JPH10512445A - Ｉｌ−２ｒ結合ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、インターロイキン-2レセプター(IL-2R)と会合するポリペプチド、p43 に関する。特にIL-2R のβ及びγサブユニットに結合し、 NAD⁺を結合することもできる。本発明は、更に、p43 をコードする核酸分子に関し、特にp43 を結合する抗体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＩＬ−２Ｒ結合ポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ分子 発明の分野 本発明は、ポリペプチドp43 、 NAD⁺、インターロイキン２受容体(IL-2R)β鎖 又はIL-2R γ鎖の少なくとも２種の結合部位を含むポリペプチド、前述のポリペ プチドのコード情報を含む核酸分子、前述のポリペプチドに特異的な抗体、アン チセンスオリゴヌクレオチド、前述のポリペプチド又は核酸を含む医薬組成物、 及び前述のポリペプチドの生産方法に関する。 発明の背景 インターロイキン2(IL-2)は、造血細胞の増殖及び分化の調節に重要な役割を 果たしている(27，29)。IL-2は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)活性化、及 び細胞増殖に重要である核プロトオンコジーン発現(16，29)を含む特定の細胞表 面受容体(IL-2R)(30)に結合することによって多数の生物活性を与える。IL-2Rは 、少なくとも３種類の異なるサブユニット；α鎖、β鎖及びγ鎖を有する(5,9， 28)。それらのサブユニットの中でIL-2R β鎖とγ鎖は共に細胞外ドメインにお いて４つの保存システインと Trp-Ser-X-Trp-Serの配列(“WSモチーブ”)を特徴 とするサイトカイン受容体の新たに同定されたスーパーファミリーに属する(1,2 )。特に、IL-2R サブユニットはいずれも PTK活性のような既知の触媒活性をも たない。 IL-2R サブユニットの異なる組合わせの発現は、種々の形のIL-2R を生じ、各 々がIL-2に対して異なる結合親和性を示す(28)。“高親和性”IL-2R(Kd; 10^-11M )は、ヘテロ三量体α鎖、β鎖及びγ鎖からなり、“中間親和性”IL-2R（Kd; 10^-9 ）は、ヘテロ二量体β鎖及びγ鎖から生じ、“低親和性”IL-2R（Kd; 10^-8） は、α鎖のみの発現によってつくられる。IL-2R β鎖は、２８８個のアミノ酸(a .a.)からなる最大の細胞質ドメインを有し、IL-2シグナル導入に重要な役割を果 たすことがわかった(8)。本来は内在IL-2R α鎖及びγ鎖を発現するがβ鎖を発 現しないマウスIL-3依存性プロＢ細胞系 BAF-B03にヒトIL-2R β鎖cDNAを導入す ると、 それらの細胞はIL-2R に応答して増殖することができた(3，8)。IL-2R β鎖の欠 失変異cDNAによる発現実験から、“セリンを多く含んだ”領域(S領域)と呼ばれ るIL-2R β鎖の限定細胞質領域が BAF-B03細胞のIL-2R 刺激による c-myc遺伝子 誘導及びマイトジェン形成に不可欠であることがわかった(26)。“酸性”領域(A 領域)と呼ばれる酸性アミノ酸に多く含んだIL-2R β鎖の他の細胞質領域は、S領 域のほかに BAF-B03細胞のIL-2R 刺激による srcファミリー PTK活性化及び p21^ras 活性化並びに c-fos/c-jun遺伝子導入に必要である(6，7，17，24，26)。い くつかの証拠から、IL-2R γ鎖がIL-2R 誘導シグナル導入に重要であることも示 されている(29)。更に、IL-2R γ鎖は、IL-2、IL-4及びIL-7受容体及びおそらく 他のサイトカイン受容体の間で共有された共通の成分であることが示されている (14，15，21，23)。IL-2R γ鎖の突然変異は、 T細胞発生の欠陥を示す重篤なＸ 連鎖性複合型免疫不全患者に見られ、サイトカインシグナリングにおけるIL-2R γ鎖の重要な役割が証明された。更に、最近の研究により、IL-2R β鎖とγ鎖の 細胞質ドメイン間の機能協力がIL-2シグナリングに重要であることが示された(1 1，19，20)。 正常な身体機能及び疾患にIL-2R 仲介過程が重要であることから、それらの過 程をより理解することが求められていると共にそれらに影響する新規な手段が求 められている。 発明の開示 本発明は、新規なIL-2R 結合タンパク質、p43 、及びp43 のコード情報を有す る核酸分子を提供する。好ましくは、該p43 ポリペプチドは、配列番号２(図1A 参照): 又は配列番号４(図1B、マウスp43 参照): のアミノ酸配列を有する。 本発明は、更に、p43 様活性をもつポリペプチド又はp43 の機能誘導体に関 し、特に、少なくとも NAD⁺とIL-2R β鎖、 NAD⁺とIL-2R γ鎖、又はIL-2R β鎖 とIL-2R γ鎖の結合部位を含むポリペプチドに関する。機能誘導体は、p43 の変 異体、断片、化学誘導体、又は融合タンパク質とすることができる。 他の態様においては、本発明は、p43 、p43 様活性をもつポリペプチド、又は 機能誘導体のコード情報を有する核酸分子に関する。