CN111093688A - 长效白细胞介素-15受体激动剂以及相关免疫治疗组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本披露提供了长效IL‑15受体激动剂、相关组合物和制备方法以及例如在治疗对有效提供例如持续的免疫激活和/或抗肿瘤活性的疗法有应答的病状中的用途。

Description

长效白细胞介素-15受体激动剂以及相关免疫治疗组合物和 方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)要求以下临时专利申请的优先权的权益：2017年5月15日提交的美国临时专利申请号62/506,494；和2017年7月25日提交的美国临时专利申请号62/536,966；和2017年11月6日提交的美国临时专利申请号62/582,186；以及2018年3月26日提交的美国临时专利申请号62/648,240，这些专利申请的披露内容通过援引以其全文并入本文。

技术领域

本披露(尤其)涉及长效白细胞介素-15(“IL-15”)受体激动剂、相关组合物和制备方法以及例如在治疗对有效提供例如持续的免疫激活和抗肿瘤活性的疗法有应答的病状中的用途。

背景技术

白细胞介素-15(“IL-15”)是由Grabstein等人首先报道的多效性细胞因子(Grabstein等人(1994)Science[科学]264:965-968)。作为162个氨基酸前体被分泌，人IL-15包含29个氨基酸前导序列和19个氨基酸前序列；该成熟蛋白的长度因此是114个氨基酸。IL-15属于具有四个α-螺旋束的细胞因子家族，结合到异源三聚体受体，其中独特的α亚基(IL-15Rα)赋予受体对于IL-15的特异性，并且该受体的β和γ亚基共享与一种或多种其他细胞因子受体的共性。Giri等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]14:3654-3663。

作为细胞因子，IL-15对先天免疫系统和适应性免疫系统二者具有影响(DiSabitino等人(2011)Cytokine Growth Factor Rev.[细胞因子与生长因子综述]22:19-33)。关于先天免疫系统(其一般性地防卫宿主免受外来入侵物)，除了具有其他特性之外，IL-15导致自然杀伤细胞(“NK细胞”)和自然杀伤-T细胞(“NK-T细胞”)的发育并且维持其存活。与它们在先天免疫系统中的作用一致，NK细胞不特异性攻击入侵病原体；相反，这些细胞破坏受到损害的宿主细胞(诸如肿瘤细胞或病毒感染细胞)。NK-T细胞产生免疫调节细胞因子、特别是干扰素-γ，这导致免疫应答的一般激活。

关于适应性免疫系统(与特定病原体初次相遇后，其防卫宿主免受特定外来入侵物)，IL-15对于产生免疫调节细胞因子的辅助T细胞的维护是必要的。重要的是，IL-15还支持“经历过抗原的”记忆T细胞的长期维护，这些记忆T细胞具有快速繁殖的能力，从而在再暴露于入侵宿主的特定外来病原体时产生较快且较强的免疫应答。

最后，尽管IL-15在先天性和适应性免疫系统二者中有特定作用，它在这两种类别的免疫系统中有显著且广泛的影响。具体地，IL-15抑制或减少在这两种类别的免疫系统内关联的许多细胞类型(包括树突细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、CD4+T细胞和B细胞)的凋亡(或细胞死亡)。

由于它刺激可以抵抗对于宿主表现为外来物(或“非自体”)的细胞的在免疫系统内的许多细胞的增殖和维护，已经提出在罹患癌症的个体的治疗中使用IL-15(Steel等人(2012)Trends Pharmacol.Sci.[药理科学趋势]33(1):35-41)。例如，已经提出基于IL-15的激动剂来治疗骨髓瘤(Wong等人(2013)OncoImmunology[肿瘤免疫学]2(11),e26442:1-3)。另外，已经提出IL-15药物疗法用于治疗罹患病毒感染(诸如HIV感染)的个体。

尽管基于IL-15的治疗方法具有用于治疗罹患多种疾病的个体的潜能，其面临许多挑战。例如，IL-15被从血浆中快速清除并且在生理条件下是相对不稳定的。此外，IL-15的体内信号传导活性同样短暂，并且该分子不利地需要每日给药或多日连续输注以实现最佳活性。某些方法尝试通过将IL-15与IL-15受体α亚基络合来克服这些限制。然而，这种方法可能消除所希望的信号传导，该信号传导通过在多种细胞类型上表达的IL-15受体α独特发生。已经报道了用具有相对小的分子量(5kDa)的、琥珀酰亚胺基碳酸酯封端的聚合物的不可释放的PEG化，但这导致IL-15的生物活性的显著改变。Pettit等人(1997)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272(4):2312-2318。

尽管有前述方法，然而，仍然需要具有改善的特征和概况的新的IL-15受体激动剂，这些改善的特征和概况例如像有效的免疫刺激效应、低全身性毒性、稳定性和/或改善的药代动力学。因此，本披露尤其提供了具有多个下文将更详细描述的有利特征的长效IL-15受体激动剂、以及包含这类激动剂的组合物和试剂盒、以及如本文所述的相关制备方法和用途，它们据信是新颖的并且在本领域完全未被提出过。

发明内容

在第一方面，本文提供了长效IL-15受体激动剂，包括其药学上可接受的盐形式。所述长效IL-15受体(IL-15R)激动剂包含经由酰胺键联稳定地共价连接至IL-15氨基基团的至少单个直链PEG(聚乙二醇)部分。介于所述直链PEG链与到IL-15氨基基团的所述稳定酰胺键联之间的可以是具有从2至5个碳原子的直链未取代的亚烷基基团(～CH₂～)_m(即，m＝2、3、4、或5)。

例如，在一些实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₂；或者，在一些另外的实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₃；在又一些其他实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₄；在又一些其他实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₅。

例如，在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂具有以下结构：

其中IL-15是白细胞介素-15部分，n是从约150至约3,000的整数；m是从2-5的整数(例如，2、3、4或5)并且n’是1。式(I)还可以描绘为[CH₃O-(CH₂CH₂O)_n(CH₂)_mC(O)-NH-]_n’-IL15，并且两个式可以互换地使用。在式I中(以及在本文提供的类似式中)，结构中的～NH～表示IL-15部分的氨基基团。

在一些其他实施例中，n是从约200至约2000、或从约400至约1300、或从约450至约1200的整数。

在又一个或多个另外的实施例中，m是2或3，由此使得将所述PEG部分与到IL-15的所述稳定酰胺键联分开的所述直链亚烷基基团是～(CH₂)₂～或(CH₂₎₃～。在一些优选的实施例中，m是3。

在一个或多个实施例中，n是具有对应于聚乙二醇聚合物的值的整数，所述聚乙二醇聚合物具有选自下组的重均分子量，该组由以下组成：10,000道尔顿(例如，n是约227)、15,000道尔顿(例如，n是约340)、20,000道尔顿(例如，n是约454)、25,000道尔顿(例如，n是约568)、30,000道尔顿(例如，n是约681)、40,000道尔顿(例如，n是约909)、50,000道尔顿(例如，n是约1136)以及60,000道尔顿(例如，n是约1364)。

在一个或多个说明性实施例中，提供了组合物，所述组合物包含根据式(I)的长效IL-15受体激动剂，包括但不限于如本文提供的其相关实施例中的每一种。

在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂：

其中n和m的值如上文针对式(I)所提供。也就是说，就这类组合物的长效IL-15受体激动剂组分而言，所述组合物中包含的不超过约15mol％的长效IL-15受体激动剂具有式(II)。

例如，在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约10摩尔％的由式(II)涵盖的长效IL-15受体激动剂。

在前述的一些另外的实施例中，所述组合物包含不超过约7摩尔％的n’等于2、3或大于3(即，高级PEG聚体，也称为“高聚体”)的长效IL-15受体激动剂。在又一些其他实施例中，所述组合物包含不超过约5摩尔％、6摩尔％、9摩尔％或10摩尔％的n’等于2、3或大于3(即，2或更大)的长效IL-15受体激动剂。

在一些其他实施例中，所述组合物包含根据式(I)的长效IL-15受体激动剂，

其中n和m如上所述，并且n’表示(针对组合物的)共价连接至IL-15氨基基团的聚乙二醇部分的平均数目，并且针对组合物的n’在从1.0至约1.3的范围内。例如，每个IL-15部分的聚乙二醇部分的平均数目选自约1.0、1.1、1.2和约1.3。

在又另一方面，本文提供了制备诸如式(I)(例如，式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id))和式(II)(例如，(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId))中所述的长效白细胞介素-15受体激动剂的方法。在所述方法中，使白细胞介素-15(通常溶解在缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水或任何其他适合的缓冲液中，处于约7(例如，7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6)的pH下)与根据以下结构的经活化的PEG试剂(诸如甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯)(其中n是从约150至约3,000的整数)反应：

持续足以形成以下的时间段，

其中n’是1。用于与白细胞介素-15反应的示例性甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂包括以下：

在一些优选的实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂是

mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯。

在一些实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂具有选自下组的重均分子量，该组由以下组成：约10,000道尔顿(例如，n是约227)、约15,000道尔顿(例如，n是约340)、约20,000道尔顿(例如，n是约454)、约25,000道尔顿(例如，n是约568)、约30,000道尔顿(例如，n是约681)、约40,000道尔顿(例如，n是约909)、约50,000道尔顿(例如，n是约1136)和约60,000道尔顿(例如，n是约1364)。

在所述方法的一个或多个实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂与白细胞介素-15以等摩尔量(即，等摩尔比)添加。

在一个或多个替代性实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂以相对于白细胞介素-15的摩尔过量添加。在一些特定实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂以2倍摩尔过量、或5倍摩尔过量、或7倍摩尔过量、或10倍摩尔过量、或甚至12倍摩尔过量或更多存在。在一些实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂以5至10倍摩尔过量添加。

在一些实施例中，甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂作为固体添加。

在一些其他实施例中，将甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂溶解于合适溶剂中。在特定实施例中，将甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂溶解于酸水溶液，例如像稀盐酸中，但可以采用任何适合的酸。

在方法的一些其他实施例中，白细胞介素-15最初(即，在与甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂混合之前)以约0.5mg/mL至约10mg/mL的浓度存在于溶液中。另外的说明性浓度范围包括例如从约0.5mg/mL至约5mg/mL白细胞介素-15、从约0.5mg/mL至约3mg/mL、以及从约1.0mg/mL至约4mg/mL白细胞介素-15。

在一些其他实施例中，在添加甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂之前将白细胞介素-15溶液的pH调节至约8.0。

在一些其他实施例中，在添加甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂之后将反应混合物的pH调节至约8.0。

在一些其他实施例中，将所得反应混合物搅拌(或混合)足以使反应物之间反应的时间段。在一些实施例中，将反应物混合至多且包括从约15分钟至约10小时。在一些其他实施例中，将反应物混合从约30分钟至约5小时、或从约30分钟至约2小时。

在一些实施例中，在环境条件下，例如在室温下，即在不存在热量添加下进行反应。用于进行反应的说明性温度范围包括例如从约5℃至约50℃、或从约10℃至约40℃、或从约15℃至约30℃。在一些其他实施例中，在从约20℃至约25℃的温度下进行反应。

在方法的一些实施例中，通过添加氨基酸来淬灭反应。在一些相关实施例中，通过添加甘氨酸来淬灭反应。

在方法的一些其他实施例中，从反应混合物中分离出缀合产物，即甲氧基PEG-链烷酸酯-白细胞介素-15缀合物。

在一些另外的实施例中，纯化包含甲氧基PEG-链烷酸酯-白细胞介素-15缀合物的反应混合物。

在一些特定实施例中，所述反应导致形成

其中n’是1。

在一些其他实施例中，所述反应有效形成下述组合物，所述组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(I)所提供。

在又一些另外的实施例中，所述反应有效产生少于20％-35％、或少于约25％脱酰胺化的PEG化白细胞介素-15。

在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰(即，未缀合)的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约7倍的减少。例如，在一个或多个相关实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约6.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约6倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约5.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约4.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约4倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约3.5倍的减少、或甚至EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约3倍的减少。

在一些其他实施例，例如当使用适合于测定受体α结合的技术(例如像表面等离子体共振(SPR))时，所述长效IL-15受体激动剂与未缀合的IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的50％的减少。在一些相关实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与未缀合的IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约45％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约40％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约35％的减少、或甚至展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约30％的减少。

在又一些其他实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约7倍的减少并且与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少，包括上述EC50值或K_D值减少的任何一个或多个特定组合。

在又一个或多个实施例中，提供了组合物，所述组合物包含如本文所述的长效IL-15R激动剂、或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

在又一些其他实施例中，所述长效IL-15R激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于受试者时有效刺激NK激活和/或增殖。

在又一个或多个其他实施例中，所述长效IL-15R激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于受试者时有效支持CD8 T细胞存活和/或记忆形成。

在另一个方面，本文提供了通过以下方式治疗对用IL-15的治疗有应答的病状的方法：通过向患有所述病状的受试者施用治疗有效剂量的如本文提供的长效IL-15R激动剂、或包含这类激动剂的组合物。

在又另一方面，提供了用于通过向患有癌症的受试者施用治疗有效剂量的如本文提供的长效IL-15R激动剂或组合物来治疗癌症的方法。

另外的方面和实施例在以下说明书和权利要求书中进行阐述。

附图说明

图1提供了来自大肠杆菌的示例性重组人IL-15的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，该氨基酸序列为含有115个氨基酸的非糖基化多肽单链，分子量为12.9kDa。

图2是说明如实例1中所述的示例性缀合反应混合物的RP-HPLC分析的色谱图。

图3是如实例1中所述的阴离子交换色谱柱的FPLC纯化图谱。

图4是如实例1中所述的示例性、经纯化的长效IL-15受体激动剂，单mPEG-丁酰胺-IL-15的SDS-PAGE。泳道1提供如所指示的分子量标记物；泳道2是未缀合的亲本分子IL-15，并且泳道3是单mPEG-丁酰胺-IL-15。

图5是如实例1中所述的经纯化的单mPEG-丁酰胺-IL-15的RP-HPLC分析。

图6.是如实例6中所述，在小鼠中施用单次静脉内剂量的测试物品之后测试物品(IL-15，实心圆；或mPEG2-CAC-FMOC-20K-NHS-IL-15，也称为N-(2-甲氧基PEG-乙基)-7-(4-((2-甲氧基PEG-乙基)氨基)-4-氧代丁基)-9-乙基-9H-芴-4-甲酰胺氨基甲酸酯-IL-15、或缀合物2，实心正方形)随时间的血浆浓度的曲线。

图7是如实例7中所述，在大鼠中以0.3(■)、0.15(▲)和0.075mg/kg(●)的剂量的量施用单次静脉内剂量的缀合物2，或以0.15mg/kg(◆)施用单次皮下剂量的缀合物2之后，mPEG2-CAC-FMOC-20K-NHS-IL-15(也称为N-(2-甲氧基PEG-乙基)-7-(4-((2-甲氧基PEG-乙基)氨基)-4-氧代丁基)-9-乙基-9H-芴-4-甲酰胺氨基甲酸酯-IL-15、或缀合物2)随时间的平均血浆浓度的曲线。

图8A和8B说明了如实例8中所述，在施用单次静脉内剂量的IL-15(图8A)或缀合物2(0.3mg/kg，图8B)之后，各种淋巴细胞(即，CD4(■)、CD8(▲))和NK细胞(▼)中的STAT5磷酸化度。

图9A、9B和9C是展示以下的曲线：如实例9中所述，在食蟹猴中施用单次静脉内剂量(0.5mg/kg)的缀合物2之后，各种淋巴细胞(即，CD4、CD8和NK细胞)中的STAT5磷酸化度。

图10A和10B是展示以下的曲线：如实例10中详细地描述，如通过分别在人PBMC的NK亚群：CD56亮(图10A)和CD56暗淡(图10B)NK细胞中的信号传导所测量，示例性长效IL-15受体激动剂(缀合物1、3和5)的体外活性。

图11A和11B是说明以下的曲线：如实例11中所述，当与媒介物相比时，在以0.03mg/kg(低剂量，空心正方形)、0.3mg/kg(中等剂量，实心圆，实线)、或1mg/kg(高剂量，菱形)的剂量静脉内施用单mPEG-SBA40K-IL-15(在本文中也称为缀合物1)之后小鼠中的NK细胞增殖。图11A说明了随时间的Ki67表达(以百分比表示)，而图11B说明了相对于施用样品组中的每一个后的时间的NK细胞计数(细胞/ul)。

图12A-12D是说明以下的曲线：如实例11中所述，与媒介物(实心圆，虚线)相比，在以0.03mg/kg(低剂量，空心正方形)、0.3mg/kg(中等剂量，实心圆，实线)、或1.0mg/kg(高剂量，菱形)的剂量静脉内施用缀合物1之后，小鼠中所有成熟水平的NK细胞的增加数目。NK细胞的亚群通过CD11b和CD27表达定义。图12A展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的末端效应细胞的数目增加；图12B展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的前体NK细胞的数目增加；图12C展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的高效应细胞的数目增加，并且图12D展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的早期NK细胞的数目增加。

图13A和13B是说明以下的曲线：如实例11中所述，与媒介物(实心圆，虚线)相比，在以0.03mg/kg(低剂量，空心正方形)、0.3mg/kg(中等剂量，实心圆，实线)、或1mg/kg(高剂量，菱形)的剂量静脉内施用缀合物1之后，小鼠中NK细胞对NKG2D(图13A)和颗粒酶B(图13B)的表达水平。

图14是说明以下的曲线：如实例11中所述，在小鼠中以0.03mg/kg(低剂量)、0.3mg/kg(中等剂量)、或1mg/kg(高剂量)的剂量静脉内施用缀合物1之后，在给药前及施用后从24小时至120小时，以细胞/μl表示的CD8 T细胞的数目。

图15A和15B是说明以下的曲线：如实例11中所述，与媒介物和IL-15相比，在小鼠中以0.3mg/kg或1.0mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后，相对于施用后时间，分别地T效应记忆细胞和T中央记忆细胞随时间的Ki67表达水平。

图16A和16B是说明以下的曲线：如实例12中所述，在以500μg/kg的剂量静脉内施用缀合物2之后食蟹猴中的NK细胞增殖。图16A说明了从给药前至施用后15天，NK细胞中的Ki67表达(以百分比表示)，而图16B说明了从给药前至施用后15天的NK细胞计数。

图17是说明以下的曲线：从给药前至施用后14天，在如实例12中所述以500μg/kg的剂量静脉内施用缀合物2之后食蟹猴中的CD8 T细胞计数(针对每只动物示出)。

图18A和18B是说明以下的曲线：如实例12中所述，在以500μg/kg的剂量静脉内施用缀合物2之后，相对于施用后时间(从给药前至施用后14天)，食蟹猴中分别地CD8 T效应记忆细胞(T_EM细胞)和CD8 T中央记忆细胞(T_CM)的数目。

