ES2640343T3

ES2640343T3 - Composición de transglutaminasa anhidra

Info

Publication number: ES2640343T3
Application number: ES09735163.9T
Authority: ES
Inventors: Mark Brader; Thomas Falck; Gunhild Klarskov Kristiansen
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2029-04-20
Also published as: CN102065844A; EP2268267B1; MX2010011208A; CA2722230A1; US20110165140A1; KR101710471B1; KR20160124245A; KR20110015552A; AU2009240026A1; JP2011518206A; KR101897534B1; US10391062B2; MX349837B; EP2268267A2; WO2009130181A2; PL2268267T3; RU2010145064A; CA2722230C; JP6244079B2; RU2616847C2

Abstract

Una composición de Factor XIII anhidra, dicha composición se puede obtener liofilizando una composición acuosa que comprende un compuesto de Factor XIII, una sal de cloruro sódico y al menos un componente adicional seleccionado del grupo compuesto por un azúcar, un aminoácido y un tampón, donde la concentración de sal de cloruro sódico en la composición acuosa está en el intervalo de 10 a 75 mM y donde el compuesto de Factor XIII es un compuesto de Factor XIII recombinante.

Description

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DESCRIPCION

Composicion de transglutaminasa anhidra CAMPO DE LA INVENClON

La presente invencion se refiere a composiciones de transglutaminasa, en particular composiciones liofilizadas estables de Factor XIII de coagulacion sangumea, segun se define en las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

Las transglutaminasas son enzimas dependientes de Ca2+ que catalizan la formacion de enlaces isopeptidicos en las protemas entre el grupo y-carboxamida de la cadena lateral de glutamina y el grupo £-amino de la cadena lateral de lisina. Las transglutaminasas se encuentran tanto extracelular como intracelularmente. Algunos ejemplos de transglutaminasas incluyen el Factor XIII, transglutaminasas epidermicas, transglutaminasas de tipo II (transglutaminasas de tipo tisular, transglutaminasas hepaticas) y transglutaminasas de tipo I (transglutaminasas queratinocfticas).

El Factor XIII de coagulacion sangumea (FXIII) es una transglutaminasa plasmatica tambien conocida como “fibrinoligasa” y “factor estabilizante de fibrina”; circula en el plasma con una concentracion de 20 microgramos/mL. Esta protema existe en el plasma como un tetramero compuesto por dos subunidades A y dos subunidades B (A2B2). Cada subunidad tiene un peso molecular de aproximadamente 80 000 Da y la protema completa tiene un peso molecular de aproximadamente 330 000 Da. Las subunidades A contienen el sitio catalftico de la transglutaminasa, mientras que las subunidades B no tienen actividad catalttica, sino que actuan como una protema estructural que protege a las subunidades A de ser eliminadas.

El Factor XIII depende de trombina y Ca2+ para su activacion. La trombina escinde el lado C terminal de la Arg37 en las subunidades A, con lo cual libera el peptido de activacion (residuos 1-37 de la subunidad A) y las subunidades B y deja la forma activa del dfmero A2. La subunidad A2 del FXIII activado (FXIIIa) es la forma catalfticamente activa del FXIII.

La enzima FXIII es la ultima enzima que se activa en la cascada de coagulacion y sirve para entrecruzar cadenas de a- y y-fibrina, lo que da como resultado un coagulo mas fuerte con una resistencia mayor a la fibrinolisis. Ademas, se entrecruzan una serie de protemas antifibrinolfticas, prohemostaticas y adhesivas en el coagulo, con lo cual proporcionan una estructura de fibrina fuerte con mayor resistencia mecanica a la disolucion mediante plasmina y otras enzimas proteolfticas.

Los preparados de Factor XIII o transglutaminasa purificados o parcialmente purificados que se pueden adquirir de distribuidores comerciales, en muchos casos, contienen estabilizantes anadidos tales como seroalbumina humana (HSA, por sus siglas en ingles). El uso de estabilizantes proteicos es problematico, puesto que disminuye la actividad proteica espedfica, aumenta la carga proteica cuando se administra a los pacientes y puede interferir con la determinacion de la pureza. Tambien puede hacer que el preparado proteico sea inmunogenico. Estas desventajas de los estabilizantes proteicos los hacen particularmente desfavorables para la estabilizacion de protemas altamente purificadas tales como protemas recombinantes. Asimismo, el uso de estabilizantes proteicos causa contaminacion potencial con antfgenos virales cuando se anade, por ejemplo, albumina.

El FXIII, aislado a partir de placenta o plasma o en forma de plasma fresco congelado, se ha empleado durante muchos anos para el tratamiento de la deficiencia de Factor XIII. Estas formulaciones, sin embargo, presentan las desventajas de contener protemas exogenas, con todos los problemas asociados a estas tales como inmunogenicidad indeseada.

Actualmente es posible preparar transglutaminasas y Factor XIII utilizando tecnologfa de ADN recombinante. Segun se utiliza en la presente, rFXIII se refiere a Factor XIII recombinante. Sin embargo, hasta la fecha no hay ningun producto rFXIII que se pueda adquirir de distribuidores comerciales en el mercado.

La composicion y actividad de los preparados proteicos utilizados en terapia debe ser estable durante periodos de tiempo relativamente largos. Solo rara vez es posible conseguir esta estabilidad en disolucion y, por lo tanto, tales productos se comercializan habitualmente en estado anhidro. Una criodesecacion suave (liofilizacion) es uno de los metodos elegidos para secar tales productos. Sin embargo, incluso cuando se utiliza este metodo, es diffcil conseguir preparados estables que cumplan los requisitos de integridad y durabilidad.

La criodesecacion de disoluciones de transglutaminasa o Factor XIII puede en algun caso, por ejemplo, llevar a una marcada cafda en la actividad y perdida de pureza. Un problema adicional para la criodesecacion de, por ejemplo, el Factor XIII, lo crea un producto de degradacion del Factor XIII, la denominada especie activada de forma no proteolftica (FXIIIa0), tambien conocida como Factor XIII preactivado. Se cree que el FXIIIa0 entrana un grave riesgo de toxicidad y la inyeccion de este puede potencialmente causar efectos secundarios no deseados. Es por tanto

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deseable estabilizar las formulaciones de transglutaminasa o Factor XIII frente a la formacion de productos activados de forma no proteolttica.

Se tiene constancia de varias composiciones de FXIII anhidras en la tecnica anterior. A continuacion, se exponen ejemplos de descripciones de algunas composiciones de FXIII liofilizadas. El documento JP-A-2003 055257 describe una composicion que contiene Factor XIII, sacarosa, un L-aminoacido y albumina, que esta criodesecada y se reconstituye posteriormente. El documento EP-A-0 499 679 describe un proceso para producir un concentrado de Factor XIII en forma liofilizada. El documento WO-A-0029041 describe composiciones congeladas y lfquidas de Factor XIII que contienen una sal de citrato y estabilizantes adicionales. Kreilgaard et al. describen en Arch. Biochem. Biophys. 360(1), 1998, 121-134, un estudio sobre los efectos de aditivos en la estabilidad de rhFXIII en el solido anhidro durante la criodesecacion y el almacenamiento. El documento WO2002/36155 describe que se puede formular una composicion de FXIII liofilizada con EDTA 1 mM, glicina 10 mM, 2% de sacarosa en agua, o con histidina 20 mM, 3% de sacarosa p/vol., glicina 2 mM y 0.01% de polisorbato p/vol., a pH 8.0. El documento US 6204036 (Aventis Behring) trata sobre una formulacion de transglutaminasa liofilizada estable que comprende al menos un aditivo seleccionado del grupo de D- y L-aminoacidos y sales, derivados, homologos y dfmeros de estos, azucares y alcoholes de azucares, ingredientes tensioactivos y agentes reductores con la condicion de que el aditivo no sea glicina ni arginina, donde la formulacion no contiene ningun estabilizante proteico y donde dicha formulacion es soluble sin ninguna turbidez en un disolvente acuoso adecuado para la administracion parenteral.

