ES2247106T3 - Uso de una composicion farmaceutica que comprende un factor viia y un factor xiii. - Google Patents

Abstract

Uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado en un sujeto, el medicamento estando previsto para la administración intravenosa.

Description

Uso de una composición farmacéutica que comprende un factor VIIa y un factor XIII.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una combinación de un factor VIIa con un factor XIII para la producción de un medicamento para el tratamiento de sujetos que sufren episodios de sangrado, o para su prevención.

Antecedentes de la invención

La hemostasis se inicia por la formación de un complejo entre el factor tisular (TF) que se expone a la sangre que fluye tras una herida en la pared del vaso, y FVIIa que está presente en la circulación en una cantidad correspondiente de aproximadamente el 1% de la masa proteínica del FVII total. Este complejo está fijado a la célula portadora del TF y activa FX en FXa y FIX en FIXa en la superficie de la célula. FXa activa la protrombina hasta trombina, la cual activa FVIII, FV, FXI y FXIII. Además, la cantidad limitada de trombina formada en esta fase inicial de la hemostasis también activa las plaquetas. Tras la acción de la trombina en las plaquetas, éstas cambian de forma y exponen los fosfolípidos cargados en su superficie. Esta superficie activada de las plaquetas forma el molde para la posterior activación de FX y la generación completa de trombina. Además la activación de FX en la superficie activada de las plaquetas se produce por medio de un complejo FIXa-FVIIIa formado en la superficie de las plaquetas activadas, y FXa luego convierte la protrombina en trombina mientras que permanece en la superficie. La trombina luego convierte el fibrinógeno en fibrina que es insoluble y que estabiliza el tapón plaquetario inicial. Este proceso se divide por compartimentos, es decir, se localiza en el lugar de expresión o de exposición del TF, minimizando así el riesgo de una activación sistémica del sistema de coagulación. La fibrina insoluble que forma el tapón es además estabilizada por entrecruzamiento catalizado con FXIII de las fibras de fibrina.

El FVIIa se encuentra en el plasma en su mayor parte como un zimógeno monocatenario, que es dividido por FXa en su forma bicatenaria, activada, FVIIa. El factor VIIa recombinante activado (rFVIIa) ha sido desarrollado como un agente prohemostático. La administración de rFVIIa ofrece una respuesta rápida y prohemostática muy eficaz en sujetos hemofílicos con sangrados que no pueden ser tratados con productos con factores de coagulación debido a la formación de anticuerpos. Además los sujetos con sangrados con falta del factor VII o los sujetos con un sistema de coagulación normal pero que experimentan sangrados excesivos pueden ser tratados exitosamente con FVIIa. En estos estudios, no se han encontrado efectos secundarios desfavorables de rFVIIa (en particular, la incidencia de tromboembolia).

El FVIIa administrado extraexógenamente aumenta la formación de trombina en la superficie activada de las plaquetas. Esto ocurre en sujetos hemofílicos que carecen de FIX o FVIII y en consecuencia que pierden la vía más potente para la formación completa de trombina. También en presencia de un número reducido de plaquetas o plaquetas con una función defectuosa, una cantidad extra de FVIIa aumenta la formación de trombina.

El FXIII, factor estabilizador de fibrina, es una transglutaminasa que entrecruza los monómeros de fibrina proporcionando así una estructura de fibrina con resistencia aumentada a la disolución por plasmina y otras enzimas proteolíticas, el factor XIII es también conocido como "fibrinoligasa" y "factor estabilizador de fibrina". Cuando se activa, el FXIIIa es capaz de formar entrecruzamientos gamma-glutamil-epsilon-lisina intermoleculares entre cadenas laterales de moléculas de fibrina y entre otros sustratos. FXIII se encuentra en el plasma y en las plaquetas. La enzima se encuentra en el plasma como un zimógeno tetramérico consistente en dos subunidades alfa y dos subunidades beta (denominadas a_{2}b_{2}) y en las plaquetas como un zimógeno consistente en dos subunidades alfa (denominas
dímero-a_{2}).

Ambos zimógenos son activados por trombina y Ca2+. El calcio es liberado de las plaquetas durante la adición en el lugar de la herida. La trombina divide los residuos 1-37 de los aminoácidos N-terminales (del dímero-a_{2}). En el caso del zimógeno-a_{2}b_{2}, las subunidades beta son luego disociadas de las subunidades alfa activadas. El calcio se enlaza igualmente al zimógeno y a la molécula modificada con trombina. Después de la activación de la trombina y del calcio, queda expuesta la cisteína del centro activo en la cadena alfa, formándose la enzima completamente activada. Se ha descubierto que los sujetos con trombocitopenia severa tienen niveles de plasma bajos de FXIII.

Es bien conocido que los sujetos que sangran en exceso en relación con la cirugía o un traumatismo más importante y que necesitan transfusiones de sangre desarrollan más complicaciones que aquellos que no experimentan ningún sangrado. No obstante, también los sangrados moderados que requieren la administración de sangre humana o productos sanguíneos (plaquetas, leucocitos, concentrados derivados de plasma para el tratamiento de defectos de coagulación, etc.) pueden conducir a complicaciones en relación con el riesgo de transferir virus humanos (hepatitis, VIH, parvovirus, y otros virus, hasta ahora desconocidos). Los sangrados extensos que requieren transfusiones masivas de sangre pueden conducir al desarrollo de fallos orgánicos múltiples que incluyen un mal funcionamiento del pulmón y del riñón. Una vez que un sujeto haya desarrollado estas complicaciones serias comienza una cascada de eventos que implican varias citoquinas y reacciones inflamatorias dificultando cualquier tratamiento y con frecuencia, desafortunadamente, sin éxito. En consecuencia un objetivo más importante en cirugía al igual que en el tratamiento de la mayoría de los daños tisulares es evitar o minimizar el sangrado.

Para evitar o minimizar este sangrado es importante asegurar la formación de tapones hemostáticos estables y sólidos que no sean fácilmente disueltos por enzimas fibrinolíticas. Además, es importante asegurar la formación rápida y eficaz de tales tapones o coágulos.

La solicitud de patente japonesa N°. 2-167234 A se refiere a un adhesivo para biotejido caracterizado por el hecho de que contiene fibrinógeno, protrombina, factor VII de coagulación de la sangre, factor IX de coagulación de la sangre, factor X de coagulación de la sangre, factor XIII de coagulación de la sangre, antitrombina, un inhibidor de proteinasa, y un ion calcio.

La solicitud de patente japonesa N°. 59-116213A se refiere a una composición de aerosol para el uso como un adhesivo tisular que contiene un coagulante sanguíneo como componente activo. El coagulante sanguíneo puede ser seleccionado de factores de coagulación sanguínea I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, y XIII, precalicreína, el polímero elevado quininógeno y trombina. Una combinación de F XIII y trombina es preferida.

WO 93/12813 (ZymoGenetics) se refiere al uso de FXIII para reducir la pérdida de sangre perioperativa en un sujeto sometido a cirugía. La composición puede también comprender aprotinina. El FXIII es administrado al sujeto como una inyección de bolo, normalmente un día antes de la cirugía.

La Patente Europea N°. 225.160 (Novo Nordisk) se refiere a composiciones de FVIIa y métodos para el tratamiento de trastornos de sangrado no provocados por defectos del factor de coagulación o inhibidores del factor de coagulación.

Patente europea N°. 82.182 (Baxter Travenol Lab.) se refiere a una composición de factor VIIa para el uso para combatir deficiencias de factores de coagulación de la sangre o los efectos de los inhibidores de los factores de coagulación de la sangre en un sujeto.

