PL196430B1

PL196430B1 - Sposób wytwarzania interleukiny-2 do zastosowania farmaceutycznego, kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, wodna kompozycja farmaceutyczna, zestaw środków farmaceutycznych, zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu, zastosowanie kompozycji zawierającej interleukinę-2 oraz dodecylosiarczan sodu, zastosowanie wybranego środka farmaceutycznego, zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanusodowego oraz drugiego środka farmaceutycznego

Info

Publication number: PL196430B1
Application number: PL372651A
Authority: PL
Inventors: Maninder Hora
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2008-01-31
Also published as: PL372651A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania interleukiny-2 do stosowania farmaceutycznego, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) dodawania dodecylosiarczanu sodu (SDS) do kompozycji zawierającej interleukinę-2 z wewnątrzcząsteczkowymi mostkami disiarczkowymi, do otrzymania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; (b) usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 c) częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg IL-2. 18. Kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, znamienna tym, że zawiera 95-250 μg dodecylosiarczanu sodu na 1 mg interleukiny-2; interleukina-2 i dodecylosiarczan sodu są w postaci agregatów o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8 nm-20 nm, a kompozycja wykazuje zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm2/g. 33. Liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że po rekonstytucji za pomocą 1,2 ml sterylnej wody do iniekcji zawiera w każdym mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej ludzkiej des-alanylo-1-seryno-125 IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, przy czym IL-2 i SDS są w postaci agregatów tak, że po rekonstytucji kompozycja ma zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm2/g. 41. Zestaw, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 18 albo 33 albo 35 i drugi środek farmaceutyczny wybrany z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała antyEGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette- -Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny. 45. Zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu do wytwarzania leku do podawania pacjentowi, przy czym, mikroagregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 196430 (13) B1 ^{(21) Numer zgłoszenia: 372651} _{(51) Int.Cl.}

A61K 38/20 (2006.01) C07K 1/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 07.02.2005 C07K 14/55 (2006.01)

A61P 35/00 (2006.01)

Sposób wytwarzania interleukiny-2 do zastosowania farmaceutycznego, kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, wodna kompozycja farmaceutyczna, zestaw środków farmaceutycznych, (54) zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu, zastosowanie kompozycji zawierającej interleukinę-2 oraz dodecylosiarczan sodu, zastosowanie wybranego środka farmaceutycznego, zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodowego oraz drugiego środka farmaceutycznego

	(73) Uprawniony z patentu:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	CHIRON CORPORATION,Emeryville,US
30.05.2005 BUP 11/05	(72) Twórca(y) wynalazku:
	Maninder Hora,Emeryville,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik:
	Kossowska Janina, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1. Sposób wytwarzania interleukiny-2 do stosowania farmaceutycznego, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) dodawania dodecylosiarczanu sodu (SDS) do kompozycji zawierającej interleukinę-2 z wewnątrzcząsteczkowymi mostkami disiarczkowymi, do otrzymania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; (b) usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 c) częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg IL-2.

18. Kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, znamienna tym, że zawiera 95-250 μg dodecylosiarczanu sodu na 1 mg interleukiny-2; interleukina-2 i dodecylosiarczan sodu są w postaci agregatów o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8 nm-20 nm, a kompozycja wykazuje zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.

33. Liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że po rekonstytucji za pomocą 1,2 ml sterylnej wody do iniekcji zawiera w każdym mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej ludzkiej des-alanylo-1-seryno-125 IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, przy czym IL-2 i SDS są w postaci agregatów tak, że po rekonstytucji kompozycja ma zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.

41. Zestaw, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 18 albo 33 albo 35 i drugi środek farmaceutyczny wybrany z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała antyEGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.

45. Zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu do wytwarzania leku do podawania pacjentowi, przy czym, mikroagregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.

PL 196 430 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania interleukiny-2 do zastosowania farmaceutycznego, kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, wodna kompozycja farmaceutyczna, zestaw środków farmaceutycznych, zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu, zastosowanie kompozycji zawierającej interleukinę-2 oraz dodecylosiarczan sodu, zastosowanie wybranego środka farmaceutycznego, zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodowego oraz drugiego środka farmaceutycznego.

Interleukina-2 (IL-2) jest cytokiną, która przyspiesza wzrost i różnicowanie limfocytów T in vivo, a także zwiększa cytotoksyczność limfocytów T CD8+ i naturalnych komórek zabójców. Podawanie jej pacjentom wywołuje liczne działania odpornościowe w sposób zależny od dawki, obejmujące aktywację reakcji odporności komórkowej z silną limfocytozą, eozynofilię, małopłytkowość i wytwarzanie cytokin obejmujących TNF, IL-1 i interferon γ. Dalsze szczegóły dotyczące IL-2 można znaleźć w „GeneCard pod numerem dostępu GC04M123831.

IL-2 została zatwierdzona w wielu krajach do stosowania farmaceutycznego u ludzi. Zalecana niezastrzeżona nazwa międzynarodowa to ALDESLEUKIN, a preparat sprzedawany jest przez firmę Chiron Corporation pod nazwą handlową PROLEUKIN™. Amerykański Urząd ds. Żywności i Leków FDA zatwierdził IL-2 PROLEUKIN™ do stosowania w leczeniu dorosłych z przerzutowym rakiem nerkowokomórkowym (przerzutowy RCC) lub przerzutowym czerniakiem.

Jak to stwierdzono w informacji opisowej USA, PROLEUKIN™ ma postać biologicznie czynnych mikroagregatów, związanych niekowalencyjnie o średniej wielkości 27 rekombinowanych cząsteczek IL-2. Dostarczana jest w postaci sterylnego liofilizowanego placka w kolorze od białego do białawego w ampuł kach do jednorazowego stosowania, przeznaczonych do podawania doż ylnego (I.V.). Po rekonstytuowaniu w 1,2 ml sterylnej wody do iniekcji, każdy ml roztworu zawiera 18 milionów IU (jednostek międzynarodowych) (1,1 mg) IL-2 PROLEUKIN™, 50 mg mannitu i 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS), buforowanych około 0,17 mg monozasadowego i 0,18 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5. Proste mieszanie tych składników nie daje jednak takiej samej mikroagregowanej postaci IL-2, jaka jest w produkcie PROLEUKIN™.

Mikroagregacja IL-2 w produkcie PROLEUKIN™ jest ważna dla skuteczności in vivo. Właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne niezagregowanej (wolnej monomerycznej) IL-2 różnią się bardzo od właściwości mikrozagregowanej IL-2 i te dwie postaci mają różne indeksy terapeutyczne: zbyt małe agregaty są zbyt szybko wydalane z organizmu, zbyt duże agregaty mogą być nierozpuszczalne i mniej aktywne. Mikroagregacja jest więc kluczową cechą produktu PROLEUKIN™. Sposób, dzięki któremu tworzą się biologicznie aktywne mikroagregaty PROLEUKIN™, nie był dotychczas podany do publicznej wiadomości, chociaż w stanie techniki opisano wiele sposobów wytwarzania farmaceutycznych preparatów IL-2 [np. patrz odnośniki 1 do 30]. Publikacja 9 ujawnia sposób wytwarzania PROLEUKIN™ ze szczegółami dotyczącymi ekspresji, odzyskiwania, oczyszczania, sporządzania preparatów i wykończania, lecz to ujawnienie nie jest kompletne pod wieloma względami.

Wiedza o tym jak uzyskać aktywną mikroagregowaną postać IL-2, taką jak stwierdzona w produkcie PROLEUKIN™, byłaby przydatna każdemu, kto chciałby wytworzyć produkt IL-2 podobny do PROLEUKIN™. Tak więc, celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania IL-2 w postaci mikroagregatów, jakie znajdują się w produkcie PROLEUKIN™ oraz dostarczenie takiej mikroagregowanej IL-2. Celem wynalazku jest też dostarczenie sposobu wytwarzania IL-2, który uzupełni rozwiązanie ujawnione w odnośniku 9.

Sposób wywarzania produktu PROLEUKIN™ obejmuje następujące kluczowe etapy: (i) oczyszczanie wyrażanej IL-2 z hodowli komórek; (ii) solubilizację IL-2 za pomocą detergentu SDS; (iii) redukcję IL-2 do postaci monomerycznej; (iv) oczyszczanie, utlenianie i strącanie IL-2; (v) ponowną solubilizację IL-2 z zastosowaniem dużej ilości detergentu SDS; (vi) oczyszczanie w celu usunięcia oligomerycznej IL-2; (vii) diafiltrację w celu zmniejszenia poziomu detergentu SDS bez jego całkowitego usunięcia do optymalnego poziomu dla otrzymania odpowiednio mikroagregowanego preparatu IL-2; (viii) sporządzanie preparatu z mannitem i buforem oraz (ix) liofilizację i pakowanie.

Etapy (i), (iv), (vi), (viii) i (ix) w tej procedurze zostały ujawnione w publikacji 9, lecz etapy (ii), (iii), (v) i (vii) nie zostały ujawnione, chociaż zastosowanie nieokreślonego konkretnie detergentu w celu ponownej solubilizacji IL-2 przed etapem (vi) zostało ujawnione. Ponadto w publikacji 9 zasugerowano, że SDS dodaje się do IL- 2 po oczyszczaniu w etapie (vi), w którym faktycznie jest on usuwany.

PL 196 430 B1

Z dziewięciu etapów, najbardziej krytycznymi etapami, dzię ki którym tworzą się mikroagregaty, są etapy (v) i (vii). Żaden z dalszych etapów (viii) lub (ix) nie ma istotnego wpływu na mikroagregację, a procedury oczyszczania w etapach (i), (ii), (iii), (iv) i (vi) mają takż e ma ł y wpł yw. Gdy dodaje się SDS w etapie (v), IL-2 ulega jednak solubilizacji i to wł a ś nie nastę pny etap zmniejszenia poziomów SDS w etapie (vii) powoduje tworzenie mikroagregatów obecnych w końcowym produkcie PROLEUKIN™. W celu ponownej solubilizacji strą conej IL-2 do zasadniczo monomerycznej rozpuszczalnej postaci, należy dodać wystarczającej ilości SDS, a następnie należy go usunąć (lecz nie całkowicie), w celu otrzymania żądanych mikroagregatów.

Według wynalazku sposób wytwarzania interleukiny 2 do stosowania farmaceutycznego, obejmuje etapy: (a) dodawania dodecylosiarczanu sodu (SDS) do kompozycji zawierającej interleukinę 2 z wewnątrzcząsteczkowymi mostkami disiarczkowymi, aż do uzyskania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; (b) usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 (c) częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg IL-2.

Procedura dodawania SDS, a następnie częściowego usuwania zapewnia optymalne warunki dla ścisłego współdziałania cząsteczek IL-2 i SDS, w celu wytworzenia mikroagregatów IL-2 i SDS, jakie są w produkcie PROLEUKIN™ i, dla danego stosunku IL-2/SDS, prowadzi do wytworzenia produktu różniącego się od produktu uzyskanego przez proste wymieszanie SDS i IL-2.

Korzystnie sposób obejmuje etapy: oczyszczania IL-2 przez RP-HPLC; wytrącania IL-2; dodawania SDS do wytrąconej IL-2 do otrzymania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 i częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia SDS, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg na 1 mg IL-2.

Korzystnie SDS dodaje się do końcowego stężenia przynajmniej 900 μg/mg interleukiny-2, a stężenie SDS w produkcie końcowym korzystnie wynosi 135-180 μg/mg interleukiny-2.

Gdy proces według wynalazku obejmuje zmniejszanie stężenia SDS do zakresu 95-250 μg SDS na mg IL-2, w pewnych postaciach wykonania jest możliwe zmniejszanie stężenia poniżej 95 μg/mg (np. do wielkości w zakresie 50-95 μg/mg), a następnie ponowne zwiększenie stężenia do zakresu 95-250 μg/mg. To zwiększenie do zakresu 95-250 μg/mg może odbywać się dogodnie podczas rekonstytuowania liofilizowanego materiału, np. proces może obejmować usuwanie SDS do wielkości <95 μg/mg, poddanie liofilizacji, następnie poddanie rekonstytuowaniu wodnym roztworem SDS tak, aby stężenie SDS było w zakresie 95-250 μg/mg.

IL-2 i dodecylosiarczan sodu są obecne w produkcie końcowym w postaci agregatów. Korzystnie agregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.

Korzystnie stężenie SDS zmniejsza się przez diafiltrację.

Korzystnie sposób dodatkowo obejmuje etap dodawania mannitu, korzystnie w ilości 40-50 mg na 1 mg IL-2.

Korzystny sposób dodatkowo obejmuje także etap liofilizacji.

Korzystnie IL-2 jest ludzką IL-2, des-alanylo-1 IL-2, seryno-125 IL-2 lub ludzką des-alanylo-1-seryno-125 IL-2.

Korzystnie IL-2 ma sekwencję aminokwasów Sekw. Id Nr 1.

Korzystnie IL-2 jest nieglikozylowana.

Korzystnie stosuje się IL-2 oczyszczoną po ekspresji w rekombinowanych prokariotycznych komórkach gospodarza.

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja, która zawiera interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu w ilości 95-250 μg dodecylosiarczanu sodu na 1 mg interleukiny-2; w której interleukina-2 i dodecylosiarczan sodu są w postaci agregatów o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8 nm20 nm, a kompozycja wykazuje zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.

Kompozycja ta nadaje się do stosowania farmaceutycznego, jak to wykazano na podstawie produktu PROLEUKIN™.

Kompozycja korzystnie jest w postaci liofilizowanej, którą można rekonstytuować w ośrodku wodnym i uzyskać kompozycję określoną powyżej.

