JP2005510514A - Ｖｉｉ因子ポリペプチド及びｐａｉ−１ポリペプチドを含む薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】VII因子ポリペプチド及びPAI-1ポリペプチドを含む薬学的組成物
【解決手段】本発明は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドを組合せた組成物に関し、また、出血の発症を治療するためのそれらの使用に関する。

Description

本発明は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドおよびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。また、本発明は、出血の発症を被っている被検者を治療するため及び予防するための薬物を製造するための、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドとPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの組合せの使用に関する。また、本発明は、被検者における出血の発症の治療方法および被検者における血餅形成を増強する方法に関する。本発明はまた、それらの化合物を含むキットに関する。

止血は、血管壁に対する傷害の後に循環血液に暴露された組織因子（TF）と総FVIIタンパク質質量の約1%に相応する量の循環中に存在するFVIIaとの間の複合体の形成によって開始される。この複合体は、TFを有する細胞にアンカーされ、細胞表面においてFXをFXaに、およびFIXをFIXａに活性化する。FXaは、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、これがFVIII、FV、FXI、およびFXIIIを活性化する。さらに、この止血における初期段階で形成される限られた量のトロンビンは血小板をも活性化する。血小板に対するトロンビンの作用に続き、これらは形を変えて、それらの表面に電荷をもったリン脂質を露出する。この活性化された血小板の表面は、さらなるFX活性化および完全なトロンビン生成のための鋳型を形成する。活性化された血小板の表面上に形成されたFIXa-FVIIa複合体を経てさらなるFXの活性化が、活性化された血小板表面において生じ、次いでFXaは、依然として表面上にありながらプロトロンビンをトロンビンに転換する。次いでトロンビンは、フィブリノーゲンを、不溶性であり、また初期の血小板栓を安定化するフィブリンに転換する。このプロセスは、TFを発現または暴露する部位に区画化、即ち局在化され、これによって凝固系が全身で活性化されるリスクを最小化している。栓を形成する不溶性のフィブリンは、FXIIIで触媒されるフィブリン線維の架橋によってさらに安定化される。

FVIIaは、主に単鎖酵素前駆体として血漿中に存在し、これがFXaによって切断されて、その2本鎖の活性化形体のFVIIaになる。組換え活性型VIIa因子（rFVIIa）は、前止血性（pro-haemostatic）の薬剤として開発されている。rFVIIaの投与により、抗体形成のために凝固因子産物で治療することができない出血を有する血友病被検者において、迅速かつ非常に有効な前止血性の反応を提供する。また、VII因子を欠損する出血被験者または正常な凝固系を有するが過剰の出血を受けている被験者は、FVIIaでうまく治療することができる。これらの研究において、好ましくないrFVIIaの副作用（特に血栓塞栓症の発生）には、遭遇しなかった。

外因的に投与された余分なFVIIaは、活性化された血小板表面におけるトロンビンの形成を増大する。これは、FIXまたはFVIIIを欠き、従って完全なトロンビン形成のための最も強力な経路を欠いている血友病被検者において生じる。また、血小板数の低下または機能に欠陥がある血小板の存在下において、余分なFVIIaはトロンビン形成を増大する。

組換えヒトFVIIaの商業的な製剤は、NovoSeven（登録商標）（Novo Nordisk A/S, Denmark）として販売されている。NovoSeven（登録商標）は、血友病AおよびBの患者における出血の発症の治療のために指示（indicate）されており、出血の発症の治療のために有効かつ信頼できる、市場において入手可能な唯一の組換えFVIIaである。

プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（PAI-1）は、プラスミンが媒介するタンパク分解の制御において重要な役割を果たすことが示されている。PAI-1はまた、内皮性タイプのプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ｅ−ＰＡＩ）とも呼ばれ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡＩ）及び組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡＩ）を阻害し、典型的には、ヒト内皮細胞、ヒト血液血小板、及びラットヘパトーマ細胞（ＨＴＣ）から得られる。PAI-1阻害剤は、米国特許番号第６,２７１,３５２号に開示されているように、人繊維肉腫細胞株ＨＴ−１８０から、またはvan Mourik,J.A（１９８４）らによって開示されているように（J.Biol.Chem.259,14914-14921）ウシ内皮細胞から得られる。PAI-1は、分子量が５０ｋＤａの単鎖糖タンパクであり（Van Mourik J A et al.,J Biol Chem(1984) 259:14914-14921)、単鎖及び二重鎖形体のｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡで知られる最も効果的な阻害剤である（Lawrence D et al., Eur J Biochem(1989)186:523-533）。PAI-1はプラスミン及びトリプシンも阻害し（Hekman C M et al., Biochemistry(1988) 27:2911-2918）、また、効率は比較的低いがトロンビン及び活性化タンパクＣも阻害する。

手術または主要な外傷に付随して過度に出血し、輸血の必要がある被検者は、いかなる出血も受けていない人々よりも多くの合併症を発病することは周知である。しかし、また、ヒトの血液または血液製剤（凝固欠陥の治療のための血小板、白血球、血漿に由来する濃縮物、その他）の投与を必要とする適度な出血では、ヒト・ウイルス（肝炎、HIV、パルボウイルス、およびその他の現在未知のウイルス）を伝達するリスクに関連した合併症を引き起こすかもしれない。大量の輸血を必要とする大量の出血は、肺および腎機能の障害を含む多臓器不全の発症を引き起こすかもしれない。一旦被検者がこれらの深刻な合併症を発症すると、多くのサイトカインおよび炎症反応に関与するイベントのカスケードが開始され、どのような治療も極めて困難となり、残念なことにうまくいかないことが多い。従って、手術における、また主要な組織損傷の治療における主な目標は、出血を避けること、または最小にすることである。このような出血を避けるため、または最小にするために、線維素溶解酵素によって容易に溶解されない安定な、および堅固な止血栓の形成を確実にすることが重要である。さらに、このような栓または血餅の迅速かつ効率的な形成を確実にすることが重要である。

今日、外傷被害者および手術に付随して出血している被験者を含む、出血の発症を受けている被験者は、しばしばいくらかのFVIIaの注射または輸液によって治療されることが多く、FVIIaの短い半減期（2.5時間）のため、特定のレベルの止血能を維持するために一回以上の投与が必要とされる。より迅速な出血の阻止は、そのような被検者に対して重要な利益となろう。そうなれば、出血を停止させ、止血を維持するために必要な投与数が減少するであろう。

欧州特許第225.160号（Novo Nordisk）は、凝固因子の欠陥または凝固因子阻害剤によって引き起こされるものではない出血性疾患の治療のための、FVIIa組成物および方法に関する。

欧州特許第82.182号（Baxter Travenol Lab.）は、被検者において、血液凝固因子の欠陥に、または血液凝固因子に対する阻害剤の効果に対向する際に使用するためのVIIa因子の組成物に関する。

国際特許公開番号WO93/06855（Novo Nordisk）は、FVIIaの局所適用に関する。

当該技術分野において、出血の発症が、手術、外傷、またはその他の形態の組織損傷による出血の発症；多回輸血された被検者における凝固障害を含む凝固障害の誘導；肝機能の減少（「肝疾患」）を含む、先天性または後天性の凝固または出血の障害；血小板機能の欠陥または血小板数の減少；凝固に必須の「化合物」（例えば、血小板またはフォンウィルブラント因子タンパク質）の欠乏または異常；線維素溶解の増大；抗凝固療法または血栓溶解療法；または幹細胞移植のためである被験者を含む、出血の発症を受けている被検者の治療を改善する必要性がなお存在する。

当該技術分野において、改善された、信頼のおける、かつ広く適用できる、凝固を増強する方法、または安定な止血栓の形成を確実にもしくは増強する方法、または治療される被検者のための便宜を増強する方法、または被験者、特にトロンビン生成の障害を有する被験者における完全な止血を達成する方法の必要性が残されている。また、出血停止に要する時間が短縮された方法の必要性もある。

本発明を実施するための最良の形態

発明の概要
本発明の一つの目的は、出血の発症および凝固障害の治療または予防において有効に使用することができる組成物を提供することである。

本発明の第2の目的は、出血の発症の治療もしくは予防に、または凝血原として、有効に使用することができる単一の単位剤形の組成物を提供することである。本発明のもう一つの目的は、相乗効果を示す組成物、治療方法、またはキットを提供することである。

本発明のさらなる目的は、凝固系が全身的に高レベルに活性化されるような、実質的な副作用を示さない組成物、治療方法、またはキットを提供することである。

本発明のその他の目的は、本明細書を読むことによって明らかとなるであろう。

第１の側面において、本発明は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。

第2の側面において、本発明は、出血の発症の治療を含むパーツのキットであって、
a）第1の単位剤形中に、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の有効な量、および薬学的に許容される担体；
b）第2の単位剤形中に、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の有効な量、および薬学的に許容される担体；および
c）前記第１および第２の剤形を含むための容器手段、
を含むパーツのキットを提供する。

第3の側面において、本発明は、被検者の出血の発症を治療するための薬物の製造のための、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドと組み合わせたVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの使用を提供する。さらなる側面において、本発明は、被検者の出血の発症を治療するための薬物の製造のための、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物の使用を提供する。

その異なる態様において、薬物は、完全な止血を得るために必要な時間を減少するため、止血を維持するために必要な時間を減少するため、凝固時間を減少するため、血餅溶解時間を延長するため、および血餅強度を増大するためのものである。

異なる態様において、薬物は、手術、外傷、またはその他の形態の組織損傷による出血の発症；多回輸血された被検者における凝固障害を含む凝固障害；肝機能の減少（「肝疾患」）を含む、先天性または後天性の凝固または出血の障害；血小板機能の欠陥または血小板数の減少；必須凝固「化合物」（例えば、血小板またはフォンウィルブラント因子タンパク質）の欠乏または異常；線維素溶解の増大；抗凝固治療または血栓溶解治療；または幹細胞移植による出血の発症を受けている被検者を治療するためのものである。一連の態様において、出血は、脳、内耳領域、目、肝臓、肺、腫瘍組織、消化管などの器官において生じ；一連のもう一つの態様において、これは、出血性胃炎およびおびただしい子宮出血におけるものなどの、瀰漫性出血である。一連のもう一つの態様において、出血の発症は、急性の関節出血（haemarthroses）（関節における出血）、慢性血友病の関節症、血腫（例えば筋肉、後腹膜、舌下、および咽頭後方のもの）、その他の組織における出血、血尿（腎尿管（renal tract）からの出血）、大脳出血、手術（例えば、肝切除）、抜歯、および胃腸出血（例えば、UGIの出血）を有する被験者における手術または外傷と関連した出血である。一つの態様において、薬物は、被検者における、外傷、または手術、または血小板の数もしくは活性の低下のための出血の発症を治療するためのものである。

さらなる側面において、本発明は、被検者における出血の発症を治療するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に出血を治療するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における凝固時間を減少するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に凝固時間を減少するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は被検者における止血を増強する方法であって、該方は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に止血を増強するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における血餅溶解時間を延長するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に血餅溶解時間を延長するために有効である方法を提供する。

さらなる側面において、本発明は、被検者における血餅強度を増大するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に血餅強度を増大するために有効である方法を提供する。

本方法の一つの一連の態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、単一の単位剤形で投与される。

もう一つの一連の態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を含む第1の単位剤形およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤を含む第2の単位剤形の形態で投与される。その一連の態様において、第1の単位剤形および前記第2の単位剤形は、15分を超える時間間隔をあけずに投与される。

さらなる側面において、本発明は、出血の発症のための治療を含むキットであって、
d）VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの有効な量、並びにPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの有効な量および薬学的に許容される担体の単一剤形；および、
e）前記単一の単位剤形を含むための容器手段、
を含むキットを提供する。

本発明の一連の態様の一つにおいて、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、VII因子関連ポリペプチドである。本発明の一連の態様の一つにおいて、VII因子関連ポリペプチドは、VII因子アミノ酸配列変異体である。一つの態様において、VII因子関連ポリペプチドの活性と天然のヒトVIIa因子（野生型FVIIa）の活性の比は、本明細書に記載されたとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約1.25である。

本発明の一連の態様の一つにおいて、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、VII因子である。一つの態様において前記VII因子は、ヒトVII因子である。一つの態様において、VII因子は、ウシ、ブタ、イヌ、マウス、ウマ、またはサケのVII因子である。もう一つの態様において、VII因子は、組換えによって作製される。もう一つの態様において、VII因子は、血漿に由来する。好ましい態様において、VII因子は、組換えヒト因子VIIである。本発明の一つの一連の態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、その活性型である。本発明の一つの好ましい態様において、VII因子は、組換えヒトVIIa因子である。