La publicación de patente internacional N°. WO 93/06855 (Novo Nordisk) se refiere a la aplicación tópica de FVIIa.

Kjalke et al, Thrombosis and Haemostasis, 1999 (Suppl), 095 1 se refiere a la administración extraexógena de FVIIa y el efecto sobre la formación de trombina en la superficie de las plaquetas activadas en un sistema modelo que imita las condiciones de la hemofilia A o B.

Sigue habiendo una necesidad en la técnica de un método mejorado, fiable y aplicable con mayor extensión para aumentar la coagulación, formar rápidamente tapones hemostáticos estables y lograr una hemostasis completa en sujetos, en particular en sujetos que tienen una generación de trombina dañada. Hay también una necesidad de un método en el que se reduzca la cantidad de FVIIa requerida para lograr una hemostasis completa.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, para el uso en el tratamiento o profilaxis de episodios de sangrado y trastornos de la coagulación.

Estos inventores han demostrado que una combinación de un factor VIIa y un factor XIII puede reducir el tiempo de coagulación del plasma humano normal más eficazmente que el factor VIIa o el factor XIII por separado. También se ha demostrado que una combinación de un factor VIIa y un factor XIII puede aumentar la firmeza del coágulo más eficazmente que el factor VIIa o el factor XIII por separado. Combinando un factor VIIa a una concentración en la que no se observó un aumento adicional en la firmeza del coágulo con un factor XIII, también a una concentración en la que no se observó un aumento adicional en la firmeza del coágulo, se demostró de forma imprevista que se obtuvo un aumento adicional en la firmeza del coágulo. También se ha demostrado que la combinación de un factor VIIa y un factor XIII puede prolongar el tiempo de tisis del coágulo in vitro en plasma humano normal más eficazmente que el inhibidor del factor VIIa o del factor XIII por separado. Por lo tanto, aumentando la coagulación se puede obtener un tratamiento más eficaz del sangrado en los sujetos. Además, los pacientes pueden ser tratados con concentraciones relativamente inferiores del factor VIIa, reduciendo así los costes relativamente altos relacionados con el tratamiento convencional con el factor VIIa por separado.

En un primer aspecto, se describe una composición farmacéutica que comprende un factor VIIa y un factor XIII y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica que comprende un factor VIIa y un factor XIII como únicos agentes activos y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica formulada para la administración intravenosa que comprende un factor VIIa y un factor XIII, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica formulada para administración intravenosa que comprende un factor VIIa y un factor XIII como únicos agentes activos y, opcionalmente, un soporte farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, el factor VIIa es el factor VIIa recombinante y el factor XIII es el factor XIII recombinante.

En una forma de realización de la invención, el factor VIIa es el factor VIIa recombinante. En otra forma de realización, el factor VIIa es el factor VIIa recombinante humano. En otra forma de realización el factor VIIa es una variante del factor VIIa.

En una forma de realización, las variantes del factor VIIa son variantes de la secuencia de aminoácidos que tiene no más de 20 aminoácidos reemplazados, eliminados o insetados en comparación con el factor VIIa de tipo salvaje (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Patente U.S. N°. 4,784,950). En otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 15 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 10 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 8 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 6 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 5 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del factor VIIa no tienen más de 3 aminoácidos reemplazados, eliminados o insertados en comparación con el factor VIIa de tipo salvaje. En una forma de realización, las variantes del factor VIIa están seleccionadas de la lista formada por [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L3051]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [VI58T/M298Q]-FVIIa, [VI 58D/E296V/M298Q]-FVIIa y [K337A]-FVIIa.

En una forma de realización, el factor XIII es FXIII a2b2. En otra forma de realización, el factor XIII es FXIII a2. En otra forma de realización, el factor XIII es el factor XIII activado (FXIIIa). En una forma de realización, el factor XIII es una variante del factor XIII. En una forma de realización, el factor XIII es el factor XIII humano. En una forma de realización, el factor XIII es el factor XIII recombinante. En una forma de realización, el factor XIII es el factor XIII recombinante humano . En una forma de realización, el factor XIII es el dímero a2 humano.

En un aspecto, la composición además contiene un inhibidor TFPI. En otro aspecto, la composición además contiene un factor VIII. En otro aspecto, la composición además contiene un factor VIII y un inhibidor TFPI.

En una forma de realización, la composición además comprende un inhibidor del sistema fibrinolítico, p. ej., aprotinina, ácido aminocaproico o ácido tranexámico.

La invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación de en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para prolongar el tiempo de Tisis del coágulo en plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para aumentar la resistencia del coágulo en plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para aumentar la formación del coágulo de fibrina en plasma mamífero.

En una forma de realización, el plasma mamífero es plasma humano. En otra forma de realización, el plasma mamífero es plasma normal; en otra forma de realización, el plasma es plasma humano normal; en una forma de realización, el plasma es plasma de un sujeto que tiene una generación de trombina perjudicada. En una forma de realización, el plasma es de un sujeto que tiene una concentración disminuida de fibrinógeno.

En una forma de realización, el factor VIIa y el factor XIII prolongan el tiempo de tisis del coágulo in vitro en plasma humano normal.

En una forma de realización de los métodos de la invención, el factor VIIa y el factor XIII son los únicos agentes activos que son administrados al sujeto. En otra forma de realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un factor VIIa y un factor XIII como únicos agentes activos.

En una forma de realización de la invención, el factor VIIa y el factor XIII deben ser administrados simultáneamente y en forma de monodosis. En otra forma de realización, el factor VIIa y el factor XIII deben ser administrados de forma secuencial. En otra forma de realización, el factor VIIa y el factor XIII está administrado en un período de aproximadamente 1-2 horas entre uno y otro, por ejemplo en un periodo de 30 minutos entre uno y otro, por ejemplo en un periodo de 10 minutos entre uno y otro, p. ej., en forma de un kit que comprende un factor VIIa en una primera forma de dosificación unitaria y un factor XIII en una segunda forma de dosificación uni-
taria.

En una forma de realización, la cantidad eficaz de un factor VIIa es de 0.05 mg/día a 500 mg/día (sujeto de 70 kg). En una forma de realización, la cantidad eficaz de un factor XIII es de 0.05 mg/día a 500 mg/día (sujeto de
70 kg).

En una forma de realización de la presente invención, la composición farmacéutica (cuando está en forma de preparación unitaria) consiste esencialmente en un factor VIIa y un factor XIII, y, opcionalmente, al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa.

En otra forma de realización de la presente invención, la composición farmacéutica (cuando está en forma de preparación unitaria) consiste esencialmente en un factor VIIa y un factor XIII, y, opcionalmente, al menos un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa, y/o un Inhibidor TFPI.

En otra forma de realización de la presente invención, la composición farmacéutica (cuando está en forma de preparación unitaria) consiste esencialmente en un factor VIIa y un factor XIII, y, opcionalmente, al menos un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una .sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa, y/o un Inhibidor TFPI, y/o un factor VIII.

En otra forma de realización, la composición farmacéutica (cuando en está forma de kit) consiste en una primera forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un factor VIIa y, opcionalmente, al menos en un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa, y una segunda forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un factor XIII, y, opcionalmente, al menos unos excipientes o portador aceptables farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa.