Korzystnie kompozycja według wynalazku ma zmętnienie właściwe mniejsze niż 0,7 cm²/g, bardziej korzystnie zmętnienie właściwe w zakresie 0,3 cm²/g - 0,6 cm²/g.

PL 196 430 B1

Korzystnie kompozycja zawiera mikroagregaty SDS/IL-2 o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 11 nm-13 nm. Korzystnie zawartość mannitu w kompozycji jest w zakresie 40-50 mg na 1 mg IL-2.

Korzystnie IL-2 w kompozycji jest ludzką IL-2, des-alanylo-1 IL-2, seryno-125 IL-2 lub des-alanylo-1-seryno-125 ludzką IL-2.

Korzystnie IL-2 w kompozycji ma sekwencję aminokwasów Sekw. Id Nr 1.

Korzystnie IL-2 w kompozycji jest nieglikozylowana.

Korzystnie IL-2 jest oczyszczona po ekspresji w rekombinowanych prokariotycznych komórkach gospodarza.

Korzystnie stężenie IL-2 w kompozycji wynosi około 1,1 mg/ml.

Wynalazek dotyczy również liofilizowanej kompozycji zawierającej interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, która po rekonstytucji za pomocą 1,2 ml sterylnej wody do iniekcji zawiera w każdym mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej des-alanylo-1-seryno-125 ludzkiej IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, przy czym IL-2 i SDS są w postaci agregatów tak, że po rekonstytucji kompozycja ma zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.

Wynalazek dotyczy także wodnej kompozycji farmaceutycznej, która zawiera w mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej des-alanylo-1, seryno-125 ludzkiej IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, i może być wytworzona przez rekonstytuowanie kompozycji liofilizowanej za pomocą sterylnej wody do iniekcji.

Kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu według wynalazku, liofilizowana kompozycja farmaceutyczna i wodna kompozycja według wynalazku są przeznaczone do stosowania w medycynie.

Wszystkie opisane powyżej formy kompozycji według wynalazku mogą być podawane z drugim środkiem farmaceutycznym równocześnie, oddzielnie lub kolejno, przy czym drugi środek jest wybrany z grupy skł adają cej się z przeciwciał a anty-CD20, przeciwciał a anty-CD40, przeciwciał a anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.

Taka kompozycja i drugi środek farmaceutyczny również objęte są wynalazkiem.

Drugim środkiem farmaceutycznym w kompozycji jest monoklonalne przeciwciało, przeciwciało dostarczające ADCC, lub histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy, jako agonista receptora H2.

W zakres wynalazku wchodzi też zestaw, który zawiera (a) kompozycję według wynalazku i (b) drugi środek farmaceutyczny wybrany z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.

Korzystnie w zestawie agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.

Gdy w zestawie drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało, korzystnie jest to przeciwciało monoklonalne.

Korzystnie drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.

W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu do wytwarzania leku do podawania pacjentowi, przy czym mikroagregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm oraz zastosowanie kompozycji zawierającej interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, które są w postaci mikroagregatów o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8mm-20mm, w ilości 95-250 μg SDS na 1 mg interleukiny-2, wykazującej zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g, do wytwarzania leku.

Korzystnie lek wytworzony zgodnie z zastosowaniem jest przeznaczony do leczenia raka, a zwłaszcza raka nerkowokomórkowego lub czerniaka.

PL 196 430 B1

Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi po uprzednim podaniu drugiego środka farmaceutycznego bądź wspólnie z drugim środkiem farmaceutycznym, który jest wybrany z grupy skł adają cej się z przeciwciał a anty-CD20, przeciwciał a anty-CD40, przeciwcia ł a anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.

Korzystnie drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało monoklonalne, korzystnie przeciwciało dostarczające ADCC.

Korzystnie agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania środka farmaceutycznego wybranego z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny, do wytwarzania kombinacji leków obejmującej kompozycję według wynalazku i wymieniony powyżej drugi środek farmaceutyczny, do stosowania w terapii skojarzonej.

W takim zastosowaniu korzystnie drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało monoklonalne, korzystnie przeciwciało dostarczające ADCC.

Leki z kombinacji wytworzonej zgodnie z zastosowaniem według wynalazku podaje się oddzielnie, przy czym kompozycję według wynalazku podaje się jako pierwszą, a drugi środek farmaceutyczny po uprzednim podaniu tej kompozycji.

Oba leki z kombinacji można też podawać wspólnie.

Wynalazek obejmuje też zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu, które mają średnią średnicę hydrodynamiczną między 8 nm a 20 nm i drugiego środka farmaceutycznego wybranego z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny do wytwarzania kombinacji leków do podawania pacjentowi.

Stosowany w sposobie według wynalazku detergent dodecylosiarczan sodu (SDS) znany jest także jako laurylosiarczan sodu. Wzór tego anionowego detergentu jest następujący: CH3(CH2)11OSO3^-Na⁺i ma on numer CAS 151-21-3 i numer EC 205-788-1.

SDS jest standardowym reagentem stosowanym do solubilizacji białek i w tym celu jest stosowany w etapie (a) sposobu według wynalazku, gdy stosowana IL-2 jest w postaci wytrąconej. Do kompozycji zawierającej wytrąconą IL-2, dodaje się wystarczające ilości SDS, aby zapewnić, że zasadniczo cała wytrącona IL-2 stała się rozpuszczalna (za wyjątkiem kowalencyjnie związanych multimerów IL-2 w wytrąconym osadzie, które zasadniczo pozostaną wytrącone nawet w obecności SDS).

Przy stężeniach SDS wyższych niż około 500 μg/mg, mikroagregacja IL-2 w stężeniu 1 mg/ml zasadniczo nie zachodzi, zatem typowo dodaje się SDS do końcowego stężenia wynoszące przynajmniej 500 μg SDS na mg IL-2 (np. przynajmniej 550, przynajmniej 600, przynajmniej 700, przynajmniej 800, przynajmniej 900, przynajmniej 1000, przynajmniej 1200, przynajmniej 1400, przynajmniej 1600, przynajmniej 1800 lub przynajmniej 2000 μg SDS na mg IL-2). Korzystne jest stosowanie około 910 μg SDS na mg IL-2.

Wyjściowe stężenie SDS w próbce jest na ogół znane, ponieważ SDS nie występuje naturalnie w komórkach, a ilość SDS, którą dodano podczas obróbki materiału pochodzącego z komórek będzie

PL 196 430 B1 monitorowana. W przypadku, gdy stężenie SDS nie jest znane, można je jednak zmierzyć za pomocą konwencjonalnych technik oznaczania, albo przeprowadzanych na materiale jako całości, albo na próbce materiału. Na przykład w publikacji 31 ujawniono metodę kapilarnej elektroforezy do oddzielania i oznaczania środków powierzchniowo czynnych, w tym SDS; w publikacji 32 ujawniono metodę pojedynczej kropli do oznaczania jonu dodecylosiarczanowego w zakresie 0,2-100 μmoli za pomocą piezoelektrycznego kryształu kwarcu bez elektrody; w publikacji 33 porównano trzy metody dogodnego oznaczania SDS w roztworach wodnych, mianowicie miareczkowanie bromkiem cetylotrimetyloamoniowym z zastosowaniem albo elektrody jonoselektywnej albo zmętnienia do mierzenia punktu końcowego, lub pomiar zmętnienia w obecności bromku mirystylotrimetyloamoniowego; w publikacji 34 ujawniono metodę oznaczania SDS opartą na interakcji z barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak bromek etydium itd. Korzystnym sposobem oznaczania poziomów SDS jest analiza spektrofotometryczna oparta na reakcji z oranżem akrydynowym, jak to bardziej szczegółowo zostało opisane w przykładach i w publikacji 35.

Jako alternatywę dla pomiaru zawartości SDS w stosunku do masy IL-2, można mierzyć tę zawartość względem aktywności IL-2. W oparciu o aktywność IL-2 wynoszącą 18 x 10⁶ IU w 1,1 mg IL-2 (jaką stwierdzono dla PROLEUKIN™) 100 μg SDS na mg IL-2 jest równoważne 6,111 μg SDS na jednostkę MIU IL-2.

Po dodaniu SDS do kompozycji IL-2 i usunięciu kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2, sposób według wynalazku obejmuje usuwanie pewnej ilości (lecz nie całkowite) SDS, i w ten sposób dostarczenie zmikroagregowanej postaci IL-2 i SDS.

SDS można usuwać różnymi technikami. Za pomocą chromatografii jonowymiennej można usunąć ujemnie naładowany SDS. Można stosować także filtrację żelową. Najbardziej korzystnie jednak SDS usuwa się za pomocą diafiltracji. Podczas diafiltracji, rozpuszczalnik i/lub mikrosubstancje rozpuszczone (np. sole) zostają zastąpione innym rozpuszczalnikiem i/lub mikrosubstancjami rozpuszczonymi. Na ogół usuwanie i zastępowanie zachodzi z taką samą szybkością, a zatem objętość roztworu może pozostać zasadniczo stała, tak więc całkowitym skutkiem operacji jest zastąpienie oryginalnych rozpuszczalników/mikrosubstancji rozpuszczonych nowymi rozpuszczalnikami/mikrosubstancjami rozpuszczonymi.

Korzystnym sposobem usuwania SDS jest diafiltracja wobec buforu niezawierającego SDS, np, wobec 10 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5.

Usuwanie SDS prowadzi się aż do momentu, gdy kompozycja będzie zawierać SDS w zakresie 95 μg-250 μg na każdy mg interleukiny 2, np. w zakresie 118-210 μg/mg, 135-180 μg/mg lub około 160 μg/mg. Własności farmakokinetyczne IL-2 są zasadniczo stałe w tym zakresie stężeń, a poziom SDS nie jest tak wysoki, aby powstał problem toksyczności. Jednak, gdy stężenie SDS spadnie poniżej około 95 μg/mg, gwałtownie rośnie wielkość mikroagregatów (figura 1) wzrastając z przeciętnie ~60 cząsteczek IL-2 na agregat przy 95 μg/mg do przeciętnie ~180 przy 75 μg/mg.

Dodawanie, a następnie niecałkowite usunięcie SDS, daje w rezultacie utworzenie się biologicznie czynnych mikroagregatów IL-2, jakie są w produkcie PROLEUKIN™. Proste mieszanie SDS i IL-2 w stężeniach znalezionych w produkcie PROLEUKIN™ nie daje mikroagregatów. W publikacji 36 opisano badanie, w którym SDS dodawano do preparatów IL-2 zawierających 1,1 mg IL-2, jak w produkcie PROLEUKIN™. Stwierdzono, że SDS powoduje wytrącanie IL-2 przy stężeniach detergentu w zakresie 0,02% - 0,05%. Natomiast, IL-2 nie ulega wytrąceniu przy tych stężeniach SDS, gdy prowadzi się usuwanie SDS według wynalazku i nie stwierdza się wytrącania IL-2 nawet wtedy, gdy stężenie SDS zmniejszy się z 1200 μg/mg (około 0,1% SDS w odniesieniu do 1,1 mg IL-2) do 70 μg/mg (<0,01%).

Podczas usuwania SDS można określić jego stężenie, jak opisano powyżej. Gdy sposób usuwania jest standaryzowany i powtarzalny, kontrola stężenia SDS podczas usuwania SDS może nie być konieczna, ponieważ można zwykle oczekiwać takiego samego wyniku za każdym razem, gdy przeprowadzana jest procedura (chociaż można przeprowadzać potwierdzające pomiary końcowe). Gdy jednak metodę usuwania zmienia się, lub, gdy z innych względów wymagane jest regularne kontrolowanie procesu, można przeprowadzać regularne lub ciągłe pomiary stężenia SDS, aż uzyska się żądane stężenie końcowe.

Jak wspomniano powyżej, kluczowymi etapami sposobu wytwarzania mikroagregatów IL-2/SDS są (a) dodawanie, a następnie (b) dalsze usuwanie SDS. Chociaż te dwa etapy dają IL-2 w postaci odpowiedniej do zastosowania jako składnik czynny w środkach farmaceutycznych, to same te etapy

PL 196 430 B1 nie są odpowiednie do wytworzenia końcowej kompozycji farmaceutycznej i wymagane są również inne etapy. Etapy te mogą występować przed etapami (a) i (b), po etapach (a) i (b) i/lub pomiędzy etapami (a) i (b).

Pierwszym etapem sposobu wytwarzania IL-2 do farmaceutycznego zastosowania jest zwykle ekspresja białka. Będzie ona na ogół obejmowała stosowanie komórek gospodarza zawierających gen kodujący IL-2 będącą przedmiotem zainteresowania, takich jak komórki gospodarza bakteryjnego, komórki gospodarza drożdżowego, lub komórki gospodarza ssaczego. Jednak, jako alternatywa dla drogi rekombinacyjnej, jest także możliwe aktywowanie lub zwiększenie ekspresji endogennego genu IL-2 w genomie komórek gospodarza (np. przez aktywację promotora) lub oczyszczanie hormonu ze źródła naturalnego (np. z krwi).

Korzystną drogą pozyskiwania IL-2 jest ekspresja IL-2 w rekombinancie E. coli, z uzyskaniem IL-2 tworzącej ciałka inkluzyjne. Odpowiednie E. coli zostały zdeponowane z zachowaniem wymagań Traktatu Budapesztańskiego w ATCC w 1984 pod numerami dostępu 39452 i 39626.

Sposoby hodowli, zbierania, rozrywania lub ekstrakcji IL-2 z różnych typów komórek są w stanie techniki znane, np. z publikacji 19-30 i 37-41.

