노)-프로판설폰산(MOPS)중에서 Epo(0.5mg/㎖)를 하룻밤동안 투석함으로써 준비하였고, 이 투석된 Epo-용액 1㎖ 및 세척된 아피겔(Affigel) 15 2㎖를 혼합하고 실온의 회전진탕기에서 2시간동안 배양함으로써 Epo를 아피겔 15 비이드에 결합시켰다. 2000g에서 30초간 마이크로원심분리한 다음 상응액을 제거하였다. 충진된 Epo-아가로오스 비이드를 4℃ 에서 TBS 또는 PBS 로 3 회 세척하고 사용할 때까지 보관하였다. 목적하는 단백질 분획을 회수한 다음, Epo-아가로오스 비이드를 TBS 또는 PBS 로 오래 세척하고 재사용할 때까지 4℃에서 보관한다.
실시예 5
Epo-bp 에 대한 항체의 생성
본 실시예는 정제된 Epo-bp 에 대한 항체의 생성을 기술하고 있다. 정제된 Epo-bp를 12.5% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고 Epo-bp 단백질 밴드를 PBS 등 장액중에 재현탁시킨 후 양에 주입시킨다. 항-Epo-bp 항체를 함유하는 양 혈청은 그 혈청을 1:2000으로 희석시켰을 때 정제된 인간 Epo-bp 를 검출하는 것으로 나타났다.
상기 언급한 바와 같이 정제된 Epo-bp(0.5mg)를 2x 처리 완충액(라믈리; Laemmli)과 혼합하고 10분간 끓인 후, 혼합물을 12.5% SDS 겔에 적용하고 200 볼트로 3 내지 4 시간동안 전기영동하였다. 겔을 0.125% 쿠마시 블루로 하룻밤동안 염색하고 dH2O 로 1 내지 2 시간동안 탈염시킨 다음, 면도날로 겔에서 Epo-bp 밴드를 절단해내었다.
Epo-bp 겔 슬라이스를 PBS 완충액 10 내지 15㎖중에 재현탁시킨 다음, 겔이 작은 조각으로 분쇄되어 PBS 와 현탁혼합물을 형성할 때까지 반복하여 주사기를 통과시켰다. 현탁액을 성숙한 양에 피하주사하는데, 이때 동물 체중 25kg 당 Epo-bp 0.5mg 이상의 비율로 Epo-bp를 주사하였다. 최초의 주사 후 3 주마다 1회 씩 초기와 동일한 용량으로 2회의 추가항원자극을 수행하였다. 두 번째 추가 항원 자극후, 혈액을 채취하여 항체를 수거할 수 있다. 그 동물내에서 지속적으로 항체가 생성되도록 하기 위해서는 매달 1회씩 주사하여야 하며, 동물의 각 부위를 돌아가며 주사한다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 18, 1989).
주사한 동물로부터 채혈하기 위해, 채혈부위의 털을 깎고 70% 알콜로 소독하였다. 귀동맥 또는 다른 접근가능한 동맥을 찾아 털을 깎은 후 소량의 크실렌을 귀 끝에 바르나 채혈부위는 피하였다. 혈액을 나비모양의 바늘로 천천히 뽑아 헤파린이 포함되어 있지 않은 유리 시험관에 받았다. 혈액을 실온에서 1 시간동안 방치하여 응고시킨 후 파스퇴르 피펫으로 시험관 벽으로부터 혈병(clot)을 분리시킨 다음, 시험관을 4℃에서 하룻밤동안 보관하였다. 응고된 혈액 혼합물을 접시에 쏟고 혈병을 제거하였다. 응고되지 않은 나머지 부분을 다시 유리시험관으로 옮기고 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. Epo-bp 의 정제에 관해 상기 기술한 것과 동일한 방법에 따라 상등액(혈청)을 Epo-bp 친화성 칼럼에 적용한 다음, 칼럼에 결합된 항체를 0.1M 글리신 완충액(pH 3.0)으로 용출시켰다. 용출액을 4℃의 PBS 완충액중에서 하룻밤동안 투석하고 500㎕씩의 분취량(aliquot)으로 나누어 -70℃에서 보관하였다. Epo-bp 친화성 칼럼은 하기 실시예 6 에 기재된 Epo-bp 아피겔 비이드에 대한 것과 동일한 방식으로 수행하여 Epo-bp 및 아피겔 15 아가로오스 비이드로부터 제조하였다.