图19说明了如实例13中详细地描述，在用以下测试物品之一治疗之后，用小鼠CT-26结肠癌细胞接种的雌性Balb/c小鼠的肺中总病灶数/只小鼠：媒介物，磷酸盐缓冲盐水(A组)；单独的初始IL-15(B组)；剂量为0.03mg/kg的缀合物2(C组)；剂量为0.1mg/kg的缀合物2(D组)；剂量为0.3mg/kg的缀合物2(E组)；剂量为1.0mg/kg的缀合物2(F组)；剂量为3.0mg/kg的缀合物2(G组)。

图20说明了如实例13中详细地描述，在用以下测试物品之一治疗之后，用小鼠CT-26结肠癌细胞接种的雌性Balb/c小鼠的肺中总病灶数/只小鼠：媒介物，磷酸盐缓冲盐水(A组)；剂量为0.03mg/kg的缀合物1(H组)；以及剂量为0.3mg/kg的缀合物1。

图21说明了如实例14中所述，在1000ng/mL(正方形)、3000ng/mL(圆形)、300ng/mL(三角形)、30ng/mL(上部X)、3ng/mL(菱形)、以及未刺激(下部X)下，随E:T(效应物:靶标)比而变的特异性裂解百分比。该数据说明在与缀合物1一起培养之后体外NK细胞的剂量依赖性增加的细胞毒性。

图22A-22D是说明以下的曲线：如实例11中所述，在以0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和1.5mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后小鼠中所有成熟水平的NK细胞的增加数目。图22A展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的末端效应细胞的数目增加；图22B展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的前体NK细胞的数目增加；图22C展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的高效应细胞的数目增加，并且图22D展示了从施用后24小时至120小时，以细胞/μL表示的早期NK细胞的数目增加。

图23是说明以下的曲线：如实例15中所述，在用缀合物1以0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和1.5mg/kg的剂量治疗后随时间而变的颗粒酶B表达。该数据表明用缀合物1治疗增加NK细胞的颗粒酶B表达。

图24是说明以下的曲线：如实例11中所述，在小鼠中以0.03mg/kg(填充圆，虚线)和0.3mg/kg(填充圆，实线)的剂量静脉内施用缀合物1、以及静脉内施用媒介物IL-15缓冲液(空心圆，虚线)之后，在给药前及施用后24小时至96小时，以细胞/μl表示的从小鼠脾分离的CD8 T细胞的数目。

图25是说明以下的曲线：如实例11中所述，与媒介物IL-15缓冲液相比，在小鼠中以0.03mg/kg或0.3mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后，相对于施用后时间，CD49b细胞的Ki67表达水平(以百分比表示)。

图26是说明以下的曲线：如实例11中所述，与媒介物IL-15缓冲液相比，在小鼠中以0.03mg/kg或0.3mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后，相对于施用后时间，CD49b细胞随时间的颗粒酶B表达水平(以百分比表示)。

图27是说明如实例14中所述，用缀合物1以0.3mg/kg治疗之后体内细胞毒性结果的曲线。在治疗后24小时、48小时、和72小时评估细胞毒性。

图28A-28D是说明以下的曲线：如实例11中所述，在以0.03mg/kg和0.3mg/kg的剂量以单次剂量静脉内施用缀合物1之后或在q7dx3方案中的第三次剂量之后，小鼠中所有成熟水平的NK细胞的增加数目。图28A展示了从施用后24小时至240小时，Ki67CD49b细胞的百分比增加；图22B展示了从施用后24小时至240小时，颗粒酶B CD49b细胞的百分比增加；图28C展示了从施用后24小时至240小时，以细胞/μL表示的CD49b细胞的数目增加；并且图28D展示了从施用后24小时至240小时，颗粒酶B(granB)+MFI CD49b细胞的百分比增加。

图29A-29C是与实例16中所述的研究相关的曲线。图29A是在balb/c小鼠中分别以0.5和0.3mg/kg施用单次静脉内剂量的测试物品之后，在144小时时程期间测试物品(IL-15或缀合物1)的血浆浓度。缀合物1展现出大约12小时的半衰期，而IL-15从血浆中快速清除，半衰期小于1小时。图29B是在以0.03和0.3mg/kg单次注射缀合物1之后，小鼠中CD8 T细胞内的pSTAT5阳性率百分比的曲线图。两种剂量水平下的缀合物1均诱导CD8 T细胞中持续的pSTAT5信号传导。示出了120小时时程，包括给药前。图29C是在以0.03和0.3mg/kg单次注射缀合物1之后，鼠类NK细胞内的pSTAT5阳性率百分比的曲线图。两种剂量水平下的缀合物1均诱导NK细胞中稳健且持续的pSTAT5信号传导。

图30A-30C是如实例17中所述，在以0.01、0.03、0.1、0.3、1或1.5mg/kg单次施用缀合物1之后，分别地总CD8、CD8中央记忆(Tcm)和CD8效应记忆(Tem)细胞数目的曲线。如实例17中所述，等于或大于0.03的剂量水平下的缀合物1诱导血液中总CD8T细胞的显著增加。0.01mg/kg的最低剂量增加了CD8 Tcm和CD8Tem。在0.3mg/kg下，缀合物1将CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem分别增加6.4X、37.9X和14.5X。值得注意的是，当以0.3-1.5mg/kg给药缀合物1时，CD8和CD8记忆T细胞数目未在注射后240小时返回到基线，这证明了缀合物1的持续PD效应。

图30D、30E和30F是如实例17中所述，小鼠中分别地总CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem群体内的Ki-67阳性率百分比的曲线。在所有剂量水平下，单次剂量的缀合物1增加了所有CD8和CD8亚群体中的Ki-67阳性率。

图31A、31B和31C是如实例17中所述，在以0.03和0.3mg/kg单次(虚线)或Q7dx3(实线)给药缀合物1之后的CD8和CD8记忆亚群体T细胞数目的曲线。重复给药进一步增加了这些群体，其中CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem分别增加35.3X、183X和73.8X。在时程结束(在0.3mg/kg下的第一次或最后一次剂量之后的240小时)时，小鼠中的细胞数目未返回到基线。

图32A和32B是如实例17中所述，在小鼠中单次给药从0.01至1.5mg/kg的缀合物1之后NK细胞数目和Ki-67阳性率百分比的曲线。在所有剂量水平下，NK细胞数目均高于剂量对照地显著增加，并且到给药后240小时时返回到基线。所有剂量水平均诱导NK细胞中Ki-67阳性率百分比的稳健增加。

图32C是如实例17中所述，在以0.03和0.3mg/kg单次(实线)或Q7dx3(虚线)给药缀合物1之后鼠类NK细胞数目的曲线。与单次剂量相比，以0.3mg/kg重复给药缀合物1诱导略微较少，但仍显著的NK细胞数目。用在0.03mg/kg下的单次相对于重复给药实现了类似的NK数目。

图33A说明了如实例中18所述的体外NK细胞毒性测定，该测定测量在小鼠中进行测试物品治疗之后，NK介导的靶细胞裂解的变化。示出了从用0.006、0.03或0.3mg/kg缀合物1或1mg/kg IL-15治疗的balb/c小鼠中分离的脾NK细胞对YAC-1细胞的特异性裂解百分比的指示小时下的时程。将来自用媒介物给药的小鼠的脾NK细胞充当对照。与来自以1mg/kg接受IL-15的单次注射的小鼠的NK细胞相比，以0.3mg/kg给药的缀合物1诱导的NK细胞毒性升高的幅度和持续时间更优异。

图33B是图33A中来自专用于NK体外细胞毒性测定的相同小鼠的血液NK细胞中颗粒酶B阳性率百分比的曲线图。参见实例18。以0.03和0.3mg/kg给药的缀合物1诱导NK颗粒酶B表达的显著增加，在0.3mg/kg下发现稳健且持续的升高。

图34A和34B说明了如实例19中所述，在接受静脉内CT-26肿瘤细胞注射、继之以0.03或0.3mg/kg间隔一周给药两次的缀合物1治疗的balb/c小鼠中的肺结节抑制百分比。以0.03和0.3mg/kg的缀合物1注射分别将肺结节形成抑制了40％和80％。对以0.3mg/kg给药的相同小鼠随访，持续肿瘤细胞注射后的32天以评估存活率。与接受媒介物对照的注射肿瘤的小鼠相比，用缀合物1治疗显著增加存活率。

图35是如实例20中所述，接受抗体介导的NK细胞耗尽(橄榄绿)、IgG对照(蓝色)、或PBS(橙色)的用缀合物2治疗的注射CT-26的小鼠中的肺结节抑制百分比的图。数据以相对于未进行NK细胞耗尽并且用媒介物对照(黑色)治疗的注射CT-26的小鼠的肺结节抑制百分比表示。当小鼠缺乏NK细胞时，该肿瘤模型中的缀合物2功效被消除。

图36A和36B是说明以下的曲线：如实例21中所述，在以0.1mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后，一只雄性(虚线)和一只雌性(实线)cyno的CD8细胞数目和作为增殖量度的Ki-67阳性率百分比的两周时程。缀合物1诱导cyno中显著的CD8 T细胞增加，在单次剂量之后细胞数目增加7-10X。

图36C和36D说明了如实例21中所述，在单次注射缀合物1之后cyno CD8 Tcm和CD8Tem细胞数目的增加。CD8 Tcm和Tem数目分别增加了27-30X和21-33X。

图37A和37B是在以0.1mg/kg单次给药缀合物1之后cyno中NK细胞数目和Ki-67阳性率百分比的曲线图。参见实例21。在用缀合物1治疗之后，NK细胞增加了9-10X。

图38A和38B是针对如实例22中所述，人PBMC的IL-15(红色，实心圆)相对于缀合物1(绿色，实线正方形)治疗以及随后对CD8和CD56亮NK细胞中的pSTAT5阳性率百分比的测量的EC50曲线。在接合CD8和CD56亮NK细胞方面，缀合物1的效力比IL-15分别弱5.5和15X。然而，缀合物1实现与常规IL-15相同的最大应答。

图39是如实例23中所述，在小鼠中施用单次静脉内剂量之后，在500μg/kg下的IL-15(绿色，实心圆)或在10μg/kg(粉色，实心正方形)、30μg/kg(紫色，实心向上三角形)、100μg/kg(红色，实心面向下的三角形)、300μg/kg(橙色，实心菱形)或1000μg/kg(暗红色，空心六边形)下的缀合物1随时间的血浆浓度曲线。

图40是如实例24中所述，在大鼠中施用单次静脉内剂量之后，在10μg/kg(粉色，实心正方形)、75μg/kg(紫色，实心向上三角形)或150μg/kg(橙色，实心面向下的三角形)下的缀合物1随时间的血浆浓度曲线。

图41是如实例25中所述，在食蟹猴中施用单次静脉内剂量的测试物品之后，在50μg/kg下的IL-15(绿色，实心圆)或在10μg/kg(红色，实心面向下的三角形)、50μg/kg(蓝色，实心菱形)或100μg/kg(橙色，实心正方形)下的缀合物1随时间的血浆浓度曲线。

图42A和42B是如实例26中所述，在小鼠中以0.03mg/kg(蓝色，实心圆)或0.3mg/kg(橙色，实心圆)的剂量单次给药缀合物1之后分别地CD4 T细胞数目和Ki-67阳性率百分比的曲线。还示出了媒介物(黑色)和给药前(空心圆)细胞水平。所有剂量水平到给药后240小时均返回到基线。0.3mg/kg剂量水平诱导CD4 T细胞中Ki-67阳性率百分比的稳健增加。

图43是如实例26中所述，在以0.03mg/kg(橙色，实心圆)或0.3mg/kg(蓝色，实心正方形)单次注射缀合物1之后，小鼠中CD4 T细胞内的pSTAT5阳性率百分比的曲线图。两种剂量水平下的缀合物1均诱导了CD4 T细胞中pSTAT5信号传导的增加，其中0.3mg/kg诱导更大的增加。示出了120小时时程，包括媒介物(黑色)和给药前(空心圆)。

图44A、44B和44C是说明以下的曲线：如实例27中所述，在以0.003mg/kg(蓝色，面向下的三角形)、0.01mg/kg(绿色，菱形)或0.1mg/kg(橙色，实心正方形)的剂量静脉内施用媒介物(黑色)或缀合物1之后，食蟹猴中针对NK细胞(图44A)、CD8T细胞(图44B)和CD4 T细胞(图44C)的相对于施用后时间的细胞计数。

图45A、45B和45C是说明以下的曲线：如实例27中所述，在食蟹猴中以0.001mg/kg(紫色，实心正方形)、0.003mg/kg(蓝色，面向下的三角形)或0.1mg/kg(橙色，实心正方形)的剂量单次给药缀合物1之后的Ki-67阳性率百分比。也示出了媒介物(黑色)水平。所有剂量水平到给药后至少17天均返回到基线。0.1mg/kg和0.003mg/kg剂量水平诱导NK细胞和CD8 T细胞中Ki-67阳性率百分比的稳健增加。0.1mg/kg剂量水平诱导所测试的所有细胞类型中Ki-67阳性率百分比的增加。

图46A、46B和46C说明了如实例27中所述，在食蟹猴中施用单次静脉内剂量的媒介物(黑色)或0.001mg/kg(紫色，实心正方形)、0.01mg/kg(绿色，菱形)或0.1mg/kg(橙色，实心正方形)缀合物1之后，NK细胞(图46A)、CD8 T细胞(图46B)和CD4 T细胞(图46C)中的STAT5磷酸化度。

图47A-47D是说明以下的曲线：如实例27中所述，在食蟹猴中以0.001mg/kg(紫色，实心正方形)、0.01mg/kg(绿色，菱形)或0.1mg/kg(橙色，实心正方形)的剂量单次给药缀合物1之后的Ki-67阳性率百分比。也示出了媒介物(黑色)水平。图47A示出了针对CD8 T_初始细胞的结果，图47B示出了针对CD8 T_scm细胞的结果。图47C示出了针对CD8 T_cm细胞的结果。图47D示出了针对CD8 T_em细胞的结果。

图48A、48B和48C是说明以下的曲线：如实例28中所述，在用缀合物1以0.001mg/kg(图48A)、0.01mg/kg(图48B)和0.1mg/kg(图48C)的剂量治疗之后随时间而变的颗粒酶B表达。该数据表明用缀合物1治疗增加了非人类灵长类动物(NHP)中NK细胞中的颗粒酶B水平。

图49A、49B和49C是说明以下的曲线：如实例28中所述，在用缀合物1以0.001mg/kg(图49A)、0.01mg/kg(图49B)和0.1mg/kg(图49C)的剂量治疗之后随时间而变的穿孔素表达。该数据表明用缀合物1治疗增加了NHP中NK细胞的穿孔素水平。

具体实施方式

在详细描述本披露的一个或多个方面或实施例之前，应当指出的是，本披露并非旨在限于特定合成技术、IL-15部分等，因此可如本披露所适用的领域的普通技术人员所理解那样变化。

在描述和要求本披露的某些特征时，除非另外指示，否则将依据以下所述定义使用以下术语。

必须指出的是，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。

在描述和要求一个或多个实施例时，将依据以下所述定义使用以下术语。

“生理学上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是与水在生理学条件下进行反应(即，被水解)的相对不稳定的键。键在水中水解的趋势可能不仅取决于在给定分子之内连接两个原子的键联的一般类型，而且取决于连接至这些原子的取代基。适当的水解不稳定的或弱的键联可以包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽、寡核苷酸、硫酯、以及碳酸酯。

“酶可降解的键联”意指经受一种或多种酶降解的键联。

“稳定的”键联或键是指在水中基本上稳定，也就是说在生理条件下经延长的时间段没有经受任何明显程度水解的化学键。水解稳定的键联的实例通常包括但不限于以下：碳-碳键(例如，在脂族链中)、醚、酰胺、胺等。一般而言，稳定的键联是在生理条件下展现出小于约1％-2％的每日水解速率的键联。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科书中找到。

例如在共价连接至活性部分(诸如白细胞介素-15)的聚乙二醇的背景下，共价“可释放”键联是在生理条件下，例如通过任何适合的机制，以临床上有用的速率从活性部分释放或分离聚乙二醇聚合物，并且包括例如且不限于可水解键和酶可降解键联。

“基本上”或“实质上”意指几乎全部地或完全地，例如给定量的95％或更大。

类似地，如在此所使用的“约”或“大约”意指在给定量的加或减5％内。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的情形可以但是并非必然发生，这样该说明包括其中该情形发生的情况以及该情形不发生的情况。

“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可以包含在如本文所述的组合物中并且不会对受试者引起显著不良毒理学作用的组分。

短语“药学上有效量”和“药理学上有效量”和“治疗有效量”以及“生理学上有效量”在本文中可互换使用并且指代在血流中或靶组织中提供所希望水平的物质以产生所希望的生物或药物应答所需的如本文提供的长效IL-15R激动剂的量。例如，这种应答可能会破坏靶癌细胞或减缓或遏制受试者中的癌症进展。该术语还适用于将诱导靶细胞中特定应答的剂量。.精确量将取决于许多因素，例如像，所治疗的特定病状、预期的患者群体、个体患者的考虑因素、待施用的治疗组合物的组分和物理特性等。

提及如本文所述的长效IL-15R激动剂意指涵盖其药学上可接受的盐形式。

如在此所使用的，术语“患者”或“受试者”是指罹患或易患可以通过施用如本文提供的化合物或组合物来预防或治疗的病状的活生物体。受试者包括但不限于哺乳动物(例如，鼠类、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科等)，并且优选是人。

在水溶性聚合物(诸如PEG)的背景下，分子量可以表示为数均分子量或重均分子量。除非另外指明，否则所有对分子量的提及在此均指重均分子量。两种分子量测定(数均与重均分子量)均可以使用凝胶渗透色谱法或其他液相色谱技术(例如，凝胶过滤色谱法)来测量。最常采用的是凝胶渗透色谱法和凝胶过滤色谱法。用于确定分子量的其他方法包括末端-基团分析或依数性(例如冰点降低、沸点升高、或渗透压)的测量以确定数均分子量；或使用光散射技术、超速离心法、MALDI TOF、或粘度测定法以确定重均分子量。PEG聚合物典型地是多分散的(即，这些聚合物的数均分子量与重均分子量不相等)，具有优选小于约1.2、更优选小于约1.15、仍然更优选小于约1.10、又仍然更优选小于约1.05并且最优选小于约1.03的低多分散性值。

与一种特定官能团结合使用时，术语“活性”、“反应性”或“活化”是指一种反应性官能团，该反应性官能团易于与另一个分子上的亲电子体或亲核体反应。这与需要强催化剂或高度不切实际的反应条件以便反应的那些基团(即“非反应性”或“惰性”基团)形成对比。