好ましくは、本発明の核酸 は、配列番号１(図1A参照): のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１のヌクレオチド配列を有す る前記核酸分子の縮重変異体、又は配列番号１を有する核酸分子に対してハイブ リッド形成することができる核酸分子、又は前述の核酸分子のいずれかのヌクレ オチド配列の一部を含む核酸分子、又は前述の核酸分子のいずれかの断片である 。好ましくは、配列番号１の一部を含むかかる核酸分子は、配列番号９： のヌクレオチド配列、又は配列番号９の縮重変異体を含む。 本発明の核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子に対し て、好ましくは50％を超える、更に好ましくは70％を超える、更に好ましくは80 ％を超える、更に好ましくは90％を超える相同性、又は配列同一性を選ぶ条件下 でハイブリッド形成することができる。ハイブリッド形成することができるかか る核酸分子は、好ましくはp43 様生物活性及び／又は免疫活性をもつポリペプチ ド、更に好ましくは NAD⁺、IL-2R β鎖、又はIL-2R γ鎖のp43 結合部位の少な くとも１種、更に好ましくは前記結合部位の少なくとも２種を有する前記ポリペ プチドのコード情報を含む。 本発明の他の態様は、前述の核酸のいずれかのヌクレオチド配列を含むベクタ ー、特に前記ヌクレオチド配列が発現ベクターのように発現調節配列に作用上結 合される場合に含むベクターである。 本発明の別の態様は、記載されたベクター、特に発現ベクターをもつ宿主細胞 である。かかる宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞とすることができる。かかる 宿主細胞は、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞である。前記宿 主細胞は、更に好ましくは E．coli細胞又はCOS 細胞である。 従って、本発明の別の態様は、組換え発現によるp43 、p43 の機能誘導体、又 はp43 様活性をもつポリペプチドの生産方法である。かかる方法は、p43 、p43 の機能誘導体、又はp43 様生物活性をもつポリペプチドのコード情報を含む発現 ベクターをもつ記載された宿主細胞を、前記コード情報が前記宿主細胞によって 発現される条件下で培養し、発現したポリペプチドを単離することを特徴とする 。 本発明の別の態様は、p43 、p43 の機能誘導体、又はp43 様活性をもつポリペ プチドに特異的な抗体分子である。かかる抗体分子は、ポリクローナル又はモノ クローナル抗体、完全免疫グロブリン又はその断片、特に Fab′又はF(ab)₂フラ グメント、組換え抗体又は抗体断片、例えば、組換え単鎖抗体(scFv)、キメラ抗 体、二重特異性抗体、又は人化抗体とすることができる。 好ましくは、かかる抗体分子は、下記のアミノ酸配列: の１種に特異的であり、配列番号11が好ましい。 本発明の別の態様は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の一部に対応する アンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるオリゴヌクレオチドの好適実施 態様は、配列番号８の配列: 5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT- 3′を有する。 本発明の別の態様は、p43 、p43 の機能誘導体、又はp43 様活性をもつポリペ プチド、前述のポリペプチドのいずれかのコード情報を含む核酸、又は前記核酸 分子のヌクレオチド配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物 である。かかる医薬組成物は、IL-2R 関連疾患の治療及び診断に用いられる。 本明細書に用いられる“p43 様活性をもつポリペプチド”は、p43 に実質的に 類似している生物活性を示すポリペプチドである。これは、例えば、 NAD⁺、IL- 2R β鎖、及び／又はIL-2R γ鎖へのp43 の結合特性についてp43 と共通の構造 又は触媒特性を１つ以上、好ましくは少なくとも２つもつことを意味する。本明 細書に用いられるp43 の“機能誘導体”は、p43 の生物活性に実質的に類似して いる生物活性（機能或いは構造）をもつ化合物である。生物活性の例としては、 p43 の天然リガンドへの結合能、好ましくは NAD⁺、IL-2R β鎖、又はIL-2R γ 鎖の少なくとも２種を結合する能力が含まれる。両者の分子が実質的に類似の構 造をもつ場合又は両者の分子が類似の生物活性をもつ場合には一つの分子はもう １つの分子に“実質的に類似”していると言われる。p43 の“機能誘導体”とし ては、p43 の断片、変異体、化学誘導体又は融合タンパク質が含まれる。“p43 の断片”という語は、その分子のポリペプチドサブセットを表すことを意味する 。“p43の変異体”という語は、全分子、又はその断片に構造が実質的に類似し た分子を表すことを意味する。但し、その変異体はp43 の活性に類似しているか 或いはp43 の活性に阻止する少なくとも１種の生物活性をもっている。p43 の変 異体 は、１個以上のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失又は付 加によりp43 と異なることができる。