DE60112429T2 - Verwendung von faktor vii-a und faktor xiii enthaltenden pharmazeutischen verbindungen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DIESER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Kombination eines Faktors VIIa mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Patienten, die unter Blutungen leiden, oder zu deren Vorbeugung.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Hämostase wird durch die Bildung eines Komplexes zwischen dem Gewebefaktor (TF), der dem Blutkreislauf im Anschluss an eine Gefäßwandverletzung ausgesetzt wird, und FVIIa, der im Blutkreislauf in einer Menge vorliegt, die etwa 1% der gesamten FVII-Proteinmasse entspricht, ausgelöst. Dieser Komplex ist auf der TF-tragenden Zelle verankert und aktiviert FX zu FXa und FIX zu FIXa auf der Zelloberfläche. FXa aktiviert Prothrombin zu Thrombin, welches FVIII, FV, FXI und FXIII aktiviert. Des Weiteren aktiviert die begrenzte Menge an Thrombin, die in diesem Anfangsschritt der Hämostase gebildet wird, auch die Blutplättchen. Im Anschluss an die Einwirkung von Thrombin auf die Blutplättchen ändern diese die Gestalt und exponieren geladene Phospholipide auf ihrer Oberfläche. Diese aktivierte Blutplättchenoberfläche bildet die Matrize für die weitere FX-Aktivierung und die volle Thrombinbildung. Die weitere FX-Aktivierung auf der aktivierten Blutplättchenoberfläche erfolgt durch einen FIXa-FVIIIa-Komplex, der auf der Oberfläche des aktivierten Blutplättchens gebildet wird, und FXa wandelt Prothrombin zu Thrombin um, während dieser sich noch auf der Oberfläche befindet. Thrombin wandelt dann Fibrinogen zu Fibrin um, welches unlöslich ist und den anfänglichen Blutplättchenpfropfen stabilisiert. Dieser Vorgang ist abgegrenzt, d.h. an der Stelle der TF-Expression oder -Exposition lokalisiert, und minimiert dadurch das Risiko der systemischen Aktivierung des Gerin nungssystems. Das unlösliche Fibrin, das den Pfropfen bildet, wird des Weiteren durch die FXIII-katalysierte Vernetzung der Fibrinfasern stabilisiert.
  • FVIIa liegt im Plasma hauptsächlich als einkettiges Zymogen vor, welches durch FXa in seine zweikettige aktivierte Form FVIIa gespalten wird. Der rekombinante aktivierte Faktor VIIa (rFVIIa) wurde als ein prohämostatisches Mittel entwickelt. Die Verabreichung von rFVIIa bietet eine schnelle und hochwirksame prohämostatische Antwort bei Blutertestpersonen mit Blutungen, die wegen der Antikörperbildung nicht mit Gerinnungsfaktorprodukten behandelt werden können. Auch Blutertestpersonen mit einem Mangel an Faktor VII oder Patienten, die über ein normales Gerinnungssystem verfügen, aber eine übermäßige Blutung erleiden, können mit FVIIa erfolgreich behandelt werden. In diesen Studien ist man auf keine nachteiligen Nebenwirkungen von rFVIIa (insbesondere das Auftreten von Thromboembolie) gestoßen.
  • Zusätzlich exogen verabreichter FVIIa erhöht die Bildung von Thrombin auf der aktivierten Blutplättchenoberfläche. Dies kommt bei Blutertestpersonen vor, denen FIX oder FVIII und deshalb der wirksamste Weg der vollen Thrombinbildung fehlt. Auch in Gegenwart einer verringerten Anzahl von Blutplättchen oder von Blutplättchen mit einer Fehlfunktion erhöht zusätzlicher FVIIa die Thrombinbildung.
  • FXIII, der Fibrin stabilisierende Faktor, ist eine Transglutaminase, die die Fibrinmonomere vernetzt und dadurch eine Fibrinstruktur mit erhöhter Resistenz gegen eine Auflösung durch Plasmin oder andere proteolytische Enzyme bereitstellt. Der Faktor XIII ist auch als „Fibrinoligase" und „Fibrin stabilisierender Faktor" bekannt. Wenn er aktiviert ist, kann FXIIIa intermolekulare Gamma-Glutamyl-Epsilon-Lysin-Vernetzungen zwischen den Seitenketten von Fibrinmolekülen und zwischen anderen Substraten bilden. FXIII findet man im Plasma und in Blutplättchen. Das Enzym liegt im Plasma als ein tetrameres Zymogen, das aus zwei Alpha-Untereinheiten und zwei Beta-Untereinheiten (bezeichnet als a2b2) besteht, und in Blutplättchen als ein Zymogen, das aus zwei Alpha-Untereinheiten (bezeichnet als a2-Dimer) besteht, vor.
  • Beide Zymogene werden durch Thrombin und Ca2+ aktiviert. Calcium wird von den Blutplättchen nach der Aggregation an der Verletzungsstelle freigesetzt. Thrombin spaltet die N-terminalen Aminosäurereste 1–37 (des a2-Dimers) ab. Im Falle des a2b2-Zymogens werden die Beta-Untereinheiten dann von den aktivierten Alpha-Untereinheiten dissoziert. Calcium bindet an das Zymogen und an das Thrombin-modifizierte Molekül gleich gut. Anschließend an die Thrombin- und Calcium-Aktivierung wird das Cystein im aktiven Zentrum in der Alphakette exponiert, und das vollaktivierte Enzym ist gebildet. Man hat festgestellt, dass Patienten mit schwerer Thrombozytopenie eine geringe Menge an FXIII im Plasma aufweisen.
  • Es ist bekannt, dass Patienten, die in Verbindung mit einer Operation oder einer großen Verletzung übermäßig bluten und Bluttransfusionen benötigen, mehr Komplikationen entwickeln, als jene, die keine Blutungen erleiden. Jedoch können auch mittelmäßige Blutungen, welche die Verabreichung von menschlichem Blut oder Blutprodukten (Blutplättchen, Leukozyten, vom Plasma abgeleitete Konzentrate zur Behandlung von Gerinnungsdefekten, etc.) erfordern, zu Komplikationen führen, die mit dem Risiko der Übertragung menschlicher Viren (Hepatitis, HIV, Parvovirus und andere bis jetzt unbekannte Viren) verbunden sind. Übermäßige Blutungen, die massive Bluttransfusionen erfordern, können zur Entwicklung eines Multiorganversagens einschließlich beeinträchtigter Lungen- und Nierenfunktion führen. Sobald ein Patient diese schweren Komplikationen entwickelt hat, beginnt eine Kaskade von Ereignissen, die eine Anzahl von Cytokinen und Entzündungsreaktionen zur Folge haben, was jede Behandlung extrem schwer und unglücklicherweise oft erfolglos macht. Deshalb ist es ein Hauptziel in der Chirurgie sowie in der Behandlung von Gewebeschäden, die Blutung zu vermeiden oder zu minimieren.
  • Um eine derartige Blutung zu vermeiden oder zu minimieren, ist es wichtig, die Bildung von stabilen und festen hämostatischen Pfropfen, die durch fibrinolytische Enzyme nicht einfach aufgelöst werden, zu gewährleisten. Des Weiteren ist es wichtig, eine schnelle und wirksame Bildung derartiger Propfen oder Blutgerinnsel zu gewährleisten.
  • Die Japanische Patentanmeldung Nr. 2-167234 A betrifft ein Haftmittel für Biogewebe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es Fibrinogen, Prothrombin, Blutgerinnungsfaktor VII, Blutgerinnungsfaktor IX, Blutgerinnungsfaktor X, Blutgerinnungsfaktor XIII, Antithrombin, einen Proteaseinhibitor und Calciumion enthält.
  • Die Japanische Patentanmeldung Nr. 59-116213A betrifft eine Aerosolzusammensetzung zur Verwendung als Gewebeklebstoff, die ein Blutgerinnungsmittel als Wirkbestandteil enthält. Das Blutgerinnungsmittel kann aus den Blutgerinnungsfaktoren I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII und XIII, Präkallikrein, hochpolymeres Kininogen und Thrombin ausgewählt sein. Eine Kombination von FXIII und Thrombin ist bevorzugt.
  • WO 93/12813 (ZymoGenetics) betrifft die Verwendung von FXIII, um perioperativen Blutverlust bei einem Patienten, die sich einer Operation unterzogen hat, zu verringern. Die Zusammensetzung kann auch Aprotinin umfassen. Der FXIII wird dem Patienten als eine Bolusinjektion typischerweise ein Tag vor der Operation verabreicht.
  • Das Europäische Patent Nr. 225.160 (Novo Nordisk) betrifft Zusammensetzungen von FVIIa und Verfahren zur Behandlung von Blutungsstörungen, die nicht durch Blutgerinnungsfaktordefekte oder Blutgerinnungsfaktorinhibitoren hervorgerufen werden.
  • Das Europäische Patent Nr. 82.182 (Baxter Travenol Lab.) betrifft eine Zusammensetzung von Faktor VIIa zur Verwendung, dem Mangel an Blutgerinnungsfaktoren oder Wirkungen von Inhibitoren für Blutgerinnungsfaktoren bei einem Patienten entgegenzuwirken.
  • Die Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 93/06855 (Novo Nordisk) betrifft die topische Anwendung von FVIIa.