一連の態様において、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、PAI-1関連ポリペプチドである。一つの態様において、PAI-1関連ポリペプチドは、PAI-1アミノ酸配列の変異体である。一つの態様において、PAI-1関連ポリペプチドの活性と天然のヒト血漿PAI-1（野生型PAI-1）の活性の比は、本発明に記載されたとおりの「PAI-1アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約1.25である。一つの態様において、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、PAI-1ポリペプチドである。一つの態様において、PAI-1は、ヒトPAI-1である。一つの態様において、PAI-1は、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、マウス、またはラットのPAI-1である。好ましい態様において、PAI-1は、組換えによって作製される。もう一つの態様において、PAI-1は、血漿に由来する。あるいは、内皮細胞に由来する。好ましい態様において、PAI-1は、組換えヒトPAI-1である。一つの態様において、PAI-1関連ポリペプチドは、PAI-1の断片である。一つの態様において、PAI-1関連ポリペプチドはハイブリッドPAI-1ポリペプチド、例えばブタ/ヒトのハイブリッドである。

一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、約100：1乃至約1：100（w/w VII因子：PAI-1）の質量比で存在する。

一つの態様において、VII因子関連ポリペプチドは、野生型VII因子と比較して、20以下のアミノ酸が、置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸配列変異体である（即ち、米国特許第4,784,950に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド）。もう一つの態様において、VII因子変異体は、15以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入されたアミノ酸配列変異体である。その他態様において、VII因子変異体は、野生型のVII因子と比較して8、6、5、または3などの10以下のアミノ酸が置換され、欠失され、または挿入されている。一つの態様において、VII因子変異体は、以下の一覧から選択される：L305V-FVIIa、L305V/M306D/D309S-FVIIa、L305I-FVIIa、L305T-FVIIa、F374P-FVIIa、V158T/M298Q-FVIIa、V158D/E296V/M298Q-FVIIa、K337A-FVIIa、M298Q-FVIIa、V158D/M298Q-FVIIa、L305V/K337A-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa）、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、およびS336G-FVII。

さらなる態様において、VII因子関連ポリペプチドは、天然のヒト凝固VIIa因子と比較して、組織因子非依存的な活性が増大されている。もう一つの態様において、増大された活性は、基質特異性の変化を伴わない。本発明のもう一つの態様において、組織因子に対するVII因子関連ポリペプチドの結合は、損なわれず、VII因子関連ポリペプチドは組織因子に結合したときに、少なくとも野生型のVIIa因子の活性を有する。

好ましい態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびVII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、組換えヒトVIIa因子および組換えヒトPAI-1である。

一つの態様において、哺乳類の血液における凝固時間が減少される。他の態様において、哺乳類の血液における止血が増強される。他の態様において、哺乳類の血液における血餅溶解時間が延長される。他の態様において、哺乳類の血液における血餅強度が増大される。他の態様において、哺乳類の血液はヒトの血液である。他の態様において、哺乳類の血液は正常なヒトの血液であり；一つの態様において、血液はトロンビン生成の障害を有する被検者からの血液である。一つの態様において、血液は、一つまたは複数の凝固因子の欠損を有する被検者からの血液であり；他の態様において、血液は、一つまたは複数の凝固因子に対する阻害剤を有する被検者からの血液であり；他の態様において、血液は、フィブリノーゲンの濃度が低下された被検者からのものであり；他の態様において、血液は、PAI-1を欠損したヒト血液である。一つの一連の態様において、血液は、血漿である。

本発明の一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、組成物に含まれる唯一の止血性薬剤である。他の態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、組成物に含まれる唯一の活性な止血性薬剤である。他の態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、被検者に投与される唯一の凝固因子である。本発明の一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、患者に投与される唯一の活性薬剤である。他の態様において、組成物は、実質的にトロンビンまたはプロトロンビンを含まない；他の態様において、組成物は、実質的にFXを含まない；他の態様において、組成物は、実質的にFXaを含まない。

もう一つの態様において、薬学的組成物は、静脈内投与、好ましくは注射または輸液、特に注射のために処方される。一つの態様において、組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。

本発明の一つの態様において、組成物は、単一の単位剤形であって、単一の単位剤形は、両方の凝固因子を含む。本発明の一つの態様において、組成物は、第1の単位剤形としてVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を、および第2の単位剤形としてPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤を含み、かつ前記第１および第２の剤形を含むための容器手段を含むパーツのキットの形態である。一つの態様において、組成物またはキットは、適用できるものとして、組成物または分離した成分のそれぞれの投与法をさらに含む。

本発明の一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、単一剤形で投与される。本発明の一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を含む第1の単位剤形およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤を含む第2の単位剤形の形態で投与される。

本発明の一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、同時に投与される。もう一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、連続して投与される。一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、15分、好ましくは10分、より好ましくは5分、より好ましくは2分を超えた時間間隔をあけずに投与される。一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、2時間まで、好ましくは1〜2時間、より好ましくは1時間まで、より好ましくは30分〜1時間、より好ましくは30分まで、より好ましくは15〜30分までの時間間隔をあけて投与される。

一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの有効な量は、約0.05mg/日〜約500mg/日（70kgの被験者）である。一つの態様において、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の有効な量は、約0.01mg/日〜約500mg/日（70kgの被験者）である。

一つの態様において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、約100：1乃至約1：100（w/wVII因子：PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチド）の質量比で存在する。

本発明の一つの態様において、薬学的組成物は、単一の単位剤形であり、かつ本質的にVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、並びにＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤、並びに薬学的に許容される担体、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される一つまたは複数の成分からなる。

本発明のもう一つの態様において、薬学的組成物は、本質的にVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤並びに薬学的に許容される担体、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される一つまたは複数の成分からなる第1の単位剤形；並びに本質的にPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤並びに薬学的に許容される担体、安定剤、界面活性剤、中性塩、抗酸化剤、保存剤、およびプロテアーゼ阻害剤のリストから選択される一つまたは複数の成分からなる第2の単位剤形を有する、パーツのキットの形態である。

さらなる態様において、被検者はヒトであり；もう一つの態様において、被検者は、トロンビン生成障害を有し；一つの態様において、被検者は、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下されており（例えば、多回輸血された被検者）；一つの態様において、被検者は、VIII因子またはFIXを因子の血漿濃度が低下されている。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固タンパク質としてVII因子で被検者を治療したときと比較して、VII因子応答性症候群をわずらっている被検者における止血を増強する方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に止血を増強するために有効である方法に関する。

もう一つの側面において、本発明は、被検者のトロンビン形成を増強するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共にトロンビン形成を増強するために有効である方法に関する。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固タンパク質としてVII因子で被検者を治療したときと比較して、VII因子応答性症候群をわずらっている被検者におけるトロンビン形成を増強する方法であって該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共にトロンビン形成を増強するために有効である方法に関する。

もう一つの側面において、本発明は、唯一の凝固因子タンパク質としてVII因子を被検者に投与したときに必要な投与数と比較して、VII因子応答性症候群をわずらっている被検者における止血を達成するために必要な凝固因子タンパク質の投与数を減少するための方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に凝固因子タンパク質の投与数を減少するために有効である方法に関する。

もう一つの側面において、本発明は、VII因子応答性症候群をわずらっている被検者における出血を治療する方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に出血を治療するために有効である方法に関する。

一つの態様において、VII因子は、ヒト組換えVIIa因子（rFVIIa）である。もう一つの態様において、rFVIIaは、Novo Seven（登録商標）（Novo NordiskA/S、Bagsvaerd、Denmark）である。

もう一つの側面において、本発明は、哺乳類の血漿においてフィブリン血餅形成を増強するための薬物の製造のための、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドと組み合わせたVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの使用に関する。

もう一つの側面において、本発明は、被検者におけるフィブリン血餅形成を増強する方法であって、該方法は、その必要がある被検者に対して、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第1の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第2の量とを投与することを含み、前記第1および第2の量は、共に出血を治療するために有効である方法に関する。

本発明の詳細な説明
手術または主要な外傷に関連して過度に出血し、輸血の必要がある被検者では、いかなる出血も経験していない人々よりも多くの合併症を発病する。しかし、適度な出血であっても、彼らが人血または血液製剤（凝固欠陥の治療のための血小板、白血球、血漿に由来する由来する濃縮物、その他）の投与を必要とする場合は、これによりヒト・ウイルス（肝炎、HIV、パルボウイルス、およびその他の現在未知のウイルス）並びに非ウイルス病原を伝達するリスクがあるので、合併症を引き起こし得る。一旦被検者がこれらの深刻な合併症を発病すると、多くのサイトカインおよび炎症反応に関与するイベントのカスケードが開始され、どのような治療も極めて困難となり、残念なことにうまくいかないことが多い。大部分の血液の損失を経験している患者は、臨床的に不安定になる。このような患者は、心房細動を受けるリスクがあり、これにより心臓活動の致命的な停止；腎機能障害；または、肺において流体血管外遊走（いわゆる「湿性肺」またはARDS）を生じる可能性もある。従って、手術並びに主要な組織損傷の治療における主な目標は、出血を避けること、または最小にすることである。このような望ましくない出血を避けるため、または最小にするために、線維素溶解酵素によって容易に溶解されない安定な固体の止血栓の形成を確実にすることが重要である。さらに、このような栓または血餅の迅速かつ効率的な形成を確実にすることが重要である。

また、血小板減少症の（血小板の数または活性が低下された）被検者は、トロンビン生成が損なわれており、同時にフィブリン栓の安定化が不完全であることにより、中途で溶解されやすい止血栓を生じる。さらに、主要な外傷または器官損傷を受けた被検者は、結果として、頻繁に輸血が行われ、血小板数の低下、並びにフィブリノーゲン、VIII因子、およびその他の凝固タンパク質レベルが低下されることが多い。これらの被検者は、トロンビン生成の障害（または、低下）を経験する。従って、これらの被検者では、止血に欠陥があるか、またはほとんど効果がなく、タンパク質分解酵素によって容易に、および中途で溶解されるフィブリン栓を形成することになり、そのうえこのような酵素は、広範な外傷および器官損傷によって特徴づけられる局面において広範囲に放出される。

また、組織の出血により、血腫を形成する可能性もある。血腫の大きさ（特に、頭蓋内および脊髄内における）は、神経機能の損失の程度、リハビリの困難さ、および／または損失およびリハビリ後の神経機能の永久的な減失の重篤さおよび程度と密接に関連がある。最も重篤な血腫の結果は、これらが脳に位置するときに見られ、これらにより、患者の死亡さえも引き起こすであろう。

従って、出血の治療における主要な目的は、最短時間で止血を行い、従って、失血を最小にしておくことである。

従って、本発明は、このような治療を必要とする被検者における出血の発症の治療のための治療の、有益な組成物、使用、および方法を提供する。該組成物、使用、および方法は、止血が行われる前の失血を少なくすること、手術の際に必要とされる血液を少なくすること、止血が行われるまで血圧を許容されるレベルに保持すること、血圧のより迅速な安定化、治療された患者の回復時間を短縮すること、治療された患者のリハビリ時間を短くすること、脳血腫を含む血腫の形成の減少または血腫の形成を小さくすること、迅速な出血の抑止、出血の停止および止血の維持のために必要な投与数の減少などの有益な効果に関与しているであろう。

ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤と組み合わせて、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、例えばVIIa因子の製剤を投与することにより、VIIa因子またはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１のいずれかが単独で投与されるときの凝固時間、血餅の堅固さ、および耐性と比較して、凝固時間の短縮、堅固な血餅、および線維素溶解に対する耐性の増大がもたらされる。

また、ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤と組み合わせて、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、例えばVIIa因子の製剤を投与することにより、VIIa因子またはＰＡＩ−１のいずれかが単独で投与されるときの状況と比較して、出血の抑止を行うための時間の減少および止血を維持するための投与数の減少がもたらされる。本発明は、ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤およびVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の同時または経時的な投薬における有益な効果を提供する。本発明に従った薬学的組成物は、単一の組成物の形態であってもよく、または多成分のキット（パーツのキット）の形態であってもよい。本発明に従った組成物は、ヒトなどの霊長類を含む哺乳類において、治療的および予防的な凝血原として有用である。本発明はさらに、ヒトを含む被検者における出血の発症を治療する（予防的に治療することまたは防止することを含む）ための方法を提供する。