En otra forma de realización, la composición farmacéutica (cuando está en forma de kit) consiste en una primera forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un factor VIIa y, opcionalmente, al menos un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante, y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa, y/o un Inhibidor TFPI; y una segunda forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un factor XIII, y, opcionalmente, al menos unos excipientes o portador aceptables farmacéuticamente, y/o un estabilizador, y/o un detergente, y/o una sal neutra, y/o un antioxidante ,y/o un conservante, y/o un inhibidor de proteasa, y/o un Inhibidor TFPI, y/o un factor VIII.

En otra forma de realización, el sujeto es un humano; en otra forma de realización, el sujeto tiene una generación de trombina perjudicada; en una forma de realización, el sujeto tiene una concentración reducida de plasma de fibrinógeno (p. ej., un sujeto multitransfundido).

En otro aspecto, la composición además contiene un factor VIII. En una forma de realización, el factor VIII es un factor VIII activado (factor VIIIa). En otra forma de realización, el factor VIII es un factor VIIIa recombinante. En otra forma de realización, el factor VIII es el factor VIIIa recombinante humano.

En otro aspecto, la composición además comprende un inhibidor del sistema fibrinolitico, p. ej., aprotinina, ácido \varepsilon-aminocaproico o ácido tranexámico.

Lista de figuras

La Figura 1 muestra que la formación del coágulo espontánea en plasma humano normal citrado (NHP) diluido a 1/10 en un tampón con un contenido de 20 nM de Hepes, 150 mM de NaCl, y 5 mM de CaCl_{2}, pH 7.4 en un pocillo de microtitulación (volumen total 250 \mul) fue obtenida a aproximadamente 2500-3000 seg. La formación del coágulo de fibrina fue controlada por el aumento de la densidad óptica a 600 nm en un Specramax™ 340. Molecular Devices, Sunnyvale CA. La Fig. 1 muestra que 10 nM de factor recombinante VIIa (rFVIIa) de Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dinamarca redujo el tiempo de coagulación a 1600 seg (N = 2). Además se obtuvo una reducción del tiempo de coagulación cuando se añadió 30 nM de factor XIII (FXIII) de American Diagnostica inc, Greenwich, Se añadió CT junto con 10 nM de rFVIIa (N = 3). El coágulo formado en presencia de FXIII fue más transparente (inferior OD máxima) que sin él, lo que indica que la adición de FXIII resultó en una estructura de gel de fibrina de malla fina con fibras más delgadas.

La Figura 2 muestra que FXIII (30 nm) suplementario prolonga el tiempo de Tisis del coágulo de fibrina de los coágulos formados en presencia de rFVIIa y activador del tejido plasminógeno (tPA). La formación del coágulo fue inducida en presencia o ausencia de 30 nM de XIII añadiendo 25 \mul de NHP a 225 \mul de Hepes 20 nM, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, pH 7.4 conteniendo 50 nM de rFVIIa y 0.5 nM de tPA recombinante de Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dinamarca. La formación del coágulo y la posterior tisis del coágulo inducida por activación plasminógena por medio de tPA fue controlada por un Spectramax® 340 a 600 nm como el aumento de OD_{600 \ nm} seguido de reversión del metal traza a nivel basal. La Fig. 2 muestra que el tiempo de tisis del coágulo bajo estas condiciones fue significativamente prolongado por la presencia de FXIII.

La Figura 3 muestra el efecto de rFVIIa y FXIII en la Firmeza Máxima del Coágulo (MCF) al igual que la resistencia del coágulo a la tisis por medio de t-PA. Antes de añadir rFVIIa y/o FXIII la MCF obtenida fue 25 mM y el tiempo requerido para obtener la tisis de la mitad del coágulo fue 12.3 minutos (Fig. 3). La adición de concentraciones en aumento de FXIII (0-40 nM) no alteraron la MCF; no obstante, una prolongación dependiente de la dosis de la tisis de la mitad del coágulo fue observada, siendo óptima a 30 nM de FXIII (tiempo de tisis de la mitad del coágulo: 14,3 min, Fig. 3). De forma similar, la adición de rFVIIa (1 nM) dio como resultado la protección del coágulo de la fibrinólisis por medio de t-PA (tiempo de tisis de la mitad del coágulo; 16.4 minutos) sin cualquier efecto en MCF (Fig. 3). No obstante, tras la adición de rFVIIa (1 nM) junto con FXIII (30 nM) se observó un aumento en la MCF (29 mM), al igual que una protección profunda de la fibrinólisis (tiempo de tisis de la mitad del coágulo; 27.1 min) (Fig. 3). Al observarse juntos, estos resultados demuestran que la adición de rFVIIa y FXIII al plasma en una forma sinergística mejora la fuerza mecánica del coágulo y la resistencia a la fibrinólisis por medio de t-PA.

Descripción detallada de esta invención

La presente invención proporciona una composición que comprende una combinación de un factor VIIa y un factor XIII. La invención también proporciona una composición que comprende una combinación de un factor VIIa y un factor XIII como únicos ingredientes activos. La composición puede estar en forma de una composición unitaria o puede estar en forma de kit multi-componente. Las presentes composiciones son útiles como agentes procoagulantes terapéuticos y profilácticos y estabilizantes del coágulo de fibrina y forman coágulos de fibrina rápidos en mamíferos, incluyendo los primates así como los seres humanos.

Siempre que, una primera o segunda o tercera, etc., dosis unitaria es mencionada en toda esta descripción, ésta no indica el orden preferido de administración, pero se hace meramente por motivos de conveniencia.

La presente invención además proporciona medios para tratar (incluyendo el tratamiento o prevención de forma profiláctica) episodios de sangrado en un sujeto, incluyendo un ser humano, p. ej., debido a un traumatismo o cirugía, o en sujetos que carecen o que tienen factores de coagulación sanguínea FIX o FVIII o plaquetas defectuosos.

Ahora se ha descubierto que una combinación de un factor VIIa y un factor XIIIa es un producto ventajoso que asegura la formación de tapones hemostáticos sólidos, estables e rápidos.

La generación completa de trombina es necesaria para que se forme un tapón hemostático sólido y estable. La estructura de fibrina de un tapón de este tipo depende a la vez de la cantidad de trombina formada y del nivel de la generación de trombina inicial. Ante una generación de trombina perjudicada se forma un tapón poroso de fibrina, que es altamente permeable. Las enzimas fibrinolíticas normalmente presentes en la superficie de fibrina disuelven fácilmente el tapón de fibrina. La formación de un tapón de fibrina estable también depende de la presencia del factor XIIIa, que es activado por trombina y por lo tanto también es dependiente de la generación de trombina completa. Además, el inhibidor fibrinolítico activable de trombina recientemente descrito, TAFI, requiere más bien altas cantidades de trombina para su activación. En presencia de una formación no totalmente adecuada de trombina el TAFI puede en consecuencia no ser activado dando como resultado la formación de un tapón hemostático, que se disuelve más fácilmente de lo normal por la actividad fibrinolítica normal.

Aumentando la generación de trombina, el factor VIIa proporciona la base para una activación del factor XIII completa, que es de extrema importancia para la formación de un tapón hemostático completamente estabilizado y de ese modo para el mantenimiento de la hemostasis. En situaciones con un número reducido de plaquetas, trombocitopenia, se inicia una generación de trombina más rápida mediante la administración extra de factor exógeno VIIa. No obstante, la generación de trombina total no es normalizada por el factor VIIa incluso a altas concentraciones.

Combinando un factor VIIa y un factor XIII, en particular la cadena alfa del factor XIII (dimero-a2), una activación completa del factor XIII es facilitada realzando el efecto hemostático del factor VIIa.