好ましくは、変異体は NAD⁺、IL-2R β鎖 、又はIL-2R γ鎖の少なくとも２種を結合する能力を有する。“p43の化学誘導 体”は、p43 から化学反応、例えば、ヨウ素化、アセチル化、又は放射性同位元 素又は毒素への結合により誘導された分子である。“p43の融合タンパク質”は 、p43 遺伝子の全部又は一部を他の遺伝子又は核酸の全部又は一部に融合した枠 内コード情報を含むものの組換え発現によりつくられたポリペプチドである。核 酸分子の“縮重変異体”は、遺伝コードの縮重により、第１核酸分子と比べて異 なるヌクレオチド配列を有しかつ第１核酸分子と同じアミノ酸配列をコードする 第２核酸分子である。核酸分子の“断片”は、第１核酸分子の核酸配列の一部を 表すヌクレオチド配列を有する第２核酸分子を意味する。 本発明を実施する１つの方法は、タンパク質産物がIL-2R γ鎖と相互作用する ことができるcDNAを単離する方法である。IL-2R γ鎖と相互作用することができ るタンパク質をコード化するヒトcDNAを選別するために、(37)及び(4)に記載さ れた二ハイブリッドスクリーニング法が用いられる。概要としては、IL-2R γ鎖 をコードするDNA(28)、又はその一部がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomy ces cerevisiae)GAL4タンパク質の、特定のDNA 配列に結合することができる(UA S_G)Ｎ末端ドメインをコードするDNA に融合される。次に、その構築物が発現ベ クターに組込まれ、GAL4が欠失した酵母株に形質転換される。選別されるべきcD NA収集物は発現ベクターに組込まれ、個々のcDNA分子がGAL4の転写活性化ドメイ ンをコードするDNA に融合される。得られた構築物はIL-2R γ鎖構築物で前形質 転換された同じ酵母株に形質転換される。問題のcDNA、即ち、IL-2R γ鎖に結合 することができるポリペプチドをコードするcDNAをもつ酵母細胞において、それ らの分子は同じ細胞内で発現されるIL-2R γ鎖ポリペプチドに結合し、２つのGA L4ドメイン（IL-2R γ鎖に融合したDNA 結合ドメインと問題のcDNAに融合した転 写活性化ドメイン）を共に架橋する。その相互作用の結果として、GAL4/UAS_Gに よって調節された遺伝子の転写が起こる。それは、例えば、周知のβ−ガラクト シダーゼ／ガラクトース系を用いる適切な選択系に用いられる。例えば、LexAタ ンパク質とIL-2R γ鎖の融合遺伝子が構築され、適切な酵母細胞に 形質転換される。得られた形質転換細胞はpACTヒトcDNAライブラリー(4)で連続 して形質転換され、形質転換細胞はスクリーニング法に供される。形質転換細胞 は選択のもとに置かれ、生存コロニーについてβ−ガラクトシダーゼを生産する 能力が選別される。GAL4転写活性化ドメインに融合した部分的オープンリーディ ングフレームからなる正のクローンが同定される。かかる正のクローンのcDNA挿 入断片を用いてオーバーラップcDNAが得られる。オーバーラップ断片から標準の 手順によって全長cDNAクローンが得られるか又は構築される。次に、このように して得られたcDNAを用いて関連ポリペプチドを同定するためにマウスのような他 の種からの他のcDNAライブラリーを選別することができる。それは、同様に標準 の手順で行われる。 本発明の情報、特に図1A及び図1Bの配列情報があれば、本発明のポリペプチド 及び核酸分子は標準の手順で生成される。例えば、図1Aのヌクレオチド配列を有 する核酸分子は、化学合成によって生成される。代替的方法は、図1Aに示された ヌクレオチド配列の一部に対応するオリゴヌクレオチド又はDNA 断片を化学的に 合成する方法及びハイブリッド形成によって適切なcDNAライブラリー又はゲノム ライブラリーを選別する方法である。そのようなオリゴヌクレオチド又はDNA 断 片をどのように設計するか、ライブラリーをどのように作成するか、及びそのよ うなライブラリーをオリゴヌクレオチド又はDNA 断片とハイブリッド形成するこ とによりどのように選別するかの詳細なプロトコールは、標準実験マニュアル、 例えば(32)、特にchap.7，8，9，11 & 12 に見られ、その内容を参考として本明 細書に引用する。その中で、あるプローブに適切なハイブリッド形成条件、例え ば、完全な適合(100％の相同性)、又は50％、70％、80％又は90％の相同性を選 択する条件をどのように調整するかも教示されている(32、p.11.45-11.57)。例 として、ヒトp43 cDNAをプローブとして用いて、３×SSC 中65℃でハイブリッド 形成するとアミノ酸レベルで約90％の相同性を有するマウスp43 cDNAが選択され る。また、p43 、又はその断片のコード情報を含む核酸は、標準実験プロトコー ルのポリメラーゼ連鎖反応によってcDNAライブラリーから生成される(32，chap. 24)。 検討中のp43 又はその機能誘導体をコードする核酸、特に図1Aのコード配列 （図1Aのヌクレオチド配列の位置246 のＡから始まり位置1433のＴで終わる）を 用いて、当業者は原核細胞或いは真核細胞において標準プロトコールに従って組 換え発現によりポリペプチドを生産することができる（例えば、32、特に chap. 16 & 17参照）。