KR20220163518A - Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체 - Google Patents

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Abstract

IL-2 부분과 하나 이상의 비펩티드성 수용성 중합체의 접합체가 제공된다. 통상적으로 상기 비펩티드성 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이의 유도체이다. 뿐만 아니라, 특히 접합체를 포함하는 조성물, 접합체를 제조하는 방법, 조성물을 개체에 투여하는 방법, 핵산 서열, 발현 시스템, 숙주 세포 및 IL-2 부분을 제조하는 방법도 제공된다.

Description

ＩＬ-2 부분 및 중합체의 접합체{CONJUGATES OF AN IL-2 MOIETY AND A POLYMER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e)에 따라서 2010년 11월 12일자로 출원한 미국 가출원 제61/413,236호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 본원에 전체가 참조로 포함되어 있다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web 을 통해 ASCII 포맷으로 제출되었으며 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2011년 12월 20일에 생성된 상기 ASCII 카피는 SHE326PC.txt 로 명명되고 크기가 8,697 바이트이다.
본 발명의 분야
특히, 본 발명의 하나 이상의 구체예는 일반적으로 IL-2 부분(즉, 사람 IL-2와 적어도 일부 유사한 활성을 가지는 부분) 및 중합체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 (특히) 접합체를 포함하는 조성물, 접합체를 합성하는 방법, 그리고 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다.
건강한 사람에 있어서, 면역계는 건강한 세포와 암 세포를 구별할 수 있다. 소정의 세포를 암 세포로서 확인할 때, 면역계는 통상적으로 이와 같은 세포를 제거한다. 그러므로 면역계가 파괴되거나 압도당한 때, 암 세포를 구별하여 제거하는 능력이 손상된 면역계의 불능으로 인하여 암이 진행할 수 있다. 암을 앓고 있는 환자에 있어서, 이 환자에 면역 조정 단백질을 투여하는 것은 환자의 면역계를 다시 (적어도 부분적으로) 정상 상태로 되돌려 놓는 것을 도울 수 있으므로, 이로써 암 세포를 제거하는 환자의 면역계의 능력은 회복된다. 이러한 방식으로, 암은 진행이 늦추어지거나 심지어 제거될 수 있다.
임의의 암을 앓고 있는 환자의 치료에 사용되는 면역 조정 단백질의 일례로서는 인터루킨-2가 있다. 인터루킨-2(IL-2)는 자연 살해 세포(NK 세포)의 자극 인자로서의 활성 및 T 세포 증식 유도 인자로서의 활성 둘 다를 가지는 자연적으로 생성되는 사이토카인이다. 글리코실화되지 않은 형태에 있어서, IL-2는 분자량이 약 15,300 달톤이다(하지만 IL-2는 생체 내에서 다양하게 글리코실화된 형태로서 발견됨).
시판 중인 비글리코실화 사람 재조합 IL-2 제품인 알데스루킨(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재, 프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션(Prometheus Laboratories Inc.)으로부터 상품명 프로루킨(PROLEUKIN)®으로서 시판되고 있는 데스-알라닐-1, 세린-125 사람 인터루킨-2)은 전이성 신세포 암 및 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자에 투여되는 것에 대해 승인되었다. 또한 C형 간염 바이러스(HCV), 사람 면역 결핍증 바이러스(HIV), 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 소아 류머티스성 관절염, 아토피 피부염, 유방암 및 방광암에 감염되거나 이를 앓고 있는 환자에게 있어서 IL-2를 투여하는 것이 제안되었다.
그러나 알데스루킨의 권장 용량조차도 심각한 부작용, 예를 들어 모세 혈관 누출 증후군(CLS) 및 호중구 기능 손상이 발생할 수 있다. 이러한 심각한 부작용에 대한 잠재성을 고려하였을 때, 그리고 권장 치료 주기는 총 14회 용량에 대하여 8시간마다 한 번씩 15분에 걸친 정맥 내 주입을 수반하므로, 알데스루킨의 투여는 임상학적 설정 내에서 일어난다. 뿐만 아니라, 알데스루킨의 상업적 제형은, 소듐 도데실 설페이트, 즉 형태 안정성을 통해 최적 활성을 유지하는데 필요한 것으로 보이는 물질의 존재를 포함한다. 문헌[Arakawa et al. (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:583-587]을 참조한다.
IL-2의 독성에 관한 문제점에 대처하고자 하는 시도가 행하여졌다. 하나의 접근법에서는, 제형상의 접근법이 시도되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,706,289호 및 국제 특허 출원 공개 WO 02/00243호 및 WO 99/60128호를 참조한다. 다른 접근법에서는, IL-2의 임의의 접합체가 제안되었다. 예를 들어, 미국 특허 제4,766,106호, 제5,206,344호, 제5,089,261호 및 제4,902,502호를 참조한다.
그러나 이들 접근법에도 불구하고 IL-2의 접합체에 대한 수요가 남아있다. 따라서 본 발명의 특히 하나 이상의 구체예는 이러한 접합체뿐만 아니라 본원에서 기술된 바와 같이 접합체를 포함하는 조성물 및 관련 방법에 관한 것이며, 이들은 업계에서 신규하며 전적으로 시사된 바가 없는 것으로 여겨진다.
따라서 본 발명의 하나 이상의 구체예에서는 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 수용성 중합체에 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 접합체가 제공되는데, 이 접합체는 수용성 중합체에 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함하고, 여기에서 상기 IL-2 부분의 잔기는 유리가능한 결합을 통해 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 접합체가 제공되는데, 이 접합체는 수용성 중합체에 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함하고, 여기에서 상기 IL-2 부분은 전구체 IL-2 부분이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 접합체가 제공되는데, 이 접합체는 수용성 중합체에 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함하고, 여기에서 상기 IL-2 부분은 비전구체 IL-2 부분이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 접합체를 전달하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 IL-2의 잔기와 수용성 중합체의 접합체를 포함하는 조성물을 환자에게 피하 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 분리된 핵산 분자가 제공되는데, 이 분리된 핵산 분자는 IL-2 부분을 암호화하고, 상기 핵산 분자는 서열 번호 5에 제시된 서열과의 서열 동일성이 상당한(예를 들어, 80% 이상) 서열을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 발현 벡터가 제공되는데, 이 발현 벡터(예를 들어, 시험관 내 발현 벡터)는 본원에 제공된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 숙주 세포가 제공되는데, 이 숙주 세포(예를 들어, 시험관 내 숙주 세포)는 본원에 제공된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다.
도 1은 실시예 1에 추가로 기술된 유전자의 DNA 서열 (서열 번호 5)과 이로부터 생성되는 아미노산 서열 (서열 번호 6)을 제공한다.
도 2a는 실시예 2에 제시된 방법에 따라서 제조된 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 통상의 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 2b는 실시예 2에 추가로 기술된 바와 같은 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]의 역상 HPLC 분석에 따른 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 2c는 실시예 2에 제시된 방법에 따라서 제조된 다양한 접합체의 유리 프로필에 대한 그래프이다.
도 3a는 실시예 3에 제시된 방법에 따라서 제조된 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 통상의 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 3b는 실시예 3에 추가로 기술된 바와 같은 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]의 역상 HPLC 분석에 따른 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 3c는 실시예 3에 제시된 방법에 따라서 제조된 다양한 접합체의 MALDI-TOF 분석에 따른 결과를 나타내는 것이다.
도 4a는 실시예 4에 제시된 방법에 따라서 제조된 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 통상의 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 4b는 실시예 4에 추가로 기술된 바와 같은 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]의 역상 HPLC 분석에 따른 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 5는 실시예 5에 추가로 기술된 바와 같은 [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 6은 실시예 6에 추가로 기술된 바와 같은 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]의 양이온 교환 크로마토그래피에 따른 크로마토그램을 나타내는 것이다.
도 7은 실시예 11에 추가로 기술된 바와 같은, 알데스루킨 및 안정적인 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]에 반응한 CTLL-2 세포의 증식에 대한 그래프를 나타낸다. 데이터 점들은 하나의 실험에서 3회 행해진 측정의 결과에 대한 평균들이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 8은 실시예 11에 추가로 기술된 바와 같이, 알데스루킨, 유리 및 유리되지 않은 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 및 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]에 반응한 CTLL-2 세포의 증식에 대한 그래프를 나타낸다. 데이터 점들은 하나의 실험에서 3회 행해진 측정의 결과에 대한 평균들이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 9는 실시예 12에 추가로 기술된 바와 같이, 마우스에 1회 주사한 후의 농도-시간 곡선의 그래프를 나타낸다.
도 10은 실시예 13에 추가로 기술된 바와 같이, 몇 가지 테스트 화합물에 대한 총 병변 면적(㎟)의 그래프를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 실시예 14에 추가로 기술된 바와 같이, 다양한 투여 계획시 테스트 약품에 대한 시간 대 종양 진행 곡선을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예를 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정 중합체, 합성 기술, IL-2 부분 등으로 제한되지 않고, 이들은 다양화할 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서 및 의도된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않는다면 복수의 지시대상물을 포함하는 것을 주의해야 한다. 따라서 예를 들어, “중합체”에 대한 언급은 단일의 중합체뿐만 아니라 둘 이상의 동일한 또는 상이한 중합체를 포함하고, “임의의 부형제”에 대한 언급은 단일의 임의의 부형제뿐만 아니라 둘 이상의 동일한 또는 상이한 임의의 부형제 등을 지칭한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예를 기술하고 청구하는 것에서, 다음 용어는 하기에 기술된 정의에 따라서 사용될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 “PEG”, “폴리에틸렌 글리콜” 및 “폴리(에틸렌 글리콜)은 상호교환가능하며 임의의 비펩티드성 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 통상적으로, 본 발명에 따른 용도에서 PEG는 다음의 구조 “-(OCH2CH2)n-”((n)은 2 내지 4000임)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, PEG는 또한 말단 산소가 예를 들어 합성 변환(synthetic transformation) 동안에 치환되는지 여부에 따라 “-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-” 및 “-(OCH2CH2)nO-”를 포함한다. 명세서 및 청구항 전체에서, 용어 “PEG”는 다양한 말단 또는 “말단 캐핑(end capping)”기(group) 등을 가지는 구조를 포함하는 것을 기억해야 한다. 또한 용어 “PEG”는 대부분, 즉 50% 초과의 -OCH2CH2- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 의미한다. 특정 형태에 대하여, PEG는 임의의 수의 다양한 분자량뿐만 아니라 하기에 보다 상세하게 기술되는 “분지형(branched)”, “선형(linear)”, “갈라진(forked)”, “다기능의(multifunctional)” 등과 같은 구조 또는 기하학적 구조를 취할 수 있다.
용어 “말단 캐핑된(end-capped)” 및 “말단에 캐핑된(terminally capped)”은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 말단 캐핑 부분(end-capping moiety)을 가지는 중합체의 말단 또는 종점을 지칭한다. 통상적으로, 필수적이지는 않지만 말단 캐핑 부분은 하이드록시 또는 C1-20 알콕시기, 보다 바람직하게는 C1-10 알콕시기, 더욱더 바람직하게는 C1-5 알콕시기를 포함한다. 따라서, 말단 캐핑 부분의 예는 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시)뿐만 아니라 아릴, 헤테로아릴, 사이클로, 헤테로사이클로 등을 포함한다. 말단 캐핑 부분은 중합체에서 말단 모노머[예를 들어, CH3O(CH2CH2O)n- 및 CH3(OCH2CH2)n-에서 말단 캐핑 부분 “메톡시”]의 하나 이상의 원자를 포함할 수 있음을 기억해야 한다. 덧붙여, 상기한 것의 각각의 포화, 불포화, 치환 및 비치환된 형태가 생각된다. 게다가 말단 캐핑기(end-capping group)는 실란일 수도 있다. 또한 말단 캐핑기는 유리하게 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 표지를 포함하는 말단 캐핑기를 가질 때, 중합체 및/또는 중합체가 결합한 부분(예를 들어, 활성제)의 양 또는 위치는 적합한 검출기를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 표지는 이에 한정되지 않지만, 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지화에 사용되는 부분, 비색물질(예를 들어, 색소), 금속 이온, 방사성 부분 등을 포함한다. 적합한 검출기는 광도계, 필름, 분광계 등을 포함한다. 또한 말단 캐핑기는 유리하게 인지질을 포함할 수 있다. 중합체가 인지질을 포함하는 말단 캐핑기를 가질 때, 특유의 성질이 중합체 및 생성되는 접합체로 부여된다. 예시적인 인지질은 이에 한정되지 않지만, 포스파티딜콜린으로 불리는 인지질의 종류에서 선택된 것들을 포함한다. 특이적인 인지질은 이에 한정되지 않지만, 디라우로일포스파티딜콜린(dilauroylphosphatidylcholine), 디올레일포스파티딜콜린(dioleylphosphatidylcholine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 디스테로일포스파티딜콜린(disteroylphosphatidylcholine), 베헤노일포스파티딜콜린(behenoylphosphatidylcholine), 아라키도일포스파티딜콜린(arachidoylphosphatidylcholine), 및 레시틴으로 이루어지는 군에서 선택된 것들을 포함한다. 말단 캡핑기는 또한 표적화 부분을 포함할 수 있으므로, 중합체(및 이 중합체에 부착된 무엇, 예를 들어 IL-2 부분)는 관심 부위에 우선적으로 국소화될 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이 중합체에 대하여 “자연적으로 생성하지 않는”은 그 전체가 자연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나 자연적으로 생성되지 않는 중합체는 전체 중합체 구조가 자연에서 발견되지 않는한, 자연적으로 생성되는 하나 이상의 모노머 또는 자연적으로 생성되는 모노머의 분절을 포함할 수 있다.
“수용성 중합체”에서와 같이 용어 “수용성”은 실온에서 물에서 용해성인 임의의 중합체다. 통상적으로, 수용성 중합체는 여과 후에 동일한 용액에 의하여 전송된 빛의 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%를 전송할 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체는 바람직하게 적어도 약 35%(중량으로) 물에서 용해하고, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%(중량으로) 물에서 용해하며, 보다 더 바람직하게는 약 70%(중량으로) 물에서 용해하고, 보다 더 바람직하게는 약 85%(중량으로) 물에서 용해할 것이다. 그러나 수용성 중합체가 약 95%(중량으로) 물에서 용해하거나 또는 물에서 완전히 용해하는 것이 가장 바람직하다.
PEG와 같은 수용성 중합체의 맥락에서 분자량은 수 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로서 표현될 수 있다. 다르게 지시되지 않는다면, 본원에서 분자량에 대한 모든 언급은 중량 평균 분자량을 말한다. 수 평균 및 중량 평균의 두 가지 분자량 결정 모두 겔 투과 크로마토그래피 또는 기타 다른 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 또한 말단기(end-group) 분석법의 이용 또는 수 평균 분자량 또는 광 산란 기술의 이용을 결정하는 총괄적 성질(예를 들어, 어는점 하락, 끓는점 상승, 또는 삼투압), 중량 평균 분자량을 결정하는 초원심분리 또는 점도의 측정과 같은 분자량 값을 측정하는 기타 다른 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 중합체는 통상적으로 다분산이고(즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 동등하지 않음), 바람직하게는 약 1.2 미만, 보다 바람직하게는 약 1.15 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산 값을 가진다.
특정 작용기와 함께 사용될 때 용어 “활성”, “반응성” 또는 “활성화”는 다른 분자 상에서 친전자체(electrophile) 또는 친핵체(nucleophile)와 용이하게 반응하는 반응성 작용기를 말한다. 이는 반응하기 위하여 강한 촉매 또는 매우 비현실적인 반응 조건을 필요로 하는 기들(즉, “비반응성” 또는 “불활성”기)과 반대이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “작용기” 또는 이의 임의의 동의어는 이의 보호된 형태뿐만 아니라 비보호된 형태도 포함하는 것으로 의미한다.
용어 “스페이서 부분”, “결합” 및 “링커”는 본원에서 임의로 중합체 분절의 말단 및 IL-2 부분 또는 IL-2 부분의 친전자체 또는 친핵체와 같은 상호 결합하는(interconnecting) 부분을 결합하는데 사용되는 결합 또는 원자 또는 원자의 집합을 지칭하는 것으로 사용된다. 스페이서 부분은 가수분해적으로 안정적일 수 있거나 또는 생리적으로 가수분해되거나 효소로 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 문맥이 다르게 분명하게 지시하지 않는다면, 스페이서 부분은 임의로 화합물의 임의의 두 가지 요소 사이에 존재한다(예를 들어, IL-2 부분의 잔기 및 수용성 중합체를 포함하는 제공된 접합체는 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 간접적으로 부착될 수 있다).
“알킬”은 통상적으로 길이가 약 1개 내지 15개 원자의 범위인 탄화수소 사슬을 말한다. 이와 같은 탄화수소 사슬은 필수적이지는 않지만 바람직하게는 포화되어 있고 분지형 또는 직선형 사슬일 수 있지만 통상적으로 직쇄가 바람직하다. 예시적인 알킬기로서는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “알킬”은 사이클로알킬뿐만 아니라 사이클로알킬렌 함유 알킬을 포함한다.
“저급 알킬”은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 말하고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸로 예시되는 바와 같이 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
“사이클로알킬”은 가교(bridged), 융합 또는 스피로 사이클릭 화합물을 포함하여 포화 또는 불포화 사이클릭 탄화수소 사슬을 말하며, 바람직하게는 3개 내지 약 12개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3개 내지 약 8개의 탄소 원자로 구성된다. “사이클로알킬렌”은 사이클릭 고리계 내 임의의 2개의 탄소에서 사슬의 결합으로써 알킬 사슬 내로 삽입되는 사이클로알킬기를 말한다.
“알콕시”는 -OR기를 말하며, 여기에서 R은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-6 알킬(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등)이다.
예를 들어 “치환된 알킬”에서와 같이, 용어 “치환된”은 하나 이상의 비간섭(noninterfering) 치환기, 예를 들어 이로 한정되지 않지만 알킬, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸 등과 같은 C3-8 사이클로알킬; 예를 들어 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드와 같은 할로; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환된 페닐; 등으로 치환되는 부분(예를 들어, 알킬기)을 말한다. “치환된 아릴”은 치환기로서 하나 이상의 비간섭기를 가지는 아릴이다. 페닐 고리상에서의 치환에 대하여, 치환기는 임의의 방향(즉, 오르토, 메타 또는 파라)으로 있을 수 있다.
“비간섭 치환기”는 분자 내에 존재할 때 통상적으로 분자 내에 포함되는 기타 다른 작용기와 반응하지 않는 기들이다.
“아릴”은 각각 5개 또는 6개의 코어 탄소 원자를 가지는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합될 수 있거나 또는 바이페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있는 다수의 아릴 고리를 포함한다. 또한 아릴 고리는 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합되거나 또는 융합되지 않을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 “아릴”은 헤테로아릴을 포함한다.
“헤테로아릴”은 바람직하게 황, 산소, 또는 질소, 또는 이들의 조합인, 1개 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기이다. 또한 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
“헤테로사이클” 또는 “헤테로사이클릭”은 불포화 또는 방향족 특징을 가지거나 가지지 않으며, 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 가지는 5개 내지 12개 원자, 바람직하게는 5개 내지 7개 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다.
“치환된 헤테로아릴”은 치환기로서 하나 이상의 비간섭기를 가지는 헤테로아릴이다.
“치환된 헤테로사이클”은 비간섭 치환기로 형성된 하나 이상의 측쇄를 가지는 헤테로사이클이다.
본 명세서에서 “유기 라디칼”은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴을 포함한다.
“친전자체(electrophile)” 및 “친전자성기(electrophilic group)”는 친전자성 중심, 즉 전자를 구하고, 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 가지는, 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 말한다.
“친핵체(nucleophile)” 및 “친핵성기(nucleophilic group)”는 친핵성 중심, 즉 친전자성 중심을 구하거나 또는 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 가지는, 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다.
“생리적으로 절단가능한” 또는 “가수분해가능한” 또는 “분해가능한” 결합은 생리적 조건 하에서 물과 반응하는(즉, 가수분해되는) 결합이다. 물에서 가수분해하는 결합의 성향은 2개의 중심 원자를 결합하는 결합의 일반적인 유형뿐만 아니라 이들 중심 원자에 부착된 치환기에 따라 다를 것이다. 적절한 가수분해에 불안정한 또는 약한 결합은 이에 한정되지 않지만 카복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
“효소로 분해가능한 결합”은 하나 이상의 효소로 분해되는 결합을 의미한다.