如在此所使用的，术语“官能团”或其任何同义词意指涵盖其受保护的形式以及未受保护的形式。

术语“间隔基部分”、“键联”以及“接头”可以在此用于指任选地用来连接互连部分(诸如聚合物试剂的末端和IL-15部分)的键或原子或原子集合。该间隔基部分可以是水解稳定的或者可以包括生理学上可水解的、酶可降解的、或以其他方式可释放的键联。除非上下文另外明确规定，否则间隔基部分任选地存在于化合物的任何两种元素之间(例如，IL-15部分与水溶性聚合物(诸如PEG)可以通过间隔基部分直接或间接连接)。

“烷基”是指长度典型地在从约1至15个原子的范围内的烃链。此类烃链优选地但并非必须是饱和的并且可以是支链或直链，不过典型地直链是优选的。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、3-甲基戊基等。

“低级烷基”是指包含从1到6个碳原子，并且可以是直链或支链的烷基，如通过甲基、乙基、正丁基、异丁基、以及叔丁基所例示。

“烷氧基”是指-OR基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选地是C_1-6烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等等)。

术语“取代的”，如在例如“取代的烷基”中，是指被一个或多个非干扰性取代基取代的部分(例如，烷基基团)，这些取代基是诸如但不限于：烷基、C_3-8环烷基，例如，环丙基、环丁基等；卤代，例如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基、低级苯基；取代的苯基；等。“取代的芳基”是具有一个或多个非干扰性基团作为取代基的芳基。对于苯基环上的取代，取代基可以处于任何取向(即，邻位、间位或对位)。

“非干扰性取代基”是当存在于分子中时典型地不与该分子内部所含的其他官能团反应的那些基团。

“芳基”意指一个或多个芳族环，各自具有5或6个核心碳原子。芳基包括多个芳基环，这些芳基环可以是稠合的(如萘基中那样)或是未稠合的(如联苯基中那样)。芳基环还可以与一个或多个环烃、杂芳基、或杂环稠合或未稠合。如在此所使用的，“芳基”包括杂芳基。

“杂芳基”是含有从一个至四个杂原子(优选硫、氧、或氮、或其组合)的芳基基团。杂芳基环还可以与一个或多个环烃环、杂环、芳基环、或杂芳基环稠合。

“杂环”或“杂环的”意指一种或多种环，这些环具有5-12个原子、优选5-7个原子，具有或不具有不饱和度或芳族特征并且具有至少一个不是碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。

“取代的杂芳基”是具有一个或多个非干扰性基团作为取代基的杂芳基。

“取代的杂环”是具有一个或多个由非干扰性取代基形成的侧链的杂环。

如在此所使用的，“有机基团”应当包括烷基、取代的烷基、芳基、以及取代的芳基。

“药学上可接受的赋形剂或载体”是指可以任选地包含在本发明的组合物中并且不对患者造成明显有害毒理学作用的赋形剂。

如在此所使用的，术语“IL-15部分”是指具有人IL-15活性的肽或蛋白质部分。另外，术语“IL-15部分”涵盖缀合之前的IL-15部分以及缀合之后的IL-15部分残基。如下文中将进一步详细解释，本领域的普通技术人员可以确定任何给定部分是否具有IL-15活性。包含与SEQ ID NO:1至3中任一项对应的氨基酸序列的蛋白质以及基本上与其同源的任何蛋白质或多肽都是IL-15部分。如在此所使用的，术语“IL-15部分”包括例如通过位点定向诱变而有意修饰或通过突变而偶然修饰的此类肽和蛋白质。这些术语还包括具有从1至6个额外糖基化位点的类似物、在肽或蛋白质的羧基末端处具有至少一个额外氨基酸(其中该一个或多个额外氨基酸包含至少一个糖基化位点)的类似物以及具有包含至少一个糖基化位点的氨基酸序列的类似物。该术语包括天然地、重组地和合成地产生的部分。

术语“基本上同源”或“基本上相同”意指特定主题序列(例如突变序列)因一个或多个取代、缺失或添加而不同于参考序列，其净效应不导致该参考序列与该主题序列之间不利的官能差异。出于本文的目的，与给定序列具有大于95％的同源性(同一性)、等效的生物活性(但并非必须是等效强度的生物活性)、以及等效的表达特征的序列被认为是基本上同源的(一致的)。出于确定同源性的目的，应当忽略成熟序列的截短。在此所用的示例性IL-15多肽包括与SEQ ID NO:1基本上同源的那些序列。SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1几乎相同，不同之处在于SEQ ID NO:2在序列开端具有甲硫氨酸，该甲硫氨酸是大肠杆菌中起始翻译所需的。

术语“片段”意指具有IL-15部分的一部分或片段的氨基酸序列、并且具有IL-15的生物活性、或基本具有IL-15的生物活性的任何蛋白质或多肽。片段包括由IL-15部分的蛋白水解降解所产生的蛋白质或多肽以及通过本领域中常规的方法以化学合成产生的蛋白质或多肽。

将肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸为Phe或F；亮氨酸为Leu或L；异亮氨酸为Ile或I；甲硫氨酸为Met或M；缬氨酸为Val或V；丝氨酸为Ser或S；脯氨酸为Pro或P；苏氨酸为Thr或T；丙氨酸为Ala或A；酪氨酸为Tyr或Y；组氨酸为His或H；谷氨酰胺为Gln或Q；天冬酰胺为Asn或N；赖氨酸为Lys或K；天冬氨酸为Asp或D；谷氨酸为Glu或E；半胱氨酸为Cys或C；色氨酸为Trp或W；精氨酸为Arg或R；并且甘氨酸为Gly或G。

概述

本披露涉及提供长效IL-15受体激动剂。这种激动剂将理想地具有若干个有利和不可预测的特征，例如像以下中的至少一个(如果不是更多的话)：(i)通过提供可测量的药效动力学作用来递送持续的IL-15活性而不需要每日给药的能力，(ii)在很大程度上保留与IL-15受体α的结合(即，与IL-15相比)，(iii)刺激NK细胞激活和/或增殖，和/或(iv)支持CD8 T细胞存活和/或记忆形成，以及(v)提供对肿瘤生长的抑制。意外地，本申请人已经实现了将在下文详细描述的具有有利特性的独特组合的长效IL-15R激动剂。

长效IL-15R激动剂和相关组合物

一般而言，长效IL-15受体激动剂或其药学上可接受的盐形式包含经由酰胺键联稳定地共价连接至IL-15氨基基团的单个直链PEG(聚乙二醇)部分。介于PEG部分与到IL-15氨基基团的稳定酰胺键联之间的是具有从2至5个碳原子的直链未取代的亚烷基基团(～CH₂～)_m(即，m＝2、3、4、或5)。

在考虑IL-15部分的情况下，术语“IL-15部分”是指在缀合之前的IL-15部分以及在连接至非肽水溶性聚合物(诸如聚(环氧烷)(例如，聚(乙二醇)或PEG))之后的IL-15部分。虽然在后文特别提及PEG为下文的非肽水溶性聚合物，但应了解的是，本披露总体上涉及非肽水溶性聚合物或聚(烷撑二醇)。然而，应了解的是，当原始IL-15部分连接至聚乙二醇部分时，由于存在与一种或多种聚合物键联相关的一个或多个共价键而使IL-15部分轻微改变。

IL-15部分可以源自非重组方法和重组方法，并且在此方面本披露不受限制。另外，IL-15部分可以源自人类来源、动物来源(包括昆虫)、真菌来源(包括酵母)、以及植物来源。

IL-15部分可以根据例如Grabstein等人描述的程序获得[参见.Grabstein等人(1994)Science[科学]264:965-968]。IL-15部分还可以使用重组方法，例如像英姆纳克斯公司(Immunex Corporation)的欧洲专利号0 772 624B2中所述的那些重组方法制备。替代性地，IL-15部分可以商购自，例如，金斯瑞美国有限公司(GenScript USA Inc.)(新泽西州皮斯卡特维(Piscataway NJ))和派普泰克公司(Peprotech)(新泽西州洛基山(Rockyhill,NJ))。

IL-15部分可以在细菌[例如大肠杆菌，参见例如，Fischer等人(1995)Biotechnol.Appl.Biotechnol.[生物技术与应用生物化学]21(3):295-311]、哺乳动物[参见例如，Kronman等人(1992)Gene[基因]121:295-304]、酵母[例如，毕赤酵母(Pichiapastoris)，参见例如，Morel等人(1997)Biochem.J.[生物化学杂志]328(1):121-129]、以及植物[参见例如，Mor等人(2001)Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]75(3):259-266]表达系统中表达。表达可以经由外源性表达(当宿主细胞天然地包含所希望的遗传编码时)或经由内源性表达来进行。

虽然用于制备蛋白质的基于重组的方法可以不同，但重组方法典型地涉及构建编码所希望的多肽或片段的核酸，将该核酸克隆到表达载体中，转化宿主细胞(例如，植物、细菌、酵母、转基因动物细胞或哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞)，并且表达该核酸以产生所希望的多肽或片段。用于在体外以及在原核和真核宿主细胞中产生并表达重组多肽的方法是本领域普通技术人员已知的。

为促进重组多肽的鉴定和纯化，可以将编码表位标签或其他亲和结合序列的核酸序列与编码序列符合可读框地插入或添加，由此产生由所希望的多肽与适合于结合的多肽构成的融合蛋白。可以通过以下方式鉴定并纯化融合蛋白：首先使包含融合蛋白的混合物经过携带针对融合蛋白中表位标签或其他结合序列的结合部分(例如，抗体)的亲和柱，由此在柱内结合融合蛋白。此后，融合蛋白可以通过用适当溶液(例如，酸)洗涤该柱以释放结合的融合蛋白来回收。还可以通过以下方式纯化重组多肽：裂解宿主细胞，例如通过离子交换色谱法、亲和结合方法、疏水性相互作用方法分离多肽，并且此后通过MALDI或蛋白印迹法鉴定，并且收集该多肽。这些和其他用于鉴定和纯化重组多肽的方法是本领域普通技术人员已知的。然而，在一个或多个实施例中，IL-15部分不呈融合蛋白的形式。

根据用于表达具有IL-15活性的蛋白质的系统，IL-15部分可以是非糖基化或糖基化的并且任一种可以使用。也就是说，IL-15部分可以是非糖基化的或IL-15部分可以是糖基化的。在一个或多个实施例中，IL-15部分是非糖基化的。

可以有利地修饰IL-15部分以包含和/或取代一个或多个氨基酸残基，例如像赖氨酸、半胱氨酸和/或精氨酸，以便使聚合物与氨基酸侧链内部的原子容易连接。IL-15部分的取代实例描述于美国专利号6,177,079中。另外，可以修饰IL-15部分以包含非天然存在的氨基酸残基。用于添加氨基酸残基和非天然存在的氨基酸残基的技术是为本领域普通技术人员众所周知的。参考J.March,Advanced Organic Chemistry:Reactions Mechanismsand Structure[高等有机化学：反应、机理与结构],第4版(New York:Wiley-Interscience[纽约：威利-跨学科出版社],1992)，和Bioinformatics for Geneticists[遗传学工作者的生物信息学](Michael R.Barnes和Ian C Gray编辑),2003John Wiley&Sons,Ltd[约翰威利父子有限公司],第14章,Amino Acid Properties and Consequences ofSubstitutions[氨基酸特性和取代后果],Betts,M.J.,和Russell,R.B.。

另外，可以有利地修饰IL-15部分以包含对官能团的连接(除通过添加包含官能团的氨基酸残基以外)。例如，可以修饰IL-15部分以包含硫醇基。另外，可以修饰IL-15部分以包含N末端α碳。另外，可以修饰IL-15部分以包含一个或多个碳水化合物部分。另外，可以修饰IL-15部分以包含醛基团。另外，可以修饰IL-15部分以包含酮基团。在本发明的一些实施例中，优选的是IL-15部分不被修饰成包含以下中的一种或多种：硫醇基团、N末端α碳、糖、醛基团以及酮基团。

在本文中、在文献中、并且在例如美国专利申请公开号US 2006/0104945，Pettit等人(1997)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272(4):2312-2318，和Wong等人(2013)OncoImmunology[肿瘤免疫学]2(11),e26442:1-3中描述了示例性IL-15部分。优选的IL-15部分包括具有以下氨基酸序列的那些，该氨基酸序列包括选自由SEQ ID NO:1至3组成的组的序列，以及基本上与其同源的序列(其中即使SEQ ID NO 2和3、以及基本上与其同源的序列不满足本文提供的IL-15部分的体外活性标准，但应理解的是出于本发明的目的，这些序列也被理解为“IL-15部分”)。优选的IL-15部分具有与SEQ ID NO:1对应的氨基酸序列。在一些实施例中，IL-15部分是与SEQ ID NO:1-3中的任一种具有至少约85％或至少约90％同一性的功能同源物。在一些实施例中，IL-15部分是与SEQ ID NO:1-3中的任一种具有至少约95％、98％或99％同一性的功能同源物。

在一些情况下，IL-15部分将处于“单体”形式，其中将相应肽的单一表达组织成离散单元中。在其他情况下，IL-15部分将处于“二聚体”形式(例如重组IL-15的二聚体)，其中蛋白质的两个单体形式彼此缔合。

另外，IL-15的前体形式可以用作IL-15部分。IL-15的一种示例性前体形式具有序列SEQ ID NO:3。

前述序列中任一项的截短形式、杂交变体、以及肽模拟物也可以充当IL-15部分。前述序列中任一项的维持至少一些程度的IL-15活性的生物活性片段、缺失变体、取代变体或添加变体也可以充当IL-15部分。

对于任何给定的肽、蛋白质部分或缀合物，有可能确定该肽、蛋白质部分或缀合物是否具有IL-15活性。本领域中描述了用于确定体外IL-15活性的不同方法。示例性方法是基于pSTAT测定。简言之，如果将IL-15依赖性CTLL-2细胞暴露于具有IL-15活性的测试物品，可以定量地测量包括STAT5在酪氨酸残基694(Tyr694)处磷酸化的信号级联结果的开始。测定方案和试剂盒是已知的并且包括例如MSD磷酸(Tyr694)/总STATa,b全细胞溶解产物试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡的Meso Scal Diagnostics公司(Meso Scal Diagnostics,LLC,Gaithersburg,MD))。例如，使用该方法，展现出至少一个5分钟或在10分钟不超过约300ng/mL(更优选不超过约150ng/mL)的pSTAT5 EC₅₀值的所提出的IL-15部分被认为是与本披露有关的“IL-15部分”。优选的是，然而，所使用的IL-15部分是更有效力的(例如，具有在至少5分钟或10分钟之一小于150ng/mL的pSTAT5 EC₅₀值，诸如小于约1ng/mL、并且甚至更优选至少一个5分钟或在10分钟小于0.5ng/mL)。

本领域中已知的其他方法也可以用于评估IL-15功能，包括量电法、分光光度法、色谱法以及辐射测量方法。对于一种这样的另外类型的测定，参见例如，Ring等人(2012)Nat.Immunol.[自然免疫学]13(12):1187-1195。

与测量IL-15部分的活性相联系使用的测定也可以用于测量本文所述的长效IL-15R激动剂的活性。参见例如，本文提供的支持性实例。

只要在施用于受试者之后化合物展现出体内IL-15激动性，持续的时间量比施用IL-15的情况更长，该激动剂就视为根据本披露的长效IL-15R激动剂。可以使用常规方法，诸如涉及放射性标记化合物、将该化合物施用于体内、并测定其清除率的那些方法，可用于评估提出为长效IL-15R激动剂的化合物是否是“长效”的(即，具有的清除率是否长于在相同体内系统中施用的IL-15的清除率)。出于本文的目的，长效IL-15R激动剂的长效性质可以、并且典型地使用流式细胞术来测定以在施用有待在小鼠中评价的激动剂之后的不同时间点测量淋巴细胞中的STAT5磷酸化。作为参考，在IL-15的情况下信号丢失约24小时，但是持续时间段大于长效IL-15激动剂的时间段。

如先前所讨论，优选的长效IL-15R激动剂通常将包含经由酰胺键联稳定地共价连接至IL-15氨基基团的单个直链PEG(聚乙二醇)部分。介于PEG部分与到IL-15氨基基团的稳定酰胺键联之间的是具有从2至5个碳原子的直链未取代的亚烷基基团(～CH₂～)_m(即，其中m＝2、3、4、或5)。

例如，在一些实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₂；或者，在一些另外的实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₃；在又一些其他实施例中，所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₄；在又一些其他实施例中，所述未取代的亚烷基基团是所述未取代的亚烷基基团是(～CH₂～)₅。

例如，在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂具有以下结构：

其中IL-15是白细胞介素-15部分，n是从约150至约3,000的整数；m是从2-5的整数(例如，2、3、4或5)并且n’是1。在式I中(以及在本文提供的类似式中)，结构中的～NH～表示IL-15部分的氨基基团。式(I)还可以如下描绘，其中移动括号以反映末端PEG甲氧基基团，

并且两个式可以互换使用。说明性的示例性化合物包括由式(I)涵盖的以下化合物：

以及

在一些优选的实施例中，长效IL-15受体激动剂对应于式(Ia)或式(Ib)。在一些特别优选的实施例中，长效IL-15受体激动剂对应于式(Ib)。

在一些其他实施例中，关于本文所述的结构和式，n是从约200至约2000、或从约400至约1300、或从约450至约1200的整数。也就是说，在一些实施例中，n是从约200至约2000的整数。在又一些其他实施例中，n是从约400至约1300的整数。在又一些其他实施例中，n是从约450至约1200的整数。

具有对应于n值的前述范围中的任一个的分子量的PEG通常是优选的。

在一个或多个实施例中，n是具有对应于具有选自下组的重均分子量的聚乙二醇聚合物的值的整数，该组由以下组成：约10,000道尔顿(其中n是约227)、或约15,000道尔顿(其中n是约340)、或约20,000道尔顿(其中n是约454)、或约25,000道尔顿(其中n是约568)、或约30,000道尔顿(其中n是约681)、或约40,000道尔顿(其中n是约909)、或约50,000道尔顿(其中n是约1136)或甚至约60,000道尔顿(其中n是约1364)。

除了前述重均分子量之外，化合物的聚乙二醇部分的其他示例性重均分子量包括约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约22,500道尔顿、约35,000道尔顿、约45,000道尔顿、约55,000道尔顿、约65,000道尔顿、约70,000道尔顿、和约75,000道尔顿。

在一些优选的实施例中，化合物的聚乙二醇聚合物部分的重均分子量是约40,000道尔顿。

虽然PEG部分优选地如上文式(I)中所示用甲氧基基团末端封端，但PEG部分可以在其末端以任何低级C_1-6烷氧基基团封端，或者可以以羟基基团、或其他适合的末端封端基团封端。

在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约20摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(I)所提供。也就是说，就这类组合物的长效IL-15受体激动剂组分而言，所述组合物中包含的不超过约20摩尔％的长效IL-15受体激动剂具有式(II)。