第1または第2または第3などの単位用量がこの明細書の全体にわたって言及されるが、これは、投与の好ましい順序を示すのではなく、単に便宜上の目的でなされるだけである。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤の組み合わせは、短い凝固時間、止血栓の迅速な形成、および安定な止血栓の形成を確実にする有利な製品である。VII因子またはVII因子関連ポリペプチドおよびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの組み合わせが、堅固で安定であり、かつ迅速に形成される止血栓の形成を確実にする有利な製品であることは、本発明の発明者によって見いだされたことである。

本発明の発明者は、VIIa因子およびＰＡＩ−１の組み合わせが、VIIa因子またはＰＡＩ−１のいずれか単独よりも効率的に血餅の堅固さを増大することができることを示した。

また、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドおよびＰＡＩ−１の組み合わせが、VIIa因子またはＰＡＩ−１のいずれか単独よりも効率的に正常なヒト血漿におけるインビトロでの血餅溶解時間を引き延ばすことができることが示された。また、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドおよびＰＡＩ−１の組み合わせが、VIIa因子またはＰＡＩ−１のいずれか単独よりも効率的に正常のヒト血漿における血餅半溶解時間を引き延ばすことができることが示された。また、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドおよびＰＡＩ−１の組み合わせが、VIIa因子またはＰＡＩ−１のいずれか単独よりも効率的に正常のヒト血漿における線維素溶解、特にtPAを媒介した線維素溶解から血餅を保護することができることが示された。従って、凝固を増強することにより、被験者の出血のより有効な治療を得ることができる。

理論によって義務づけられることは望まないが、完全なトロンビン生成は、堅固で安定な止血栓を形成するめに、またその結果の止血の維持のために必要であると考えられている。このような栓のフィブリン構造は、形成されるトロンビンの量および初期のトロンビン生成速度に依存的である。トロンビン生成障害の存在下では、非常に浸透性の多孔性フィブリン栓が形成されている。通常フィブリン表面に存在する線維素溶解性酵素は、このようなフィブリン栓を容易に溶解する。また、安定なフィブリン栓の形成は、トロンビンによって活性化されるXIIIa因子の存在に依存的であり、従って完全なトロンビン生成にも依存的である。さらに、最近記載されたトロンビンを活性化できる線維素溶解性阻害剤のTAFIは、その活性化のためにむしろ多量のトロンビンを必要とする。完全に十分ではないトロンビン形成の存在下では、TAFIは活性化されず、従って正常な繊維素溶解活性による正常な分解よりも容易な止血栓の形成を生じる。血小板数が低下した状況である血小板減少症では、外来性のVIIa因子の投与によって、より迅速なトロンビン生成が開始される。しかし、総トロンビン生成は、高濃度のVIIa因子によってさえ正常化されない。

フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した被検者（多くの外傷または広範な手術の結果として多回輸血された被検者）では、完全なトロンビン活性化は起こらない。従って、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドとＰＡＩ−１の組み合わせの投与によって、より有効な止血が行われる。

血小板減少症の被検者は、トロンビン生成障害と共にフィブリン栓の安定化の欠陥を有し、中途で溶解されやすい止血栓を生じる。さらに、主要な外傷または組織損傷を受けたに被検者は、結果として、頻繁に輸血が行われており、しばしば血小板数が低下し、同時にフィブリノーゲン、VIII因子、およびその他の凝固タンパク質のレベルが低下する。これらの被検者は、トロンビン生成の障害（または、低下）を経験する。加えて、これらのフィブリノーゲン・レベルの低下は、ネガティブにXIII因子の活性化を妨げる。従って、これらの被検者は、止血に欠損があるか、またはあまり効率的でなく、止血はタンパク質分解酵素によって容易にかつ中途で溶解されるフィブリン栓を形成し、その上そのような酵素は広範な外傷及び器官損傷によって特徴付けられる状況で広範に放出される。

被検者の止血を維持するための完全な能力を有する完全に安定化された栓の形成を容易にするために、本発明に従った組成物は投与される。この組成物は、特に血小板数が低下した被検者において、並びにフィブリノーゲンおよび／またはその他の凝固タンパク質の血漿レベルが低下した被検者において有益である。

VII因子ポリペプチド：
本発明を実施する際に、出血を防止または治療するために有効な任意のVII因子ポリペプチドを使用してもよい。これは、血液もしくは血漿に由来するか、または組換え手段によって産生されたVII因子ポリペプチドを含む。

本発明は、例えば米国特許第4,784,950号（野生型ヒトVII因子）に開示されたアミノ酸配列を有するものなどのVII因子ポリペプチドを含む。一連の態様において、VII因子ポリペプチドは、少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、および最も好ましくは少なくとも約70%のヒトVIIa因子の特異的な生物活性を示すポリペプチドを含む。一連の態様において、VII因子ポリペプチドは、少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約100%、好ましくは少なくとも約120%、より好ましくは少なくとも約140%、および最も好ましくは少なくとも約160%のヒトVIIa因子のヒトVIIa因子の特異的な生物活性を示すポリペプチドを含む。一連の態様において、VII因子ポリペプチドは、米国特許第4,784,950号に開示されたとおりの野生型VII因子の配列と少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、および最も好ましくは少なくとも約95%の一致性を示すポリペプチドを含む。

本明細書で使用されるものとして、「VII因子ポリペプチド」は、VII因子、並びにVII因子関連ポリペプチドを含むが、これに限定されない。「VII因子」という用語は、野生型ヒトVII因子（米国特許第4,784,950号に開示されたもの）、並びに例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケVII因子などのその他の種に由来する野生型VII因子のアミノ酸配列1-406を有するポリペプチドを含むことが意図されるが、これに限定はされず、前記VII因子は、血液もしくは血漿に由来するか、または組換手段によって産生される。これには、1つの個体から別の個体に存在し、生じるであろう、VII因子の天然の対立形質の変異がさらに含まれる。また、糖鎖形成またはその他の翻訳後修飾の程度および部位は、選択した宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異なるであろう。また、「VII因子」という用語は、VII因子ポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク分解処理されてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された、VIIa因子と称されるものを含むことが意図される。典型的には、VII因子は、残基152および153の間で切断されてVIIa因子を産生する。

「VII因子関連ポリペプチド」は、ヒトVII因子と比較して化学的に修飾されたか、および／またはヒトVII因子と比較して1つまたは複数のアミノ酸配列の変化を含む（即ちVII因子変異体）か、および／またはヒトVII因子と比較して切断されたアミノ酸配列を含む（即ちVII因子断片）、いずれかのVII因子ポリペプチドを含むが、これらに限定されはない。このようなVII因子関連ポリペプチドは、ヒトVII因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変更された比活性などを含む異なる特性を示し得る。「VII因子関連ポリペプチド」の用語は、このようなポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク分解処理されてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された「VIIa因子関連ポリペプチド」または「活性化されたVII因子関連ポリペプチド」と称されるものを含むことが意図される。

本明細書で使用されるものとして、「VII因子関連ポリペプチド」は、野生型のヒトVII因子と比較して、実質的に同等または改善された生物活性を示すポリペプチド、並びに野生型ヒトVIIa因子の活性と比較して、VIIa因子生物活性が実質的に修飾され、または減少したポリペプチドを含むが、これに限定されない。これらのポリペプチドは、化学的に修飾されたVII因子またVIIaおよび特定のアミノ酸配列の変化が導入されて、ポリペプチドの生理活性が修飾されまたは崩壊されたVII因子変異体を含むが、これらに限定されない。

わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えばN末端アミノ酸の欠失もしくは付加を含む修飾されたN末端を有するポリペプチド、および／またはヒトVIIa因子と比較して化学的に修飾されたポリペプチドを含む。

VII因子の変異体を含むVII因子関連ポリペプチドは、実質的に野生型VII因子と同等もしくは優れた生理活性を示すか、またあるいは、野生型VII因子と比較して修飾され、もしくは減少した生理活性を示すかどうかにかかわらず、VII因子の変異体を含み、1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。

変異体を含むVII因子関連ポリペプチドは、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合実験の1つまたは複数で試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型VIIa因子の比活性の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、または少なくとも約130%を示すものを含む。

変異体を含むVII因子関連ポリペプチドは、野生型VIIa因子と比較して実質的に同等または改善された生物活性を有し、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合アッセイの1つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型VIIa因子の比活性の少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約100%、より好ましくは少なくとも約110%、より好ましくは少なくとも約120%、およびもっとも好ましくは少なくとも約130%を示すものを含む。

変異体を含み、野生型VIIa因子と比較して実質的に減少した生物活性を有するVII因子関連ポリペプチドは、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合アッセイの1つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型VIIa因子の比活性の多くとも約25%、好ましくは多くとも約10%、より好ましくは多くとも約5%、最も好ましくは多くとも約1%を示すものである。野生型VII因子と比較して実質的に修飾された生物活性を有するVII因子変異体は、TF非依存性のX因子タンパク分解活性を示すVII因子変異体、およびTFに結合するが、X因子を切断しないものを含むが、これらに限定されない。

一部の態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子関連ポリペプチド、特に、「インビトロ加水分解アッセイ法」（下記の「アッセイ法」を参照されたい）で試験したときに、前記VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒトVIIa因子（野生型FVIIa）の活性との間の比が少なくとも約1.25である変異体であり；その他の態様において、比が少なくとも約2.0であり；さらなる態様において、比が少なくとも約4.0である変異体である。本発明の一部の態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子関連ポリペプチド、特に、「インビトロ加水分解アッセイ法」（下記の「アッセイ法」を参照されたい）で試験したときに、前記VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒトVIIa因子（野生型FVIIa）の活性との間の比が少なくとも約1.25である変異体であり；その他の態様において、比が少なくとも約2.0であり；さらなる態様において、比が少なくとも約4.0である変異体であり；さらなる態様において、比が少なくとも約8.0である変異体である。

一部の態様において、VII因子ポリペプチドは、例えば米国特許第4,784,950号（野生型VII因子）に開示されたとおりのヒトVII因子である。一部の態様において、VII因子ポリペプチドは、ヒトVIIa因子である。一連の態様において、VII因子ポリペプチドは、ヒトVIIa因子の生物比活性の少なくとも約10%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約50%、および最も好ましくは少なくとも約70%を示すVII因子関連ポリペプチドである。一部の態様において、VII因子ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有する。

野性型VIIa因子と比較して、実質的に同等または優れた生物活性を有するVII因子の変異体の非限定の例は、デンマーク特許出願番号第PA2000 00734およびPA2000 01360（WO01/83725に対応する）およびPA2000 01361（WO02/22776に対応する）号に記載されたものを含むが、これらに限定されない。野性型VII因子と実質的に同等または改善された生物活性を有するVII因子変異体の非限定の例は、S52A-FVII、S60A-FVII（lino ら、Arch. Biochem. Biophys.352 : 182-192,1998）；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、およびS336G-FVII；米国特許第5,580,560号に開示したとおりの、増大されたタンパク分解性の安定度を示するFVIIa変異体；残基290および291の間または残基315および316の間でタンパク質加水分解で切断されたVIIa因子（Mollerupら、Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505,1995）；並びにVIIa因子の酸化型（Kornfeltら、Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54,1999）を含む。野生型VII因子と比較して、実質的に減少したかまたは修飾された生物活性を有するVII因子変異体の非限定の例は、R152E-FVIIa（Wildgooseら、Biochem29 : 3413-3420,1990）、S344A-FVIIa（Kazamaら、J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995）、FFR-FVIIa（Holstら、Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520, 1998）、およびGlaドメインを欠いているVIIa因子（Nicolaisenら、FEBS Letts. 317: 245-249,1993）を含む。化学的に修飾されたVII因子ポリペプチドおよび配列変異体の非限定の例は、例えば米国特許第5,997,864号に記載されている。

血液凝固におけるVIIa因子の生物活性は、これが、（i）組織因子（TF）に結合する能力、および（ii）IX因子またはX因子のタンパク分解性の切断を触媒して活性化されたIX因子またはX因子を産生する（それぞれIXa因子またはXa因子）能力に由来する。