その目的のために、問題のコード配列を含む核酸分子は、発現 調節配列に作用上結合される発現ベクターに組込まれる。その発現ベクターは、 選ばれた宿主細胞の特別な要求に適応する。発現は、調節可能である。次に、発 現ベクターは、選ばれた宿主細胞に導入される。適切な条件下で培養する際に、 宿主細胞はp43 ポリペプチド又はその機能誘導体を合成する。発現系は、発現し たポリペプチドを培養液に分泌させることができる。次に、ポリペプチドは、宿 主細胞或いは発現したポリペプチドが培養液に分泌される場合には培養液から単 離される。p43 又はその機能誘導体の発現の個々の例は下記に記載される。 本発明の情報、特に図1A又は図1Bの配列情報があれば、当業者はp43 の機能誘 導体を構築することができる。それは、機能誘導体のコード情報を含むDNA 分子 を構築し、そのDNA 分子を発現ベクターに組込み、その発現ベクターを宿主細胞 に導入し、前記機能誘導体をコードする前記DNA 分子を発現することにより達成 される。例えば、当業者はp43 をコードするDNA 分子の断片を作製することがで き、前記DNA 断片は完全配列の一部のみ含み、その断片を発現する。得られたポ リペプチド断片の機能分析については、当業者はp43 、 NAD⁺、IL-2R β鎖又はI L-2R γ鎖の天然リガンドとの結合実験を下記に記載されるように或いは類似の 方法で行うことができる。p43 の断片は、 NAD⁺、IL-2R β鎖、又はIL-2R γ鎖 の結合部位を好ましくは少なくとも１種、更に好ましくは少なくとも２種保持す る。変異体の生成については、当業者は、p43 の完全コード情報の全部又は一部 を含むDNA 分子を標準の手順、例えば、部位特定変異誘発により修飾することが でき(32、特にchap.15; 33，chap.11，p.279-295)、このように修飾したDNA 分 子を記載されたように発現する。例として、変異体は、記載されたp43 と比べて １、２、３個以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失によって確認される。発現後 、このように生成された変異体ポリペプチドは、記載された機能であるかが試験 される。あるポリペプチドの化学誘導体の生成については、標準の手順が同様に 用いられる（例えば、33，chap.9，p.225-245、及びchap.10，p.247-277参照） 。 融合タンパク質の生成は、下記の実施例に記載される。 本発明の情報、特に図1A又は図1Bの配列情報があれば、当業者は、標準の手順 に従ってp43 、又はその機能誘導体に特異的な抗体を生産することができる(34 、特にvol.１、chap.2，3，4)。抗原として使用する場合には、例えば、配列番 号２又は４、又は図1A及び1Bのアミノ酸配列の一部を示す合成ペプチドが合成さ れ、担体に作用上結合された免疫化プロトコールで用いられる。抗原を生成する 他の例は、例えば E．coli中でのp43 又はその機能誘導体、場合によっては融合 タンパク質としての組換え発現である。次に、発現したポリペプチド又は融合タ ンパク質−精製されていてもよい−は、免疫化計画において用いられる。次に、 個々の抗体又は−モノクローナル抗体の場合−個々の抗体を生産するハイブリド ーマが適切な方法で選択される(35)。抗体は、モノクローナル抗体或いはポリク ローナル抗体とすることができる。そのままの免疫グロブリンの代わりに、免疫 グロブリンの断片、例えば、 Fab′又はF(ab)₂フラグメントが用いられる。ある 抗原に対する組換え抗体又は抗体断片、キメラ抗体、人化抗体、二重特異性抗体 又は単鎖抗体の生産は、当該技術の状態である。抗体は、他の物質、例えば、放 射性同位元素又は毒素に結合される。p43 、又はその機能誘導体に特異的な抗体 は、IL-2誘導細胞因子の機構を研究する有用な手段であり、IL-2誘導シグナルの 伝達を遮断又は減弱するためにも用いられる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準の手順に従って化学的に合成される 。 p43 、その機能誘導体、p43 又はその機能誘導体のコード情報を含む核酸、p4 3 又はその機能誘導体に特異的な抗体、又はp43 又はその機能誘導体をコードす るヌクレオチド配列の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-2 関連疾患の治療又は診断用医薬組成物を製造するための薬剤として用いられる。 本発明の分子は、既知の方法に従って処方され、それらの物質は薬学的に許容し うる担体賦形剤と共に混合される。適切な賦形剤、及び場合によってはヒト血清 アルブミンのような他のヒトタンパク質との製剤は、例えば(36)に記載される。 医薬組成物は、患者に静脈内、筋肉内、皮下、経腸、又は非経口投与される。投 与は、持続注入又は一回又は多回用量によることができる。用量は、患者の年齢 、体重、身長、性別、全身状態、疾病等の要因によって異なる。通常は約1pg/kg 〜 10mg/kg 患者の体重の範囲内にある。 組換えで生産されたp43 又はその機能誘導体は、また、IL-2誘導シグナル導入 の機構を研究するために用いられる。 図面の説明 図１． p43 のヌクレオチド配列と予想アミノ酸完全配列。(A)ヒトp43 のヌ クレオチド配列と予想アミノ酸配列。