在一些另外的实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(I)所提供。也就是说，就这类组合物的长效IL-15受体激动剂组分而言，所述组合物中包含的不超过约15mol％的长效IL-15受体激动剂具有式(II)。在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含不超过约0.1mol％-20mol％的具有式(II)的化合物。在实施例中，这些组合物包含不超过约0.1mol％-15mol％、0.1mol％-10mol％、0.1mol％-5mol％、0.1mol％-1mol％、1mol％-20mol％、1mol％-15mol％、1mol％-10mol％、1mol％-5mol％、5mol％-20mol％、5mol％-15mol％、5mol％-10mol％、10mol％-20mol％、10mol％-15mol％、或15mol％-20mol％的具有式(II)的化合物。

在与前述相关的一些特定实施例中，关于式(Ia)，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(Ia)所提供。

在一些其他优选的实施例中，关于式(Ib)，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(Ib)所提供。

在一些其他实施例中，关于式(Ic)，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(Ic)所提供。

在一些其他实施例中，关于式(Id)，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％(mol％)的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)：

其中n和m的值如上文针对式(Id)所提供。

在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂包含不超过约0.1mol％-20mol％的具有式(II)的化合物，这些化合物包括具有式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)的化合物。在一些另外的实施例中，这些组合物包含不超过约0.1mol％-15mol％、0.1mol％-10mol％、0.1mol％-5mol％、0.1mol％-1mol％、1mol％-20mol％、1mol％-15mol％、1mol％-10mol％、1mol％-5mol％、5mol％-20mol％、5mol％-15mol％、5mol％-10mol％、10mol％-20mol％、10mol％-15mol％、或15mol％-20mol％的具有式(II)的化合物，这些化合物包括具有(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)的化合物。在一些实施例中，这些组合物包含不超过约0.1mol％、1mol％、5mol％、10mol％、15mol％、或20mol％的具有式(II)的化合物，这些化合物包括具有式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)的化合物。应当理解，可以通过本领域已知的方法针对具有式(I)的化合物纯化这些组合物，从而使得没有、痕量的、或基本上没有具有式(II)的化合物存在于该组合物中。

例如，在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时不超过约12摩尔％、或不超过约10摩尔％的由式(II)涵盖的长效IL-15受体激动剂，包括具有式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)的化合物。

在前述的一些另外的实施例中，该组合物包含不超过约7mol％的n’等于2、3或大于3(即，高级PEG聚体)的长效IL-15受体激动剂。在又一些其他实施例中，该组合物包含不超过约5mol％的n’等于2、3或大于3(即，2或更大)的长效IL-15受体激动剂。

在一些其他实施例中，所述组合物包含根据式(I)的长效IL-15受体激动剂，

其中n和m如上所述，并且n’表示(针对组合物的)共价连接至IL-15氨基基团的聚乙二醇部分的平均数目，并且针对组合物的n’在从1.0至约1.3的范围内。例如，每个IL-15部分的聚乙二醇部分的平均数目选自约1.0、1.1、1.2和约1.3。也就是说，优选的根据式(I)的长效IL-15受体激动剂在本文中可以称为“单PEG化”，其中应理解，关于如上所述的PEG化度存在一定可变性。在关于本文所述的式的一些优选的实施例中，“m”等于3。

长效IL-15R激动剂的组合物可以包含单一物种，其中n’等于约1并且该组合物中基本上所有的IL-15缀合物的PEG部分连接在同一位置；或替代性地，可以包含单PEG化缀合物物种的混合物，其中直链聚乙二醇部分的连接发生在白细胞介素-15部分上的不同位点，也就是说，其中组合物中包含的所有单PEG化IL-15物种的具体连接位点并不相同)。因此，这类组合物就连接至IL-15的PEG部分的数目而言是基本上均质的(例如，1聚体)，但就IL-15分子上氨基基团连接的位置而言是异质的。

虽然另外的PEG体系结构和键联化学可以用于实现长效IL-15R激动剂，但诸如前文描述的化合物在一个或多个实施例中是优选的，如在根据支持性实例考虑时将变得显而易见的。然而，还涵盖具有如本文提供的结构的另外的长效IL-15R激动剂。

在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时至少约80mol％的由式(I)(包括式(Ia-Id))涵盖的长效IL-15受体激动剂(该组合物中含IL-15的分子)。在一个或多个实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含至少约85mol％、90mol％、95mol％、98mol％或99mol％的具有式(I)的长效IL-15受体激动剂。

如上所述，长效IL-15R激动剂可以呈药学上可接受的盐的形式。典型地，此类盐通过与药学上可接受的酸或酸等效物反应而形成。术语“药学上可接受的盐”在此方面通常将是指相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过将如本文所述的长效白细胞介素-15受体激动剂与适合的有机酸或无机酸分别反应并分离因此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、草酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、和月桂基磺酸盐等。(参见例如，Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts”[药用盐],J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]66:1-19)。因此，如所描述的盐可以衍生自无机酸，这些无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；或由有机酸制备，这些有机酸诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯基乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、草酸、衣康酸等。

在一些实施例中，长效IL-15受体激动剂组合物包含在共同考虑时至少约1mol％-5mol％的游离IL-15蛋白质(该组合物中含IL-15的分子)。在一些其他实施例中，长效IL-15激动剂组合物包含不超过约0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、或5mol％的游离(即，未缀合的)IL-15。

为制备长效IL-15受体激动剂，IL-15部分可以例如在其氨基基团(例如，赖氨酸或N末端)处与用琥珀酰亚胺基基团(或其他活化酯基团)官能化的PEG试剂缀合。使用该方法，经琥珀酰亚胺基活化的PEG可以在水性介质中在约7.0到9.0的pH下与IL-15部分上的氨基基团连接，不过使用不同的反应条件(例如，诸如6至7或7至8的更低pH，或不同温度和/或小于15℃)可以导致PEG部分与IL-15部分上的不同位置连接。

长效IL-15R激动剂可以如在实例1中所述制备。例如，长效IL-15R激动剂通常可以通过使白细胞介素-15(例如，经纯化的IL-15，诸如重组IL-15)与经活化的PEG试剂(诸如，活化酯、甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯、mPEG-SBA)反应来制备。其他适合的经活化的PEG试剂包括丙酸甲氧基PEG-琥珀酰亚胺酯、戊酸甲氧基PEG-琥珀酰亚胺酯、和己酸甲氧基PEG-琥珀酰亚胺酯。虽然典型地使用琥珀酰亚胺基活化基团，但可以使用任何适合的活性酯或活化基团，其中这种反应基团适合于形成所希望的稳定酰胺键联。一般而言，将白细胞介素-15溶解于适合的缓冲液，例如像磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。PEG试剂可以通常以在适合的缓冲液中的溶液、与IL-15(相对于白细胞介素-15的摩尔量)等摩尔比添加，或者以至多约15倍摩尔过量，例如2倍摩尔过量、或5倍摩尔过量、或7倍摩尔过量、或10倍摩尔过量、或甚至12倍摩尔过量或更多的摩尔过量(基于IL-15的摩尔量)添加。在一些实施例中，PEG试剂在约5至10倍的摩尔过量下添加。PEG试剂可以以固体形式、或作为在合适溶剂(例如酸水溶液，诸如稀盐酸)中的溶液添加。

在方法的一些其他实施例中，白细胞介素-15最初(即，在与甲氧基PEG-琥珀酰亚胺基链烷酸酯试剂混合之前)以约0.5mg/mL至约10mg/mL的浓度存在于溶液中。在溶液中的另外的说明性浓度范围包括例如约0.5-5mg/mL、约0.5-4mg/mL、约0.5-3mg/mL、约0.5-2mg/mL、约0.5-1.5mg/mL、约0.5-1mg/mL、约1-10mg/mL、约1-5mg/mL、约1-4mg/mL、约1-3mg/mL、约1-2mg/mL、约1-1.5mg/mL、约1.5-10mg/mL、1.5-5mg/mL、约1.5-4mg/mL、约1.5-3mg/mL、约1.5-2mg/mL、约2-10mg/mL、约2-5mg/mL、约2-4mg/mL、约2-3mg/mL、约3-10mg/mL、约3-5mg/mL、约3-4mg/mL、约4-10mg/mL、约4-5mg/mL或约5-10mg/mL白细胞介素-15。在一些具体但非限制性实施例中，溶液中白细胞介素-15的浓度为约0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、或10mg/mL。

应当理解，可以使用任何适合的缓冲液或将任何适合的缓冲液添加到反应混合物中。一些示例性缓冲液包括磷酸钠(NaPi)、乙酸钠(NaAc)、硼酸盐、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、柠檬酸盐、和双-TRIS缓冲液。

在一些实施例中，在添加PEG试剂之前将IL-15溶液的pH调节至约pH 8。

在添加PEG试剂之后，然后可以在必要时将反应混合物调节至适合的pH，例如从约7.0-8.5、或至约8.0。在一些实施例中，将反应混合物调节至约7.0-8.0或至约7.4-8.5的pH。在一些特定实施例中，将反应混合物调节至约8.0的pH。应当理解，可以根据需要在添加PEG试剂之前和之后调节pH，以实现所希望的pH。

白细胞介素-15如同许多蛋白质一样尤其是在较高pH下经受脱酰胺化，而较低的pH水平可能导致大量可能的缺点，例如像在伊普西龙(ε)胺处较低的缀合度、和/或增加的和/或不希望的位置异构体、以及蛋白质聚集。脱酰胺化将负电荷引入蛋白质中，这可能导致蛋白质的活性、结构、功能、稳定性的变化并且/或者可能改变蛋白质对降解的易感性。因此，本发明激动剂和相关方法所解决的挑战之一是提供这样的长效白细胞介素-15受体激动剂，该激动剂维持足够的活性度(即，将为治疗上有用的)，同时除其他考虑之外至少平衡(i)所希望的缀合度，(ii)在与主题PEG试剂缀合之前和之后，白细胞介素-15部分的低脱酰胺化量(该脱酰胺化可能例如导致白细胞介素-15活性降低)，以及(iii)蛋白质聚集(例如，在缀合之前和之后)。

基于与用于制备如本文所述的长效白细胞介素-15受体激动剂的反应参数相关联的竞争且矛盾的挑战，本申请人已经发现，通过(在与PEG试剂反应之前或之后)调节白细胞介素-15溶液、和/或IL-15-PEG试剂反应混合物的pH，可以实现最佳(较低水平)的脱酰胺化，同时还促进PEG部分与白细胞介素-15部分(例如，在ε胺和N末端处)的缀合以提供如本文所述的长效IL-15R激动剂。虽然不受理论束缚，但基于其中多种反应参数变化的一系列反应，看起来从约7.0至约8.5、或从约7.5至约8.2、或从约7.8至约8.2、或在约8.0下的pH范围有效提供产物中较低的脱酰胺化水平，同时还促进PEG部分的缀合以形成如本文所述的产物，该产物还维持所希望的治疗概况。

例如，本文所述的方法有效产生少于约35％脱酰胺化、或在一些实施例中少于约30％脱酰胺化、或少于约25％脱酰胺化、或少于约20％脱酰胺化的PEG化白细胞介素-15。在一些实施例中，产物的脱酰胺化水平在从约20％-35％的范围内、或在约20％-25％的范围内、或在约25％-35％的范围内、或在约25％-30％的范围内。替代性地，在一些实施例中，涵盖脱酰胺化度小于上文陈述的PEG化白细胞介素-15。如实例1的实验2中所示，将pH调节在约7.0-8.5的范围内导致21.29％(组合物1)或33.26％(组合物2)的脱酰胺化水平。

通常将反应物混合至多且包括约5至10小时。在一些实施例中，将反应物混合至多且包括约2至5小时。在一些实施例中，将反应物混合至多且包括约2小时。在一些示例性实施例中，将反应物混合约30分钟至约3.0小时、或从约30分钟至2.5小时、或从约30分钟至2小时、或从约30分钟至1.5小时、或从约45分钟至约3.0小时、或从约45分钟至约2.5小时、或从约45分钟至约2.0小时、或从约45分钟至约1.5小时、或从约45分钟至约1.0小时。混合通常在温和条件(例如，从约20℃至约65℃、或从约20℃至约40℃)下、或在环境温度或室温(例如约22℃)下进行。可采用较低温度以有利于较低的PEG化度。可以例如通过添加氨基酸(诸如甘氨酸)来淬灭反应。

在实施例中，可以进一步调节组合物的pH以便减轻脱酰胺化。在一些实施例中，将组合物调节至约6.5-7.5或约6.5-7.0的pH。在一些实施例中，将组合物调节至约6.5、6.8、7.0或7.5的pH。

然后通常可以通过任何适合的方法(例如，离子交换色谱法)来纯化PEG化rIL-15反应产物以获得所希望的产物。例如，可以采用阴离子交换色谱法。然后可以将色谱法产物池浓缩并使用例如切向流过滤(TFF)渗滤到适合的配制品缓冲液(例如，含蔗糖的乙酸钠缓冲液)中。可以通过任何适合的方法进行分析，该方法例如像SDS-PAGE、反相HPLC或任何其他适合的分析方法。

如先前所述，IL-15部分上的氨基基团在IL-15部分与聚乙二醇部分之间提供连接位点以提供诸如由式(I)涵盖的长效IL-15R激动剂。例如，考虑到本文提供的示例性IL-15氨基酸序列，显然的是存在各自具有可用于缀合的ε-氨基酸的七个赖氨酸残基。此外，甲硫氨酸的N末端胺也可以充当与PEG部分的连接点。应当理解，聚乙二醇部分可以在赖氨酸或N末端胺位置中的任何一个或多个处连接。在一些实施例中，聚乙二醇部分连接位点位于Lys¹⁰和Lys¹¹(使用如例如SEQ ID NO:2中所示的编号或使用SEQ ID NO:1的Lys¹¹和Lys¹²)中的一个或多个处。在一些实施例中，聚乙二醇部分在N末端胺处连接。应当理解，赖氨酸位点中的任何一个都可以适合作为PEG部分的连接位点(例如SEQ ID NO:1的Lys³⁷或Lys⁴²)。在一些实施例中，长效白细胞介素-15受体激动剂包括位置异构体的混合物，其中聚乙二醇部分的共价连接主要位于N末端(也就是说，在位置异构体的集合中，与其他位置异构体相比时，具有在N末端连接的PEG部分的异构体以最高量存在)。

如果希望，则产物池可以通过以下方式进一步分离为位置异构体：反相色谱法，使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，使用适合的柱(例如可从诸如安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)或维达克(Vydac)的公司商购获得的C18柱或C3柱)；或离子交换色谱法，使用离子交换柱，例如可从安玛西亚生物科学公司获得的Sepharose^TM离子交换柱。可以使用任一方法来分离具有相同分子量的PEG-白细胞介素-15位置异构体(即位置同种型)。

适合于进行这种类型分离的凝胶过滤柱包括可从通用电气医疗集团(GEHealthcare)(英国白金汉郡(Buckinghamshire,UK))获得的Superdex^TM和Sephadex^TM柱。特定柱的选择将取决于所希望的分级分离范围。通常使用适合的缓冲剂(诸如磷酸盐、乙酸盐等)进行洗脱。可以通过多种不同方法分析所收集的级分，例如(i)针对蛋白质含量的在280nm的吸光度，(ii)使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准物的基于染料的蛋白质分析法，(iii)针对PEG含量的碘测试(Sims等人(1980)Anal.Biochem[分析生物化学],107:60-63)，(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色，以及(v)高效液相色谱法(HPLC)。

已发现本发明长效IL-15R激动剂具有某些显著且有利的特征。虽然据信下文所述的特征大体适用于如本文提供并由式(I)涵盖的化合物，但以下一个或多个特征可以特别由根据式(Ib)并且引申开来根据式(IIb)的化合物展现出。长效IL-15R激动剂可以具有以下特征中的一个或多个。例如，在一些实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)不超过约7倍的减少。例如，在一个或多个相关实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约6.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约6倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约5.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约4.5倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约4倍的减少、或EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约3.5倍的减少、或甚至EC50值(ng/mL，CTLL-2 pSTAT5)的不超过约3倍的减少。根据前述特征的示例性长效IL-15R激动剂在本文和随附实例中进行了描述。

如实例10中所述，说明性缀合物(1、3和5)的体外活性均诱导人PBMC中的IL-15信号传导，其中缀合物1有效力地诱导这种信号传导。进行进一步的实验以研究缀合物1对人CD8 T细胞、NK细胞和CD4 T细胞的体外活性(实例16、22和26-27)。如图10A-10B中所示，至少缀合物1诱导了与CD56亮和CD56浅细胞中的IL-15相比相似或增加的信号传导。虽然在接合CD8和CD56亮NK细胞方面，缀合物1的效力低于IL-15(实例22)，但重要的是注意到缀合物1实现了与常规IL-15相同的最大应答(参见图38A-38B)。如实例16中针对小鼠模型所述，缀合物1以两种不同剂量的单次注射诱导了CD8和NK细胞中持续的pSTAT信号传导。如在实例26的小鼠模型中所述，缀合物1的单次注射导致与IL-15相比的pSTAT5％增加。在小鼠模型中，NK细胞对单次剂量的缀合物的敏感性最高，之后是CD8 T细胞，其中对于所测试细胞，CD4 T细胞的敏感性最低。

缀合物1也诱导了非人类灵长类动物模型(实例27中的食蟹猴模型)中NK细胞、CD8T细胞和CD4 T细胞中的信号传导。与鼠类模型一样，NK细胞对缀合物1的诱导的敏感性最高。

在一些另外的实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少。也就是说，在一些相关实施例中，所述长效IL-15受体激动剂与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约45％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约40％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约35％的减少、或甚至展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约30％的减少。

优选地，所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约7倍的减少并且与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少，包括上述EC50值或K_D值减少的任何一个或多个特定组合。

任选地，长效IL-15受体激动剂包含在组合物中，该组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。示例性赋形剂包括但不限于选自下组的那些赋形剂，该组由以下组成：碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱、氨基酸、及其组合。

碳水化合物，诸如糖、衍生化糖(诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物)，可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃糖基山梨糖醇、肌醇、环糊精等。

赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，诸如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以及其组合。

组合物还可以包含用于防止或遏制微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明的一个或多个实施例的抗微生物剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、十六烷基吡锭氯化物、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞(thimersol)、及其组合。

抗氧化剂也可以存在于组合物中。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止缀合物或制剂的其他组分的变质。适用于本发明的一个或多个实施例的抗氧化剂包括例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、及其组合。

表面活性剂可以作为赋形剂存在。示例性表面活性剂包括：聚山梨醇酯，诸如“吐温20”和“吐温80”以及普郎尼克(pluronics)，诸如F68和F88(两者均可从新泽西州芒特奥利夫的巴斯夫公司(BASF,Mount Olive,New Jersey)获得)；脱水山梨糖醇酯；脂质，诸如磷脂，诸如卵磷脂和其他磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(但是优选不呈脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酯；类固醇，诸如胆固醇；以及IL-15螯合剂，诸如EDTA、锌和其他此类适合的阳离子。