이 실시예에서 사용된 용액들은 다음과 같이 제조한다.
용해 완충액 Π: 50mM NaPO4(0.5M 이염기성 PO47.74㎖ + 0.5M 일염기성 PO42.26㎖) + 10mMβ-머캅토에탄올 + 10mM EDTA, pH 8.0.
PBS 완충액: 0.15M NaCl + 16mM 이염기성 PO4+ 6mM 일염기성 PO4, pH 7.4.
TBS 완충액: 총 1ℓ 중에 2M Tris-HCl 12.5㎖, pH 7.4 + 5M NaCl 27.5㎖ 함유.
2x 처리(마믈리) 완충액: 0.125M Tris-HCl, pH 6.8 + 4% SDS + 20% 글리세롤 + 10% 베타-머캅토에탄올.
문헌(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재되어 있는 웨스턴 블롯팅법 및 ECL 제조자(Amersham Co., Arlington Heights, I1)에 의해 제공된 웨스턴 블롯팅 프로토콜(protocol)에 따라, 정제된 Epo-bp dp 대한 양 항-Epo-bp 혈청의 결합력을 분석하였다. EpoRex-th를 트롬빈으로 절단한 다음 Epo-bp 및 GST 를 SDS-PAGE 겔상에서 전기영동으로 분리하였다. 그 후, 겔을 니트로셀룰로오스상에 블롯(blot)시킨 다음(참조: Schleicher and Schuell Co., Keene, NH), 블롯토(Blotto; 총 1ℓ중에 탈지분유 80g, 5M NaCl 30㎖, 2M Tris-HCl 10㎖, pH 7.5 및 0.05% Tween-20)중의 니트로셀룰로오스에 양 항-Epo-bp 혈청을 1:2000의 희석배율로 가하고 실온에서 천천히 진탕하면서 1 시간동안 배양하였다. 1 차 항체를 세척한 후, 2 차 시약인 바이오틴화된 토끼 항-이뮤노글로블린 항-양 항체를 1:10,000 으로 희석하여 블롯토중의 니트로셀룰로오스에 가하고 다시 1 시간동안 실온에서 진탕배양하였다. 다시 세척한 후, 호울스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제-아비딘(1:10,000 희석)을 가하고 혼합물을 실온에서 45분간 배양하였다. 세척된 니트로셀룰로오스를 재빨리 화학발광(ECL) 시약에 담근 후에, 젖은 상태의 블롯을 즉시 KODAK X-ray 필름에 노출시킨다. 제 4 도는 각 레인(lane)에 하기와 같이 단백질들이 적용된 웨스턴 블롯의 사진을 나타낸다: 레인 1, 분자량 스탠다드; 레인 2, 트롬빈 분해된 EpoRex-th; 레인 3, GST; 레인 4, 정제된 Epo-bp. 제 4 도의 레인 4 로부터 알 수 있듯이, 정제된 Epo-bp 는 1:2000 비율로 희석된 항-Epo-bp 항체에 의해 탐지되었으며, 정제된 Epo-bp 의 겉보기 분자량은 약 29kDa 으로 측정되었다.
실시예 6
Epo-bp 에 대한 Epo 의 결합
본 실시예는 Epo-bp 에 대한 Epo 의 리간드 결합 및 결합에 있어서의 Epo 농도에 따른 효과를 나타내고 있다.
PBS 중의 세척된 아피겔 15 아가로오스 비이드에 Epo-bp를 60㎍/㎖ 농도로 첨가하여 단백질의 최종농도가 Epo-bp 비이드 1㎖ 당 대략 30㎍ 으로 되도록 Epo-bp 비이드를 제조하였다. 혼합물을 실온의 회전 플랫폼(flatform)상에서 2 시간동안 배양하였다. 빙냉각된 PBS 완충액으로 3 회 세척한 다음, 펠렛을 PBS 완충액 1㎖ 중에 재현탁시켰다. 결합분석을 위해, 최종 현탁액 30㎕(Epo-bp 약 1.0㎍)를 다양한 농도의125I-Epo 와 혼합하고 매 5 분 간격으로 피펫으로 재현탁시키면서 실온에서 1 시간동안 배양하였다. 배양 완료시에 빙냉각된 PBS 완충액 1㎖를 가하여 반응하지 않은125I-Epo를 세척해내고 2 회 더 세척하였다. 반응한 비이드를 감마 계수기로 계수하였다. 온전한 Epo-bp 보다 더 작은 크기로 트립신 분해된 추출물(하기 참조)중에 존재하는 단백질들도 동일한 방식으로 리간드 결합에 관한 효과를 테스트하기 위해 적용하였다. 비특이적 결합의 측정은 표지된 Epo를 첨가하기 전에 혼합물을 1 시간동안 200배 과량의 비표지된 Epo 와 미리 배양하는 점을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다.