本発明の目的のために、VII因子ポリペプチド（「VII因子生物活性」）の生物活性は、例えば米国特許第5,997,864号に記載されているとおり、VII因子が欠損した血漿およびトロンボプラスチンを使用して、製剤が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量してもよい。このアッセイ法において、生物活性は、対象試料と比較した凝固時間の減少として現され、1単位/mlのVII因子活性を含むプールされたヒト血清標準と比べることにより「VII因子単位」に転換する。あるいは、VIIa因子生物活性は、
（i）脂質膜およびX因子に包埋されたTFを含む系において、VIIa因子またはVIIa因子関連ポリペプチドが活性化されたX因子（Xa因子）を産生する能力を測定すること（Perssonら、J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997）；
（ii）水性系におけるX因子の加水分解を測定すること（「インビトロ・タンパク質分解アッセイ法」、下記を参照されたい）；
（iii）表面プラスモン共振に基づいた機器を使用して、VIIa因子またはVIIa因子関連ポリペプチドのTFに対する物理的な結合を測定すること（Persson, FEBS Letts. 413: 359-363,1997）；および、
（iv）VIIa因子および／またはVIIa因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解を測定すること（「インビトロ加水分解アッセイ法」、下記を参照されたい）；および、
（v）TF非依存的なインビトロ系におけるトロンビン生成を測定すること、
によって定量してもよい。

「VII因子の生物活性」または「VII因子の活性」という用語は、トロンビンを生成する能力を含むことが意図され；該用語は、組織因子の非存在下で活性化された血小板の表面においてトロンビンを生成する能力も含む。

本発明に従って使用可能なVIIa因子製剤は、NovoSeven（登録商標）（Novo Nordisk AIS, Bagsvaerd, Denmark）であるが、これに限定されない。

PAI-1ポリペプチド：
本発明は、例えばGilsら（Biochim Biophys Avta.1998 Sep 8;1387(1-2):291-7）;Suiら（Biochem J.1998 Apr 15;331(Pt2):409-15）；Ginsburgら（J.Clin.Invest., vol.78,pp.1673-1680(1986)）―これらは米国特許番号第６,３０３,３３８号、同第６,１０３,４９８号に記載されている―、またはPannekoekら（JOURNAL EMBO J.5(10),2539-2544(1986)（野生型PAI-1））によって開示されたアミノ酸配列を含むPAI-1ポリペプチドの使用を包含する。

本発明の実行において、出血の予防または治療に有効な任意のPAI-1ポリペプチドが使用され得る。これは、血液または血漿に由来するPAI-1ポリペプチドを含み、または組換え方法によって生産される。「PAI-1」という用語は、例えばPAI-1（１４−１ｂ、Molecular Innovations）及び潜在性のコンホメーションのような構造的に活性な形体を含む両活性の、全ての自然発生PAI-1ポリペプチドを包含するように意図される。

ここで使用する「PAI-1ポリペプチド」という用語は、PAI-1並びにPAI-1に関連するポリペプチドを包含するが、これに限定されない。

「PAI-1」という用語は、他種、例えばウシ、ブタ、イヌ、マウス及びラットのPAI-1に由来する野生型PAI-1の他に、Pannekoekら（JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986), Gils et al., Biochim Biophys Acta. 1998 Sep 8; 1387 (1-2): 291-7）、Suiら（Biochem J. 1998 Apr 15 ; 331 (Pt 2): 409-15）、Ginsburgら（J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986)）−これらは米国特許番号第6,303, 338号、同第6,103, 498号にも記載されている−に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これに限定されない。

これはさらに、一つの固体から別の固体に存在し、生じるであろう、天然の対立形質の変異を包含する。また、糖鎖形成またはその他のポスト-翻訳修飾の程度および部位は、選ばれた宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異なってもよい。

また、「ＰＡＩ−１」の用語は、未切断の（酵素前駆体）形態のPAI-1ポリペプチド、並びにそれらのそれぞれの生理活性の形態を産生するために処理されたものを含むように意図される。

「ＰＡＩ−１関連ポリペプチド」は、ヒトＰＡＩ−１に関連して化学的に修飾されたＰＡＩ−１ポリペプチド、及び／またはヒトＰＡＩ−１に関連して一つまたは複数のアミノ酸配列の変化を含むＰＡＩ−１ポリペプチド（即ち、ＰＡＩ−１変異体）、及び／またはヒトＰＡＩ−１に関連してアミノ酸の切断を含むＰＡＩ−１ポリペプチド（即ち、ＰＡＩ−１断片）であるが、これらに限定されない。

そのようなＰＡＩ−１ポリペプチドは、ヒトＰＡＩ−１に関連して、安定度、リン脂質結合、比活性の変化などの異なる性質を示し得る。

「ＰＡＩ−１関連ポリペプチド」という用語は、未切断の（酵素前駆体）形態のポリペプチド、並びにそれらのそれぞれの生理活性形態を産生するために処理されたモノを含むように意図される。

本明細書で使用される「ＰＡＩ−１関連ポリペプチド」は、野生型のＰＡＩ−１と比較して実質的に同じまたは改良された生物学的活性を示し、同時に該ＰＡＩ−１の生物学的活性は、野生型ヒトＰＡＩ−１の活性と比較して実質的に改変されまたは減少されたものを含むが、これに限定されない。これらのポリペプチドは、特異的なアミノ酸配列改変が、該ポリペプチドの生物活性を改変または破壊するように導入された、化学的に修飾されたＰＡＩ−１及びＰＡＩ−１変異体を含むが、これらに限定されない。

これはさらに、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えばＮ末端アミノ酸の欠損または付加を含むＮ末端の修飾を有するポリペプチド、及び／またはヒトＰＡＩ−１と比較して化学的に修飾されたポリペプチドのようなポリペプチドを含む。

ＰＡＩ−１の変異体を含むＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、それが野生型ＰＡＩ−１と比較して実質的に同じかまたはより良い生物活性を示すかどうかに関わらず、またあるいは、それが野生型ＰＡＩ−１と比較して実質的に改変されたかまたは減少された生物活性を示すかどうかに関わらず、一つまたは複数のアミノ酸が挿入、欠損、または置換したことによって野生型ＰＡＩ−１の配列と異なったアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これに限定されない。

変異体を含むＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、本明細書の通りにＰＡＩ−１活性アッセイ法で試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ＰＡＩ−１の比活性の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約110%、少なくとも約120%、及び少なくとも約130%を示すものを含む。

変異体を含み、野生型VIIa因子と比較して実質的に同じまたは改良された生物活性を有するＰＡＩ−１因子関連ポリペプチドは、上記の通りに特異的ＰＡＩ−１活性アッセイ法の1つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ヒトＰＡＩ−１の生物学的比活性の少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約100%、より好ましくは約110%、より好ましくは約120%、および最も好ましくは約130%を示すものである。本発明のために、ＰＡＩ−１の生物活性は、ｔＰＡが媒介する血餅溶解、または例えば本明細書において記載されたようなプラスミンが媒介する血餅溶解を阻害するための製剤の能力を測定することによって定量できる。両アッセイ法で、生物学的活性は、コントロールサンプルと比較した血餅溶解時間の減少として表される。或いは、ＰＡＩ−１の生物学的活性は、ＰＡＩ−１及び／または、例えばChandlerらが開示しているような（Clinical chemistry ,35(5)787-793(1989)）ＰＡＩ−１等価物、または当該分野で周知の他のアッセイ法によってｔＰＡアミド溶解性活性の阻害を測定する事によって定量できる。

変異体を含み、野生型ＰＡＩ−１と比較して実質的に減少された生物活性を有するＰＡＩ−１因子関連ポリペプチドは、上記の通りに特異的ＰＡＩ−１活性アッセイ法の1つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型ヒトＰＡＩ−１の生物学的比活性の多くとも約25％、好ましくは多くとも約10％、より好ましくは多くとも約5％、及び最も好ましくは多くとも約1％の比活性を示すものである。

ＰＡＩ−１等価物の非限定的な例は、例えば米国特許第6103498号に記載されているようなＰＡＩ−１等価物を含む。

一部の態様において、ＰＡＩ−１はＰＡＩ−１等価物であり、該ＰＡＩ−１ポリペプチドの活性と天然のヒトＰＡＩ−１（野生型ＰＡＩ−１）の活性の比は、「ＰＡＩ−１アッセイ法」（Chandler et al., Clinical Chemistry, 35(5)787-793(1989)、上記を参照されたし。）で試験されたときに少なくとも約1.25であり；他の態様において、該比は少なくとも約2.0であり；さらなる態様において該比は少なくとも約4.0である。

また、ＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、それらの特徴的な止血に関連する活性を保持しているＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの断片をも含む。ＰＡＩ−１ポリペプチドの止血に関連する活性は、例えば、本明細書で記載されたＰＡＩ−１活性アッセイ法を用いて測定されることができる。

定義
本文脈において、アミノ酸の３文字または１文字表記は、表１に示したように従来の意味で使用した。明示的に示されない限り、本明細書において言及されるアミノ酸は、Lアミノ酸である。例えばK337における最初の文字は、野生型VII因子の示された位置に天然に存在するアミノ酸を表し、例えば、[K337A]-FVIIaは、示された位置において天然に存在する1文字コードKによって表されるアミノ酸が、1文字コードAによって表されるアミノ酸によって置換されたFVII-変異体を示すことは、よく理解されるべきである。

表1：
アミノ酸のための略語：
アミノ酸 3文字コード １文字コード
グリシン Gly G
プロリン Pro P
アラニン Ala A
バリン Val V
ロイシン Leu L
イソロイシン Ile I
メチオニン Met M
シスチン Cys C
フェニルアラニン Phe F
チロシン Tyr Y
トリプトファン Trp W
ヒスチジン His H
リジン Lys K
アルギニン Arg R
グルタミン Gln Q
アスパラギン Asn N
グルタミン酸 Glu E
アスパラギン酸 Asp D

「VIIa因子」または「FVIIa」の用語は、交換可能に使用されてもよい。

この文脈において、「トロンビン生成の障害を有する被検者」は、活性化された血小板表面において完全なトロンビンのバーストを生成することができない被験者を意味し、正常な量および機能の凝固因子、血小板、およびフィブリノーゲン（例えば、プールされた、正常ヒト血漿のもの）を含む、完全に機能する、正常な止血剤系を有する被験者におけるトロンビン生成よりも少ないトロンビンの生成を有する被検者を含み、そしてこれに限定されないが、VIIl因子を欠いた被験者；血小板数の低下または機能に欠陥のある血小板を有する被験者（例えば、血小板減少症またはグランツマン血小板無力症または多量に出血した被験者）；プロトロンビン、FXまたはFVIIのレベルが低下した被検者；いくつかの凝固因子のレベルが低下した被験者（例えば、外傷または広範な手術の結果としての過剰な出血によるもの）；および、フィブリノーゲンの血漿濃度が低下した被検者（例えば、多回輸血された被検者）を含む。

「トロンビン生成のレベル」または「正常なトロンビン生成」は、健康者のレベルと比較した患者のトロンビン生成のレベルを意味する。レベルは、正常レベルの割合として示される。本用語は、適切な場合には、交換可能に使用される。

「止血系を増強すること」という用語は、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。「止血を増強する」という用語は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む試験試料についてトロンビン生成を測定したときに、同じトロンビン生成アッセイ法で試験したときの、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドまたはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々のトロンビン生成と比較して延長される状況を含むことが意図される。トロンビン生成は、本記述のトロンビン生成アッセイ法に記載したようにアッセイしてもよい（「アッセイ法の部」を参照されたい）。

本明細書において使用される「唯一の」薬剤または因子は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドが、共に、薬学的組成物またはキットに含まれる唯一の止血剤もしくは活性な止血薬剤もしくは凝固因子であるか、または特定の治療の過程において、例えば特定の出血の発症の過程などにおいて、患者に投与した唯一の止血剤もしくは活性な止血剤もしくは凝固因子である状況をいう。これらの状況は、その他の止血剤または凝固因子が、1つまたは複数の凝固パラメータに有意に影響するように、適用可能なものとして、十分な量または活性で存在しないものを含むことは理解されるであろう。

血餅溶解時間、血餅強度、フィブリン血餅形成、および凝固時間は、患者の止血系の状態を検定するために使用される臨床的パラメータである。血液試料は、適切な間隔で患者から吸い出し、そして例えばMeh ら、Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001 ； 12: 627637； Vig ら、Hematology, Vol. 6 （3） pp. 205-213 （2001）； Vigら、Blood coagulation &fibrinolysis, Vol. 12 （7） pp. 555-561 （2001） Oct； Glidden ら、Clinical and applied thrombosis/hemostasis, Vol. 6 （4） pp. 226-233 （2000） Oct； McKenzieら、Cardiology, Vol. 92 （4） pp. 240-247 （1999） Apr； or Davis ら、Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 6 （4） pp.1250-1255 （1995）に記載されているように、トロンボエラストグラフィによって1つまたは複数のパラメータをアッセイする。