“가수분해에 안정적인” 연결 또는 결합은 실질적으로 물에서 안정적인, 즉 생리적 조건 하에서 길어진 시간 동안 임의의 주목할 만한 정도로 가수분해되지 않는 화학적 결합, 통상적으로 공유 결합을 말한다. 가수분해에 안정적인 결합의 예로서는 이에 한정되지 않지만 탄소-탄소 결합(예를 들어, 지방족 사슬에서), 에테르, 아미드, 우레탄 등을 포함한다. 일반적으로, 가수분해에 안정적인 결합은 생리적 조건 하에서 하루에 약 1% 내지 2% 미만의 가수분해율을 나타내는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
“약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체”는 본 발명의 조성물 내에 임의로 포함될 수 있고 환자에게 어떤 유의한 부정적인 독성 효과를 야기하지 않는 부형제를 말한다. “약리학적으로 유효한 양”, “생리적으로 유효한 양” 및 “치료적으로 유효한 양”은 혈류에서 또는 표적 조직에서 중합체-(IL-2) 부분 접합체(또는 이에 상응하는 접합되지 않은 IL-2 부분)의 원하는 수준을 제공하는데 필요한 중합체-(IL-2) 부분 접합체의 양을 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 정확한 양은 다수의 인자, 예를 들어 특정 IL-2 부분, 치료 조성물의 구성요소 및 물리적 특성, 의도된 환자 집단, 개별적인 환자 고려사항 등과 같은 인자에 따라 다를 것이고, 이는 본원에서 제공된 정보에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
“다기능성”은 중합체 내에 3개 이상의 작용기를 가지는 중합체를 의미하며, 작용기들은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 다기능성 중합체 시약은 통상적으로 약 3개 내지 100개의 작용기, 또는 3개 내지 50개의 작용기, 또는 3개 내지 25개의 작용기, 또는 3개 내지 15개의 작용기, 또는 3개 내지 10개의 작용기를 포함할 것이고, 또는 중합체 골격 내에 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 작용기를 포함할 것이다.
본원에 사용된 용어 “IL-2 부분”은 사람 IL-2 활성을 가지는 부분을 말한다. IL-2 부분은 또한 중합체 시약과의 반응에 적합한 하나 이상의 친전자성기 또는 친핵성기를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 용어 “IL-2 부분”은 접합 이전의 IL-2 부분과 접합 후의 IL-2 부분 잔기 둘 다를 포함한다. 하기에서 보다 상세히 설명될 바와 같이, 당업자는 임의의 주어진 부분이 IL-2 활성을 가지는지 여부를 확인할 수 있다. 서열 번호 1 내지 서열 번호 4 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 IL-2 부분일 뿐만 아니라, 상기 서열들에 실질적으로 상동성인 임의의 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 용어 “IL-2 부분”은, 예를 들어 부위 지정 돌연 변이 유발법 또는 우발적 통과 돌연 변이(accidentally through mutation)에 의해 고의적으로 변형된 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 또한 1개 내지 6개의 부가 글리코실화 부위를 가지는 유사체, 단백질의 카복시 말단에 하나 이상의 부가 아미노산(여기에서, 부가 아미노산(들)은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함함)을 가지는 유사체, 그리고 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 유사체를 포함한다. 상기 용어는 자연적으로 생성되는 부분 및 재조합에 의해 생성되는 부분 둘 다를 포함한다.
용어 “실질적으로 상동성인”은 특정 주제 서열, 예를 들어 돌연 변이 서열이 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가에 의해 기준 서열과 차이가 나지만, 그 순 효과가 전체적으로 기준 서열과 주제 서열 간 비유사성의 기능적 불리함을 가져오지 않는 것을 의미한다. 본 발명을 위하여, 80% 초과(더 바람직하게는 85% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 90% 초과, 그리고 가장 바람직하게는 95% 초과)의 상동성을 가지고, 생물학적 활성이 동등하며(반드시 생물학적 활성의 세기까지 동등할 필요는 없음), 발현 특징도 동등한 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상동성을 측정하기 위하여, 성숙한 서열의 절단은 무시되어야 한다. 본원에 사용되는 예시적인 IL-2 부분으로서는 서열 번호 2와 실질적으로 상동성인 서열들을 포함한다.
용어 “단편”은 IL-2 부분의 일부 또는 단편의 아미노산 서열을 가지면서, IL-2의 생물학적 활성을 가지는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 IL-2 부분의 단백 분해에 의하여 생산된 단백질 또는 폴리펩티드뿐만 아니라, 당업계의 통상적인 방법에 의한 화학 합성법에 의해 생산된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 “환자”는 활성제(예를 들어, 접합체)의 투여로 예방되거나 치료될 수 있는 병태를 겪거나 겪기 쉬운 생물체를 말하고, 인간과 동물 모두 포함한다.
“임의의” 또는 “임의로”는 이후에 기술되는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있어서, 기술은 상황이 일어나는 경우 및 상황이 일어나지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.
“실질적으로”는 거의 전부 또는 완전히, 예를 들어 조건의 50% 초과, 51% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 및 95% 이상 중 하나 이상을 만족하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 “서열 동일성”은 기준 DNA 서열의 서열 부분과 다른 DNA 서열의 서열 부분을 비교하여, 서열 갭은 최소로 하면서 상기 두 서열 간 중첩되는 부분을 최대로 만들도록 정렬함으로써 측정되며, 여기에서 상기 두 서열 간 중첩되지 않는 임의의 서열은 무시된다. 본원에 기술된 임의의 서열 동일성에 대하여, 서열 동일성은 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85%, 훨씬 더 바람직하게는 90%, 훨씬 더 바람직하게는 95%이며, 가장 바람직하게는 서열 동일성이 96%, 97%, 98% 및 99%이다.
펩티드 내의 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이며; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이며; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이며; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이며; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이며; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이며; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이며; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이며; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이며; 아르기닌 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에 따라서 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 수용성 중합체에 (직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해서) 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함한다. 본 발명의 접합체는 하나 이상의 하기 특성을 가질 것이다.
IL-2 부분
앞서 진술한 바와 같이, 접합체는 일반적으로 수용성 중합체에 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 공유적으로 부착된 IL-2 부분의 잔기를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “IL-2 부분”은 접합 전의 IL-2 부분뿐만 아니라 비펩티드성인 수용성 중합체에 부착한 후의 IL-2 부분도 말할 것이다. 그러나, 원래의 IL-2 부분은 비펩티드성인 수용성 중합체에 부착할 때, 중합체(들)에의 결합과 관련된 하나 이상의 공유 결합의 존재 때문에 IL-2 부분은 약간 변형된다는 것을 이해할 것이다. 종종 다른 분자에 부착된 IL-2 부분의 약간 변형된 형태는 IL-2 부분의 “잔기”로 지칭된다.
IL-2 부분은 비재조합 방법에서 및 재조합 방법에서 유래할 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 한정되지 않는다. 덧붙여, IL-2 부분은 인간 출처, 동물 출처 및 식물 출처로부터 유래할 수 있다.
IL-2 부분은 비재조합적으로 유래할 수 있다. 예를 들어, 생물 시스템으로부터 IL-2를 분리할 수 있거나, 아니면 배양된 배지로부터 IL-2를 수득할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,401,756호 및 문헌[Pauly et al. (1984) J. Immunol Methods 75(1):73-84]에 기술된 방법을 참조한다.
IL-2 부분은 재조합 방법으로 유래할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,614,185호를 참조하며, 이의 개시 내용과 실험은 본원에 제공되어 있다.
비재조합 접근법 및 재조합 접근법으로 수득한 임의의 IL-2 부분은 본원에 기술된 접합체를 제조하는데 있어서 IL-2 부분으로서 사용될 수 있다.
IL-2 부분은 박테리아, 예를 들어 이.콜라이(E. coli)[예를 들어, 문헌[Fischer et al. (1995) Biotechnol. Appl. BioIL-2m. 21(3):295-311] 참조], 포유 동물[예를 들어, 문헌[Kronman et al. (1992) Gene 121:295-304] 참조], 효모, 예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)[예를 들어, 문헌[Morel et al. (1997) Biochem. J. 328(1):121-129] 참조], 그리고 식물[예를 들어, 문헌[Mor et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 75(3):259-266] 참조] 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 발현은 외부 발현(숙주 세포가 자연적으로 원하는 유전 암호를 포함할 때)을 통하거나 내부 발현을 통하여 일어날 수 있다.
단백질을 제조하기 위한 재조합에 기초한 방법이 상이할 수 있더라도, 재조합 방법은 통상적으로 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 암호화하는 핵산을 구성하는 단계, 상기 핵산을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계, 숙주 세포(예를 들어, 식물, 박테리아, 이스트, 유전자이식 동물 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 아기 햄스터 신장 세포와 같은 포유류 세포)를 형질변환시키는 단계, 및 핵산을 발현시켜 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 시험관내에서 및 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 생성 및 발현하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
재조합 폴리펩티드의 확인 및 정제를 용이하게 하기 위하여, 에피토프 태그(epitope tag) 또는 기타 다른 친화성 결합 서열에 대하여 암호화하는 핵산 서열은 암호화 서열과 함께 프레임 내에 삽입되거나 부가될 수 있고, 그렇게 함으로써 원하는 폴리펩티드 및 결합에 적합한 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질을 생성한다. 융합 단백질은 융합 단백질 내에서 에피토프 태그 또는 기타 다른 결합 서열에 대해 지시된 결합 부분(예를 들어, 항체)을 가지는 친화성 컬럼을 통해 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 먼저 러닝(running)하고 그렇게 하여 컬럼 내에 융합 단백질을 결합시킴으로써 확인 및 정제할 수 있다. 그 후에, 적절한 용액(예를 들어, 산)으로 컬럼을 세척하여 결합된 융합 단백질을 방출시킴으로써 융합 단백질을 회수할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 또한 숙주 세포를 용균시키고, 폴리펩티드를 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 결합 접근법, 소수성 상호 작용 접근법에 의해 분리한 후, MALDI 또는 웨스턴 블럿에 의해 확인한 다음, 폴리펩티드를 수집함으로써 정제될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 확인 및 정제하는 상기와 같은 방법과 기타 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 하나 이상의 구체예에서, IL-2 부분은 융합 단백질의 형태가 아니다.
IL-2 활성을 가지는 단백질을 발현하는데 사용되는 시스템에 따라서, IL-2 부분은 글리코실화되지 않을 수 있거나 글리코실화될 수 있으며, 또한 글리코실화되지 않은 IL-2 부분 또는 글리코실화된 IL-2 부분 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 다시 말해서, IL-2 부분은 글리코실화되지 않을 수 있거나, IL-2 부분은 글리코실화될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 구체예에서, IL-2 부분은 글리코실화되지 않는다.
유리하게, IL-2 부분은 아미노산 측쇄 내부 원자에의 중합체의 용이한 부착을 제공하기 위하여, 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 리신, 시스테인 및/또는 아르기닌을 포함하고/포함하거나 치환하도록 변형될 수 있다. IL-2 부분의 치환에 관한 일례가 미국 특허 제5,206,344호에 기술되어 있다. 뿐만 아니라, IL-2 부분은 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 아미노산 잔기 및 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 부가하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 문헌[J. March, Advanced Organic IL-2mistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)]을 참조한다.
또한, 유리하게 IL-2 부분은 작용기의 부착을 포함하도록 변형될 수 있다(작용기 포함 아미노산 잔기를 부가함으로 인하여 변형되는 경우 제외). 예를 들어, IL-2 부분은 티올기를 포함하도록 변형될 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2 부분은 N-말단 알파 탄소를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 부분은 하나 이상의 탄수화물 부분을 포함하도록 변형될 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2 부분은 알데히드기를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, IL-2 부분은 케톤기를 포함하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, IL-2 부분은 티올기, N-말단 알파 탄소, 탄수화물, 알데히드기 및 케톤기 중 하나 이상을 포함하도록 변형되지 않는 것이 바람직하다.
예시적인 IL-2 부분은 문헌, 예를 들어 미국 특허 제5,116,943호, 제5,153,310호, 제5,635,597호, 제7,101,965호 및 제7,567,215호, 그리고 미국 특허 출원 공개 제2010/0036097호 및 제2004/0175337호에 기술되어 있다. 바람직한 IL-2 부분은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 아미노산 서열, 그리고 이 아미노산 서열과 실질적으로 상동성인 서열을 가지는 부분을 포함한다. 바람직한 IL-2 부분은 서열 번호 3에 상응하는 아미노산 서열을 가진다.
몇몇 경우에 있어서, IL-2 부분은 “단량체”의 형태일 것인데, 이 경우 상응하는 펩티드의 1회 발현은 개별 단위로 조직화된다. 다른 경우에 있어서, IL-2 부분은 “이량체”(예를 들어, 재조합 IL-2의 이량체)의 형태일 것인데, 이 경우 단백질의 단량체 형태 2개는 (예를 들어, 이황화 결합에 의해) 서로 결합된다. 예를 들어, 재조합 사람 IL-2 이량체의 경우, 상기 이량체는 2개의 단량체가 각 단량체의 Cys125 잔기에 의해 형성되는 이황화 결합에 의하여 서로 결합되어 있는 형태일 수 있다.
뿐만 아니라, 전구체 형태 IL-2는 IL-2 부분으로서 사용될 수 있다. IL-2의 예시적 전구체 형태는 서열 번호 1의 서열을 가진다.
전술한 서열들 중 임의의 것의 절단된 형태의 잡종 변이체, 펩티드 모의체도 또한 IL-2 부분으로서 사용될 수 있다. IL-2 활성을 최소한 어느 정도 유지하는 전술한 서열들 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체도 또한 IL-2 부분으로서 작용할 수 있다.
임의의 주어진 펩티드 또는 단백질 부분에 대해서, 이 부분이 IL-2 활성을 가지는지 여부를 측정할 수 있다. 시험관 내 IL-2 활성을 측정하는 다양한 방법들이 당업계에 기술되어 있다. 예시적인 접근법으로서는, 이하 실험에 기술된 CTTL-2 세포 증식 분석법이 있다. 예시적인 접근법은 문헌[Moreau et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1047-1056]에 기술되어 있다. 간단히 말하면, 비특이적 결합 분석법에 있어서, 제안된 IL-2 부분은 IL-2 수용체를 가지는 세포주의 존재 하에 4℃에서 1시간 동안 예비 항온 처리될 수 있다. 그 다음, 125I로 표지화된 IL-2는 4℃에서 3시간 동안 시스템 내 항온 처리될 수 있다. 데이터는, 제안된 IL-2 부분 활성의 억제능% 대 야생형 IL-2 부분 활성의 억제능%로서 표현된다. 당업계에 공지된 기타 다른 방법들, 예를 들어 전기 측량술, 분광 분석법, 크로마토그래피 및 방사선 측정 방법이 IL-2 기능을 평가하는데 사용될 수 있다.
수용성 중합체
앞서 검토한 바와 같이, 각각의 접합체는 수용성 중합체에 부착된 IL-2 부분을 포함한다. 수용성 중합체에 대하여, 수용성 중합체는 비펩티드성이고, 비독성이며, 자연적으로 생성되지 않고 생체적합성이다. 생체적합성에 대하여, 물질 단독 또는 살아있는 조직과 관련된 다른 물질(예를 들어, IL-2 부분과 같은 활성제)과의 사용(예를 들어, 환자에게 투여)과 관련된 이로운 효과가 임상의, 예를 들어 내과의가 평가한 바와 같은 임의의 유해한 효과 보다 크다면 그 물질은 생체적합성인 것으로 고려된다. 비면역원성에 대하여, 생체내에서 물질의 의도된 사용이 원하지 않는 면역 반응(예를 들어, 항체 형성)을 생성하지 않는다면 그 물질은 비면역원성인 것으로 고려되고, 또는 면역 반응이 생성되면 그러한 반응은 임상의가 평가한 바와 같은 임상적으로 유의한 또는 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 비펩티드성 수용성 중합체가 생체적합성이고 비면역원성인 것이 특히 바람직하다.
추가적으로, 중합체는 통상적으로 2개 내지 약 300개의 종점을 가지는 것으로 특징지어진다. 상기 중합체의 예는 이에 한정되지 않지만 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(“PEG”), 폴리(프로필렌 글리콜)(“PPG”), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(“POZ”)(WO 2008/106186호에 기술되어 있음), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 임의의 상기한 것 중의 임의의 것의 조합을 포함한다.
수용성 중합체는 특정 구조로 제한되지 않고 선형(예를 들어, 말단 캐핑된, 예를 들어 알콕시 PEG 또는 이기능성 PEG), 분지형 또는 다수의 팔을 가진(multi-armed)(예를 들어, 갈라진 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 수지상(또는 별) 구조(architecture)일 수 있으며, 각각은 하나 이상의 분해가능한 결합을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 더욱이, 수용성 중합체의 내부 구조는 임의의 수의 상이한 반복 패턴으로 구조화될 수 있고 동종중합체, 교호 공중합체(alternating copolymer), 랜덤 공중합체(random copolymer), 블록 공중합체(block copolymer), 교호 삼중합체(alternating tripolymer), 랜덤 삼중합체(random tripolymer), 및 블록 삼중합체(block tripolymer)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
통상적으로, 활성화된 PEG 및 기타 다른 활성화된 수용성 중합체(즉, 중합체 시약)는 IL-2 부분 상에서 원하는 부위와 결합하는데 적절한, 적합한 활성화기로 활성화된다. 따라서, 중합체 시약은 IL-2 부분과 반응하는 반응기를 가질 것이다. 이들 중합체를 활성 부분에 접합시키는 대표적인 중합체 시약 및 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌[Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides", Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)], 및 [Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182]에 더 기술되어 있다. IL-2 부분에 결합하는데 적합한 예시적인 활성화기는 특히 하이드록실, 말레이미드, 에스테르, 아세탈, 케탈, 아민, 카복실, 알데히드, 알데히드 수화물, 케톤, 비닐 케톤, 티온, 티올, 비닐 술폰, 하이드라진을 포함한다.
바람직하게, 본원에 기술된 접합체를 제조하는데 사용되는 중합체 시약은 포스겐을 사용하지 않고 제조된다. 이와 같은 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제4,902,502호(클로로포르메이트를 형성하여, 추후 이것을 IL-2와 반응하는 PEG 활성 에스테르를 형성하는데 사용하는 것에 관하여 구체적으로 기술함)에 제시된 개시 내용과 반대의 입장에 있는 것이다. 포스겐의 사용은 중합체 중 사슬을 절단함으로써, 통상의 기술을 사용해서는 제거될 수 없는 불순물을 증가시킬 수 있는 염화 수소를 형성시키게 된다. 그러므로, 어떠한 이론에 의해서도 구애되지 않고, 포스겐을 사용하지 않고 형성된 중합체 시약으로 제조된 IL-2 부분 접합체는 중합체 사슬 분해 생성물이 실질적으로 존재하지 않는, 고품질의 조성물을 제공한다. 또한, 하나 이상의 구체예에서, 수용성 중합체와 IL-2 부분 사이에 있는 스페이서 부분은 카바메이트 함유 스페이서 부분이 아니다.
통상적으로, 접합체에서 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 약 100달톤 내지 약 150,000달톤이다. 그러나 예시적인 범위는 5,000달톤 초과 내지 약 100,000달톤의 범위로, 약 6,000달톤 내지 약 90,000달톤의 범위로, 약 10,000달톤 내지 약 85,000달톤의 범위로, 10,000 초과 내지 약 85,000달톤의 범위로, 약 20,000달톤 내지 약 85,000달톤의 범위로, 약 53,000달톤 내지 약 85,000달톤의 범위로, 약 25,000달톤 내지 약 120,000달톤의 범위로, 약 29,000달톤 내지 약 120,000달톤의 범위로, 약 35,000달톤 내지 약 120,000달톤의 범위로, 및 약 40,000달톤 내지 약 120,000달톤의 범위로 중량 평균 분자량을 포함한다. 임의의 주어진 수용성 중합체에 대하여, 분자량이 이들 범위 중 하나 이상인 PEG가 바람직하다.
수용성 중합체에 대하여 예시적인 중량 평균 분자량은 약 100달톤, 약 200달톤, 약 300달톤, 약 400달톤, 약 500달톤, 약 600달톤, 약 700달톤, 약 750달톤, 약 800달톤, 약 900달톤, 약 1,000달톤, 약 1,500달톤, 약 2,000달톤, 약 2,200달톤, 약 2,500달톤, 약 3,000달톤, 약 4,000달톤, 약 4,400달톤, 약 4,500달톤, 약 5,000달톤, 약 5,500달톤, 약 6,000달톤, 약 7,000달톤, 약 7,500달톤, 약 8,000달톤, 약 9,000달톤, 약 10,000달톤, 약 11,000달톤, 약 12,000달톤, 약 13,000달톤, 약 14,000달톤, 약 15,000달톤, 약 20,000달톤, 약 22,500달톤, 약 25,000달톤, 약 30,000달톤, 약 35,000달톤, 약 40,000달톤, 약 45,000달톤, 약 50,000달톤, 약 55,000달톤, 약 60,000달톤, 약 65,000달톤, 약 70,000달톤, 및 약 75,000달톤을 포함한다. 또한 총 분자량이 상기한 것 중 임의의 것인 수용성 중합체의 분지형 형태(version)(예를 들어, 두 개의 20,000달톤 중합체로 구성되는 분지형 40,000달톤의 수용성 중합체)를 사용할 수 있다. 하나 이상의 구체예에서, 접합체는 중량 평균 분자량이 약 6,000달톤 미만인 PEG와 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 PEG 부분을 가지지 않을 것이다.