Po ekspresji, lub gdy materiałem wyjściowym jest produkt ekspresji, przeprowadza się początkowy etap oczyszczania IL-2. Jeśli IL-2 znajduje się w komórkach, to etap oczyszczania będzie obejmował rozrywanie komórek (np. za pomocą szoku osmotycznego, homogenizacji, sonikacji itd.) w celu uwolnienia białka; jeśli IL-2 znajduje się już w roztworze (np. została wydzielona po ekspresji), rozrywanie komórek nie jest konieczne. Można także przeprowadzić inaktywację żywych komórek, na przykład przez odwirowywanie. Na końcu początkowego etapu oczyszczania, IL-2 typowo znajduje się w postaci wytrąconej, zwłaszcza, jeśli została oczyszczona z ciałek inkluzyjnych, lecz oddziela się ją od resztek komórkowych, aby uzyskać pastę bogatą w IL-2 do dalszej obróbki.

Po wytworzeniu wytrąconej oczyszczonej IL-2 lub gdy materiałem wyjściowym jest wytrącony produkt, IL-2 można poddać solubilizacji w celu jej oddzielenia od innych białek gospodarza itd. Solubilizację można uzyskać przez dodanie detergentu, takiego jak SDS, korzystnie do uzyskania końcowego stężenia w zakresie między 4 a 4,5%. Można to wykonać dodając roztwór SDS o stężeniu 5%.

Po solubilizacji, lub gdy materiałem wyjściowym jest solubilizowany materiał, IL-2 można poddać redukcji, w celu rozerwania mostków disiarczkowych w białku, a w szczególności rozerwania disiarczkowych mostków międzycząsteczkowych. Wszystkie kowalencyjne agregaty IL-2 utworzone przez międzycząsteczkowe wiązania mostkami disiarczkowymi zostają tym samym przekształcone w postać monomeryczną. Środki redukujące stosowane zwykle do redukcji mostków disiarczkowych obejmują (β-merkaptoetanol i ditiotreitol (DTT). Dla zapewnienia rozpuszczalności IL-2 na ogół utrzymuje się obecność detergentu.

Po redukcji lub gdy materiałem wyjściowym jest materiał zredukowany, IL-2 można utlenić ponownie, w celu otrzymania monomerycznej IL-2 z międzycząsteczkowymi mostkami disiarczkowymi.

Po ponownym utlenieniu, lub gdy materiałem wyjściowym jest materiał ponownie utleniony, IL-2 można poddać dalszemu oczyszczaniu, w celu usunięcia reagentów, takich jak środki utleniające, endotoksyny, DNA i/lub białka pochodzące z komórek gospodarza oraz w celu usunięcia izoform lub konformerów IL-2 (np. utlenionych postaci IL-2) itd. To oczyszczanie można dogodnie przeprowadzić stosując wysokosprawną chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz (HPLC-RP).

Po oczyszczaniu za pomocą HPLC-RP lub gdy materiałem wyjściowym jest materiał oczyszczony za pomocą HPLC-RP, można wytrącić IL-2, np. dodając 0,8 N wodorotlenek sodu. Umożliwia to, tak jak i wytrącanie IL-2, oddzielenie białka od rozpuszczalników organicznych stosowanych podczas HPLC-RP. Wytrącony materiał można dogodnie zebrać przez odwirowanie. Materiał uzyskany po ekspresji, oczyszczeniu, solubilizacji, redukcji, utlenianiu, HPLC-RP i wytrącaniu (jak to opisano powyżej) idealnie nadaje się do ponownej solubilizacji i diafiltracji sposobem według wynalazku, chociaż można stosować także IL-2 wytwarzane przez oczyszczanie innymi drogami. Jednak typowo IL-2 znajduje się w postaci wytrąconej przed dodaniem SDS w etapie (a) sposobu według wynalazku.

Jak wspomniano powyżej, kowalencyjnie związane multimery IL-2 pozostają wytrącone nawet w obecności SDS. Ponieważ te multimery są znacznie większe niż białka IL-2 solubilizowane SDS (ponieważ nie ulegają one dysocjacji), można je dogodnie usunąć między etapem (a) i (b) (tzn. po początkowym dodaniu SDS lecz przed diafiltracją) za pomocą filtracji żelowej. W celu zapobieżenia wytrącaniu się IL-2, podczas filtracji żelowej powinno się zachować obecność SDS.

Po diafiltracji w celu usunięcia SDS i wytworzeniu mikroagregatów, roztwór IL-2 może być poddany jednemu lub więcej z następujących etapów: rozcieńczaniu, w celu uzyskania żądanej dawki

PL 196 430 B1 końcowej, sterylizacji, typowo przez sterylną filtrację, np. przez filtr 0,22 μm; sporządzaniu preparatu farmaceutycznego (patrz niżej), liofilizacji, pakowaniu itd.

Wynikiem solubilizacji za pomocą SDS i diafiltracji sposobem według wynalazku jest wytwarzanie biologicznie aktywnych mikroagregatów SDS i IL-2, jak to jest widoczne w produkcie PROLEUKIN™.

Szczegółowa struktura cząsteczkowa mikroagregatów SDS/IL-2 nie została określona, lecz uważa się, że są to struktury micelarne lub podobne do miceli. Przy stężeniu SDS -160 μg/mg typowa micela zawiera ~30 cząsteczek IL-2 i ~150 cząsteczek SDS. SDS i IL-2 w mikroagregatach współoddziałują niekowalencyjnie, a hydrofobowa część IL-2 (reszty 121-133) może oddziaływać ze szkieletem alkilowym SDS tworząc micele. Pewna ilość SDS może pozostawać wolna w roztworze.

Mikroagregaty można wykrywać przez rozproszenie światła i ta technika pozwala także na pomiar ich wielkości (patrz niżej). Zależność między stężeniem SDS a przeciętnym wymiarem mikroagregatów, mierzona klasyczną metodą rozpraszania światła, została oszacowana doświadczalnie, jak to pokazano na figurze 1.

Podczas przebiegu usuwania SDS, uzyskuje się stężenie, poniżej którego wymiary cząstek zaczynają rosnąć wykładniczo (patrz figura 1). Według wynalazku, SDS usuwa się aż do uzyskania stężenia 95 μg-250 Lig na 1 mg IL-2. W tym zakresie, zmętnienie właściwe (τ) jest w zakresie między ~0,05 a ~1,00 cm²/g, co oznacza, że w jednym agregacie znajduje się średnio mniej niż 50 cząsteczek IL-2. Przy stężeniu 160 Lig SDS na 1 mg IL-2 zmętnienie właściwe (τ) wynosi około 0,48 (około 27 cząsteczek IL-2).

Specjalista będzie wiedział, że określona kompozycja SDS/IL-2 według wynalazku rzadko, jeśli w ogóle, będzie zawierać pojedynczy rodzaj mikroagregatów. Pomiary rozpraszania światła dowodzą raczej, że mikroagregaty mają różne wymiary mieszczące się w pewnym rozkładzie, a przez pomiar można oszacować wymiar średni. Gdy kompozycja zawiera mikroagregaty o stwierdzonym średnim wymiarze, na ogół będzie się w niej znajdować pewna ilość mniejszych i pewna ilość większych mikroagregatów.

Korzystne kompozycje według wynalazku obejmują takie mikroagregaty SDS/IL-2, że kompozycja wykazuje zmętnienie właściwe (τ) w zakresie 0,3-0,6, np. w zakresie 0,4-0,5 lub około 0,45. Te własności dotyczą w szczególności kompozycji rekonstytuowanych po liofilizacji, przy czym wartość τ przed liofilizacją i rekonstytuowaniem może być niższa (figura 14).

Korzystne kompozycje według wynalazku zawierają mikroagregaty SDS/IL-2 o średnicy hydrodynamicznej w zakresie 11 nm-13 nm.

Korzystne mikroagregaty według wynalazku zawierają od 10 do 50 cząsteczek IL-2, np., w zakresie 20-35 a korzystnie około 27 cząsteczek.

W korzystnych kompozycjach, zasadniczo cała IL-2 jest obecna w postaci mikroagregatów. Kompozycje mogą zasadniczo nie zawierać monomerycznej IL-2.

Ponieważ na mikroagregaty SDS/IL-2 według wynalazku mają wpływ panujące warunki, techniki takie jak chromatografia wykluczania rozmiarów i analityczne odwirowywanie nie mogą być stosowane do określania ich rozmiarów. Zamiast tego do wykrywania i analizy mikroagregatów można stosować klasyczne (lub statyczne) rozpraszanie światła (CLS) przez pomiar zmętnienia. Można także stosować dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). Pomiary można przeprowadzać za pomocą specjalnego oprzyrządowania lub za pomocą fluorymetru z monochromatycznym wzbudzaniem i emisją ustawioną na tę samą długość fali (np. 467 nm z lampy ksenonowej lub 488 nm z lampy argonowej, które są różnią się od długości fal absorbowanych przez analizowany materiał) i/lub stosując odpowiednie filtry (np. żółte filtry) tak, aby fluorymetr działał jako fotometr CLS pod kątem 90°.

Podczas pomiaru rozproszenia światła, standardowym parametrem spektroskopu jest „stosunek Rayleigh'a (R®). Gdy rozproszenie światła prowadzi się pod kątem 90° w stosunku do kąta padania (tzn. gdy Θ=90°), wiadomo, że stosunek Rayleigh'a oznacza się jako R90 [patrz np. publikacja 42] i do pomiarów zmętnienia stosuje się rozproszenie pod kątem 90°.

Pomiary zmętnienia (intensywność rozproszenia przy 90°) mogą być normalizowane w stosunku do toluenu o jakości optycznej, tzn. pomiar zmętnienia dla standardowej próbki toluenu dzieli się przez R90 toluenu. Przez normalizację w ten sposób można oznaczyć absolutną wartość intensywności rozproszenia światła.

Dla mikroagregatów IL-2 wytwarzanych sposobem według wynalazku, zmętnienie można mierzyć przy 467 nm lub 488 nm, w 25°C. Przed oznaczaniem zmętnienia, kompozycje można odwirować lub przesączyć, w celu usunięcia dużych cząstek (np. wytrąconego białka), które w przeciwnym wyPL 196 430 B1 padku będą zniekształcać wyniki. Po odwirowaniu, kompozycje IL-2 według wynalazku korzystnie zachowują przynajmniej 97% (np. >98%, >99% lub więcej) całkowitej ilości IL-2 w supernatancie.

Pomiary zmętnienia dla mieszanin SDS/IL-2 mogą być przeliczone na wartości bezwzględnego zmętnienia właściwego (τ) w następujący sposób:

T_f

0.98η 3.2x10²

--xΤ C gdzie:

Ti oznacza intensywność zmętnienia kompozycji IL-2,

Tt oznacza intensywność zmętnienia kontrolnej próbki toluenu, C oznacza stężenie DL-2 w kompozycji IL-2.

Gdy mierzy się Ti i Tt w cm^-1, a C mierzy się w g/ml (tzn. g/cm³) to jednostką τ jest cm²/g. Jest to korzystny sposób określania zmętnienia właściwego kompozycji IL-2 według wynalazku.

Kompozycje według wynalazku mogą mieć zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g, lecz korzystnie większe niż 0,1 cm²/g. Korzystne kompozycje mają τ mniejsze niż 0,7 cm²/g. Kompozycje według wynalazku korzystnie mają τ w zakresie 0,3-0,6 cm²/g.

Jak to opisano w odnośnej publikacji 43, w szczególności w rozdziale 10, do określania średnicy hydrodynamicznej (lub promienia) cząstek w roztworze można stosować dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). Agregaty SDS/IL-2 według wynalazku mogą być wykrywane za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Z zastosowaniem DLS, korzystne agregaty mają średnią liczbowo średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm, korzystnie w zakresie 10 nm-15 nm, bardziej korzystnie w zakresie 11 nm-13 nm, a najbardziej korzystnie około 12 nm. Jak to pokazano Na figurze 17, agregaty mają średnice rozrzucone wokół tej średniej.

W praktyce, za pomocą DLS można wykryć pewną ilość dużych cząstek (np. pik 54 nm na figurze 17), lecz średnica hydrodynamiczna odnosząca się do powyższego jest średnicą głównego piku DLS, który typowo reprezentuje liczbowo przynajmniej 90% (np., przynajmniej 95%, przynajmniej 97%, przynajmniej 99%, przynajmniej 99,5% lub więcej) w widmie DLS. Zatem, przynajmniej 90% liczbowo cząstek wykrywanych przez DLS będzie mieć podaną wielkość średnią.

Interpretację danych DLS może zakłócać obecność składników wolniej zmieniających się, takich jak cząstki pyłu lub przez zjawisko mieszania. Dla uniknięcia tych zakłóceń, kompozycje IL-2 według wynalazku do pomiarów DLS korzystnie nie zawierają cząstek o średnicy większej niż około 1 μm (tzn. nie zawierają pyłów) i można to uzyskać przez zastosowanie odpowiednich filtrów, np. filtra 0,22 μm. Kompozycje powinny też być dobrze wymieszane przed pomiarem DLS. Jeśli pomiar DLS ujawnia składnik wolniej zmieniający się w kompozycji, pomiary powinny być odrzucone, a pomiar powinien zostać powtórzony na nowej próbce.

IL-2 jest dobrze znanym białkiem, a w sposobach i produktach według wynalazku można stosować dowolną odpowiednią postać IL-2. IL-2 jest zwykle ludzką IL-2 lub może być pochodną IL-2, która zachowuje aktywność biologiczną u ludzi.