  • Kjalke et al., Thrombosis and Haemostasis, 1999 (Ergänzungsbd.), 095 1 betrifft die Verabreichung von zusätzlichem exogenem FVIIa und die Wirkung auf die Thrombinbildung auf der aktivierten Blutplättchenoberfläche in einem Modellsystem, das die Bedingungen der Hämophilie A oder B nachahmt.
  • Es bleibt auf dem Fachgebiet Bedarf an einem verbesserten, verlässlichen und breit anwendbaren Verfahren zur Förderung der Blutgerinnung, durch welches insbesondere bei den Patienten, die eine beeinträchtigte Thrombinbildung aufweisen, stabile hämostatische Propfen schnell gebildet werden und eine vollständige Hämostase bei den Patienten erzielt wird. Es besteht auch Bedarf an einem Verfahren, in welchem die Menge an FVIIa, die zum Erzielen von vollständiger Hämostase nötig ist, verringert ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung von Blutungen oder Gerinnungsstörungen zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfinder zeigten, dass eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII die Blutgerinnungszeit eines normalen menschlichen Plasmas wirksamer verringern kann als entweder Faktor VIIa oder Faktor XIII allein. Es wurde auch gezeigt, dass eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII die Stabilität des Blutgerinnsels wirksamer erhöhen kann als entweder Faktor VIIa oder Faktor XIII allein. Durch Kombinieren eines Faktors VIIa mit einer Konzentration, mit der keine weitere Erhöhung der Blutgerinnselstabilität mehr beobachtet wurde, mit einem Faktor XIII auch mit einer Konzentration, mit der keine weitere Erhöhung der Blutgerinnselstabilität mehr beobachtet wurde, wurde unerwarteterweise gezeigt, dass eine weitere Erhöhung der Blutgerinnselstabilität erreicht wurde. Es wurde auch gezeigt, dass eine Kombination eines Faktor VIIa- und eines Faktor XIII die In-vitro-Blutgerinnsellysezeit in einem normalen menschlichen Plasma wirksamer verlängern kann als entweder ein Faktor VIIa- oder ein Faktor XIII-Inhibitor allein. Daher kann durch Fördern der Gerinnung eine wirksamere Behandlung der Blutung bei Patienten erreicht werden. Darüber hinaus können Patienten mit vergleichsweise geringeren Konzentrationen an Faktor VIIa behandelt und daher die vergleichsweise hohen Kosten in Verbindung mit der herkömmlichen Behandlung mit Faktor VIIa allein gesenkt werden.
  • In einer ersten Ausführungsform ist ein Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII als einzige Wirkstoffe und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein für die intravenöse Verabreichung formuliertes Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist ein für die intravenöse Verabreichung formuliertes Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII als einzige Wirkstoffe und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, beschrieben.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIIa um einen rekombinanten Faktor VIIa und bei dem Faktor XIII um einen rekominanten Faktor XIII.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Faktor VIIa um einen rekombinanten Faktor VIIa. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIIa um einen rekombinanten menschlichen Faktor VIIa. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIIa um eine Variante von Faktor VIIa.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei den Varianten von Faktor VIIa um Varianten mit Aminosäuresequenzen, die nicht mehr als 20 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren verglichen mit dem Wildtyp-Faktor VIIa aufweisen (d.h. ein Polypeptid, das die im U.S.-Patent Nr. 4,784,950 offenbarte Aminosäuresequenz aufweist). In einer anderen Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 15 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer anderen Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 10 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer weiteren Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 8 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer anderen Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 6 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer anderen Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 5 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer anderen Ausführungsform weisen die Varianten von Faktor VIIa nicht mehr als 3 ersetzte, entfernte oder eingefügte Aminosäuren verglichen mit dem Wildtyp-Faktor VIIa auf; in einer Ausführungsform sind die Varianten von Faktor VIIa ausgewählt aus der Liste von [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa und [K337A]-FVIIa.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um FXIII a2b2. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um FXIII a2. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um den aktivierten Faktor XIII (FXIIIa). In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um eine Variante von Faktor XIII. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um einen menschlichen Faktor XIII. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um einen rekombinanten Faktor XIII. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um einen rekombinanten menschlichen Faktor XIII. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um ein menschliches a2-Dimer.
  • In einer Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ferner einen TFPI-Inhibitor. In einer anderen Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ferner einen Faktor VIII. In einer anderen Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ferner einen Faktor VIII und einen TFPI-Inhibitor.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ferner einen Inhibitor des fibrinolytischen Systems, z.B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Tranexamsäure.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungen.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments, um die Blutgerinnungszeit bei einem Patienten zu verringern.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments, um die Blutgerinnsellysezeit in einem Säugetierplasma zu verlängern.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments, um die Blutgerinnselstabilität in einem Säugetierplasma zu erhöhen.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments, um die Fibringerinnselbildung in einem Säugetierplasma zu fördern.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Säugerplasma um ein menschliches Plasma. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Säugerplasma um ein normales Plasma; in einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Plasma um ein normales menschliches Plasma; in einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Plasma um das Plasma eines Patienten, der eine beeinträchtigte Thrombinbildung aufweist. In einer Ausführungsform stammt das Plasma von einem Patienten, der eine verringerte Konzentration an Fibrinogen aufweist.
  • In einer Ausführungsform verlängert der Faktor VIIa und der Faktor XIII die in-vitro-Blutgerinnsellysezeit in einem normalen menschlichen Plasma.
  • In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren sind der Faktor VIIa und der Faktor XIII die einzigen Wirkstoffe, die zur Verabreichung einem Patienten bestimmt sind. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das Arzneimittel einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII als einzige Wirkstoffe.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind der Faktor VIIa und der Faktor XIII zur gleichzeitigen Verabreichung in der Eindosierungsform bestimmt. In einer anderen Ausführungsform sind der Faktor VIIa und der Faktor XIII zur aufeinander folgenden Verabreichung bestimmt. In einer weiteren Ausführungsform werden der Faktor VIIa und der Faktor XIII innerhalb von etwa 1–2 Stunden, zum Beispiel innerhalb von 30 Minuten, zum Beispiel innerhalb von 10 Minuten, z.B. in Form eines Kits, der einen Faktor VIIa in einer ersten Form der Dosierungseinheit und einen Faktor XIII in einer zweiten Form der Dosierungseinheit umfasst, verabreicht.
  • In einer Ausführungsform liegt die wirksame Menge eines Faktors VIIa zwischen 0,05 mg/Tag und 500 mg/Tag (Patient mit 70 kg). In einer Ausführungsform liegt die wirksame Menge eines Faktors XIII zwischen 0,05 mg/Tag und 500 mg/Tag (Patient mit 70 kg).
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Arzneimittel (wenn es in Form eines Einzelpräparats vorliegt) im Wesentlichen aus einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stablilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsstoff und/oder einem Proteaseinhibitor.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Arzneimittel (wenn es in Form eines Einzelpräparats vorliegt) im Wesentlichen aus einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stablilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsstoff und/oder einem Proteaseinhibitor und/oder einem TFPI-Inhibitor.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Arzneimittel (wenn es in Form eines Einzelpräparats vorliegt) im Wesentlichen aus einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Anti oxidationsmittel und/oder einem Konservierungsstoff und/oder einem Proteaseinhibitor und/oder einem TFPI-Inhibitor und/oder einem Faktor VIII.
  • In einer anderen Ausführungsform besteht das Arzneimittel (wenn es in Form eines Kits vorliegt) aus einer ersten Form der Dosierungseinheit, welche im Wesentlichen aus einem Faktor VIIa und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und/oder einem Proteaseinhibitor besteht, und einer zweiten Form der Dosierungseinheit, welche im Wesentlichen aus einem Faktor XIII und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und/oder einem Proteaseinhibitor besteht.
  • In einer anderen Ausführungsform besteht das Arzneimittel (wenn es in Form eines Kits vorliegt) aus einer ersten Form der Dosierungseinheit, welche im Wesentlichen aus einem Faktor VIIa und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und/oder einem Proteaseinhibitor und/oder einem TFPI-Inhibitor besteht, und einer zweiten Form der Dosierungseinheit, welche im Wesentlichen aus einem Faktor XIII und gegebenenfalls mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und/oder einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und/oder einem Proteaseinhibitor und/oder einem TFPI-Inhibitor und/oder einem Faktor VIII besteht.
  • In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Patienten um einen Menschen; in einer anderen Ausführungsform weist der Patient eine beeinträchtigte Thrombinbildung auf; in einer Ausführungsform weist der Patient eine verringerte Plasmakonzentration an Fibrinogen auf (z.B. ein Patient mit einer Mehrfachtransfusion).
  • In einer weiteren Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ferner einen Faktor VIII. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um einen aktivierten Faktor VIII (Faktor VIIIa). In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um einen rekombinanten Faktor VIIIa. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um einen rekombinanten menschlichen Faktor VIIIa.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ferner einen Inhibitor des fibrinolytischen Systems, z.B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Tranexamsäure.
  • AUFLISTUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt, dass die spontane Blutgerinnselbildung im normalen menschlichen Citratplasma (NHP), welches 1/10 in einem Puffer, der 20 nM Hepes, 150 mM NaCl und 5 mM CaCl2, pH 7,4 enthält, in einem Mikrotiterloch (250 μl Gesamtvolumen) verdünnt wurde, nach etwa 2500–3000 Sek. erreicht wurde. Die Fibringerinnselbildung wurde durch Zunahme der optischen Dichte bei 600 nm in einem SpectramaxTM 340, Molecular Devices, Sunnyvale CA verfolgt. 1 zeigt, dass 10 nM rekombinanter Faktor VIIa (rFVIIa) von Novo Nordisk A/S Bagswærd, Dänemark, die Blutgerinnungszeit auf 1600 Sek. verkürzte (n = 2). Eine weitere Verkürzung der Blutgerinnungszeit wurde erreicht, als 30 nM Faktor XIII (FXIII) von American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, zusammen mit 10 nM rFVIIa zugegeben wurde (n = 3). Das Blutgerinnsel, das in Gegenwart von FXIII gebildet wurde, war durchsichtiger (geringere maximale OD) als in dessen Abwesenheit, was darauf hindeutet, dass die Zugabe von FXIII zu einer engmaschigeren Fibringelstruktur mit dünneren Fasern führte.
  • 2 zeigt, dass zusätzlicher FXIII (30 nM) die Fibringerinnsellysezeit von Blutgerinnseln, die in Gegenwart von rFVIIa und Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) gebildet wurden, verlängert. Die Blutgerinnselbildung wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 nM XIII durch Zugabe von 25 μl NHP zu 225 μl 20 nM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,4, welches 50 nM rFVIIa und 0,5 nM rekombinantes tPA von Novo Nordisk A/S Bagsværd, Dänemark, enthielt, induziert. Die Blutgerinnselbildung und die anschließende Blutgerinnsellyse, die durch tPA-vermittelte Plasminogenaktivierung induziert wurde, wurde durch ein Spectramax® 340 bei 600 nm als Zunahme der OD600 nm mit anschließender Umkehr der Spur bis zum Basiswert verfolgt. 2 zeigt, dass die Blutgerinnsellysezeit unter diesen Bedingungen durch die Anwesenheit von FXIII wesentlich verlängert wurde.
  • 3 zeigt die Wirkung von rFVIIa und FXIII auf die maximale Blutgerinnselstabilität (MCF) sowie die Resistenz gegen t-PA-vermittelte Lyse. Vor der Zugabe von rFVIIa und/oder FXIII lag die erreichte MCF bei 25 mm und die Zeit, die erforderlich war, um die Hälfte des Blutgerinnsels aufzulösen, bei 12,3 Minuten (3). Eine Zugabe von steigenden Konzentrationen an FXIII (0–40 nM) änderte die MCF nicht; jedoch wurde eine dosisabhängige Verlängerung der Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse beobachtet, optimal bei 30 nM FXIII (Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse: 14,4 min, 3). Ähnlich führte die Zugabe von rFVI-Ia (1 nM) zu einem Schutz des Blutgerinnsels vor t-PA-vermittelter Fibrinolyse (Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse: 16,4 Min.) ohne irgendeine Wirkung auf die MCF (3). Jedoch wurde nach Zugabe von rFVIIa (1 nM) zusammen mit FXIII (30 nM) ein Anstieg in der MCF (29 mm) sowie ein umfassender Schutz vor Fibrinolyse (Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse: 27,1 min) beobachtet (3). Zusammen betrachtet demonstrieren diese Ergebnisse, dass die Zugabe von rFVIIa und FXIII zum Plasma in einer synergistischen Art und Weise die mechanische Stabilität und die Resistenz gegen t-PA-vermittelte Fibrinolyse verbessert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung, die eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII umfasst, zur Verfügung. Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung, die eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII als einzige Wirkstoffe umfasst, zur Verfügung. Die Zusammensetzung kann in Form einer Einzelzusammensetzung oder in Form eines Mehrkomponentenkits vorliegen. Die vorliegenden Zusammensetzungen sind als therapeutische und vorbeugende gerinnungsfördernde Mittel oder Fibringerinnsel stabilisierende Mittel verwendbar und bilden schnelle Fibringerinnsel in Säugern, einschließlich Primaten wie Menschen.
  • Wann immer eine erste oder zweite oder dritte, etc., Dosierungseinheit durchweg in dieser Beschreibung erwähnt ist, bezeichnet dies nicht die bevorzugte Reihenfolge der Verabreichung, sondern wurde lediglich für Zwecke der Bequemlichkeit vorgenommen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Behandlung (einschließlich vorbeugender Behandlung oder Unterbindung) von Blutungen bei einem Patienten, einschließlich eines Menschen, z.B. auf Grund einer Verletzung oder Operation, oder bei Patienten, die einen Mangel an oder fehlerhafte Blutgerinnungsfaktoren FIX oder FVIII oder Blutplättchen aufweisen, zur Verfügung.
  • Es wurde herausgefunden, dass eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIIIa ein vorteilhaftes Produkt ist, das die Bildung fester, stabiler und schneller hämostatischer Pfropfen gewährleistet.
  • Die volle Thrombinbildung ist notwendig, damit sich ein fester, stabiler hämostatischer Pfropfen bildet. Die Fibrinstruktur eines derartigen Pfropfens ist sowohl von der Menge des gebildeten Thrombins als auch von der Geschwindigkeit der anfänglichen Thrombinbildung abhängig. In Gegenwart einer beeinträchtigten Thrombinbildung wird ein poröser Fibrinpfropfen, der hochgradig durchlässig ist, gebildet. Die fibrinolytischen Enzyme, die sich normalerweise auf der Fibrinoberfläche befinden, lösen einen derartigen Fibrinpfropfen einfach auf. Die Bildung eines stabilen Fibrinpfropfens ist auch von der Gegenwart des Faktors XIIIa abhängig, der durch Thrombin aktiviert wird und deshalb auch von der vollen Thrombinbildung abhängig ist. Des Weiteren erfordert der kürzlich beschriebene Thrombin-aktivierbare fibrinolytische Inhibitor TAFI ziemlich hohe Mengen an Thrombin für seine Aktivierung. In Gegenwart einer nicht völlig ausreichenden Thrombinbildung kann der TAFI daher nicht aktiviert werden, was zur Bildung eines hämostatischen Pfropfens führt, der einfacher als normal durch die normale fibrinolytische Aktivität aufgelöst wird.
  • Durch Erhöhen der Thrombinbildung stellt der Faktor VIIa die Grundlage für eine volle Aktivierung des Faktors XIII, die für die Bildung eines völlig stabilisierten hämostatischen Pfropfens und dadurch für die Aufrechterhaltung der Hämostase von äußerster Wichtigkeit ist, zur Verfügung.
  • In Situationen mit verringerter Anzahl von Blutplättchen, die Thrombozytopenie, wird eine schnellere Thrombinbildung durch die Verabreichung eines exogenen zusätzlichen Faktors VIIa ausgelöst. Jedoch wird die gesamte Thrombinbildung durch einen Faktor VIIa auch in hohen Konzentrationen nicht normalisiert.
  • Durch Kombinieren von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII, insbesondere der Alphakette (a2-Dimer) von Faktor XIII, wird eine volle Aktivierung von Faktors XIII erleichtert, die die hämostatischen Wirkung des Faktors VIIa fördert.
  • Des Weiteren tritt bei Patienten mit verringerten Plasmakonzentrationen an Fibrinogen (Patienten mit einer Mehrfachtransfusion als Folge von einer mehrfachen Verletzung oder einer großflächigen Operation) die volle Aktivierung von Faktors XIII nicht auf. Eine wirksamere Hämostase wird dann durch Verabreichung einer Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII erreicht.
  • Ein anderer Weg, die Stabilität von hämostatischen Fibrinpfropfen zu erhöhen, besteht darin, die volle Gegenwart von Faktor XIIIa (aktiviertem Faktor XIII) zu gewährleisten.
  • Patienten mit Thrombozytopenie weisen eine beeinträchtigte Thrombinbildung sowie eine fehlerhafte Stabilisierung von Fibrinpfropfen, die zu hämostatischen Pfropfen führen, welche zur vorzeitigen Auflösung neigen, auf. Des Weiteren weisen Patienten, die einer großen Verletzung oder einem Organschaden unterliegen und die als Folge davon häufige Bluttransfusionen erhalten haben, verringerte Blutplättchenzahlen sowie verringerte Mengen an Fibrinogen, Faktor VIII und anderen Gerinnungsproteinen auf. Diese Patienten erleiden eine beeinträchtigte (oder verringerte) Thrombinbildung. Zusätzlich hat ihr verringerter Fibrinogenspiegel negative Auswirkungen auf die Aktivierung von Faktor XIII. Diese Patienten weisen daher eine fehlerhafte oder weniger wirksame Hämostase auf, die zur Bildung von Fibrinpfropfen führt, welche einfach und vorzeitig durch proteolytische Enzyme aufgelöst werden, wobei zusätzlich derartige Enzyme in Situationen, die durch eine großflächige Verletzung oder einen Organschaden gekennzeichnet sind, erheblich freigesetzt werden.
  • Um die Bildung von völlig stabilisierten Pfropfen mit voller Belastbarkeit zur Aufrechterhaltung der Hämostase bei einem Patienten zu erleichtern, wird eine erfindungsgemäße Zusammensetzung verabreicht. Diese Zusammensetzung ist besonders bei Patienten mit einer verringerten Anzahl von Blutplättchen und bei Patienten mit verringerten Mengen an Fibrinogen und/oder anderen Gerinnungsproteinen im Plasma vorteilhaft.