Además, en sujetos con concentraciones de plasma reducidas de fibrinógeno (sujetos multitransfundidos como consecuencia de un traumatismo múltiple o cirugía extensiva) no se produce la activación completa del factor XIII. Una hemostasis más eficaz es luego obtenida por la administración de una combinación de un factor VIIa y un factor XIII.

Otro modo de aumentar la estabilidad de los tapones hemostáticos de fibrina es asegurando la presencia completa del factor XIIIa (factor XIII activado).

Los sujetos con trombocitopenia tienen una generación de trombina perjudicada al igual que una estabilización defectuosa de los tapones de fibrina dando como resultado tapones hemostáticos propensos a una disolución prematura. Además, los sujetos sometidos a traumatismos mayores o daños en los órganos y que, como consecuencia, han recibido transfusiones de sangre frecuentes a menudo tienen unas cifras reducidas de plaquetas al igual que niveles reducidos de fibrinógeno, factor VIII, y otras proteínas de coagulación. Estos sujetos experimentan una generación de trombina perjudicada (o reducida). Además, su nivel de fibrinógeno reducido interfiere negativamente con la activación del factor XIII. Estos sujetos, en consecuencia, tienen una hemostasis defectuosa, o menos eficaz, conduciendo a la formación de tapones de fibrina que son fácilmente y prematuramente disueltos por enzimas proteolíticas, tales enzimas además son liberadas en gran medida en situaciones caracterizadas por un traumatismo extensivo y daño en los órganos.

Para facilitar la formación de tapones completamente estabilizados con total capacidad para mantener la hemostasis en un sujeto, se administra una composición según la invención. Esta composición es especialmente provechosa en sujetos con un número reducido de plaquetas y en sujetos con niveles de plasma reducidos de fibrinógeno y/u otras proteínas de coagulación.

En presencia de un factor XIII concentraciones inferiores del factor VIIa pueden ser suficientes para asegurar una hemostasis suficiente.

Según se ha establecido anteriormente, el factor XIII existe en el plasma como un zimógeno tetramérico consistente en dos subunidades alfa y dos subunidades beta (denominadas a2 b2), pero se encuentra en otro tejido (p. ej., en las plaquetas) como un dimero a2. Cualquiera de estas formas de zimógeno, o factor XIII activado (factor XIIIa), puede ser usado dentro de la presente invención, al igual que las variantes creadas por ingeniería genética del factor XIII que retienen su actividad característica de entrecruzamiento. En una forma de realización, el factor XIII es factor XIII humano; en otra forma de realización, el factor XIII es el dimero-a2 humano; en otra forma de realización, el factor XIII es el factor XIIIa humano activado.

El factor XIII y el factor VIIa usados en la presente invención pueden ser purificados de la sangre o producidos por medios recombinantes. Es evidente que la práctica de los métodos descritos aquí es independiente de cómo el factor XIII purificado y el factor VIIa están derivados y, en consecuencia, la presente invención está contemplada para cubrir el uso de cualquier preparación del factor XIII y del factor VIIa adecuada para el uso en la presente. Se prefieren el factor VIIa humano y el factor XIII humano. En estas invenciones, también se pueden usar variantes creadas por ingeniería genética del factor VIIa y del factor XIII que retienen su actividad relacionada con la hemostasis característica. En estas invenciones, también se pueden usar fragmentos del factor VIIa o del factor XIII o variantes del factor VIIa o del factor XIII que retienen su actividad característica relacionada con la hemostasis. La actividad relacionada con la hemostasis de un factor VIIa puede, por ejemplo, ser medida usando el ensayo de actividad del factor VIIa descrito en la presente descripción. La actividad relacionada con la hemostasis de un factor XIII puede, por ejemplo, ser medida usando el ensayo de actividad del factor XIII descrito en la presente descripción.

Ejemplos no limitativos de variantes del factor VII que tienen sustancialmente la misma o mejor actividad biológica en comparación con el factor de tipo salvaje VIIa incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos en las solicitudes de Patente Danesa Nos. PA 2000 00734, PA 2000 01360, PA 2000 01361, y PA 2001 00477. Ejemplos no limitativos incluyen [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L3051]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [VI 58T/M298Q]-FVIIa, [VI 58D/E296V/M298Q]-FVIIa y [K337A]-FVIIa.

En este contexto las indicaciones de tres letras o de una letra de los aminoácidos han sido usadas según su significado convencional según se indica en la tabla 1. A menos que se indique explícitamente, los aminoácidos mencionados en la presente son L-aminoácidos. Debe entenderse, que la primera letra en, por ejemplo, K337 representa el aminoácido naturalmente presente en el factor VII de tipo salvaje en la posición indicada, y que, por ejemplo, [K337A]-FVIIa se refiere a la variante de FVII donde el aminoácido representado por el código K de una letra naturalmente presente en la posición indicada es reemplazado por el aminoácido representado por el código A de una letra.

TABLA 1 Abreviaturas para aminoácidos

Aminoácido	Código de tres letras	Código de una letra
Glicina	Gly	G
Prolina	Pro	P
Alanina	Ala	A
Valina	Val	V
Leucina	Leu	L
Isoleucina	Ile	I
Metionina	Met	M
Cisteína	Cys	C
Fenilalanina	Phe	F
Tirosina	Tyr	Y
Triptófano	Trp	W
Histidina	His	H
Lisina	Lys	K
Arginina	Arg	R
Glutamina	Gln	Q
Asparragina	Asn	N
Ácido Glutámico	Glu	E
Ácido Aspártico	Asp	D

Los términos "factor VIIa" o "FVIIa" pueden ser usados de forma intercambiable. El término factor VIIa incluye el factor VII zimógeno ( factor VII monocatenario). Los términos "factor XIII" o "FXIII" pueden ser usados de forma intercambiable. Los términos "factor VIII" o "FVIII" pueden ser usados de forma intercambiable.

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden hacer sustituciones fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula del factor VIIa o del factor XIII y además dan como resultado un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido del factor VIIa o del factor XIII, y en consecuencia preferiblemente no sometidos a sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis de rastreo de alanina (ver, p. ej., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y se evalúa el coagulante de las moléculas mutantes resultantes, respectivamente la actividad de entrecruzamiento para identificar residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los lugares de interacción del sustrato enzimático pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según está determinado por técnicas como el análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (ver, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por medio de la mutagénesis sitio-dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Es particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario superhelicoidal, con una inserción de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleátidos, cada uno complementario de las cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. Al incorporar los cebadores, se genera un plásmido mutado con cortes en bisel. Tras la variación de la temperatura, el producto es tratado con Dpnl, que es específico para ADN metilado y hemimetilado para digerir el ADN molde parental y para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación. Otros procedimientos conocidos en la técnica para crear, identificar y aislar variantes pueden también ser usados, como, por ejemplo, técnicas de transposición de genes o de exposición del bacteriófago.

El término "factor VIII" o "FVIII" incluye el factor VIII activado (denominado factor VIIIa), variantes y formas truncadas del factor VIII reteniendo su actividad coagulante característica. En una forma de realización, el factor VIII es el factor VII Ihumano.

El término "inhibidor TFPI" se refiere a compuestos que inhiben la actividad anticoagulante de TFPI (inhibidor de la vía del factor tisular). El término incluye compuestos como los descritos en la Patente europea N°. 558 529, WO 96/28153 y US 5,622,988. Se puede usar "TFPI" y "EPI" (inhibidor de la vía extrínseca) de forma intercam-
biable.