IL-2 ulega naturalnej translacji u ludzi jako białko prekursorowe (np. 153-merowa w banku genów pod numerem dostępu NP._000577.2). Prekursor ulega rozszczepieniu (np. za Ser-20 w NP._000577.2) dając dojrzały produkt z N-terminalną alaniną ( Sekw. Id Nr: 4).

Podczas ekspresji w E. coli, naturalny peptyd sygnałowy zastępuje się zwykle pojedynczą resztą N-terminalnej metioniny (np. Sekw. Id Nr: 3 i 4). Podczas ekspresji, metionina ulega odszczepieniu bez interwencji pozostawiając naturalną ludzką N-terminalną resztę alaniny (np. Sekw. Id Nr: 3 zostaje przekształcona w Sekw. Id Nr: 1).

W IL-2 z PROLEUKIN™ brakuje naturalnej reszty Ala-1. Nieobecność zwykłej N-terminalnej alaniny oznacza, że IL-2 w PROLEUKIN™ jest formalnie określana jako postać „des-alanylo-1 dla IL-2. Postaci des-alanylo-1 dla IL-2 są korzystne do stosowania w wynalazku.

IL-2 z PROLEUKIN™ jest również zaprojektowana tak, że ma dwie wewnętrzne reszty cysteiny, zamiast naturalnych trzech. Zmniejsza to liczbę możliwości sparowania reszt cysteiny (a więc i tworzenia międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych) z trzech do jednego [46] i polepsza wydajność składania białka i trwałość w czasie przechowywania. Podstawienie reszty seryny za naturalną resztę Cys-125 [44] oznacza, że IL-2 w PROLEUKIN™ jest formalnie oznaczana jako postać „seryno125 IL-2. Postaci „seryno-125 IL-2 są korzystne do stosowania w wynalazku. Trójwymiarowa struktu10

PL 196 430 B1 ra krystaliczna postaci ser-125 ludzkiej IL-2 wyrażanej w E. coli jest dostępna w bazie danych struktur pod numerem dostępu „3INK. Można dokonać innych podstawień w sekwencji aminokwasów IL-2, szczególnie takich, w których podstawienie jest konserwatywne, tzn., które mają miejsce w rodzinie aminokwasów, które są związane w ich łańcuchu bocznym. Aminokwasy można podzielić na cztery rodziny: (1) kwasowe - aspartany, glutaminiany; (2) zasadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne - alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; (4) nienaładowane polarne - glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasami klasyfikowane jako rodzina aminokwasów aromatycznych. Można rozsądnie przewidywać, na przykład, że izolowane zastąpienie leucyny izoleucyną lub waliną, aspartanianu glutaminianem, treoniny seryną lub podobne zastąpienie zachowawcze aminokwasu strukturalnie podobnym aminokwasem nie będzie miało większego wpływu na biologiczną aktywność. Specjalista z tej dziedziny może łatwo określić regiony IL-2, które będą mogły tolerować zmiany oparte o naturalne wariacje, porównanie aktywnych postaci bia ł ek itd., a podstawione bia ł ka mogą być badane pod kątem aktywności biologicznej np. według normy 86/504.

Wskazówki dotyczące regionów białka IL-2, które można zmienić na drodze podstawiania reszt, delecji lub insercji można także znaleźć w stanie techniki (np. wzajemna zależność struktura/działanie i/lub badania wiązania), w takich publikacjach jak 45 do 52 itd. W publikacji 53 ujawniono różne mutanty IL-2 obejmujące: Asn-26-Gln, Trp-121-Phe, delecje wszystkich reszt poza Arg-120 i ich postaci Met-1. Publikacja 44 ujawnia IL-2 z delecją lub podstawieniem Cys-125 z lub bez N-terminalnej Ala. W publikacji 54 ujawniono podstawienie lub delecję reszt obejmujących numery 2, 3, 4, 5, 6, 104 i 125. Met-104 jest podatna na utlenianie, tak wię c mutacja tej reszty (np. podstawienie Glu, Val, Ala itp.) może polepszyć trwałość [55]. W publikacji 56 ujawniono podstawienie IL-2 na Asp-20 (za pomocą His lub Ile), na Asn-88 (za pomocą Arg, Gly lub Ile) i/lub na Gln-126 (za pomocą Leu lub Glu), które opisywano, jako mające zmniejszoną toksyczność i selektywność w stosunku do receptorów o dużym powinowactwie do IL-2. W publikacji 57 ujawniono podstawienie Arg-38-Ala i Phe-42-Lys w celu zmniejszenia toksyczności do zastosowania podczas immunoterapii. W publikacji 58 ujawniono mutację oryginalnej sekwencji tripeptydu Xaa¹-Asp-Xaa², gdzie Xaa¹ jest Leu, Ile, Gly lub Val a Xaa² jest Val, Leu lub Ser, w celu zmniejszenia nieszczelności naczyń. W publikacji 59 ujawniono peptydy z N-terminalną metioniną skondensowaną z pierwszymi 30 resztami IL-2, ewentualnie z podstawieniem Asp-20-Lys, o którym mówi się, że utrzymuje aktywność podobną do IL-2.

Inne znane podstawienia obejmują: T7A, T7D, T7R, KSL, K9A, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, Q11A, Q11R, Q11T, E15A, H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, 124L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34R, P34S, P34T, P34V, K35D, K351, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L361, L36K, L36M, L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38G, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, T41G, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M461, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, K64R, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P651, P65K, P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65W, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80F, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81K, R81L, R81M, R81N, R81P, R81T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, V91W, L94A, L94I, L94T, L94V, L94Y, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q1261 i Q126V.

Biologicznie czynne warianty IL-2 będą na ogół miały przynajmniej około 70% (np. >80%, >90%, >95%, >98%, >99%) identyczności sekwencji aminokwasów z sekwencją aminokwasów wykazywaną przez referencyjną cząsteczką polipeptydową IL-2, taką jak naturalna ludzka IL-2 omawiana powyżej. Wariant może różnić się, na przykład, tak niewielką liczbą jak 1 do 15 resztami aminokwasowymi, jak 1 do 10 resztami, jak 6-10 resztami, tak niewielką liczbą jak 5, jak 4, 3, 2 lub nawet 1 resztą aminokwasu.

Opisano również C-terminalne wydłużenie IL-2 [60]. IL-2 stosowana w wynalazku korzystnie nie zawiera żadnego takiego C-terminalnego wydłużenia.

Inne postaci IL-2, które można stosować, obejmują sekwencje nie pochodzące od człowieka. IL-2 może pochodzić, na przykład, od małpy rezus (Mucucu mulatto; numer dostępu GenBank P51498; pawiana oliwkowego (Papio unubis; GenBank Q865Y1), mangany czarnej (Cercoebus torquatus atys, P46649); makaka krabojada (Macaca fascicularis; Q29615; gibbona zwyczajnego (Hylobates lar; ICG12); saimiri wiewiórczą zwyczajną (Saimiri sciureus; Q8MKH2); krowy (Bos taurus; P05016 lub NP-851340); dojrzałych sekwencji reprezentowanych przez reszty 24-158 numer dostępu GenBank

PL 196 430 B1

NP-851340); bawołu wodnego (Bubalus baublis; Q95KP3); konia (Equus caballus; P37997); kozła (Capra hircus; P36835); owcy (Ovis aries; P19114); świni (Sus scrofu; P26891); jelenia (Cervus alaphus; P51747); psa (Canis familiaris; Q29416); kota (Felis catus; 407885); królika (Orytctolagus cuniculus; 077620); orki miecznika (Orcinus orca; 097513); północnego słonia morskiego (Miroungu angustirostris; 062641); myszy domowej (Mus musculus; NP.-032392); dzikiej myszy zachodniej (Mus spretus; 408867); szczura norweskiego (Rattus norvegicus; P17108); gerbila mongolskiego (Meriones unguiculatus; Q08081). Może być także stosowana dowolna z różnych postaci ujawnionych w tych depozytach GenBank. Depozyty GenBank generalnie ujawniają sekwencje prekursorowe, które, jak to opisano powyżej dla sekwencji ludzkiej, są obrabiane w celu otrzymania końcowej postaci biologicznie czynnej, np., przez odcinanie pierwszych 20 aminokwasów.

Postaci ludzkiej des-alanylo-1, seryno-125 IL-2 są szczególnie korzystne do stosowania w wynalazku. Najbardziej korzystna postać IL-2 ma 132-merową sekwencję aminokwasów pokazaną na figurze 2 (Sekw Id Nr: 1), jaką stwierdzono dla PROLEUKIN™. Kompozycje korzystnie nie zawierają IL-2 niezawierającej N-terminalnej Ala. Białko z figury 2 można poddawać ekspresji z zastosowaniem sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na figurze 4 (Sekw Id Nr: 2) po odcięciu N-terminalnej metioniny wytworzonej przez translację.

Konsekwencją wyrażania w komórkach gospodarza E. coli jest to, że IL-2 w produkcie PROLEUKIN™ nie jest glikozylowana. Do stosowania w wynalazku korzystna jest nieglikozylowana IL-2.

Sposoby wykrywania obecności IL-2 w kompozycji i jej ilościowego oznaczania są znane w stanie techniki. Najbardziej typowym sposobem jest wykrywanie immunologiczne z zastosowaniem przeciwciał anty-IL-2 (np. metoda ELISA) i sposób ten może być stosowany także do ilościowego oznaczania. Inne metody ilościowe obejmują analizę aminokwasów, oznaczanie białek metodą Lowry'ego ze standardem białkowym zatwierdzonym urzędowo, oznaczania HPLC i pomiary wewnętrznej absorbancji w ultrafiolecie.

Standardową ilościową jednostką miary dla IL-2 jest jednostka międzynarodowa (IU), która jest oparta nie na masie białka, lecz na aktywności w teście biologicznym. Zgodnie z normą 86/504 1 (jedna) IU jest ilością IL-2, która powoduje 50% maksymalnego rozrostu komórek ustalonej linii komórek CTLL-2 zależnej od IL-2 [61]. Ilościowe oznaczenie aktywności IL-2 w innych preparatach uzyskuje się przez porównanie krzywej odpowiedzi dawki preparatu z dostępnym standardem (np., ampułka standardowa IL-2 WHO, która po rekonstytucji zawiera 100 lU/ml) z zastosowaniem równoległej linii analizy, lub oprogramowania komputera, takiego jak program ALLFIT [62,63]. W praktyce, gdy wytwarzanie jest standaryzowane, to możliwa jest konwersja między masą leku a IU. Dla produktu PROLEUKIN™, na przykład, przeliczenie wynosi: 1,1 mg IL-2 równa się 18 x 10⁶ IU.

Aktywność można przeliczyć na aktywność właściwą (tzn. aktywność na jednostkę masy IL-2, np., lU/mg) dzieląc ją przez masę obecnej IL-2. Korzystna kompozycja według wynalazku ma aktywność właściwą między 16 a 17 MlU/mg.

W sposobach według wynalazku kompozycje farmaceutyczne uzyskuje się mikroagregaty IL2/SDS nadające się do zastosowania farmaceutycznego u ludzi i w ten sposób wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej zawierającej mikroagregaty IL-2/SDS według wynalazku. Przed podaniem pacjentom nie stosuje się raczej mikroagregatów pochodzących bezpośrednio z diafiltracji, lecz typowo sporządza się preparat.

Na przykład, mikroagregaty można rozcieńczać, w celu uzyskania odpowiedniego standaryzowanego stężenia jednak z zachowaniem stosunku IL-2/SDS. Typowe jest rozcieńczenie dające stężenie IL-2 około 1,1 mg/ml.

Mikroagregaty (np. po rozcieńczeniu) mogą być mieszane ze stabilizatorami, szczególnie, jeśli muszą być liofilizowane. Dla uzyskania stabilności podczas liofilizacji typowo dodaje się cukry (np. sacharozę, trehalozę), a korzystnym stabilizatorem jest mannit. Ten alkohol cukrowy można dodawać do uzyskania końcowego stężenia między 40 a 50 (np. około 45,5) mg mannitu na 1 mg IL-2 (50 mg dla 1,1 mg IL-2). Jako stabilizatora można dodawać także albuminę ludzkiej surowicy (korzystnie rekombinowaną). Można stosować także mieszaninę cukrów, np., sacharozy i mannitu, trehalozy i mannitu, itd.

Do kompozycji mikroagregatów można dodać bufor, np. bufor Tris, bufor histydynowy, bufor glicynowy lub, korzystnie bufor fosforanowy (np. zawierający diwodorofosforan (V) sodu i wodorofosforan (V) sodu).

PL 196 430 B1

Korzystne jest dodanie buforu dającego pH między 7,2 a 7,8, a w szczególności pH około 7,5.

Kompozycje zawierające mikroagregaty mogą być sterylizowane, typowo za pomocą sterylizacji przez filtrację, np. przez filtr 0,22 μm. Może być ona poprzedzona filtracją przez filtr o większych porach.

Wodne kompozycje zawierające mikroagregaty mogą być pakowane bezpośrednio do strzykawek gotowych do iniekcji. Mogą być one pakowane do nebulizatorów, gotowych do inhalacji.

Wodne kompozycje zawierające mikroagregaty mogą być liofilizowane przed rozprowadzaniem. Wodny lub liofilizowany materiał może być pakowany do pojemników (np. ampułek), które następnie mogą być hermetycznie zamykane. Liofilizacja typowo odbywa się w ampułkach, z zatopieniem po liofilizacji. Do pojedynczej ampułki można zapakować liofilizowany materiał równoważny 22 x 10⁶ IU IL-2, jako jednostka dawkowania, do rekonstytucji do objętości końcowej roztworu wodnego wynoszącej około 1,1 ml, co daje około 18 x 10⁶ lU/ml. Jako jednostki dawkowania można pakować także ułamkowe ilości tej dawki(np. 1/2¹½½ 1/3, 7 7¼¼¼ 1/5 1/8). W szczególności można stosować jednostki dawkowania zawierające około 9 x 10⁶ IU, około 4,5 x 10⁶ IU i około 14 x 10⁶ IU.