アミノ酸配列は、一文字コードで示される 。予想 NAD⁺結合ドメインの保存残基は、下線で示される。ヌクレオチド数は左 側に、アミノ酸数は右側にある。(B)ヒトとマウスのp43 アミノ酸配列のアライ ンメント。予想 NAD⁺結合ドメインの領域は枠に囲まれている。 図２． p43 と各デヒドロゲナーゼ間の相同性。アルコールデヒドロゲナーゼ 、乳酸デヒドロゲナーゼ及びリン酸グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼがヒト 又はマウスp43 に対して配列される；番号はヒトp43 に対するものである。ヒト 又はマウスp43 との同一は枠で示される。 図３． ヒト組織におけるp43 mRNA発現。ヒト組織ブロット(Clontech,カリフ ォルニア州パロアルト)。分子量サイズは左側に示されている（キロベースで） 。 図４． COS 細胞におけるp43 とIL-2R との会合。(A)p43 とIL-2R γ鎖との 会合。COS 細胞から細胞溶解物を調製した。COS 細胞を CD4γ+ LCK 標識、 CD4 γ+ LCK-p43 、 CD4γM1 + LCK標識又は CD4γM1 + LCK-p43でトランスフェクト した。各細胞溶解物の分割量を抗CD4 抗体(OKT4)で免疫沈降させた後、抗Lck を ブロットして免疫反応で検出した。(B)p43 とIL-2R β鎖との会合。COS 細胞か ら細胞溶解物を調製した。COS 細胞を LCK-p43 ＋CD4γ、CD4γM1、CD4β、CD4 βA 又は CD4βS でトランスフェクトした。 図５． IL-2誘導DNA 合成に関するp43 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオ チドの影響。FWT-2細胞についてIL-2刺激後にアンチセンスオリゴデオキシヌク レオチドの存在下で[³H]チミジンを取込む能力を分析した。データは、３回分析 の平均として示されている。 図６． NAD⁺はp43 に結合する。[³²P]NAD⁺をフィルターとインキュベートし 、結合バッファー中のオボアルブミン、組換えp43 及びアルコールデヒドロゲナ ーゼタンパク質を導入した（材料及び方法参照）。次に、フィルターを洗浄し 曝露した。 実施例 実施例１：二ハイブリッドスクリーニング及びcDNA単離 特にことわらない限り、(4)のプロトコールを適応させた。酵母二ハイブリッ ドスクリーニングについては、ヒトIL-2R γ鎖細胞質領域(28)のオープンリーデ ングフレームを次の手順によりベクターpBTM116(4)中のLexA DNA結合ドメインに 融合した；SmaI又はSalI部位を各々含む合成オリゴヌクレオチドプライマー（セ ンス: 5′-ATTTCCCGGGGGAACGGACGATGCCCCGAA- 3′，アンチセンス: 5′-CTTCT GTCGACGGATTGGGGTTCAGGTTTC- 3′）をIL-2R γ鎖細胞質領域をコード化するcDNA のPCR 増幅に用いた。断片をSmaI及びSalIで切断し、pBTM116 と結合した。得ら れたプラスミドをPstIで切断し、結合してγ鎖のＣ末端半領域を除去した。得ら れたプラスミドを餌としてのCTYLD 酵母株に形質転換した。引き続きこの形質転 換細胞株を Dr．S．Elledgenから恵与されたＢ細胞由来pACTヒトcDNAライブラリ ー(4)で形質転換し、１×10⁶形質転換細胞を(4)に記載された標準法で分析した 。希有生存コロニーについてβ−ガラクトシダーゼの生産能を選別した。正の１ クローンを同定した。クローン36と呼ばれるクローンの配列分析により、GAL4転 写活性化ドメインに融合した〜1.4 kbの部分的オープンリーディングフレームが コード化される。プローブとしてこの挿入断片を用いて、ジャーカット細胞のmR NAから作成されたヒトcDNAライブラリーを選別してp43 コード配列の全長cDNAを 得た。ヒト全長cDNAの単離については、λgt11 cDNA ライブラリーをポリ(A)+ T PA誘導ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞白血病系）からのRNA で標準の手順(32)に 従って調製した。スクリーニングについては、二ハイブリッドスクリーニングで 得られたp43 cDNAのXhoI酵素処理（切断）によりプローブDNA を調製した。５オ ーバーラップクローンを確認し、0.5〜２ kb の挿入断片を有することがわかっ た。ジデオキシヌクレオチド鎖末端法を用いてDNA 配列決定を行った。最も長い 挿入断片コード配列を表すクローンを配列決定した。クローンは、クローン36と 約1.4 kbが重なり、5′端に更に約0.6 kb伸び、AUG 開始コドンを含む2.0 kbのc DNAセグメントを有した。これにより、予想分子サイズ43 kd を有する396 アミ ノ酸ポリペプチド（図1A）の潜在的オープンリーディングフレーム がわかった。我々は、この遺伝子産物をp43 と呼ぶ。遺伝子バンクデータベース によるコンピュータ配列検索により、p43 の配列は NAD⁺結合ドメイン内の部分 的類似性を除いて既知のタンパク質に対してほとんど相同性がない。 更に、マウスp43 cDNAを得るために、マウス脾細胞mRNAから作成されたcDNAラ イブラリーを用い、プローブとしてp43 cDNA断片を用いて選別した。