Estas formulaciones mencionadas anteriormente, sin embargo, pueden presentar la desventaja, descrita anteriormente, de contener altos niveles de Factor XIII activado de forma no proteolttica, lo que se considera un obstaculo para la viabilidad clmica y comercial de estas formulaciones. Es evidente, por lo tanto, que se desean en gran medida formulaciones de Factor XIII y transglutaminasa anhidras estables con bajos niveles de productos activados de forma no proteolttica. Ademas, tales formulaciones no debenan requerir la adicion de estabilizantes proteicos, por ejemplo, HSA.

COMPENDIO DE LA INVENCION

La presente invencion se basa en el sorprendente descubrimiento de que las sales, p. ej. sales monovalentes, confieren un efecto estabilizante significativo a las composiciones de transglutaminasa anhidras, p. ej. Factor XIII, en lo que respecta a la pureza y a la formacion de transglutaminasas preactivadas. Se muestra que este efecto es espedfico para el estado anhidro y tiene una particular relevancia para la produccion de un producto comercial estable.

En un aspecto, la presente invencion proporciona una composicion de Factor XIII anhidra; dicha composicion se puede obtener liofilizando una composicion acuosa que comprende un compuesto de Factor XIII, una sal de cloruro sodico y al menos un componente adicional seleccionado del grupo compuesto por un azucar, un aminoacido y un tampon, donde la concentracion de la sal de cloruro sodico en la composicion acuosa se encuentra en el intervalo de 10 a 75 mM y donde el compuesto de Factor XIII es un compuesto de Factor XIII recombinante. En aspectos adicionales, la presente divulgacion proporciona un metodo para preparar dicha composicion de transglutaminasa anhidra, una disolucion reconstituida, una composicion farmaceutica y un metodo de tratamiento.

Otros objetos, caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente memoria descriptiva detallada. Se debena sobrentender, sin embargo, que la memoria descriptiva detallada y los ejemplos espedficos, si bien indican realizaciones preferidas de la invencion, se aportan unicamente a modo de ilustracion.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Evaluacion de los niveles de sacarosa y NaCl. Analisis Modde del efecto de NaCl 25 Mm en la pureza mediante AIE-HPLC de muestras almacenadas a 40 °C.

Figura 2: Estudio factorial completo de los niveles de NaCl e histidina. Analisis Modde de los datos de rFXIIIa° a 25 °C.

Figura 3: Estudio factorial completo de los niveles de NaCl e histidina. Analisis Modde de los datos de pureza mediante AIE-HPLC.

DEFINICIONES

Las expresiones transglutaminasa “preactivada” o “activada de forma no proteolttica”, en relacion con la presente invencion, se refieren a una transglutaminasa que ha sido activada de forma no proteolftica, por ejemplo, cuando el Factor XIII se activa sin la presencia de trombina (la trombina tiene la capacidad de escindir el FXIII proteolfticamente), se dice que se activa de forma no proteolftica; para consultar algunas referencias remftase a, por ejemplo, Polgar J., et al. Biochem J 1990; 267: 557-60. Muszbek L. et al. Thrombosis Research 94 (1999) 271-305. El Factor XIII activado de forma no proteolftica (FXIII°), que es un producto de degradacion de FXIII, constituye una

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amenaza para la viabilidad de una composicion farmaceutica de FXIII porque se cree que este producto de degradacion entrana un grave riesgo de toxicidad.

La expresion “biologicamente activo” segun se utiliza en la presente significa que tiene actividad en un ser vivo tal como actividad medica, agncola o cosmetica.

La expresion “composicion acuosa”, en relacion con la presente invencion, se refiere a una composicion que comprende agua Kquida. Tal composicion es habitualmente una disolucion o una suspension. La expresion “composicion acuosa” segun se emplea en el contexto de la presente invencion se refiere a una formulacion que comprende al menos un 50% en peso (p/p) de agua.

El termino “diluyente”, en relacion con la presente invencion, se refiere a una suspension o disolucion lfquida. El termino “diluyente” segun se emplea en el contexto de la presente invencion se refiere a una disolucion o una suspension que comprende al menos un 50% en peso (p/p) de agua. En el contexto de la presente invencion el diluyente se utiliza en la reconstitucion de la composicion de transglutaminasa anhidra.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona composiciones anhidras de Factor XIII, en particular composiciones liofilizadas estables del Factor XIII de coagulacion sangumea (FXIII), segun se definen en las reivindicaciones. La divulgacion tambien proporciona metodos para preparar dichas composiciones anhidras de transglutaminasa, disoluciones reconstituidas, composiciones farmaceuticas y metodo de tratamientos.

La presente invencion proporciona un producto que comprende una transglutaminasa, que es un Factor XIII, con un nivel de pureza y un nivel de preactivacion que se mantiene aceptable a lo largo del proceso de fabricacion, almacenamiento y periodo de uso del producto de transglutaminasa.

La composicion de la presente invencion, que proporciona una mejora en la estabilidad respecto al nivel de preactivacion y respecto a la pureza total, comprende una composicion de Factor XIII anhidra, dicha composicion se puede obtener liofilizando una composicion acuosa que comprende un compuesto de Factor XIII, una sal de cloruro sodico y al menos un componente adicional seleccionado del grupo compuesto por un azucar, un aminoacido y un tampon, donde la concentracion de la sal de cloruro sodico en la composicion acuosa se encuentra en el intervalo de 10 a 75 mM y donde el compuesto de Factor XIII es un compuesto de Factor XIII recombinante.

En un aspecto de la divulgacion, la composicion anhidra de la presente invencion comprende una composicion de transglutaminasa anhidra, dicha composicion se puede obtener liofilizando o secando mediante atomizacion una composicion acuosa que comprende una transglutaminasa, una sal y al menos un componente adicional seleccionado del grupo compuesto por un azucar, un aminoacido y un tampon, donde la concentracion de la sal en la composicion acuosa se encuentra en el intervalo de 5 a 100 mM, con la condicion de que la composicion no sea una composicion de Factor XIII anhidra obtenida liofilizando una disolucion de Factor XIII que contiene un 0.5% de NaCl y un 2.25% de glicina.

En una realizacion, la composicion anhidra de la presente invencion no contiene ningun estabilizante proteico tal como albumina.

Componentes de la composicion

La composicion de la presente divulgacion comprende una transglutaminasa. Algunos ejemplos de transglutaminasas que se podnan estabilizar con la formulacion de la presente divulgacion incluyen Factor XIII, transglutaminasas epidermicas, transglutaminasas de tipo II (transglutaminasa de tipo tisular, transglutaminasas hepaticas) y transglutaminasas de tipo I (transglutaminasa queratinocftica).

Factor XIII

En un aspecto de la divulgacion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar o secar mediante atomizacion comprende un compuesto de Factor XIII. El compuesto de Factor XIII puede ser, por ejemplo, un Factor XIII natural de origen natural y variantes alelicas naturales del Factor XIII. Estos compuestos de FXIII se pueden originar, por ejemplo, a partir de fuentes humanas o de otros animales, p. ej., FXIII humano, FXIII porcino y FXIII bovino. La secuencia de origen natural del Factor XIII humano se puede encontrar, por ejemplo, en los documentos EP 268772 y EP 236978. El compuesto de Factor XIII de la presente divulgacion incluye el tetramero zimogeno del Factor XIII completo (A2B2) y el Factor XIIIa, asf como las subunidades de este, incluida la subunidad A y los dfmeros A2.