Do rekonstytucji po liofilizacji można stosować sterylną wodę do iniekcji. Możliwe jest także rekonstytuowanie liofilizowanego placka wodną kompozycją zawierającą albuminę ludzkiej surowicy (korzystnie rekombinant). Zalecana jest rekonstytucja do roztworu wodnego o objętości między 1,0 ml a 1,2 ml (tzn. IL-2 może być rozcieńczona w celu otrzymania takiego samego stężenia jak przed liofilizacją). Ten rekonstytuowany materiał, może być następnie aseptycznie rozcieńczony do większej objętości płynu do wlewów dożylnych np. do około 50 ml, roztworem D5W (iniekcja 5% dekstrozy). Zmętnienie właściwe podczas rozcieńczania za pomocą D5W pozostaje zasadniczo stałe aż do momentu, gdy stężenie IL-2 spadnie poniżej około 0,1 mg/ml. Rozcieńczanie może odbywać się w różnych pojemnikach, np. w butlach szklanych, workach z tworzywa sztucznego (np. z poli(chlorku winylu) itd. Należy unikać rozcieńczania dającego końcowe stężenie IL-2 poza zakresem 30-70 μg/ml. Należy unikać warunków, które powodują zmiany mikroagregacji, np. rekonstytucji za pomocą wody bakteriostatycznej do iniekcji lub 0,9% chlorku sodu do iniekcji.

Pierwszą korzystną kompozycją farmaceutyczną jest zatem wodna kompozycja o pH około 7,5, zawierająca 1,1 mg/ml IL-2, 0,18 mg SDS, 50 mg/ml mannitu i bufor fosforanowy, w której SDS i IL-2 tworzą mikroagregaty, w których przeciętna ilość cząsteczek IL-2 wynosi między 10 a 50. Takie kompozycje mogą być rekonstytuowane z liofilizowanego materiału.

Drugą korzystną kompozycją farmaceutyczną jest produkt rozcieńczania pierwszej korzystnej kompozycji farmaceutycznej za pomocą roztworu D5W.

Korzystne kompozycje nie zawierają środków konserwujących, nie zawierają antybiotyków i nie zawierają białek innych niż IL-2 (włącznie z kompozycjami nie zawierającymi HSA/albumin ludzkiego osocza) tzn. materiały te są niewykrywalne.

Leczonym pacjentem jest korzystnie człowiek, może to być dziecko (np. dziecko uczące się chodzić lub niemowlę), nastolatek lub dorosły, lecz na ogół jest to dorosły.

Zastosowania, sposoby i środki lecznicze są korzystne do leczenia raka, zwłaszcza raków z litymi guzami, takich jak rak nerkowokomórkowy lub czerniak, które mogą być rakami przerzutowymi. Zastosowania, sposoby i środki lecznicze mogą być wykorzystywane także do leczenia pacjentów, którzy otrzymali przeszczep tkanki lub narządu lub, którzy są przygotowywani do takiego przeszczepu. Zastosowania, sposoby i środki lecznicze mogą być stosowane także do leczenia pacjentów zainfekowanych wirusem HIV, obejmujących pacjentów z zespołem AIDS i bez tego zespołu.

Pacjenci do leczenia kompozycjami według wynalazku powinni być więc zdiagnozowani jako pacjenci z rakiem. Pacjenci, którzy nie powinni być leczeni kompozycjami według wynalazku obejmują (1) pacjentów z nadwrażliwością na IL-2 lub inny składnik kompozycji farmaceutycznej; (2) pacjentów ze statusem ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) > 2; (3) pacjentów z równoczesną obecnością statusu ECOG >1 i więcej niż jednym narządem z miejscem przerzutu i okresem <24 miesięcy między początkową diagnozą pierwotnego nowotworu a datą zakwalifikowania do leczenia IL-2; (4) pacjentów z istotną historią lub bieżącymi objawami poważnej choroby serca; (5) pacjentów z objawami aktywnej infekcji wymagającej leczenia antybiotykami; (6) pacjentów z PaO2 <60 mm Hg podczas odpoczynku; (7) pacjentów z wcześniej stwierdzoną poważną dysfunkcją głównych narządów i (8) pacjentów z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego lub napadowymi zaburzeniami, z wyjątkiem pacjentów leczonych z powodzeniem na przerzuty do mózgu.

Sposoby sprawdzania skuteczności leczenia terapeutycznego IL-2 są znane w dziedzinie.

Krzywe okresu półtrwania IL-2 w surowicy u ludzi po dożylnym podaniu dużej dawki lub wlewu mogą być określone jako bi-wykładnicze. Dla dużej dawki, T%a wynosi 8 minut, a Τ%β wynosi 88 miPL 196 430 B1 nut; dla wlewu Ty₂a wynosi 15 minut, a T/,β wynosi 96 minut. Obserwowane poziomy w surowicy są proporcjonalne do dawki IL-2.

Własności odpowiednich leków podane są powyżej w sekcji zatytułowanej „Kompozycje farmaceutyczne. Te kompozycje będą na ogół podawane bezpośrednio pacjentowi. Podawanie bezpośrednie można realizować przez iniekcję pozajelitową (np. dożylną, podskórną, dootrzewnową, domięśniową lub do przestrzeni czy tkanki jelitowej) lub doodbytniczo, doustnie, dopochwowo, miejscowo, transdermalnie, donosowo, do oczu, do ucha, do płuc lub innym typem podawania na śluzówkę. Jednak ogólnie IL-2 podaje się za pomocą iniekcji dożylnych (np. ciągłego wlewu lub jednej dużej porcji) lub za pomocą iniekcji podskórnych (np. ciągłego wlewu lub jednej dużej porcji).

Dozowanie IL-2 jest zwykle dostosowane do wielkości ciała pacjenta, mierzonej albo przez masę ciała (kg) lub polem powierzchni ciała (BSA; mierzonym w m², mierzonym lub szacowanym na podstawie kombinacji masy ciała i wzrostu pacjenta). Chociaż nie ma dokładnej konwersji między dozowaniem ma masę i powierzchnię, istnieje dobre przybliżenie: dla osoby o przeciętnej masie i wzroście (50-ciu percentyli dla każdego parametru) 25000 lU/kg = 1MIU/m².

Leczenie może odbywać się w schemacie jednodawkowym lub za pomocą wielu dawek. Dawki mogą być podawane w postaci dużej dawki (bolus) lub za pomocą wlewu. Typowy reżim podawania IL-2 obejmuje podawanie 18 x 10⁶ IU na 1 m² na 24 godziny w postaci ciągłego wlewu przez 5 dni z dalszym okresem 2-6 dni bez podawania IL-2 i następnym dodatkowym podawaniem dożylnym IL-2 przez 5 dni w postaci ciągłych wlewów jak poprzednio, a następnie 3 tygodniami bez otrzymywania IL-2. Jest to pojedynczy „cykl indukcji dla IL-2. Po okresie 3 tygodni odpoczynku po pierwszym cyklu, można zacząć drugi cykl. Można zastosować do czterech cykli podtrzymujących z 4-tygodniowymi przerwami u pacjentów, którzy odpowiadają lub mają chorobę ustabilizowaną. Jeśli pacjent nie może tolerować tego reżimu dawkowania, dawka powinna być jednak zmniejszona lub podawanie powinno być przerwane, aż do zmniejszenia toksyczności. Innym reżimem podawania IL-2 jest podawanie 6 x 10⁵ IU na kg masy ciała za pomocą jednej dużej dawki dożylnej co 8 godzin w 14 dawkach przez 5 dni, z drugim cyklem leczenia rozpoczynającym się po 9 dniowym okresie odpoczynku.

Korzystne podawanie obejmuje: dożylny wlew do leczenia przerzutowego raka nerkowokomórkowego iv, dożylny wlew do leczenia przerzutowego czerniaka, podskórne wstrzykiwanie dużej porcji do leczenia przerzutowego raka nerkowokomórkowego, podskórny wlew do leczenia przerzutowego raka nerkowokomórkowego, podawanie do płuc przez inhalację do leczenia przerzutowego raka nerkowokomórkowego z przerzutem do płuc.

Mikroagregaty IL-2 według wynalazku mogą być stosowane jako składnik czynny środków farmaceutycznych. Takie środki farmaceutyczne mogą być same stosowane do leczenia pacjentów lub mogą być stosowane w połączeniu z innymi składnikami czynnymi. Typowo IL-2 nie miesza się z innym składnikiem czynnym przed podawaniem; IL-2 i inny składnik czynny podaje się raczej jako oddzielne, niezależne leki według protokołu leczenia skojarzonego. Leczenie skojarzone nadaje się zwłaszcza do leczenia raków, obejmujących postaci złośliwe i przerzutowe.

Wynalazek dotyczy także zastosowania mikroagregatów IL-2 według wynalazku do wytwarzania leku, w którym lek przeznaczony jest do podawania pacjentowi, który był leczony wcześniej drugim środkiem farmaceutycznym. Podobnie, wynalazek dotyczy także zastosowania drugiego środka farmaceutycznego do wytwarzania leku, w którym lek przeznaczony jest do podawania pacjentowi leczonemu wcześniej mikroagregatami IL-2 według wynalazku. To wcześniejsze leczenie może być nieodległe w czasie (np. w ciągu 24 godzin poprzedzających podawanie wspomnianego leku), średnio odległe (np. ponad 24 godziny wcześniej, lecz nie dłużej niż w ciągu 4 tygodni poprzedzających podawanie wspomnianego leku), bardziej odległe (np. co najmniej 4 tygodnie wcześniej), lub bardzo odległe (np. co najmniej 6 miesięcy wcześniej), przy czym te odległości czasowe odnoszą się do ostatniej dawki wstępnego leczenia. Pacjent może być oporny na leczenie środkiem farmaceutycznym podawanym podczas leczenia wstępnego.

Wynalazek dotyczy także zastosowania mikroagregatów IL-2 według wynalazku do wytwarzania leku, który jest podawany wspólnie z drugim środkiem farmaceutycznym. Podobnie, wynalazek dotyczy także zastosowania drugiego środka farmaceutycznego do wytwarzania leku, który podawany wspólnie z mikroagregatami IL-2 według wynalazku. Te dwa środki podawane są korzystnie w ciągu 4 godzin kolejno po sobie.

PL 196 430 B1

Korzystnie drugi środek farmaceutyczny wybrany jest z następującej tabeli, która obejmuje także szczegóły dotyczące warunków, w których terapię skojarzoną można zastosować do leczenia (i jeżeli to konieczne, podstawowe szczegóły jak można podawać terapię skojarzoną):

Drugi środek	Do leczenia:
1	2
Przeciwciało anty-CD20, takie jak rytuksymab, ibritumomab lub tozytumomab, np. Rituxan™, Mabthera®, Zevalin™, HuMax-CD20™, Bexxar™	Chłoniak nieziarniczy (NHL). Przewlekła białaczka limfocytowa. Szczególnie, gdy pacjent z NHL jest oporny na leczenie rytuksymabem
Przeciwciało anty-CD40	Chłoniak nieziarniczy. Szpiczak mnogi. Przewlekła białaczka limfocytowa
Przeciwciało anty-Her2, takie jak trastuzumab, np. Herceptin™	Rak sutka. Szczególnie, gdy pacjent jest oporny na leczenie trastuzumabem
Przeciwciało anty-EGFR, takie jak cetuksymab, np. Erbitux™	Nie-drobnokomórkowy rak płuc lub rak odbytu. Szczególnie, gdy guz powoduje nadekspresję EGFR. Szczególnie, gdy pacjent jest oporny na leczenie cetuksymabem
Przeciwciało anty-VEGF, takie jak bewacyzumab, np. Avastin™	Rak odbytu
Przeciwciało anty-CD52, takie jak alemtuzumab, np. Campath™	Przewlekła białaczka limfocytowa
Przeciwciało anty-CD33, takie jak gemtuzumab, np. Mylotarg™	Ostra białaczka szpikowa
Agonista receptora H2, taki jak histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, np. dichlorowodorek histaminy	Zaawansowany czerniak złośliwy (np. w IV stadium), ostra białaczka pochodzenia szpikowego lub rak nerkowokomórkowy. Szczególnie, gdy pacjent ma przerzuty do wątroby. Oba środki mogą być podawane za pomocą iniekcji podskórnych. Dla czerniaka: iL-2 podskórnie dwa razy dziennie (BID) w dniu 1 i 2 w 1szym i 3-cim tygodniu i w dniach 1-5 w tygodniu 2-gim i 4- tym; diHCl histaminy podskórnie w ciągu 10-30 minut w dniach 1-5 przez wszystkie 4 tygodnie. W przypadku ostrej białaczki szpikowej, rozpoczęcie leczenia po przeszczepie autologicznych komórek macierzystych lub po chemioterapii
Laseczki Calmette-Guerina (BCG)	Rak pęcherza. IL-2 może być podawana za pomocą cewnika Foleya
Talidomid	Chłoniak nieziarniczy
Lenalidomid	Szpiczak mnogi
Inhibitory proteazomowe, takie jak bortezomib, np. Velcade™	Chłoniak nieziarniczy
„CVP, będący kombinacją cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu	Chłoniak nieziarniczy. Podawany za pomocą iniekcji dożylnych
„CHOP, będący kombinacją cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu	Chłoniak nieziarniczy. Cyklofosfamid, hydroksydoksorubicynę, winkrystynę podaje się za pomocą zastrzyków dożylnych, a prednizon podaje się w postaci tabletek doustnych
„CHOP-R będący kombinacją „CHOP i rytuksymabu	Chłoniak nieziarniczy. Szczególnie, gdy pacjent jest oporny na sam „CHOP lub sam R
„CVP-R będący kombinacją „CVP i rytuksymabu	Chłoniak nieziarniczy. Szczególnie, gdy pacjent jest oporny na sam „CVP lub sam „R
Interferon α („IFNa)	Rak sutka, rak odbytu lub nerkowokomórkowy
Interferon γ („INFy)	Rak

PL 196 430 B1 ciąg dalszy

1	2
5-fluorouracyl („5-FU)	Rak sutka, rak odbytu lub rak nerkowokomórkowy
Kombinacja 5-FU i INFa	Rak sutka, rak odbytu lub rak nerkowokomórkowy
Związki przeciw retrowirusom	HIV
Inhibitor tyrozynokinazy taki jak Bay43-9006 lub SU11248	Rak nerkowokomórkowy lub czerniak
Decytabina	Rak tarczycy, objawy dysplastyczne szpiku, czerniak lub rak nerkowokomó rkowy

Gdy drugim środkiem jest przeciwciało, jest to korzystnie przeciwciało monoklonalne, bardziej korzystnie przeciwciało humanizowane lub ludzkie. Przeciwciała są generalnie podawane za pomocą iniekcji, np. podskórnie lub dożylnie. Przeciwciała mogą być sprzężone z innymi środkami czynnymi,

131 np. z tiuksetanem, ozogamicyną, nuklidami promieniotwórczymi, jodem ¹³¹J itd., szczególnie w leczeniu raka.