酸或碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限制性实例包括选自下组的那些，该组由以下组成：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸、及其组合。适合的碱的实例包括但不限于选自下组的碱，该组由以下组成：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、富马酸钾、及其组合。

一种或多种氨基酸可以作为赋形剂存在于本文描述的组合物中。在此方面，示例性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及甘氨酸。另外的适合的药学上可接受的赋形剂包括例如在Handbook of Pharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册],第7版,Rowe,R.C.编辑,Pharmaceutical Press[医药出版社],2012中描述的那些。

组合物中包含的长效IL-15R激动剂的量将根据多个因素而改变，但是当该组合物在单位剂量容器(例如，小瓶)中储存时它最佳地将是治疗有效剂量。另外，可以将药物制剂收纳在注射器中。治疗有效剂量可以通过重复施用渐增量的长效IL-15R激动剂以便确定产生如本文所述的临床上所希望的终点的量来以实验方式确定。组合物中任何单独赋形剂的量将根据赋形剂的活性和组合物的特定需要而变化。典型地，任何单独赋形剂的最佳量通过常规实验确定，即通过制备含有不同量的赋形剂(范围从低到高)的组合物，检查稳定性和其他参数，并且然后确定在没有显著不利作用的情况下获得最佳性能的范围。

长效IL-15R激动剂适合于向罹患对用白细胞介素-15的治疗有应答的病状的患者施用。该方法包括通常以肠胃外方式向患者施用治疗有效量的长效IL-15R激动剂(优选作为药物组合物的一部分提供)。如先前所述，长效IL-15R激动剂可以以肠胃外(例如，肌内注射、皮下、静脉内、或腹膜内)方式施用。适合用于肠胃外施用的配制品类型包括注射即用型溶液、在使用之前与溶剂组合的干散剂、注射即用型混悬剂、在使用之前与媒介物组合的干的不溶性组合物以及在施用之前稀释的乳剂和液体浓缩剂等等。在一些特定实施例中，长效IL-15受体激动剂提供在适合于静脉内施用的配制品中，并且以静脉内方式施用。在一些其他实施例中，长效IL-15受体激动剂提供在适合于皮下施用的配制品中，并且以皮下方式施用。

施用长效IL-15受体激动剂(例如，作为药物组合物的一部分提供)的方法可以任选地进行为使激动剂定位到特定区域中。例如，也可以将包含激动剂的液体、凝胶以及固体配制品以手术方式植入患病区域内(诸如在肿瘤中、在肿瘤附近、在发炎区域中以及在发炎区域附近)。方便地，还可以对器官和组织成像以便确保所希望的位置更佳地曝露于缀合物。

施用的方法可以用来治疗通过施用长效IL-15R激动剂可得到补救或预防的任何病状，例如像癌症。例如，长效激动剂可以单独或与另一药物疗法组合使用以治疗罹患可对IL-15疗法有应答的病状(例如癌症)的患者。

如在此关于治疗患有癌症的患者所使用的，术语“治疗(treatment/treat/treating)”意指包括对受试者所罹患癌症的全谱干预，诸如施用组合以缓解、减缓、终止、或逆转癌症的一个或多个症状或即时未实际上消除也延迟癌症的进展。治疗可以包括例如减小症状的严重程度、症状的数目、或复发的频率，例如，抑制肿瘤生长、遏制肿瘤生长、或使已经存在的肿瘤消退。

例如，癌症或癌症相关疾病的改善可表征为完全或部分应答。“完全应答”是指不存在临床上可检测到的疾病，其中任何先前异常的X射线照像研究、骨髓、和脑脊液(CSF)或异常的单克隆蛋白测量都正常化。“部分应答”是指在不存在新的病灶下，所有可测量的肿瘤负荷(即，受试者中存在的恶性肿瘤细胞的数目、或测量的肿瘤块的体积或异常单克隆蛋白的数量)减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。术语“治疗”涵盖完全应答和部分应答二者。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调控的细胞生长为特征的生理病状。

如在此所使用的“肿瘤”和“实体肿瘤”是指所有病灶和赘生性细胞生长和增殖(不论是恶性的还是良性的)、以及所有癌变前和癌变细胞和组织。

示例性病状是癌症，例如像纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、头颈癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤(包括例如葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤和柔脑膜黑素瘤)、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、以及白血病。

在一种特定方法中，长效IL-15R激动剂用于治疗血液恶性肿瘤，诸如白血病或淋巴瘤。在又另一种方法中，长效IL-15R激动剂用于治疗实体癌。

在一些实施例中，长效IL-15R激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于受试者时有效刺激NK激活和/或增殖。

在如实例11中所述的示例性小鼠模型中，缀合物1有效诱导NK细胞的增殖和数目持续增加，如通过细胞数目的增加(细胞/μ，如图12B-12C中所示)以及Ki67％的增加(例如图11A)所示出的。将Ki67％用作增殖细胞的标记物。如在图12A-12D中所见，在所有成熟水平的NK细胞(末端效应细胞、前体NK细胞、高效应细胞和早期NK细胞)中均发现了细胞数目的增加。如实例17中所示，NK细胞数目的增加在所有剂量水平下持续至少96小时，其中中等剂量水平和高剂量水平持续至少144小时。与媒介物相比，在小鼠模型中施用缀合物1在所有剂量水平下诱导了持续至少120小时的Ki67％的增加。％Ki67至少中等剂量范围(例如0.1mg/kg和0.3mg/kg)诱导了持续至少144小时的Ki67％的增加。

缀合物1的效果可以用单次剂量进行诱导和持续。在如实例11中所述的示例性鼠类模型中，施用单次剂量的缀合物1诱导并持续了细胞数目的增加。单次剂量在鼠类CD49b细胞中诱导并持续了与相同水平下的重复(例如Q7dx3)给药相当的Ki67％水平(参见图28A)。

在一些其他实施例中，长效IL-15R激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用时有效增加NK细胞激活，如通过NK细胞的细胞毒性蛋白酶表达增加所证实的。在如实例28中所述的示例性非人类灵长类动物模型中，单次剂量的缀合物1诱导并增强了NK细胞溶解酶颗粒酶B和穿孔素的表达。如图48A-48C中所见，所有剂量水平均增加了颗粒酶B表达并且中等/较高剂量与给药前水平相比至少使表达(MFI)增至三倍。如图49A-49C中所见，所有剂量水平均增加了穿孔素表达并且中等/较高剂量与给药前水平相比使表达(MFI)加倍。因此，缀合物1有效增加NK细胞的细胞毒性。

在又一些其他实施例中，长效IL-15 R激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于受试者时有效支持CD8 T细胞存活和记忆形成。

在示例性小鼠模型中，在所有剂量水平下的单次剂量的缀合物1增加了细胞增殖，如通过CD8细胞中Ki-67阳性率％的增加(图30D)以及中央记忆和效应记忆CD8亚群的增加(图30E-30F)所示出的。如实例17中所示，在鼠类模型中施用缀合物1诱导了血液中总CD8 T细胞的显著增加(参见图30A)。最低的剂量增加了CD8 Tcm和CD8 Tem(参见图30B-30C)。在示例性鼠类模型中，与施用媒介物相比，缀合物1的单次静脉内注射将增加的细胞数目维持至少240小时(例如参见图30A)。值得注意的是，当以一些剂量水平施用缀合物1时，CD8和CD8记忆T细胞数目未在注射后240小时返回到基线。因此，缀合物1维持CD8+记忆T细胞群体持续延长的时间段。在所有剂量水平下，单次剂量的缀合物1也增加了所有CD8和CD8亚群体中的Ki-67阳性率，这表明这些细胞的增殖增加。用缀合物1重复给药导致CD8、CD8 Tcm、和CD8 Tem群体进一步增加(参见图31A-31C)。对于小鼠中CD8、CD8 Tcm、和CD8 Tem中的每一种而言，重复给药也导致细胞增殖的至少240小时的长期增加。

与施用媒介物相比，缀合物1也诱导了非人类灵长类动物模型(实例27中的食蟹猴模型)中NK细胞和CD8 T细胞的增殖和数目持续增加。缀合物1的每种剂量水平均诱导并持续了NK细胞数目的增加，持续至少14天(参见图44A)。在每种剂量水平下，缀合物1均诱导并持续了CD8 T细胞数目的增加，持续至少10天。

在又一个或多个其他实施例中，IL-15R激动剂以静脉内方式施用。在甚至其他实施例中，IL-15R激动剂以皮下方式施用。

在又一些其他实施例中，在施用后，IL-15R激动剂有效诱导淋巴细胞中持续的信号传导，从而导致CD8 T细胞的增殖和CD8中央记忆群体的优先扩增。

待施用的实际剂量将根据受试者的年龄、体重和一般状况，以及所治疗的病状的严重程度、健康专家的判断、和所施用的缀合物而变化。治疗有效量是本领域的普通技术人员已知的和/或在相关参考文本和文献中描述的。一般而言，治疗有效量将在从约0.001mg至100mg的范围内，优选在从0.01mg/天至75mg/天的剂量、并且更优选在从0.10mg/天至50mg/天的剂量。可以定期施用给定剂量直到例如临床医生确定实现适当的终点(例如、治愈、消退、部分消退等等)。

在一些实施例中，治疗有效剂量在从约0.25-25mcg/kg的范围内。在其他实施例中，治疗有效剂量在每天从约0.25mcg/kg至约0.1mg/kg、从约0.01mg/kg至约0.1mg/kg或每天从约0.03mg/kg至约0.1mg/kg或的范围内。在其他实施例中，治疗有效剂量在从约1-10mcg/kg、从约0.03mg/kg至约0.1mg/kg的范围内。在一些具体但非限制性实施例中，治疗有效剂量是约0.25mcg/kg、0.3mcg/kg、0.5mcg/kg、1mcg/kg、2mcg/kg、3mcg/kg、5mcg/kg、6mcg/kg、7mcg/kg、10mcg/kg,15mcg/kg、20mcg/kg、25mcg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、或0.1mg/kg。参考本文实例中所提及的剂量，本领域普通技术人员可以使用如本领域已知的转化法(例如Nair等人,J.Basic and Clin.Pharmacy[基础与临床药学杂志](2016)7:27-31)将动物(例如小鼠)剂量转化为人类中的相应剂量。

根据临床医师的判断、患者的需要等等，可以按多种给药方案施用单位剂量的任何给定缀合物(同样，优选作为药物制剂的一部分提供)。具体给药方案将是本领域的普通技术人员已知的或可以使用常规方法以实验方式确定。示例性的给药方案包括但不限于每日施用一次、每周施用三次、每周施用两次、每周施用一次、每月施用两次(例如q/14天)、每月施用一次(例如q/30或31天或q/21天)、及其任何组合。一旦已实现所希望的临床终点，就暂停或减少组合物的给药。在一些实施例中，可以施用一次单位剂量的任何给定缀合物以提供持续效果。

应理解，虽然已结合本发明的优选特定实施例描述本发明，但前述描述以及随后的实例旨在说明而不是限制本发明的范围。本披露范围内的其他方面、优点和修改对本发明所属领域的技术人员而言将是显而易见的。

在本文中所引用的所有文章、书籍、专利、及其他出版物通过援引以其全文并入本文。倘若本说明书的传授内容和通过援引并入的本领域之间不一致，则以本说明书中的传授内容和定义的含义为准(特别是关于在本文所附的权利要求中使用的术语)。例如，如果本申请和通过援引并入的出版物以不同方式定义了同一术语，则将该术语的定义保留在该定义所处文件的传授内容内。

实例

应理解，前述描述以及随后的实例旨在说明而不是限制本文提供的本发明的范围。其他方面、优点和修改对本披露所属领域的技术人员而言将是显而易见的。

在以下实例中，已努力确保所使用数字(例如量、温度等)的准确性，但应将一些实验误差和偏差考虑在内。除非另外指明，否则温度是以℃为单位并且压强是在或接近海平面的大气压。认为以下每个实例对于本领域普通技术人员进行本文所述的一个或多个实施例是有指导性的。

材料与方法

在以下实例中使用利用常规技术制备的重组IL-15(“rIL-15”)SEQ ID NO:1(如图1中所提供)，但可以类似地采用任何适合的IL-15部分。SEQ ID NO:1，一种来自大肠杆菌的重组人IL-15，是含有115个氨基酸的非糖基化单多肽链，分子量为12.9kDa。

反应性聚合物试剂，直链mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯(40kDa)(“mPEG-SBA”)具有以下结构，

其中n对应于提供重均分子量为约40千道尔顿的聚合物的单体亚基的数目，即，其中n是约909。适合使用的另外的mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸酯试剂包括重均分子量为例如约10kD、15kD、20kD、25kD、30kD、40kD、50kD或60kD的那些。此经活化的聚合物试剂在与IL-15的氨基基团(例如，赖氨酸或N末端)反应时有效形成IL-15部分与聚乙二醇部分之间的稳定的酰胺键联。

反应性芴基-PEG试剂PEG2-CAC-FMOC-20kD-NHS具有以下结构：

其中mPEG是甲氧基(聚乙二醇)并且聚合物试剂的重均分子量为约20千道尔顿(即，其中每个mPEG部分的重均分子量为约10千道尔顿)。另外的具有不同分子量的PEG2-CAC-FMOC试剂相应地命名为例如PEG2-CAC-FMOC-10kD-NHS、PEG2-CAC-FMOC-15kD-NHS、PEG2-CAC-FMOC-30kD-NHS、PEG2-CAC-FMOC-40kD-NHS，其中这类试剂具有上文所示的结构并且仅在连接至FMOC核心的“mPEG”的分子量方面不同。

SDS-PAGE分析

样品是使用英杰公司(Invitrogen)凝胶电泳系统(XCell SureLock Mini-Cell)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的。将样品与样品缓冲液混合。然后，将制备的样品装载到NuPAGE Novex预制凝胶中并且运行持续大约30分钟。

RP-HPLC分析

在安捷伦(Agilent)1200HPLC系统(安捷伦公司)上进行反相色谱(RP-HPLC)分析。使用多孔层(Poroshell)300SB-C3柱(2.1x 75mm，安捷伦公司)在60℃下分析样品。所使用的流动相是0.1％TFA/H2O(A)和0.1％TFA/CH3CN(B)。柱的流速是0.5ml/min。洗脱的蛋白质和PEG-蛋白质缀合物使用UV在280nm处检测。

生物测定

在CTLL-2细胞中基于STAT5磷酸化的效力测定(小鼠T细胞)

在磷酸化-STAT5测定中，在受体结合之后，下游细胞信号传导然后可以通过磷酸化激活信号转导及转录激活因子5(STAT5)以促进基因表达从而诱导细胞增殖。使用磷酸化-STAT5/总STAT5多重测定(马里兰州的Meso Scale Discovery公司)在CTLL-2细胞(鼠类T淋巴细胞系)中应答于样品和参考治疗持续约10分钟测量了磷酸化-STAT5激活。

在测定前一天，将CTLL-2细胞分离到新鲜生长培养基[RPMI 1640，补充有10％FBS、10％T-细胞培养补充物(目录号354115，马萨诸塞州图克斯伯里的康宁公司(Corning,Inc.,Tewksbury,MA))、2mM L-谷氨酸、以及1mM丙酮酸钠]。在测定那天，将细胞在测定培养基(RPMI 1640，补充有1％FBS、2mM L-谷氨酸、以及1mM丙酮酸钠)中预孵育至少4小时，并且然后以50,000个细胞/孔接种在96孔板中的测定培养基中。在即将测定之前在适当的缓冲液中制备测试物品的稀释物。通过将25X测试物品溶液转移到包含CTLL-2细胞的一式三份的孔中来引发对CTLL-2细胞的刺激。将这些板在37℃、5％CO₂下孵育10分钟，并且通过细胞裂解停止反应。在细胞裂解物中的磷酸化-STAT5和总STAT5蛋白质水平的检测是使用MSD磷酸化(Tyr694)/总STATa,b全细胞裂解物试剂盒(马里兰州的Meso Scale Discovery公司)进行的。在10分钟处理之后，从派普泰克公司(PeproTech)获得的重组人IL-15通过诱导CTLL-2细胞中的STAT5磷酸化证明了IL-15活性，其中平均EC₅₀为0.27ng/mL，这充当对照。

人PBMC-pStat5测定

IL-15或长效IL-15R激动剂对各种人淋巴细胞亚群体的效力是通过磷酸化-STAT5(Y694)剂量应答测定来确定的。由澳赛尔斯公司(AllCells)供应来自多种供体的冷冻人PBMC。将1x 10⁶个细胞/100ul在完全RPMI培养基中培养2小时并且然后与指定浓度(10,000ng/ml-0.001ng/ml连续稀释物)的IL-15或缀合物一起在37℃下孵育20分钟。然后将细胞固定(使用BD Cytofix)并透化(使用100％预冷甲醇)并且用针对CD3、CD4、CD8、CD4-Treg(CD4+CD25+Foxp3+)、CD56和磷酸化STAT5(Y694)的抗体染色，之后通过流式细胞术进行分析。使用浓度-应答关系计算EC₅₀值。

长效rIL-15受体激动剂对于IL-15Rα的受体亲和力

IL-15和示例性长效rIL-15受体激动剂的亲和力是使用表面等离子体共振(“SPR”)、使用BIAcoreTMSPR系统测量的。简言之，使用1:1的NHS:EDC混合物活化BiacoreCM5传感器芯片的表面以产生活性NHS酯。通过将山羊抗人Fc抗体注入10mM乙酸钠(pH 4)中持续五分钟使其与该表面共价连接。存在大约8000RU的抗体结合到该表面上。然后用乙醇胺淬灭任何剩余的NHS酯。

在每个注入循环开始时，在PBSP中通过五分钟注入步骤将IL-15-Rα-Fc捕获在传感器芯片通道上。典型地，150-200RU的受体结合在该表面上。

将长效rIL-15受体激动剂测试物品在PBS(含有0.05％吐温20和0.1mg/ml BSA)中稀释至10μM。制成一系列的3倍稀释物并且将其注入到涂覆有IL-15Rα的传感器芯片上。亲和力是通过分别测定k_a和k_d速率测量的，并且k_d与k_a之间的比率被用来计算K_d值。

实例1

制备长效IL-15受体激动剂，

单(甲氧基PEG-N-丁酰胺)_40kD白细胞介素-15

实验1：将2.7ml IL-15溶液(1.23mg/ml，在PBS缓冲液中，pH 7.4)转移到小反应瓶中。添加300μl在pH 8下的0.6M硼酸盐缓冲液以将pH调节至pH 8。将在-20℃下、在氩气下储存的mPEG-SBA(40kDa)升温到环境温度。将十倍过量(相对于IL-15的摩尔量)的mPEG-SBA-40K溶解在2mM HCl中以形成10％PEG试剂溶液。将10％PEG试剂溶液迅速添加到IL-15溶液中并充分混合。在添加mPEG-SBA-40K后，使用常规技术测定反应混合物的pH并调节至pH 8。为了使将mPEG-SBA-40K偶联到IL-15上(即，经由形成稳定的酰胺键联)，将反应溶液在室温下放置在慢速实验室旋转器上持续1.5小时以促进缀合。通过添加甘氨酸溶液迅速淬灭反应。