  • In Gegenwart eines Faktors XIII können geringere Konzentrationen von Faktor VIIa ausreichend sein, um eine genügende Hämostase zu gewährleisten.
  • Wie vorstehend angegeben, liegt Faktor XIII im Plasma als ein tetrameres Zymogen vor, das aus zwei Alpha-Untereinheiten und zwei Beta-Untereinheiten (bezeichnet als a2b2) besteht, kommt jedoch in einem anderen Gewebe (z.B. Blutplättchen) als ein a2-Dimer vor. Es kann entweder eines dieser Zymogenformen oder aktivierter Faktor XIII (Faktor XIIIa) sowie gentechnisch manipulierte Varianten von Faktor XIII, die ihre charakteristische Vernetzungsaktivität beibehalten, innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um einen menschlichen Faktor XIII; in einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um ein menschliches a2-Dimer; in noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor XIII um einen aktivierten menschlichen Faktor XIIIa.
  • Der Faktor XIII und Faktor VIIa, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus Blut gereinigt oder durch rekombinante Verfahren hergestellt werden. Es ist offensichtlich, dass die Anwendung der hier beschriebenen Verfahren davon unabhängig ist, wie der gereinigte Faktor XIII und Faktor VIIa abgeleitet wird, und deshalb ist die vorliegende Erfindung dafür vorgesehen, die Verwendung einer beliebigen Präparation von Faktor XIII und Faktor VIIa, die hier zur Verwendung geeignet ist, abzudecken. Auch gentechnologisch manipulierte Varianten von Faktor VIIa und Faktor XIII, die ihre charakteristische, mit einer Hämostase verbundene Aktivität beibehalten, können in den vorliegenden Erfindungen verwendet werden. Fragmente von Faktor VIIa oder Faktor XIII oder Varianten von Faktor VIIa oder Faktor XIII, die ihre charakteristische, mit einer Hämostase verbundene Aktivität beibehalten, können in den vorliegenden Erfindungen verwendet werden. Die mit einer Hämostase verbundene Aktivität eines Faktors VIIa kann zum Beispiel gemessen werden, indem der in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Aktivitätstest für Faktor VIIa verwendet wird. Die mit einer Hämostase verbundene Aktivität eines Faktors XIII kann zum Beispiel gemessen werden, indem der in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Aktivitätstest für Faktor XIII verwendet wird.
  • Nicht beschränkende Beispiele für Varianten von Faktor VII, die im Wesentlichen die selben oder bessere biologische Aktivität verglichen mit dem Wildtyp-Faktor VIIa aufweisen, schließen diejenigen ein, die in den dänischen Patentanmeldungen Nr. PA 2000 00734, PA 2000 01360, PA 2000 01361 und PA 2001 00477 beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Nicht beschränkende Beispiele schließen [L30SV]-FVIIa, [L30SV/M306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa und [K337A]-FVIIa ein.
  • Im vorliegenden Zusammenhang wurden die Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Bezeichnungen der Aminosäuren in ihrer üblichen Bedeutung wie in Tabelle 1 angegeben verwendet. Sofern nicht ausdrücklich angegeben, handelt es sich bei den hier erwähnten Aminosäuren um L-Aminosäuren. Es ist selbstverständlich, dass der erste Buchstabe zum Beispiel in K337 die Aminosäure repräsentiert, die sich natürlicherweise an der bezeichneten Position des Wildtyp-Faktors VII befindet, und dass zum Beispiel [K337A]-FVIIa die Variante von FVII kennzeichnet, bei der die Aminosäure, die durch den Ein-Buchstaben-Code K dargestellt ist, welche sich natürlicherweise an der bezeichneten Position befindet, durch die Aminosäure ersetzt ist, die durch den Ein-Buchstaben-Code A dargestellt ist.
  • Tabelle 1: Abkürzungen für Aminosäuren:
    Figure 00190001
  • Der Begriff „Faktor VIIa" oder „FVIIa" kann abwechselnd verwendet werden. Der Begriff Faktor VIIa schließt das Zymogen Faktor VII (einzelkettiger Faktor VII) ein. Der Begriff „Faktor XIII" oder „FXIII" kann abwechselnd verwendet werden. Der Begriff „Faktor VIII" oder „FVIII" kann abwechselnd verwendet werden.
  • Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass Austausche außerhalb der Regionen, die für die Funktion des Moleküls von Faktor VIIa oder Faktor XIII kritisch sind und dennoch zu einem aktiven Polypeptid führen, vorgenommen werden können. Aminosäurereste, die für die Aktivität des Polypeptids von Faktor VIIa oder Fak tor XIII wesentlich und deshalb vorzugsweise nicht Gegenstand des Austauschs sind, können entsprechend den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie z.B. ortsdirigierter Mutagenese oder Alanin-Rastermutagenese (siehe z.B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085) identifiziert werden. Bei dem letzteren Verfahren werden Mutationen bei jedem positiv geladenen Rest ins Molekül eingeführt und die resultierenden Mutantenmoleküle auf Gerinnungsmittel bezüglich Vernetzungsaktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, welche für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Die Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch die Analyse der dreidimensionalen Struktur, wie sie durch solche Verfahren wie Kernspinresonanzanalyse, Kristallographie oder Photoaffinitätsmarkierung (siehe z.B. de Vos et al., 1992, Science 255: 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59–64) bestimmt wird, ermittelt werden.
  • Die Einführung einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz, um ein Nukleotid gegen ein anderes Nukleotid auszutauschen, kann durch ortsdirigierte Mutagenese durch Verwenden beliebiger auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren bewerkstelligt werden. Insbesondere verwendbar ist das Verfahren, das einen superhelikalen, doppelsträngigen DNA-Vektor mit einer Insertion von Interesse und zwei synthetischen Primern, die die gewünschte Mutation enthalten, verwendet. Die Oligonukleotid-Primer, von denen jeder zu den gegenüberliegenden Strängen des Vektors komplementär ist, verlängern sich während den Temperaturzyklen mittels Pfu-DNA-Polymerase. Nach Einbau der Primer wird ein mutiertes Plasmid, das versetzte Einschnitte enthält, gebildet. Im Anschluss an die Temperaturzyklen wird das Produkt mit DpnI, welches für methylierte und halbmethylierte DNA spezifisch ist, behandelt, um die elterliche DNA-Matrize zu spalten und nach synthetisierter DNA, die Mutationen enthält, auszulesen. Andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet zum Erzeugen, Identifizieren und Isolieren von Varianten bekannt sind, können auch verwendet werden, wie zum Beispiel Gen-Shuffling-(Genumstrukturierung) und Phage-Display-Verfahren.
  • Der Begriff „Faktor VIII" oder „FVIII" schließt den aktivierten Faktor VIII (bezeichnet als Faktor VIIIa), Varianten und verkürzte Formen von Faktor VIII, die ihre charakteristische Gerinnungsaktivität beibehalten, ein. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um einen menschlichen Faktor VIII.
  • Der Begriff „TFPI-Inhibitor" bedeutet Verbindungen, welche die Antigerinnungsaktivität von TFPI (Gewebefaktorpfad-Inhibitor) hemmen. Der Begriff schließt Verbindungen, wie z.B. diejenigen, die in dem Europäischen Patent Nr. 588 529, WO 96/28153 und US 5,622,988 offenbart sind, ein. „TFPI" und „EPI" (extrinsischer Pfad-Inhibitor) kann abwechselnd verwendet werden.
  • Innerhalb der vorliegenden Erfindung ist eine „wirksame Menge" eines Faktors VIIa und eine „wirksame Menge" eines Faktors XIII definiert als diejenige Menge eines Faktors VIIa und eines Faktors XIII, die ausreicht, um eine Blutung oder einen Blutverlust zu verhindern oder zu verringern, um die Krankheit und ihre Komplikationen zu heilen, zu lindern oder teilweise zu stoppen.
  • Die erfindungsgemäß verabreichte Menge eines Faktors VIIa und die Menge eines Faktors XIII kann zwischen einem Verhältnis von etwa 1:100 bis etwa 100:1 (μg Faktor VIIa: μg Faktor XIII) variieren.
  • In diesem Zusammenhang bedeutet „Patienten mit einer beeinträchtigten Thrombinbildung" Patienten, die keinen vollen Thrombinschub auf der aktivierten Blutplättchenoberfläche erzeugen können, und schließt Patienten, die eine geringere Thrombinbildung aufweisen als die Thrombinbildung in Patienten, die über ein voll funktionierendes, normales hämostatisches System verfügen, einschließlich einer normalen Menge und Funktion von Gerinnungsfaktoren, Blutplättchen und Fibrinogen, und Patienten, denen FIX und/oder FVIII fehlt (Hämophilie A und B) oder die einen fehlerhaften FIX und/oder FVIII aufweisen oder Inhibitoren gegen FIX und/oder FVIII aufweisen, Patienten, denen FXI fehlt, Patienten mit einer verringerten Blutplättchenzahl oder Blutplättchen mit einer fehlerhaften Funktion (z.B. Thrombozytopenie oder Glanzmann-Thrombasthenie oder Patienten mit übermäßigen Blutungen) und Patienten, die einen verringerten Spiegel an Prothrombin, FX oder FVII aufweisen, ein.