Ogólnie, drugim środkiem może być przeciwciało, które dostarcza ADCC (cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał). Leczenie skojarzone oparte na IL-2 jest bardziej przydatne z przeciwciałami, które przy leczeniu raka pośredniczą w ADCC, aniżeli ze środkami, które leczą raka przez hamowanie unaczynienia lub przez zmianę transdukcji sygnału cyklu komórkowego.

Określenie „zawierający obejmuje „zawierający w sobie jak i „składający się z, np. kompozycja „zawierająca X może składać się wyłącznie z X lub może zawierać coś dodatkowego obok X, np. X + Y.

Określenie „około w odniesieniu do wielkości liczbowej x oznacza, na przykład, x±10%. Gdy to konieczne określenie „około można pominąć.

Określenie „zasadniczo nie wyklucza „całkowicie, np. kompozycja zasadniczo niezawierająca Y może zupełnie nie zawierać Y. Gdy to konieczne określenie „zasadniczo można pominąć w definicjach według wynalazku.

Procent identyczności sekwencji można określić stosując algorytm badań homologii SmithaWatermana, z zastosowaniem poszukiwania afinicznych przerw z otwartą sekcją karną przerwy 12 i sekcją karną długości przerwy 2, matrycy BLOSUM 62. Algorytm badań homologii Smitha-Watermana jest podany w publikacji 64.

Na figurze 1 pokazano zwiększenie zmętnienia właściwego (τ) w funkcji usuwania SDS podczas diafiltracji.

Na figurach 2 i 3 pokazano sekwencję aminokwasów IL-2 w produkcie PROLEUKIN™ ( Sekw. Id Nr 1). W tej sekwencji (i) brak N-terminalnej metioniny z Sekw. Id Nr 3, (ii) brak reszty alaniny stwierdzonej dla N-terminalnej naturalnej dojrzałej ludzkiej IL-2, jak to widać w Sekw. Id Nr 4 i (iii) występuje podstawienie seryny na reszcie Cys-125 widocznej w Sekw. Id Nr 4.

Na figurze 4 pokazano sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję z figury 2 (Sekw. Id Nr 2, która obejmuje kodony startowy i stop i jest wyrażana jako Sekw. Id Nr 3 przed odcięciem N-terminalnej metioniny). Numery po lewej podają numer pierwszej zasady w każdym rzędzie, licząc od końca 5' łańcucha (+DNA) genu IL-2. Numery pod sekwencją aminokwasu wskazują numery reszt, licząc od N-końca naturalnej ludzkiej IL-2. Strzałki wskazują różnice nukleotydów w stosunku do ludzkiej IL-2 (tzn. różnice między Sekw. Id Nr 2 i 5).

₂

Na figurze 5 pokazano zmętnienie właściwe (τ, cm²/g) siedmiu próbek stosowanych w badaniach farmakokinetycznych z różnymi stężeniami SDS (ug SDS na mg IL-2), a na figurze 6 pokazano udział całkowitej IL-2, która może być przekształcona do postaci tabletki przez odwirowywanie tych siedmiu próbek.

Na figurze 7 pokazano aktywność biologiczną osocza dla sześciu z siedmiu próbek. Na figurze 8 porównano próbki o zawartości 160 μg/mg i 25 μg/mg a figura 9 jest połączeniem figur 7 i 8. Na osi X pokazano czas (w godzinach) po iniekcji, na osi Y pokazano aktywność biologiczną osocza (ng/ml).

Na figurze 10 pokazano τ (cm²/g) w funkcji stężenia SDS (mg/ug) podczas diafiltracji a figura 11 przekształca τ w MW/ciężar cząsteczkowy w (kDa/kilodaltony).

Na figurze 12 pokazano spadek stężenia SDS podczas diafiltracji.

Na figurze 13 nałożono wyniki zmętnienia z figury 10 na profil usuwania SDS z figury 12.

PL 196 430 B1

Na figurze 14 pokazano wpływ liofilizacji na τ (cm²/g). Kwadraty wskazują wartości przed liofilizacją a kółka wskazują wartości po liofilizacji. Na osi X podano stężenie SDS w próbkach (Lg/mg).

Na figurze 15 pokazano aktywność biologiczną mikroagregatów IL-2 przed i po rozcieńczeniu surowicą w porównaniu z monomerową IL-2.

Na figurach 16 i 17 pokazano widmo dynamicznego rozpraszania światła dla mikroagregatów IL-2. Na figurze 16 przedstawiono rozkład masowy składników roztworu, a na figurze 17 rozkład liczbowy.

P r z y k ł a d y

1) Wytwarzanie mikroagregatów IL-2

E. coli transformowane plazmidem niosącym sekwencję nukleotydów z figury 4 hodowano w standardowych warunkach tak, aby spowodować ekspresję białka IL-2 mającego sekwencję z figury 2. Po hodowli IL-2 znajdowała się w przeważającej ilości w postaci ciałek inkluzyjnych.

Pierwotne odzyskiwanie IL-2 obejmowało zatężanie, rozrywanie komórek, diaflitrację, inaktywację, ponowne rozrywanie komórek i zawieszanie w sacharozie. W celu około 5 krotnego zmniejszenia objętości do obróbki przeprowadzono zatężanie zebranych komórek stosując filtry przepływowe. Komórki rozrywano przez homogenizację, w celu ułatwienia wyodrębniania ciałek inkluzyjnych IL-2. Sole z pożywki fermentacyjnej usuwano przez diafiltrację i przez dodanie alkoholu zabijano komórki gospodarza w diafiltrowanym roztworze. Po traktowaniu alkoholem komórki rozrywano przez homogenizację. Dodano sacharozę, w celu otrzymania mieszaniny o większej gęstości, co umożliwia oddzielenie ciałek inkluzyjnych IL-2 od resztek komórkowych podczas odwirowywania. Pastę cząstek IL-2 zbierano przez odwirowywanie, dzielono na porcje i składowano w temperaturze -70°C lub niższej aż do dalszej obróbki.

Pastę z cząstek IL-2 solubilizowano za pomocą SDS i redukowano ditiotreitolem (DTT), w celu otrzymania monomerycznej rozpuszczalnej postaci IL-2, bez jakichkolwiek wiązań disiarczkowych. Ten etap procesu przeprowadzano, w celu zwiększenia wydajności podczas chromatografii IL-2 w następnym etapie.

Monomeryczną, rozpuszczalną postać IL-2 oczyszczano sposobem obejmującym: chromatografię z wykluczaniem rozmiarów (SEC), utlenianie, zatężanie metodą HPLC-RP, wytrącanie i odwirowywanie. Pierwszy etap - chromatografię SEC, przeprowadzano w celu oddzielenia IL-2 od białek gospodarza i kwasów nukleinowych. Zbierano frakcje zawierające IL-2 i zlewano razem i pulowano. Utleniano IL-2 w celu otrzymania międzycząsteczkowych wiązań disiarczkowych. Zatężanie roztworu IL-2 przeprowadzano za pomocą ultrafiltracji, w celu zmniejszenia objętości do obróbki. Drugi etap, preparatywną chromatografię HPLC-RP, przeprowadzano w celu oddzielenia IL-2 od bakteryjnych endotoksyn, kwasów nukleinowych i białek gospodarza oraz w celu usunięcia izoform IL-2 obejmujących postaci utlenione. Zbierano i zlewano frakcje zawierające IL-2. Wytrącano IL-2 przez dodawanie wodorotlenku sodu (NaOH) i zbierano przez odwirowywanie. Ten etap procesu przeprowadzono w celu usunięcia rozpuszczalników stosowanych w oczyszczaniu HPLC-RP. Materiał na tym etapie określano jako „pasta HPLC. Pastę HPLC ponownie solubilizowano przez dodanie roztworu 0,05 molowego Na2HPO4 + 1% SDS. Po dodaniu SDS do odpowiedniego stężenia kompozycja zawierała głównie solubilizowaną monomeryczną IL-2, ale i niewielkie ilości oligomeru IL-2 (tzn. kowalencyjnie związanych cząsteczek IL-2 w postaci oligomerów), które mogły powstać podczas oczyszczania. Te oligomery usuwano za pomocą filtracji żelowej, w której usuwano także resztki rozpuszczalników organicznych z poprzednich etapów.

Ponieważ SDS może być toksyczny dla komórek, jest on usuwany z solubilizowanej IL-2. Roztwór poddawano diafiltracji wobec 10 nM buforu fosforanowego o pH 7,5 aż do uzyskania poziomu SDS około 160 Lg/mg IL-2. Mikroagregaty IL-2 i SDS zaczynały się tworzyć przy stężeniu około 500600 Lg/mg i ich wymiary stopniowo zwiększały się przy dalszym zmniejszaniu stężenia SDS do stężenia docelowego 160 Lg/mg (figura 1). To usuwanie SDS, które jest kluczowe dla tworzenia się mikroagregatów, jest ostatnim etapem procesu oczyszczania IL-2 przed sporządzaniem preparatów.

2) Sporządzanie preparatów z mikroagregatów IL-2 do stosowania farmaceutycznego

Diafiltrowaną mieszaninę SDS/IL-2, zawierającą mikroagregaty, badano na stężenie białek (mg/ml) dzieląc jej absorbancję przy 280 nm przez współczynnik ekstynkcji IL-2 (0,79). Mierzono także objętość diafiltrowanego roztworu IL-2 (ml). Całkowitą ilość białka IL-2 (mg) obliczano przez mnożenie objętości diafiltrowanego roztworu IL-2 przez stężenie białka. Końcową obrabianą objętość (ml) do sporządzania preparatu obliczano przez mnożenie całkowitej ilości białka w mg przez współczynnik 0,909. Ten współczynnik uwzględnia stratę IL-2 podczas filtracji.

PL 196 430 B1

W celu stabilizacji IL-2 podczas liofilizacji dodawano ¼ objętości roztworu mannitu o stężeniu 20%, w celu uzyskania końcowego stężenia mannitu wynoszącego 5% (tj. 50 mg/ml). Do końcowej obrabianej objętości dodawano także 10 mmolowy bufor fosforanu sodu pH 7,5. Po dodaniu mannitu i buforu oznaczano stężenie IL-2 w sporządzonym roztworze przez mierzenie absorbancji przy 280 nm.

Końcowym wynikiem po sporządzeniu roztworu był roztwór dopełniający o pH 7,5 zawierający IL-2 w końcowym stężeniu 1,1 ± 0,05 mg/ml; 0,18 mg/ml SDS; 50 mg/ml mannitu; 0,17 mg/ml monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg/ml dizasadowego fosforanu sodu.

Sporządzony roztwór IL-2 sterylizowano przez filtrację do sterylnego pojemnika zbiorczego. Z tego zbiorczego pojemnika materiał przenoszono do sterylnych ampułek. Do każdej ampułki wprowadzano 1,2 ml roztworu. Następnie ampułki umieszczano w aparaturze do liofilizacji i suszono przez wymrażanie. Następnie nakładano zaślepki i szczelnie zamykano. Następnie ampułki znakowano i pakowano.

3) Wpływ stężenia SDS na zmętnienie

Przed uzyskaniem korzystnego zakresu stężenia SDS, IL-2 wytwarzano metodą opisaną powyżej z tym wyjątkiem, że w różnych momentach diafiltracji usuwano duże próbki (~300 mg IL-2) do badań zmętnienia, w celu określenia wpływu SDS na agregację IL-2.

Na figurze 12 pokazano stężenie SDS podczas diafiltracji materiału wyjściowego. Stężenie zmniejszało się w sposób liniowy na osi logarytmicznej. Próbki pobierano przy następujących stężeniach SDS (1 ąg na 1 mg IL-2): 1195, 536, 351,217, 173, 137, 123, 104 i 72.

Czystość IL-2 była taka sama w każdej próbce (100%, metodą SDS-PAGE, >98,5% metodą HPLC). Zmętnienie mierzono przy 488 nm i przeliczano na bezwzględne zmętnienie właściwe (τ) jak to opisano wyżej, w oparciu o stężenie IL-2 w próbkach. Wyniki zostały pokazane na figurze 10, zaś figura 13 nakłada wyniki zmętnienia na profil usuwania SDS przedstawiony na figurze 12.