图2示出了在对缀合反应混合物进行RP-HPLC分析之后的色谱图。该反应产生40％的单缀合物(即，具有单个连接至IL-15的PEG部分)、24％的二缀合物(具有两个连接至IL-15的PEG)和6％的三缀合物(具有三个连接至IL-15的PEG)物种。反应混合物中保留大约30％未反应的IL-15，但没有优化反应条件。

通过阴离子交换色谱法、使用Q Sepharose高效柱并使用磷酸钠缓冲液作为洗脱相来分离所希望的单缀合物。将经纯化的单mPEG-SBA40K-IL-15缀合物(在本文中也称为单mPEG-丁酰胺-40K-IL-15或单(甲氧基PEG-N-丁酰胺)_40kD白细胞介素-15、或单mPEG_40K-C4-酰胺-IL-15)通过HPLC和SDS-PAGE来表征。对于剩余实例，经纯化的单mPEG-SBA40K-IL-15称为缀合物1。

图3提供了阴离子交换色谱柱的FPLC纯化图谱。图4示出了经纯化的单mPEG-SBA-40K-IL-15缀合物的SDS凝胶。如通过凝胶所指示的，经纯化的缀合物具有高水平纯度并且不含未反应的IL-15。图5示出了经纯化的单mPEG-SBA-40K-IL-15的RP-HPLC分析。如从HPLC结果可见，经纯化的单mPEG-SBA-40K-IL-15组合物包含少于约10％(摩尔量)的二或更高级的缀合物。

使用此相同方法，缀合物诸如单mPEG-SBA-10K-IL-15、单mPEG-SBA-15K-IL-15、单mPEG-SBA-20K-IL-15、单mPEG-SBA-25K-IL-15、单mPEG-SBA-30K-IL-15、单mPEG-SBA-40K-IL-15、单mPEG-SBA-50K-IL-15、和单mPEG-SBA-60K-IL-15使用具有不同重均分子量的mPEG-SBA制备。

实验2：将大约2mg/ml IL-15于缓冲液(50mM磷酸钠、100mM氯化钠、10％蔗糖，pH7.4)中的溶液转移到两个不同反应容器中的每一个中(在本文中称为组合物1和组合物2)。为将pH调节至8.0，添加在pH 8下的硼酸盐缓冲液(0.4M或0.6M)。将十倍过量(相对于IL-15的摩尔量)的稀释于2mM HCl中的mPEG-SBA-40K(mPEG-SBA，40kDa)添加到每种IL-15溶液中并充分混合。在添加mPEG-SBA-40K后，将反应混合物的pH确定为pH 8，或在必要时通过使用额外的硼酸盐缓冲液调节。反应中IL-15的终浓度的目标为1g/L，在必要时使用额外的稀释剂(将含有50mM磷酸钠、100mM氯化钠、10％蔗糖，pH 7.4的缓冲液用于组合物1并且将水用于组合物2)。为了使mPEG-SBA-40K与IL-15偶联(即，经由形成显著稳定的酰胺键联)，对于组合物1或组合物2分别将反应溶液在室温下混合45或60分钟以促进缀合。通过添加71倍过量的甘氨酸(相对于最初在pH 8.0下添加至反应物中持续30分钟的PEG的摩尔量将反应淬灭。对于组合物1，通过使用0.2M磷酸滴定至pH 7.0来调节pH。

将所得组合物通过反相HPLC(RP-HPLC)、SDS-PAGE、和离子交换HPLC(IEX-HPLC)来表征。RP-HPLC分析的结果提供于下表1A中。

表1A.

RRT是相对保留时间。

SEC-HPLC分析的结果提供于下表1B中。

表1B.

HMW＝具有3个或更多个共价连接至白细胞介素-15的PEG的高分子量mPEG-IL-15缀合物。

IEX-HPLC分析的结果提供于下表1B中。

表1C.

所制备的组合物主要包含mPEG-SBA-40K单PEG化物种，并具有少于10％的PEG二聚体(即，具有2个连接至IL-15的PEG部分)以及甚至更低量的高级PEG物种(即，具有3个或更多个连接至IL-15的PEG部分)。

此外，这些组合物具有相对较低的脱酰胺化度(在表1C中标识为“酸性区”)。组合物1是21.29％脱酰胺化的并且组合物2是33.26％脱酰胺化的。

实例2

制备长效IL-15受体激动剂，

在氮气吹扫下，将在-80℃下、在氮气下储存的mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS升温到环境温度。在2mM HCl中制备mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS的储备溶液(200mg/mL)，并且将mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS以范围从5:1至100:1的mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS与rIL-15的摩尔比添加到rIL-15中。混合物中rIL-15的终浓度是0.5mg/mL(0.031mM)。将碳酸氢钠缓冲液(1M，pH8.0)添加到混合物中以达到100mM的终浓度，并且使缀合进行三十分钟以提供[mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS]-[rIL-15]缀合物(其中该缀合物的非正式名称反映了用于制备该缀合物的聚合物试剂，应了解，对于一种或多种所得产物，聚合物试剂中的反应性部分已经被与IL-15(在该实例中)的键联置换)。三十分钟后，通过添加1M甘氨酸(pH6.0)至反应混合物中以使终浓度达到100mM来实现淬灭。然后在柱色谱法纯化和表征之前，使用冰醋酸将淬灭的反应混合物的pH调节至4.0。

通过RP-HPLC分析来分析反应混合物。依据SDS-PAGE，反应混合物包含约10％-20％的单缀合物、约50％-70％的二缀合物、和约20％-30％的三缀合物-也就是说，反应混合物主要包含二缀合物种。通过阴离子交换色谱法、使用Q Sepharose高效柱并使用磷酸钠缓冲液作为洗脱相来分离缀合物混合物以提供平均PEG化度为约2(PEG化度在约1.7-2.5的范围内)的经纯化的[mPEG2-CAC-FMOC-20kD-NHS]-IL-15，由此使得上文结构中的n’对于该经纯化的组合物是约2。

对于剩余实例，将经纯化的[mPEG2-CAC-FMOC-20kD-NHS]-IL-15称为缀合物2。

实例3

制备长效IL-15受体激动剂，

[单PEG2-RU-ButryALD-40K]-IL15

将支链mPEG-丁醛PEG试剂单PEG2-RU-ButryALD-40K，

用于制备主题长效IL-15R激动剂，其中用于制备该激动剂的PEG试剂的重均分子量是约40,000道尔顿。

将2.7ml IL-15(1.23mg/ml，在PBS缓冲液中，pH 7.4)转移到小反应瓶中，添加0.3ml 1M乙酸钠缓冲液(pH 5)以将pH调节至pH 6。将在-20℃下、在氮气下储存的mPEG2-ru-ButyrALD(40kDa)升温到环境温度。将十五倍过量(相对于IL-15的量)的mPEG2-ru-ButyrALD溶解在MilliQ H2O中以形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速添加到IL-15溶液中并充分混合，并且置于RotoMixer上持续15min。然后将1/100体积的1M NaCNBH3/H2O添加到反应混合物中。为了使mPEG2-ru-ButyrALD与IL-15经由仲胺键联偶联，将反应溶液放置在4℃下的RotoMixer上持续17小时并且然后用甘氨酸溶液淬灭。因为PEG化反应在酸性pH下进行，所以将PEG衍生物连接至IL-15对于N末端更有选择性。还开发使用Q Sepharose高效柱和磷酸钠缓冲液的阴离子交换色谱法来纯化缀合物。将经纯化的单PEG2-ru-ButyrALD-40K-IL-15缀合物通过HPLC和SDS-PAGE来表征。

对于剩余实例并且在随附披露内容中，将经纯化的[单PEG2-RU-ButryALD-40K]-IL-15(即，具有有着经由胺键联共价连接至IL-15的上文所示结构的单个PEG部分)称为缀合物3。

使用该相同方法，使用具有不同重均分子量的PEG2-RU-ButryALD-制备缀合物。例如，使用20kD聚合物试剂制备如上所述的单PEG2-RU-ButryALD-20K]-IL-15(在本文称为缀合物4)。

实例4

制备长效IL-15受体激动剂，

单mPEG-ButyrALD-40K-IL-15

将PEG试剂-具有结构

的直链mPEG-丁醛(40kDa)(“mPEG-ButyrALD”)用于制备主题长效IL-15R激动剂，其中用于制备该激动剂的PEG试剂的重均分子量是约40,000道尔顿。

将2.7ml IL-15(1.23mg/ml，在PBS缓冲液中，pH 7.4)转移到小反应瓶中，添加0.3ml 1M乙酸钠缓冲液(pH 5)以将pH调节至pH 6。将在-20℃下、在氮气下储存的mPEG-ButyrALD(40kDa)升温到环境温度。将十倍过量(相对于IL-15的量)的mPEG-ButyrALD溶解在MilliQ H2O中以形成10％试剂溶液。将10％试剂溶液迅速添加到IL-15溶液中并充分混合，并且置于RotoMixer上持续15min。然后将1/100体积的1M NaCNBH3/H2O添加到反应混合物中。为了使mPEG-ButyrALD与IL-15经由仲胺键联偶联，在4℃下将反应溶液放置在RotoMixer上持续17小时并且随后用甘氨酸溶液淬灭。因为PEG化反应在酸性pH下进行，所以将PEG衍生物连接至IL-15对于N末端更有选择性。还开发使用Q Sepharose高效柱和磷酸钠缓冲液的阴离子交换色谱法来纯化缀合物。经纯化的单mPEG-ButyrALD-40K-IL-15缀合物通过HPLC和SDS-PAGE来表征。

对于剩余实例，将单mPEG-ButryALD-40k-IL-15称为缀合物5。

实例5

长效IL-15受体激动剂对于IL-15Rα的受体偏倚评价

测量示例性长效IL-15受体激动剂(测试物品)对于IL-15α受体的亲和力并将其与IL-15比较。亲和力是通过BIAcore、使用通过固定化抗Fc捕获的IL-15Rα:Fc测量的。

将测试物品在PBS(含有0.05％吐温20和0.1mg/ml BSA)中稀释至10μM。制成一系列的3倍稀释物并且将其注入到涂覆有IL-15Rα的传感器芯片上。亲和力是通过分别测定k_a和k_d速率测量的，并且k_d与k_a之间的比率被用来计算K_d值。

优选的缀合物一般来说是与未经修饰的IL-15相比在PEG化之后尽可能多地保留IL-15Rα亲和力的那些。相反地，优选的缀合物一般来说是其中对IL-15Rα的亲和力相对于未经修饰的IL-15的亲和力减少最少的那些。

例如，在一些实施例中，优选的缀合物与IL-15相比展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约7倍的减少、以及受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少。例如，缀合物1与IL-15相比时具有约两倍的效力减少并且保留约80％的IL-15的α受体亲和力。

表2A.

测试物品	k<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>sec<sup>-1</sup>)	K<sub>d</sub>(sec<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(pM)
				IL-15	5.78x 10<sup>5</sup>	1.49x 10<sup>-4</sup>	258
缀合物1	4.92x 10<sup>5</sup>	1.03x 10<sup>-4</sup>	209

如上表中所指示，缀合物1保留其对IL-15α受体的高亲和力(即，与IL-15相比时)，这是一种对于长效IL-15受体激动剂特别优选的特征。下文提供另外的缀合物的亲和力常数(K_D)(以pM为单位)。

表2B.示例性长效IL-15受体激动剂的另外特征

实例6

体内研究：在小鼠中的单次剂量PK研究

向C57BL/6只小鼠(n＝3只/组)施用单次静脉内剂量的IL-15(对照)(以0.3mg/kg)或缀合物2(以0.3mg/kg的剂量)。在施用之后，在施用后的各个时间点(24小时、48小时、78小时、96小时)收集血液样品。将样品汇集并且针对淋巴细胞群体上的药物作用的药效动力学分析通过流式细胞术对这些样品进行评价，该分析表示为相对于媒介物对照的倍数变化(结果在下文的后续实例中描述)。除了细胞数目的变化之外，将功能标记物和活性标记物定量。最终，在每个时间点，测定药物的血浆浓度。参看图6。

如图6中所示，在施用之后，缀合物2在延长的时间段内(例如持续大于1周)维持血浆中可测量的浓度(实心正方形)，T_1/2为约20-30小时，相比之下，对于非长效IL-15观测到血浆水平的迅速下降(实心圆)。

实例7

体内研究：在大鼠中的单次剂量PK研究

向大鼠(n＝3只/组)以0.3、0.15和0.075mg/kg的剂量施用单次静脉内剂量的缀合物2、或以0.15mg/kg施用单次皮下剂量的缀合物2。在施用之后，在施用后第1-7天收集血液(其中在施用后前24小时内收集多个样品)。在每个时间点，测定药物的血浆浓度。参看图7。

如图7中所示，并且与图6中针对小鼠所示的结果相似，施用缀合物2导致持续的且与剂量成比例的药物暴露。

实例8

在小鼠中的体内IL-15信号传导研究

如上文实例6中所述向小鼠给药以评估体内信号传导，如通过STAT5磷酸化程度所评估的。各种淋巴细胞(CD4、CD8、和NK细胞)中的STAT5磷酸化度通过以下方式评估：针对白细胞表面标记物和pSTAT5对全血进行染色，之后通过流式细胞术测量。IL-15和缀合物2的结果分别示于图8A和8B中。

STAT5磷酸化是IL-15/IL-2受体信号传导中的早期且瞬态的事件。如在图8A中所见，IL-15的体内信号传导活性极其短暂，而示例性缀合物2诱导持久的STAT5磷酸化，该磷酸化在NK细胞(倒置的实心三角形▼)和CD8细胞(正常的实心三角形▲)中最显著，其中在超过72小时后在NK和CD8细胞中注意到可测量的STAT5磷酸化活性。还示出了CD4细胞的STAT5磷酸化活性(闭合正方形■)。

实例9

在非人类灵长类动物中的体内IL-15信号传导研究

在该研究中，将食蟹猴(cyno)(一只雌性和一只雄性)各自以静脉内方式施用单次剂量的缀合物2(0.5mg/kg)。在治疗之前(第-6天和第-1天)和在治疗之后多个时间间隔从每只动物中取出一系列血液样品以通过流式细胞术评估各种淋巴细胞类型(CD4、CD8和NK细胞)中的STAT5磷酸化。结果提供于图9A(CD4)、9B(CD8)、和9C(NK)中。

如图9A-9C中所示，结果与在小鼠(实例7)中观察到的相似，但在非人类灵长类动物中，也在CD4细胞中观察到了STAT5磷酸化(图9A)。三种细胞类型中每一种中的STAT5磷酸化在施用后显著上升，在施用说明性长效IL-15激动剂之后约3天与4天之间达到最大水平并且到约第5-10天返回到接近第-1天的水平(给药前)。与实例7相似，这些结果指示活性IL-15物种的持续存在。

实例10

示例性长效IL-15受体激动剂在人外周血单核细胞(PBMC)的NK

亚群中的体外IL-15活性

示例性长效IL-15受体激动剂(例如，缀合物1、3和5)的体外活性的评估是通过研究人PBMC的NK细胞亚群中的信号传导来进行的，如图10A(CD56亮细胞)和10B(CD56暗淡细胞)中所示。如先前针对评估长效IL-15受体激动剂的IL-15信号传导活性所述那样评价STAT5磷酸化。

表3.

结果示于图10A(CD56亮)和10B(CD56暗淡)中。

如可见的，每一种说明性缀合物均诱导人PBMC中的IL-15信号传导，而缀合物1有效力地诱导这种信号传导。在所测试的缀合物(未示出全部数据)中，缀合物1展示出对人PBMC最高的效力/活性。数据说明，即使在维持每个IL-15蛋白相同程度的PEG化度(即，PEG部分的数目)和相同大小的PEG部分时，不同的PEG体系结构和接头也可以对所得缀合物的生物活性引发非常不同的影响。

进行第二研究以研究/比较从两种供体获得的人PBMC(CD3、CD4、CD8、CD56(亮和暗淡)和CD4-Treg(CD25+Foxp3+))对IL-15、缀合物1和缀合物5的pStat5应答。使用剂量范围为0.001-10000ng/ml的10倍稀释物和20min刺激检查11点剂量应答。将每种测试物品稀释于IL-15缓冲液+0.1％BSA中。结果提供于下表中。

表4.CD3和CD4细胞中的pSTAT5％和pSTAT5 MFI

基于上表3中的数据，对于CD3和CD4诱导二者，IL-15的效力看起来比缀合物1强约4-6倍；对于CD3和CD4诱导，缀合物1和缀合物5的效力看起来是相似的。

表5.CD4-Treg和CD8细胞中的pSTAT5％和pSTAT5 MFI

基于上表5中的数据，对于Treg和CD8诱导，IL-15的效力看起来比缀合物1强大约3-5倍；对于CD4和CD8诱导，缀合物1和5的效力看起来基本上相似。

表6.CD56亮和CD56暗淡细胞中的pSTAT5％和pSTAT5 MFI

基于表6中的数据，对于CD56诱导，IL-15的效力看起来比缀合物1强约10倍。然而，在诱导CD56亮和CD56暗淡方面，缀合物1的效力看起来比缀合物5更强。

基于前述数据，IL-15、缀合物1和缀合物5对所有细胞群体显示出相似的pSTAT5诱导，看起来对于CD56亮和Treg细胞的最大应答是更高的。

表7.汇总表

基于前述数据，在诱导CD3、CD4、CD8和Treg细胞方面，IL-15的效力比缀合物1强大约3-4倍并且比缀合物5强大约5-8倍，而在诱导CD56亮和CD56暗淡细胞方面，IL-15比缀合物1强大约12倍并且比缀合物5强大约40-60倍-表明了缀合物1的某些不可预见并特别有利的特征。

实例11

体内研究：在小鼠中的单次剂量PD研究-细胞增殖和激活

向Balb/c小鼠(n＝3只/组)以0.03mg/kg(图11，低剂量)、0.3mg/kg(图11，中等剂量)或1mg/kg(图11，高剂量)的剂量施用单次静脉内剂量的媒介物(50mM磷酸钠、100mM氯化钠、10％蔗糖，pH 7.4)或缀合物1。在施用之后，在施用后的各个时间点(24小时、48小时、78小时、96小时、120小时)收集血液样品。通过流式细胞术对来自每只小鼠的样品进行对淋巴细胞群体上的药物作用的药效动力学分析。除了细胞数目的变化之外，还检查功能标记物和活性标记物。

以0.01mg/kg、0.1mg/kg和1.5mg/kg的剂量进行缀合物1的另外施用。

结果提供于图11A和11B中，这些结果说明了经施用0.03mg/kg(图11，低剂量)、0.3mg/kg(图11，中等剂量)和1mg/kg(图11，高剂量)缀合物1中的每一种的小鼠中NK细胞的增殖。