중합체로서 사용될 때, PEG는 통상적으로 많은 (OCH2CH2) 단량체[또는 PEG를 정의한 방법에 따라 (CH2CH2O) 단량체]를 포함할 것이다. 기술 전체에 사용된 바와 같이, 반복 유닛의 수는 “(OCH2CH2)n”에서 아래첨자 “n”으로 확인된다. 따라서, (n)의 값은 통상적으로 2 내지 약 3400, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900 범위의 하나 이상 내에 해당한다. 분자량이 공지된 임의의 주어진 중합체에 대하여, 중합체의 총 중량 평균 분자량을 반복 단량체의 분자량으로 나눔으로써 반복 유닛의 수(즉, “n”)를 결정하는 것이 가능하다.
또한 하이드록실기를 사용할 수 있지만, 본 발명에서의 사용을 위한 하나의 특히 바람직한 중합체는 말단 캐핑된 중합체, 즉 상대적으로 불활성기, 예를 들어 저급 C1-6 알콕시기와 같은 기로 캐핑된 하나 이상의 말단을 가지는 중합체이다. 중합체가 PEG일 때, 예를 들어 메톡시-PEG(보통 mPEG로 지칭됨)를 사용하는 것이 바람직하며, 메톡시-PEG는 중합체의 하나의 말단이 메톡시(-OCH3)기인 반면 다른 말단은 하이드록실 또는 임의로 화학적으로 변형될 수 있는 기타 다른 작용기인 PEG의 선형 형태이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에 유용한 하나의 형태에서, 자유 또는 비결합 PEG는 각 말단에서 하이드록실기로 종결되는 선형 중합체이며,
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,
여기에서 (n)은 통상적으로 0 내지 약 4,000의 범위이다.
상기 중합체, 알파-, 오메가-디하이드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 HO-PEG-OH로서 간단한 형태로 표현될 수 있고, -PEG- 부호는 다음 구조 단위로 표현될 수 있음이 이해되며,
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
여기에서 (n)은 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서 유용한 PEG의 다른 유형은 메톡시-PEG-OH, 또는 간략히 mPEG이고, 이의 하나의 말단은 상대적으로 불활성인 메톡시기인 반면, 다른 말단은 하이드록실기이다. mPEG의 구조는 하기에 주어져 있다.
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
여기에서 (n)은 상기에 기술된 바와 같다.
또한 미국 특허 제5,932,462호에 기술된 바와 같이, 다수의 팔을 가진 또는 분지형 PEG 분자는 PEG 중합체로서 사용할 수 있다. 예를 들어, PEG는 다음 구조를 가질 수 있으며,
Figure pat00001
여기에서,
polya 및 polyb는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 (동일한 또는 상이한) PEG 골격이고;
R”은 H, 메틸 또는 PEG 골격과 같은 비반응성 부분이며; 및
P 및 Q는 비반응성 결합이다. 바람직한 구체예에서, 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 이치환된 리신이다. 사용된 특이적인 IL-2 부분에 따라서, 이치환된 리신의 반응성 에스테르 작용기는 추가적으로 변형되어 IL-2 부분 내에서 표적기와 반응하기에 적합한 작용기를 형성할 수 있다.
덧붙여, PEG는 갈라진 PEG를 포함할 수 있다. 갈라진 PEG의 예는 다음의 구조로 표현되며,
Figure pat00002
여기에서, X는 하나 이상의 원자의 스페이서 부분이고 각각의 Z는 정의된 길이의 원자의 사슬로 CH에 결합된 활성화된 말단기다. 국제 특허 출원 공개 WO 99/45964호는 본 발명의 하나 이상의 구체예에서 사용할 수 있는 다양한 갈라진 PEG 구조를 개시한다. 분지화 탄소 원자에 Z 작용기를 결합하는 원자의 사슬은 테더링기(tethering group)의 역할을 하고, 예를 들어 알킬 사슬, 에테르 사슬, 에스테르 사슬, 아미드 사슬 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG 사슬의 말단에서보다 PEG의 길이를 따라 공유적으로 부착된, 카복실과 같은 반응성기를 가지는 펜던트(pendant) PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성기는 PEG에 직접적으로 또는 알킬렌기와 같은 스페이서 부분을 통해 부착될 수 있다.
상기한 PEG 형태에 더하여, 또한 상기 중합체는 상기한 임의의 중합체를 포함하여, 중합체에서 하나 이상의 약한 또는 분해가능한 결합으로 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되는 중합체에서 에스테르 결합으로 제조될 수 있다. 아래에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해는 낮은 분자량의 단편으로 중합체의 절단을 일으킨다:
Figure pat00003
중합체 골격 내에서 분해가능한 결합으로서 및/또는 IL-2 부분으로의 분해가능한 결합으로서 유용한 기타 다른 가수분해로 분해가능한 결합은 카보네이트 결합; 예를 들어 아민 및 알데히드의 반응으로 생긴 이민 결합(예를 들어, 문헌 [Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3] 참고); 예를 들어 알코올과 포스페이트기와의 반응으로 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 통상적으로 하이드라지드 및 알데히드의 반응으로 형성되는 하이드라존 결합; 통상적으로 알데히드 및 알코올 사이의 반응으로 형성되는 아세탈 결합; 예를 들어, 포르메이트 및 알코올 사이의 반응으로 형성되는 오르토에스테르 결합; 예를 들어 PEG와 같은 중합체의 말단에서 아민기, 및 다른 PEG 사슬의 카복실기에 의해 형성된 아미드 결합; 예를 들어 말단 이소시아네이트기 및 PEG 알코올을 이용한 PEG의 반응으로 형성된 우레탄 결합; 예를 들어 PEG와 같은 중합체의 말단에서 아민기, 및 펩티드의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 예를 들어 중합체의 말단에서 포스포라미디트기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실기로 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.
접합체의 이와 같은 임의적인 특징, 즉 중합체 사슬 내로 또는 IL-2 부분으로 하나 이상의 분해가능한 결합의 도입은 투여시 접합체의 최종적인 원하는 약리학적 특성 이상으로 추가적인 제어를 제공할 수 있다. 예를 들어, 크고 상대적으로 불활성인 접합체(즉, 이에 부착된 하나 이상의 고분자량 PEG 사슬, 예를 들어 약 10,000 초과의 분자량을 가지는 하나 이상의 PEG 사슬을 가지며, 여기에서 접합체는 근본적으로 어떠한 생물활성을 가지지 않음)가 투여될 수 있고, 유리되어 원래의 PEG 사슬의 일부를 가지는 생물활성 접합체를 생성한다. 이러한 방식으로, 접합체의 특성은 더 효과적으로 조정되어 시간이 지남에 따라 접합체의 생물활성의 균형을 이룰 수 있다.
접합체와 결합되어 있는 수용성 중합체도 또한 “유리가능한 것”일 수 있다. 다시 말해서, 상기 수용성 중합체는 (가수 분해, 효소 공정 또는 촉매 공정 등을 통하여) 유리되고, 그 결과, 미접합 IL-2 부분이 생성된다. 몇몇 경우에 있어서, 유리가능한 중합체는 수용성 중합체의 어떠한 단편도 남기지 않고 IL-2 부분으로부터 생체 내 해리된다. 다른 경우에 있어서, 유리가능한 중합체는 수용성 중합체로부터 유래하는, 크기가 비교적 작은 단편(예를 들어, 숙시네이트 태그)을 남기면서 IL-2 부분으로부터 생체 내 해리된다. 예시적인 절단가능한 중합체로서는 카보네이트 결합을 통하여 IL-2 부분에 부착되는 중합체를 포함한다.
비펩티드성 및 수용성 중합체에 관하여 상기한 검토는 결코 총망라한 것이아니고 단지 예시적인 것이며, 상기 기술된 품질을 가지는 모든 중합체 물질이 고려됨을 당업자는 인지할 것이다. 본원에서 사용된 용어 “중합체 시약”은 일반적으로 전체 분자를 말하며, 이는 수용성 중합체 분절 및 작용기를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 접합체는 IL-2 부분에 공유적으로 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 통상적으로, 임의의 주어진 접합체에 대하여, IL-2 활성을 가지는 하나 이상의 부분에 공유적으로 부착되는 1개 내지 3개의 수용성 중합체일 것이다. 그러나 몇몇 경우에서, 상기 접합체는 IL-2 부분에 개별적으로 부착된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 수용성 중합체를 가질 수 있다. 임의의 주어진 수용성 중합체는 IL-2 부분의 아미노산에, 또는 IL-2 부분이 (예를 들어) 당단백질일 때, IL-2 부분의 탄수화물에 공유적으로 부착될 수 있다. 탄수화물에의 부착은 예를 들어 시알산-아지드 화학 반응[Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38):12358-12366] 또는 알데히드기의 도입을 용이하게 하는 글리시돌의 이용과 같은 기타 다른 적합한 접근법[Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433]을 이용하여 물질대사 작용화를 사용함으로써 실행할 수 있다
IL-2 활성을 가지는 부분 및 중합체 내에서 특정한 결합은 다수의 인자에 따라 다르다. 상기 인자는, 예를 들어 이용된 특정한 결합 화학 성질, 특정한 IL-2 부분, IL-2 부분 내에서 (중합체로의 부착 또는 적합한 부착 부위로의 전환을 위하여) 이용가능한 작용기, IL-2 부분 내에서 추가적인 반응성 작용기의 존재 등을 포함한다.
본 발명의 접합체는, 반드시 그러하여야 하는 것은 아니지만, 전구 약물일 수 있는데, 이는 중합체와 IL-2 부분 사이의 결합이 유리가능하여, 부모 부분이 유리될 수 있음을 의미한다. 예시적인 유리가능한 결합으로서는 카복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 티올 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 결합은 IL-2 부분(예를 들어, 단백질의 카복실기 C 말단 또는 단백질 중에 포함된 아미노산, 예를 들어 세린 또는 트레오닌의 측쇄 하이드록실기, 또는 탄수화물 중 유사한 작용기) 및/또는 중합체 시약을, 당업계에서 통상적으로 사용되는 커플링 방법을 사용하여 적절히 변형함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 그러나, 적당히 활성화된 중합체와 IL-2 활성을 가지는 부분 중에 포함된 비변형 작용기의 반응에 의해 용이하게 형성되는 유리가능 결합이 가장 바람직하다.
대안적으로, 아미드, 우레탄(카바메이트로도 알려짐), 아민, 티오에티르(설파이드로도 알려짐), 또는 우레아(카바마이드로도 알려짐) 결합과 같은 가수분해에 안정적인 결합은 또한 IL-2 부분을 결합하기 위하여 결합으로서 이용될 수 있다. 또 한편, 바람직한 가수분해에 안정적인 결합은 아미드이다. 하나의 접근법에서, 활성화된 에스테르를 가지는 수용성 중합체는 IL-2 부분 상에서 아민기와 반응함으로써 아미드 결합을 생성할 수 있다.
접합체(접합되지 않은 IL-2 부분에 반대인 것)는 측정가능한 정도의 IL-2 활성을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 즉, 본 발명에 따라서 중합체-IL-2 부분 접합체는 변형되지 않은 부모 IL-2 부분의 생물활성의 약 0.1% 내지 약 100%를 어디에서도 가질 것이다. 몇몇 경우에서, 중합체-IL-2 부분 접합체는 변형되지 않은 부모 IL-2 부분의 100% 초과의 생물활성을 가질 것이다. 바람직하게, IL-2 활성을 약간 가지거나 또는 전혀 가지지 않는 접합체는 중합체를 상기 부분과 결합하는 가수분해가능한 결합을 포함하여, 접합체에서 활성의 결여(또는 상대적으로 결여)에 관계없이, 가수분해가능한 결합의 수성 유도 절단시 활성 부모 분자(또는 이의 유도체)가 유리된다. 이용되는 IL-2 활성을 가지는 특정 부분의 공지된 활성에 따라서, 상기 활성은 적당한 생체내 또는 시험관내 모델을 사용하여 결정할 수 있다.
중합체에 대하여 IL-2 활성을 가지는 부분을 결합하는 가수분해에 안정적인 결합을 가지는 접합체에 대하여, 상기 접합체는 통상적으로 측정가능한 정도의 생물활성을 가질 것이다. 예를 들어, 상기 접합체는 통상적으로 접합되지 않은 IL-2 부분의 생물활성에 대한 하기 퍼센트의 하나 이상을 만족하는 생물활성을 가지는 것으로 특징지어진다: 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 100% 이상, 및 105% 초과(당업계에 익히 공지된 모델과 같은 적합한 모델에서 측정될 때). 바람직하게 이상, 가수분해에 안정적인 결합(예를 들어, 아미드 결합)을 가지는 접합체는 IL-2 활성을 가지는 변형되지 않은 부모 부분의 적어도 일부 정도의 생물활성을 가질 것이다.
이제, 본 발명에 의한 예시적인 접합체를 기술할 것이다. 통상적으로 IL-2 부분은 서열 번호 1 내지 서열 번호 4 중 하나 이상에 제공된 서열과 유사한 아미노산 서열을 (적어도 부분적으로) 공유하는 것으로 예측된다. 그러므로, 서열 번호 1 내지 서열 번호 4 중 특정 위치 또는 원자를 참고로 하였을 때, 이와 같은 참고는 오로지 편의를 위한 것으로서 당업자는 IL-2 활성을 가지는 기타 다른 부분들 중 상응하는 위치 또는 원자를 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 특히 본원에서 타고난 사람 IL-2에 관하여 제공된 설명은 종종 상기 서열들 중 임의의 것의 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체에도 적용될 수 있다.
IL-2 부분 상의 아미노기는 IL-2 부분과 수용성 중합체 사이의 부착점을 제공한다. 서열번호 1 내지 4에서 제공되는 아미노산 서열을 사용하여, 접합체에 대하여 이용가능한 ε-아미노산을 가지는 각각에 수 개의 리신 잔기가 있음은 명백하다. 추가적으로 또한 임의의 단백질의 N-말단 아민은 부착점으로서의 역할을 할 수 있다.
IL-2 부분의 이용가능한 아민으로 공유 결합을 형성하는데 유용한 적합한 중합체 시약의 다수의 예가 있다. 상응하는 접합체에 따른 특이적인 예는 하기 표 1에 제공된다. 표에서 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-NH-(IL-2)”는 중합체 시약에 접합한 후 IL-2 부분의 잔기를 나타낸다. 표 1에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]이 “CH3”기에서 종결할 때, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
Figure pat00010
IL-2 부분의 아미노기로 중합체 시약의 접합은 다양한 기술로 이루어질 수 있다. 하나의 접근법에서, IL-2 부분은 숙신이미딜 유도체(또는 기타 다른 활성화된 에스테르기, 여기에서 대안적인 활성화된 에스테르기 함유 중합체 시약에 대하여 기술된 것과 유사한 접근법을 사용할 수 있음)로 작용화된 중합체 시약으로 접합될 수 있다. 이러한 접근법에서, 상이한 반응 조건(예를 들어, 6 내지 7과 같은 낮은 pH, 또는 상이한 온도 및/또는 15℃ 미만 온도)을 사용하여 IL-2 부분 상의 상이한 위치로 중합체의 부착을 일으킬 수 있더라도, 숙신이미딜 유도체를 가지는 중합체는 pH 7 내지 9.0의 수성 매질에서 IL-2 부분에 부착될 수 있다. 덧붙여, 아미드 결합은 아민 종결 비펩티드성, 수용성 중합체를 활성화 카복실산기를 가지는 IL-2 부분과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식 내에 포함되며,
Figure pat00011
상기 식중,
(n)은 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고;
X는 스페이서 부분이며;
R1은 유기 라디칼이고;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식에 의해 포함되며,
Figure pat00012
상기 식중, (n)은 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고, IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
IL-2 부분을 중합체 시약으로 접합시키는데 유용한 통상적인 다른 접근법은 IL-2 부분의 1차 아민을 케톤, 알데히드 또는 이의 수화물 형태(예를 들어, 케톤 수화물, 알데히드 수화물)로 작용화된 중합체 시약으로 접합하는 환원적 아미노화(reductive amination)의 이용이다. 이러한 접근법에서, IL-2 부분으로부터의 1차 아민은 알데히드 또는 케톤(또는 수화된 알데히드 또는 케톤의 상응하는 하이드록실 함유 기)의 카보닐기와 반응하며, 이렇게 함으로써 시프염기(Schiff base)를 형성한다. 그 후 결과적으로 시프염기는 소듐 보로하이드라이드와 같은 환원제의 이용을 통해 안정적인 접합체로 환원적으로 전환될 수 있다. 특히 케톤 또는 알파-메틸 분지형 알데히드로 및/또는 특이적인 반응 조건(예를 들어, 환원된 pH) 하에서 작용화된 중합체와의 선택적인 반응(예를 들어, N-말단에서)이 가능하다.
수용성 중합체가 분지형인 본 발명의 예시적인 접합체는, 수용성 중합체가 다음과 같은 구조식 내에 포함되는 것을 포함하며,
Figure pat00013
상기 식중, 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식 내에 포함되며,
Figure pat00014
상기 식중,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고;
X는 스페이서 부분이며;
(b)는 2 내지 6의 값을 가지는 정수이고;
(c)는 2 내지 6의 값을 가지는 정수이며;
각각의 경우, R2는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식 내에 포함되며,
Figure pat00015
상기 식중,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
본 발명의 기타 다른 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식 내에 포함되며,
Figure pat00016
상기 식중,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고;
(a)는 0 또는 1이며;
X가 존재할 때, 이 X는 하나 이상의 원자로 이루어진 스페이서 부분이고;
(b')는 0이거나 1 내지 10의 값을 가지는 정수이며;
(c)는 1 내지 10의 값을 가지는 정수이고;
각각의 경우, R2는 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이며;
각각의 경우, R3은 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
본 발명의 또 다른 예시적 접합체는 다음과 같은 구조식 내에 포함되며,
Figure pat00017
상기 식중,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000 사이의 값을 가지는 정수이고;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
유리가능한 결합을 포함하는 예시적인 접합체는, IL-2 부분이 다음과 같은 화학식 내에 포함되는 중합체 시약에 접합되어 있는 것을 포함하며,
Figure pat00018
상기 식중,
POLY1은 제1 수용성 중합체이고;
POLY2는 제2 수용성 중합체이며;
X1은 제1 스페이서 부분이고;
X2는 제2 스페이서 부분이며;
Hα는 이온화 가능한 수소 원자이고;
R1은 H 또는 유기 라디칼이며;
R2는 H 또는 유기 라디칼이고;
(a)는 0 또는 1이며;
(b)는 0 또는 1이고;
Re1이 존재할 때, 이 Re1은 제1 전자 변경기(electron altering group)이며;
Re2가 존재할 때, 이 Re2는 제2 전자 변경기이고;
(FG)는 활성 제제의 아미노기와 반응하여 유리가능한 결합, 예를 들어 카바메이트 결합을 형성할 수 있는 작용기이다. 이러한 화학식들 중, 더 자세히 정의된 구조를 가지는 중합체 시약이 고려되며,
Figure pat00019
상기 식중, POLY1, POLY2, X1, X2, R1, R2, Hα 및 (FG)는 각각 상기 정의된 바와 같고, Re1은 제1 전자 변경기이며; Re2는 제2 전자 변경기이다.
또 다른 예시적 중합체 시약은 다음과 같은 화학식에 포함되며,
Figure pat00020
;
Figure pat00021
;
Figure pat00022
;
Figure pat00023
;
Figure pat00024
;
Figure pat00025
;
Figure pat00026
; 및
Figure pat00027
상기 식중, 각각의 구조식과 각각의 경우에 있어서, (n)은 독립적으로 4 내지 1500 사이의 정수이다.
이와 같이 유리가능한 결합을 제공하는 중합체 시약은 미국 특허 출원 공개 제2006/0293499호에 제시된 방법에 따라서 제조될 수 있다.
유리가능한 결합을 제공하는 중합체 시약을 사용하여 형성된 예시적인 접합체는 다음과 같은 화학식의 것들을 포함하며,
Figure pat00028
상기 식중,
POLY1은 제1 수용성 중합체이고;
POLY2는 제2 수용성 중합체이며;
X1은 제1 스페이서 부분이고;
X2는 제2 스페이서 부분이며;
Hα는 이온화가능한 수소 원자이고;
R1은 H 또는 유기 라디칼이며;
R2는 H 또는 유기 라디칼이고;
(a)는 0 또는 1이며;
(b)는 0 또는 1이고;
Re1이 존재할 때, 이 Re1은 제1 전자 변경기이며;
Re2가 존재할 때, 이 Re2는 제2 전자 변경기이고;
Y1은 O 또는 S이며;
Y2는 O 또는 S이고;
(IL-2)는 IL-2 부분의 잔기이다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조식을 가지며,
Figure pat00029
;
Figure pat00030
;
Figure pat00031
;
Figure pat00032
;
Figure pat00033
;
Figure pat00034
;
Figure pat00035
; 및
Figure pat00036
상기 식중,
각각의 구조식과 각각의 경우에 있어서, (n)은 독립적으로 4 내지 1500 사이의 정수이고, (IL-2)는 IL-2 부분의 잔기이다.