Dentro de la presente invención una "cantidad efectiva" de un factor VIIa y una "cantidad efectiva" de un factor XIII se definen como la cantidad de un factor VIIa y un factor XIII suficiente para prevenir o reducir el sangrado o la pérdida de sangre, para curar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones.

La cantidad de un factor VIIa y la cantidad de un factor XIII administrado según la presente invención puede variar de una proporción de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1 (pg de factor VIIa: pg de factor
XIII).

En este contexto, "sujetos con una generación de trombina perjudicada" se refiere a sujetos que no pueden generar una producción total de trombina en la superficie plaquetaria activada e incluyen sujetos que tienen una generación de trombina inferior a la generación de trombina en sujetos que tienen un sistema hemostático que funciona completamente normal, incluyendo una cantidad y función normales de factores de coagulación, plaquetas y fibrinógeno, e incluyendo sujetos carentes de FIX y/o FVIII (hemofilia A y B) o que tienen FIX defectuoso y/o FVIII o que tienen inhibidores contra FIX y/o FVIII; sujetos carentes de FXI; sujetos con un número reducido de plaquetas o con plaquetas con mal funcionamiento (p. ej., trombocitopenia o trombastenia Glanzmann o sujetos con sangrado excesivo); y sujetos que tienen niveles reducidos de protrombina, FX o FVII.

Los sujetos con concentraciones de plasma reducidas de fibrinógeno (p. ej., sujetos multitransfundidos como consecuencia de un traumatismo múltiple o cirugía extensiva) también sufren la formación de tapones de fibrina malformados e inestables que son fácilmente disueltos.

El término "hemostasis completa" significa la formación de un coágulo o tapón de fibrina estable y sólido en el lugar de la herida que detiene eficazmente el sangrado y que no es fácilmente disuelto por el sistema fibrinolítico.

El término "actividad del factor VIIa" o significa la capacidad para generar trombina; el término también incluye la capacidad para generar trombina en la superficie de las plaquetas activadas en ausencia de factor tisular.

El término "aumento del sistema hemostático normal" significa una intensificación de la capacidad para generar trombina.

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Según se utiliza en este caso, el término "alteración del sangrado" refleja cualquier defecto congénito, adquirido o inducido, de origen celular o molecular manifestada en los sangrados. Ejemplos son deficiencias del factor de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII), inhibidores del factor de coagulación, función de las plaquetas defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand.

El término "episodios de sangrado" incluye el sangrado descontrolado y excesivo que es un gran problema relacionado con la cirugía y otras formas de daño tisular. Se puede producir un sangrado descontrolado y excesivo en sujetos con un sistema de coagulación básicamente normal (estos sujetos no obstante desarrollan una coagulopatía resultante del sangrado-dilución de proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y plaquetas reducidas debido a un efecto de dilución del sangrado) y en sujetos con coagulación o trastornos del sangrado. Las deficiencias del factor de coagulación (hemofilia A y B, deficiencia de factores de coagulación XI o VII) o los inhibidores del factor de coagulación pueden ser la causa de los trastornos del sangrado. Los sangrados excesivos también ocurren en sujetos con una cascada de coagulación de la sangre con un funcionamiento normal (sin deficiencias del factor de coagulación o de inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) y pueden ser provocados por un funcionamiento plaquetario defectuoso, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. En estos casos, los sangrados pueden ser comparados a los sangrados provocados por la hemofilia porque el sistema hemostático, como en la hemofilia, carece de o tiene "compuestos" de coagulación esenciales anormales (como plaquetas o proteína con factor de von Willebrand) que produce mayores sangrados. En sujetos que experimentan un daño tisular extensivo asociado con la cirugía o con un traumatismo de grandes dimensiones, el mecanismo hemostático normal puede ser rebasado por la demanda de hemostasis inmediata y pueden desarrollar el sangrado a pesar de un mecanismo hemostático (pretraumático) básicamente normal. Conseguir una hemostasis satisfactoria también es un problema cuando ocurren sangrados en órganos como el cerebro, región interna del oído y ojos con limitada posibilidad de hemostasis quirúrgica. El mismo problema puede surgir en el proceso de tomar biopsias de varios órganos (hígado, pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal) así como en cirugía laparoscópica. Un factor común en todas estas situaciones es la dificultad para proporcionar hemostasis por técnicas quirúrgicas (sutura, clips, etc.) siendo también el caso cuando el sangrado es difundido (gastritis hemorrágica y sangrado uterino profuso). Los sangrados graves y profusos pueden también ocurrir en sujetos en terapia anticoagulante en los que se haya inducido una hemostasis defectuosa por la terapia dada. Estos sujetos pueden precisar intervenciones quirúrgicas en el caso de que el efecto anticoagulante tenga que ser contrarrestado rápidamente. La prostatectomía retropúbica radical es un procedimiento común para sujetos con cáncer prostático localizado. La operación se complica frecuentemente por una pérdida de sangre significante y a veces masiva. La pérdida de sangre considerable durante la prostatectomía está principalmente relacionada con una situación anatómica complicada, con varios lugares densamente vascularizados que no son fácilmente accesibles para la hemostasis quirúrgica, y que pueden suponer un sangrado difundido en un área amplio. Otra situación que puede causar problemas en el caso de una hemostasis insatisfactoria es cuando se proporciona una terapia anticoagulante a sujetos con un mecanismo hemostático normal para prevenir una enfermedad tromboembólica. Esta terapia puede incluir heparina, otras formas de proteoglicanos, warfarina u otras formas de antagonistas de la vitamina K así como aspirina y otras inhibidores de la agregación plaquetaria.

En una forma de realización de la invención, el sangrado está asociado con la hemofilia. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la hemofilia con inhibidores adquiridos. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la trombocitopenia. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la enfermedad de von Willebrand. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con un daño tisular severo. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con un traumatismo severo. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la cirugía. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la cirugía laparoscópica. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la gastritis hemorrágica. En otra forma de realización, el sangrado es sangrado uterino profuso. En otra forma de realización, el sangrado se produce en órganos con una limitada posibilidad de hemostasis mecánica. En otra forma de realización, el sangrado se produce en el cerebro, región interna del oído u ojos. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con el proceso de tomar biopsias. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con una terapia anticoagulante.

La composición según la invención puede además comprender un Inhibidor TFPI. Esta composición sería preferible que fuera administrada a sujetos con hemofilia A o B.

La composición según la invención puede además comprender un factor VIII. Esta composición debería preferiblemente ser administrada a sujetos que no tengan inhibidores del factor VIII.

En este contexto, el término "tratamiento" incluye la prevención de un sangrado previsto, como, por ejemplo, en cirugía, y la regulación de un sangrado ya ocurrido, como, por ejemplo, en la hemofilia o en el traumatismo, con el propósito de inhibir o minimizar el sangrado. La administración profiláctica de un factor VIIa y un factor XIII está incluida por lo tanto en el término "tratamiento".

El término "sujeto" según se utiliza en este caso se refiere a cualquier animal, en particular mamíferos, como seres humanos, y puede, si fuera apropiado, ser usado de forma intercambiable con el término "paciente".