El compuesto de FXIII de la presente invencion es un compuesto de Factor XIII recombinante. Los compuestos de Factor XIII pueden ser, por ejemplo, fragmentos, derivados o variantes biologicamente activos del Factor XIII que conservan al menos parte de la actividad de entrecruzamiento caractenstica del Factor XIII de origen natural. Esta actividad de entrecruzamiento se puede medir mediante metodos conocidos en la tecnica.

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En algunas realizaciones, los fragmentos, derivados o variantes biologicamente activos del Factor XIII conservan un 10%, un 20%, un 30%, un 40%, un 50%, un 60% un 70%, un 80%, un 90% o un 100% de la actividad de entrecruzamiento del Factor XIII de origen natural.

Los fragmentos, derivados y variantes del Factor XIII incluyen variantes sustitucionales, insercionales y delecionales. Las variantes insercionales comprenden fusiones de grupos amino y/o carboxilo terminales, asf como inserciones intrasecuenciales de un unico o multiples residuos de aminoacidos. Las inserciones se pueden introducir, por ejemplo, dentro de la secuencia de codificacion madura de la protema Factor XIII de tipo natural. Las variantes delecionales se caracterizan por la eliminacion de uno o mas residuos de aminoacidos de la protema Factor XIII de tipo natural. Estas variantes se preparan normalmente mediante mutagenesis de nucleotidos de sitios espedficos en el ADN que codifica la protema, con lo cual se produce ADN que codifica la variante, y posteriormente se expresa el ADN en un cultivo celular recombinante. Sin embargo, los fragmentos de protemas variantes se pueden preparar tambien mediante smtesis in vitro. Si bien el sitio para la introduccion de una variacion en la secuencia de aminoacidos normalmente esta predeterminado, no es necesario que la mutacion en sf este predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar la eficiencia de una mutacion en un sitio determinado, se pueden llevar a cabo mutagenesis aleatorias en el codon o region objetivo y examinar las variantes de protema expresadas en busca de la combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para llevar a cabo mutaciones sustitucionales en sitios predeterminados del ADN que tienen una secuencia conocida son muy conocidas, por ejemplo, mutagenesis del cebador M13. Las variantes sustitucionales son aquellas donde al menos una secuencia de un residuo se ha eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoacidos son habitualmente de residuos unicos; las inserciones normalmente seran del orden de aproximadamente desde 1 hasta 10 residuos de aminoacidos y las delecciones variaran desde aproximadamente 1 hasta 30 residuos. Las delecciones o las inserciones se pueden llevar a cabo, por ejemplo, en pares adyacentes, es decir, una deleccion de 2 residuos o una insercion de 2 residuos. Se pueden combinar sustituciones, delecciones, inserciones o cualquier combinacion de estas para llegar a un constructo final. Obviamente, las mutaciones que se llevaran a cabo en el ADN que codifica la protema variante no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearan regiones complementarias que podffan producir una estructura secundaria de ARNm. Un ejemplo de una variante de Factor XIII geneticamente modificada es la variante Val34Leu del Factor XIII humano de origen natural (es decir, una variante en la cual el residuo de Val en la posicion 34 de la secuencia de aminoacidos del Factor XIII humano de origen natural se reemplaza por un residuo de leucina).

El Factor XIII de la presente divulgacion se puede purificar a partir de una amplia variedad de materiales biologicos, incluidos lisados, homogeneizados o extractos de celulas que producen de forma natural un Factor XIII, pero tambien de celulas que han sido modificadas geneticamente para que produzcan un Factor XIII tales como celulas de levadura transformadas con ADN que codifica un Factor XIII. Un ejemplo de un metodo para purificar Factor XIII se describe en el documento WO/2006/021584.

El Factor XIII de la presente invencion se puede preparar, por ejemplo, mediante tecnologfa de ADN recombinante. Los metodos para preparar Factor XIII recombinante se conocen en la tecnica. Remftase a, por ejemplo, Davie et al., EP 268 772, Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279-283 y Broker et al., FEBS Lett. 1989, 248: 105-110. En una realizacion, el dfmero A2 del Factor XIII se prepara citoplasmaticamente en la levadura Saccharomyces cerevisiae segun se describe en la solicitud de patente de Ee. UU. con n.° de serie 07/741 263. Las celulas se recolectan y se lisan, y se prepara un lisado limpiado. El lisado se fracciona mediante cromatograffa de intercambio anionico a pH desde neutro hasta ligeramente alcalino utilizando una columna de agarosa derivatizada tal como DEAE Sepharose™ de flujo rapido (Pharmacia) o similar. El Factor XIII se precipita a continuacion a partir del eluato de la columna concentrando el eluato y ajustando el pH a 5.2-5.5 tal como mediante diafiltracion frente a un tampon de succinato amonico. El precipitado se disuelve a continuacion y se purifica adicionalmente utilizando tecnicas cromatograficas convencionales tales como filtracion en gel y cromatograffa de interaccion hidrofoba. De acuerdo con la presente invencion, el Factor XIII es un Factor XIII recombinante. En una realizacion de la presente invencion, el Factor XIII es Factor XIII humano. En una realizacion de la presente invencion, el Factor XIII es Factor XIII humano recombinante. En una realizacion de la presente invencion, el Factor XIII es un dfmero de subunidades A.

La concentracion de Factor XIII en la composicion acuosa que se ha de liofilizar puede variar, por ejemplo, en un amplio intervalo, y en una realizacion esta en el intervalo de 0.003-100 mg/mL, en una realizacion adicional en el intervalo de 1-30 mg/mL y en otra realizacion adicional en el intervalo de 2-15 mg/mL.

Sales

La composicion acuosa de la invencion comprende una sal de cloruro sodico. La sal se utiliza para mejorar la estabilidad de la composicion anhidra en cuanto a la preactivacion y en cuanto a la pureza total. El diluyente de la divulgacion puede, por ejemplo, comprender una sal o mezclas de sales. En algunos aspectos de la divulgacion la sal es una sal monovalente. Algunos ejemplos de sales monovalentes que se pueden utilizar, por ejemplo, incluyen, sin caracter limitante, cloruro sodico, cloruro potasico, acetato sodico, sulfato sodico, gluconato sodico y mezclas de

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estas. En algunos aspectos de la divulgacion, la sal es una sal divalente. En algunos aspectos, la sal es una sal divalente con la condicion de que la sal divalente no sea una sal de Ca (II).

La concentracion de NaCl empleada puede variar dentro del intervalo de 10-75 mM, en realizaciones adicionales en los intervalos de 15-70 mM, 25-75 mM y 20-60 mM, y en otra realizacion adicional en el intervalo de 25-50 mM.

Azucares y alcoholes de azucares

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar comprende uno o mas azucares o alcoholes de azucares. El diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada puede comprender, por ejemplo, uno o mas azucares o alcoholes de azucares. Los azucares o alcoholes de azucares se pueden utilizar para estabilizar las protemas en la composicion anhidra de la invencion durante la criodesecacion evitando efectos desestabilizantes ffsicos/qmmicos (p. ej. despliegue). Algunos ejemplos de azucares o alcoholes de azucares que se pueden utilizar, por ejemplo, incluyen sacarosa, manitol, trehalosa, lactosa, maltosa, sorbitol, rafinosa, dextrinas, ciclodextrinas y los derivados, homologos y mezclas de estos.

La concentracion de azucar y alcohol de azucar empleado puede variar, por ejemplo, en un amplio intervalo, y en una realizacion esta en el intervalo de 0.1-15% (p/p), en una realizacion adicional en el intervalo de 0.1-8.5% (p/p) y en otra realizacion adicional en el intervalo de 0.5-5% (p/p).