Epo 에 대한 Epo-bp 의 결합을 제 5 도에 나타내었다. 제 5 도의 각점은 2 내지 4회 실험의 평균치이며, 데이터는 평균치 ± SEM 으로 나타내었다.
p 수치가 0.05 미만일 때 유의성 있는 것으로 보았으며, 결과들은 2-테일드 스튜던트 t-테스트(two-tailed Student t-test)로 분석하였다. Epo-bp 에 대한 Epo 의 특이적 결합활성은 Epo 농도가 증가함에 따라 급격히 증가하였으며;125I-Epo 의 농도를 8nM에서 12nM로 증가시키면 결합활성은 3 배로 증가하였다. 12nM 농도에서 Epo 결합이 포화상태에 이르는 것처럼 보여지며, 이는125I-Epo 의 반응하지 않은 상등액에서도 확인되었다. Epo-bp에 대한125I-Epo 의 결합은125I-Epo 가 8nM 이상인 농도 조건에서 비표지된 Epo 존재하에 심각하게 억제되었다 (양 비교에서 p ＜ 0.0001). 비특이적 결합은 예상했던 것보다 다소 높았다. 웨스턴 블롯 및 결합 분석에서 나타난 바와 같은 Epo-bp 에 대한 Epo 결합의 민감성 및 특이성으로 인하여 과량의 비표지된 Epo 가125I-Epo 의 결합을 완전히 제거할 수도 있을 것으로 기대된다.
리간드 결합에 포함되는 Epo-bp 의 최소한의 서열을 확인하기 위하여 트립신 분해 실험을 수행하였다. Epo 수용체 단백질에는 여러개의 아르기닌 및 리신 부위가 존재하므로 이들이 트립신 분해의 특이적 부위로 될 수 있다. Epo-bp 의 트립신 분해는 총 200㎕ 부피의 PBS 중에 Epo-bp 5㎍당 10, 20, 30, 50, 100㎍ 및 2mg 의 비율로 트립신을 첨가하고 pH 6.7, 37℃ 의 조건하에 3 또는 6시간동안 반응시켜 수행하였다. 분해반응은 동일 부피의 2N 아세트산을 가하거나 끓임으로써 중지시켰다. 제 6 도로부터 알 수 있듯이, 20㎍ 이상의 트립신이 존재하는 경우 Epo-bp 가효과적으로 분해되었다. 트립신은 2mg의 트립신이 함유된 레인에서 23.2kDa 단백질 밴드로 가시화된다. 트립신에 의해 분해된 Epo-bp 는 20kDa 분자량의 단백질로 가시화된다. 제 6 도에서 레인 1 은 표준 분자량 마커를 나타내고, 레인 2 는 대조군이며; 레인 3 내지 8 은 각각 10, 20, 30, 50, 100㎍ 및 2mg 농도의 트립신 존재하에 37℃에서 3 시간동안 반응시킨 분해물을 나타내고; 레인 9 내지 14 는 동일농도의 트립신 존재하에 37℃에서 6 시간동안 반응시킨 분해물을 나타낸다.