  • Patienten mit verringerten Plasmakonzentrationen an Fibrinogen (z.B. Patienten mit einer Mehrfachtransfusion als Folge von einer mehrfachen Verletzung oder einer großflächigen Operation) leiden auch an der Bildung von lockereren und instabileren Fibrinpfropfen, die einfach aufgelöst werden.
  • Der Begriff „volle Hämostase" bedeutet die Bildung eines stabilen und festen Fibringerinnsels oder -pfropfens an der Verletzungsstelle, welches/r die Blutung wirksam stoppt und welches/r durch das fibrinolytische System nicht einfach auf gelöst wird.
  • Der Begriff „Aktivität von Faktor VIIa" oder „Faktor VIIa-Aktivität" bedeutet die Fähigkeit, Thrombin zu bilden; der Begriff schließt auch die Fähigkeit, Thrombin auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen in Abwesenheit des Gewebefaktors zu bilden, ein.
  • Der Begriff „Förderung des normalen hämostatischen Systems" bedeutet eine Förderung der Fähigkeit, Thrombin zu bilden.
  • Wie hierin verwendet spiegelt der Begriff „Blutungsstörung" einen beliebigen Defekt, ob angeboren, erworben oder induziert, zellulären oder molekularen Ursprungs, der sich in Blutungen äußert, wider. Beispiele sind Blutgerinnungsfaktormängel (z.B. Hämophilie A und B oder der Mangel an den Gerinnungsfaktoren XI oder VII), Blutgerinnungsfaktorinhibitoren, fehlerhafte Blutplättchenfunktion, die Thrombozytopenie oder die von Willebrand'sche Krankheit.
  • Der Begriff „Blutungen" ist dafür bestimmt, eine unregulierte und übermäßige Blutung, die ein Hauptproblem sowohl im Zusammenhang mit der Operation als auch bei anderen Formen von Gewebeschaden ist, einzuschließen. Eine unregulierte und übermäßige Blutung kann bei Patienten, die ein im Grunde normales Gerinnungssystem aufweisen (diese Patienten entwickeln jedoch eine Koagulopathie infolge einer Blutung – Verdünnung von Gerinnungsproteinen, erhöhte Fibrinolyse und verringerte Blutplättchen auf Grund eines Verdünnungseffekts der Blutung) und bei Patienten, die Gerinnungs- oder Blutungsstörungen aufweisen, vorkommen. Die Blutgerinnungsfaktormängel (Hämophilie A und B, Mangel an den Gerinnungsfaktoren XI oder VII) oder die Blutgerinnungsfaktorinhibitoren können die Ursache von Blutungsstörungen sein. Übermäßige Blutungen kommen auch bei Patienten mit einer normal funktionierenden Blutgerinnungskaskade (keine Blutgerinnungsfaktormängel oder -inhibitoren gegen einen der Gerinnungsfaktoren) vor und können durch eine fehlerhafte Blutplättchenfunktion, durch Thrombozytopenie oder durch die von Willebrand'sche Krankheit verursacht werden. In derartigen Fällen können die Blutungen mit jenen Blutungen, die durch Hämophilie verursacht werden, verglichen werden, da das hämostatische System wie bei der Hämophilie einen Mangel an oder krankhafte lebenswichtige/n „Verbindungen" der Blutgerinnung (wie z.B. Blutplättchen oder das Protein des von Willebrand-Faktors) aufweist, was die großen Blutungen verursacht. Bei Patienten, die einen großflächigen Gewebeschaden in Verbindung mit einer Operation oder einer ausgedehnten Verletzung erleiden, kann der normale hämostatische Mechanismus durch die Forderung nach sofortiger Hämostase überwältigt werden und sie können sich Blutungen trotz eines im Grunde (vor der Verletzung) normalen hämostatischen Mechanismus zuziehen. Das Erreichen von zufrieden stellender Hämostase ist auch ein Problem, wenn Blutungen in Organen wie z.B. das Gehirn, Innenohrregion und Augen mit begrenzter Möglichkeit für chirurgische Hämostase auftreten. Dasselbe Problem kann sich im Biopsieentnahmeprozess aus verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Tumorgewebe, Magen-Darm-Trakt) sowie in der laparoskopischen Chirurgie ergeben. All diesen Situationen gemeinsam ist die Schwierigkeit, Hämostase durch chirurgische Techniken (Nähte, Klammern usw.) zur Verfügung zu stellen, was auch der Fall ist, wenn die Blutung diffus ist (hämorrhagische Gastritis und übermäßige Gebärmutterblutung).
  • Akute und übermäßige Blutungen können auch bei Patienten nach einer Antigerinnungstherapie, bei denen eine fehlerhafte Hämostase durch die festgelegte Therapie induziert wurde, vorkommen. Derartige Patienten können chirurgische Eingriffe benötigen, falls der Wirkung des Antigerinnungsmittels schnell entgegengewirkt werden muss. Die radikale retropubische Prostatektomie ist eine üblich durchgeführte Maßnahme bei Patienten mit örtlich begrenztem Prostatakrebs. Die Operation ist häufig durch den wesentlichen und manchmal gewaltigen Blutverlust erschwert. Der beträchtliche Blutverlust während der Prostatektomie ist hauptsächlich verbunden mit der komplizierten anatomischen Situation mit verschiedenen, dicht mit Gefäßen durchzogenen Stellen, die für die chirurgische Hämostase nicht einfach zugänglich sind und die zu diffuser Blutung aus einem großen Bezirk führen können. Eine andere Situation, die Probleme im Falle nicht zufrieden stellender Hämostase verursachen kann, besteht, wenn Patienten mit einem normalen hämostatischen Mechanismus eine Antigerinnungstherapie erteilt wird, um die thromboembolische Krankheit zu verhindern. Eine derartige Therapie kann Heparin oder Formen von Proteoglykanen, Warfarin oder andere Formen von Antagonisten des Vitamin K sowie Aspirin und andere Inhibitoren der Blutplättchenaggregation einschließen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Blutung mit der Hämopilie verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit der Hämophilie mit erworbenen Inhibitoren verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit der Thrombozytopenie verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit der von Willebrand'schen Krankheit verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einem schweren Gewebeschaden verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einer schweren Verletzung verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einer Operation verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit der laparoskopischen Chirurgie verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit hämorrhagischer Gastritis verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit übermäßiger Gebärmutterblutung verknüpft. In einer anderen Aus führungsform tritt die Blutung in Organen mit einer begrenzten Möglichkeit zur mechanischen Hämostase auf. In einer anderen Ausführungsform tritt die Blutung im Gehirn, in der Innenohrregion oder in den Augen auf. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit dem Biopsieentnahmeprozess verknüpft. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit der Antigerinnungstherapie verknüpft.
  • Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann ferner einen TFPI-Inhibitor umfassen. Eine derartige Zusammensetzung sollte vorzugsweise Patienten, die Hämophilie A oder B aufweisen, verabreicht werden.
  • Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann ferner einen Faktor VIII umfassen. Eine derartige Zusammensetzung sollte vorzugsweise Patienten verabreicht werden, die keine Inhibitoren für Faktor VIII aufweisen.
  • In diesem Zusammenhang ist der Begriff „Behandlung" dafür bestimmt, sowohl die Unterbindung einer erwarteten Blutung, wie zum Beispiel bei der Operation, als auch die Regulierung einer bereits auftretenden Blutung, wie zum Beispiel bei der Hämophilie oder bei einer Verletzung, mit dem Zweck, die Blutung zu hemmen oder zu minimieren, einzuschließen. Die vorbeugende Verabreichung von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII ist daher mit dem Begriff „Behandlung" eingeschlossen.
  • Der Begriff „Subjekt", wie er hier verwendet wird, sollte ein beliebiges Tier, insbesondere Säugetiere, wie z.B. Menschen bedeuten und kann gegebenenfalls abwechselnd mit dem Begriff „Patient" verwendet werden.
  • Abkürzungen
    • TF
      Gewebefaktor
      FVII
      Faktor VII in seiner einzelkettigen, nicht aktivierten Form
      FVIIa
      Faktor VII in seiner aktivierten Form
      rFVIIa
      rekombinanter Faktor VII in seiner aktivierten Form
      FXIII
      Faktor XIII in seiner zymogenen, nicht aktivierten Form
      FXIIIa
      Faktor XIII in seiner aktivierten Form
      rFXIII
      rekombinanter FXIII
      rFXIIIa
      rekombinanter FXIIIa
      a2
      Alpha- oder a-Kette von FXIII oder rFXIII
      b2
      Beta- oder b-Kette von FXIII oder rFXIII
      FXIIIa2
      dimere Form von FXIII, die zwei a-Ketten enthält
      FXIIIa2b2
      tetramere Form von FXIII, die zwei a- und zwei b-Ketten enthält
      FVIII
      Faktor VIII in seiner zymogenen, nicht aktivierten Form
      rFVIII
      rekominanter FVIII
      FVIIIa
      Faktor VIII in seiner aktivierten Form
      rFVIIIa
      rekominanter FVIIIa
      TFPI
      Gewebefaktorpfad-Inhibitor
  • Herstellung von Verbindungen
  • Menschlicher gereinigter Faktor VIIa, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird vorzugsweise durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt, wie z.B. von Hagen et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412–2416, 1986 beschrieben wurde oder wie in dem europäischen Patent Nr. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.) beschrieben ist. Bei dem Faktor VIIa, der durch Rekombinationstechnologie hergestellt wurde, kann es sich um den authentischen Faktor VIIa oder um einen mehr oder weniger veränderten Faktor VIIa handeln, vorausgesetzt, dass ein derartiger Faktor VIIa im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität zur Blutgerinnung als der authentische Faktor VIIa (Wildtyp-Faktor VIIa) aufweist. Ein derartiger veränderter Faktor VIIa kann durch Verändern der Nukleinsäuresequenz, die den Wildtyp-Faktor VII kodiert, entweder durch Ändern der Aminosäurecodons oder durch Entfernen von einigen der Aminosäurecodons in der Nuk leinsäure, die den natürlichen Faktor VII kodiert, durch bekannte Verfahren, z.B. durch ortsspezifische Mutagenese, hergestellt werden.