Aminoacidos

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar comprende uno o mas aminoacidos. En algunas realizaciones de la presente invencion, el diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada puede comprender uno o mas aminoacidos. Los aminoacidos se pueden utilizar, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la composicion liofilizada o secada mediante atomizacion. En una realizacion, el o los aminoacidos se utilizan para reducir la formacion de agregados de la transglutaminasa, p. ej., el FXIII durante el almacenamiento de la composicion. Algunos ejemplos de aminoacidos que se pueden utilizar incluyen glicina, histidina, arginina, acido glutamico, metionina, treonina, lisina, alanina, isoleucina y cistema (Gly, His, Arg, Glu, Met, Thr, Lys, Ala, Ile y Cys) y las sales, derivados, homologos, dfmeros, oligomeros y mezclas de estos.

Los derivados y homologos adecuados son muy conocidos. Los derivados adecuados incluyen esteres, tioesteres y amidas del grupo carboxilo, derivados acilados del grupo amino, incluidos derivados de uretano; y esteres, amidas y esteres de grupos funcionales de cadena lateral. Los homologos adecuados incluyen, por ejemplo, ornitina (homologo de lisina), homoserina y acido or-aminobutmco. Las sales fisiologicamente aceptables tambien son muy conocidas en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Science: Drug Receptors and Receptor Theory, (18.a ed.), Mack Publishing Co., Easton Pa. (1990).

Las concentraciones de los aminoacidos empleadas pueden estar, por ejemplo, en el intervalo de 0.01-10% (p/p) o en el intervalo de 0.1-3% (p/p).

Tampones

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un tampon. Un tampon es una disolucion que comprende una sustancia, sustancia que puede prevenir cambios significativos en el pH de disoluciones a las que se anaden pequenas cantidades de acidos o bases y, por ende, puede mantener en gran medida la acidez o basicidad original de la disolucion. Un tampon normalmente comprende un acido debil o base debil junto con una sal de estos.

El pH de las composiciones acuosas podna estar en el intervalo de 2 a 10, particularmente entre 7 y 8. Los aminoacidos descritos anteriormente o los tampones, que tienen un pH en el intervalo de 2 a 10 se podnan utilizar para efectuar el tamponado. Algunos ejemplos de tampones que se pueden utilizar, por ejemplo, incluyen tampones de acetato, tampones de carbonato, tampones de citrato, tampones de glicilglicina, tampones de histidina, tampones de glicina, tampones de lisina, tampones de arginina, tampones de fosfato (que contienen, p. ej., dihidrogenofosfato sodico, hidrogenofosfato disodico o fosfato trisodico), tampones de TRIS [tris(hidroximetil)aminometano], tampones de bicina, tampones de tricina, tampones de malato, tampones de succinato, tampones de maleato, tampones de fumarato, tampones de tartrato, tampones de aspartato y mezclas de estos. En algunas realizaciones se utilizan tampones de citrato, tampones de histidina, tampones de fosfato sodico, tampones de succinato y tampones de TRIS. En una realizacion se utiliza histidina.

Las concentraciones de tampon empleadas pueden estar, por ejemplo, en el intervalo de 0-50 mM o en el intervalo de 0-25 mM.

Otros componentes

Tambien se pueden incorporar otro u otros componentes a la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o al diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada. Tales ingredientes adicionales incluyen, sin

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caracter limitante, surfactantes no ionicos, agentes reductores, agentes quelantes, antioxidantes, conservantes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes espesantes, modificadores de la tonicidad (agentes que ajustan la tonicidad), vehmulos oleaginosos, protemas (p. ej., seroalbumina humana, gelatina u otras protemas) y sustancias zwitterionicas (p. ej., betama, taurina o un aminoacido tal como arginina, glicina, lisina o histidina). Tales ingredientes 5 adicionales no debenan, obviamente, afectar adversamente a la estabilidad global de la composicion acuosa o de la composicion anhidra de la presente invencion. A este respecto, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19.a edicion, 1995.

Surfactantes no ionicos

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente 10 utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un surfactante no ionico. Los surfactantes ionicos son agentes tensioactivos que ejercen su efecto protegiendo a las protemas de superficies cnticas (p. ej., envases, solidos). Los surfactantes ionicos se pueden utilizar, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la composicion liofilizada. Algunos ejemplos de surfactantes no ionicos que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, sin caracter limitante, Tween 80, Tween 20, PEG, alcohol acetflico, PVP, PVA, alcohol lanolmico, monooleato de 15 sorbitan, poloxameros y eteres alqmlicos de polioxietileno. En una realizacion, se utiliza Tween 20.

Las concentraciones de los surfactantes no ionicos empleadas pueden estar, por ejemplo, en el intervalo de 0.00001-5% (p/p) o en el intervalo de 0.0002% y 0.1% (p/p).

Agentes reductores

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente 20 utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un agente reductor. Los agentes reductores tales como antioxidantes, se utilizan para eliminar radicales libres que podnan desestabilizar las protemas. Algunos ejemplos de agentes reductores que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, sin caracter limitante, cistema, N- acetilcistema, tioglicerol, sulfuro de sodio, tocoferoles y glutation.

Agentes quelantes

25 En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un agente quelante. Los agentes quelantes se utilizan para eliminar metales (hierro, cobre) de la formulacion y normalmente tienden a proteger las protemas de reacciones catalizadas por metales. Algunos ejemplos de agentes quelantes que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, sin caracter limitante, sales de EDTa, acido cftrico y acido aspartico, y mezclas de estos. En una 30 realizacion de la presente invencion, el agente quelante esta presente en una concentracion de 0.1 mg/mL a 5

mg/mL. En una realizacion de la presente invencion, el agente quelante esta presente en una concentracion de 0.1 a 2 mg/mL. En una realizacion adicional de la presente invencion, el agente quelante esta presente en una concentracion de 2 mg/mL a 5 mg/mL.

Antioxidantes

35 En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un antioxidante. En una realizacion, la composicion acuosa comprende metionina (u otro aminoacido o analogo aminoaddico que contenga azufre) para inhibir la oxidacion de los residuos de metionina a su forma sulfoxfdica cuando la transglutaminasa, p. ej. el FXIII, es un polipeptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible de tal oxidacion. Se pretende que la 40 expresion “inhibir la oxidacion” indique una minimizacion de la acumulacion de especies oxidadas (de metionina) con

el tiempo. La inhibicion de la oxidacion de la metionina da como resultado una mayor retencion del polipeptido en su forma molecular adecuada. Se puede utilizar, por ejemplo, cualquier estereoisomero de metionina (isomero L, D o LD) o combinaciones de estos. La cantidad que se ha de anadir debena ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidacion de los residuos de metionina de tal modo que la cantidad de forma sulfoxfdica de metionina sea aceptable 45 para las agencias reguladoras. Habitualmente esto significa que la composicion no contiene mas de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 30% de forma sulfoxfdica de metionina. Esto se puede conseguir en general, por ejemplo, anadiendo metionina en una cantidad tal que la proporcion molar de metionina anadida respecto a los residuos de metionina vane de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1, tal como de 10:1 a aproximadamente 100:1.

50 Conservantes

En algunas realizaciones de la presente invencion, la composicion acuosa que se ha de liofilizar y/o el diluyente utilizado para la reconstitucion de la composicion secada comprenden un conservante. Los conservantes se pueden anadir por requisitos reguladores para recipientes de dosis multiples. Los conservantes se utilizan como agente antimicrobiano para proteger de contaminacion microbiana durante la extraccion de multiples dosis a partir de viales. 55 Algunos ejemplos de conservantes que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, sin caracter limitante, fenol, o-

cresol, m-cresol, p-cresol, clorocresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de etilo, p-hidroxibenzoato de propilo, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-fenoxietanol, 2-feniletanol, alcohol bendlico, clorobutanol, tiomerosal, bronopol, acido benzoico, imidurea, clorhexidina, dehidroacetato sodico, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3-p- clorfenoxipropan-1,2-diol) y mezclas de estos. El conservante puede estar presente, por ejemplo, en una 5 concentracion de 0.1 mg/mL a 20 mg/mL. En una realizacion de la presente invencion el conservante esta presente en una concentracion de 0.1 mg/mL a 5 mg/mL. En una realizacion adicional de la presente invencion, el conservante esta presente en una concentracion de 5 mg/mL a 10 mg/mL. En otra realizacion de la presente invencion el conservante esta presente en una concentracion de 10 mg/mL a 20 mg/mL.