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Abreviaturas

TF

factor tisular

FVII

factor VII en su forma monocatenaria, inactivada

FVIIa

factor VII en su forma activada

rFVIIa

factor Vil recombinante en su forma activada

FXIII

factor XIII en su forma zimogénica, inactivada

FXIIIa

factor XIII en su forma activada

rFXIII

FXIII recombinante

rFXIIIa

FXIIIa recombinante

a2

cadena alfa o a- de FXIII o rFXIII

b2

cadena beta o b- de FXIII o rFXIII

FXIIIa2

forma dimérica de FXIII que contiene dos cadenas a-

FXIIIa2b2

forma tetramérica de FXIII que contiene dos cadenas a- y b-

FVIII

factor VIII en su forma zimogénica, inactivada

rFVIII

FVIII recombinante

FVIIIa

factor VIII en su forma activada

rFVIIIa

FVIIIa recombinante

TFPI

inhibidor de la vía del factor tisular

Preparación de compuestos

El factor VIIa humano purificado adecuado para el uso en la presente invención es preferiblemente producido mediante la tecnología del ADN recombinante, p. ej. según se describe por Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986 o según se describe en la Patente europea N°. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.). El factor VIIa producido mediante la tecnología recombinante puede ser el factor VIIa auténtico o un factor VIIa más o menos modificado a condición de que este factor VIIa tenga sustancialmente la misma actividad biológica para la coagulación de la sangre que el factor VIIa auténtico (factor VIIa de tipo salvaje). Este factor VIIa modificado puede ser producido modificando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el factor VII de tipo salvaje bien alterando los codones de los aminoácidos o eliminando algunos codones de los aminoácidos en el ácido nucleico que codifica el factor VII natural mediante medios conocidos, p. ej. por mutagénesis sitio-específica.

El factor VII puede también ser producido por los métodos descritos por Broze y Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242 1247, 1980 y Hedner y Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Estos métodos producen un factor VII sin cantidades apreciables de otros factores de coagulación sanguínea. También se puede obtener otra preparación del factor VII purificado mediante la inclusión de una filtración adicional en gel como la fase de purificación final. El factor VII es luego convertido en factor VIIa activado por unos medios conocidos, p. ej. por diferentes proteínas plasmáticas, como factor XIIa, IX a o Xa. De forma alternativa, como está descrito por Bjoem et al. (Research Disclosure, 269 Septiembre 1986, págs. 564-565), el factor VII puede ser activado al pasar a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, como Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o similar.

El factor XIII para el uso en la presente invención puede ser obtenido a partir de plasma según unos métodos conocidos, como los descritos por Cooke y Holbrook (Biochem. J. 141: 79-84, 1974) y Curtis y Lorand (Methods Enzymol. 45: 177-191, 1976), incorporados aquí por referencia. La forma del dímero a2 del factor XIII puede ser preparada a partir de placenta como se describe en las Patentes U.S. Nos. 3,904,751; 3,931,399; 4,597,899 y 4,285,933, incorporadas aquí por referencia. Se prefiere, no obstante, usar el factor XIII recombinante para evitar usar productos derivados de la sangre o del tejido que conllevan un riesgo de transmisión de enfermedades. Los métodos para preparar factor XIII recombinante son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Davie et al., EP 268,772; Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279-283; y Bröker et al., FEBS Left. 1989, 248: 105-110, que están incorporados aquí por referencia en su totalidad. En una forma de realización, el dímero a2 del factor XIII es preparado citoplásmicamente en la levadura de Saccharomyces cerevisiae según está descrito en la solicitud de patente divisional U.S. Ser. N°. 07/741,263, incorporada aquí por referencia en su totalidad). Las células son recogidas y lisadas, y se prepara un lisado aclarado. El lisado es fraccionado por cromatografía de intercambio aniónico con pH de neutro a ligeramente alcalino usando una columna de agarosa derivatizada, como DEAE Fast-Flow Sepharose.™. (Pharmacia) o similar. El factor XIII es luego precipitado del eluato de la columna para concentrar el eluato y ajustar el pH a 5.2-5.5, como por diafiltración contra un tampón de succinato de amonio. El precipitado es luego disuelto y purificado adicionalmente
usando técnicas cromatográficas convencionales, como filtración en gel y cromatografía de interacción hidrofóbica.

Como será apreciado por expertos en la técnica, se prefiere el uso de proteínas del factor XIII y factor VIIa singénicas con el sujeto para reducir el riesgo de inducir una respuesta inmunitaria. La preparación y caracterización del factor XIII no humano han sido descritas por Nakamura et al. (J. Biochem. 78: 1247-1266, 1975). La presente invención también incluye el uso de estas proteínas del factor XIII y factor VIIa en procedimientos veterinarios.

Administración y composiciones farmacéuticas

Para un tratamiento relacionado con intervenciones deliberadas, el factor VII y el factor XIII normalmente será administrado en un periodo de aproximadamente 24 horas antes de realizar la intervención, y durante al menos 7 días o más después de ésta. La administración como un coagulante puede ser por una variedad de vías como se describe en la presente.

La dosis del factor VII varía de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 500 mg/día, p. ej., de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg/día, o, p. ej., de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175 mg/día para un sujeto de 70 kg de peso como dosis de carga y de mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto, la enfermedad y la gravedad de la enfermedad.

La dosis del factor XIII varía de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 500 mg/día, p. ej., de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg/día, o, p. ej., de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175 mg/día para un sujeto de 70 kg como dosis de carga y de mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto, la enfermedad y la gravedad de la enfermedad.

Las composiciones y kits descritos en la presente son útiles en medicina humana y veterinaria; como, por ejemplo, en el tratamiento o profilaxis de sujetos que sufren episodios de sangrado o trastornos de la coagulación. Para el uso dentro de la presente invención, el factor VIIa y el factor XIII son formulados, opcionalmente con un soporte farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas deben ser administradas parenteralmente, es decir, por vía intravenosa, subcutánea, o intramuscularmente, o pueden ser administradas por infusión continua o pulsátil.

Las formulaciones pueden además incluir uno o más diluyentes, emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes, etc. y pueden ser proporcionados en estas formas como líquidos, polvos, emulsiones, liberación controlada, etc. Los expertos en esta técnica pueden formular las composiciones de la invención de una manera apropiada, y de acuerdo con prácticas aceptadas, como las descritas en Reminaton's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Las composiciones para la administración parenteral comprenden un factor VII y un factor XIII en combinación con, preferiblemente disueltos en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos pueden ser usados, como el agua, agua tamponada, 0.4% de solución salina, 0.3% de glicina y similares. Las variantes del factor VII de la invención pueden también ser formuladas en preparaciones de liposomas para administrar o dirigir a los lugares donde se produzca la herida. Las preparaciones de liposomas están descritas en general en, p. ej., U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728, y U.S. 4,975,282.

Una composición farmacéutica típica para infusión intravenosa podría ser realizada para contener 250 ml de solución estéril de Ringer y 10 mg de un factor VIIa y/o un factor XIII. Los métodos reales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y están descritos con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

En resumen, las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso según la presente invención se hacen mezclando un factor VIIa, o un factor XIII, o un factor VIIa en combinación con un factor XIII, preferiblemente en forma purificada, con adyuvantes adecuados y un portador o diluyente adecuado. Portadores o diluyentes fisiológicos aceptables adecuados incluyen agua estéril y solución salina. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según se requiera para acercarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH y amortiguadores, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Adyuvantes adecuados también incluyen calcio, proteínas (p. ej. albúminas), u otros péptidos inertes (p. ej. glicilglicina) o aminoácidos (p. ej. glicina, o histidina) para estabilizar el factor purificado VIIa y/o factor XIII. Otros adyuvantes fisiológicos aceptables son azúcares no reductores, polialcoholes (p. ej. sorbitol, manitol o glicerol), polisacáridos como dextrinas de peso molecular bajo, detergentes (p. ej. polisorbato) y antioxidantes (p. ej. bisulfito y ascorbato). Los adyuvantes están presentes generalmente en una concentración de 0.001 a 4% p/v. La composición farmacéutica puede también incluir inhibidores de proteasa, p. ej. aprotinina o ácido tranexámico, y agentes conservantes. Además, la preparación puede también contener un inhibidor TFPI y/o factor VIII.

Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con una solución acuosa estéril antes de la administración.

La concentración de un factor VIIa, un factor XIII, o un factor VIIa en combinación con un factor XIII en estas formulaciones pueden variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente el 0.5% en peso, normalmente hasta o al menos de aproximadamente el 1% en peso hasta un máximo del 15 o 20% en peso y será seleccionada principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., conforme al modo particular de administración seleccionado.

Se prefiere la administración por inyección o infusión, en particular por inyección. Así, el factor VIIa y el factor XIII son preparados en una forma adecuada para la administración intravenosa, como por ejemplo una preparación que sea un polvo liofilizado disuelto o sea una formulación líquida que contenga el factor VIIa y el factor XIII en una dosificación unitaria, o un polvo disuelto liofilizado o una formulación líquida que contenga el factor VIIa en una dosificación unitaria y un polvo liofilizado disuelto o una formulación líquida que contenga el factor XIII en otra dosificación unitaria.

La administración local de un factor VIIa y un factor XIII, como, por ejemplo, mediante aplicación tópica puede ser realizada, por ejemplo, mediante una pulverización, perfusión, catéteres de balón doble, stent, incorporados en injertos vasculares o stents, hidrogeles usados para revestir catéteres de balón, u otros métodos bien establecidos. Para sujetos ambulatorios que requieren niveles de mantenimiento diario, el factor VIIa y el factor XIII puede ser administrado por infusión continua usando p. ej. un sistema de bombeo portátil. De cualquier modo, las composiciones farmacéuticas deberían proporcionar una cantidad de un factor VIIa y un factor XIII suficiente para tratar eficazmente al sujeto.

La combinación de un factor VIIa y un factor XIII muestra un efecto sinergístico en un ensayo de firmeza y de duración de la fibrinólisis del coágulo in vitro. Además, la combinación de un factor VIIa y un factor XIII muestra un efecto sinergístico para la formación de coágulos de fibrina estables, aumentando el tiempo de tisis de la mitad del coágulo, aumentando la resistencia del coágulo y aumentando la resistencia a la fibrinólisis.

Las composiciones que contienen un factor VII y un factor XIII pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En usos terapéuticos, las composiciones son administradas a un sujeto que ya padece una enfermedad, según el modo descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o parcialmente detener la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograrlo está definida como una "cantidad eficaz" o una "cantidad eficaz terapéuticamente". Como experto en la materia entenderá, las cantidades eficaces para este propósito dependerán de la gravedad de la enfermedad o herida al igual que del peso y estado general del sujeto. Hay que tener en cuenta que los materiales de la presente invención pueden generalmente ser empleados en estados de enfermedad o heridas graves, es decir, en situaciones que ponen en peligro la vida o que la ponen en peligro potencialmente. En estos casos, vista la minimización de sustancias extrañas y la falta general de inmunogenicidad del factor VIIa y factor XIII en los seres humanos, es posible y puede ser deseable por el médico tratante que se administre un exceso sustancial de estas composiciones.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen un factor VIIa y un factor XIII son administradas a un sujeto susceptible de o por el contrario en riesgo de un estado de enfermedad o herida para aumentar la capacidad coagulativa propia del sujeto. Esta cantidad está definida por ser una "dosis eficaz profiláticamente."

Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con niveles de dosis y modelos que son seleccionados por el médico tratante. Las composiciones pueden ser administradas una o más veces al día o a la semana. Una cantidad eficaz de esta composición farmacéutica es la cantidad que proporciona un efecto clínicamente significante contra episodios de sangrado. Estas cantidades dependerán, en parte, de la condición particular que se deba tratar, edad, peso, y salud general del sujeto, y otros factores evidentes para los expertos en la técnica.

La composición es generalmente administrada en una dosis individual antes del sangrado previsto o al principio del sangrado. No obstante, también puede darse en dosis múltiples, preferiblemente con intervalos de 2-4-6-12 horas, dependiendo de la dosis y de la enfermedad del sujeto.

La composición puede estar en forma de una preparación individual que comprende un factor VIIa y un factor XIII en concentraciones adecuadas. La composición puede también estar en forma de un kit consistente en una forma de una primera dosificación individual que comprende un factor VIIa y una segunda forma de dosificación individual que comprende un factor XIII y, opcionalmente, una o más formas de dosificación individual adicionales que comprenden un factor VIII y/o un inhibidor TFPI. En este caso, el factor VIIa y el factor XIII deberían de ser administrados consecutivamente, preferiblemente en aproximadamente 1-2 horas entre uno y otro, por ejemplo 30 minutos entre uno y otro o, preferiblemente, 10 minutos o, más preferiblemente, 5 minutos entre uno y otro. Cualquiera de las dos formas de dosificación unitaria pueden ser administradas primero.

Puesto que la presente invención se refiere a la prevención o tratamiento de episodios de sangrado o para un tratamiento de coagulación por tratamiento con una combinación de ingredientes activos que pueden ser administrados por separado, la combinación de las composiciones farmacéuticas separadas en forma de kits está también descrita. El kit incluye al menos dos composiciones farmacéuticas separadas. El kit incluye unos medios contenedores para contener las composiciones separadas como una botella dividida o un paquete de hojas divididas. Normalmente el kit incluye direcciones para la administración de los componentes separados. La forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados son preferiblemente administrados en formas de dosificación diferentes, cuando son administrados a intervalos de dosificación diferentes, o cuando la titulación de los componentes individuales de la combinación es deseada por el médico de cabecera.

Ensayos Evaluación de la actividad del factor VIIa

Un ensayo adecuado para evaluar la actividad del factor VIIa y seleccionar así las variantes del factor VIIa adecuadas puede ser realizado como una prueba preliminar simple in vitro:

Ensayo de hidrólisis in vitro

Se pueden evaluar las actividades específicas del factor VIIa nativo (tipo salvaje) y de la variante del factor VIIa (ambos denominados a partir de aquí "factor VIIa"). También se pueden evaluar paralelamente para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El sustrato cromogénico D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final 1 mM, se añade al factor VIIa (concentración final 100 nm) en 50 mM de Hepes, pH 7.4, que contiene 0.1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm está medida continuamente en un lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbencia en un pocillo blanco que no contenía ninguna enzima, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades de la variante y del factor VIIa de tipo salvaje: Proporción = (A405 nm de la variante factor VIIa)/(A405 nm de factor VIIa de tipo salvaje):

Proporción = (A_{450 \ nm} de la variante factor \ VIIa)/(A_{405 \ nm} de factor VIIa de tipo salvaje).

Basado en lo anterior, las variantes del factor VIIa con una actividad comparable o superior al factor VIIa nativo pueden ser identificadas, como, por ejemplo, las variantes en las que la proporción entre la actividad de la variante y la actividad del factor VII nativo mostrado en la Fig. 1 está alrededor, versus sobre 1.0.

La actividad del factor VIIa o de las variantes del factor VIIa pueden también ser medidas usando un sustrato fisiológico como el factor X, idóneamente a una concentración de 100-1000 nM, donde el factor Xa generado es medido después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo, S-2765). Además, el ensayo de actividad puede ser realizado a temperatura fisiológica.