Poniżej około 300 ąg/mg zmętnienie stopniowo rośnie i ten wzrost staje się bardzo gwałtowny poniżej około 95 ąg/mg.

Wartości τ mogą być przeliczone na wynikowy ciężar cząsteczkowy za pomocą następującego wzoru τχ10⁷ ^MW = 8.1 + 2τ

Wyniki tego przeliczenia dla próbek przed liofilizacją zostały pokazane na figurze 11. Te i inne dane wskazują, że MW odpowiadający monomerycznej IL-2 jest widoczny przy stężeniu powyżej 600 ąg/mg, a MW zaczyna znacznie się zwiększać, gdy stężenie SDS jest poniżej około 300 ąg/mg, zaś wzrost ten staje się bardzo gwałtowny, gdy stężenie SDS spadnie poniżej około 100 ąg/mg.

W oparciu o MW monomerycznej IL-2 (15,3 kDa dla naturalnej IL-2), ciężar cząsteczkowy agregatu może być przeliczony na wydedukowaną ilość monomerycznych IL-2 w agregacie.

4) Liofilizacja i zmętnienie właściwe

Podczas diafiltracji, w celu usunięcia SDS, pobierano próbki po 15 ml przy następujących stężeniach SDS: 1155, 840, 585, 400, 190 i 155 ąg/ml IL-2. Określano zmętnienie tych próbek zarówno przed sporządzaniem preparatu jak i po (tzn. po dodaniu mannitu, buforu fosforanowego, liofilizacji i rekonstytucji). W obu przypadkach pomiary zmętnienia poprzedzono filtracją przez filtr 0,22 ąm, w celu usunięcia jakichkolwiek większych agregatów.

Na figurze 14 pokazano wpływ liofilizacji na τ (w skali logarytmicznej) dla tych próbek. Na wykresie pokazano, że liofilizacja nie niszczy mikroagregatów, lecz często trochę zwiększa zmętnienie właściwe (tzn. mikroagregaty zwiększają wymiary), bez naruszania zależności od stężenia SDS. Ten wpływ jest generalnie mniejszy w korzystnym zakresie SDS.

5) Dynamiczne rozpraszanie światła

Wytwarzano mikroagregaty IL-2 jak to opisano powyżej przy stężeniu SDS 160 ąg/mg i analizowano za pomocą DLS. Wyniki pokazano na figurach 16 i 17. Na figurze 16 pokazano wyniki DLS w odniesieniu do masy składników roztworu, a na figurze 17 pokazano je liczbowo.

Na figurze 16 główny pik ma średnią średnicę hydrodynamiczną wynoszącą 12,7 nm, reprezentującą 99,02% masy całkowitej. Występuje także dalszy pik o średniej średnicy hydrodynamicznej 55,6 nm, reprezentujący pozostałe 0,98% masy. Na figurze 17 główny pik ma średnią średnicę hydro18

PL 196 430 B1 dynamiczną wynoszącą 11,7 nm, reprezentującą 99,99% całkowitej liczby cząstek. Występuje także dalszy pik o średniej średnicy hydrodynamicznej 53,7 nm, reprezentujący pozostałe 0,01% cząstek.

6) Porównanie mikroagregatów z monomeryczną IL-2

Mikroagregaty IL-2 porównywano z monomeryczną IL-2 w różnych testach. Mikroagregaty IL-2 wytwarzano jak to opisano wyżej. Do celów porównawczych, IL-2 wytwarzano w postaci monomerycznej, w której zamiast SDS jako detergent stosowano Tween 80. Ten detergent nie tworzy mikroagregatów z IL-2 lecz solubilizuje IL-2 i daje monomeryczny produkt biologicznie czynny.

Potwierdzono, że obie postaci są biologicznie czynne. Agregaty IL-2 miały aktywność około 20 MlU/mg. Po rozcieńczeniu za pomocą surowicy ex vivo, aktywność nieco spadała. W obu przypadkach, aktywność była nieco wyższa niż dla monomerycznej IL-2 (figura 15). Tak więc mikroagregaty według wynalazku są zdolne do dysocjacji dając produkt biologicznie czynny, a aktywność biologiczna jest równa aktywności IL-2 nie poddawanej agregacji.

Porównywano in vivo rozkład IL-2 znakowanej promieniotwórczo po podaniu dożylnym białka albo w postaci mikroagregatów z SDS, albo w postaci monomerycznej. Postać mikroagregowana korzystnie przedostaje się do płuc, wątroby i nerek, podczas gdy produkt monomeryczny prawie w 100% przedostaje się do nerek. Mikroagregacja ma więc wpływ na rozkład produktu in vivo.

Zmikroagregowaną IL-2 i monomeryczną IL-2 porównywano także w przerzutowym modelu nowotworu. Komórki nowotworu B16F10 wstrzykiwano dożylnie do ogona myszy i 14 dni później badano płuca na obecność guzów. Zwierzęta doświadczalne otrzymywały codziennie IL-2 od dnia 3 do 10. Przeciętna ilość przerzutów płucnych w 14 dniu przedstawiała się następująco:

Dawka (mg/kg)	Mikroagregaty IL-2/SDS	Monomeryczna IL-2/Tween 80
15	1	16
10	3	26
7,5	4,5	49
5	24	53,5
1	60	59,5
0,1	88,5	72

Postać IL-2 z mikroagregatami, jest więc bardziej skuteczna w modelu nowotworu niż postać monomeryczna dzięki temu, że można zapobiec przerzutom stosując znacznie mniejsze dawki IL-2. Ponieważ IL-2 może sama być toksyczna, dane te jednak nie mogą być bezpośrednio porównywalne, np. 10 mg/kg mikroagregatów może zabić około ½ badanej populacji. Najważniejszym porównaniem jest zatem najwyższa nieśmiertelna dawka, a mianowicie dawka 7,5 mg/kg. Przy tej dawce o takiej samej toksyczności, przeciętna ilość przerzutów widocznych dla mikroagregatów wynosiła 4,5 (zakres 1-18) w porównaniu z 16 (zakres 4-57) dla monomerycznej IL-2, czyli dawała różnicę statystycznie istotną. Różnica przedstawia 3- do 5-krotnie lepszy współczynnik terapeutyczny dla IL-2 w postaci mikroagregatów.

Dalsze badania z tym sztucznym przerzutowym modelem B16 ujawniły, że zawartość SDS w końcowym produkcie nie wydaje się wpływać na skuteczność. Na przykład, kompozycja zawierająca 160 μg/mg SDS zachowywała się w ten sam sposób jak kompozycja ze 181 μg/mg. Przy zawartości SDS w zakresie 95-250 μg/mg aktywność przeciwnowotworowa pozostaje optymalna, przy czym unika się toksyczności związanej z SDS.

7) Wpływ farmakokinetyczny końcowego stężenia SDS

Jak to pokazano wyżej, zmętnienie mieszanin IL-2/SDS zwiększa się przy zmniejszaniu poziomów SDS podczas diafiltracji. W teście farmakokinetycznym, diafiltrację kontynuowano poniżej typowej wartości docelowej 160 μg/mg aż do 25 μg/mg. Podczas procesu diafiltracji pobierano próbki w różnych momentach: 1090 μg/mg, 200 μg/mg, 160 μg/mg, 125 μg/mg, 95 μg/mg, 65 μg/mg i 25 μg/mg.

Wszystkie próbki za wyjątkiem najbardziej rozcieńczonej (25 μg/mg) były wyraźnie przezroczyste, przy czym na figurze 5 pokazano zmętnienie właściwe (τ) tych siedmiu próbek. Spadek τ dla najniższego stężenia odzwierciedla olbrzymie zwiększenie w wytrącaniu się białka przy stężeniu

PL 196 430 B1 μg/mg, co było widoczne gołym okiem. Na figurze 6 pokazano udział całkowitej IL-2, która może być osadzona przez odwirowanie w siedmiu próbkach i przy najniższym stężeniu SDS widoczny jest duży wzrost, podczas gdy przy wyższych stężeniach są one zasadniczo stałe. Ten wytrącony materiał osadza się i nie powoduje zmętnienia, wyjaśniając tym samym małą wartość τ z figury 5.

W przeciwieństwie do zmian zmętnienia i wytrącania się, aktywność biologiczna (IU) była zasadniczo stała dla siedmiu próbek (około 19 lU/mg).

Do badań farmakokinetycznych, wszystkie próbki, za wyjątkiem najbardziej rozcieńczonej, wstrzykiwano jako bolus do żyły ogonowej szczurów (potrójnie na dawkę SDS, łącznie 18 szczurów) z dawką 0,2 mg IL-2 na 1 kg masy ciała, w oparciu o allometryczną ekstrapolację dawki dla ludzi. Pobierano próbki krwi po 1, 3, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 i 60 minutach po iniekcji i oznaczano aktywność biologiczną IL-2. Na figurze 7 pokazano aktywność biologiczną osocza (ng/ml) dla tych próbek. W okresie między 0,5 godziny a 1 godziną linię górną stanowi dawka 160 μg/mg () a najniższą linią jest dawka 65 μg/mg (Δ), chociaż wszystkie linie są bardzo podobne.

W drugim badaniu, próbkę z najwyższą linią z pierwszego doświadczenia (160 μg/mg) porównywano z najbardziej rozcieńczoną próbką 25 μg/mg). Parametry farmakodynamiczne próbki 160 μg/mg w drugim badaniu odpowiadały stwierdzonym w pierwszym badaniu. Podczas gdy linie na figurze 7 mają wszystkie podobny kształt, najbardziej rozcieńczona próbka daje jednak bardzo różne wyniki (figura 8). Szybkość klirensu obliczona z krzywej różni się ~30 krotnie: 12,7 ml/min/kg dla dawki 160 μg/mg i 362 ml/min/kg dla dawki 25 μg/mg.

Gdy porównuje się wyniki z tych dwóch doświadczeń, najbardziej rozcieńczona próbka jest wyraźnie inna niż pozostałe sześć próbek (figura 9).

Tak więc stan agregacji IL-2 ma wyraźny wpływ na farmakokinetykę in vivo.

8) Wolny SDS

W powyższych doświadczeniach mierzono całkowite stężenie SDS w mieszaninach SDS/IL-2. Przeprowadzono doświadczenia, aby stwierdzić jaka ilość z całkowitej ilości SDS była związana z IL-2 i ile pozostawało w stanie wolnym w roztworze.

Ampułki z produktem PROLEUKIN™ rekonstytuowano zgodnie z zaleceniami i poddano ultrafiltracji przez membrany Centricon 10 (odcinanie 10 kDa) przez dwa wirowania przy 3000 obrotach na minutę (rpm) po 30 minut każda. Próbkę wyjściową i przesącz badano na zawartość SDS i IL-2. SDS mierzono testem z oranżem akrydynowym [35]. W skrócie, test ten obejmuje: pobranie 0,5 ml próbki, dodanie 0,1 ml 1,75 molowego roztworu NaHSO4, dodanie 0,1 ml 1% roztworu (wag./obj.) oranżu akrydynowego, dodanie 1,5 ml toluenu, uszczelnienie, wirowanie w aparacie vortex przez 3 minuty, oddzielanie fazy organicznej i wodnej, np., przez wirowanie przez 5 minut przy 3000 rpm w temperaturze pokojowej, mierzenie absorbancji górnej fazy organicznej przy 499 nm. Próbki mogą być rozcieńczane (np. czystą wodą) przed oznaczaniem, dla doprowadzenia ich do zakresu krzywej standardowej, np. jeśli krzywa standardowa bazuje na znanych stężeniach SDS do 25 μg/ml to próbkę powinno się rozcieńczyć, w celu doprowadzenia stężenia SDS do tego zakresu. Ślepą próbą dla etapu spektrofotometrii powinna być próbka standardowa zawierająca zero SDS, którą obrabia się w ten sam sposób jak próbkę doświadczalną.

Wyniki pokazały, że IL-2 była całkowicie zatrzymywana przez membrany do ultrafiltracji (niewykrywalna w przesączu), podczas gdy około 35% SDS było zdolne do przechodzenia przez membranę.

Jest zrozumiałe, że wynalazek został opisany tylko na zasadzie przykładu i można dokonać modyfikacji szczegółów nie odchodząc od ducha i zakresu wynalazku.

Odnośniki (ich treść włącza się w całości jako odniesienie)

[1] Hora i inni (1990 Biotechnology (N.Jork) 8:755-8.

[2] Opis patentowy USA Nr 4569790.

[3] Meyers i inni (1991) Clin Pharmacol Ther. 49:307-13.

[4] Opis patentowy USA Nr 4604377.

[5] Hora i inni (1992) Dev Biol Stand 74:295-306.

[6] Publikacja WO 85/04328.

[7] Opis patentowy USA Nr 4748234.

[8] Ho i inni (1992) Vaccine 10:209-13.

[9] Geigert i inni (1993) Rozdział 8 Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs:

Case Histories (Wyd.: Wang i Pearlman) ISBN 0-306-44365-1.

[10] Vemuri (1992) Dev Biol Stand. 74:341-51.

PL 196 430 B1

[11] Andersen i inni (1992) Am J Hosp Pharm 49:608-12.

[12] Johnston i inni (1992) Pharm Res 9:425-34.

[13] Anderson i inni (1992) J Immunother 12:19-31.

[14] Anderson i Sorenson (1994) Clin Pharmacokinet 27:19-31.

[15] Konigsberg i inni (1998) Biochim Biophys Acta 1370:243-51.