  • Faktor VII kann auch durch die Verfahren, die von Broze und Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242–1247, 1980 und Hedner und Kisiel, J.Clin.Invest. 71: 1836–1841, 1983 beschrieben sind, hergestellt werden. Diese Verfahren liefern Faktor VII ohne nachweisbare Mengen an anderen Blutgerinnungsfaktoren. Eine sogar weiter gereinigte Präparation von Faktor VII kann durch Einschließen einer zusätzlichen Gelfiltration als letzten Reinigungsschritt erhalten werden. Faktor VII wird dann in den aktiven Faktor VIIa durch bekannte Mittel, z.B. durch mehrere verschiedene Plasmaproteine, wie z.B. Faktor XIIa, IXa oder Xa, umgewandelt. In einer anderen Ausführungsform, wie von Bjoern et al. (Forschungsoffenbarung, 269, September 1986, S. 564–565) beschrieben ist, kann Faktor VII aktiviert werden, indem man diesen durch eine Ionenaustauschchromatographiesäule, wie z.B. MonoQ® (Pharmacia Feinchemikalien) oder dergleichen, laufen lässt.
  • Faktor XIII kann zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung aus Plasma gemäß bekannter Verfahren, wie z.B. solche, die von Cooke und Holbrook (Biochem.J. 141: 79–84, 1974) und Curtis und Lorand (Methods Enzymol. 45: 177–191, 1976), die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, offenbart wurden, hergestellt werden. Die a2-Dimer-Form von Faktor XIII kann aus Plazenta, wie in U.S.-Pat. Nr. 3,904,751; 3,931,399; 4,597,899 und 4,285,933, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, offenbart ist, hergestellt werden. Es ist jedoch bevorzugt, den rekombinanten Faktor XIII zu verwenden, um die Verwendung von Produkten, die von Blut oder Gewebe, die das Risiko einer Krankheitsübertragung mit sich bringen, abgeleitet sind, zu vermeiden. Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Faktor XIII sind in dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Davie et al., EP 268,772 ; Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861–1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235–240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279–283; und Bröker et al., FEBS Lett. 1989, 248: 105–110, die hier durch Bezugnahme in vollem Um fang aufgenommen sind. Innerhalb einer Ausführungsform wird das Faktor XIIIa2-Dimer cytoplasmatisch in der Hefe Saccharomyces cerevisiae hergestellt, wie in der mitanhängigen U.S.-Patentanmeldung Ser. Nr. 07/741,263 offenbart ist, die hier durch Bezugnahme in vollem Umfang aufgenommen ist. Die Zellen werden geerntet und lysiert und ein klares Lysat wird hergestellt. Das Lysat wird durch Anionenaustauschchromatographie bei neutralem bis leicht alkalischem pH-Wert fraktioniert, indem eine Säule mit derivatisierter Agarose, wie z.B. DEAE Fast Flow-SepltaroseTM (Pharmacia) oder dergleichen, verwendet wird. Faktor XIII wird dann aus dem Säuleneluat durch Einkonzentrieren des Eluates und Einstellen des pH-Wertes auf 5,2–5,5 gefällt, wie z.B. durch Diafiltration gegen Ammoniumsuccinat-Puffer. Der Niederschlag wird dann aufgelöst und weiter gereinigt, indem herkömmliche chromatographische Verfahren, wie z.B. Gelfiltration und Hydrophobe Interaktionschromatographie verwendet werden.
  • Wie vom Fachmann anerkannt ist, ist es bevorzugt, die Faktor XIII- und Faktor VIIa-Proteine genidentisch in Bezug auf die Patienten zu verwenden, um das Risiko des Induzierens einer Immunantwort zu verringern. Die Herstellung und Charakterisierung von nicht menschlichem Faktor XIII wurde von Nakamura et al. (J. Biochem. 78: 1247–1266, 1975) offenbart. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung derartiger Faktor XIII- und Faktor VIIa-Proteine innerhalb tierärztlicher Verfahren.
  • Verabreichung und Arzneimittel
  • Zur Behandlung in Verbindung mit vorsätzlichen Eingriffen wird der Faktor VII und der Faktor XIII typischerweise innerhalb von etwa 24 Stunden vor dem Durchführen des Eingriffs und bis zu 7 Tage lang und mehr danach verabreicht. Die Verabreichung als Gerinnungsmittel kann über eine Vielfalt von Wegen, wie sie hier beschrieben sind, erfolgen.
  • Die Dosis des Faktors VII liegt zwischen etwa 0,05 mg bis etwa 500 mg/Tag, z.B. zwischen etwa 1 mg bis etwa 200 mg/Tag oder z.B. zwischen etwa 10 mg bis etwa 175 mg/Tag, für einen Patienten mit 70 kg als Belastungs- und Erhaltungsdosen, abhängig vom Gewicht des Patienten, des Zustands und der Schwere des Zustands.
  • Die Dosis des Faktors XIII liegt zwischen etwa 0,05 mg bis etwa 500 mg/Tag, z.B. zwischen etwa 1 mg bis etwa 200 mg/Tag oder z.B. zwischen etwa 10 mg bis etwa 175 mg/Tag, für einen Patienten mit 70 kg als Belastungs- und Erhaltungsdosen, abhängig vom Gewicht des Patienten des Zustands und der Schwere des Zustands.
  • Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Kits sind innerhalb der Human- und Veterinärmedizin verwendbar, wie zum Beispiel in der Behandlung oder Vorbeugung für Patienten, die an Blutungen oder Gerinnungsstörungen leiden. Zur Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung werden Faktor VIIa und Faktor XIII gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert. Vorzugsweise ist das Arzneimittel parenteral, d.h. intravenös, subkutan oder intramuskulär zur Verabreichung bestimmt, oder es kann durch eine kontinuierliche oder pulsierende Infusion verabreicht werden.
  • Die Formulierungen können ferner ein oder mehrere Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Exzipienten, etc. einschließen und können in derartigen Formen wie Flüssigkeiten, Pulver, Emulsionen, regulierte Abgabe, etc. zur Verfügung gestellt werden. Der Fachmann kann die Zusammensetzungen der Erfindung in entsprechender Weise und in Übereinstimmung mit der anerkannten Praxis, wie z.B. jene, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990 offenbart sind, formulieren. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen einen Faktor VIII und einen Faktor XIII in Kombination mit, vorzugsweise gelöst in, einem pharmazeutisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger. Es kann eine Vielfalt von wässrigen Trägern, wie z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dergleichen, verwendet werden. Die Varianten von Faktor VII der Erfindung können auch zu Liposomenpräparationen zur Abgabe an oder zum Zielen auf die Stellen der Verletzung formuliert sein. Die Liposomenpräparationen sind allgemein z.B. in U.S. 4,837,028 , U.S. 4,501,728 und U.S. 4,975,282 beschrieben.
  • Ein typisches Arzneimittel zur intravenösen Infusion könnte hergestellt werden, um 250 ml sterile Ringer-Lösung und 10 mg eines Faktors VIIa und/oder eines Faktor XIII zu umfassen. Die tatsächlichen Verfahren zum Herstellen parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt oder ersichtlich und sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) ausführlicher beschrieben.
  • Kurz gefasst, werden Arzneimittel, die für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, durch Mischen eines Faktors VIIa oder eines Faktors XIII oder eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII vorzugsweise in gereinigter Form mit geeigneten Hilfsstoffen und einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel hergestellt. Geeignete physiologisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel schließen steriles Wasser und Kochsalzlösung ein. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie sie erforderlich sind, um sich den physiologischen Bedingungen, wie z.B. pH-Wert einstellende und puffernde Mittel, Tonizität einstellende Mittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchorid, etc., anzunähern, enthalten. Geeignete Hilfsstoffe schließen auch Calcium, Proteine (z.B. Albumine) oder andere inerte Peptide (z.B. Glycylglycin) oder Aminosäuren (z.B. Glycin oder Histidin) ein, um den gereinigten Faktor VIIa und/oder Faktor XIII zu stabilisieren. Bei anderen physiologisch verträglichen Hilfsstoffen handelt es sich um nicht reduzierende Zucker, Polyalkohole (z.B. Sorbit, Mannitol oder Glycerin), Polysaccharide wie z.B. Dextrine mit geringem Molekulargewicht, Detergenzien (z.B. Polysorbat) und Antioxidationsmittel (z.B.