マウスp43 cDNAクローンの単離については、プローブとして全長ヒトp43 cDNAクローンから の EcoRI切断挿入断片を用いると共に(38)に記載されたマウスcDNAライブラリー を用いてハイブリッド形成を行い、フィルターを3 x SSC 中65℃で洗浄した(SSC バッファーをref．32，p．B.12に従って調製した)。マウス脾臓からのcDNAライ ブラリーをヒトp43 cDNAで選別すると極めて関連した配列のクローンが得られた 。予想したヒトとマウスのp43 アミノ酸配列は極めて関連し、タンパク質レベル で〜90％同一である（図1B）。 NAD⁺結合ドメインのアミノ酸配列はヒトとマウ スp43 の双方で保存される(図1B及び2)。 ノーザンブロット分析により検出されたp43 mRNAの発現は、試験したヒト組織 全てに偏在した。p43 mRNAは長さが約2.0 kbであり、骨格筋に最も存在した(図3 )。 実施例２：哺乳動物細胞におけるp43 とIL-2R γ鎖との会合 上述の通り、我々は酵母二ハイブリッド系を用いてIL-2R γ鎖結合分子、p43 を単離した。しかしながら、我々はp43 が哺乳動物細胞においてIL-2R γ鎖と会 合することができるかわからなかった。哺乳動物細胞においてp43 とIL-2R γ鎖 の結合を確認するために、我々はp43 を p56^lck（LCK-p43）のＮ末端領域を認識 した特定の抗体に結合しIL-2R γ鎖をCD4（CD4γ）の細胞外ドメインに結合する ２つのキメラタンパク質を構築した。発現プラスミド、CD4γ及びLCK-p43 をサ ルCOS7細胞に一時的にコトランスフェクトした後、分子内結合をOKT4との免疫沈 降により分析し、続いて抗Lck 抗血清でウェスタンブロット分析した（詳細につ いては実施例６参照; ref.(7)も参照）。LCK-p43 及びLCK 標識を、全細胞溶解 物の抗Lck 抗血清イムノブロッティングにより評価されるようにトランスフェク トしたCOS 細胞中で発現させた（データは示されていない）。図４から、LCK-p4 3に結合したが対照のLCK 標識に結合しなかったIL-2R γ鎖又は端を切り取った IL-2R γ鎖が経膜領域のみ含むことがわかり、哺乳動物細胞における２つのタン パク質の直接結合を意味する。 実施例３：IL-2R β鎖は p43と会合する IL-2R γ鎖とβ鎖が会合しIL-2シグナル導入の重要な機能を共有することから 、我々はIL-2R β鎖が p43と会合するかを求めた。これらの分子の結合を確認す るために、我々はIL-2R β鎖、又は変異体β鎖を CD4に融合するキメラ遺伝子を 構築した(CD4-IL-2Rβ，CD4-βS，CD4- βA)。これらのプラスミド及びLck-p43 をサルCOS7細胞にコトランスフェクトし、分子内結合を測定した(cf.実施例2，6 )。図4Bから、p43 がIL-2R γ鎖のみと会合せずIL-2R β鎖と会合することがわ かる。おもしろいことに、p43 は、IL-2仲介シグナル導入に重要な領域であるＳ 領域を介してIL-2R β鎖としっかりと会合した。 実施例４：オリゴデオキシヌクレオチドの合成及び[³H]チミジン取込みの測定 S-オリゴデオキシヌクレオチドを自動DNA シンセサイザー(AppliedBiosystems )で合成した。センス及びアンチセンスのオリゴデオキシヌクレオチドの配列は 、各々 5′-CAGGATGGGCGTTTTGAAGA- 3′及び 5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT- 3′で ある。野生型ヒトIL-2R β鎖とγ鎖を発現する BAF-B03由来細胞系であるFWT-2 細胞を本実験に用いた。連続して増殖した後、細胞を PBSで洗浄し、細胞を 1Ｘ 10⁴/ウェルの開始濃度で96ウェルプレートに分配した。オリゴマー(5μM 又は10 μM)をIL-2R(2 nM)と共に又はなしで加えた。20時間インキュベートした後、細 胞を 1μCiの[³H]チミジン（20μCi／ミリモル）(NEN Research Products)で４ 時間パルスラベルした後に収集した。 増殖のパラメーターとしてIL-2R 刺激後の[³H]チミジン取込みにおけるp43 セ ンス及びアンチセンスオリゴマーの影響を図５に示されるように評価した。実験 を少なくとも３回繰り返した。p43 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが [³H]チミジン取込みを部分的に阻害する（〜30％）ことは明らかである。一方、 センスオリゴデオキシヌクレオチドを用いた影響は認められなかった。これらの 結果は、p43 分子がIL-2シグナルを部分的に変えるが、全スケールのシグナルを 阻害しないことを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在するとき p43 のないことを補償することができる重複結合分子の存在を評価することは残 っている。 実施例５：NAD⁺結合分析 前述の通り、p43 はアルコールデヒドロゲナーゼのようなNAD⁺結合タンパク質 に部分的相同性を有する。p43 が NAD⁺を結合することができるかを確認するた めに、我々は NAD⁺結合分析を行った。我々は、まず、細菌内で産生された組換 えp43 への NAD⁺の結合を試験した。