분해되지 않은 Epo-bp 가 대략 30 kDa 이므로, 파마시아 세파덱스 G-50(MW≤30,000)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 분자량 30,000 이하의 단백질 단편들을 총 혼합물로부터 분리하였다. 분말상의 세파덱스 G-50을 수화시키고 등장성 PBS로 수회 세척하여 방부제들을 제거하였다. 트립신에 의해 분해된 EpoRex-th를 겔 칼럼의 상단에 총 0.2㎖ 부피의 PBS 용액으로 적용하였다. 칼럼을 실온의 날개 회전자(swinging-bucket rotor) 내에서 2,000g 로 4 분간 원심 분리하였다. 주사기를 사용한 이 칼럼 하단에 뚜껑을 벗긴 마이크로원심분리 시험관을 받혀 밑에서부터 첫 번째 유출액(∼0.2㎖)을 회수하였으며, 이 유출액은 Epo-bp 보다 크기가 큰 단백질을 함유하고 있다. PBS 완충액 0.2㎖를 칼럼에 더 가하고 10분간 다시 원심분리함으로써 두 번째 용출액을 또다른 뚜껑을 벗긴 마이크로원심분리 시험관에 회수하였으며, 이 단계를 2 회 반복하였다. 두 번째 용출액을 Epo-아가로오스 칼럼에 적용하고 피크부분의 분획을 SDS-PAGE 겔 및 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. 제 6 도에 나타낸 바와 같이, 트립신으로 분해한 Epo-bp의 최종 산물은 대략 20 kDa 이었다. 항체는 분해된 Epo-bp를 인식하지 못하였다. 트립신 분해에 의해 Epo-bp 로부터 30개의 아미노산이 제거되면 이 분해된 Epo-bp에 대한 항체의 인식도 완전히 배제되는 것이 웨스턴블롯팅에서 확인되었다.
상기의 자세한 설명은 본 발명에 대한 이해를 증진시키기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 자명한 정도의 변형은 첨부된 청구범위 영역내의 것으로 이해되어야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 카르복시 말단에 트롬빈 분해부위를 갖는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 첫 번째 뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체의 cDNA 코딩 서열중 뉴클레오티드 73 내지 750을 필수적으로 포함하며, 상기 트롬빈 분해부위의 3' 에 위치하고 상기 첫 번째 서열에 해독적으로(translationally) 연결되어 있는 두번째 뉴클레오티드 서열
    을 함유하는 발현벡터.
  2. (a) 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가지며, 카르복시 말단에 트롬빈 분해부위를 포함하는 첫 번째 폴리펩타이드 세그먼트; 및
    (b) 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질중 아미노산 서열 약 25 내지 약 250을 필수적으로 포함하며, 상기 첫 번째 폴리펩타이드 세그먼트의 카르복시 말단에 공유적으로 결합된 두 번째 폴리펩타이드 세그먼트를 필수적으로 포함하는 정제된 융합단백질.
  3. 인간 에리스로포이에틴과 결합할 수 있고 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질중 아미노산 서열 약 25 내지 약 250 을 필수적으로 포함하는 정제된 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드.
  4. 인간 에리스로포이에틴과 결합할 수 있고 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질중 아미노산 서열 약 25 내지 약 250 을 필수적으로 포함하는 정제된 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 정제된 항체.
  5. (a) 고체상 면약분석 시약; 및
    (b) 상기 시약에 작동적으로 결합된 제 3 항의 단백질
    을 함유하는 면역분석 조성물.
  6. (a) 고체상 시약; 및
    (b) 상기 시약에 작동적으로 결합된 제 4 항의 항체
    를 함유하는 면역분석 조성물.
  7. (a) 제 2 항의 정제된 융합단백질을 준비하고;
    (b) 융합단백질로부터 인간에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드를 절단할 수 있는 조건하에 상기 융합단백질을 트롬빈으로 처리하여 분해 혼합물을 형성하고;
    (c) 상기 폴리펩타이드로 하여금 고체상 시약과 결합하도록 하는 조건하에 에리스로포이에틴이 결합되어 있는 고체상 시약에 상기 분해 혼합물을 첨가하여 폴리펩타이드-고체상 조성물을 형성하고:
    (d) 상기 폴리펩타이드-고체상 조성물을 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고;
    (c) 상기 폴리펩타이드-고체상 조성물로부터 폴리펩타이드를 용출시키는 과정을 포함하여,
    에리스로포이에틴과 결합할 수 있고 전체 길이 인간 에리스로포이에틴 수용체 단백질중 아미노산서열 약 25 내지 약 250 을 필수적으로 포함하는 실질적으로 순수한 인간 에리스로포이에틴 수용체 폴리펩타이드를 수득하는 방법.
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