Un experto en la tecnica sena capaz de utilizar los metodos descritos mas adelante para analizar los efectos en la 10 estabilidad, preactivacion y pureza del o de los componentes anadidos en la composicion anhidra o composicion acuosa de la divulgacion, con experimentacion rutinaria unicamente.

Composicion anhidra - Polvo

Tras la liofilizacion, la composicion de la invencion estara en forma anhidra. La composicion anhidra de la invencion puede ser, por ejemplo, un material solido, en polvo o granular. En una realizacion, la composicion anhidra de la 15 invencion es un polvo. El nivel de humedad residual en esta composicion secada es importante para la estabilidad de la transglutaminasa anhidra, p. ej. FXIII, durante el almacenamiento. En una realizacion de la invencion, la composicion anhidra contiene menos de un 3% de humedad residual. En una realizacion adicional, la composicion anhidra contiene menos de un 1% de humedad residual.

Tecnicas de secado y reconstitucion

20 La liofilizacion y secado por atomizacion de la composicion acuosa de la presente divulgacion se pueden llevar a cabo utilizando metodos de liofilizacion y secado por atomizacion muy conocidos para aquellos expertos en la tecnica: para la liofilizacion remftase a, por ejemplo, Williams y Polli (1984), J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59. Para el secado por atomizacion remftase a, por ejemplo, Masters in Spray-Drying Handbook (5.a ed; Longman Scientific and Technical Essex, R.U., 1991), pags. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm.

25 18:1169-1206 y Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20. Tambien se pueden utilizar otras tecnicas de

secado, tales como secado al aire, remftase a Carpenter y Crowe (1988), Cryobiology 25:459-470 y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53. La composicion anhidra de la presente invencion se obtiene mediante liofilizacion. El proceso de liofilizacion habitualmente incluye los siguientes pasos: un paso de congelacion, un paso de secado primario y un paso de secado secundario. En el paso de congelacion, se enfna la composicion acuosa. La temperatura y la

30 duracion del paso de congelacion se eligen de modo que todos los componentes en la composicion se congelen

completamente. Por ejemplo, una temperatura de congelacion adecuada es aproximadamente -40 °C. En el paso de secado primario, el hielo formado durante la congelacion se elimina mediante sublimacion a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente al vado. Por ejemplo, la camara de presion utilizada para la sublimacion puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente 40 mTorr a 400 mTorr y la temperatura puede estar, por ejemplo, entre -30 °C y -5 35 °C. Tras el secado primario, cualquier cantidad de ftquido residual que no se haya podido eliminar por sublimacion se

elimina mediante el secado secundario, es decir, por desorcion. La temperatura durante el secado secundario es proxima o superior a la temperatura ambiente.

En una realizacion de la invencion, se introduce un templado (paso de calentamiento) en el paso de congelacion durante la liofilizacion. Este calentamiento se lleva a cabo hasta temperaturas por debajo del punto de congelacion 40 de la formulacion. Este templado (paso de calentamiento) puede estabilizar adicionalmente la composicion anhidra de la invencion.

Reconstitucion

En una etapa deseada, por ejemplo, cuando sea el momento de administrar la transglutaminasa, p. ej., el FXIII, a un paciente, se puede reconstituir la composicion anhidra de la invencion con un diluyente. La reconstitucion 45 generalmente tiene lugar a una temperatura de aproximadamente 25 °C para asegurar la hidratacion completa, aunque se pueden emplear otras temperaturas segun se desee. El tiempo requerido para la reconstitucion dependera, p. ej. del tipo de diluyente y de la cantidad de transglutaminasa y otros componentes.

En un aspecto de la divulgacion el diluyente es agua destilada. Puede ser, por ejemplo, una ventaja utilizar agua destilada, ya que no se necesita producir un diluyente distinto personalizado.

50 En un aspecto de la divulgacion, el diluyente es etanol. En un aspecto de la divulgacion, el diluyente puede comprender, por ejemplo, uno o mas componentes tales como sales, azucares, aminoacidos, tampones, surfactantes no ionicos, agentes reductores, agentes quelantes, antioxidantes, conservantes, agentes humectantes, emulsificantes, agentes espesantes, modificadores de la tonicidad, vehmulos oleaginosos, protemas (p. ej. seroalbumina humana, gelatina u otras protemas) y sustancias zwitterionicas. La eleccion de que componentes 55 incluir en el diluyente y la cantidad de estos componentes, esta regida por el efecto que se desea conseguir mediante estos componentes. Algunos ejemplos de diluyentes incluyen, sin caracter limitante, agua bacteriostatica

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para inyeccion (BWFI, por sus siglas en ingles), una disolucion de pH tamponado, (p. ej., salino tamponado con fosfato), una disolucion de salino esteril y una disolucion de dextrosa.

La concentracion de protema en la disolucion reconstituida es de al menos 5 mg/mL, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 400 mg/mL, de aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL o de aproximadamente 30 mg/mL a aproximadamente 150 mg/mL. Se considera que las altas concentraciones de protema en la disolucion reconstituida son particularmente utiles cuando la disolucion reconstituida esta destinada a una administracion subcutanea. Sin embargo, para otras vfas de administracion, tales como la administracion intravenosa, puede que se deseen concentraciones mas bajas de protema en la disolucion reconstituida (por ejemplo, de aproximadamente 5-50 mg/mL o de aproximadamente 10-40 mg/mL de protema en la disolucion reconstituida). En ciertos aspectos de la divulgacion, la concentracion de protema en la disolucion reconstituida es significativamente mas alta que en la formulacion presecada. Por ejemplo, la concentracion de protema en la disolucion reconstituida puede ser aproximadamente 2-40 veces, 3-10 veces y o 3-6 veces (p. ej. al menos tres veces o al menos cuatro veces) la de la composicion acuosa presecada.

En una realizacion de la presente invencion, la composicion de transglutaminasa anhidra, p. ej., que comprende un Factor XIII, es estable durante mas de 3 anos de almacenamiento y la disolucion reconstituida es estable durante mas de 6 semanas de uso. En una realizacion de la presente invencion, la composicion de transglutaminasa anhidra, p. ej. que comprende un Factor XIII, es estable durante mas de 2 anos de almacenamiento y la disolucion reconstituida es estable durante mas de 4 semanas de uso. En una realizacion de la presente invencion, la composicion de transglutaminasa anhidra, p. ej., que comprende un Factor XIII, es estable durante mas de 1 ano de almacenamiento y la disolucion reconstituida es estable durante mas de 2 semanas de uso. En una realizacion de la presente invencion, no mas de un 1% de la composicion de Factor XIII reconstituida es Factor XIII activado no proteoltticamente. En una realizacion de la presente invencion, no mas de un 0.5% de la composicion de Factor XIII reconstituida es Factor XIII activado no proteolfticamente.

Variantes ilustrativas

En las Tablas 1 y 2 se expone una lista de variantes ilustrativas de la invencion.