p43 の完全オープンリーディングフレーム を 6×His 標識配列に融合し、得られたキメラタンパク質をNiカラムによるアフ ィニティークロマトグラフィーで過剰発現細菌株から精製した。組換えE.coli発 現p43 については、 6×His アフィニティー標識に融合したp43 キメラタンパク 質を、Mr．Hashimoto(ロックフェラー大学)から恵与されたベクター、6HisT-pET 11d を用いて構築した。プラスミドを E．coli株BL21/pLysSに形質転換し、組換 えp43 をNiカラム(Invitrogen)を用いて精製した。精製したp43 及び対照タンパ ク質（オボアルブミン及びアルコールデヒドロゲナーゼ）をSDS-PAGE（10〜20% 勾配ゲル）に加え、PVDF膜フィルターに電気泳動的に移した。結合バッファー[5 0 mMトリス-HCl pH7.5、１mM EDTA、５mM MgCl₂、0.3 %（v/v）トゥイーン20]に 室温で１時間浸漬した後、その膜フィルターを結合バッファー中[³²P]NADと20℃ で18時間インキュベートした。次に、そのフィルターを結合バッファーで３回洗 浄し、Ｘ線フィルムに曝露した。図６に示されるように、p43 のNAD⁺結合能が検 出された。一方、その結合能は削除した過剰非放射能NAD の存在下に完全に消失 した。 実施例６：免疫沈降及び免疫ブロット分析 IL-2R 及びp43 の免疫沈降及び免疫ブロット法については、CD4 細胞外及び経 膜ドメインをもつキメラ遺伝子: CD4β、 CD4βA、 CD4βS、 CD4γ及び CD4γ M1キメラレセプター発現プラスミドを次の通り構築し、IL-2R β鎖、内部“S領 域”及び“A領域”を欠くIL-2R β鎖、IL-2R γ鎖の細胞質ドメイン、及びIL-2R γ鎖の細胞質ドメインの膜方向の７アミノ酸を(18)のように構築した。概要とし ては、 CD4β及び CD4γキメラレセプターは、２組の合成オリゴヌクレオチドを 用いて IL-2Rβ鎖及び IL-2Rγ鎖と枠内で各々融合したヒトCD4 細胞外／経膜ド メインを含む。 CD4β及び CD4γcDNAをEcoRI/XbaI切断pEF ベクター(25)(pEF- CD4 β及び pEF-CD4γ)に各々挿入した。キメラ分子、 CD4βA 及び CD4βS の 発現ベクター(pEF-CD4βA 及び CD4βS)を構築するために、pdKCRA及び pdKCRS ベクター(8)を各々NcoI及び BamHIで消化した。消化後、各NcoI-BamHI断片(〜0. 9Kb)をNcoI/BamHI切断 pEF-CD4βベクターに挿入した。LCK-p43 キメラ分子は、 LCK の PCR断片を用いてp43 と枠内で融合した Glyから Alaまでミリスチル化部 位で変異した p56^lckＮ末端領域（〜100アミノ酸）を含む。LCK-p43 cDNAをpEF ベクター(25)に挿入した。構築物を制限酵素消化及びDNA 配列決定で確認した。 COS 細胞における一時的cDNA発現の実験を(7)のように行った。抗CD4 抗体(OK T4)を用いる免疫沈降及び抗 p56^lck抗血清を用いる免疫ブロット分析を(18)のよ うに行った。 実施例７：抗体の生産 ポリクローナル抗体を、p43 の異なる配列モチーフに対応する下記の合成ペプ チドに対して高めた。 抗原複合体調製、免疫化及び抗体力価測定のプロトコールは次の通りである。 担体タンパク質へのスルフヒドリル含有ペプチドの複合のプロトコールを用い た。概要としては、５００μl のPBS 中１mgのペプチドとキーホールリンペット ヘモシアニン(KLH，cf．34，vol．I，p．26)を５００μl の完全フロインドアジ ュバントとリュアロックコネクト型注射器を用いて混合した。複合成分の適切な 混合を試験した後、ウサギの首の後ろに皮下注射した。ウサギに５００μg の抗 原（不完全フロインドアジュバントと混合した複合体）を２週間の間隔で３ヵ月 間追加注射した。 抗血清を酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)を用いて定期的に試験し、 １μg/μl のペプチドKLH 結合体をコーティングバッファー(0.1 M NaHCO₃ pH9. 0)中で96ウェルマイクロプレートに被覆した。そのマイクロプレートをリンスバ ッファー(PBS，0.1％トゥイーン20)で洗浄した後、免疫血清又は対照血清の 種々の希釈液を５０〜１００μl の容量でウェルに加え、室温で２時間インキュ ベートした。 プレートをリンスバッファーで洗浄し、PBS 及び１％ BSA及び0.1％トゥイー ン20中アルカリホスファターゼと結合した５０μl のヤギ抗ウサギIgG をウェル に加え、室温で２時間インキュベートした。そのマイクロプレートをリンスバッ ファーで洗浄し、基質バッファー中１００μl の基質、p-フェニルリン酸二ナト リウムをウェルに加えた。マイクロプレートを室温で１〜２時間インキュベート し、光学濃度(OD)を405 nmで測定した(ref．620 nm)。 ３種類の異なる抗ペプチド抗体は、希釈度1/10⁴のペプチド結合体を認識する ことができた。配列番号11のペプチドに対する抗体は、E．coli発現組換えヒトp 43 を認識することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｋ 5/10 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/00 21/08 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 バースミアン エドワード リーオン 大阪府箕面市船場西３−11−５−503