카복실기는 IL-2 부분 상의 부착점으로서의 역할을 할 수 있는 다른 작용기를 나타낸다. 구조적으로, 상기 접합체는 하기를 포함할 것이며,
Figure pat00037
여기에서 (IL-2) 및 인접한 카보닐기는 카복실 포함 IL-2 부분에 해당하고, X는 결합, 바람직하게 O, N(H), 및 S로부터 선택된 헤테로원자이며, POLY는 PEG와 같은 수용성 중합체이고, 선택적으로 말단 캐핑 부분에서 종결된다.
C(O)-X 결합은 말단 작용기를 가지는 중합체 유도체와 카복실 포함 IL-2 부분 사이의 반응으로 생긴다. 상기에서 검토된 바와 같이, 특이적인 결합은 이용되는 작용기의 유형에 따라 다를 것이다. 중합체가 하이드록실기로 말단 작용화되거나 또는 “활성화”되면, 생성되는 결합은 카복실산 에스테르일 것이고 X는 0일 것이다. 중합체 골격이 티올기로 작용화되면, 생성되는 결합은 티오에스테르일 것이고 X는 S일 것이다. 임의의 다수의 팔을 가진, 분지형 또는 갈라진 중합체를 이용할 때, C(O)X 부분, 및 특히 X 부분은 상대적으로 더 복잡할 수 있고 더 긴 결합 구조를 포함할 수 있다.
또한 하이드라지드 부분을 포함하는 수용성 유도체는 카보닐 및 카복실산에서 접합에 유용하다. IL-2 부분이 카보닐 부분 또는 카복실산을 포함하지 않는 정도로, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 추가될 수 있다. 예를 들어, 카복실산(예를 들어, C-말단 카복실산)을 환원시킴으로써 및/또는 IL-2 부분의 글리코실화된 또는 글리케이트된(glycated)(여기에서 첨가된 당은 카보닐 부분을 가짐) 형태(version)를 제공함으로써 카보닐 부분을 도입할 수 있다. 카복실산을 포함하는 IL-2 부분에 대하여, PEG-하이드라진 시약은 커플링제(coupling agent)(예를 들어, DCC)의 존재 하에, IL-2 부분에 공유적으로 부착한다[예를 들어, mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(O)-(IL-2)는 mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-2를 생성함]. 상응하는 접합체에 따른 하이드라지드 부분을 포함하는 수용성 유도체의 특이적인 예는 하기 표 2에 제공된다. 덧붙여, 활성화된 에스테르(예를 들어, 숙신이미딜기)를 포함하는 임의의 수용성 유도체는, 활성화된 에스테르를 포함하는 수용성 중합체 유도체를 하이드라진(NH2-NH2) 또는 tert-부틸 카바제이트[NH2NHCO2C(CH3)3]와 반응시킴으로써 전환되어 하이드라지드 부분을 포함할 수 있다. 표에서, 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-C(O)-(IL-2)”는 중합체 시약으로의 접합 후의 IL-2 부분의 잔기를 나타낸다. 선택적으로, 하이드라존 결합은 적합한 환원제를 사용함으로써 환원될 수 있다. 표 2에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]이 “CH3”기에서 종결할 때, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
Figure pat00038
Figure pat00039
IL-2 부분 내에 포함된 티올기는 수용성 중합체에 대한 효과적인 부착 부위로서의 역할을 할 수 있다. IL-2 부분이 단백질일 때 특히 시스테인 잔기는 티올기를 제공한다. 그 다음 상기 시스테인 잔기에서 티올기는 티올기, 예를 들어 N-말레이미딜 중합체 또는 미국 특허 제5,739,208호 및 WO 01/62827호에 기술된 바와 같은 기타 다른 유도체와의 반응에 특이적인 활성화된 PEG와 반응할 수 있다. 덧붙여, 보호된 티올은 활성화된 당단백질의 올리고당 측쇄 내로 편입되고, 그 후 티올 반응성 수용성 중합체로 탈보호화된다.
상응하는 접합체에 따른 시약의 특이적인 예는 하기 표 3에 제공된다. 표에서, 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-S-(IL-2)”는 수용성 중합체로의 접합 후의 IL-2 부분의 잔기를 나타낸다. 표 3에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]이 “CH3”기에서 종결할 때, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
예시적인 IL-2 부분들과 상응하는 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 있어서, 125번 위치에 시스테인 잔기가 존재하는 것이 확인될 수 있다. 그러므로 예시적인 티올 부착 부위는 125번 위치에 위치하는 시스테인이다. 비록 주어진 IL-2 부분과 결합된 임의의 이황화 결합을 파괴하는 것은 바람직하지 않지만, 이러한 시스테인 잔기들 중 하나 이상의 측쇄 내에 중합체를 부착시켜 활성의 정도를 유지하는 것이 가능할 수 있다. 뿐만 아니라, 통상의 합성 기술을 이용하여 IL-2 부분에 시스테인 잔기를 부가할 수도 있다. 예를 들어, WO 90/12874호에 기술된, 시스테인 잔기를 부가하는 방법(이 방법은 IL-2 부분에 맞춰 수정될 수 있음)을 참고한다. 또한, 통상의 유전자 조작 방법도 시스테인 잔기를 IL-2 부분에 도입하는데 사용될 수 있다. 그러나, 몇몇 구체예에서, 부가의 시스테인 잔기 및/또는 티올기를 도입하지 않는 것이 바람직하다.
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
(말레이미드가 IL-2 부분 상의 아민 또는 티올기와 반응하는지 여부와 관계없이) 하나 이상의 말레이미드 작용기를 가지는 수용성 중합체로부터 형성된 접합체에 대하여, 수용성 중합체의 상응하는 말레암산(maleamic acid) 형태(들)는 또한 IL-2 부분과 반응할 수 있다. 임의의 조건(예를 들어, 약 pH 7~9 및 물의 존재) 하에서, 말레이미드 고리는 “열려서(open)” 상응하는 말레암산을 형성할 것이다. 결과적으로 말레암산은 IL-2 부분의 아민 또는 티올기와 반응할 수 있다. 예시적인 말레암산에 기초한 반응은 하기에 도식적으로 나타내어져 있다. POLY는 수용성 중합체를 나타내고, (IL-2)는 IL-2 부분을 나타낸다.
Figure pat00043
본 발명에 따라서 대표적인 접합체는 다음의 구조를 가질 수 있으며,
POLY-L0,1-C(O)Z-Y-S-S-(IL-2)
여기에서 POLY는 수용성 중합체고, L은 임의의 링커이며, Z는 O, NH, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 헤테로원자이고, Y는 C2-10 알킬, C2-10 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되며, (IL-2)는 IL-2 부분이다. IL-2 부분과 반응할 수 있고 접합체의 이러한 유형을 생성할 수 있는 중합체 시약은 미국 특허 출원 공개 제2005/0014903호에 기술되어 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 수용성 중합체가 분지형의 형태인 본 발명의 예시적인 접합체는 수용성 중합체의 분지형의 형태가 다음의 구조를 포함하게 할 것이며,
Figure pat00044
여기에서, 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이다.
분지형의 형태로 수용성 중합체를 가지는 예시적인 접합체는 다음의 시약을 사용하여 제조되며,
Figure pat00045
그렇게 함으로써 다음의 구조를 가지는 접합체를 형성하고,
Figure pat00046
여기에서,
(각각의 구조에 있어서) 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이며,
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
추가적인 예시적 접합체는 다음의 시약을 사용하여 형성될 수 있으며,
Figure pat00047
그렇게 함으로써 다음의 구조를 가지는 접합체를 형성하고,
Figure pat00048
여기에서,
(각각의 구조에 있어서) (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이며;
IL-2는 IL-2 부분의 잔기이다.
접합체는 다수의 방식으로 티올 선택적인 중합체 시약을 사용하여 형성될 수 있고 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 선택적으로 적합한 완충액(원한다면, 아민 함유 완충액을 포함함)에서, IL-2 부분은 약 pH 7~8의 수성 매질에 배치하고, 티올 선택적인 중합체 시약은 과량 몰로 첨가한다. PEG화 수율을 상대적으로 낮게 결정한다면 2 시간 초과의 반응 시간(예를 들어, 5시간, 10시간, 12시간, 및 24시간)은 유용할 수 있지만, 반응은 약 0.5 내지 2 시간 동안 진행되게 한다. 이러한 접근법에서 사용할 수 있는 예시적인 중합체 시약은 말레이미드, 술폰(예를 들어, 비닐 술폰), 및 티올(예를 들어, 오르토 피리디닐 또는 “OPSS”와 같은 작용화된 티올)로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성기를 가지는 중합체 시약이다.
중합체 시약에 대하여, 여기 및 다른 부분에서 기술된 것들은 상업적 출처에서 구입하거나 또는 상업적으로 이용가능한 출발 물질에서 제조할 수 있다. 덧붙여, 중합체 시약을 제조하는 방법은 문헌에 기술되어 있다.
IL-2 부분과 비펩티드성 수용성 중합체 사이의 부착은, 어떠한 개재 원자(intervening atom)가 IL-2 부분과 중합체 사이에 위치하지 않아 직접적일 수 있거나, 또는 IL-2 부분과 중합체 사이에 하나 이상의 원자가 위치하여 간접적일 수 있다. 간접적인 부착에 대하여 “스페이서 부분”은 IL-2 부분의 잔기와 수용성 중합체 사이에서 링커로서의 역할을 한다. 스페이서 부분을 구성하는 하나 이상의 원자는 하나 이상의 탄소 원자, 질소 원자, 황 원자, 산소 원자, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서 부분은 아미드, 2차 아민, 카바메이트, 티오에테르, 및/또는 이황화기를 포함할 수 있다. 특이적인 스페이서 부분의 비제한적인 예로서는 -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, 2가 사이클로알킬기, -O-, -S-, 아미노산, -N(R6)-, 및 상기한 것 중 임의의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하고, 여기에서 R6은 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택된 유기 라디칼이고, (h)는 0 내지 6이며, (j)는 0 내지 20이다. 기타 다른 특이적인 스페이서 부분은 -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, 및 -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-의 구조를 가지며, 여기에서 각각의 메틸렌 뒤의 아래첨자는 상기 구조 내에 포함된 메틸렌의 수를 나타내는데, 예를 들어 (CH2)1-6은 구조가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 메틸렌을 포함할 수 있음을 의미한다. 추가적으로, 임의의 상기 스페이서 부분은 1개 내지 20개의 에틸렌 옥사이드 단량체 단위[즉, -(CH2CH2O)1-20]를 포함하는 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬을 더 포함할 수 있다. 즉, 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬은 스페이서 부분의 앞에 또는 뒤에, 그리고 선택적으로 두 개 이상의 원자로 구성되는 스페이서 부분의 임의의 두 개의 원자 사이에서 생길 수 있다. 또한, 상기 올리고머가 중합체 분절에 인접하거나 단지 중합체 분절의 연장을 나타내는 것이라면, 상기 올리고머 사슬은 스페이서 부분의 일부인 것으로 고려되지 않는다.
조성물
상기 접합체는 통상적으로 조성물의 부분이다. 일반적으로, 바람직하게 필수적이지는 않지만, 상기 조성물은 복수의 접합체를 포함하고 각각의 접합체는 동일한 IL-2 부분으로 구성된다(즉, 전체 조성물 내에서, IL-2 부분의 오직 한 가지 유형만이 발견된다). 덧붙여, 상기 조성물은 다수의 접합체를 포함할 수 있고, 여기에서 임의의 주어진 접합체는 둘 이상의 상이한 IL-2 부분으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 부분으로 구성된다(즉, 전체 조성물 내에서, 둘 이상의 상이한 IL-2 부분이 발견된다). 그러나 선택적으로 조성물 내에서 실질적으로 모든 접합체(예를 들어, 조성물 내에서 85% 이상의 다수의 접합체)는 각각 동일한 IL-2 부분으로 구성된다.
조성물은 단일의 접합체 종(species)(예를 들어, 단일 중합체가 조성물 내에서 실질적으로 모든 접합체에 대하여 동일한 위치에서 부착된 모노PEG화된 접합체) 또는 접합체 종의 혼합물(예를 들어, 중합체의 부착이 상이한 부위에서 일어난 모노PEG화된 접합체의 혼합물 및/또는 모노PEG화된 접합체, 다이PEG화된 접합체 및 트리PEG화된 접합체의 혼합물)을 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 IL-2 활성을 가지는 임의의 주어진 부분에 부착된 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상의 중합체를 가지는 기타 다른 접합체를 포함할 수 있다. 덧붙여, 본 발명은 조성물이 다수의 접합체를 포함하는 경우를 포함하며, 각각의 접합체는 하나의 IL-2 부분에 공유적으로 부착된 하나의 수용성 중합체뿐만 아니라 하나의 IL-2 부분에 공유적으로 부착된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상의 수용성 중합체를 포함하는 조성물을 포함한다.
조성물 내의 접합체에 대하여, 조성물은 하나 이상의 다음 특징을 만족할 것이다: 조성물 내의 약 85% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 4개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 85% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 3개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 85% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 2개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 85% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 95% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 5개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 95% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 4개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 95% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 3개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 95% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 2개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 95% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 99% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 5개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 99% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 4개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 99% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 3개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 99% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개 내지 2개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 약 99% 이상의 접합체는 IL-2 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것임. 중합체의 범위에 대한 언급, 예를 들어 “x 내지 y개의 중합체”는 x부터 y까지를 포함한 중합체의 수를 고려(즉, 예를 들어 “1 내지 3개의 중합체”는 1개의 중합체, 2개의 중합체 및 3개의 중합체를 고려하고, “1 내지 2개의 중합체”는 1개의 중합체 및 2개의 중합체를 고려, 등등)하는 것으로 이해된다.
하나 이상의 구체예에서, 접합체 포함 조성물은 알부민이 없거나 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 또한 상기 조성물은 IL-2 활성을 가지지 않는 단백질이 없거나 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 조성물은 알부민이 85%, 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 없는 것이 바람직하다. 추가적으로, 상기 조성물은 IL-2 활성을 가지지 않는 임의의 단백질이 85%, 더 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 99% 없는 것이 바람직하다. 상기 조성물 내에 알부민이 존재하는 정도까지, 본 발명의 예시적인 조성물은 IL-2 부분의 잔기를 알부민에 결합하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 접합체가 실질적으로 없다.
상품명 프로루킨®(캘리포니아 샌디에고 소재, 프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션으로부터 시판)인 알데스루킨에 있어서, IL-2는 소듐 도데실 설페이트(“SDS”)와 함께 제공된다. 이와는 대조적으로, 유리하게 본 발명의 조성물은 SDS를 필요로 하지 않을 수 있는 것이므로, SDS와 일반적으로는 세제(예를 들어, 트윈 20 (Tween20) 및 트윈 80)를 포함하지 않는다(또는 실질적으로 포함하지 않는다). 결과적으로 본 발명의 조성물과 접합체는 SDS, 트윈 20 및 트윈 80을 첨가하는 단계를 수행하지 않고서도 제조될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물과 접합체는 세제 또는 기타 다른 부형제를 첨가하는 단계를 수행하지 않고서도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 세제, 예를 들어 SDS, 트윈 20 및 트윈 80을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(예를 들어, 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 15% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 10% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 9% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 8% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 6% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 5% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 4% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 3% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 2% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 0.001% 미만을 포함한다). 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물과 접합체는 (예를 들어, 한외 여과에 의해) 세제, 예를 들어 SDS, 트윈 20 및 트윈 80을 제거하는 단계를 수행하지 않고서도 제조될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조성물과 접합체는 (예를 들어, 한외 여과에 의해) 세제를 제거하는 단계를 수행하지 않고서도 제조될 수 있다.
임의의 주어진 부분에 대한 중합체의 원하는 수의 제어는 적절한 중합체 시약, IL-2 부분에 대한 중합체 시약의 비율, 온도, pH 조건, 및 접합 반응의 기타 다른 양상을 선택함으로써 성취될 수 있다. 덧붙여, 원하지 않는 접합체(예를 들어, 4개 이상의 부착된 중합체를 가지는 접합체)의 감소 또는 제거는 정제 수단을 통해 성취될 수 있다.
예를 들어, 중합체-IL-2 부분 접합체는 정제되어 상이한 접합된 종을 획득/분리할 수 있다. 구체적으로, 생성물 혼합물은 정제되어 IL-2 부분당 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 PEG, 통상적으로 IL-2 부분당 1개, 2개, 또는 3개의 PEG로부터 임의의 부분의 평균을 획득할 수 있다. 최종 접합체 반응 혼합물의 정제를 위한 전략은 예를 들어 이용된 중합체 시약의 분자량, 특정 IL-2 부분, 원하는 투여 요법, 및 잔여 활성 및 개별적인 접합체(들)의 생체내 특성을 포함한 다수의 인자에 따라 다를 것이다.
원한다면, 상이한 분자량을 가지는 접합체는 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다. 즉, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 상이한 분자량에 기초하여(차이는 본질적으로 수용성 중합체 부분의 평균 분자량에 해당함) 상이하게 번호가 매겨진 중합체 대 IL-2 부분의 비율(예를 들어, 1-머, 2-머, 3-머 등, 여기에서 “1-머”는 IL-2 부분에 대한 1개의 중합체를 나타내고, “2-머”는 IL-2 부분에 대한 2개의 중합체를 나타낸다, 등등)을 분별한다. 예를 들어, 35,000달톤 단백질이 약 20,000달톤의 분자량을 가지는 중합체 시약에 무작위로 접합되는 예시적인 반응에서, 생성되는 반응 혼합물은 변형되지 않은 단백질(약 35,000달톤의 분자량을 가짐), 모노PEG화된 단백질(약 55,000달톤의 분자량을 가짐), 다이PEG화된 단백질(약 75,000달톤의 분자량을 가짐), 등을 포함할 수 있다.
이러한 접근법을 사용하여 PEG와 상이한 분자량을 가지는 기타 다른 중합체-IL-2 부분 접합체를 분리하는 반면, 이러한 접근법은 일반적으로 IL-2 부분 내에서 상이한 중합체 부착 부위를 가지는 위치상 이소형(positional isoform)을 분리하는데 효과적이지 않다. 예를 들어, 회수된 접합체 조성물의 각각은 IL-2 부분 내에서 상이한 반응성기(예를 들어, 리신 잔기)에 부착된 PEG(들)를 포함할 수 있지만, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 각각의 다른 혼합물을 분리할 수 있다.
이러한 유형의 분리를 실행하는데 적합한 겔 여과 컬럼은 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)(뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 이용가능한 슈퍼덱스TM(SuperdexTM) 및 세파덱스TM(SephadexTM) 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼의 선별은 원하는 분별 범위에 따라 다를 것이다. 용출은 일반적으로 포스페이트, 아세테이트 등과 같은 적합한 완충액을 사용하여 실행할 수 있다. 수집된 분획물은, 예를 들어 (i) 단백질 함량에 대하여 280nm에서의 흡광도, (ii) 표준으로서 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 염색에 기초한 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대하여 요오드 시험(Sims et al. (1980) Anal. BioIL-2m, 107:60-63), (iv) 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE) 후 바륨 요오다이드로 염색, 및 (v) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 다수의 상이한 방법으로 분석할 수 있다.
위치상 이소형의 분리는 적합한 컬럼(예를 들어, C18 컬럼 또는 C3 컬럼, 아머샴 바이오사이언시스 또는 바이닥(Vydac)과 같은 회사에서 시판 중임)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 역상 크로마토그래피로 또는 이온 교환 컬럼(예를 들어, 아머샴 바이오사이언시스에서 시판 중인 세파로즈TM(SepharoseTM) 이온 교환 컬럼)을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피로 실행한다. 이러한 접근법 중 하나를 사용하여 동일한 분자량을 가지는 중합체-활성제 이성질체(isomer)(즉, 위치상 이소형)를 분리할 수 있다.
상기 조성물은 바람직하게 IL-2 활성을 가지지 않는 단백질이 실질적으로 없다. 덧붙여, 상기 조성물은 바람직하게 기타 다른 비공유적으로 부착된 수용성 중합체 모두 실질적으로 없다. 그러나 몇몇 환경에서, 상기 조성물은 중합체-IL-2 부분 접합체 및 접합되지 않은 IL-2 부분의 혼합물을 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다. 원한다면, 약학적으로 허용가능한 부형제는 접합체에 첨가되어 조성물을 형성할 수 있다.
예시적인 부형제는 이에 한정되지 않지만, 탄수화물, 무기염, 항균제, 항산화제, 계면활성제, 완충액, 산, 염기, 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
당과 같은 탄수화물, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 및/또는 당 중합체와 같은 유도체화 당은 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제로서는 예를 들어 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 사이클로덱스트린 등과 같은 알디톨을 포함한다.
또한 부형제로서는 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 및 이의 조합과 같은 무기염 또는 완충액을 포함할 수 있다.