[16] Kanaoka i inni (2001) J Pharm Pharmacol 53:295-302.

[17] Ozbas-Turan i inni (2002) J Pharm Sci 91:1245-51.

[18] Bergmann i inni (1991) Mol Imunol 28 (1-2) : 99-105.

[19] Opis patentowy USA Nr 4 908 434.

[20] Opis patentowy USA Nr 4 925 919.

[21] Opis patentowy USA Nr 4 853 322.

[22] Opis patentowy USA Nr 5 464 939.

[23] Opis patentowy USA Nr 5 824 330.

[24] Opis patentowy USA Nr 4 778 879.

[25] Opis patentowy USA Nr 4 992 271.

[26] Opis patentowy USA Nr 5 037 644.

[27] Opis patentowy USA Nr 5 078 997.

[28] Opis patentowy USA Nr 4 816 440.

[29] Opis patentowy EP-B-0268110.

[30] Opis patentowy EP-B-0217645.

[31] Heining i Vogt (1999) Electrophoresis 20:3311-28.

[32] Nomura i Murakami (1999) Bunseki Kagaku 48:111-6.

[33] Fielden i Claesson (1998 J Colloid Interface Sci 198:261-5.

[34] Gabor i May (1996) Abstrakt Nr C-04, 1996 FDA Science Forum Poster Abstracts.

[35] Sokoloff i Frigon (1981) Analytical Biochem 118:138-41.

[36] Arakawa i inni (1994) Int J Pept Protein Res 43:583-7.

[37] Opis patentowy USA Nr 4 738 927.

[38] Opis patentowy USA Nr 4 656 132.

[39] Opis patentowy USA Nr 4 530 787.

[40] Opis patentowy USA Nr 4 572 798.

[41] Opis patentowy USA Nr 4 931 543.

[42] Rozdział 8 Biological Spectroscopy (Campbell i Dwek), ISDN 0-8053-1849-6.

[43] Piccora (1985) Dynamic Light Scattering. Plenum Press, Nowy Jork.

[44] Opis patentowy USA Nr 4 518 584.

[45] Bazan (1992) Science 224:1431-3.

[46] Wang i inni (1984) Science 224:1431-3.

[47] McKay (1992) Science 257:412.

[48] Theze i inni (1996) Immunol Today 17:481-6.

[49] Buchli i Ciardelli (1993) Aren Biochem Biophys 307: 411-5.

[50] Collins i inni (1998) PNAS USA 85:7709-13.

[51] Kuziel i inni (1993) J Immunol 150:5731.

[52] Eckenberg i inni (1997) Cytokine 9:488-98.

[53] Opis patentowy EP-A-0136489.

[54] Opis patentowy USA Nr 4 752 585.

[55] Opis patentowy EP-A-0200280.

[56] Publikacja WO 99/60128.

[57] Opis patentowy USA Nr 5 229 109.

[58] Publikacja WO 00/58456.

[59] Opis patentowy USA Nr 6 168 785.

[60] Ahmad i inni (1994) J Protein Chem 13:591-8.

[61] Gearing i Thorpe (1988) J Immunol Metod 114:3-9.

[62] Rossio (1997) Cytokines and immune celi products, strony 348-356 z podręcznika Manual of Clinical and Laboratory Immunology, wyd.: 5-te (wydawcy Rose, deMacario, Folds, Lane, Nakamura).

[63] Wadhwa i inni (2000) Quantitive biological assays for individual cytokines. Strony 207-239 z Cytokine Cell Biology: A practical Approach (wyd. Balkwill) ISBN 0-19-963860-8.

[64] Smith i Waterman (1981) Adv Appl Math 2:482-9.

PL 196 430 B1

LISTA SEKWENCJI <110> CHIRON CORPORATION <120> Sposób wytwarzania interleukiiiy-2 do zastosowania farmaceutycznego, sposób wytwarzania kompozycji,kompozycja zawierająca interleukinę-2, liofilizowana kompozycja, liofilizowana farmaceutyczna kompozycja, wodna farmaceutyczna kompozycja, zestaw, zastosowanie mikroagregatów, zastosowanie kompozycji, zastosowanie drugiego środka farmaceutycznego <130> REF. RZECZNIKA <160> 5 <170> SeqWin99, wersja 1.02 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Dojrzale warianty des-alanyl-1 seryno-125 ludzkiej interleukiny-2 <400> 1

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu

10 15

Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gin Ser Ile He 115 120 125

Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Warianty des-alanyl-1 seryno-125 ludzkiej interleukiny-2

PL 196 430 B1 <400> 2 atgcctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttctcagag catcatctca acactgactt ga 402 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Powstający wariant des-alanyl-1 seryno-125 ludzkiej interleukiny-2 <400> 3

Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 15 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn He Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gin Ser Ile 115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130
<210>	4
<211=-	133
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	4

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Gin His 15 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

PL 196 430 B1

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile 115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 405 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Sekwencja ludzkiej IL-2 z Met w miejscu sygnałowym <400> 5 atggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttgtca aagcatcatc tcaacactaa cttga 405

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania interleukiny-2 do stosowania farmaceutycznego, znamienny tym, że obejmuje etapy: (a) dodawania dodecylosiarczanu sodu (SDS) do kompozycji zawierającej interleukinę-2 z wewnątrzcząsteczkowymi mostkami disiarczkowymi, do otrzymania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; (b) usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 c) częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg IL-2.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, obejmuje etapy: oczyszczania IL-2 przez RPHPLC; wytrącania IL-2; dodawania SDS do wytrąconej IL-2 do otrzymania końcowego stężenia SDS przynajmniej 500 μg SDS na 1 mg IL-2; usuwania przez filtrację żelową wytrąconych kowalencyjnie połączonych multimerów IL-2 i częściowego usuwania SDS w celu zmniejszenia jego stężenia SDS, z wytworzeniem kompozycji, która zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg IL-2.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że SDS dodaje się do końcowego stężenia przynajmniej 900 μg/mg interleukiny-2.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stężenie SDS w produkcie końcowym wynosi 135-180 μg/mg interleukiny-2.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 i dodecylosiarczan sodu są obecne w produkcie końcowym w postaci agregatów.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że agregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stężenie SDS zmniejsza się przez diafiltrację.

PL 196 430 B1
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap dodawania mannitu.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że mannit dodaje się w ilości 40-50 mg na 1 mg IL-2.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap liofilizacji.
11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 jest ludzką IL-2.
12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 jest des-alanylo-1 IL-2.
13. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 jest seryno-125 IL-2.
14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 jest ludzką des-alanylo-1-seryno-125 IL-2.
15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 ma sekwencję aminokwasów Sekw. Id Nr 1.
16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że IL-2 jest nieglikozylowana.
17. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się IL-2 oczyszczaną po ekspresji w rekombinowanych prokariotycznych komórkach gospodarza.
18. Kompozycja zawierająca interleukinę-2 i dodecylosiarczan sodu, znamienna tym, że zawiera 95-250 ąg dodecylosiarczanu sodu na 1 mg interleukiny-2; interleukina-2 i dodecylosiarczan sodu są w postaci agregatów o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8 nm-20 nm, a kompozycja wykazuje zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.
19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że jest w postaci liofilizowanej, która może być rekonstytuowana w ośrodku wodnym, dając kompozycję określoną w zastrz. 18.
20. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że ma zmętnienie właściwe mniejsze niż 0,7 cm²/g.
21. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że ma zmętnienie właściwe w zakresie 0,3 cm²/g - 0,6 cm²/g.
22. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera mikroagregaty SDS/IL-2 o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 11 nm-13 nm.
23. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że zawiera mannit w ilości 40-50 mg mannitu na 1 mg IL-2.
24. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 jest ludzką IL-2.
25. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 jest des-alanylo-1 IL-2.
26. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 jest seryno-125 IL-2.
27. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 jest ludzką des-alanylo-1-seryno-125 IL-2.
28. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 ma sekwencję aminokwasów Sekw. Id Nr 1.
29. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że IL-2 jest nieglikozylowana.
30. Kompozycja według zastrz 18, znamienna tym, że IL-2 jest oczyszczana po ekspresji w rekombinowanych prokariotycznych komórkach gospodarza.
31. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że stężenie IL-2 wynosi około 1,1 mg/ml.
32. Kompozycja określona w zastrz. 18, do stosowania w medycynie.
33. Liofilizowana kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że po rekonstytucji za pomocą 1,2 ml sterylnej wody do iniekcji zawiera w każdym mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej ludzkiej des-alanylo-1-seryno-125 IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, przy czym IL-2 i SDS są w postaci agregatów tak, że po rekonstytucji kompozycja ma zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g.
34. Kompozycja określona w zastrz. 33 do stosowania w medycynie.
35. Wodna kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera w mililitrze: 1,1 mg nieglikozylowanej des-alanylo-1-seryno-125 ludzkiej IL-2; 50 mg mannitu; 0,18 mg dodecylosiarczanu sodu (SDS); 0,17 mg monozasadowego fosforanu sodu i 0,89 mg dizasadowego fosforanu sodu do pH 7,5, i może być wytworzona przez rekonstytuowanie kompozycji liofilizowanej za pomocą sterylnej wody do iniekcji.
36. Kompozycja określona w zastrz. 35 do stosowania w medycynie.
37. Kompozycja określona w zastrz. 18 albo 33 albo 35 i drugi środek farmaceutyczny do równoczesnego, oddzielnego lub kolejnego podawania, przy czym drugi środek jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciaPL 196 430 B1 ła anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.
38. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest monoklonalne przeciwciało.
39. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.
40. Kompozycja według zastrz. 37, znamienna tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.
41. Zestaw, znamienny tym, że zawiera kompozycję określoną w zastrz. 18 albo 33 albo 35 i drugi środek farmaceutyczny wybrany z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.
42. Zestaw według zastrz. 41, znamienny tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy taka jak dichlorowodorek histaminy.
43. Zestaw według zastrz. 41, znamienny tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest monoklonalne przeciwciało.
44. Zestaw według zastrz. 41, znamienny tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.
45. Zastosowanie mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu do wytwarzania leku do podawania pacjentowi, przy czym, mikroagregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.
46. Zastosowanie kompozycji zawierającej interleukinę-2 oraz dodecylosiarczan sodu do wytwarzania leku do podawania pacjentowi, przy czym interleukina-2 i dodecylosiarczan sodu są w postaci mikroagregatów, a kompozycja ma następujące własności:

(i) wykazuje zmętnienie właściwe (τ) mniejsze niż 1,1 cm²/g;

(ii) zawiera agregaty SDS/IL-2 o średniej średnicy hydrodynamicznej w zakresie 8 nm-20 nm;

(iii) zawiera 95-250 μg SDS na 1 mg interleukiny-2.
47. Zastosowanie według zastrz. 45 albo 46, znamienne tym, lek jest przeznaczony do leczenia raka.
48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rakiem jest rak nerkowokomórkowy.
49. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że rakiem jest czerniak.
50. Zastosowanie według zastrz. 45 albo 46, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania pacjentowi po uprzednim podaniu drugiego środka farmaceutycznego wybranego z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu α, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.
51. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest monoklonalne przeciwciało.
52. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.
53. Zastosowanie według zastrz. 50, znamienne tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.
54. Zastosowanie według zastrz. 45 albo 46, znamienne tym, że lek podaje się wspólnie z drugim środkiem farmaceutycznym wybranym z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombi26

PL 196 430 B1 nacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu a, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny.
55. Zastosowanie według zastrz. 54, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest monoklonalne przeciwciało.
56. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 54, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.
57. Zastosowanie według zastrz. 54, znamienne tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.
58. Zastosowanie środka farmaceutycznego wybranego z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu a, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny, do wytwarzania kombinacji leków obejmującej kompozycję określoną w zastrz. 18 albo 33 albo 35 i wymieniony powyżej drugi środek farmaceutyczny, do stosowania w terapii skojarzonej.
59. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest monoklonalne przeciwciało.
60. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że drugim środkiem farmaceutycznym jest przeciwciało dostarczające ADCC.
61. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.
62. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że leki z kombinacji podaje się oddzielnie, przy czym kompozycję określoną w zastrz. 18 albo 33 albo 35 podaje się jako pierwszą, a drugi środek farmaceutyczny po uprzednim podaniu określonej powyżej kompozycji.
63. Zastosowanie według zastrz. 58, znamienne tym, że oba leki z kombinacji podaje się wspólnie.
64. Zastosowanie (a) mikroagregatów interleukiny-2 i dodecylosiarczanu sodu i (b) drugiego środka farmaceutycznego wybranego z grupy składającej się z przeciwciała anty-CD20, przeciwciała anty-CD40, przeciwciała anty-Her2, przeciwciała anty-EGFR, przeciwciała anty-VEGF, przeciwciała anty-CD52, przeciwciała anty-CD33, agonisty receptora H2, laseczki Calmette-Guerina, talidomidu, lenalidomidu, inhibitora proteasomu, kombinacji cyklofosfamidu, winkrystyny i prednizonu; kombinacji cyklofosfamidu, hydroksydoksorubicyny, winkrystyny i prednizonu; cytokiny, interferonu a, interferonu γ, 5-fluorouracylu, związku przeciw retrowirusom, inhibitora kinazy tyrozynowej i decytabiny do wytwarzania kombinacji leków do podawania pacjentowi, przy czym mikroagregaty mają średnią średnicę hydrodynamiczną w zakresie 8 nm-20 nm.
65. Zastosowanie według zastrz. 64, znamienne tym, że agonistą receptora H2 jest histamina lub farmaceutycznie dopuszczalna sól histaminy, taka jak dichlorowodorek histaminy.