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．p43 様生物活性をもつポリペプチド。 ２．NAD⁺結合ドメイン及びIL-2R β鎖の結合部位を含むポリペプチド。 ３．IL-2R γ鎖の結合部位を更に含む請求項２記載のポリペプチド。 ４．NAD⁺結合ドメイン及びIL-2R γ鎖の結合部位を含むポリペプチド。 ５．IL-2R β鎖の結合部位及びIL-2R γ鎖の結合部位を含むポリペプチド。 ６．前記ポリペプチドがIL-2R γ鎖よりIL-2R β鎖に強く結合する請求項３又は ５記載のポリペプチド。 ７．前記ポリペプチドが配列番号２： 又は配列番号４： のアミノ酸配列を有する請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ８．配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記ポリペプチ ドの、NAD⁺、IL-2R β鎖、又はIL-2R γ鎖の少なくとも１種を結合する機能誘導 体。 ９．前記機能誘導体が前記ポリペプチドの変異体、断片、化学誘導体、又は融合 タンパク質である請求項８記載の機能誘導体。 10．請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド又は機能誘導体のコード 情報を含む核酸分子。 11．配列番号１： のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は前記核酸分子の縮重変異体、又は前 記ヌクレオチド配列を有する核酸分子に対してハイブリッド形成することができ る核酸分子、又は配列番号１の一部又は前述の核酸配列のいずれかの一部を含む 核酸分子、好ましくは配列番号９： のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号９の縮重変異体。 12．配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子に対して、70％を超える、 更に好ましくは90％を超える相同性を選択する条件下でハイブリッド形成するこ とができる請求項11記載の核酸分子。 13．配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子に対して、３×SCC 中65℃で ハイブリッド形成することができる請求項12記載の核酸分子。 14．請求項11〜13のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされたポリペ プチド。 15．請求項10〜13のいずれか１項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列を含むベ クター。 16．発現ベクターである請求項15記載のベクター。 17．請求項15又は16記載のベクターをもつ宿主細胞。 18．下記の工程を含む請求項１〜９又は14のいずれか１項に記載のポリペプチド の生産方法。 a)請求項17記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドが前記宿主細胞によって発現 される条件下で培養する工程、及び b)前記ポリペプチドを単離する工程。 19．前記宿主細胞が E．coli細胞又は哺乳動物細胞、好ましくはCOS 細胞である 請求項18記載の方法。 20．請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド又は機能誘導体に特異的 な抗体分子。 21．ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、完全免疫グロブリン又はその断 片、免疫グロブリンの Fab′又はF(ab)₂フラグメント、組換え抗体又は組換え抗 体断片、組換え単鎖抗体(scFv)、キメラ抗体、二重特異性抗体、又は人化抗体で ある請求項20記載の抗体分子。 22．下記のアミノ酸配列のいずれかに特異的である請求項20又は21記載の抗体分 子。 23．請求項10〜13のいずれか１項に記載の核酸分子の配列の一部に対応するアン チセンスオリゴヌクレオチド。 24．配列番号８： 5′-GTCTTCAAAACGCCCATCCT- 3′の核酸配列を有する請求項23 記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 25．IL-2依存性細胞増殖を阻止するために使用される請求項23又は24記載のアン チセンスヌクレオチドの使用。 26．請求項23又は24記載のアンチセンスヌクレオチドを含む医薬組成物。 27．請求項１〜９、又は14のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成 物。 28．請求項10〜13、15又は16のいずれか１項に記載の核酸分子を含む医薬組成物 。