「血餅溶解時間を引き延ばすこと」という用語は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む試験試料について血餅溶解時間を測定したときに、同じ血餅溶解アッセイ法で試験したときの、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドまたはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の血餅溶解時間と比較して延長される状況を含むことが意図される。血餅溶解時間は、上記の通りにアッセイしてもよい。

「血餅強度を増大すること」という用語は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む試験試料について血餅強度、例えば機械強度を測定したときに、同じ血餅強度アッセイ法で試験したときの、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドまたはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の血餅溶解時間と比較して増大される状況を含むことが意図される。血餅強度は、例えばCarrら（Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation. AM J MED SCI 1991； 302: 13-8）に記載されたように、または上記の通りにトロンボエラストグラフィによってアッセイしてもよい。

「フィブリン血餅形成を増強すること」という用語は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む試験試料についてフィブリン血餅形成の速度または程度を測定したときに、同じ凝固アッセイ法で試験したときの、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドまたはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々のフィブリン血餅形成の速度または程度と比較して増大される状況を含むことが意図される。フィブリン血餅形成は、上記の通りにアッセイしてもよい。

「凝固時間を短縮すること」の用語は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む試験試料について血餅形成の時間（凝固時間）を測定したときに、同じ凝固アッセイ法で試験したときの、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドまたはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドのみをそれぞれ含む対象試料における個々の凝固時間と比較して増大される状況を含むことが意図される。凝固時間は、当業者に既知の標準的なPtまたはaPTTアッセイ法によってアッセイしてもよい。

「血小板の数または活性の低下」という用語は、被検者の血漿中に存在する血小板（platelet）（血小板：thrombocyte）の数、およびこのような血小板の生物学的な凝固に関連した活性をいう。数の低下は、例えば血小板破壊の増大、血小板産生の減少、および脾臓における血小板の通常画分より多くのプールによるものであってもよい。血小板減少症は、例えば、150,000血小板／マイクロリットルよりも少ない血小板数として定義される；一般に、正常な血小板数の上限は、350,000および450,000血小板／マイクロリットルの間であると考えられる。血小板数は、自動化された血小板計数器によって計数されてもよい；これは、当業者に周知の方法である。血小板数の低下による症候群としては、血小板減少症、凝固障害（coagulophathy）を含むが、これらに限定されない。「活性」には、血小板の凝集、接着、および血液凝固活性を含むが、これらに限定されない。活性の減少は、例えば糖タンパク質異常、異常な膜−細胞骨格相互作用、血小板顆粒の異常、血小板血液凝固活性の異常、シグナル伝達および分泌の異常によるものを含む。凝集、接着、および血液凝固活性を含む血小板活性は、当業者既知の標準的な方法によって測定してもよく、例えば、 Platelets. A Practical Approach, Ed. S. P. Watson &K. S. Authi: Clinical Aspects of Platelet Disorders（K. J. Clemetson） 15: 299-318,1996, Oxford UniversityPress ； Williams Hematology, Sixth Edition, Eds. Butler, Lichtman, Coller, Kipps &Seligsohn, 2001, McGraw-Hill.を参照されたい。血小板活性の低下による症候群には、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群、抗凝血薬療法、および血栓溶解治療を含むが、これらに限定されない。「低下」は、同じアッセイ法において測定したときの、正常なプールされた血漿の試料の数または活性と比較した試験血漿の試料の数または活性をいう。

本明細書において使用するものとして、「出血性疾患」という用語は、出血の発症の際に現れる、先天性の、後天性の、または誘導される、細胞または分子起源のいずれかの欠損を反映する。出血性疾患の例は、凝固因子欠損（例えば、凝固因子VIII、IX、XIまたはVIIの欠損）、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥（例えば、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、および凝固タンパク質の希釈によって生じるものなどの凝固障害、出血および／または輸液による線維素溶解の増大および血小板数の低下（例えば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者のもの）を含むが、これらに限定されない。

出血は、循環系の任意の構成要素から血液が血管外遊走することをいう。「出血の発症」という用語は、手術、外傷、その他の形態の組織の損害と関連して、望まれず、抑制できず、およびしばしば過剰である出血、並びに出血性疾患を有する被検者における望まれない出血を含むことを意味する。出血の発症は、基本的には正常な凝固系を有するが、（一時的な）凝固障害を受けている被験者において、並びに先天性のまたは後天性の凝固障害または出血性疾患を有する被検者において、生じるであろう。血友病における止血系では、必須の凝固「化合物」（例えば、血小板またはフォンウィルブラント因子タンパク質）を欠いているか、または異常であるために、血小板機能の欠陥を有する被検者における出血は、血友病によって引き起こされる出血に関連づけられるであろう。例えば手術または莫大な外傷に関連して、広範な組織損傷を受けている被検者では、正常な止血機構による即時性の止血の要求によっては手に負えず、彼らは、基本的には（外傷前または手術前には）正常な止血機構であるにもかかわらず過剰の出血を発生するであろう。さらに、このようなしばしば多回輸血された被検者は、出血および／または輸液の結果として、（一時的な）凝固障害（即ち、出血および／または輸液による、凝固タンパク質の希釈、線維素溶解の増大、および血小板数の低下）を発病する。出血は、また、脳、内耳領域、および目などの器官においても生じ得るし；これらにおいては、外科的な止血の可能性が制限されており、従って、満足な止血を達成するのに問題がある領域である。同様の問題は、種々の器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）からの生検を行うプロセスにおいて、並びに腹腔鏡検査手術および根治的な恥骨後前立腺摘除術においても起こるであろう。これら全ての状況において共通することは、出血がびまん性である場合（例えば出血性胃炎および大量の子宮出血）にも、手術の技術（縫合、クリップ、その他）によって止血を実現することが困難なことである。また、出血は、与えられた治療によって止血の欠陥が誘導される抗凝固療法の被検者において生じ得るし；これらの出血は、急性および大量であることが多い。抗凝固療法は、血栓塞栓性疾患を防止するために行われることが多い。このような治療は、ヘパリン、その他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたはその他の形態のビタミンK-アンタゴニスト、並びにアスピリン、および、例えば抗体などのその他の血小板凝集阻害剤またはその他のGP IIb/IIIa活性阻害剤等を含み得る。また、出血は、抗血小板剤（例えば、アセチルサリチル酸）、抗凝固薬（例えば、ヘパリン）、および線維素溶解素（例えば、組織プラスミノゲンアクチベータ、tPA）と組み合わせた治療を含む、いわゆる血栓溶解療法によるものであってもよい。また、出血の発症は、急性の関節出血（haemarthroses）（関節の出血）を有する被検者、慢性血友病の関節症、血腫（例えば筋肉、後腹膜、舌下、および咽頭後方のもの）、その他の組織における出血、血尿（腎尿管（renal tract）からの出血）、大脳出血、手術（例えば、肝切除）、抜歯、および胃腸出血（例えば、UGIの出血）を有する被験者における手術または外傷と関連した出血を含むことが意図されるが、これらに限定されない。出血の発症は、VIII因子に対する阻害剤；血友病A；血友病Aと阻害剤;血友病B；VII因子の欠損；ＰＡＩ−１の欠損；血小板減少症；フォンウィルブランド因子の欠損（フォンウィルブランド病）；重篤な組織損傷；重篤な外傷；手術；腹腔鏡検査手術；出血性胃炎；生検採取；抗凝固剤療法；上胃腸出血（upper gastroentestinal bleedings:UGI）；または幹細胞移植に関連していてもよい。出血の発症は、大量の子宮出血；機械的な止血の可能性が制限されている器官において生じるもの;脳において生じるもの；内耳領域において生じるもの；または、目元において生じるものであってもよい。「出血の発症」および「出血」という用語は、適切な場合は、交換可能に使用されてもよい。

この文脈において、「治療」という用語は、例えば手術におけるものなどの予想される出血を防止すること、および例えば外傷におけるものなどのすでに起こっている出血を、出血を阻害するか、または最小にする目的で、調節することの両者を含むことが意図される。上述した「予想される出血」は、特定の組織または器官において起こると思われる出血であってもよく、または詳細不明の出血であってもよい。従って、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤の予防的投与は、「治療」の用語に含まれる。

本明細書に使用されるものとして、「被験者」という用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類を意味することが意図され、適切な場合は、「患者」の用語と交換可能に使用されてもよい。また、本発明は、獣医学の手順の範囲内におけるVII因子またはFVII関連ポリペプチド、およびtPA阻害剤の使用を含む。

本明細書において定義されたVII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、同時に、または経時的に投与されてもよい。本因子は、単一の剤形に両方の凝固因子を含む単一の剤形において、または第1の単位剤形としてVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を、第2の単位剤形としてＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含むパーツのキットの形態で供給されてもよい。第1または第2または第3などの単位用量は、この明細書の全体にわたって言及されるが、これは、投与の好ましい順序を示すのではなく、単に便宜上の目的でなされるだけである。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤の「同時」投薬は、単一の単位剤形での凝固因子の投与、または第1の凝固因子タンパク質の投与に続き、第2の凝固因子タンパク質の投与が、15分、好ましくは10分、より好ましくは5分、より好ましくは2分を超えた時間間隔を空けないことを意味する。どちらの因子が先に投与されても良い。

「経時的」な投薬は、第１の凝固因子タンパク質の投与に続き、第２の凝固因子タンパク質の投与が、２時間まで、好ましくは１〜２時間、より好ましくは１時間まで、さらに好ましくは３０分〜１時間、より好ましくは３０分まで、さらに好ましくは１５〜３０分の時間間隔を空けて行われることを意味する。２つの単位剤形、或いは凝固因子タンパク質の何れが最初に投与されても良い。好ましくは、両製品が同じ静脈を利用することにより注射される。

「ＰＡＩ−１のレベル」または「ＰＡＩ−１レベル」は、健康な被験者におけるレベルと比較した患者の凝固ＰＡＩ−１活性を意味する。該レベルは、正常レベルの割合として表される。本用語は、適切な場合には、交換可能に使用される。

「ＰＡＩ−１のレベルの減少」または「ＰＡＩ−１レベルの減少」は、ＰＡＩ−１凝固の欠損またはＰＡＩ−１凝固の阻害剤を有さない被検者集団における平均ＰＡＩ−１レベルと比較した、血流におけるＰＡＩ−１の存在もしくは活性の減少または活性を意味する。循環しているＰＡＩ−１のレベルは、凝固剤または免疫アッセイ法のいずれかによって測定することができる。ＰＡＩ−１の活性は、患者の血漿がＰＡＩ−１を欠損する血漿における凝固時間を修正する能力によって決定される（例えばAPTTアッセイ法、下記参照されたい；また、本明細書の「アッセイ法の部分」を参照されたい）。

1単位のＰＡＩ−１は、1ミリリットルの正常な（プールされた）ヒト血漿に存在するＰＡＩ−１の量（ＰＡＩ−１レベル100%に対応する）として定義した。

1単位のVII因子は、1mlの正常血漿に存在するVII因子の量として定義され、これは約0.5μgのタンパク質に対応する。活性化された後では、50単位は、約1μgのタンパク質に対応する。

「欠損」は、正常な健康な個々のものと比較して、例えば血漿中のＰＡＩ−１の存在または活性の減少を意味する。本用語は、適切な場合には、「減少したＰＡＩ−１レベル」と交換可能に使用されてもよい。

「APTT」または「aPTT」は、活性化された部分的トロンボプラスチン時間を意味する（例えば、Proctor RR, Rapaport SI : The partial thromboplastin time with kaolin ; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiencies. Am J Clin Pathol 36: 212,1961に記載されている）。

「ＰＡＩ−１応答性の症候群」は、その必要がある被検者に投与された外因性のＰＡＩ−１により、該症候群よって引き起こされ、予測され、もしくは存在する、いずれかの徴候、症状、または疾病が防止、治癒、または回復されるであろう症候群を意味する。ＰＡＩ−１のレベルの減少によって引き起こされる症候群、例えばＰＡＩ−１に対する阻害剤によって引き起こされる出血性疾患を含むが、限定されない。ＰＡＩ−１応答性の症候群は、本発明に従った組成物で治療し得る。