또한 조성물은 미생물 성장을 방지 또는 막기 위한 항균제를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 구체예에 적합한 항균제의 제한적이지 않는 예는 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질 알코올, 염화세틸피리디늄, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산 페닐수은, 타이메로솔(thimersol), 및 이의 조합을 포함한다.
항산화제도 또한 상기 조성물 내에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지하는데 사용되어, 접합체 또는 제조물의 기타 다른 성분의 악화를 방지한다. 본 발명의 하나 이상의 구체예에서의 사용에 적합한 항산화제로서는 예를 들어 팔미트산아스코빌, 부틸 하이드록시아니솔, 부틸 하이드록시톨루엔, 차아인산(hypophosphorous acid), 모노티오글리세롤, 갈산프로필(propyl gallate), 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 소듐포름알데히드설폭실레이트(sodium formaldehyde sulfoxylate), 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite), 및 이의 조합을 포함한다.
계면활성제는 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 “트윈 20” 및 “트윈 80”과 같은 폴리소르베이트, F68 및 F88(둘 다 BASF(뉴저지주 마운트 올리브 소재)에서 시판 중임)과 같은 플루로닉(pluronic); 소르비탄 에스테르; 레시틴 및 기타 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민(바람직하게는 리포좀 형태로 있지 않음)과 같은 인지질, 지방산 및 지방 에스테르와 같은 지질; 콜레스테롤과 같은 스테로이드; 및 EDTA, 아연 및 기타 다른 적합한 양이온과 같은 IL-2화제를 포함한다.
산 또는 염기는 상기 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용할 수 있는 산의 제한적이지 않는 예로서는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산(perchloric acid), 인산, 황산, 푸마르산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 산들을 포함한다. 적합한 염기의 예로서는 이에 한정되지 않지만, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨(potassium fumerate), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기들을 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 본원에 기술된 조성물 중 부형제로서 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 예시적인 아미노산으로서는 아르기닌, 리신 및 글리신을 포함한다.
상기 조성물 내에서 접합체(즉, 활성제와 중합체 시약 사이에 형성된 접합체)의 양은 다수의 인자에 따라 다양할 것이지만, 최적으로는 조성물이 단위 투약 용기(unit dose container)(예를 들어, 바이알) 내에 저장될 때 치료상으로 효과적인 용량일 것이다. 덧붙여, 약학적 제조물은 주사기 내에 수용될 수 있다. 치료상으로 효과적인 용량은 임상적으로 원하는 종점을 제공하는 양을 결정하기 위하여 접합체의 양을 증가시키면서 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정할 수 있다.
상기 조성물 내에서 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 수요에 따라 다를 것이다. 통상적으로, 임의의 개별적인 부형제의 최적양은 통상적인 실험을 통해, 즉 (낮은 양에서 높은 양의 범위로) 부형제의 양을 달리하면서 포함하는 조성물을 제조, 안정성 및 기타 다른 파라미터를 시험, 및 그 다음 유의한 부작용이 없는 최적의 성능을 이루는 범위를 결정함으로써 결정된다.
그러나 일반적으로 부형제는 조성물 내에 부형제의 중량으로 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 중량으로 약 5% 내지 약 98%, 보다 바람직하게는 중량으로 약 15% 내지 약 95%의 양으로, 가장 바람직하게는 중량으로 30% 미만의 농도로 존재할 것이다.
기타 다른 부형제와 마찬가지로 이들 상기한 약학적 부형제는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 및 Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.
상기 조성물은 모든 유형의 제형, 특히 주사에 적합한 유형, 예를 들어 재구성될 수 있는 분말 또는 동결건조물(lyophilate)뿐만 아니라 액체를 포함한다. 주사하기 전에 고체 조성물을 재구성하기에 적합한 희석제의 예로서는 정균성 주사용수(bacteriostatic water for injection), 물 내의 5% 덱스트로스, 인산완충식염수, 링거용액, 식염수, 멸균수, 탈이온수, 및 이의 조합을 포함한다. 액체 약학적 조성물에 대하여, 용액 및 현탁액이 고려된다.
본 발명의 하나 이상의 구체예의 조성물은 통상적으로 필수적이지는 않지만 주사를 통해 투여되고, 따라서 일반적으로 투여 직전에 액체 용액 또는 현탁액이다. 또한 약학적 제조물은 시럽, 크림, 연고, 정제(tablet), 파우더 등과 같은 기타 다른 형태를 취할 수 있다. 기타 다른 투여 방식, 예를 들어 폐내, 직장, 경피, 경점막, 경구, 척추 강내, 종양 내, 종양 주위, 복막 내, 피하 및 동맥 내 등을 포함한다.
또한 본 발명은 상기 접합체를 이용한 치료에 반응하는 병태를 겪는 환자에게 본원에서 제공되는 바와 같은 접합체를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 일반적으로 주사를 통해 치료적으로 유효한 양의 접합체(바람직하게는 약학적 조성물의 부분으로서 제공됨)를 투여하는 단계를 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이, 상기 접합체는 (예를 들어, 근육내로, 피하로 및 비경구로) 주사될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형 유형으로서는 특히 주사용 용액으로 준비된 것, 사용 전에 용매와 같이 사용하는 건조 분말, 주사용으로 준비된 현탁액, 사용 전에 비히클과 같이 사용하는 건조 불용성 조성물, 및 투여 전에 희석하는 에멀젼 및 액체 농축물을 포함한다.
접합체(바람직하게는 약학 조성물의 부분으로서 제공됨)를 투여하는 방법은 상기 접합체가 특정 부위에 국소화되도록 임의로 수행될 수 있다. 예를 들어, 접합체를 포함하는 액체, 겔 및 고체 제형은 발병 부위(예를 들어, 종양 내부, 종양 근처, 염증이 생긴 내부 및 염증이 생긴 부위 근처)에 수술에 의해 이식될 수 있다. 편리하게, 장기와 조직은 또한 원하는 위치가 접합체에 더 잘 노출되도록 보장하기 위해 조영될 수도 있다.
투여 방법은 접합체의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 임의의 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 당업자들은 어떤 병태를 특정 접합체가 효과적으로 치효할 수 있는지를 인식한다. 예를 들어, 접합체는 신 세포 암, 전이성 흑색종, C형 간염 바이러스(HCV), 사람 면역 결핍증 바이러스(HIV), 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 소아 류머티스성 관절염, 아토피 피부염, 유방암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 기타 다른 약물 요법제와 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다. 유리하게, 접합체는 다른 활성제를 투여하기 전, 투여함과 동시, 또는 투여한 후 환자에게 투여될 수 있다.
투여되는 실제 용량은 개체의 나이, 체중, 및 일반적인 상태 뿐만 아니라 치료될 병태의 중증도, 보건 전문가의 판단 및 투여될 접합체에 따라 다양할 것이다. 치료적으로 유효한 양은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 적절한 참조 문서 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료적으로 유효한 양은 약 0.001mg 내지 100mg, 바람직하게는 0.01mg/일 내지 75mg/일의 용량으로, 보다 바람직하게는 0.10mg/일 내지 50mg/일의 용량의 범위일 것이다. 주어진 용량은, 예를 들어 유기인산 화합물 중독의 증상이 감소 및/또는 완전히 없어질 때까지 주기적으로 투여될 수 있다.
임의의 주어진 접합체(또한, 바람직하게는 약학적 제조물의 부분으로서 제공됨)의 단위 복용량은 임상의의 판단, 환자의 수요 등에 따라 다양한 투여 스케줄로 투여될 수 있다. 구체적인 투여 스케줄은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 통상적인 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 스케줄은 이에 한정되지 않지만, 하루에 1번, 일주일에 3번, 일주일에 2번, 일주일에 1번, 한달에 2번, 한달에 1번 투여 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 일단 임상 종점을 성취하면, 조성물의 투여는 중단시킨다.
본 발명은 이의 바람직한 특이적 구체예와 함께 기술되어 있고, 상기한 기술뿐만 아니라 후술하는 실시예는 본 발명을 예시하는 것이고 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아닌 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다른 양상, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련된 자들에게 명백할 것이다.
본원에서 참조한 모든 논문, 서적, 특허 및 기타 다른 간행물은 참조로서 전체가 포함된다.
실험예
본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는다면, 유기합성, 생화학, 단백질 정제 등의 통상적인 기술을 이용할 것이고, 이는 당업계의 기술 범위 내이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 상기한 문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)]을 참조한다.
다음의 실시예에서, 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대하여 정확성을 확보하기 위하여 노력하였으나, 몇몇 실험적 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 다르게 지시되지 않는다면, 온도는 섭씨이고 압력은 해수면에서의 대기압 또는 대기압 근처이다. 하기 실시예의 각각은 본원에 기술된 하나 이상의 구체예를 실행하는데 당업자에게 도움이 될 것으로 고려된다.
서열 번호 3의 아미노산 서열, 즉 성숙한 단백질 서열에 상응하는 재조합 IL-2(“rIL-2”)를 포함하는 수용액(“스톡 용액”)은 실시예에서의 사용을 위하여 마이오덤(Myoderm)(팬실베니아주 노리스타운 소재)으로부터 입수하였거나, 실시예 1에 따라서 제조하였다. 스톡 용액의 농도는 1㎎/㎖ 내지 100㎎/㎖으로 다양하였다.
SDS-PAGE 분석
인비트로겐 NuPAGE(Invitrogen NuPAGE) 시스템 및 노벡스(Novex) 4% 내지 10% 비스-트리스 예비 주조 겔(캘리포니아주 칼스배드 소재, 인비트로겐)을 사용하는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 샘플을 분석하였다. 샘플을 제조하고 나서, 겔에 로딩한 후, 제조자에 의해 기술된 바와 같이 전기 영동을 수행하였다.
양이온 교환 크로마토그래피
표준적 방법을 사용하여, 층 용적(bed volume) 약 100㎖인 SP-HP 세파로스(Sepharose)(GE 헬스케어; GE Healthcare) 양이온 교환 컬럼을 준비하였다. 상기 컬럼을 GE 헬스케어(영국 찰폰트 에스티. 길스 소재) AKTA 익스플로러 100에 연결하여, 제조된 PEG-rIL-2 접합체를 정제하였다. 정제 과정에 대한 상세한 설명은 이하에 기술되어 있다.
RP-HPLC 분석
애질런트(Agilent)(캘리포니아주 산타 클라라 소재) 1100 HPLC 시스템 상에서 역상 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석을 수행하였다. 실버톤(Silverton)(일본) 인트라다 WP-RP 컬럼(입도 3㎛, 2.1 × 150㎜)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 컬럼의 유속은 0.5㎖/분이었다. 이동상은 수중 0.09% TFA(용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.04% TFA(용매 B)였다.
실시예 1
IL-2 유전자의 클로닝 및 rIL-2의 발현
사람 IL-2 cDNA 서열은, 상이한 유기체의 코돈 사용 빈도에 있어서 상당한 차이로 인해 이.콜라이와 같은 원핵 세포 내에서는 최적으로 발현되지 않을 수 있다. 이.콜라이 코돈 사용 빈도를 최대화하기 위하여 현존하는 사람 유래 cDNA 서열에 대해 다수의 점 돌연 변이를 수행하는 대신에 PCR 기술을 사용하여 유전자 전체를 합성하였다.
중첩 프라이머로부터 유전자를 합성하는 방법은 본질적으로 최소한의 변형을 가한 2가지 방법의 조합이었다. 각각의 개별적인 방법에 대한 기초 설명은 문헌[Young et al. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59] 및 [Devlin et al. (1988) Gene 65:13-22]에 제공되어 있다. 간단히 말해서, DNA 서열을 몇가지 예외를 두고 정 올리고뉴클레오티드 및 역 올리고뉴클레오티드(길이는 35bp 미만)로 나누고, 상기 올리고뉴클레오티드들 사이에는 갭을 두지 않았다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 반대 가닥 상에 존재하는 2개의 인접한 서열과 10개 뉴클레오티드 이상만큼(3번 말단) 그리고 15개 뉴클레오티드 이상 만큼(5번 말단) 중첩되었다. 이중 비대칭 PCR을 사용하여 유전자의 부분 단편들을 조립하였으며, 중첩 연장 PCR을 사용하여 이와 같은 단편들을 합함으로써 전체 유전자를 조립하였다. 이후, Young et al.에 의해 기술된 바와 같이, T7 엔도뉴클레아제 I 선별 단계를 사용하여, 미스매칭된 이중사슬을 제거하였다. 문헌[Young et al. (2004) Nucleic Acids Research 32(7):e59]을 참조한다. 제한 효소 부위는 유전자 말단부에 포함시켰으며, 최종 유전자 단편은 시판 중인 발현 벡터(이.콜라이용)에 클로닝하였다. DNA 서열 분석을 사용하여 도 1과 서열 번호 5에 나타낸 바와 같이 획득한 서열을 확인하였다.
이러한 접근법을 이용함으로써 아미노산 서열은 타고난 성숙 사람 서열과 비교하였을 때 1번 아미노산 위치(알라닌)를 배제하고, 나타낸 바와 같이 서열에 대해 125번 아미노산 위치에서 C →S 아미노산 돌연 변이를 포함하였다. 이러한 서열 중 제1 아미노산은 직접 박테리아 발현용인 메티오닌이었다(신호 펩티드는 암호화되지 않음). 그러나, 발현이 진행될 때 초기 메티오닌은 숙주의 메티오닌 아미노 펩티다제에 의해 제거되었다.
유전자는 pET(T7) 발현 벡터들 중 하나에 클로닝되었다. 단백질은 이.콜라이 균주 BL21(DE3), 즉 통상적으로 T7 발현 시스템용으로서 사용되는 균주들 중 하나에서 발현시켰다. 이러한 발현 시스템은 시판되고 있으며, 발현 방법은 EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences)(독일 담슈타트 소재, 머크 카가아(Merck KGaA))로부터 입수할 수 있다. 이 시스템의 사용은 브루크헤이븐 국립 실험실로부터 연구 면허를 승인 받은 상태에서 수행되었다. 벡터는 단백질을 이.콜라이 내 봉입체의 형태로서 발현하였다. 발현에 이용되는 통상의 레시피는 문헌[Protein Production by Auto-Induction in High-Density Shaking Cultures, by F. William Studier, Biology Department, Brookhaven National Laboratory, Upton, NY 11973(December 20, 2007)]에서 살펴볼 수 있다.
발효 후 원심 분리에 의해서 세포를 수집하였다. 세포 덩어리 펠릿을 -80℃에 보관하여 추후 균질화에 사용하였다. 냉동 세포 덩어리 펠릿을 농도 10%(W/V)가 될 때까지 세포 세정 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA, pH8.0) 중에 재현탁한 다음, 13,860×g에서 30분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세정된 펠릿을 균질화 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA, 1mM PMSF, pH8.0) 중에서 재현탁한 다음, 4℃ 내지 15℃에서 마이크로플루다이저(Microfludizer)(M-110P; 미국 메사츄세츠주 뉴톤 소재, 마이크로플루이딕스)로 균질화하였다(1회 통과). 세포 세정 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA, pH8.0)을 사용하여 균질화물을 2배 희석한 다음, 이를 13,860×g에서 60분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA, 2% 트리톤 X-100, pH8.0; 50mM Tris, 5mM EDTA, 1% 소듐 데옥시콜레이트, pH8.0; 및 50mM Tris, 5mM EDTA, 1M NaCl, pH8.0)을 사용하여 봉입체 펠릿을 3 단계 연속 세정하였다. 이 펠릿을 세정한 결과 미정제 IL-2 봉입체를 수득하였다.
미정제 IL-2 봉입체를 6M 구아니딘, 100mM Tris, pH8 완충액 중에 용해하였다. EDTA를 최종 농도 2mM이 되도록 첨가하였다. 그 다음 디티오트레이톨(DTT)을 최종 농도 50mM이 되도록 첨가하였다. 이 혼합물을 50℃에서 30분 동안 항온 처리하였다. 환원 후, 물을 상기 혼합물에 첨가하여 구아니딘 농도를 4.8로 감소시켰다. 13,860×g에서 1시간 동안 원심 분리한 후, 생성된 겔 유사 펠릿을 폐기하였다. 여기에 물을 첨가하여 상청액 중 구아니딘 농도를 3.5M로 더 감소시켰다. 100% 아세트산으로 적정하여 pH를 5로 맞추었다. 상기 혼합물을 실온에서 60분 동안 항온 처리한 다음, 13,860×g에서 1시간 동안 원심 분리하였다. 생성된 펠릿을 3.5M 구아니딘, 20mM 아세테이트, 5mM DTT, pH 5 완충액에 현탁한 다음, 이를 13,860×g에서 1시간 동안 원심 분리하였다. 이러한 세정 단계를 1회 더 반복 실시하였다.
청정하고 크기가 작아진 IL-2 봉입체를 6M 구아니딘 및 100mM Tris pH8 완충액 중에 용해하였다. 여기에 100mM CuCl2 스톡을 첨가하여 Cu2+ 최종 농도가 0.1mM이 되도록 만들었다. 이 혼합물을 4℃에서 밤새 항온 처리하였다.
본 발명의 다른 구체예는, 단백질의 3차 구조를 얻기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 이와 관련하여 예전의 방법들은 종종 단계별 희석에 의존하였는데, 이는 종종 단백질에 무리를 주었다. 그러므로, 더 온화한 조건 하에서 단백질을 폴딩(folding)시키기 위한 개선된 접근 방법에 있어서, 발현된 단백질(예를 들어, IL-2 부분, 예를 들어 본 실시예에 의하여 생산된 IL-2)을 투석 백(이 백의 공극 크기는 발현된 단백질의 크기 미만임) 내부에 넣는 단계 및 여기에 단백질 변성제를 포함하지 않는 용액(예를 들어, 물)을 (바람직하게는 수 시간에 걸쳐서, 예를 들어 6시간에 걸쳐서, 더 바람직하게는 10시간에 걸쳐서, 훨씬 더 바람직하게는 15시간에 걸쳐서) 첨가하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 단백질 변성제 불포함 용액은 당업자들에게 인식되고 있으며, 그 예로서는 구아니딘, 우레아, 리튬 퍼클로레이트, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨 및 세제를 포함하지 않는(또는 실질적으로 포함하지 않는) 용액(예를 들어, 완충액 및 물)을 포함한다. 그러므로, 본 방법에 따라서, 발현된 IL-2 용액을 투석 백(분자량 공극 크기 = 3.5kDa)에 주입하였다. 상기 투석 백을, 4.8M 구아니딘, 0.1M Tris, pH8인 완충액이 담긴 저장기에 넣었다. 3시간 동안 평형 상태를 유지시킨 후, 15시간의 기간에 걸쳐 물을 상기 저장기 내에 펌핑하여 집어넣음으로써 저장기 중 구아니딘 농도를 서서히 2M로 감소시켰다. 전체 리폴딩(refolding) 과정을 4℃에서 종결하였다. 리폴딩된 IL-2를 SEC-HPLC로 분석하였다.
리폴딩된 IL-2를 13,860×g에서 60분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상청액을 펠리콘 XL TFF 막 시스템(Pellicon XL TFF membrane system)(미국 소재, 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))으로 농축하였다.
리폴딩되어 농축된 IL-2를, 세파크릴 S-100 HR 수지가 팩킹된 BPG 컬럼(스웨덴 웁살라 소재, GE 헬스케어 바이오-사이언시스 아베(GE Healthcare Bio-Sciences AB))에 로딩하였다. 전개 완충액은 2M 구아니딘, 20mM Tris pH8이었으며, 유속은 25㎖/분이었다. IL-2 단량체 피크를 나타낸 분획을 풀링(pooling)하였다. 기타 다른 적절한 정제 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC 크로마토그래피)도 사용될 수 있음이 주목되어야 할 것이다.
펠리콘 XL TFF 막 시스템(미국 소재, 밀리포어 코포레이션)을 사용하여 4℃ 및 30psi 내지 40psi 작동 압력 하에서 IL-2 단량체 분획 풀을 약 1㎎/㎖ 내지 2㎎/㎖의 농도로 농축하였다. 농축된 IL-2 단량체 용액을 최종 제형 완충액(10mM 아세테이트-Na, 5% 트레할로스, pH 4.5)에 대해 투석한 다음, 제형 완충액을 수회(보통 4회 내지 5회) 교체하여 구아니딘 농도를 0.1mM 미만으로 만들었다. 0.22㎛ 필터에 통과시켜 제형화된 IL-2 용액을 멸균 상태로 만든 다음, 추후 사용에 대비하여 -80℃에 보관하여 두었다.