NK细胞及其增殖使用CD45+CD3-CD49b+和CD45+CD3-CD49b+Ki67+标记物组合定义。在给药之后，在运行FACS DIVA软件的Fortessa流式细胞仪上采集血液样品。将Flowjo软件用于分析并且使用Prism对NK细胞内的NK细胞绝对值和Ki67阳性率％进行绘图。

图11A是随时间的Ki67表达(以百分比计)的曲线；图11B提供了随时间的NK细胞数目。这些曲线说明了缀合物1在小鼠中诱导持续的NK细胞增殖的能力。

探索示例性长效IL-15受体激动剂对所有成熟水平的NK细胞的影响。外周NK细胞池可以通过CD27的表达来描绘，其中CD27^低/-NK细胞与CD27^高NK细胞相比具有更大的细胞毒性并产生更多的细胞因子(Hayakawa Y等人,J Immunol.[免疫学杂志]2006；176:1517-1524)。成熟外周NK细胞群体已经进一步细分为四个成熟阶段，这四个成熟阶段是通过CD11b表达的顺序上调、继之的CD27的下调定义的，其中最不成熟的NK细胞是CD27^-CD11b^-并且最成熟的NK细胞是CD27^-CD11b⁺(Chiossone L.等人,Blood[血液],2009；113:5488-5496)。

在小鼠中，NK细胞的四个不同成熟状态通过CD27和CD11b表达定义。一旦鉴定到NK标记物(CD49b+)、自然激活性NK受体(NKp46+)和IL-15/IL-2RB(CD122+)三重阳性细胞，就通过流式细胞术对不成熟(CD11b-CD27-)、早期(CD11b-CD27+)、高效应(CD11b+CD27+)和末端效应(CD11b+CD27-)NK细胞进行定量。

在以如上所述的0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、和1.5mg/kg接受缀合物1的单次剂量、或q7dx3方案的第三次剂量之后的小鼠中对各种成熟状态下的NK细胞进行定量。使用流式细胞术，通过CD49b、NKp46和CD122阳性率鉴定感兴趣的NK群体。然后使用CD11b和CD27将NK群体进一步区分为不成熟(CD11b-CD27-)、早期NK(CD11b-CD27+)、高效应(CD11b+CD27+)和末端效应(CD11b+CD27-)亚群体。在Fortessa流式细胞仪上运行外周血并且使用BD FACSDIVA软件，在样品采集期间使用计数珠测定每个群体的绝对值。流式细胞术分析使用Flowjo软件进行并在Prism中对数据绘图。

结果示于图12A-12D中。另外的结果示于图22A-22D中。q7dx3结果示于图28A-28D中。如从曲线可见，缀合物1有效增加所有成熟水平的NK细胞(末端效应细胞、前体NK细胞、高效应细胞和早期NK细胞)的数目。观察到所有成熟亚群体中NK细胞的剂量依赖性增加，该影响持续至少120小时。

使用对抗NKG2D信号的流式细胞术分析来表现NKG2D的表面表达，该信号表示为NK细胞中的平均荧光强度(MFI)。相似地，使用对抗颗粒酶B信号的基于流式细胞术的检测来表现胞内颗粒酶B的水平，该信号也表示为NK细胞中的MFI。在使用Fortessa流式细胞仪和FACS Diva软件检测NKG2D和颗粒酶B信号之后，使用Flowjo软件进行分析。使用Prism对MFI值进行绘图。结果示于图13A和13B中，这些结果进一步说明缀合物1增加NK细胞激活的能力，如通过缀合物1的以下能力所证实的：缀合物1与媒介物相比实现NK细胞对NKG2D和颗粒酶B(一种促凋亡丝氨酸蛋白酶)二者表达的持续增加，该增加对于中等剂量和高剂量的量最显著。在单次剂量的缀合物1之后观察到两种NK激活标记物的剂量依赖性增加。

在小鼠中，将CD8 T细胞定义为CD45+CD3+CD4-CD8+。使用Fortessa流式细胞仪对来自小鼠的血液和脾进行免疫表型分型，并使用Flowjo软件进行分析。在Prism中对绝对CD8细胞计数进行绘图，如图14(血液)和图24(脾)中所示。图14和图24说明在以上述每一种剂量的量在小鼠中单次静脉内施用之后，缀合物1诱导CD8 T细胞增殖和数目持续增加的能力。对于中等剂量(0.1mg/kg、0.3mg/kg)和高剂量(1.0mg/kg、1.5mg/kg)的量而言影响最显著。

在小鼠中，将CD8效应记忆(Tem)和CD8中央记忆(Tcm)T细胞鉴定为CD45+CD3+CD4-CD8+CD44+CD62-和CD45+CD3+CD4-CD8+CD44+CD62L+。这些记忆群体的增殖使用Ki-67阳性率进行。在单次剂量的缀合物1或IL-15之后，使用Fortessa流式细胞仪、DIVA采集软件和Flowjo分析软件对血液和脾进行免疫表型分型。在Prism中绘制曲线图。对于血液而言，缀合物1诱导效应和中央记忆CD8 T细胞二者的剂量依赖性增加，而单次剂量IL-15并未如此，如图15A和15B中所示。对于脾而言，缀合物1诱导Ki67和颗粒酶B二者的剂量依赖性增加，而单次剂量IL-15并未如此，如图25和26中所示。效应和中央记忆群体二者均应答于缀合物1(示例性长效IL-15激动剂)的施用而增殖。

实例12

体内研究：在非人类灵长类动物中的单次剂量PD研究

在该研究中，向食蟹猴(一只雌性和一只雄性)以静脉内方式施用500μg/kg的缀合物2。在治疗之前(第-6天和第-1天)和在单次剂量治疗之后的多个时间间隔从每只动物中取出一系列血液样品以通过流式细胞仪评估淋巴细胞数目(NK细胞、CD8 T细胞等)和激活。

测定NK细胞计数以评估示例性缀合物2在非人类灵长类动物中诱导持续的NK细胞增殖的能力；结果示于图16A和16B中。来自食蟹猴的血液中的NK细胞及其增殖通过流式细胞术来鉴定。NK细胞(CD45+CD3-CD16+)及其增殖状态(CD45+CD3-CD16+Ki67+)的采集和分析使用BD FACS DIVA软件进行。将NK细胞和增殖NK细胞的绝对值用于计算NK群体内的Ki67阳性率％。使用Prism对治疗前和治疗后的值进行绘图。

如其中所示，缀合物2的单次剂量施用有效诱导非人类灵长类动物中的持续NK细胞增殖。

还如图17中所示，针对每只动物测定从给药前至施用后14天的CD8 T细胞计数。具体地，将CD8 T细胞定义为CD45+CD3+CD4-CD8+。还如先前所述对来自猴的血液进行免疫表型分型。在猴中，CD8 T细胞以持续方式增加，该影响持续至少10天。该曲线进一步例证示例性长效IL-15受体激动剂缀合物2在施用后诱导CD8 T细胞增殖和数目持续增加的能力。

在猴中，将CD8 T_EM细胞定义为CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra-CD197-并且将CD8 T_CM定义为CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra-CD197+。免疫表型分型通过流式细胞术进行，其中在DIVA软件上进行样品采集并在Flowjo软件上进行数据分析。使用Prism绘制曲线图。分别测定每只动物从给药前至施用后14天的CD8 T效应记忆细胞(T_EM细胞)和CD8 T中央记忆细胞(T_CM)计数，如图18A和18B中所示。缀合物2诱导食蟹猴中CD8效应和中央记忆T细胞群体的显著且持续的增加。附图表明，CD8效应和中央记忆T细胞群体二者均应答于示例性缀合物2而增殖。

实例13

在BALB/C小鼠中对CT26诱导性皮下肺转移肿瘤模型的抗肿瘤活性的评价

在第0天，通过尾静脉注射用1×10⁵个小鼠CT-26细胞接种6-8周龄雌性Balb/c小鼠。在第1天，在施用CT-26细胞24h后，将小鼠分成十组。每组由6-9只动物(针对缀合物2)或9-12只动物(针对缀合物1)组成。(对于缀合物1和缀合物2的施用进行两项独立的研究，但两项研究中的研究方案实质上相同)。每组如下分配一次干预：媒介物，磷酸盐缓冲盐水(A组)；单独的初始IL-15(B组)；剂量为0.03mg/kg的缀合物2(C组)；剂量为0.1mg/kg的缀合物2(D组)；剂量为0.3mg/kg的缀合物2(E组)；剂量为1.0mg/kg的缀合物2(F组)；剂量为3.0mg/kg的缀合物2(G组)；对于缀合物1：媒介物，磷酸盐缓冲盐水(H组)；剂量为0.03mg/kg的缀合物1(I组)和剂量为0.3mg/kg的缀合物1(J组)。在第1天、第5天和第10天向动物给药。

从CT-26肿瘤细胞施用之日起的13天后，将小鼠麻醉，并收集血液和脾细胞以进一步分析免疫表型分型标记物，同时将肺在含有苦味酸和甲醛的包因氏(Bouins)液中固定24-48h。

在解剖下计数每个肺的肺肿瘤结节数目，并确定每组的平均肺结节。还使用非配对学生t检验在媒介物组与干预组之间获得了统计显著性。

分别对应于缀合物2和缀合物1的治疗组的肺转移结果示于图19和20中。虽然两种说明性长效IL-15受体激动剂均有效促进肺转移的减少，但缀合物2与媒介物相比提供了转移的65％减少，而缀合物1提供了转移的85％减少。

在第13天使用流式细胞术和与各种荧光染料缀合的标记物抗体分析血液和脾细胞的免疫表型分型标记物的变化。以0.3、1和3mg/kg施用的缀合物2相对于媒介物分别诱导了血液中CD8 T细胞1.5、2.5、和3.3倍的剂量依赖性增加。在脾中获得了相似的观察结果，相对于媒介物在0.3、1和3mg/kg剂量水平下增加1.3、1.7和2.2倍。Ki-67免疫表型分型揭示出CD8 T细胞增殖的显著剂量依赖性增加：在相同的低、中、和高剂量水平下，与媒介物相比，在血液中具有1.7、4.6和5.3倍变化，并且在脾中具有2.5、5.7、和6.9倍变化。另外，缀合物2治疗增加了血液和脾二者中CD8的促生存Bcl-2+MFI，多达1.5倍。

表8.

实例14

用缀合物1处理之后的NK细胞的体外和体内细胞毒性

使用基于流式细胞术的测定体外评价针对靶肿瘤细胞的NK细胞介导的细胞毒性。使用阴性选择磁性细胞分离(小鼠NK细胞富集试剂盒，干细胞技术有限公司(StemcellTechnologies))将NK细胞从Balb/c小鼠的脾中分离并将其用作效应细胞。对于体外研究，在用于细胞毒性测定之前，在处于37℃，5％CO₂下的加湿孵育箱中用浓度为3000、1000、300、30、3、或0(未刺激)ng/mL的缀合物1刺激经分离的NK细胞过夜。对于体内研究，用0.3mg/kg缀合物1向小鼠给药，并且在给药后24、48和72h分离脾NK细胞并将其直接用于细胞毒性测定。

将用PKH26标记的YAC-1T细胞用作靶细胞。为监测NK细胞细胞毒性，将NK和YAC-1细胞以各种效应物:靶标比(50:1、25:1、和12.5:1)在37℃，5％CO₂下共同培养4小时，然后用7-AAD染色10min以标记死亡细胞。立即使用流式细胞术分析细胞。将裂解的靶细胞鉴定为PKH26⁺7-AAD⁺。

体外结果：在共同培养4小时之后，通过流式细胞术评估细胞毒性。结果示于图21中。

体内结果：在以0.3mg/kg治疗之后，在24小时、48小时、和72小时之后评估细胞毒性。结果示于图27中。

该数据说明在用缀合物1处理之后体外和体内NK细胞的细胞毒性剂量依赖性增加。

实例15

缀合物1对颗粒酶B的诱导

在用缀合物1以0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和1.5mg/kg的剂量治疗之后测量随时间而变的NK细胞颗粒酶B表达。从给药后24至240小时收集全血以用于免疫表型分型。在红细胞裂解之后，用存活力染料和对CD45、CD3和CD49b具有特异性的标记物标记白细胞以鉴定活NK细胞。然后将细胞同时固定并透化以进行胞内颗粒酶B染色。将染色的血液在Fortessa流式细胞仪上运行、通过DIVA软件采集并使用Flowjo软件分析。将数据表示为对颗粒酶B表达呈阳性的NK细胞的百分比。

结果示于图23中。该数据表明用缀合物1治疗增加NK细胞的颗粒酶B表达。

实例16

体内研究：在小鼠中的单次剂量IL-15和缀合物1PK和JAK/STAT

信号传导研究

对于PK分析，在balb/c小鼠(n＝3)中以0.3mg/kg的单次静脉内剂量施用缀合物1。在施用之后，人道处死小鼠，并且在治疗后24、48、72、96、120和144小时收集血浆。根据独立的研究，向小鼠施用单次静脉内剂量的IL-15(0.5mg/kg)。在治疗6小时内的指定时间点收集来自这些小鼠的样品。[本文先前所述的PK方法]。对于药效动力学检查，使balb/c小鼠(n＝/组)接受0.03或0.3mg/kg的缀合物1或媒介物(50mM磷酸钠、100mM氯化钠、10％蔗糖，pH7.4)的静脉内注射并且在给药前和治疗后15min、1、24、48、72、96和120小时收集血液。将样品通过流式细胞术单独分析并且表示为CD8和NK细胞内的pSTAT5阳性率百分比。

图29A是在balb/c小鼠中分别以0.5和0.3mg/kg施用单次静脉内剂量的测试物品之后，在144小时时程期间测试物品(IL-15或缀合物1)的血浆浓度。

结果：缀合物1展现出大约12小时的半衰期，而IL-15从血浆中快速清除，半衰期小于1小时。

图29B是在以0.03和0.3mg/kg单次注射缀合物1之后，小鼠中CD8 T细胞内的pSTAT5阳性率百分比的曲线图。

结果：两种剂量水平下的缀合物1均诱导CD8 T细胞中持续的pSTAT5信号传导。示出了120小时时程，包括给药前。

图29C是在以0.03和0.3mg/kg单次注射缀合物1之后，鼠类NK细胞内的pSTAT5阳性率百分比的曲线图。

结果：两种剂量水平下的缀合物1均诱导NK细胞中稳健且持续的pSTAT5信号传导。

实例17

在小鼠中的体内单次和Q7DX3药效动力学研究-细胞数目和增殖

向Balb/c小鼠(n＝3只/组)施用单次剂量，或每周一次剂量、三次的缀合物1(以0.01、0.03、0.1、0.3、1或1.5mg/kg)或媒介物。处死小鼠并在施用后的各个时间点(24、48、72、96、120、144、240小时)收集血液。对来自每只小鼠的样品进行流式细胞术分析以检查淋巴细胞群体内的药效动力学作用和感兴趣的功能标记物(CD8 T细胞、CD8记忆T细胞和NK细胞的细胞计数以及每个群体内Ki-67的阳性率百分比)。结果示于图30A-30F、31A-31C、和32A-32C中。

图30A-30C是如实例17中所述，在以0.01、0.03、0.1、0.3、1或1.5mg/kg单次施用缀合物1之后，分别地总CD8、CD8中央记忆(Tcm)和CD8效应记忆(Tem)细胞数目的曲线。如实例17中所述，等于或大于0.03的剂量水平下的缀合物1诱导血液中总CD8 T细胞的显著增加。0.01mg/kg的最低剂量增加了CD8 Tcm和CD8 Tem。在0.3mg/kg下，缀合物1将CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem增加6.4X、37.9X和14.5X。值得注意的是，当以0.3-1.5mg/kg给药缀合物1时，CD8和CD8记忆T细胞数目未在注射后240小时返回到基线，这证明了缀合物1的持续PD效应。

图30D、30E和30F是如实例17中所述，小鼠中分别地总CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem群体内的Ki-67阳性率百分比的曲线。在所有剂量水平下，单次剂量的缀合物1增加了所有CD8和CD8亚群体中的Ki-67阳性率。

图31A、31B和31C是如实例17中所述，在以0.03和0.3mg/kg单次(虚线)或Q7dx3(实线)给药缀合物1之后的CD8和CD8记忆亚群体T细胞数目的曲线。重复给药进一步增加了这些群体，其中CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem分别增加35.3X、183X和73.8X。在时程结束(在0.3mg/kg下的第一次或最后一次剂量之后的240小时)时，小鼠中的细胞数目未返回到基线。

图32A和32B是如实例17中所述，在小鼠中单次给药从0.01至1.5mg/kg的缀合物1之后NK细胞数目和Ki-67阳性率百分比的曲线。在所有剂量水平下，NK细胞数目均高于剂量对照地显著增加，并且到给药后240小时时返回到基线。所有剂量水平均诱导NK细胞中Ki-67阳性率百分比的稳健增加。

图32C是如实例17中所述，在以0.03和0.3mg/kg单次(实线)或Q7dx3(虚线)给药缀合物1之后鼠类NK细胞数目的曲线。与单次剂量相比，以0.3mg/kg重复给药缀合物1诱导略微较少，但仍显著的NK细胞数目。用在0.03mg/kg下的单次相对于重复给药实现了类似的NK数目。

结果：等于或大于0.03的剂量水平下的缀合物1诱导血液中总CD8 T细胞的显著增加。0.01mg/kg的最低剂量增加了CD8 Tcm(中央记忆)和CD8 Tem(效应记忆)。在0.3mg/kg下，缀合物1将CD8、CD8 Tcm和CD8 Tem分别增加6.4X、37.9X和14.5X。值得注意的是，当以0.3-1.5mg/kg给药缀合物1时，CD8和CD8记忆T细胞数目未在注射后240小时返回到基线，这证明了缀合物1的有益的持续PD效应。

实例18

用缀合物1治疗的小鼠中体外NK细胞毒性的测量和血液NK细胞颗粒酶B分析

用缀合物1(0.006、0.03或0.3mg/kg)、IL-15(1mg/kg)或媒介物对照治疗Balb/c小鼠(n＝2只/组)。在治疗后24、72和96小时分离脾以实现NK细胞分离。将NK细胞通过基于磁体的阴性选择方法分离并以12.5:1、25:1和50:1NK(效应物)对YAC-1(靶细胞)比率(E:T)在37C，5％CO₂下孵育4小时。将YAC-1靶细胞预先标记并然后在NK细胞孵育之后用7AAD染色。通过流式细胞术进行对裂解(7AAD+)靶细胞(PKH26+)的检测。还在相同时间点收集来自这些小鼠的血液并对其进行对NK细胞的颗粒酶B表达的流式细胞术测量。结果示于图33A和33B中。