「VII因子応答性の症候群」は、その必要がある被検者に投与された外因性のVII因子、好ましくはVIIa因子により、該症候群よって引き起こされる、予測され、もしくは存在する、いずれかの徴候、症状、または疾病が防止、治癒、または回復されるであろう症候群を意味し、凝固因子VIII、IX、XIまたはVIIレベルの減少、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥（例えば、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、および凝固タンパク質の希釈によって生じ得るものなどの凝固障害、出血および／または輸液による線維素溶解の増大および血小板数の低下（例えば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者のもの）によって引き起こされる症候群が含まれるが、これらに限定されない。

「半減期」は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、またはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの血漿濃度が、特定の値からその値の半分まで減少するために必要とされる時間をいう。

「一次止血」は、FXaおよびTF：VIIa因子によるトロンビンの初期の生成、その後の血小板の活性化および活性化されて、接着された血小板による初期のゆるい栓の形成であって、フィブリン、最終的には架橋されたフィブリンによってまだ安定化されていないものを意味する。

「二次止血」または「止血の維持」は、二次的な、完全かつ主要な、トロンビンのバーストまたは生成であって、活性化された血小板表面において生じ、かつVIIIa因子およびVIIIa因子によって触媒され、その後のフィブリンの形成および初期の血小板栓の安定化を意味する。フィブリンによる栓の安定化によって、完全な止血がなされる。

「完全な止血」は、傷害の部位における安定かつ堅固なフィブリンの血餅または栓の形成であって、有効に出血を止め、線溶系によって容易に溶かされないものを意味する。この文脈において、止血の用語は、上記の通りに完全な止血を表すために使用される。

製剤中の総タンパク量は、一般に既知の方法によって、例えば光学濃度を測定することによって測定してもよい。ＰＡＩ−１またはVII因子タンパク質（「抗原」）の量は、標準的なイライザ（Elisa）免疫アッセイ法などの一般に既知の方法によって測定してもよい。一般的な用語として、このようなアッセイ法は、例えばＰＡＩ−１タンパク質を含有する製剤の溶液を、Elisaプレート上に結合された抗トロンボモデュリン（thromobomodulin）抗体と接触させて、その後に固定された抗体-ＰＡＩ−１複合体を、マーカーを有する抗ＰＡＩ−１二次抗体と接触させ、その量を第3の工程において測定することによって行われる。それぞれの凝固因子の量は、同様の方法において適切な抗体を使用して測定してもよい。製剤中に存在する凝固因子タンパク質の総量は、個々の凝固因子タンパク質の量を加えることによって決定される。1つの態様において、製剤は、単離された凝固因子を含む。もう１つの態様において、製剤は、凝固因子IIおよび凝固因子IIa（プロトロンビンおよびトロンビン）および／またはX因子もしくはXa因子を本質的に含まない。

本明細書において使用されるものとして、「単離された」という用語は、凝固因子、例えばＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドであって、これらが合成された細胞から分離されたもの、あるいはそれらが天然に発見される媒体（例えば、血漿または血液）から分離されたものをいう。これらの起源の細胞に由来するポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよく、接着性細胞の培養物から所望の産物を含む細胞培養培地を取り出すこと；非接着性細胞を遠心分離または濾過して取り出すことなどを含むが、これらに限定されない。これらが天然に存在する媒体からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよく、例えば、抗VII因子または抗ＰＡＩ−１抗体のそれぞれのカラムにおけるようなアフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動的な手順（例えば調製用の等電点電気泳動（IEF））、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出などを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の範囲内において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの「有効な量」は、共に、疾患およびその合併症を治癒する、軽減する、または部分的に抑えるために、出血もしくは失血を防止または減少するために十分な、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、例えばFVIIa、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの量として定義される。

「VIIa因子の活性」または「VIIa因子活性」という用語は、トロンビンを生成する能力を含み；本用語には、組織因子の非存在下で活性化された血小板の表面においてトロンビンを生成する能力も含まれる。

略語：
TF 組織因子
FVII VII因子の単鎖、不活性化型
FVIIa VII因子の活性化型
rFVIIa 組換えVII因子の活性化型
TAFI TAFIの酵素前駆体、不活性化型
PAI-1 プラスミノーゲン活性化阻害剤

化合物の調製：
本発明に使用するために適したヒト精製VIIa因子は、例えばHagenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986に記載されているように、または欧州特許番号第200.421号（ZymoGenetics）に記載されているように、好ましくはDNA組換技術によって作成される。

また、VII因子は、Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 （4）: 1242-1247,1980並びにHedner and Kisiel, J. Clin. lnvest. 71: 1836-1841, 1983に記載されている方法によって産生されてもよい。これらの方法は、検出可能な量のその他の血液凝固因子を伴わずにVII因子を産生する。さらに精製VII因子製剤は、最終的な精製工程としてさらなるゲル濾過を含む方法によって得てもよい。次いでVII因子は、既知の手段、例えば、ＰＡＩ−１Ia、IX、またはXaなどの異なるいくつかの血漿タンパク質によって、活性化VIIa因子に変換される。あるいは、Bjoernら（Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564- 565）によって記載されているように、VII因子はMono Q（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことによって活性化され得る。

VII因子関連ポリペプチドは、野生型VII因子の修飾によって、または組換技術によって産生した。野生型VII因子と比較したときにアミノ酸配列が変化したVII因子関連ポリペプチドは、周知の手段、例えば部位特異的突然変異により、天然のVII因子をコードする核酸において、アミノ酸コドンを変えることによって、またはいくつかのアミノ酸コドンを除去することによって、野生型VII因子をコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。

VIIa因子またはＰＡＩ−１分子の機能に重要な領域の外側に置換を作成し、なおも活性なポリペプチドを生じさせることができることは当業者には明らかであろう。VII因子もしくはVII因子関連ポリペプチド、またはＰＡＩ−１もしくはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの活性に必須であり、従って、好ましくは、置換を受けないアミノ酸残基は、部位特異的突然変異生成またはアラニン走査変異生成（例えば、CunninghamおよびWells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照されたい）などの当該技術分野において既知の手順に従って同定されてもよい。後者の技術では、分子において正に荷電したすべての残基に変異が導入され、生じる変異体分子では、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために、凝固剤について、架橋性活性をそれぞれ試験する。また、基質-酵素の相互作用部位は、核磁気共鳴解析、結晶学、または光親和性標識化（例えば、de Vos ら、1992, Science 255: 306-312；Sm ith et a/., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904；Wlodaverら、1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照されたい）などの技術によって決定される、三次元構造解析によって決定することもできる。

1つのヌクレオチドをもう一つのヌクレオチドに交換するための、核酸配列への突然変異の導入は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、部位特異的変異誘発によって達成されてもよい。関心対象のインサートを有するスーパーコイル二重鎖DNAベクターおよび所望の変異を含む2つの合成プライマーを利用する手順が、特に有用である。ベクターの反対の鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、pfu DNAポリメラーゼによって温度サイクリングの間に伸長した。プライマーの取り込みにより、スタガー・ニックを含む変異プラスミドを産生する。温度サイクリングの後、メチル化およびヘミメチル化されたDNAに特異的であるDpnlで産物を処理して、親のDNA鋳型を消化し、変異を含有する合成DNAを選択する。遺伝子混合技術またはファージディスプレイ技術などの、変異体を作成、同定、および単離するための当該技術分野において既知のその他の手順を使用してもよい。

これらの起源の細胞に由来するポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成されてもよく、接着性細胞の培養物から所望の産物を含む細胞培養培地を取り出すこと；非接着性細胞を遠心分離または濾過して取り出すことなどを含むが、これらに限定されない。

任意には、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドをさらに精製してもよい。精製は、例えば抗VII因子抗体カラム（例えば、Wakabayashiら、J. Biol. Chem. 261: 11097,1986 ； and Thim ら、Biochem. 27: 7785,1988を参照）などによるアフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動的な手順（例えば調製用の等電点電気泳動（IEF）、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出などを含むが、これに限定されない当該技術分野において既知の任意の方法を使用して達成されてもよい。一般に、Scopes, Protein Puri-fication, Springer-Verlag, New York, 1982；およびProtein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい。精製後、本製剤は、宿主細胞に由来する非VII因子または非VII因子関連ポリペプチドを好ましくは約10重量％未満、より好ましくは約5%未満、および最も好ましくは約1%未満で含む。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、ＰＡＩ−１Ia、または、例えばIXa因子、カリクレイン、Xa因子、およびトロンビンなどのようなトリプシン様の特異性を有するその他のプロテアーゼを使用するタンパク分解性の切断によって活性化されてもよい。例えばOsterud ら、Biochem. 11: 2853 （1972）米国特許第4,456,591号；およびHednerら、J. Clin. Invest. 71: 1836 （1983）を参照されたい。あるいは、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、Mono Q（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより、活性化してもよい。次いで、生じる活性化されたVII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、後述するように処方され、投与される。

本発明の範囲内の用途のためのＰＡＩ−１は、例えば血漿または内皮細胞から既知の方法に従って単離され得る。しかしながら、疾患伝染のリスクをもたらす血液または組織由来の産物の使用を避けるために、組換えＰＡＩ−１を使用することが好ましい。ＰＡＩ−１の単離方法及び組換えＰＡＩ−１の調製方法は、当該分野で周知である：例えば、Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986), Gils et al., Biochim Biophys Acta. 1998 Sep 8 ; 1387 (1-2): 291-7; Sui et al. Biochem J. 1998 Apr 15 ; 331 (Pt 2) : 409-15; Ginsburg, et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986);または米国特許番号第6,303,338号及び同第6,103,498号を参照。ＰＡＩ−１変異体は、上記の通りに部位特異的突然変異誘発によって作製されてもよい。

ＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、野生型ＰＡＩ−１の修飾によって、または組換技術によって産生されてもよい。野生型ＰＡＩ−１と比較したときにアミノ酸が変更されているＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、周知の手段、例えば上記のより多詳細に説明したように、部位特異的突然変異により、天然のＰＡＩ−１をコードする核酸のアミノ酸コドンを変更することによって、またはいくつかのアミノ酸コドンを除去することによってのいずれかにより、野生型ＰＡＩ−１をコードする核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。これらの起源細胞からのポリペプチドの分離は、当該技術分野において既知のいずれの方法によって達成されてもよく、所望の産物を含む細胞培養培地を接着性細胞培養物から取り出すこと；遠心分離または濾過して非接着性細胞を取り出すこと；および同様のものを含むが、これらに限定されない。任意には、ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、さらに精製されてもよい。精製は、当業者に既知の任意の方法を使用して達成されてもよく、例えば上記により詳細に説明したような抗ＰＡＩ−１抗体カラムでのアフィニティークロマトグラフィ；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動的な手順（例えば調製用の等電点電気泳動（IEF））、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出などを含むが、これらに限定されるものではない。精製後、本製剤は、宿主細胞に由来する非ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドを好ましくは約10重量％未満、より好ましくは約5%未満、および最も好ましくは約1%未満で含む。次いで、得られた活性化ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは処方され、後述するように投与される。

当該分野の技術者には理解されるように、免疫応答が誘発されるリスクを減じるために、被験者と同質遺伝子的なＰＡＩ−１ポリペプチドおよびVII因子ポリペプチドを使用することが好ましい。また、本発明は、獣医学の手順の範囲内における、このようなＰＡＩ−１ポリペプチドおよびVII因子ポリペプチドの使用を含む。

薬学的組成物および使用方法
本発明の製剤は、凝固因子VIII、IX、XIまたはVIIレベルの減少、凝固因子阻害剤、血小板機能の欠陥によって引き起こされる症候群（例えば、グランツマン血小板無力症、ベルナール‐スリエ症候群）、血小板減少症、フォンウィルブランド病、および凝固タンパク質の希釈によって生じるような凝固障害、出血および／または輸液による線維素溶解の増大および血小板数の低下（例えば、手術または外傷を受けた多回輸血された被験者のもの）を含むがこれらに限定されない出血性疾患などのような、いずれのVII因子応答性の症候群を治療するために使用してもよい。本発明に従ったVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む薬学的組成物は、主に予防的および／または治療的な治療のための非経口投与が意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、即ち静脈内、皮下、または筋肉内に投与され；静脈内に投与されることが最も好ましい。また、これらは、持続的またはパルス状の輸液によって投与されてもよい。