La capacidad del factor VIIa o variantes del factor VIIa para generar trombina puede también ser medida en un ensayo que comprende todos los factores de coagulación pertinentes e inhibidores a concentraciones fisiológicas (menos el factor VIII cuando imita las condiciones de la hemofilia A) y plaquetas activadas (como se describe en p. 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547 que se incorpora a la presente como referencia).

Evaluación de la actividad del factor XIII

Un ensayo adecuado para evaluar la actividad transglutaminasa del factor XIII y de ese modo seleccionar variantes del factor XIII adecuadas puede ser realizado como una simple prueba in vitro como se describe, por ejemplo, en Methods of Enzymology, Vol. 45 (1976), Proteolytic Enzymes, Part B, pages 177-191 (Ed. Lorand, L.).

La presente invención está ilustrada con mayor detalle por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no deben ser construidos como limitadores del objetivo de protección. Las características descritas en la descripción anterior y en los ejemplos siguientes pueden, ambos separadamente y en cualquiera de sus combinaciones, ser materiales para realizar la invención de diversas formas.

Ejemplos Ejemplo 1 El factor XIII aumenta la formación del coágulo de fibrina inducida por el factor VIIa

El plasma humano citrado normal (NHP) fue diluido 1/10 en un tampón que contenía 20 nm de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, pH 7.4 en un pocillo de micro titulación ( volumen total 250 NI) y la formación del coágulo de fibrina fue controlada por el aumento de la densidad óptica a 600 nm en un Specramax™ 340 (Molecular Devices, Sunnyvale CA).

La formación del coágulo espontánea se obtuvo a aproximadamente 2500-3000 seg. La Fig. 1 muestra que 10 nM de factor VIIa recombinante (rFVIIa) (Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dinamarca) redujo el tiempo de coagulación a 1600 seg (N = 2). Además la reducción del tiempo de coagulación se obtuvo cuando 30 nM de factor XIII (FXIII) (American Diagnostica inc, Greenwich, CT) fueron añadidos junto con 10 nM de rFVIIa (N = 3). El coágulo formado ante FXIII fue más transparente (inferior a la OD máxima) que en su ausencia lo que indica que la adición de FXIII resultó en una estructura de gel de fibrina de malla más fina con fibras más delgadas.

Ejemplo 2 La presencia de factor XIII suplementario durante la formación del coágulo inducida por el factor VIIa ocasiona mayor resistencia a la degradación fibrinolítica

Un coágulo de fibrina consistente en fibras finas es mecánicamente más fuerte y más difícil de degradar que un coágulo que contenga la misma cantidad de fibrina dispuesta como fibras gruesas o fibras menos entrecruzadas. El experimento mostrado en la Fig. 2 ilustra que más FXIII (30 nM) prolonga el tiempo de Tisis del coágulo de fibrina formado en presencia de rFVIIa y del activador plasminógeno del tejido (t-PA, American Diagnostica). La formación del coágulo fue inducida en presencia o ausencia de 30 nM de FXIII mediante la adición de 25 \mul de NHP a 225 \mul de HEPES 20 nM, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, pH 7.4 conteniendo 50 nM de rFVIIa y 0.5 nM de t-PA recombinante. La formación del coágulo y la resultante tisis del coágulo inducida por medio de la activación del plasminógeno por medio de t-PA fue controlada por un Spectramax® 340 a 600 nm como el aumento de OD_{600 \ nm} seguido de la reversión del metal traza al nivel basal. La Fig. 2 muestra que el tiempo de tisis del coágulo bajo estas condiciones fue significativamente prolongado por la presencia de FXIII.

Ejemplo 3 El factor VIIa en combinación con el factor XIII aumenta la firmeza máxima del coágulo y aumenta la resistencia del coágulo a la fibrinólisis

Las mediciones de la trombelastografía fueron conducidas en plasma humano normal citrado al que se añadió 6 nM de activador de plasminógeno del tejido de tipo recombinante (t-PA, American Diagnostica) y el efecto de la adición de 1 nM rFVIIa (Novo Nordisk NS, Bagsvaerd, Dinamarca) solo o en combinación con varias concentraciones de factor XIII (FXIII, Haematologic Technologies, HCXIII-0160, Lot N1212,) fue analizado. La coagulación fue iniciada mediante la adición de Innovin (concentración final diluida 2000 veces, Dade Behring # 526945) y calcio (concentración final 15 mM) en un tampón 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.4.

Las mediciones de trombelastografía fueron utilizadas para analizar el efecto de rFVIIa y FXIII en Firmeza Máxima del Coágulo (MCF) al igual que la resistencia del coágulo a la tisis por medio de t-PA. Antes de añadir rFVIIa y/o FXIII la MCF obtenida fue 25 mm y el tiempo requerido para lisar la mitad del coágulo fue 12.3 minutos (Fig. 3). La adición de concentraciones en aumento de FXIII (0-40 nm) no alteraron la MCF; no obstante, una prolongación dependiente de la dosis de la Tisis de la mitad del coágulo fue observada, siendo óptima a 30 nM de FXIII (tiempo de Tisis de la mitad del coágulo: 14,3 minutos, Fig. 3). De forma similar, la adición de rFVIIa (1 nM) resultó en la protección del coágulo a partir de fibrinólisis por medio de t-PA (tiempo de lisis de la mitad del coágulo; 16.4 minutos) sin cualquier efecto en la MCF (Fig. 3). No obstante, tras la adición de rFVIIa (1 nm) junto con FXIII (30 nM) se observó un aumento en la MCF (29 mM), al igual que una protección profunda a partir de la fibrinólisis (tiempo de tisis de la mitad del coágulo; 27.1 minutos) (Fig. 3). Tomados juntos, estos resultados demuestran que la adición de rFVIIa y FXIII a plasma de forma sinergística mejora la fuerza mecánica del coágulo y la resistencia a la fibrinólisis por medio de t-PA.

Claims (16)

1. Uso de un factor VIIa en combinación con un factor XIII para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado en un sujeto, el medicamento estando previsto para la administración intravenosa.

2. Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación en un sujeto.

3. Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para prolongar el tiempo de Tisis del coágulo en plasma mamífero normal.

4. Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para aumentar la resistencia del coágulo en plasma mamífero normal.

5. Uso según la reivindicación 1, para la producción de un medicamento para aumentar la formación del coágulo de fibrina en plasma humano normal.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el factor VIIa es una variante del factor VII.

7. Uso según la reivindicación 6, donde la variante del factor VII está seleccionada de la lista formada por: [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L3051]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [VI 58D/E296V/M298Q]-FVIIa y [K337A]-FVIIa.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el factor VIIa es el factor VIIa humano, como el factor VIIa recombinante humano.

9. Uso según la reivindicación 8, donde el factor VIIa y el factor XIII es el factor VIIa recombinante humano y el factor XIII recombinante humano.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el medicamento además contiene un inhibidor del sistema fibrinolítico.

11. Uso según la reivindicación 10, donde el inhibidor del sistema fibrinolítico está seleccionado de la lista formada por: aprotinina, ácido epsilon-aminocaproico, y ácido tranexámico.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el factor VIIa y el factor XIII debe ser administrado de forma secuencial en un periodo de 1-2 horas, así como de 30 minutos, o 10 minutos, entre uno y otro.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el sujeto tiene una generación de trombina perjudicada.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el sujeto tiene una concentración de plasma reducida de fibrinógeno.

15. Uso según la reivindicación 14, donde el sujeto es multitransfundido, p.ej., como resultado de un traumatismo múltiple o cirugía extensiva.

16. Uso según la reivindicación 15, donde la multitranfusión es una consecuencia de un traumatismo múltiple o cirugía extensiva.