Tabla 1: Una lista de variantes ilustrativas

5 mL de llenado; 2.5 mL de reconstitucion


: Disolucion de llenado Disolucion de llenado Reconstituida

: composicion concentracion (mM) solidos (mg/mL) osmolaridad (mM)

Protema: 2.5 0 2.5 0

Sacarosa: 26 mg/mL 75 26 150

Histidina: 20 mM 20 3.1 40

NaCl: 25 mM 25 1.45 100

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 33.05 290

6 mL de llenado; 3 mL de reconstitucion

Protema: 2.5 0 2.5 0

Sacarosa: 26 mg/mL 75 26 150

Histidina: 20 mM 20 3.1 40

NaCl: 25 mM 25 1.45 100

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 33.05 290

3 mL de llenado reconstituir con 3 mL

Protema: 5.0 mg/mL 0 5 0

Sacarosa: 55 mg/mL 160 55 160

Histidina: 20 mM 20 3.1 20

NaCI: 50 mM 50 2.9 100

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 66 280

3 mL de llenado reconstituir con 3 mL

Protema: 5.0 mg/mL 0 5 0

Sacarosa: 72 mg/mL 210 72 210

Histidina: 20 mM 20 3.1 20

NaCI: 25 mM 25 1.45 50

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 81.55 280

3 mL de llenado reconstituir con 3 mL

Protema: 5.0 mg/mL 0 5 0

Sacarosa: 48 mg/mL 140 48 140

Histidina: 40 mM 40 6.2 40

NaCI: 50 mM 50 2.9 100

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 62.1 280

4 mL de llenado reconstituir con 2 mL

Protema: 5.0 mg/mL 0 5 0

Sacarosa: 26 mg/mL 76 26 152

Histidina: 20 mM 20 3.1 40

NaCI: 25 mM 25 1.45 100

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 35.55 292

2 mL de llenado; 3 mL de reconstitucion

Protema: 7.5 0 7.5 0

Sacarosa: 85 mg/mL 250 57 166

Histidina: 20 mM 20 3.1 13

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2 mL de llenado; 3 mL de reconstitucion

NaCl: 50 mM 50 2.9 33

Polisorbato 20: 0.01% 0 0 0



: 70.5 212

Tabla 2: Una variante ilustrativa

Vial de 12 mL llenado con 3 mL de disolucion de llenado, liofilizado, a continuacion reconstituido con 3 mL de agua

Disolucion de llenado: Vial liofilizado (polvo) Vial reconstituido

5 mg/mL rFXIII: 15 mg 5 mg/mL

55 mg/mL Sacarosa: 165 mg 55 mg/mL

20 mM Histidina: 9.3 mg 20 mM

0.01% Polisorbato 20: 0.3 mg 0.01%

50 mM NaCl: 8.7 mg 50 mM

00 II X Cl: -
00 II X Cl

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS

La presente divulgacion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una transglutaminasa, p. ej. un Factor XIII. Esta composicion farmaceutica comprende la disolucion reconstituida o la composicion anhidra de la presente invencion.

En una realizacion, la composicion farmaceutica es una composicion criodesecada anhidra destinada a la reconstitucion por parte del facultativo o del paciente mediante la adicion de diluyente antes del uso.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion que contienen una transglutaminasa, p. ej. un Factor XIII, se pueden administrar a un paciente que necesite un tratamiento de este tipo mediante varias vfas diferentes, p. ej. por via topica (tal como mediante aplicacion a la piel o a una membrana mucosa), mediante vfas que evitan la absorcion (tales como administracion en una arteria, en una vena o en el corazon) y mediante vfas que implican absorcion (tales como administracion en la piel, bajo la piel, en un musculo o en el abdomen).

La administracion de las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la presente divulgacion a pacientes que lo necesiten puede ser mediante varias vfas de administracion, p. ej., lingual, sublingual, bucal, oral, en el estomago o intestino, nasal, pulmonar (p. ej., a traves de los bronquiolos y alveolos, o ambos), epidermica, dermica, transdermica, vaginal, rectal, ocular (p. ej., a traves de la conjuntiva), uretral o parenteral.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se pueden administrar en varias formas farmaceuticas, p. ej., como disoluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsiones multiples, espumas, unguentos, pastas, emplastos, pomadas, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, capsulas (p. ej., capsulas de gelatina dura o capsulas de gelatina blanda), supositorios, capsulas rectales, gotas, geles, esprais, polvos, aerosoles, inhalantes, gotas oftalmicas, pomadas oftalmicas, enjuagues oftalmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales, pomadas vaginales, soluciones para inyeccion, soluciones que se transforman in situ (p. ej., gelificacion in situ, fijacion in situ, precipitacion in situ o cristalizacion in situ), disolucion para infusion o como implantes.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se pueden ademas combinar, unir o conjugar (p. ej., mediante interacciones electrostaticas, hidrofobas o covalentes), con un portador de farmacos, un sistema de suministro de farmacos o un sistema de suministro de farmacos avanzado con el fin de aumentar adicionalmente la estabilidad de la transglutaminasa, p. ej., el Factor XIII, para incrementar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, conseguir una cronoterapia, muy conocida para aquellos expertos en la tecnica, y/o para aumentar la adhesion del paciente. Algunos ejemplos de portadores, sistemas de suministro de farmacos y sistemas de suministro de farmacos avanzados incluyen, sin caracter limitante, polfmeros, p. ej., celulosa y derivados de esta, otros polisacaridos (p. ej., dextrano y derivados de este, almidon y derivados de este), alcohol polivimlico, polfmeros de acrilato y metacrilato, acido polilactico y acido poliglicolico y copolfmeros de bloque de estos, polietilenglicoles, protemas portadoras (p. ej., albumina), geles (p. ej., sistemas termogelificantes tales como sistemas de copolfmeros de bloque muy conocidos para aquellos expertos en la tecnica), micelas, liposomas,

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microesferas, nanoparticulados, cristales Kquidos y dispersiones de estos, fase L2 y dispersiones de esta muy conocidas para aquellos expertos en la tecnica del comportamiento de fases en sistemas Kpido-agua, micelas polimericas, emulsiones multiples (autoemulsionantes y automicroemulsionantes), ciclodextrinas y derivados de estas, y dendnmeros.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion son adecuadas para su uso en la formulacion de solidos, semisolidos, polvos y disoluciones para administracion pulmonar utilizando, por ejemplo, un inhalador de dosis medida, un inhalador de polvo seco o un nebulizador, todos los cuales son dispositivos muy conocidos para aquellos expertos en la tecnica.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion son adecuadas para su uso en la formulacion de sistemas de suministro de farmacos de liberacion controlada, liberacion sostenida, liberacion prolongada, liberacion retardada o liberacion lenta. Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion son utiles, por ejemplo, en la formulacion de sistemas de liberacion sostenida y de liberacion controlada parenterales (ambos sistemas conducen a una reduccion multiple en el numero de administraciones) de tipos muy conocidos para aquellos expertos en la tecnica, tales como sistemas de liberacion sostenida y de liberacion controlada para administracion subcutanea. Algunos ejemplos de composiciones y sistemas de liberacion controlada utiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales lfquidos, micelas polimericas, microesferas y nanopartfculas. Los metodos para producir sistemas de liberacion controlada utiles para las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen procesos de cristalizacion, condensacion, cocristalizacion, precipitacion, coprecipitacion, emulsificacion, dispersion, homogeneizacion a alta presion, encapsulacion, secado por atomizacion, microencapsulacion, coacervacion, separacion de fases, evaporacion de disolvente para producir microesferas, extrusion y fluidos supercnticos. Se hace una referencia general al Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D. L., ed., Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y a Drugs and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000).

La administracion parenteral se puede llevar a cabo mediante inyeccion subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, por ejemplo, una jeringa en un dispositivo de tipo pluma. De forma alternativa, la administracion parenteral se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de una bomba de infusion. Una opcion adicional para la administracion de las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion en forma de disolucion o suspension es la administracion como un aerosol nasal o pulmonar. Como otra opcion, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se pueden adaptar para administracion transdermica, p. ej., mediante inyeccion sin aguja, mediante aplicacion de un parche (tal como un parche iontoforetico) o mediante administracion transmucosa (p. ej., bucal).