本発明に従った薬学的組成物または製剤は、単一の単位剤形、またはパーツのキットのいずれかに処方され、好ましくは薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体または希釈液に溶解された、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドを含む。簡単には、本発明に従って使用するために適した薬学的組成物は、VII因子もしくはVII因子関連ポリペプチド、またはＰＡＩ−１、またはＰＡＩ−１と組み合わせたVII因子もしくはVII因子関連ポリペプチドを、好ましくは精製した形態で、適切なアジュバントおよび適切な担体または希釈液と混合して作成される。水、緩衝水、0.4%生理食塩水、0.3%グリシンなどの種々の水溶性担体を使用してもよい。また、本発明の製剤は、傷害の部位に送達（delivery）または標的化（targeting）するために、例えばゲルの形態で、またはリポソーム製剤としてなどの非水系の担体を使用して処方することもできる。リポソーム製剤は、例えば米国特許第4,837,028号4,501,728号、および4,975,282号において一般に記載されている。本組成物は、従来のよく知られた滅菌法技術によって殺菌されていてもよい。生じる水溶液は、使用のためにパックされ、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥されていてもよく、凍結乾燥された製剤は、投与の前に滅菌水溶液と混合される。

本組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、その他などの、pH調整剤、及び緩衝剤および／または緊張度調整剤（これらに限定されるものではない）を含む、薬学的に許容される補助物質またはアジュバントを含んでいてもよい。

製剤は、1つまたは複数の希釈液、乳化剤、保存剤、緩衝液、賦形剤、その他を更に含んでもよく、液体、粉末、エマルジョン、徐放性、その他などの形態で提供されてもよい。この技術分野の当業者であれば、本発明の組成物を適切な方法で、およびRemington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990に開示されたものなどの是認された実務に従って処方可能である。従って、静脈内輸液のための典型的な薬学的組成物は、250mlの無菌のリンゲル液および10mgの本製剤を含むように作成することができるであろう。

本発明の製剤を含む組成物は、予防的および／または治療的な治療のために投与することができる。治療的な適用において、本組成物は、すでに疾患に罹患している被検者に対して、疾患およびその合併症の臨床症状を治癒する、軽減する、または部分的に抑えるために十分な量で、上記の通りに投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な量」として定義される。それぞれの目的のための有効な量は、疾患または傷害の重篤さ、並びに被検者の重量および一般的な状態に依存する。適切な用量の決定が、値のマトリックスを構築すること、およびマトリックスの異なる点を試験することによって、ルーチン試験を使用して達成されるであろうことが理解される。

本発明の製剤の局所的な送達、例えば局所的な適用は、例えば噴霧、灌流、二重バルーンカテーテル、ステント、血管グラフトまたはステントに組み込むこと、バルーンカテーテルを被覆するために使用されるヒドロゲル、またはその他のよく確立された方法によって行ってもよい。いずれにしても、薬学的組成物は、症状を有効に治療するために十分な製剤の量を提供するべきである。

これらの製剤中の、VII因子もしくはVII因子関連ポリペプチド、ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチド、またはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドと組み合わせたVII因子もしくはVII因子関連ポリペプチドの濃度は、広く変更させることができ、即ち、約0.5重量％未満、通常少なくとも約1重量％以上から、15または20重量％程度であり、選択される特定の投与方法に従って、主に液体体積、粘性、その他によって選択される。注射または輸液、特に注射による投与が好ましい。従って、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、VII因子もしくはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの両方を含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の1つの剤形のもの、またはVII因子もしくはVII因子関連ポリペプチドを含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の1つの剤形のものとＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドを含む溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の1つの剤形のもののいずれかの製剤などの静脈内投与に適した形態で調製される。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの量、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの量は、共に、出血の発症を治療するために有効な量の凝集体を含むことが理解されるべきである。

本発明の材料が、一般に重篤な疾病または傷害において、即ち生命に脅威となる、または潜在的に生命に脅威となる状況において使用されることを考慮に入れておかなければならない。そのような場合、外来物質の極小化およびヒトにおけるVIIa因子の免疫原性およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの一般的な欠如の点からみて、治療医師によって、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能であり、また望ましいと感じられるであろう。

予防的適用において、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含む組成物は、疾病状態または傷害に感受性があるか、またはさもなければリスクのある被験者に投与されて、被検者自身の凝固能力を増強する。このような量は、「予防的に有効な用量」であると定義される。VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの量、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの量は、共に、出血の発症を治療するために有効な量の凝集体を含むことが理解される。

本組成物の一回または複数回の投与は、治療者により選択される用量レベル及びパターンで実施される。本組成物は、日または週につき、1回または複数回で投与されてもよい。このような薬学的組成物の有効な量は、出血の発症に対して臨床的に有意な効果を提供する量である。このような量は、一つには治療される特定の症状、被検者の年齢、重量、および一般的な健康、並びに当業者に明らかなその他の因子に依存する。

本発明の組成物は、一般に、予想される出血の前に、または出血の開始時に、単一用量で投与される。しかし、好ましくは、与えられる用量および被検者の症状によって、2-4-6-12時間の間隔で繰り返し（多回投与において）与えられてもよい。

慎重な処置に関連した治療のためには、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、典型的には処置を行う前の約24時間以内に、およびその後に7日以上の間投与されるであろう。凝固剤としての投与は、本明細書に記載されているように種々の経路によることができる。

本組成物は、適切な濃度のVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤の両方を含む単一の製剤（単一の剤形）の形態であってもよい。また、本組成物は、第1の単位剤形としてVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を、第2の単位剤形としてＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの製剤を含むパーツキットの形態で供給されてもよい。この場合、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、一方の後に他方が、好ましくは、互いに約15分以内、例えば互いに10分以内、またはより好ましくは、互いに5分以内、または、より好ましくは互いに2分以内に、投与されるべきである。2つの単位剤型のいずれを最初に投与してもよい。

本キットは、少なくとも2つの別々の薬学的組成物を含む。本キットは、別々の瓶または別々の箔パケットなどの、別々の組成物を含むための容器手段を含む。典型的には、本キットは、別々の成分の投与のための説明書を含む。別々の成分が好ましくは異なる剤形で、異なる投与間隔で投与されるときに、または個々の成分の組み合わせの滴定が処方する医師によって要求されているときに、本キット形態は特に有利である。

本発明に従って投与されるVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの量、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの量は、約1：100〜約100：1（w/w）の間の比で変化してもよい。従って、ＰＡＩ−１に対するVII因子の比は、例えば約1：100、または1：90、または1：80、または1：70、または1：60、または1：50、または1：40、または1：30、または1：20、または1：10、または1：5、または1：2、または1：1、または2：1、または5：1、または10：1、または20：1、または30：1、または40：1、または50：1、または60：1、または70：1、または80：1、または90：1、または100：1；または、約1：90〜約1：1の間、または、約1：80〜約1：2の間、または、約1：70〜約1：5の間、または、約1：60〜約1：10の間、約1：50〜約1：25の間、約1：40〜約1：30の間、または約90：1〜約1：1の間、または、約80：1〜約2：1の間、または、約70：1〜約5：1の間、または約60：1〜約10：1の間、または約50：1〜約25：1の間、または約40：1〜約30：1の間であってもよい。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの用量は、被検者の重量、症状、および症状の重篤さに依存して、負荷投与量または維持量として、70kgの被検者について約0.05mg〜約500mg/日の野生型VII因子、例えば約1mg〜約200mg/日、または例えば約5mg〜約175mg/日に対応する範囲で変動する。

ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの用量は、被検者の重量、症状、および症状の重篤さに依存して、負荷投与量または維持量として、70kgの被検者について約0.05mg〜約500mg/日の野生型ＰＡＩ−１、例えば約1mg〜約200mg/日、または例えば約1mg〜約175mg/日に対応する範囲で変動する。

VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの組み合わせにより、インビトロにおける血餅堅固性アッセイ法および線維素溶解時間アッセイ法において相乗効果を示す。さらに、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドの組み合わせにより、安定なフィブリン凝塊の形成、半血餅溶解時間の増大、血餅強度の増大、および線維素溶解に対する耐性の増大において相乗効果を示す。

本組成物は、適切な濃度のVII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドを含む単一の製剤の形態であってもよい。また、本組成物は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドを含む第1の単位剤形と、ＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドを含む第2の単位剤形とからなるキットの形態であってもよい。この場合、VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、およびＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドは、好ましくは、互いに約1〜2時間以内、例えば、互いに30分以内、または好ましくは10分以内、またはより好ましくは互いに5分以内に、連続的に投与されるべきである。2つの単位剤型のいずれを最初に投与してもよい。

本発明は、出血の発症の予防または治療に関し、或いは別々に投与されてもよい活性成分を組み合わせて治療することによる凝固治療のためのものであり、本発明は、キット形態で別々の薬学的組成物を組み合わせることにも関する。

本キットは、少なくとも2つの別々の薬学的組成物を含む。本キットは、別々の瓶または別々の箔パケットなどの別々の組成物を含むための容器手段を含む。典型的には、本キットは、別々の成分の投与のための説明書を含む。別々の成分が好ましくは異なる剤形で、異なる投与間隔で投与されるとき、または個々の成分の組み合わせの滴定が処方する医師によって要求されているときに、本キット形態は特に有利である。

アッセイ法：
VIIa因子活性の試験：
VIIa因子活性を試験することにより、適切なVIIa因子変異体を選択するために適したアッセイ法は、単一の予備的なインビトロ試験として行うことができる：
インビトロ加水分解アッセイ法
天然の（野生型）VIIa因子およびVIIa因子変異体（両者とも、これ以降「VIIa因子」と称する）は比活性をアッセイしてもよい。また、これらは、平行して、直接これらの比活性を比較するためにアッセイしてもよい。アッセイ法は、マイクロタイタープレート（MaxiSorp、Nunc, Denmark）において行う。終濃度1mMの色素生産性基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド（S-2288、Chromogenix、Sweden）を、VIIa因子（終濃度100nM）の0.1M NaCI、5mM CaCl₂、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む50mmのHepes、pH7.4溶液に添加する。405nmの吸光度を、SpectraMax（商標）340プレートリーダー（Molecular Devices, USA）において経時的に測定する。20分のインキュベーションの間に発生した吸光度を、酵素を含んでいない空のウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型のVIIa因子活性の間の比を算出するために使用する：
比=（A_405nmVIIa因子変異体）/（A_405nmVIIa野生型因子）。

その結果に基づいて、天然のVIIa因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有するVIIa因子変異体、例えば変異体の活性と天然のVII因子（野生型FVII）の活性の比が、対1.0を超えるかその周辺にある変異体などを同定してもよい。

また、VIIa因子またはVIIa因子変異体の活性は、X因子などの生理学的な基質を、最適には100〜1000nMの濃度で使用して測定してもよく、この場合、Xa因子の生成は、適切な色素生産性基質（例えば、S-2765）を添加した後に測定する。加えて、活性アッセイ法は、生理学的な温度で行ってよい。

インビトロ・タンパク質分解アッセイ法
天然の（野生型）VIIa因子およびVIIa因子変異体（両者とも、これ以降「VIIa因子」と称する）を、平行して、直接これらの比活性を比較するためにアッセイする。アッセイ法は、マイクロタイタープレート（MaxiSorp, Nunc, Denmark）において行う。VIIa因子（10nM）およびX因子（0.8μM）の0.1M NaCl、5mM CaCl₂、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む50mMのHepes、pH7.4の100μlの溶液を15分間インキュベートする。次いで、0.1M NaCl、20mM EDTA、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含む50mMのHepes、pH7.4を50μl添加することにより、X因子の切断を停止する。生成したXa因子の量は、色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド（S-2288, Chromogenix, Sweden）（終濃度0.5mM）を添加することによって測定する。405nmの吸光度を、SpectraMax（商標）340プレートリーダー（Molecular Devices, USA）において経時的に測定する。10分のインキュベーションの間に発生した吸光度を、酵素を含んでいない空のウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型のVIIa因子活性の間の比を算出するために使用する：
比=（A₄₀₅nmVIIa因子変異体）/（A₄₀₅nmVIIa野生型因子）。

その結果に基づいて、天然のVIIa因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有するVIIa因子変異体を、例えば変異体の活性および天然のVII因子（野生型FVII）の活性の間の比が、対1.0を超える周辺にある変異体などを、同定してもよい。