실시예 2
mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS를 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00049
mPEG2-C2-fomc-20K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 20kDa("mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS")
아르곤 대기 하에 -80℃에 보관하여 두었던 mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS를 질소 퍼징(nitrogen purging) 하에서 주위 온도로 가온시켰다. mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS의 스톡 용액(200mG/㎖)을 2mM HCl중에 마련한 다음, mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS를, mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS 대 rIL-2의 몰비가 100:1이 되기에 충분한 양으로 rIL-2에 첨가하였다. 혼합물 중 rIL-2의 최종 농도는 0.5mG/㎖(0.035mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1M, pH 9.0)을 상기 혼합물에 최종 농도가 20mM이 될 때까지 첨가하고 나서, 30분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체를 제공하였다. 이로부터 30분 경과 후, 상기 반응 혼합물에 1M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 만들어 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이후, 급랭된 반응 혼합물을 H2O로 희석하여 전도도가 0.5mS/cm(25℃) 미만이 되도록 만들었다. 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 후 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]의 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 정제 프로필이 도 2a에 제공되어 있다. [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]와 미반응 PEG를 표시하였는데, 이때 선들은 다양한 파장(예를 들어, 280㎚ 및 225㎚)에서의 흡광도에 해당한다. 역상 HPLC 분석법에 의해 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]의 순도를 분석한 결과, 정제된 접합체의 280㎚에서의 순도는 100%인 것으로 확인되었다. 도 2b를 참조한다. 정제된 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 20㎍을 대상으로 수행된 4% 내지 12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE 겔 분석(쿠마시 블루 염색(겔은 나타내지 않음))에 의해 측정된 순도는 95% 이상이었다. 겉보기 분자량이 큰(200kDa 초과) 접합체는 PEG 수화 정도가 커서 접합체가 겔을 통과할 때의 이동도가 느렸던 것으로 보아, 유체 역학적 반경이 비교적 큰 것으로 생각되었다. 이러한 테스트를 통하여 3개의 접합체, 즉 4-머, 3-머, 2-머 및 1-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2], 즉 4개의 "[mPEG2-C2-fmoc-20K]"가 하나의 "[rIL-2]" 에 결합된 것(4-머), 3개의 "[mPEG2-C2-fmoc-20K]"가 하나의 "[rIL-2]"에 결합된 것(3-머), 2개의 "[mPEG2-C2-fmoc-20K]"가 하나의 [rIL-2]에 결합된 것(2-머), 1개의 "[mPEG2-C2-fmoc-20K]"가 하나의 [rIL-2]에 결합된 것(1-머)이 생산되었음이 확인하였다.
역상 HPLC로 종들의 변화를 관찰함으로써, rIL-2를 해리시키는 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]의 유리 특성을 나타내었다. 간단히 말해서, 정제된 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]를 100mM NaHCO3 용액 중에서 수 시간 동안 항온 처리하였다(pH 9.0, 37℃). 주기적으로 시스템 분취액을 채집한 후 이를 테스트하여, [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체가 사라지는 것과 rIL-2가 해리된 상태로 존재하는 것을 확인하였다. rIL-2의 생산은 항온 처리 후 약 10시간 경과시에 일정해졌으며, 침전이 일어남에 따라서 상기 rIL-2의 생산은 감소될 수 있었다. 데이터는 도 2c에 제공되어 있다.
실시예 3
mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS를 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00050
mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 20kDa("mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS")
아르곤 대기 하에 -80℃에 보관하여 두었던 mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS를 질소 퍼징 하에서 주위 온도로 가온시켰다. mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS의 스톡 용액(200mG/㎖)을 2mM HCl중에 마련한 다음, mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS를, mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS 대 rIL-2의 몰비가 100:1이 되기에 충분한 양으로 rIL-2에 첨가하였다. 혼합물 중 rIL-2의 최종 농도는 0.5mG/㎖(0.035mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1M, pH 9.0)을 상기 혼합물에 최종 농도가 20mM이 될 때까지 첨가하고 나서, 30분 동안 접합을 실시하여 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체를 제공하였다. 이로부터 30분 경과 후, 상기 반응 혼합물에 1M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 만들어 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이후, 급랭된 반응 혼합물을 H2O로 희석하여 전도도가 0.5mS/cm(25℃) 미만이 되도록 만들었다. 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 후 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]의 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 정제 프로필이 도 3a에 제공되어 있다. [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]를 표시하였는데, 이때 선들은 다양한 파장에서의 흡광도에 해당한다. 역상 HPLC 분석법에 의해 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]의 순도를 분석한 결과, 정제된 접합체의 280㎚에서의 순도는 98.5%인 것으로 확인되었다. 19.6분 경과시 피크는 미반응 mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS(0.1% 미만을 구성함)를 나타낸다. 도 3b를 참조한다. 정제된 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 20㎍을 대상으로 4% 내지 12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE 겔(쿠마시 블루 염색(겔은 나타내지 않음))에 의해 측정된 순도는 95% 이상이었다. 겉보기 분자량이 큰(200kDa 초과) 접합체는 PEG 수화 정도가 커서 접합체가 겔을 통과할 때의 이동도가 느린 것을 확인하였다. MALDI-TOF 분광 분석법에 의해, 정제된 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체의 분자량도 측정하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 79.6kDa에서의 주요 피크는 3-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체의 분자량에 관한 예상 범위 내에 포함되었다. 100.8kDa에서의 피크는 4-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]의 분자량에 관한 예상 범위 내에 포함되었다. MW 40kDa 및 58.7kDa인 피크는 이중으로 하전된 3-머 IL-2 접합체와 4-머 IL-2 접합체를 나타낼 수 있다.
실시예 4
분지형 mPEG-N-하이드록시숙신이미딜 유도체 20kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00051
mPEG2-ru-20K-N-하이드록실숙신이미딜 유도체, 20kDa("mPEG2-ru-20K-NHS")
아르곤 대기 하에 -80℃에 보관하여 두었던 mPEG2-ru-20K-NHS를 질소 퍼징 하에서 주위 온도로 가온시켰다. mPEG2-ru-20K-NHS의 스톡 용액(200mG/㎖)을 2mM HCl중에 마련한 다음, mPEG2-ru-20K-NHS를, mPEG2-ru-20K-NHS 대 rIL-2의 몰비가 100:1이 되기에 충분한 양으로 rIL-2에 첨가하였다. 혼합물 중 rIL-2의 최종 농도는 0.5mG/㎖(0.035mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1M, pH 9.0)을 상기 혼합물에 최종 농도 20mM이 될 때까지 첨가하고 나서, 30분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 접합체를 제공하였다. 이로부터 30분 경과 후, 상기 반응 혼합물에 1M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 만들어 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이후, 급랭된 반응 혼합물을 H2O로 희석하여 전도도가 0.5mS/cm(25℃) 미만이 되도록 만들었다. 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 후 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]의 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 정제 프로필이 도 4a에 제공되어 있다. [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 및 미반응 mPEG2-ru-20K-NHS를 표시하였는데, 이때 선들은 다양한 파장(예를 들어, 280㎚ 및 225㎚)에서의 흡광도에 해당한다. 역상 HPLC 분석법에 의해 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]의 순도를 분석한 결과, 정제된 접합체의 280㎚에서의 순도는 100%인 것으로 확인되었다. 도 4b를 참조한다. 정제된 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 20㎍을 대상으로 4% 내지 12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE 겔(쿠마시 블루 염색(겔은 나타내지 않음))에 의해 측정된 순도는 95% 이상이었다. 이 접합체의 겉보기 분자량은 컸는데(200kDa 초과), 이는 PEG 수화 정도가 커서 접합체가 겔을 통과할 때의 이동도가 느리다는 것으로 확인할 수 있었다.
실시예 5
분지형 mPEG-N-하이드록시숙신이미딜 유도체 40kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00052
mPEG2-ru-40K-N-하이드록실숙신이미딜 유도체, 40kDa("mPEG2-ru-40K-NHS")
아르곤 대기 하에 -80℃에 보관하여 두었던 mPEG2-ru-40K-NHS를 질소 퍼징 하에서 주위 온도로 가온시켰다. mPEG2-ru-40K-NHS의 스톡 용액(200mG/㎖)을 2mM HCl중에 마련한 다음, mPEG2-ru-40K-NHS를, mPEG2-ru-40K-NHS 대 rIL-2의 몰비가 100:1이 되기에 충분한 양으로 rIL-2에 첨가하였다. 혼합물 중 rIL-2의 최종 농도는 0.5mG/㎖(0.035mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1M, pH 9.0)을 상기 혼합물에 최종 농도가 20mM이 될 때까지 첨가하고 나서, 30분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] 접합체를 제공하였다. 이로부터 30분 경과 후, 상기 반응 혼합물에 1M 글리신(pH 4.0)을 첨가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 만들어 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이후, 급랭된 반응 혼합물을 H2O로 희석하여 전도도가 0.5mS/cm(25℃) 미만이 되도록 만들었다. 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정한 후 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
[mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]의 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 정제 프로필이 도 5에 제공되어 있다. [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] 및 미반응 PEG를 표시하였는데, 이때 선들은 280㎚에서의 흡광도에 해당한다. 역상 HPLC 분석법에 의해 [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]의 순도를 분석한 결과, 정제된 접합체의 280㎚에서의 순도는 100%인 것으로 확인되었다. 정제된 [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] 20㎍을 대상으로 4% 내지 12% NuPage Bis-Tris SDS-PAGE 겔(쿠마시 블루 염색(겔은 나타내지 않음))에 의해 측정된 순도는 95% 이상이었다. 이 접합체(예를 들어, [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2]의 3-머 형태)의 겉보기 분자량은 컸는데(200kDa 초과), 이는 PEG 수화 정도가 커서 접합체가 겔을 통과할 때의 이동도가 느리다는 것으로 확인할 수 있었다. 미반응 mPEG2-ru-40K-NHS가 처음에 컬럼을 통과하여 용출되었으며, 그 다음에는 [mPEG2-ru-40K]-[rIL-2] 접합체가 용출되었다.
실시예 6
분지형 mPEG-N-하이드록시숙신이미딜 유도체 4kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00053
mPEG2-ru-20K-N-하이드록실숙신이미딜 유도체, 4kDa("mPEG2-ru-4K-NHS")
아르곤 대기 하에 -80℃에 보관하여 두었던 mPEG2-ru-4K-NHS를 질소 퍼징 하에서 주위 온도로 가온시켰다. mPEG2-ru-4K-NHS의 스톡 용액(200mG/㎖)을 2mM HCl중에 마련한 다음, mPEG2-ru-4K-NHS를, mPEG2-ru-4K-NHS 대 rIL-2의 몰비가 100:1이 되기에 충분한 양으로 rIL-2에 첨가하였다. 혼합물 중 rIL-2의 최종 농도는 0.5mG/㎖(0.035mM)였다(0.015% SDS로 용해). 중탄산나트륨 완충액(1M, pH 9.0)을 상기 혼합물에 최종 농도가 100mM이 될 때까지 첨가하고 나서, 30분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] 접합체를 제공하였다. 이로부터 30분 경과 후, 상기 반응 혼합물에 1M 글리신(pH 4.0)을 첨가하여 최종 농도가 100mM이 되도록 만들어 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이후, 급랭된 반응 혼합물을 H2O로 희석하여 전도도가 0.5mS/cm(25℃) 미만이 되도록 만들었다. 빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 만든 후 컬럼 크로마토그래피 정제를 수행하였다.
[mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]의 통상의 양이온 교환 크로마토그래피 정제 프로필이 도 6에 제공되어 있다. 용출된 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] 접합체는 용출 분획 중 3-머, 2-머 및 1-머 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2] 접합체의 혼합물을 나타내었다. 3-머/2-머 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]의 혼합물을 함유하는 분획들과 2-머/1-머 [mPEG2-ru-4K]-[rIL-2]의 혼합물을 함유하는 분획들을 개별적으로 풀링하였다(도 6에 나타냄).
실시예 7
선형 mPEG-부티랄데히드 유도체 30kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00054
선형 mPEG-부티랄데히드 유도체, 30kDa("mPEG-부티르ALD")
반응 성분들 전부와 완충액을 첨가한 후, rIL-2의 최종 농도가 2.5㎎/㎖가 되도록 PEG화 반응을 디자인하였다. 아르곤 대기 하에 -20℃에 보관하여 두었던 mPEG-부티르ALD(30kDa)를 주위 온도로 가온시켰다. 일정량(PEG화될 rIL-2의 10몰 당량 내지 50몰 당량에 해당)의 PEG 시약을 계량하여 덜어낸 다음, 이를 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 1mM EDTA 중에 용해하여 12% 시약 용액을 형성하였다. 12% PEG 시약 용액을 스톡 rIL-2 용액의 분취액에 첨가하고 나서, 이를 15분 내지 30분 동안 교반하였다. 그 다음, 환원제인 시아노수소화붕소 나트륨(NaCNBH3)을, PEG 시약에 대하여 10몰 내지 100몰 과량으로 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 5시간 내지 18시간 동안 교반하여, 2차 아민 결합을 통한 커플링을 보장함으로써 접합체 용액을 형성하였다.
mPEG-부티르ALD의 알데히드기는, rIL-2와 결합된 1차 아민과 반응하고, 환원제, 예를 들어 시아노붕소화수소 나트륨에 의한 환원이 진행될 때 2차 아민을 통해 상기 1차 아민에 공유 결합하는 것으로 파악되었다. 어느 아민(들)이 중합체에 부착하게 되는지와 관련된 선택성은, 접합 조건 pH를 맞춤으로써 조정될 수 있었다. 비교적 낮은 pH 조건(예를 들어, pH 약 5.5)은 N-말단으로의 접합을 유도할 것이다. 비교적 중성인 pH 조건(예를 들어, pH 약 7.5 및 이보다 약간 높은 경우)에서, 공유 부착은 기타 다른 위치(즉, 단백질 내에 포함된 리신 잔기들의 아민 측쇄)에서는 더 빈번하게 이루어졌다. 접합 조건의 pH를 맞추면 위치에 따른 접합의 발생을 어느 정도 제어할 수 있어서, 원하는 위치 이성체에 도달할 수 있는 능력이 향상될 것이다.
이와 동일한 접근법을 이용하여 중량 평균 분자량이 다른 mPEG-부티르ALD 로 기타 다른 접합체를 제조하였다.
실시예 8
분지형 mPEG-부티랄데히드 유도체 40kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00055
분지형 mPEG-부티랄데히드 유도체 40kDa("mPEG2-부티르ALD")
반응 성분들 전부와 완충액을 첨가한 후, rIL-2의 최종 농도가 2.5㎎/㎖가 되도록 PEG화 반응을 디자인하였다. 아르곤 대기 하에 -20℃에 보관하여 두었던 mPEG2-부티르ALD(40kDa)를 주위 온도로 가온시켰다. 일정량(PEG화될 rIL-2의 10몰 당량 내지 50몰 당량에 해당)의 PEG 시약을 계량하여 덜어낸 다음, 이를 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 1mM EDTA 중에 용해하여 12% 시약 용액을 형성하였다. 12% PEG 시약 용액을 스톡 rIL-2 용액의 분취액에 첨가하고 나서, 이를 15분 내지 30분 동안 교반하였다. 그 다음, 환원제인 시아노수소화붕소 나트륨(NaCNBH3)을 PEG 시약에 대하여 10몰 내지 100몰 과량으로 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 5시간 내지 18시간 동안 교반하여, 2차 아민 결합을 통한 커플링을 보장함으로써 접합체 용액을 형성하였다.
mPEG2-부티르ALD의 알데히드기는, rIL-2 와 결합된 1차 아민과 반응하고, 환원제, 예를 들어 시아노수소화붕소 나트륨에 의한 환원이 진행될 때 2차 아민을 통해 상기 1차 아민에 공유 결합하는 것으로 파악되었다.
이와 동일한 접근법을 이용하여 중량 평균 분자량이 다른 mPEG2-부티르ALD 로 기타 다른 접합체를 제조하였다.
실시예 9
선형 mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 유도체 30kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
Figure pat00056
선형 mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 유도체, 30kDa("mPEG-SMB")
반응 성분들 전부와 완충액을 첨가한 후, rIL-2의 최종 농도가 2.5㎎/㎖가 되도록 PEG화 반응을 디자인하였다. 아르곤 대기 하에 -20℃에 보관하여 두었던 mPEG-SMB(30kDa)를 주위 온도로 가온시켰다. 일정량(PEG화될 rIL-2의 10몰 당량 내지 50몰 당량에 해당)의 PEG 시약을 계량하여 덜어내고, 이를 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 1mM EDTA 중에 용해하여 12% 시약 용액을 형성하였다. 12% PEG 시약 용액을 스톡 rIL-2 용액의 분취액에 첨가하고 나서, 이를 실온에서 5시간 내지 18시간 동안 교반함으로써 접합체 용액을 만들었다. 리신 용액(pH 7.5)으로 접합체 용액을 급랭시켜, 리신의 최종 몰 농도가 PEG 시약 몰 농도보다 10배 내지 100배가 되도록 만들었다.
mPEG-SMB 유도체는, 리신 및 말단 아민과 선택적으로 반응하는 입체 장해 활성 NHS 에스테르를 제공하는 것으로 파악되었다.
이와 동일한 접근법을 이용하여 중량 평균 분자량이 다른 mPEG-SMB로 기타 다른 접합체를 제조하였다.
실시예 10
mPEG-PIP 20kDa을 사용하는 rIL-2의 PEG화
중합체 시약의 기본 구조는 다음과 같이 제공되었다:
Figure pat00057
Figure pat00058
(수화된 형태)
반응 성분들 전부와 완충액을 첨가한 후, rIL-2의 최종 농도가 2.5㎎/㎖가 되도록 PEG화 반응을 디자인하였다. 아르곤 대기 하에 -20℃에 보관하여 두었던 mPEG-PIP(20kDa)를 주위 온도로 가온시켰다. 일정량(PEG화될 rIL-2의 10몰 당량 내지 50몰 당량에 해당)의 PEG 시약을 계량하여 덜어낸 다음, 이를 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 1mM EDTA 중에 용해하여 12% 시약 용액을 형성하였다. 12% PEG 시약 용액을 스톡 rIL-2 용액의 분취액에 첨가하고 나서, 이를 15분 내지 30분 동안 교반하였다. 그 다음, 환원제인 시아노수소화붕소나트륨(NaCNBH3)을, PEG 시약에 대하여 10몰 당량 내지 100몰 과량으로 첨가하고 나서, 실온에서 5시간 내지 18시간 동안 반응물을 교반하여, (2차 탄소에 대한) 2차 아민 결합을 통한 커플링을 보장하여 접합체 용액을 형성하였다. 리신 용액(pH 7.5)으로 상기 접합체 용액을 급랭시켜, 리신의 최종 몰 농도가 PEG 시약 몰 농도보다 10배 내지 100배가 되도록 만들었다.
mPEG-PIP의 케톤기는 rIL-2와 결합된 1차 아민과 반응하고, 환원제, 예를 들어 시아노수소화붕소나트륨으로 환원할 때 2차 아민을 통해 공유 결합하였음이 확인되었다.
이와 동일한 접근법을 이용하여 중량 평균 분자량이 다른 mPEG-PIP로 기타 다른 접합체를 제조하였다.
실시예 11
예시적인 (rIL-2)-PEG 접합체의 활성
CTLL-2 세포를 사용하는 세포 증식 분석법에서 알데스루킨(대조군), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 2에서 제조), [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 3에서 제조), 그리고 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2](실시예 4에서 제조)의 활성을 평가하였다.
5% CO2 대기 하에 37℃에서 CTLL-2 세포(마우스 세포 독성 T 림프구 세포주)를, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 10% 소 태아 혈청 및 10% IL-2 배양 보충물(T-STIM™; ConA(콘카나발린-A) 포함)이 보충된 완전 RPMI 1640 배지 중에 유지시켰다. 세포 밀도가 2×105세포/㎖ 내지 3×105세포/㎖에 도달할 때까지 세포를 현탁액 중에서 배양한 다음 분할(splitting)하였다.
활성 분석을 위해서, 마지막 분할 후 3일 내지 4일 경과시 세포를 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 염수 중에서 3회 세정하였다. 그 다음 세포를 보충 배지(T-STIM™ 불포함) 중에 재현탁한 다음(세포 밀도 약 2×105 세포/㎖), 96웰 백색 장벽 투명 바닥 미세 평판에 도말하였다(90㎕/웰). 항온 처리 과정 중 접합체가 유리되는 것을 최소화하기 위해 보충 배지(T-STIM™ 불포함)(pH 6.7 내지 7로 맞춤)를 사용하여 실험을 수행하였다. 그 다음, 10배 농축된 테스트 화합물 10㎕를 보충 배지(T-STIM™ 불포함) 중에 희석하여 첨가하였다. 상기 세포를 5% CO2 대기 중에서 항온 처리하였다(37℃ 및 24시간). 24시간 동안 항온 처리한 후 프로메가(Promega)의 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 시약 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 평판을 궤도 진탕기에서 2분 동안 혼합하고 나서, 이를 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 이후, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)의 탑카운트(TopCount)® 기구를 사용하여 발광도를 기록하였다(통합 시간(integration time) = 1초/웰).