El termino “tratar” en sus varias formas gramaticales en relacion con la presente divulgacion se refiere a curar, revertir, atenuar, aliviar, mejorar, inhibir, minimizar, suprimir o frenar (1) los efectos perjudiciales de una alteracion, (2) progresion de una alteracion o (3) factor causante de una alteracion. En el contexto de la presente divulgacion una “cantidad eficaz” de una composicion farmaceutica se define como la cantidad de una composicion farmaceutica, p. ej., Factor XIII, que es suficiente para prevenir, curar, revertir, atenuar, aliviar, mejorar, inhibir, minimizar, suprimir o frenar (1) los efectos perjudiciales de una alteracion, (2) progresion de una alteracion o (3) factor causante de una alteracion, sola o combinada con otros agentes terapeuticos administrados.

Se ha descrito que el Factor XIII se puede utilizar para tratar o prevenir episodios de sangrado en pacientes que tienen una deficiencia congenita de Factor XIII, asf como en pacientes que no tienen una deficiencia congenita de Factor XIII, remftase a, por ejemplo, los documentos US 5 114 916, US 5 607 917, WO 2002038167, WO 2002036155, WO 200267981 y WO 200267980.

La presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir episodios de sangrado, donde dicho metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion, que comprende un FXIII, a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para reducir el tiempo de coagulacion en un sujeto, donde el metodo comprende la administracion de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para prolongar el tiempo de coagulolisis en el plasma de mairnferos, donde el metodo comprende la administracion de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para aumentar la fuerza del coagulo en plasma de mamfferos, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para potenciar la formacion de coagulos de fibrina en plasma de mamfferos, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para la prevencion de hemorragia intraventricular en ninos prematuros, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para reducir las perdidas de sangre relacionadas con la cirugfa en un sujeto durante o tras la cirugfa, donde el metodo comprende la

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administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para tratar la hemofilia A, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para tratar la hemofilia B, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo para tratar alteraciones plaquetarias, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. En una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a un metodo para tratar la enfermedad de von Willebrand, donde el metodo comprende la administracion de una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica de la presente divulgacion a un sujeto que lo necesite. La composicion farmaceutica de la presente divulgacion, cuando comprende Factor XIII, es util ademas en la aplicacion local o sistemica para tratar afecciones que incluyen cicatrizacion de huesos o heridas, colitis ulcerosa, escleroderma, purpura de Scholein-Henoch, hemorragia subaracnoidea, sangrado intraventricular y sangrados por razones desconocidas.

En un aspecto adicional de estos metodos, la composicion farmaceutica de la presente divulgacion, p. ej. que comprende FXIII, se administra combinada con una cantidad eficaz de un factor Vila segun se describe en el documento WO 200185198.

En algunos aspectos, la composicion farmaceutica de la presente divulgacion es el unico agente activo administrado al sujeto para el tratamiento indicado.

En un aspecto, el sujeto que se ha de tratar es un ser humano; en un aspecto, el sujeto tiene una produccion de trombina deficiente; en un aspecto, el sujeto tiene una concentracion de fibrinogeno en plasma reducida (p. ej., en el caso de un sujeto multitransfundido).

La presente invencion, descrita generalmente de este modo, se entendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan a modo ilustrativo.

EJEMPLOS

Para desarrollar las composiciones de la presente invencion, se estudiaron varias composiciones, junto con sus efectos en la subsiguiente estabilidad de las composiciones durante el almacenamiento.

Ejemplo 1: Liofilizacion y reconstitucion de Factor XIII

Los experimentos de criodesecacion se llevaron a cabo en liofilizadores que se pueden adquirir de distribuidores comerciales. Las disoluciones de Factor XIII recombinante, preparado mediante expresion en celulas de levadura, junto con componentes adicionales, se secaron de acuerdo con un programa de criodesecacion adecuado. Los productos liofilizados se reconstituyeron a continuacion utilizando agua destilada.

Ejemplo 2: Estabilidad de las composiciones de Factor XIII anhidras

Se preparo una serie de composiciones de rFXIII anhidras mediante liofilizacion, de acuerdo con el Ejemplo 1, y se les realizo un estudio de estabilidad donde se midio la pureza mediante AIE-HPLC y se midieron los agregados mediante SEC-HPLC. Este estudio investigo tres niveles de NaCl incluidos en la disolucion de llenado acuosa, NaCl 0 mM, 12.5 mM y 25 mM, y cuatro niveles de sacarosa segun se proporcionan en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3: Composiciones estudiadas en presencia y en ausencia de NaCl


: Composiciones estudiadas

: Disolucion de llenado DP utilizada para la indicacion de CD Proporcion 1 Proporcion 2 Proporcion 3 Proporcion 4

rFXIII, mg/mL: 2.5 5.0 5.0 5.0 5.0

Sacarosa, mg/mL: 42.5 80 40 20 0

Histidina, mM: 20 20 20 20 20

Polisorbato 20: 0.01% 0.01% 0.01% 0.01% 0.01%

Proporcion de sacarosa respecto a protema: 17 16 8 4 0

Tabla 4: Contenido de sacarosa y NaCI

Nombre del exp.: Sacarosa NaCl

N1: 0 0

N2: 20 0

N3: 40 0

N4: 80 0

N5: 0 25

N6: 20 25

N7: 40 25

N8: 80 25

N9: 0 12.5

N10: 0 12.5

N11: 0 12.5

N12: 0 12.5

Tabla 5: Tabla de resultados

N.°: Pureza mediante AIE-0 Pureza mediante AIE 1M40 % agreg. mediante SEC 0 % agreg. mediante SEC M40 % agreg. mediante SEC M40 Pureza mediante AIE 2M40 % agreg. mediante SEC 3M40 % agreg. mediante SEC 3M25

N1: 3.87 3.95 0.2 0.6 0.9 61 1 0.5

N2: 74.75 65.87 0.05 0.1 0.1 61 0.1 0.1

N3: 74.48 66.47 0.05 0.1 0.1 64.4 0.1 0.1

N4: 74.75 69.74 0.1 0.1 0.1 66.2 0.1 0.1

N5: 73.39 71.67 4.1 1.6 1.8 66.9 2.3 1.9

N6: 75.11 72.42 0.1 0.1 0.1 68.5 0.1 0.1

N7: 75.13 72.32 0.1 0.1 0.1 68.9 0.1 0.1

N8: 74.05 72.61 0.1 0.1 0.1 69.5 0.1 0.1

N9: 72.63 69.14 1.8 1.3 1.5 65.8 1.6 1.2

N10: 72.33 69.57 1.7 1.4 1.4 66.6 1.5 1.2

N11: 72.79 69.71 1.7 1.2 1.5 65.7 1.7 1.2

N12: 72.74 69.05 1.7 1.4 1.5 66.8 1.3 1.2

Los resultados presentados en la Tabla 5 y en la Figura 1 demuestran que existe una relacion estadfsticamente 5 significativa entre el NaCl y la pureza mediante AIE-HPLC para las muestras almacenadas a 40 °C. No hay ningun efecto en la pureza inicial de las muestras. Por lo tanto, se concluye que el NaCl actua espedficamente en el estado anhidro, es decir, la composicion anhidra, con lo cual mejora significativamente la estabilidad de almacenamiento de las composiciones de rFXIII anhidras.

Ejemplo 3: Estudio factorial completo

10 El proposito del estudio era realizar un experimento de reconocimiento preliminar en formulaciones liofilizadas de rFXlII para investigar los efectos de la histidina y el cloruro sodico en la formacion de rFXIIIa° tras la liofilizacion. Se utilizo un diseno de experimento factorial completo para evaluar la concentracion de histidina en el intervalo de 20-60 mM y la concentracion de NaCl en el intervalo de 0-50 mM en composiciones de rFXIII secas.