トロンビン生成アッセイ法：
VII因子もしくはVII因子関連ポリペプチド、またはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチドもしくはＰＡＩ−１またはＰＡＩ−１関連ポリペプチド関連ポリペプチド（例えば、変異体）がトロンビンを生成する能力は、全ての関連した凝固因子および生理的濃度の阻害剤および活性化された血小板を含むアッセイ法において測定することができる（J.Haematol.99,542-547の543ページに記載されているもの、これは本明細書に参照として援用される）。

ＰＡＩ−１活性の試験：
ＰＡＩ−１活性を試験するのに適したアッセイ法、及び、それによって提供される本発明で用いるのに適したＰＡＩ−１変異体を選択するための手段は、例えば、Chandlerら、Clinical Chemistry, 35(5) 787-793 (1989)に記載されたとおりに、または当該分野で周知の他のアッセイ法によｒう、簡単なインビトロ試験として行うことができる。

本発明は、以下の実施例によってさらに図示されるが、これは、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。前記において、また以下の実施例において開示された特徴は、別々に、およびその任意の組み合わせの両方ともが、本発明のその多様な形態を理解するための材料である。

実施例1
VIIa凝固因子およびＰＡＩ−１の組み合わせによる、止血性血餅の安定度の改善
方法：
血餅溶解アッセイ法：イノビン（Innovin）（Dade Behring,2000倍希釈）、rFVIIa（Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Denmark、種々の濃度）、およびt-PA（American Diagnostica、8nm）を含む緩衝液（20mMのHEPES、150mMのNaCl、5mMのCaCl、pH7.4）で10倍に稀釈した正常ヒト血漿を96-ウェルELISAプレートに添加して、650nmの濁度を室温において時間とともに測定した。示した場合には、精製されたヒトＰＡＩ−１（American Diagnostica,種々の濃度）を含めた。

回転性スロンボエラストグラフィー（rotational thromboelastography:roTEG）：5nMのt-PAを添加した、クエン酸塩加の正常ヒト血漿またはVIII因子欠損血漿（George King Bio-Medical,Inc. #0800）で測定を行い、1nMのFVIIaを単独で、または30nMのＰＡＩ−１と組合せで添加した効果を解析した。凝固は、イノビン（終濃度2000倍稀釈、Dade Behring# 526945）およびカルシウム（終濃度15mM）の20mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4緩衝液の添加によって開始した。

結果：
血餅溶解アッセイ法：FVIIa添加により、血餅溶解時間の用量依存的な延長を生じた（図1）。この効果は、10nMのFVIIaにおいて最適であった。10nMのFVIIaの存在下において、ＰＡＩ−１を添加することにより、血餅溶解時間のさらなる延長が生じた（図2）。この効果は、用量依存的であり、10nMのＰＡＩ−１において最適であった。

トロンボエラストグラフィー（thromboelastography）:最大血餅固さ（Maximal Clot Firmness:MCF）に対するFVIIaおよびＰＡＩ−１の効果、並びにt-PAを介した溶解に対する血餅の耐性を解析するために、roTEG測定を利用した。測定は、正常なヒト血漿及びFVIII欠損ヒト血漿の両方で行った。FVIIa/ＰＡＩ−１の添加前に、MCFは25mm及び4mmであり、半血餅溶解時間は、正常な血漿及び血友病の血漿のそれぞれで、12.3分及び14.3分であった（図3及び4）。

正常なヒト血漿において、PAI-1（３０ｎＭ）の添加はＭＣＦを変化させなかったが、半血餅溶解時間を１６．１分に延長した（図３）。血友病の血漿において、PAI-1単独の添加（３０ｎＭ）は、ＭＣＦを５ｍｍに増加させ、半血餅溶解時間を３２.４分に延長した（図４）。FVIIa（１ｎＭ）を添加した結果、正常な血漿のＭＣＦに何らの深刻な影響を及ぼすことなく、ｔ−ＰＡが媒介する溶解から血餅が保護され（半血餅溶解時間；１６.７分）（図３）、血友病の血漿にFVIIaを添加した場合、溶解から血餅を保護する作用を示し（半血餅溶解時間；２１.３分）、ＭＣＦ値をかなり増大させた（１５分）（図４）。しかしながら、PAI-1と共にFVIIaを添加すると、正常な血漿及び血友病の血漿のそれぞれで、半血餅溶解時間を２９.８分および４５分に増加させ、またＭＣＦ値を２７.４ｍｍ及び１６.９ｍｍに増加させた。

結論：
これらの結果は、血漿にFVIIaおよびPAI-1を症状的な方法で添加することにより、血餅の機械的強度及び線維素溶解に対する耐性を改善することを証明した。

FVIIaを添加した結果、血餅溶解時間の延長が用量に依存した。この効果は10nM FVIIaにおいて最適であった。 10nM FVIIaの存在下において、PAI-1を添加した結果、血餅溶解時間がさらに延長された。この効果は用量に依存し、10nMのPAI-1で最適であった。 トロンボエラストグラフィー（roTEG）測定は、ｔ−ＰＡによる溶解に対する血餅の耐性と共に、最大血餅強度（MCF）を有するFVIIa及びPAI-1の組合せの効果を分析するために使用した。正常なヒトの血漿において、PAI-1（30nM）の添加は、ＭＣＦを変化させなかったが、半血餅溶解時間を１６．１分に延長した。時間尺度は分である。 トロンボエラストグラフィー（roTEG）測定は、ｔ−ＰＡによる溶解に対する血餅の耐性と共に、最大血餅強度（ＭＣＦ）を有するFVIIa及びPAI-1の組合せの効果を分析するために使用した。血友病患者の血漿において、PAI-1単独での添加は、ＭＣＦを５分に増加させ、半血餅溶解時間を３２.４分に延長した。時間尺度は分である。

Claims (53)

1. VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドを含む薬学的組成物。
2. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、VII因子関連ポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記VII因子関連ポリペプチドは、VII因子アミノ酸配列変異体である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記VII因子関連ポリペプチドの活性と、天然のヒトVIIa因子（野生型FVIIa）の活性の比が、本明細書に記載したとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１.２５である、請求項２または３に記載の組成物。
5. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドはVII因子である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記VII因子はヒトVII因子である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記VII因子は組換えヒトVII因子である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドはその活性型である、請求項１〜７の何れか一項に記載の組成物。
9. 前記VII因子は組換えヒトVIIa因子である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドはPAI-1関連ポリペプチドである、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
11. 前記PAI-1関連ポリペプチドはPAI-1アミノ酸配列変異体である、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記PAI-1関連ポリペプチドの活性と、前記天然ヒトPAI-1（野生型PAI-1）の活性の比が、本明細書に記載したとおりの「PAI-1アッセイ法」で試験したときに、少なくとも約１.２５である、請求項１０または１１に記載の組成物。
13. 前記PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドはPAI-1ポリペプチドである、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
14. 前記PAI-1はヒトPAI-1である、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記PAI-1は組換えヒトPAI-1である、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記PAI-1は活性化されたコンホメーションである、請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項１〜１６の何れか一項に記載の組成物であって、前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドと、前記PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、約１００：１乃至約１：１００（ｗ/ｗ VII因子：PAI-1）の質量比で存在することを特徴とする組成物。
18. 前記組成物は、注射または輸液、特に注射に適した薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１７の何れか一項に記載の組成物。
19. 出血の発症の治療を含むパーツのキットであって、
    ｆ）第一の単位剤形中に、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの有効量の製剤、及び薬学的に許容される担体、
    ｇ）第二の単位剤形中に、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの有効量の製剤、及び薬学的に許容される担体、及び
    ｈ）前記第一及び第二の剤形を含むための容器手段、
    を含むパーツのキット。
20. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドはVII因子関連ポリペプチドである、請求項１９に記載のキット。
21. 前記VII因子関連ポリペプチドはVII因子アミノ酸配列変異体である、請求項２０に記載のキット。
22. 前記VII因子関連ポリペプチドの活性と、前記天然ヒトVIIa因子（野生型FVIIa）の活性の比が、本明細書に記載されたとおりの「インビトロ加水分解アッセイ法」で試験したとき、少なくとも約１.２５である、請求項２０または２１に記載のキット。
23. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドはVII因子である、請求項１９に記載のキット。
24. 前記VII因子はヒトVII因子である、請求項２３に記載のキット。
25. 前記VII因子ポリペプチドは組換えヒトVII因子である、請求項２４に記載のキット。
26. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチドは、その活性型である、請求項１９〜２５の何れか一項に記載のキット。
27. 前記VII因子は組換えヒトVIIa因子である、請求項２６に記載のキット。
28. 前記PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドはPAI-1関連ポリペプチドである、請求項１９〜２７の何れか一項に記載のキット。
29. 前記PAI-1関連ポリペプチドは、PAI-1アミノ酸配列変異体である、請求項２８に記載のキット。
30. 前記PAI-1関連ポリペプチドの活性と、前記天然のヒトPAI-1（野生型PAI-1）の活性の比が、本明細書に記載したとおりの「PAI-1アッセイ法」で試験したとき、少なくとも約１.２５であることを特徴とする、請求項２８または２９に記載のキット。
31. 前記PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドはPAI-1である、請求項１９〜２７の何れか一項に記載のキット。
32. 前記PAI-1はヒトPAI-1である、請求項３１に記載のキット。
33. 前記PAI-1は組換えヒトPAI-1である、請求項３２に記載のキット。
34. 前記PAI-1は、活性化されたコンホメーションである、請求項３３に記載のキット。
35. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドが、約１００：１乃至約１：１００（ｗ/ｗ VII因子：PAI-1）の質量比で存在する、請求項１９〜３４の何れか一項に記載のキット。
36. 出血の発症を治療するための薬物を製造するための、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドと組み合わせたVII因子またはVII因子関連ポリペプチドの使用。
37. 出血の発症を治療するための薬物を製造するための、請求項１〜１８の何れか一項に記載の組成物の使用。
38. 前記薬物は凝固時間を減少させるための薬物である、請求項３６または３７に記載の使用。
39. 前記薬物は血餅溶解時間を延長させるための薬物である、請求項３６または３７に記載の使用。
40. 前記薬物は、血餅強度を増大させるための薬物である、請求項３６または３７に記載の使用。
41. 前記薬物は、注射または輸液、特に注射のために処方される、請求項３６〜４０の何れか一項に記載の使用。
42. 前記出血の発症は、外傷、または手術、あるいは血小板の計数または活性の低下によるものである、請求項３６〜４１の何れか一項に記載の使用。
43. 前記薬物は単一剤形である、請求項３６〜４２の何れか一項に記載の使用。
44. 前記薬物は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を含む第一の単位剤形と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤を含む第二の単位剤形の形態で調製されることを特徴とする、請求項３６〜４２の何れか一項に記載の使用。
45. 被検者における出血の発症を治療する方法であって、該方法は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第一の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第二の量を、それらを必要とする被検者に投与することを含み、該第一の量および第二の量は共に、出血を治療するために有効である方法。
46. 被検者における凝固時間を減少させる方法であって、該方法は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第一の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第二の量を、それらを必要とする被検者に投与することを含み、該第一の量および第二の量は共に、凝固時間を減少させるために有効である方法。
47. 被検者における止血を増強する方法であって、該方法は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第一の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第二の量を、それらを必要とする被検者に投与することを含み、該第一の量および第二の量は共に、止血を増強するために有効である方法。
48. 被検者における血餅溶解時間を延長するための方法であって、該方法は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第一の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第二の量を、それらを必要とする被検者に投与することを含み、該第一の量および第二の量は共に、血餅溶解時間を延長するために有効である方法。
49. 被検者における血餅強度を増大するための方法であって、該方法は、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤の第一の量と、PAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤の第二の量を、それらを必要とする被検者に投与することを含み、該第一の量および第二の量は共に、血餅強度を増大するために有効である方法。
50. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、単一の剤形で投与される、請求項４５〜４９の何れか一項に記載の方法。
51. 前記VII因子またはVII因子関連ポリペプチド、及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドは、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの製剤を含む第一の剤形及びPAI-1またはPAI-1関連ポリペプチドの製剤を含む第二の剤形の形態で投与される、請求項４５〜４９の何れか一項に記載の方法。
52. 前記第一の剤形及び第二の剤形は、１５分を超える時間間隔をあけずに投与されることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
53. 出血の発症のための治療を含むキットであって、
    ａ）単一の単位剤形中の、VII因子またはVII因子関連ポリペプチドの有効量、PAI-1又はPAI-1関連ポリペプチドの有効量、及び薬学的に許容される担体；及び、
    ｂ）前記単一の単位剤形を含むための容器手段
    を含むキット。

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