[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 유리가능 접합체(실시예 2에서 제조) 및 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 유리가능 접합체(실시예 3에서 제조)에 대해서, 유리된 IL-2와 유리되지 않은 접합체 둘 다의 활성을 테스트하였다. 테스트 화합물을 산성 조건(10mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 4) 하에 보관하여 접합을 안정화하였다. 분석을 수행하기 약 1시간 전, 접합체의 활성을 테스트하기 위해 샘플을 보관 완충액으로부터 보충 배지에 희석하였다. 유리된 IL-2의 활성을 테스트하기 위해, 유리가능한 접합체{즉 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체(실시예 2에서 제조) 및 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체(실시예 3에서 제조)}를 100mM(최종 농도) 중탄산나트륨 완충액(pH 9) 중에 10배 희석하고 나서 37℃에서 8시간 동안 예비 항온 처리한 다음 분석을 개시하였다.
세포 증식에 대한 EC50 수치(최대 반응의 50%를 나타내는데 필요한 테스트 화합물의 농도)를, 투여량-반응 곡선의 비선형 회귀 분석법으로 구하였다[그래프패드 프리즘(GraphPad's Prism) 5.01 소프트웨어 사용].
세포 증식 분석법을 이용하여 알데스루킨과 접합체의 활성을 측정하고, 그 결과를 요약한 것을 표 4에 나타내었다. 모든 테스트 약품은 투여량 의존적 방식으로 CTLL-2 세포의 성장을 유도하였다. 단백질을 유리시키는 조건 하에서 유리가능한 접합체를 예비 항온 처리하였으므로, 알데스루킨도 또한 대조군으로서 예비 항온 처리하여 유리 조장 처리 조건 하에서 단백질 자체의 안정성에 대해 테스트하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 유리 조건(8시간, 37℃ 및 pH 9) 하에서 예비 항온 처리하였을 때 알데스루킨은 안정하게 유지되었으며, 권장 조건 하에 보관하여 두었던 알데스루킨에 대한 상대적 효능을 나타내었다. IL-2의 유리를 유도하는 조건 하에서 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 2에서 제조) 및 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 3에서 제조)를 예비 항온 처리한 후에는, 도 8에 나타낸 바와 같이 활성이 다시 얻어졌으며; 이러한 접합체로부터 유리된 IL-2는 대조군 알데스루킨에 대한 상대적 효능을 나타냈던 반면에, 유리가 일어나지 않은 접합체 중 일부는 알데스루킨 효능과 비교하였을 때 효능이 작았다. 안정적인 3-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 접합체들은 효능이 최소였으며(도 7), 알데스루킨 효능의 0.04%였으나, 1-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]는 분석법의 공지된 표준 편차를 보았을 때 알데스루킨 효능과 동등한 효능을 나타냈다.
알데스루킨 및 PEG-IL-2 접합체에 반응하는 CTLL-2 세포 증식 결과 요약
테스트 화합물 EC50(ng/mL) 알데스루킨에 대한 효능(%)
알데스루킨 0.111 102
알데스루킨(유리 대조군) 0.113 100
3-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리됨) 0.076 149
1-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리됨) 0.105 108
3-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리됨) 0.246 46
1-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리됨) 0.056 202
3-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리되지 않음) 0.497 23
1-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리되지 않음) 0.074 153
3-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리되지 않음) 5.163 2
1-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] (유리되지 않음) 0.143 79
3-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 194.400 0.04
1-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 0.168 67
실시예 12
예시적인 (rIL-2)-PEG 접합체의 약물 동태학
알데스루킨(대조군), [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 2에서 제조), [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2](실시예 3에서 제조) 및 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2](실시예 4에서 제조)를 마우스에 1회 주사한 후 이것들의 약물 동태학적 프로필을 ELISA에서 평가하였다.
이종 샌드위치 ELISA에 의해 알데스루킨 농도를 측정하였다. 간단히 말해서, 96-웰 미세 역가 평판을 IL-2에 대한 마우스 모노클로날 항체로 코팅하여 차단하였다. 샘플과 표준물을 깨끗한 혈장 중에 마련하고 나서, IL-2에 대한 바이오틴화 토끼 폴리클로날 항체를 함유하는 완충액을 사용하여 10% 혈장으로 희석한 다음, 분석 평판 상에서 항온 처리하였다. 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제를 첨가한 다음, 발색 기질인 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 IL-2를 검출하였다. 여기에 종결 용액을 첨가한 다음 450㎚에서 흡광도를 판독하였다(650㎚에서 백그라운드 공제). 가중 4-매개 변수 알고리즘으로 표준 곡선을 그리고 나서, 표준 곡선에 대해 내삽하여 샘플 농도를 측정하였다. 양의 하한치는 0.05ng/㎖였다.
풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]의 농도를 균질 HTRF® 분석법(메사츄세츠주 베드포드 소재, 시스비오 US(Cisbio US))으로 측정하였다. 반응 혼합물(15㎕; 크롬산 유로퓸이 접합된, IL-2에 대한 마우스 모노클로날 항체, 스트렙타비딘-d2 및 PEG에 대한 바이오틴화 토끼 모노클로날 항체)을 백색의 저용량 384-웰 미세 역가 평판에 가하였다. 깨끗한 혈장 중에 희석된 샘플 및 표준(5㎕)을 상기 평판에 첨가한 후, 이 평판을 항온 처리하였다. 상기 평판을 형광도 판독기 상에서 판독하고(615㎚ 및 665㎚), 델타 F를 산정하였다. 가중 5-매개 변수 알고리즘으로 표준 곡선을 그리고 나서, 표준 곡선에 대해 내삽하여 샘플 농도를 측정하였다. 양의 하한치는 0.5ng/㎖였다.
총 IL-2 분석법에서 3-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 및 3-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]를 측정하였다. [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2] 및 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 접합체는 유리가능한 접합체여서, 분자의 상이한 종은 샘플 중에 존재하여 개별적으로 정량하는 것은 어려운 일이었으므로; IL-2의 총 수준을 측정하였다. 깨끗한 혈장 중에 제조된 샘플과 표준 스톡(1:1)을 유리 완충액(100mM HEPES / 100mM Tris-HCl, pH 9)으로 희석하고, 이를 37℃에서 30시간 내지 36시간 동안 항온 처리하여, 접합체의 중합체 함유 성분을 그 접합체로부터 유리시켰다. 항온 처리한 다음, 여기에 0.1M 아세트산 25용적%를 첨가함으로써 높은 pH를 중화하였다. 유리된 IL-2를 전술한 ELISA에 의해 측정하였다.
도 9는 테스트 약품을 1회 근육 내 주사하였을 때(1㎎/㎏), C57BL/6 마우스 내 상기 약품의 농도-시간 그래프를 나타낸다. 10분, 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 168시간 및 336시간 경과시 소듐 헤파린 처리 혈장 샘플을 수집하였다. 각 시점마다 3마리의 마우스를 대상으로 기하 평균 농도를 산정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 알데스루킨의 반감기는 짧았으며, 6시간 경과후(0.05 ng/㎖ 미만)에는 활성이 관찰되지 않았고, 접합체의 반감기는 증가하였으며, 336시간 경과시에도 활성이 관찰되었다.
실시예 13
폐 전이성 흑색종에 대한 효능 연구
IL-2 활성이 알려진 화합물의 효능을 평가하는 데에는 전이성 흑색종 폐 모델이 널리 사용되는데, 이 모델을 C57BL/6 마우스 내에서 발달시켰다. 상기 모델에서 처음에는 마우스에 B16F10 흑색종 세포를 정맥 내 주입하였는데, 이로써 상이한 수와 크기를 가지는 폐 소결절을 발달시켰다. 폐 소결절의 수와 병변의 총 표면적은 이식된 세포 농도에 따라서 다양하였다. 그 다음, 관심의 테스트 화합물을 마우스 처리군에 투여하였고, 또 다른 마우스 군은 이 화합물을 처리하지 않은 채 남겨두었다(대조군으로 사용). 테스트 화합물의 효능은, 폐 소결절의 수와 크기 그리고 처리군과 미처리군 간 각각의 폐에 대한 병변의 총 면적의 감소%로서 측정될 수 있었다.
본 연구에 있어서, 100,000개의 B16F10 세포(계대 배양 횟수는 8회를 초과하지 않음)를 꼬리의 정맥에 주사하여 이식하였다. 세포 이식일로부터 3일 경과시 관심의 테스트 화합물(또는 비히클)을 IP(복막 내) 또는 IV(정맥 내) 투여 경로를 통해 표 5에 제시된 바와 같이 투여하였다.
실시예 13에 대한 그룹 할당
그룹 번호 테스트 약품 B16F10 세포 투여 경로 동물 번호 용량
A 알데스루킨
(프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션)		 100,000 IP 1 - 12 b.i.d ×5
B 실시예 1의 IL-2 부분 100,000 IP 1 - 12 b.i.d ×5
C 비히클 100,000 IP 1 - 12 b.i.d ×5
D NKT-11135-A-001 100,000 IV 1 - 12 q2d×3
E 풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2] 100,000 IV 1 - 12 q2d×3
F 풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 100,000 IV 1 - 12 q2d×3
G 　풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 100,000 IV 1 - 12 q2d×3
각주: “b.i.d ×5”는 5일 동안 매일 2회를 의미하고;
“q2d×3”은 3회 투여시 이틀마다 한번을 의미함
세포 이식 후 14일 경과시 마우스를 안락사시켜 폐를 분리해낸 후, 이를 포름알데히드를 함유하는 보웬(Bowen) 용액 중에 고정시켰다(1일 또는 2일). (보웬 용액 중에 고정된) 폐를 입체 현미경으로 관찰한 후, 각각의 폐에 대하여 병변의 수와 크기를 측정하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 세포를 이식한지 14일 경과시에 마우스를 안락사시켜 분리해 낸 폐를 보웬 용액 중에 고정하였다. 종양 소결절과 이의 크기를 각각의 알데스루킨(캘리포니아주 샌디에고 소재, 프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션), 실시예 1의 IL-2 부분, 풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2], 풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2] 그리고 풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]에 대해 계수하였다.
실시예 14
피하 B16F10 흑색종에 대한 효능 연구
IL-2 활성이 알려진 화합물의 효능을 평가하기 위하여 매우 강건한 피하 흑색종 모델(동계 마우스, 즉 C57BL/6 마우스 내)을 사용하였다. 요약하면, 100만개의 B16F10 세포를 5주령 내지 6주령 C57BL/6 마우스 각각에 피하 이식하였다(등 중앙 부위). 종양이 손으로 만져질 정도의 크기(즉, 70cu ㎜ 내지 120cu ㎜)로 성장하였을 때, 그룹을 무작위화하여 할당하였다(표 6에 나타냄). 마우스에 테스트 화합물, 즉 알데스루킨(캘리포니아주 샌디에고 소재, 프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션), rIL-2 중합체 접합체 또는 비히클을 상이한 투약 농도로 상이한 투약 계획에 따라서 투여하였다. 하루 걸러서 체중과 종양 용적을 측정하였다. 본 연구를 마치는 시점은, 주어진 그룹에 대해 중앙 종양 부피가 1500cu ㎝가 되거나 45일이 경과하기 이전의 시간이었다.
실시예 14에 대한 그룹 할당
테스트 화합물 종속 그룹
(n=9)		 투약 농도
(mg/kg)		 투여 경로 투약 계획
풀링된 3-머/4-머
[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]		 A1 2 IV q1d
A2 4
풀링된 1-머/2-머
[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]		 E1 6 IV q1d
E2 8
알데스루킨
(프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션)		 C 3 IP b.i.dx5
H (n=6)
풀링된 3-머/4-머
[mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]		 B1 2 IV q1d
B2 4
풀링된 1-머/2-머
[mPEG2-ru-20K]-[rIL-2]		 F1 6 IV q1d
F2 9
풀링된 1-머/2-머
[mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2]		 G1 2 IV q1d
G2 4
비히클: 10mM 아세트산 나트륨;
150mM NaCl, pH 4.5;
2 % 수크로스		 D 체중 1kg당 IV q1d
I
알데스루킨(프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션) 및 rIL-2-중합체 접합체를 상이한 투여 계획에 따라서 투여하였을 때 종양 성장 억제에 대한 투약량-반응 곡선이 도 11a 및 도 11b에 제공되어 있다. 이에 따른 결과는, 테스트 대상인 rIL-2-중합체 접합체가 1회 투여시에, 알데스루킨(프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션) 투여(5일 동안 1일 2회 3㎎/㎏씩 투여)시보다 효능이 더 좋았음을 보여주었다.
도 11a는 rIL-2-중합체 접합체를 1회 투여한 후 시간 대 종양 진행 정도(종양의 중앙 부피가 1500㎣에 이르게 될 때까지)를 나타낸다. 종양 진행 곡선으로부터 종양 성장 지연(tumor growth delay; TGD)이 관찰되었다(풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2](투약 농도는 2㎎/㎏ 및 4㎎/㎏)에 대해 각각 4.6일 및 6.2일). 풀링된 3-머/4-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2]에 있어서, TGD는 각각 6.4일 및 7.6일인 것으로 관찰되었다(투약 농도는 2㎎/㎏ 및 4㎎/㎏).
도 11b는 rIL-2-중합체 접합체를 1회 투여한 후 시간 대 종양 진행 정도(종양의 중앙 부피가 1500㎣에 이르게 될 때까지)를 나타낸다. 종양 진행 곡선으로부터 TGD가 관찰되었다(풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-2](투약 농도 = 6㎎/㎏ 및 8㎎/㎏)에 대해 각각 3.6일 및 4.6일). 풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-C2-ru-20K]-[rIL-2]에 있어서, 투약 농도 2㎎/㎏일 때에는 TGD가 관찰되었고(3.8일), 투여 농도 4㎎/㎏일 때에는 자연에서 독성을 나타내는 것이 파악되었다. 종양 진행 곡선으로부터 TGD가 관찰되었다(풀링된 1-머/2-머 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-2](투여 농도 = 2㎎/㎏ 및 4㎎/㎏) 각각에 대해 2.2일 및 3.6일).
요약하면, 폐 병변 전이 모델(실시예 13) 및 피하 마우스 흑색종 모델(실시예 14) 둘 다에서 rIL-2 중합체 접합체가 효능을 나타내었는데, 이때 알데스루킨(프로메테우스 래보레토리즈 인코포레이션)의 경우와 비교하였을 때 상기 rIL-2 중합체 접합체의 투여 횟수와 전체 단백질 양은 상당히 적었다.
SEQUENCE LISTING <110> NEKTAR THERAPEUTICS <120> CONJUGATES OF AN IL-2 MOIETY AND A POLYMER <130> SHE0326.PCT <140> PCT/US2011/060408 <141> 2011-11-11 <150> 61/413,236 <151> 2010-11-12 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> mat_peptide <222> (21)..(153) <400> 1 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu -20 -15 -10 -5 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu -1 1 5 10 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 15 20 25 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 30 35 40 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 45 50 55 60 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 65 70 75 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 80 85 90 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 95 100 105 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 110 115 120 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 125 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 120 125 Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Arg Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4)..(402) <400> 5 cat atg ccg acc agc agc agc acc aaa aaa acc cag ctg cag ctg gaa 48 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 cat ctg ctg ctg gat ctg cag atg atc ctg aac ggt atc aac aac tac 96 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 aaa aac ccg aaa ctg acc cgt atg ctg acc ttc aaa ttc tac atg ccg 144 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 aaa aaa gca acc gaa ctg aaa cat ctg cag tgc ctg gaa gaa gaa ctg 192 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 aaa ccg ctg gaa gaa gtg ctg aac ctg gca cag agc aaa aac ttc cat 240 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 ctg cgt ccg cgt gat ctg atc agc aac atc aac gtg atc gtg ctg gaa 288 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 80 85 90 95 ctg aaa ggt agc gaa acc acc ttc atg tgc gaa tac gca gat gaa acc 336 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 gca acc atc gtg gaa ttt ctg aac cgt tgg atc acc ttc agc cag agc 384 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser 115 120 125 atc atc agc acc ctg acc taagaattc 411 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (25)

  1. 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-2 부분의 잔기를 포함하는 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-2 부분은 유리가능한 결합을 통하여 공유적으로 부착되어 있는 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-2 부분은 안정적인 결합을 통하여 공유적으로 부착되어 있는 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수용성 중합체는 분지형 수용성 중합체인 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 및 폴리(아크릴로일모르폴린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥사이드)인 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 폴리(알킬렌 옥사이드)는 폴리(에틸렌 글리콜)인 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케녹시, 치환된 알케녹시, 알키녹시, 치환된 알키녹시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 캡핑 부분으로 말단이 캡핑된 접합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수용성 중합체는 중량 평균 분자량이 약 500달톤 내지 약 100,000달톤인 접합체.
  10. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 접합체는 IL-2 부분의 잔기의 아민기에서 공유적으로 부착되는 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 수용성 중합체가 IL-2 부분의 잔기에 부착되어 있는 접합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개, 2개 또는 3개의 수용성 중합체가 IL-2 부분의 잔기에 부착되어 있는 접합체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개 또는 수용성 중합체가 IL-2 부분의 잔기에 부착되어 있는 접합체.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개의 수용성 중합체가 IL-2 부분의 잔기에 부착되어 있는 접합체.
  15. 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-2 부분의 잔기를 포함하는 접합체로서, 상기 수용성 중합체는 공유적으로 부착되기 전 N-하이드록시숙신이미딜기를 보유하는 중합체 시약인 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 의한 접합체와 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제16항에 의한 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 접합 조건 하에서 IL-2 부분과 중합체 시약을 접촉시키는 단계를 포함하는, 접합체를 제조하는 방법.
  19. IL-2 부분을 암호화하는 분리된 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 서열 번호 5에 제시된 서열과의 서열 동일성이 95% 이상인 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 핵산 분자는 DNA인 핵산 분자.
  21. 제19항에 의한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 발현 벡터는 플라스미드인 발현 벡터.
  23. 제22항에 의한 벡터를 포함하는 시험관 내 숙주 세포.
  24. 단백질을, 공극 크기가 단백질 크기보다 작은 투석 백에 넣어 단백질 포함 투석 백을 형성하는 단계 및 이 단백질 포함 투석 백을 단백질 변성제 불포함 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  25. IL-2 부분, 5mM 내지 15mM 아세트산 나트륨 및 2% 내지 7% 트레할로스를 포함하는 조성물.
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SM (1) SMT202100314T1 (ko)
WO (1) WO2012065086A1 (ko)

Families Citing this family (175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230148396A (ko) * 2010-11-12 2023-10-24 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
BR102013017626A2 (pt) * 2013-06-14 2015-02-10 Univ Rio De Janeiro Bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, uso de bioconjugados não aglomerantes de amilinomiméticos com polietilenoglicol, composições farmacêuticas de baixa toxicidade, adjuvante para a prevenção ou tratamento das doenças, medicamento, método de tratamento ou prevenção de doenças.
WO2015021432A1 (en) 2013-08-08 2015-02-12 The Scripps Research Institute A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
RS61661B1 (sr) * 2014-02-21 2021-04-29 Nektar Therapeutics India Pvt Ltd Il-2rbeta-selektivni agonisti u kombinaciji sa anti-ctla-4 antitelom ili anti-pd-1 antitelom
MA39711A (fr) * 2014-04-03 2015-10-08 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-15 et d'un polymère
ES2891738T3 (es) 2014-04-09 2022-01-31 Scripps Research Inst Incorporación de nucleósidos trifosfato no naturales o modificados a células a través de transportadores de ácido nucleico trifosfato
WO2015157636A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced expansion of tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy
ES2717831T3 (es) 2014-08-11 2019-06-25 Delinia Inc Variantes de IL-2 modificadas que activan selectivamente las células T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
IL254389B2 (en) * 2015-03-11 2023-03-01 Nektar Therapeutics Polymer conjugates and the il–7 group
MA47290A (fr) 2015-10-08 2019-11-27 Nektar Therapeutics Combinaison d'un agoniste sélectif de l'il-2rbeta et d'un agoniste de l'il-15 à action prolongée
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
ES2929047T3 (es) 2016-06-24 2022-11-24 Scripps Research Inst Transportador de nucleósido trifosfato novedoso y usos del mismo
US11141434B2 (en) 2016-07-07 2021-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Programmed death 1 ligand 1 (PD-L1) binding proteins and methods of use thereof
BR112019005944A2 (pt) 2016-09-28 2019-06-11 Musc Foudation For Res Development anticorpos que se ligam à interleucina 2 e usos dos mesmos
MD3532607T2 (ro) 2016-10-26 2024-07-31 Iovance Biotherapeutics Inc Restimularea limfocitelor infiltrante în tumori crioconservate
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
KR20190083656A (ko) 2016-11-08 2019-07-12 데리니아, 인크. 자가면역 질환의 치료를 위한 il-2 변이체
CN109890406A (zh) * 2016-11-10 2019-06-14 尼克塔治疗公司 肿瘤免疫治疗性治疗方法
BR112019009925A2 (pt) 2016-11-17 2019-10-08 Iovance Biotherapeutics Inc método para preparar linfócitos infiltrantes de tumor remanescente para terapia de células t adotivas, e, método de tratamento de um câncer .