图33A说明了体外NK细胞毒性测定，该测定测量在小鼠中进行测试物品治疗之后，NK介导的靶细胞裂解的变化。示出了从用0.006、0.03或0.3mg/kg缀合物1或1mg/kg IL-15治疗的balb/c小鼠中分离的脾NK细胞对YAC-1细胞的特异性裂解百分比的指示小时下的时程。将来自用媒介物给药的小鼠的脾NK细胞充当对照。

结果：与来自以1mg/kg接受IL-15的单次注射的小鼠的NK细胞相比，以0.3mg/kg给药的缀合物1诱导的NK细胞毒性升高的幅度和持续时间更优异。

图33B是图33A中来自专用于NK体外细胞毒性测定的相同小鼠的血液NK细胞中颗粒酶B阳性率百分比的曲线图。

结果：以0.03和0.3mg/kg给药的缀合物1诱导NK颗粒酶B表达的显著增加，在0.3mg/kg下发现稳健且持续的升高。

实例19

在CT-26肺转移模型中的缀合物1单一药剂功效

使Balb/c小鼠接受1x 10⁵CT-26结肠直肠癌细胞的尾静脉注射。第二天，用缀合物1(0.03或0.3mg/kg)或媒介物对照每周一次地对小鼠(n＝9只/组)治疗两次。在第二次注射后五天，将小鼠人道处死并计数肺结节。结果提供于图34A和34B中。

图34A和34B说明了在接受静脉内CT-26肿瘤细胞注射、继之以0.03或0.3mg/kg间隔一周地给药两次的缀合物1治疗的balb/c小鼠中的肺结节抑制百分比。

结果：以0.03和0.3mg/kg的缀合物1注射分别将肺结节形成抑制了40％和80％。对以0.3mg/kg给药的相同小鼠随访，持续肿瘤细胞注射后的32天以评估存活率。与接受媒介物对照的注射肿瘤的小鼠相比，用缀合物1治疗显著增加存活率。

实例20

在CT-26肺转移模型中对缀合物2功效的NK细胞依赖性的评估

向CT-26小鼠(n＝7-11只/组)注射抗脱唾液酸GM1以耗尽NK细胞或注射两种不同的对照(IgG或PBS)，然后注射1x10⁵个CT-26肿瘤细胞。然后用在肿瘤细胞注射后第1天、第5天和第10天以0.3mg/kg给药的缀合物2或媒介物对照治疗小鼠。在治疗最后一天后三天将小鼠处死并且计数肺结节。结果示于图35中。

图35是示出了接受抗体介导的NK细胞耗尽(橄榄绿)、IgG对照(蓝色)、或PBS(橙色)的用缀合物2治疗的注射CT-26的小鼠中的肺结节抑制百分比的图。数据以相对于未进行NK细胞耗尽并且用媒介物对照(黑色)治疗的注射CT-26的小鼠的肺结节抑制百分比表示。当小鼠缺乏NK细胞时，该肿瘤模型中的缀合物2功效被消除。

实例21

在非人类灵长类动物中的缀合物1单次剂量的体内药效动力学研究

在该研究中，将食蟹猴(cyno)(一只雌性和一只雄性)各自以静脉内方式施用单次剂量的缀合物1(0.1mg/kg)。在14天时程内从每只动物中取出一系列血液样品并对其进行各种淋巴细胞的流式细胞术分析(CD8 T细胞、总CD8内的Ki-67阳性率百分比、CD8中央记忆T细胞(Tcm)和CD8效应记忆T细胞(Tem)、NK细胞和NK细胞的Ki-67阳性率百分比)。结果示于图36A-36D和37A-37B中。

图36A和36B是说明以下的曲线：在以0.1mg/kg的剂量静脉内施用缀合物1之后，一只雄性(虚线)和一只雌性(实线)cyno的CD8细胞数目和作为增殖量度的Ki-67阳性率百分比的两周时程。如可见的，缀合物1诱导cyno中显著的CD8 T细胞增加，在单次剂量之后细胞数目增加7-10X。

图36C和36D说明了在单次注射缀合物1之后cyno CD8 Tcm和CD8 Tem细胞数目的增加。CD8 Tcm和Tem数目分别增加了27-30X和21-33X。

图37A和37B是在以0.1mg/kg单次给药缀合物1之后cyno中NK细胞数目和Ki-67阳性率百分比的曲线图。在用缀合物1治疗之后，NK细胞增加了9-10X。

实例22

IL-15和缀合物1在人PBMC中的CD8和CD56亮NK细胞中的体外活性的比较

对缀合物1的体外活性评估通过研究在以0.001-10000ng/ml的剂量范围用IL-15或缀合物1处理人PBMC之后的NK和CD8 JAK/STAT信号传导来进行。如先前所述那样评估STAT5磷酸化。

表9.

结果示于图38A和38B中；这些图是针对人PBMC的IL-15(●)相对于缀合物1(■)治疗以及随后对CD8和CD56亮NK细胞中的pSTAT5阳性率百分比的测量的EC50曲线。

结果：在接合CD8和CD56亮NK细胞方面，缀合物1的效力比IL-15分别弱5.5和15X。然而，重要的是缀合物1实现与常规IL-15相同的最大应答。

实例23

体内研究：在小鼠中的单次剂量PK研究

向Balb/c小鼠(n＝3只/组)施用单次静脉内剂量的IL-15(500ug/kg)或缀合物1(以10、30、100、300和1000μg/kg)。在施用后的指定时间点(缀合物1：24、48、72、96、120、144、240小时；IL-15对照：0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8小时)收集血液样品并且测定药物的血浆浓度。参看图39。

如图39中所示，与针对被迅速清除的非长效IL-15观察到的血浆水平相比，缀合物1显示出延长的药代动力学即血浆中可测量的浓度，半衰期为大约14小时。

实例24

体内研究：在大鼠中的单次剂量PK研究

以10、75和150μg/kg向斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)大鼠(n＝3)施用单次静脉内剂量的缀合物1。在注射后的指定时间点(0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144小时)测定药物的血浆浓度。参看图40。

如图40中所示，在施用之后，与针对图40中所示被迅速清除的非长效IL-15观察到的血浆水平相比，缀合物1展现出持续的药代动力学，即血浆中可测量的浓度，半衰期为大约18小时。

实例25

体内研究：在非人类灵长类动物中的单次剂量PK研究

以10、50和100μg/kg向食蟹猴(n＝2，1只雄性和1只雌性)施用单次静脉内剂量的缀合物1。以50μg/kg下的单次静脉内剂量施用IL-15作为对照。在注射后的指定时间点(0.03、0.25、1、4、12、24、48、72、96、120、144、168小时)测定药物的血浆浓度。参看图41。

如图41中所示，与被从血浆迅速清除的非长效IL-15相比，缀合物1展现出持续的药代动力学，即血浆中可测量的浓度，对于100μg/kg剂量的半衰期为大约30小时。

缀合物1在单次剂量之后在多个物种(小鼠、大鼠和食蟹猴)中实现了延长且持续的血浆暴露(参见图39-41)。

实例26

体内研究：在小鼠中的单次剂量PD研究-细胞数目、增殖和JAK/STAT信号传导的接合

向Balb/c小鼠(n＝3只/组)施用单次静脉内剂量的媒介物(如实例11中所述)或缀合物1(以0.3mg/kg或0.03mg/kg的剂量)。在施用之后，在施用后的时间点(24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、240小时)收集血液样品。对样品进行免疫表型分型以获得指定时间点处的CD4 T细胞数目(参见图42A)和Ki-67％(参见图42B)。

CD4 T细胞及其增殖分别通过CD45+CD3+CD4+CD8-和CD45+CD3+CD4+CD8-Ki-67+标记物定义。图42A是随时间的CD4 T细胞数目的曲线并且图42B是随时间的通过Ki-67阳性率％测量的CD4 T细胞增殖的曲线。与CD8和NK细胞相比，CD4 T细胞是对缀合物1治疗敏感性最低的群体，其中数目和Ki-67表达％的增加相对较小(在给药后72-144小时观察到的)(参看例如实例11)。在小鼠中，NK细胞相比于CD4 T细胞或CD8 T细胞对通过缀合物1的单次剂量施用所引起的增殖应答刺激的敏感性更高。

通过使用CD3+CD4+CD8-pSTAT5+标记物组合确定CD4 T细胞中的STAT5磷酸化。图43是在0.03mg/kg(蓝色，实心正方形)或0.3mg/kg(橙色，实心圆形)的剂量下，随时间(在施用后0.25、1、6、24、48、72、96和120小时)CD4 T细胞内的pSTAT5磷酸化阳性率百分比的曲线。还示出了随时间的媒介物(黑色)和给药前(空心圆)水平。

结果：与CD8和NK细胞相比，CD4 T细胞是对缀合物1治疗敏感性最低的群体，其中pSTAT5表达的增加相对较少(在给药后0.25至72小时观察到的)。在小鼠中，与CD8 T细胞或CD4 T细胞相比，NK细胞在增殖应答方面对单次剂量的缀合物1刺激的敏感性更高。

实例27

体内研究：非人类灵长类动物(NHP)中的最小有效剂量研究

向食蟹猴(n＝3-4只雄性)施用缀合物1(以0.003、0.01、0.1mg/kg)或媒介物对照的单次静脉内注射。在给药前和给药后的指定时间点(-5、-2、1、2、3、4、5、6、7、10、14、17天)收集血液样品并且对其进行流式细胞术分析以检查淋巴细胞群体内的药效动力学作用。检查NK、CD8 T、和CD4 T细胞的细胞数目，结果示于图44A-44C中。检查NK细胞、CD8 T细胞、和CD4 T细胞的增殖(Ki-67％)和JAK/STAT信号传导(pSTAT5％)，结果分别示于图45A-45C和图46A-46C中。检查CD8亚群体(T_初始、T_em、T_cm和T_scm)的增殖(Ki-67％)，结果示于图47A-47D中。

在NHP中，在单次剂量的缀合物1之后，NK(CD45+CD3-CD16+)细胞数目显著地并以剂量依赖性方式增加。在0.1和0.01mg/kg剂量水平下，在给药后五天观察到最大细胞数目并且持续长达14天。产生NK细胞的显著增加的最低剂量水平是0.01mg/kg。在证实NK细胞数目的观察结果的情况下，缀合物1还驱动了Ki-67表达的剂量依赖性且稳健的诱导，该Ki-67表达在治疗后大约3至4天达到最大值，并且可以持续长达约14天。可以在0.001mg/kg剂量水平之后检测到Ki-67％显著的增加。缀合物1还稳健接合NK细胞中的JAK/STAT信号传导途径，其中pSTAT5％呈剂量依赖性增加，这可以在低至0.001mg/kg的剂量水平下检测到。

图44A、45A和46A分别是在缀合物1治疗之后NK细胞数目、Ki-67％和pSTAT5％随时间的曲线。

在NHP中，缀合物1诱导了总CD8 T细胞(定义为CD45+CD3+CD4-CD8+)的显著增加，最大细胞数目在治疗后大约第5天达到。该影响持续超过七天，在给药后10至14天之间返回到基线。可以在0.003mg/kg下检测到缀合物1对总CD8细胞数目的影响。支持这些发现，缀合物1诱导了CD8 T细胞中的大量Ki-67阳性率％，这可以在0.01mg/kg的低剂量下检测到。在CD8 T细胞中缀合物1对JAK/STAT信号传导途径的接合也是稳健的，其中pSTAT5在0.1和0.01mg/kg剂量水平下剂量依赖性增加。

图44B、45B和46B分别是在缀合物1治疗之后CD8细胞数目、Ki-67％和pSTAT5％随时间的曲线。

与NK和CD8 T细胞相比，缀合物1对NHP中的总CD4 T细胞(定义为CD45+CD3+CD4+CD8-)具有相对较小的影响。以0.1mg/kg的最高剂量水平给药的缀合物1诱导了CD4 T细胞数目、Ki-67％和pSTAT5％的较小增加。

图44C、45C和46C是在缀合物1治疗之后CD4 T细胞数目、Ki-67％和pSTAT5随时间的曲线。

在NHP中，与体内CD8 T细胞或CD4 T细胞相比，NK细胞的缀合物1剂量应答敏感性最高。

在食蟹猴中，CD8初始和记忆亚群体通过CD45Ra、CD197和CD95定义。对CD8 T初始(CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra+CD197+)、CD8 Tscm(CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra+CD197+CD95+)、CD8 Tem(CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra-CD197-)和CD8 Tcm(CD45+CD3+CD4-CD8+CD45Ra-CD197+)的增殖(Ki-67％)的检查揭示，与CD8初始T细胞相比，CD8记忆亚群体对缀合物1的敏感性增加。在CD8 Tem、Tcm和Tscm群体内，缀合物1以剂量依赖性方式诱导了稳健的Ki-67表达％，增殖标记物阳性率的可检测增加早在第2天开始，在第5天达到最大值并且在第10-14天之间返回到基线。CD8群体内的Ki-67表达和动力学支持实例27和图47A-47D中所示的CD8 T细胞数目的持续增加。

图47A-47D是在缀合物1治疗之后CD8 T_初始、T_scm、T_cm和T_em群体的Ki-67％随时间的曲线。如图中所见，在NHP中，与体内初始CD8 T细胞相比，CD8 T细胞记忆群体显示出对单次剂量的缀合物1的敏感性增加。

实例28

缀合物1对颗粒酶B或穿孔素的诱导

在单次剂量的缀合物1之后，在食蟹猴中检查NK细胞溶解酶、颗粒酶B和穿孔素的表达。在0.001mg/kg、0.01mg/kg或0.1mg/kg剂量水平下在NK细胞内通过平均荧光强度(MFI)定量颗粒酶B和穿孔素的表达。在0.01和0.1mg/kg下，缀合物1将颗粒酶B的MFI增加了大约3倍(峰值，相对于给药前)。在0.01和0.1mg/kg下，缀合物1也将穿孔素的MFI增加了大约2倍(峰值，相对于给药前)。总而言之，缀合物1不仅诱导NK细胞的稳健扩增，而且增强其功能。

图48A-48C是在以下两个时间处的颗粒酶B的曲线并且图49A-49C是以下两个时间处的穿孔素MFI的曲线：在NHP中，在给药前(基线)和在缀合物1治疗(0.0001-0.1mg/kg)后的峰值水平时间处。

缀合物1增加了NHP NK细胞中细胞毒性酶(诸如组成性表达的颗粒酶B和穿孔素)的蛋白质水平。

序列表

SEQ ID NO:1(rhIL-15)

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

Claims (24)

1.一种长效IL-15受体激动剂，所述激动剂包含经由酰胺键联稳定地共价连接至IL-15的氨基基团的单个直链聚乙二醇(PEG)部分，其中介于所述PEG部分与连接到所述IL-15氨基基团的所述酰胺键联之间的是具有从2至5个碳原子的直链未取代的亚烷基基团(～CH₂～)_m，以及其药学上可接受的盐形式。

2.如权利要求1所述的长效IL-15受体激动剂，其中m是选自由2、3、4、和5组成的组的整数。

3.如权利要求1或权利要求2所述的长效IL-15受体激动剂，其中所述未取代的亚烷基基团选自(～CH₂～)₂、(～CH₂～)₃、(～CH₂～)₄、或(～CH₂～)₅。

4.一种长效IL-15受体激动剂，结构为：

其中IL-15是白细胞介素-15部分，n是从约150至约3,000的整数；m是从2-5的整数，n’是1，并且所述结构中的～NH～表示所述IL-15部分的氨基基团。

5.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中n是从约200至约2000、或从约400至约1300、或从约450至约1200的整数。

6.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中m是2或3。

7.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中m是3。

8.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中n是具有对应于聚乙二醇聚合物的值的整数，所述聚乙二醇聚合物具有选自下组的重均分子量，该组由以下组成：10,000道尔顿(约227)、15,000道尔顿(约340)、20,000道尔顿(约454)、25,000道尔顿(约568)、30,000道尔顿(约681)、40,000道尔顿(909)、50,000道尔顿(约1136)以及60,000道尔顿(约1364)。

9.一种组合物，所述组合物包含如权利要求7-11中任一项所述的长效IL-15受体激动剂，所述组合物包含在共同考虑时不超过约15摩尔％的由下式涵盖的长效IL-15受体激动剂：

10.如任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物包含在共同考虑时不超过约10摩尔％的由式(II)涵盖的长效IL-15受体激动剂。

11.如任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物包含在共同考虑时不超过约7摩尔％的由式(II)涵盖的长效IL-15受体激动剂。

12.如任一前述权利要求所述的组合物，所述组合物包含在共同考虑时不超过约5摩尔％的由式(II)涵盖的长效IL-15受体激动剂。

13.一种组合物，所述组合物包含根据式(I)的长效IL-15受体激动剂，

其中IL-15是白细胞介素-15部分，n是从约150至约3,000的整数；m是从2-5的整数，n’是1，并且所述结构中的～NH～表示所述IL-15部分的氨基基团，并且n’表示所述组合物中共价连接至IL-15氨基基团的聚乙二醇部分的平均数目，其中针对所述组合物的n’在从1.0至约1.3的范围内。

14.如任一前述权利要求所述的组合物，其中针对所述组合物的n’选自1.0、1.1、1.2和约1.3。

15.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约7倍的减少。

16.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中所述长效IL-15受体与IL-15相比时选自下组的EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的减少，该组由以下组成：EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约6.5倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约6倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约5.5倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约5倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约4.5倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约4倍的减少、EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约3.5倍的减少、以及EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约3倍的减少。

17.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，所述长效IL-15受体激动剂与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少。

18.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂，其中所述长效IL-15受体激动剂在与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约45％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约40％的减少、或展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约35％的减少、或甚至展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约30％的减少。

19.如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体，其中所述长效IL-15受体激动剂与未经修饰的IL-15相比时展现出EC50值(ng/mL，CTLL-2pSTAT5)的不超过约7倍的减少并且与IL-15相比时展现出受体α结合(K_D，pM)的不超过约50％的减少。

20.一种药学上可接受的组合物，所述组合物包含如任一前述权利要求所述的长效IL-15受体激动剂、或如权利要求12-22中任一项所述的组合物、以及药学上可接受的赋形剂。

21.如任一前述权利要求所述的长效IL-15 R激动剂或组合物，所述激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于哺乳动物受试者时有效刺激NK激活和增殖。

22.如任一前述权利要求所述的长效IL-15 R激动剂或组合物，所述激动剂或组合物在以治疗有效剂量施用于受试者时有效支持CD8 T细胞存活和记忆形成。

23.一种通过以下方式治疗对用IL-15的治疗有应答的病状的方法：向患有所述病状的受试者施用治疗有效剂量的如任一前述权利要求所述的长效IL-15R激动剂或组合物。

24.一种用于通过向患有癌症的受试者施用治疗有效剂量的如任一前述权利要求所述的长效IL-15R激动剂或组合物来治疗癌症的方法。

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