Tabla 6: Factores experimental

N.°: NaCI Histidina

N1: 0 20

N2: 25 20

N3: 50 20

N4: 0 40

N5: 25 40

N6: 50 40

N7: 0 60

N8: 25 60

N9: 50 60

N10: 25 40

N11: 25 40

N12: 25 40

Tabla 7: Tabla de resultados

N.°: % act inicial % act 2M25 Pureza mediante AIE 2M25 SEC 2M25 % act 1M40 % act 4M25

N1: 0.4 1.1 67.4 0.1 2.6 1.8

N2: 0.4 0.7 70.3 0.1 1.6 1.2

N3: 0.4 0.7 71 0.1 1.5 1.1

N4: 0.4 1.1 67.8 0.1 2.3 2

N5: 0.5 0.8 70.3 0.2 1.8 1.2

N6: 0.4 0.7 71 0.2 1.3 1

N7: 0.4 1.2 68.4 0.1 2.3 2

N8: 0.4 0.9 70.3 0.2 1.6 1.3

N9: 0.5 0.8 70.8 0.2 1.3 1

N10: 0.6 0.9 70.5 0.1 1.7 1.2

N11: 0.4 1 70.2 0.1 1.7 1.3

N12: 0.4 0.8 70.2 0.5 1.5 1.1

N.°: Pureza mediante AIE 4M25 SEC 4M25 % act 6M25 SEC 6M25 Pureza mediante AIE 6M25 Pureza mediante AIE inicial

N1: 65.1 0.1 2.2 0.1 63.5 72.1

N2: 69.2 0.1 1.4 0.1 68 72.4

N3: 70.2 0.1 1.1 0.1 69.5 72.3

N4: 66 0.1 2.2 0.1 64.6 71.8

N5: 69 0.2 1.4 0.2 68.3 72.1

N6: 70 0.2 1.1 72.2

N7: 67.1 0.1 2 0.1 65.3 71.9

N8: 69.8 0.2 1.5 0.2 68.6 72.2

N9: 70 0.2 1.3 0.2 69.6 72.3

5

10

15

20

25

N10: 69.5 0.1 1.3 0.1 68.9 72.3

N11: 69.6 0.1 1.4 0.1 69 72.3

N12: 69.2 0.1 1.4 0.1 68.9 72.3

Los resultados presentados en la Tabla 7 y en las Figuras 2 y 3 demuestran que la inclusion de NaCI tiene un efecto estabilizante significativo en la pureza y en la formacion de rFXIIIa0 para muestras almacenadas a 40 °C y 25 °C durante 1 y 2 meses, respectivamente. La inclusion de NaCl no tiene un efecto significativo en las muestras en el momento inicial. Los niveles de NaCl e histidina estudiados en la presente no tienen efectos significativos en los niveles de agregacion mediante SE-HPLC tras 2 meses a 25 °C. Este estudio muestra que incluir NaCl en la composicion de rFXIII anhidra mejora significativamente la estabilidad de almacenamiento de la composicion respecto al % de pureza y % de rFXIIIa°.

Ejemplo 4: Estudio de reconstitucion

Este experimento se llevo a cabo para verificar que el efecto estabilizante del NaCl es espedfico para el estado anhidro, es decir, la composicion anhidra. En este experimento se reconstituyo un vial de composicion de rFXIII liofilizada con agua, a continuacion, se dividio en dos volumenes iguales a cada uno de los cuales se anadio NaCl. Las disoluciones se almacenaron a temperatura ambiente durante 24 horas y a continuacion se analizaron en busca de rFXIIIa0. Se evaluaron tres concentraciones de NaCl. El diseno experimental se plasma en la Tabla 8.

Tabla 8: Diseno experimental - Efecto del NaCl en la formacion de rFXIIIa° en disolucion

Vial de 12 mL que contiene el producto farmacologico de rFXIII en polvo

Vial #1. Reconstituir con 2.5mL de agua: Vial #2. Reconstituir con 2.5mL de agua Vial #3. Reconstituir con 2.5mL de agua

NaCl 0 mM NaCl 25 mM: NaCl 0 mM NaCl 50 mM NaCl 0 mM NaCl 75 mM

Almacenar la disolucion a temperatura ambiente durante 24 horas, a continuacion analizar
Almacenar la disolucion a temperatura ambiente durante 24 horas, a continuacion analizar
Almacenar la disolucion a temperatura ambiente durante 24 horas, a continuacion analizar

Tabla 9 Resultados de potencia del estudio de reconstitucion con NaCl

Identificacion de la muestra: Concentracion de NaCl (mM) rFXIII total (IU/mL) rFXIIIa (IU/mL) % rFXIIIa (Analizado 24 horas tras la reconstitucion)

1a: 0 957 5.0 0.5

1b: 25 854 5.6 0.7

2a: 0 889 4.4 0.5

2b: 50 887 5.1 0.6

3a: 0 990 4.1 0.4

3b: 75 837 5.7 0.7

Los resultados presentados en la Tabla 9 muestran que las muestras que contienen NaCl tienen valores de rFXINa° ligeramente mas altos tras 24 horas que las respectivas disoluciones de comparacion que no contienen NaCl. Estos resultados demuestran que, en el intervalo de concentracion 25-75 mM, el NaCl en la composicion acuosa no tiene un efecto estabilizante en cuanto a la formacion de rFXNIa° Se concluye que el efecto estabilizante del NaCl en la composicion de rFXIII liofilizada, demostrado por los datos de los anteriores Ejemplos, es espedfico para el estado anhidro (composicion anhidra). Este efecto es sorprendente y hasta ahora desconocido.

ENSAYOS

Ensayo (I): Metodo para medir FXIIIa0

Para estudiar los efectos de la liofilizacion en la cantidad de FXNIa°, se puede analizar el Factor XIII recombinante purificado mediante un ensayo de actividad enzimatica de FXIII, donde la actividad de FXINa° se mide comparando la actividad de una alfcuota de una mezcla sin activacion de trombina inicial, con la de otra alfcuota de la misma

muestra a la que se ha anadido trombina. El % de FXIIIa0 se calcula como 100*[actividad de la muestra sin trombina]/[actividad de la muestra con trombina].

Ensayo (II): Metodo para medir la pureza de FXIII

Para estudiar los efectos de la liofilizacion en la pureza de FXIII, se puede analizar el FXIII recombinante purificado 5 mediante cromatograffa Uquida de alto rendimiento de intercambio anionico (AIE-HPLC).

Ensayo (III): Metodo para medir la actividad de FXIII

Los metodos para medir la actividad de entrecruzamiento de FXIII son muy conocidos en la tecnica. La actividad de FXIII se puede medir utilizando kits que se pueden adquirir de distribuidores comerciales, tales como el kit de prueba Berichrom FXIIIR.

10 Ensayo (IV): Metodo para medir el contenido de humedad

Para estudiar el contenido de humedad de la composicion de transglutaminasa anhidra, p. ej., FXIII, se puede utilizar la valoracion de Karl Fischer.

Claims

10

REIVINDICACIONES

1. Una composicion de Factor XIII anhidra, dicha composicion se puede obtener liofilizando una composicion acuosa que comprende un compuesto de Factor XIII, una sal de cloruro sodico y al menos un componente adicional seleccionado del grupo compuesto por un azucar, un aminoacido y un tampon, donde la concentracion de sal de cloruro sodico en la composicion acuosa esta en el intervalo de 10 a 75 mM y donde el compuesto de Factor XIII es un compuesto de Factor XIII recombinante.
2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto de Factor XIII es un Factor XIII humano.
3. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la composicion esta en forma de polvo.