MA47236A (fr) 2017-01-06 2019-11-13 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de lymphocytes infiltrant les tumeurs (til) avec des agonistes de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (tnfrsf) et des combinaisons thérapeutiques de til et d'agonistes de tnfrsf
JP2020503351A (ja) 2017-01-06 2020-01-30 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド カリウムチャネルアゴニストによる腫瘍浸潤リンパ球の増殖及びその治療的使用
WO2018132496A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Nektar Therapeutics Multi-arm polymer conjugates of tlr agonist compounds and related immunotherapeutic treatment methods
KR20190121773A (ko) * 2017-03-01 2019-10-28 넥타르 테라퓨틱스 입양 세포 이식 요법과 조합된 인터루킨-2 수용체 알파, 베타 선택성 효현제를 이용한 면역 요법적 종양 치료 방법
JP7165717B2 (ja) 2017-03-15 2022-11-04 パンディオン・オペレーションズ・インコーポレイテッド 標的免疫寛容
JOP20190224A1 (ar) 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي
US11254913B1 (en) 2017-03-29 2022-02-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
CN110582300B (zh) 2017-05-02 2024-08-02 尼克塔治疗公司 肿瘤免疫治疗性治疗方法
CR20190557A (es) 2017-05-10 2020-03-27 Iovance Biotherapeutics Inc Expansión de linfocitos infiltrantes de tumor a partir de tumores líquidos y usos terapéuticos de los mismos
US12036283B2 (en) 2017-05-15 2024-07-16 Nektar Therapeutics Long-acting interleukin-15 receptor agonists and related immunotherapeutic compositions and methods
US10676516B2 (en) 2017-05-24 2020-06-09 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
AR112072A1 (es) 2017-06-05 2019-09-18 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos de uso de linfocitos infiltrantes de tumor en melanoma doble refractario
AR112756A1 (es) 2017-07-11 2019-12-11 Synthorx Inc Incorporación de nucleótidos no naturales, y su método
AR112969A1 (es) 2017-08-03 2020-01-15 Synthorx Inc Conjugados de citoquina para el tratamiento de enfermedades proliferativas e infecciosas
AU2018316694A1 (en) 2017-08-17 2020-02-13 Nektar Therapeutics Immunotherapeutic tumor treatment method
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
KR20200084880A (ko) 2017-11-06 2020-07-13 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
JP7404252B2 (ja) * 2017-11-08 2023-12-25 ヤフェイ シャンハイ バイオロジー メディスン サイエンス アンド テクノロジー カンパニー リミテッド 生体分子のコンジュゲートおよびその使用
CN111601883B (zh) 2017-11-17 2024-06-21 艾欧凡斯生物治疗公司 由细针抽吸物和小活检物扩增til
MX2020005041A (es) * 2017-11-21 2020-10-12 Univ Leland Stanford Junior Agonistas parciales de interleucina-2.
CA3083118A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
CA3085765A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for determining the beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof and beneficial administration of tumor infiltrating lymphocytes, and methods of use thereof
AU2018394189B2 (en) * 2017-12-27 2023-12-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. IL-2 variant
CN112105627B (zh) 2017-12-29 2024-07-02 斯克利普斯研究所 非天然碱基对组合物及使用方法
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
SG11202006541UA (en) 2018-01-08 2020-08-28 Iovance Biotherapeutics Inc Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019160829A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
US11534479B2 (en) 2018-02-16 2022-12-27 Iltoo Pharma Use of interleukin 2 for treating Sjögren's syndrome
JP7515412B2 (ja) 2018-03-09 2024-07-12 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規のサイトカインプロドラッグ
CN111886256B (zh) 2018-03-23 2025-01-10 百时美施贵宝公司 抗mica和/或micb抗体及其用途
BR112020019639A2 (pt) * 2018-03-28 2021-01-05 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Conjugados de il-2
CN112513254A (zh) 2018-03-29 2021-03-16 艾欧凡斯生物治疗公司 肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其在免疫治疗中的用途
TWI831776B (zh) 2018-04-27 2024-02-11 美商艾歐凡斯生物治療公司 腫瘤浸潤性淋巴細胞之基因編輯和彼於免疫治療之用途
WO2019217753A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
EP3794023A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
ES2955511T3 (es) 2018-05-14 2023-12-04 Werewolf Therapeutics Inc Polipéptidos de interleucina 2 activables y métodos de uso de los mismos
KR102706554B1 (ko) * 2018-05-21 2024-09-12 넥타르 테라퓨틱스 선택적 TREG 자극제 RUR20kD-IL-2 및 관련 조성물
WO2020007937A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Iltoo Pharma Use of interleukin-2 for treating systemic sclerosis
BR112021002250A2 (pt) 2018-08-06 2021-07-20 Medikine, Inc. compostos de ligação ao receptor de il-2
EP3836954A1 (en) 2018-08-13 2021-06-23 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
KR20210057124A (ko) * 2018-09-11 2021-05-20 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 용도
US20220322655A1 (en) 2018-09-20 2022-10-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of TILs from Cryopreserved Tumor Samples
CR20210295A (es) 2018-11-05 2021-07-09 Iovance Biotherapeutics Inc Procesos para la producción de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de estos en inmunoterapia
WO2020095183A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Pfizer Inc. Combination for treating cancer
EP3877511A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
BR112021008266A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor em uma população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um sujeito com câncer, e, população terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor
EP3876940A1 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Pfizer Inc. Combinations for treating cancer
CN112969469A (zh) 2018-11-05 2021-06-15 艾欧凡斯生物治疗公司 抗pd-1抗体难治性nsclc患者的治疗
BR112021009111A2 (pt) 2018-11-16 2021-08-24 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos anti-nkg2a e usos dos mesmos
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
JP2022519271A (ja) * 2019-02-06 2022-03-22 シンソークス， インコーポレイテッド Ｉｌ－２コンジュゲートおよびその使用方法
JP2022522473A (ja) 2019-03-01 2022-04-19 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 液性腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球の拡大培養及びその治療的使用
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
KR20220023988A (ko) 2019-05-14 2022-03-03 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 분리 모이어티 및 이의 사용 방법
WO2020236875A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Pandion Therapeutics, Inc. Madcam targeted immunotolerance
KR20220012296A (ko) 2019-05-20 2022-02-03 싸이튠 파마 암 또는 감염성 질환 치료를 위한 IL-2/IL-15Rβγ 작용제 투여 요법
WO2020247598A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Emory University Photolysis to unlock caged protein therapeutics
CA3141626A1 (en) 2019-06-12 2020-12-17 AskGene Pharma, Inc. Novel il-15 prodrugs and methods of use thereof
TW202113078A (zh) 2019-06-14 2021-04-01 美商史基普研究協會 於半合成生物體中複製、轉錄及轉譯之試劑及方法
GB201911066D0 (en) 2019-08-02 2019-09-18 Achilles Therapeutics Ltd T cell therapy
CN114401997A (zh) 2019-09-28 2022-04-26 奥美药业有限公司 细胞因子前药和双前药
EP4048295A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
KR20220110207A (ko) 2019-11-05 2022-08-05 메디카인 인코포레이티드 IL-2RβγC 결합 화합물
US11248030B2 (en) 2019-11-05 2022-02-15 Medikine, Inc. Dual IL-2R and IL-7R binding compounds
EP4058471A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
JP2023506734A (ja) 2019-12-11 2023-02-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法
JP2023507432A (ja) 2019-12-20 2023-02-22 インスティル バイオ （ユーケイ） リミテッド 腫瘍浸潤リンパ球を単離するためのデバイスおよび方法ならびにそれらの使用
WO2021140416A2 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Bright Peak Therapeutics Ag Modified il-2 polypeptides and uses thereof
MX2022008772A (es) 2020-01-14 2022-10-07 Synthekine Inc Ortologos de il2 y metodos de uso.
KR102653906B1 (ko) 2020-01-14 2024-04-03 신테카인, 인크. 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물
CN113121670B (zh) 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
CN113121671A (zh) * 2020-01-15 2021-07-16 天津键凯科技有限公司 一种制备结合位点可控的peg化生物分子的方法
JP2023514128A (ja) 2020-02-03 2023-04-05 メディカイン、インコーポレイテッド ＩＬ－７Ｒαγｃ結合化合物
TW202417475A (zh) 2020-02-03 2024-05-01 美商麥地金公司 IL-7Rα結合化合物
WO2021168079A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector
TWI839476B (zh) * 2020-02-26 2024-04-21 大陸商北京泰德製藥股份有限公司 介白素-2多肽共軛物及其用途
WO2021202923A1 (en) 2020-04-02 2021-10-07 Nektar Therapeutics Immunomodulator for the prevention and treatment of coronovirus infection and other conditions
PE20231648A1 (es) * 2020-04-22 2023-10-17 Merck Sharp And Dohme Llc CONJUGADOS DE INTERLEUCINA 2 HUMANA SESGADOS AL DIMERO DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA 2 byc Y CONJUGADOS CON UN POLIMERO HIDROSOLUBLE NO PEPTIDICO
KR20230037069A (ko) 2020-04-22 2023-03-15 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 환자-특이적 면역요법을 위해 세포의 제조를 조정하기 위한 시스템 및 방법
CN115461062A (zh) 2020-04-28 2022-12-09 阿基里斯治疗英国有限公司 T细胞疗法
CN111499746B (zh) * 2020-04-28 2020-11-24 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用
US20230293685A1 (en) 2020-05-04 2023-09-21 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
JP2023523855A (ja) 2020-05-04 2023-06-07 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用
EP4161956A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Il-2 sequences and uses thereof
US20230372397A1 (en) 2020-10-06 2023-11-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
JP2023550880A (ja) 2020-10-26 2023-12-06 サイチューン ファーマ 非黒色腫皮膚癌を治療するためのＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト
KR20230096049A (ko) 2020-10-26 2023-06-29 싸이튠 파마 편평 세포 암종 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제
WO2022125941A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
JP2024500403A (ja) 2020-12-17 2024-01-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
US20240299539A1 (en) 2020-12-17 2024-09-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262828A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
WO2022130017A2 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
WO2022130015A2 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Instil Bio (Uk) Limited Processing of tumor infiltrating lymphocytes
PE20240820A1 (es) 2020-12-28 2024-04-18 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de los mismos
US20220233689A1 (en) 2020-12-28 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
JP2024501845A (ja) 2020-12-31 2024-01-16 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
WO2022170219A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Adjuvant therapy for cancer
CA3210755A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Kenneth ONIMUS Tumor storage and cell culture compositions
CA3212439A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Michelle SIMPSON-ABELSON Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
TW202305118A (zh) 2021-03-23 2023-02-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 腫瘤浸潤淋巴球之ｃｉｓｈ基因編輯及其在免疫療法中之用途
AU2022246174A1 (en) 2021-03-25 2023-09-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
JP2024515189A (ja) 2021-04-19 2024-04-05 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞免疫療法におけるキメラ共刺激受容体、ケモカイン受容体、及びそれらの使用
EP4340850A1 (en) 2021-05-17 2024-03-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JP2024524185A (ja) 2021-06-22 2024-07-05 アキレス セラピューティクス ユーケー リミテッド 抗原特異的ｔ細胞を生成するための方法
AU2022306145A1 (en) 2021-07-09 2024-02-01 Bright Peak Therapeutics Ag Antibody conjugates and manufacture thereof
CA3222358A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Vijaya Raghavan PATTABIRAMAN Checkpoint inhibitors conjugated to il-2, and uses thereof
WO2023281480A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Conjugates of checkpoint inhibitors with il-2, and uses thereof
US20230201365A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Modified cd20 antibodies and uses thereof
WO2023004074A2 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
KR20240043797A (ko) 2021-08-13 2024-04-03 싸이튠 파마 암 치료용 IL-2/IL-15Rβγ 작용제와 항체-약물 접합체 조합
KR20240109615A (ko) 2021-09-09 2024-07-11 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. Pd-1 talen 녹다운을 사용한 til 생성물의 생성 방법
CA3232700A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Rafael CUBAS Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
TW202331735A (zh) 2021-10-27 2023-08-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 協調用於患者特異性免疫療法之細胞之製造的系統及方法
JP2024544867A (ja) 2021-11-10 2024-12-05 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｄ８腫瘍浸潤リンパ球を利用する拡張治療の方法
WO2023114833A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Eli Lilly And Company Dosing regimens for selective treg stimulator rur20kd-il-2 and related compositions
EP4463135A2 (en) 2022-01-10 2024-11-20 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
EP4469065A1 (en) 2022-01-28 2024-12-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
EP4469066A1 (en) 2022-01-28 2024-12-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023150562A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Alaunos Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of t cells
CN118302435A (zh) * 2022-02-18 2024-07-05 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种实现生物活性分子其活性控释和缓释的方法及药物应用
US20240132563A1 (en) 2022-02-23 2024-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US11999771B2 (en) 2022-04-07 2024-06-04 Medikine, Inc. IL-7Rαγc ligand immunoglobulin fusion proteins
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
KR20250003614A (ko) 2022-04-22 2025-01-07 니치유 가부시키가이샤 아세탈형 방출 가능 폴리옥시에틸렌 유도체, 그 제조 방법 및 아세탈형 방출 가능 폴리옥시에틸렌 결합체
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
AU2023281061A1 (en) 2022-06-02 2024-12-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024055017A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products using pd-1/tigit talen double knockdown
TW202426633A (zh) 2022-09-09 2024-07-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 使用ｐｄ－１／ｔｉｇｉｔ ｔａｌｅｎ雙重基因減弱生成ｔｉｌ產物之方法
WO2024056154A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Interleukin-2 for use in treating autism spectrum disorder
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
WO2024119193A2 (en) 2022-12-02 2024-06-06 AskGene Pharma, Inc. Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs
US20240376170A1 (en) 2023-01-11 2024-11-14 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use
WO2024150174A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024151885A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Use of til as maintenance therapy for nsclc patients who achieved pr/cr after prior therapy
WO2024215989A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS
GB202307096D0 (en) 2023-05-12 2023-06-28 Achilles Therapeutics Uk Ltd Method
WO2025015318A2 (en) 2023-07-13 2025-01-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine encoding lentiviral vectors and uses thereof for making tumor infiltrating lymphocytes
WO2025019790A1 (en) 2023-07-19 2025-01-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060123472A (ko) * 2003-12-10 2006-12-01 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 2개의 상이한 군의 중합체-활성제 포합체를 포함하는조성물

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4401756A (en) 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
JPS60502136A (ja) * 1983-08-10 1985-12-12 アムジエン　インコーポレイテツド 微生物によるインタ−ル−キン２の形質発現
JPS60115528A (ja) * 1983-11-28 1985-06-22 Takeda Chem Ind Ltd ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物
US4569790A (en) 1984-03-28 1986-02-11 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4705848A (en) 1986-06-02 1987-11-10 International Minerals & Chemical Corp. Isolation of bioactive, monomeric growth hormone
US5078997A (en) 1988-07-13 1992-01-07 Cetus Corporation Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5153310A (en) 1989-02-28 1992-10-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Il-2 analogs containing n-linked glycosylation sites
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
IE912365A1 (en) 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5635597A (en) 1994-05-27 1997-06-03 Affymax Technologies, N.V. Peptides that bind IL-2 receptors
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6034072A (en) 1997-02-10 2000-03-07 Genemedicine, Inc. IL-2 gene expression and delivery systems and uses
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
EP1061954B1 (en) 1998-03-12 2004-06-09 Nektar Therapeutics Al, Corporation Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6168785B1 (en) 1998-07-16 2001-01-02 Institut Pasteur Biological applications of new peptides of IL-2 and derivatives and use as therapeutic agents
AU2001238595A1 (en) 2000-02-22 2001-09-03 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
US6689353B1 (en) 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
ES2382636T3 (es) 2000-10-31 2012-06-12 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Método para producir composiciones para la administración mejorada de moléculas bioactivas
FR2826365B1 (fr) 2001-06-20 2003-09-26 Oreal Compositions cosmetiques photoprotectrices contenant des derives amides, sulfonamides ou carbamates aromatiques d'acrylonitrile et nouveaux derives amides, sulfonamides ou carbamates d'acrylonitrile
JP4764630B2 (ja) * 2002-09-09 2011-09-07 ネクター セラピューティックス 水溶性ポリマーアルカナール
KR101162908B1 (ko) * 2002-12-26 2012-07-06 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체
CN1859925A (zh) * 2002-12-26 2006-11-08 山景医药公司 具有保留的受体结合活性的细胞因子、趋化因子、生长因子、多肽激素及其拮抗剂的聚合物缀合物
DE602004029646D1 (en) 2003-01-06 2010-12-02 Nektar Therapeutics San Carlos Thiolselektive wasserlösliche polymerderivate
DK1620118T3 (da) * 2003-04-08 2014-09-29 Yeda Res & Dev Reversible pegylerede lægemidler
DK2644206T3 (da) * 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
US7569215B2 (en) 2003-07-18 2009-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
PT1688146E (pt) * 2005-02-07 2007-10-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Preparação de aldesleucina para a utilização farmacêutica
AU2006255415B2 (en) * 2005-06-07 2011-10-06 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting TNFalpha
BRPI0611872B8 (pt) * 2005-06-16 2021-05-25 Nektar Therapeutics reagente polimérico, conjugado, método para preparação de um conjugado e composição farmacêutica
JP2009503111A (ja) * 2005-08-04 2009-01-29 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
NZ595303A (en) * 2005-12-14 2013-03-28 Ambrx Inc Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP2364735A3 (en) 2005-12-16 2012-04-11 Nektar Therapeutics Branched PEG conjugates of GLP-1
CA2648582C (en) 2006-04-07 2016-12-06 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
CN101104077A (zh) 2006-07-12 2008-01-16 北京紫辰医药生物技术研究所 重组人白介素-2与聚乙二醇的偶合物
AU2007340382B2 (en) 2006-12-27 2013-06-27 Nektar Therapeutics Von Willebrand Factor- and Factor VIII-polymer conjugates having a releasable linkage
US7943141B2 (en) 2007-02-28 2011-05-17 Serina Therapeutics, Inc. Activated polyoxazolines and compositions comprising the same
US7567215B1 (en) 2007-10-23 2009-07-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Portable and inflatable antenna device
KR20090103209A (ko) * 2008-03-27 2009-10-01 (주)한국비엠아이 사람 인터루킨-2 동종체
WO2009139905A2 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Nektar Therapeutics Conjugates of a cholinesterase moiety and a polymer
WO2010014258A2 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates having a releasable linkage
EP2341942A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-13 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
KR20230148396A (ko) 2010-11-12 2023-10-24 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060123472A (ko) * 2003-12-10 2006-12-01 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 2개의 상이한 군의 중합체-활성제 포합체를 포함하는조성물

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024227552A1 (en) 2024-11-28
ES2866674T3 (es) 2021-10-19
JP2018154644A (ja) 2018-10-04
EP2637694A1 (en) 2013-09-18
US20180085468A1 (en) 2018-03-29
KR102472497B1 (ko) 2022-11-29
EP2637694A4 (en) 2016-10-19
PT2637694T (pt) 2021-05-05
EP2637694B1 (en) 2021-04-07
MX358399B (es) 2018-08-16
RS61854B1 (sr) 2021-06-30
CN103517718A (zh) 2014-01-15
CA2816722A1 (en) 2012-05-18
US20140328791A1 (en) 2014-11-06
IL295201A (en) 2022-10-01
AU2011325990A1 (en) 2013-05-23
EA037083B1 (ru) 2021-02-03
KR20230148396A (ko) 2023-10-24
US9861705B2 (en) 2018-01-09
KR20130116888A (ko) 2013-10-24
EP3895735A1 (en) 2021-10-20
PL2637694T3 (pl) 2021-10-18
CN110812488A (zh) 2020-02-21
AU2018253463A1 (en) 2018-11-15
US10960079B2 (en) 2021-03-30
HUE054318T2 (hu) 2021-08-30
AU2011325990C1 (en) 2017-06-08
AU2020202673A1 (en) 2020-05-14
EA202092025A1 (ru) 2021-05-31
JP2014506116A (ja) 2014-03-13
JP2022000043A (ja) 2022-01-04
US20210023230A1 (en) 2021-01-28
KR20220008387A (ko) 2022-01-20
SMT202100314T1 (it) 2021-07-12
SI2637694T1 (sl) 2021-06-30
IL226267B (en) 2022-09-01
EA201390697A1 (ru) 2013-08-30
US20210340210A1 (en) 2021-11-04
MX2013005363A (es) 2013-11-04
AU2022268401A1 (en) 2023-01-05
JP2024001309A (ja) 2024-01-09
KR20200070407A (ko) 2020-06-17
JP2020097626A (ja) 2020-06-25
CA3144697A1 (en) 2012-05-18
AU2021225133A1 (en) 2021-09-30
CY1124659T1 (el) 2022-07-22
AU2022268401B2 (en) 2024-08-08
WO2012065086A1 (en) 2012-05-18
LT2637694T (lt) 2021-05-25
US20190008978A1 (en) 2019-01-10
JP2016202187A (ja) 2016-12-08
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