  • Bisulfit und Ascorbat). Die Hilfsstoffe liegen allgemein in einer Konzentration von 0,001 bis 4% (Gew./Vol.) vor. Das Arzneimittel kann auch Proteaseinhibitoren, z.B. Aprotinin oder Tranexamsäure und konservierende Mittel enthalten. Des Weiteren kann die Präparation auch einen TFPI-Inhibitor und/oder einen Faktor VIII enthalten.
  • Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gutbekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die sich ergebenden wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter keimfreien Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Präparation mit einer sterilen wässrigen Lösung vor der Verabreichung vereinigt wird.
  • Die Konzentration eines Faktors VIIa, eines Faktors XIII oder eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII in diesen Formulierungen kann breit variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5 Gewichtsprozent, gewöhnlich bei oder mindestens etwa 1 Gewichtsprozent bis zu 15 oder 20 Gewichtsprozent, und wird hauptsächlich durch Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten etc. in Übereinstimmung mit der speziellen Art und Weise der gewählten Verabreichung ausgewählt.
  • Die Verabreichung durch Injektion oder Infusion, insbesondere die Injektion, ist bevorzugt. Daher wird der Faktor VIIa und der Faktor XIII in einer Form hergestellt, die für die intravenöse Verabreichung geeignet ist, wie z.B. eine Präparation, bei der es sich entweder um ein aufgelöstes lyophilisiertes Pulver bzw. eine Flüssigformulierung, welche/s sowohl den Faktor VIIa als auch den Faktor XIII in einer Dosierungsform enthält, oder um ein aufgelöstes lyophilisiertes Pulver bzw. eine Flüssigformulierung, welche/s den Faktor VIIa in einer Dosierungsform enthält, und ein aufgelöstes lyophilisiertes Pulver bzw. eine Flüssigformulierung, welche/s den Faktor XIII in einer anderen Dosierungsform enthält, handelt.
  • Die lokale Abgabe von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII, wie zum Beispiel die topische Verabreichung, kann zum Beispiel mittels eines Sprays, einer Perfusion, eines Doppelballonkatheters, eines Stents, der in Gefäßtransplantate oder -stents eingearbeitet ist, Hydrogelen, die dafür verwendet werden, Ballonkatheter zu beschichten, oder durch andere gut bewährte Verfahren bewerkstelligt werden. Bei ambulanten Patienten, die tägliche Erhaltungsmengen benötigen, kann der Faktor VIIa und der Faktor XIII durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden, indem z.B. ein tragbares Pumpsystem verwendet wird. Auf jeden Fall sollten die Arzneimittel die Menge an einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII zur Verfügung stellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln.
  • Die Kombination von einem Faktor VIIa und einem Faktor XIII zeigt eine synergistische Wirkung in einem in-vitro-Blutgerinnselstabilitäts- und Fibrinolysezeit-Test. Außerdem zeigt die Kombination eines Faktors VIIa und eines Faktors XIII eine synergistische Wirkung bei der Bildung stabiler Fibringerinnsel, in der Erhöhung der Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse, in der Erhöhung der Blutgerinnselstabilität und in der Erhöhung der Resistenz gegen Fibrinolyse.
  • Die Zusammensetzungen, die einen Faktor VII und einen Faktor XIII enthalten, können für vorbeugende und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. In therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits an einer Krankheit wie oben beschrieben leidet, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Krankheit und ihre Komplikationen zu heilen, zu lindern oder teilweise zu stoppen. Eine Menge, die angemessen ist, dies zu erreichen, wird als eine „wirksame Menge" oder „therapeutisch wirksame Menge" definiert. Wie es von einem Fachmann verstanden wird, hängen die für diesen Zweck wirksamen Mengen von der Schwere der Krankheit oder Verletzung sowie vom Gewicht und allgemeinen Zustand des Patienten ab. Es muss berücksichtigt werden, dass die Materialien der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen in schweren Krankheits- oder Verletzungszuständen, das heißt lebensbedrohlichen oder möglicherweise lebensbedrohlichen Situationen, eingesetzt werden können. In derartigen Fällen ist es angesichts der Minimierung fremder Stoffe und des allgemeinen Fehlens immunogener Aktivität von Faktor VIIa und Faktor XIII in Menschen möglich und kann von dem behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden, einen reichlichen Überschuss dieser Zusammensetzungen zu verabreichen.
  • In vorbeugenden Anwendungen werden die Zusammensetzungen, die einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII enthalten, einem Patienten, die für einen Krankheitszustand oder eine Verletzung anfällig oder anderweitig diesbezüglich gefährdet ist, verabreicht, um die eigene Gerinnungsfähigkeit des Patienten zu fördern. Eine derartige Menge ist definiert als eine „vorbeugend wirksame Dosis".
  • Einzelne oder mehrfache Verabreichungen von Zusammensetzungen können mit den Dosismengen und Mustern, die von dem behandelnden Arzt ausgewählt werden, durchgeführt werden. Die Zusammensetzungen können einmal oder mehrere Male pro Tag oder Woche verabreicht werden. Eine wirksame Menge eines derartigen Arzneimittels ist diejenige Menge, die eine klinisch wesentliche Wirkung gegen Blutungen zur Verfügung stellt. Derartige Mengen werden teilweise von dem speziellen zu behandelnden Zustand, vom Alter und von der allgemeinen Gesundheit des Patienten und anderen Faktoren, die für Fachleute offensichtlich sind, abhängen.
  • Die Zusammensetzung wird allgemein in einer einzelnen Dosis vor der erwarteten Blutung oder zu Beginn der Blutung verabreicht. Sie kann jedoch auch in mehrfachen Dosen, vorzugsweise in Intervallen von 2–4–6–12 Stunden, abhängig von der gegebenen Dosis und dem Zustand des Patienten gegeben werden.
  • Die Zusammensetzung kann in Form einer einzelnen Präparation, die sowohl einen Faktor VIIa und einen Faktor XIII in geeigneten Konzentrationen umfasst, vorliegen. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines Kits vorliegen, der aus einer ersten Form der Dosierungseinheit, die einen Faktor VIIa umfasst, und einer zweiten Form der Dosierungseinheit, die einen Faktor XIII umfasst, und gegebe nenfalls einer oder mehreren weiteren Formen der Dosierungseinheit, die einen Faktor VIII und/oder einen TFPI-Inhibitor umfassen, besteht. In diesem Fall sollte der Faktor VIIa und der Faktor XIII aufeinander folgend, vorzugsweise innerhalb von etwa 1–2 Stunden, zum Beispiel innerhalb von 30 Minuten oder vorzugsweise innerhalb von 10 Minuten oder stärker bevorzugt innerhalb von 5 Minuten verabreicht werden. Einer von den beiden Formen der Dosierungseinheit kann zuerst verabreicht werden.
  • Da die vorliegende Erfindung die Vorbeugung oder Behandlung von Blutungen durch Behandlung mit einer Kombination von Wirkstoffen, die getrennt verabreicht werden können, betrifft, ist auch die Kombination von getrennten Arzneimitteln in Form eines Kits beschrieben. Der Kit schließt mindestens zwei getrennte Arzneimittel ein. Der Kit beinhaltet Behältervorrichtungen, um die separaten Zusammensetzungen zu fassen, wie z.B. eine geteilte Flasche oder ein geteiltes Folienpäckchen. Typischerweise schließt der Kit Anweisungen zur Verabreichung der getrennten Komponenten ein. Die Kitform ist besonders vorteilhaft, wenn die getrennten Komponenten vorzugsweise in verschiedenen Dosierungsformen in verschiedenen Dosierungsintervallen verabreicht werden, oder wenn die Titration einzelner Komponenten der Kombination durch den verordnenden Arzt gewünscht wird.
  • Tests
  • Test auf die Aktivität von Faktor VIIa:
  • Ein geeigneter Test zum Testen der Aktivität von Faktor VIIa und dadurch zum Auslesen geeigneter Varianten von Faktor VIIa kann als einfacher vorläufiger In-vitro-Test durchgeführt werden:
  • In-vitro-Hydrolysetest
  • Der natürliche (Wildtyp) Faktor VIIa und die Variante von Faktor VIIa (beide nachstehend als „Faktor VIIa" bezeichnet) können auf spezifische Aktivitäten getestet werden. Sie können auch parallel getestet werden, um ihre spezifischen Aktivitäten direkt zu vergleichen. Der Test wird in einer Mikrotiterplatte (Maxi-Sorp, Nunc, Dänemark) durchgeführt. Das chromogene Substrat D-Ile-Pro-Arg-p-Nitrnanilid (S-2288, Chromogenix, Schweden), Endkonzentration 1 mM, wird zum Faktor VIIa (Endkonzentration 100 nM) in 50 mM Hepes, pH 7,4, welches 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl2 und 1 mg/ml Rinderserumalbumin enthält, zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wird fortlaufend mit einem SpectraMaxTM 340-Plattenlesegerät (Molecular Devices, USA) gemessen. Die Absorption, die sich während einer 20-minütigen Inkubation entwickelt, wird nach Abziehen der Absorption in einem Blindprobenloch, welches kein Enzym enthält, verwendet, um das Verhältnis zwischen den Aktivitäten der Variante und des Wildtyps des Faktors VIIa zu berechnen: Verhältnis = (A405 nm Faktor VIIa-Variante)/(A405 nm Faktor VIIa-Wildtyp).
  • Darauf basierend können Varianten von Faktor VIIa mit einer Aktivität, die mit dem natürlichen Faktor VIIa vergleichbar oder höher ist, identifiziert werden, wie z.B. Varianten, bei denen das Verhältnis zwischen der Aktivität der Variante und der Aktivität des natürlichen Faktors VII, die in 1 gezeigt ist, ungefähr bei bzw. oberhalb von 1,0 liegt.
  • Die Aktivität von Faktor VIIa oder Varianten von Faktor VIIa kann auch gemessen werden, indem ein physiologisches Substrat, wie z.B. Faktor X entsprechend bei einer Konzentration von 100–1000 nM, verwendet wird, wobei der gebildete Faktor Xa nach Zugabe eines geeigneten chromogenen Substrats (z.B. S-2765) gemessen wird. Zusätzlich kann der Aktivitätstest bei physiologischer Temperatur durchgeführt werden.
  • Die Fähigkeit von Faktor VIIa oder Varianten von Faktor VIIa, Thrombin zu bilden, kann auch in einem Test gemessen werden, der alle relevanten Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren bei physiologischen Konzentrationen (abzüglich Faktor VIII, wenn Bedingungen der Hämophilie A nachgeahmt werden) und aktivierte Blutplättchen umfasst (wie auf S. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542–547, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, beschrieben ist).
  • Test auf Aktivität von Faktor XIII:
  • Ein geeigneter Test zum Testen auf die Transglutaminaseaktivität von Faktor XIII und dadurch zum Auslesen geeigneter Varianten von Faktor XIII kann als einfacher In-vitro-Test, wie zum Beispiel in Methods of Enzymology, Bd. 45 (1976), Proteolytic Enzymes, Teil B, Seiten 177–191 (Hrsg. Lorand, L.) beschrieben ist, durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung ist ferner durch folgende Beispiele erläutert, die jedoch nicht dahingehend interpretiert werden sollen, den Schutzbereich zu begrenzen. Die Merkmale, die in der vorangehenden Beschreibung und in den folgenden Beispielen offenbart sind, können sowohl getrennt als auch in beliebiger Kombination davon zur Verwirklichung der Erfindung in davon verschiedenen Formen materiell sein.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Faktor XIII fördert die durch Faktor VIIa induzierte Fibringerinnselbildung.
  • Normales menschliches Citratplasma (NHP) wurde 1/10 in Puffer, der 20 nM (?) HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,4 enthält, in einem Mikrotiterloch (Gesamtvolumen 250 μl) verdünnt und die Fibringerinnselbildung durch Zunahme der optischen Dichte bei 600 nm mit einem SpectramaxTM 340 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) verfolgt.
  • Die spontane Blutgerinnselbildung wurde bei etwa 2500–3000 sec erhalten. 1 zeigt, dass 10 nM rekombinanter Faktor VIIa (rFVIIa) (Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dänemark) die Blutgerinnungszeit auf 1600 sec verkürzte (n = 2). Eine weitere Verkürzung der Blutgerinnungszeit wurde erhalten, wenn 30 nM Faktor XIII (FXIII) (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) zusammen mit 10 nM rFVIIa zugegeben wurde (n = 3). Das Blutgerinnsel, das sich in Gegenwart von FXIII bildete, war durchsichtiger (geringere maximale OD) als in dessen Abwesenheit, was darauf hindeutet, dass die Zugabe von FXIII zu einer feinmaschigeren Fibringelstruktur mit dünneren Fasern führte.
  • Beispiel 2
  • Die Gegenwart von zusätzlichem Faktor XIII während der durch Faktor VIIa induzierten Blutgerinnselbildung führt zur erhöhten Resistenz gegen fibrinolytischen Abbau.
  • Ein Fibringerinnsel, das aus dünnen Fasern besteht, ist mechanisch stabiler und schwieriger abzubauen als ein Blutgerinnsel, das dieselbe Menge an Fibrin, welches als dicke Fasern oder weniger vernetzte Fasern angeordnet ist, enthält. Das in 2 gezeigte Experiment veranschaulicht, dass zusätzlicher FXIII (30 nM) die Fibringerinnsellysezeit von Blutgerinnseln, die in Gegenwart von rFVIIa und Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA, American Diagnostica) gebildet wurden, verlängert. Die Blutgerinnselbildung wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 nM FXIII durch Zugabe von 25 μl NHP zu 225 μl 20 nM (?) HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,4, welches 50 nM rFVIIa und 0,5 nM rekombinantes t-PA enthielt, induziert. Die Blutgerinnselbildung und die darauffolgende Blutgerinnsellyse, welche durch t-PA-vermittelte Plasminogen-Aktivierung induziert wurde, wurde mit einem Spectramax® 340 bei 600 nm als Zunahme in der OD600 nm verfolgt, gefolgt von der Umkehr der Spur auf den Basiswert. 2 zeigt, dass die Blutgerinnsellysezeit unter diesen Bedingungen durch die Gegenwart von FXIII wesentlich verlängert wurde.
  • Beispiel 3
  • Faktor VIIa in Kombination mit Faktor XIII erhöht die maximale Blutgerinnselstabilität und erhöht die Blutgerinnselresistenz gegen Fibrinolyse.
  • Thrombelastograph-Messungen wurden mit normalem menschlichen Citratplasma, dem 6 nM rekombinanter Plasminogen-Aktivator des Gewebetyps (t-PA, American Diagnostica) zugesetzt wurde, durchgeführt und die Wirkung der Zugabe von 1 nM rFVIIa (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) allein oder in Kombination mit verschiedenen Konzentrationen an Faktor XIII (FXIII, Haematologic Technologies, HCXIII-0160, Lot N1212) wurde analysiert. Die Blutgerinnung wurde durch Zugabe von Innovin (Endkonzentration 2000-fach verdünnt, Dade Behring # 526945) und Calcium (Endkonzentration 15 mM) in einem Puffer von 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4 ausgelöst.
  • Thrombelastograph-Messungen wurden angewendet, um die Wirkung von rFVIIa und FXIII auf die maximale Blutgerinnselstabilität (MCF) sowie die Blutgerinnselresistenz gegen t-PA-vermittelte Lyse zu analysieren. Vor der Zugabe von rFVIIa und/oder FXIII lag die erhaltene MCF bei 25 mm und die Zeit, die erforderlich war, um die Hälfte des Blutgerinnsels aufzulösen, lag bei 12,3 Minuten (3). Die Zugabe von steigenden Konzentrationen an FXIII (0–40 nM) änderte die MCF nicht; jedoch wurde eine dosisabhängige Verlängerung der Halbwertzeit der Blutgerinnsellyse beobachtet, optimal bei 30 nM FXIII (Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse: 14,3 min, 3). Gleichermaßen führte die Zugabe von rFVIIa (1 nM) zum Schutz des Blutgerinnsels vor t-PA-vermittelter Fibrinolyse (Halbwertszeit des Blutgerinnsels: 16,4 min) ohne irgendeine Wirkung auf die MCF (3). Jedoch wurde nach Zugabe von rFVIIa (1 nM) zusammen mit FXIII (30 nM) eine Zunahme der MCF (29 mm) sowie ein nachhaltiger Schutz gegen Fibrinolyse (Halbwertszeit der Blutgerinnsellyse: 27,1 min) beobachtet (3). Zu sammen betrachtet demonstrieren diese Ergebnisse, dass die Zugabe von rFVIIa und FXIII zum Plasma in einer synergistischen Art und Weise die mechanische Blutgerinnselstabilität und -resistenz gegen t-PA-vermittelte Fibrinolyse verbessert.

Claims (16)

  1. Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem Faktor XIII zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Blutungen bei einem Patienten, wobei das Medikament für die intravenöse Verabreichung bestimmt ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Verringern der Blutgerinnungszeit bei einem Patienten.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Verlängern der Blutgerinnsellysezeit in einem normalen Säugetierplasma.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen der Blutgerinnselstabilität in einem normalen Säugetierplasma.
  5. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zum Fördern der Fibringerinnselbildung in einem normalen menschlichen Plasma.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Faktor VIIa um eine Variante von Faktor VII handelt.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Variante von Faktor VII ausgewählt ist aus der Liste: [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa und [K337A]-FVIIa.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Faktor VIIa um einen menschlichen Faktor VIIa, wie z.B. rekombinanten menschlichen Faktor VIIa, handelt.
  9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Faktor VIIa und dem Faktor XIII um einen rekombinanten menschlichen Faktor VIIa und einen rekombinanten menschlichen Faktor XIII handelt.
  10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Medikament ferner einen Inhibitor des fibrinolytischen Systems enthält.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Inhibitor des fibrinolytischen Systems ausgewählt ist aus der Liste: Aprotinin, Epsilon-Aminocapronsäure und Tranexamsäure.
  12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Faktor VIIa und der Faktor XIII aufeinander folgend innerhalb von 1–2 Stunden, wie z.B. innerhalb von 30 Minuten oder 10 Minuten, zur Verabreichung bestimmt ist.
  13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Patient eine beeinträchtigte Thrombinbildung aufweist.
  14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Patient eine verringerte Plasmakonzentration an Fibrinogen aufweist.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Patient eine Mehrfachtransfusion erhält, z.B. infolge einer mehrfachen Verletzung oder einer großflächigen Operation.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Mehrfachtransfusion eine Folge von einer mehrfachen Verletzung oder einer großflächigen Operation ist.
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