CZ20023667A3

CZ20023667A3 - Farmaceutický prostředek obsahující VIIA a XIII faktory

Info

Publication number: CZ20023667A3
Application number: CZ20023667A
Authority: CZ
Inventors: Lars Christian Petersen; Ulla Hedner; Rasmus Rojkjaer
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2003-04-16
Also published as: EP1593389A1; ES2254414T3; AU2001258230A1; US20060199766A1; WO2001085199A1; DE60115422D1; DE60112429D1; EP1282439B1; DE60115422T2; AU2001258228B2; ATE311198T1; BR0110659A; EP1282438B1; NO20025355L; CN1304049C; CA2406583A1; CN1429117A; NO20025355D0; AU5822801A; WO2001085198A1

Description

Předložený vynález se týká farmaceutického prostředku, který obsahuje faktor Vila a faktor XIII. Vynález se také týká použití kombinace faktoru Vila a faktoru XIII pro výrobu léčiva pro léčbu jedinců trpících epizodami krvácení nebo pro prevenci těchto epizod. Vynález se také týká způsobu léčby epizod krvácení u jedinců a způsobem zvýšení tvorby sraženiny u jedince. Předložený vynález se také týká sad obsahujících tyto sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Zástava krvácení je odstartována tvorbou komplexu mezi tkáňovým faktorem (TF), který je vystaven po poškození cévní stěny cirkulující krvi a FVIIa, který je přítomen v krevním oběhu v množství odpovídajícím přibližně 1 % celkového množství FVII proteinu. Tento komplex je ukotven v buňkách nesoucích TF a aktivuje tak na povrchu buňky FX na FXa a FIX na FIXa. FXa aktivuje protrombin na trombin, který aktivuje FVIII, FV, FXI a FXIII. Dále v tomto počátečním kroku toto omezené množství takto vytvořeného trombinu aktivuje krevní destičky. Po kroku aktivace krevních destiček trombinem se u krevních destiček změní tvar na jejich povrchu a nabité fosfolípidy jsou odkryty. Tento aktivovaný povrch krevních destiček je vzorem pro další aktivaci FX a plnou výrobu trombinu. Další aktivace trombinu na aktivovaném povrchu krevních destiček se děje přes FIXa-FVIIIa komplex vytvořený na povrchu aktivovaných krevních destiček a FXa potom mění protrombin na trombin pokud je na povrchu.

Trombin potom přeměňuje fibrinogen na fibrin, který je nerozpustný a který stabilizuje počáteční plak krevních destiček. Tento proces je rozčleněn , tj. je lokalizován v místě exprese a vystavení TF a tím se minimalizuje riziko systémové aktivace koagulačního systému. Nerozpustný fibrin tvořící plak je dále stabilizován pomocí FXIII-katalyzovaného zesíťování vláken fibrinu.

FVIIa se vyskytuje v plazmě hlavně jako jednořetězcový zymogen, který je štěpen FXa na dva řetězce, aktivovanou formu, FVIIa. Rekombinantní aktivovaný faktor Vila (rFVIIa) byl vyvinut jako prohemostatické léčivo. Podávání rFVIIa nabízí rychlou a

vysoce účinnou prohemostatickou odezvu u hemofilického jedince s krvácením, který nemůže být léčen produkty koagulačního faktoru kvůli tvorbě protilátek. Taktéž krvácející jedinci s deficiencí faktoru VII nebo jedinci mající normální koagulační systém, ale kteří trpí nadměrným krvácením mohou být úspěšně léčeni FVIIa. V těchto studiích nebyly shledány žádné vedlejší účinky u rFVIIa (zejména žádný výskyt tromboembolizmu).

Navíc exogenně podávaný FVIIa zvyšuje tvorbu trombinu na aktivovaném povrchu krevních destiček. Toto se vyskytuje u hemofilických jedinců postrádajících FIX nebo FVIII a tím pádem postrádajících nejvíce účinnou dráhu pro plnou tvorbu trombinu. Také v přítomnosti sníženého počtu krevních destiček nebo u krevních destiček s poruchou funkce extra podávaný FVIIa zvyšuje tvorbu trombinu.

FXIII, faktor stabilizující fibrin, je transglutamináza, která zesíťuje monomery fibrinu a tím zajišťuje strukturu fibrinu se zvýšenou odolností k rozpouštění plasminem a ostatními proteolytickými enzymy. Faktor XIII je také znám jako „fibrinoligáza“ a „fibrin stabilizující faktor“. Pokud je aktivován, FXIIIa je schopen tvořit mezimolekulární gamaglutamylepsilonlysin-příčné vazby mezi bočními řetězci molekul fibrinu a mezi ostatními substráty. FXIII se nalézá v plazmě a v krevních destičkách. Enzym existuje v plazmě jako tetramerní zymogen sestávající z dvou alfa podjednotek a dvou beta podjednotek (označovaný jako a₂b₂) a v krevních destičkách jako zymogen sestávající z dvou alfa podjednotek (označovaný jako a₂ - dimer).

Oba zymogeny jsou aktivovány trombinem a Ca²⁺. Kalcium je uvolňováno z krevních destiček při agregaci v místě poranění. Trombin odštěpí 1-37 N-terminální aminokyselinový zbytek (z a₂ - dimeru). V případě a₂b₂- zymogenu je oddělena podjednotka beta od aktivované podjednotky alfa. Kalcium se váže stejně dobře k zymogenu jako k modifikované molekule trombinu. Po aktivaci trombinu a kalcia je aktivní centrum cysteinu na alfa řetězci odhaleno a je vytvořen aktivní enzym. U jedinců s vážnými trombocytopéniemi (dlouhodobý úbytek krevních destiček) bylo shledáno, že mají nízké hladiny FXIII v plazmě.

Je dobře známo, že u jedinců, kteří nadměrně krvácejí ve spojení s chirurgií nebo závažným traumatem a potřebují krevní transfúzi, se vyskytuje více komplikací než u těch, kteří netrpí žádným krvácením. Nicméně i mírné krvácení vyžadující podání lidské krve nebo krevních produktů (krevní destičky, leukocyty, od plazmy odvozené koncentráty k léčbě koagulačních poruch atd.) může vést ke komplikacím spojeným s rizikem přenosu lidských virů (hepatitidy, HIV, parvoviry a další neznámé viry).

Rozsáhlá krvácení, která vyžadují značné krevní transfúze, mohou vést k rozvoji hromadného selhání orgánů včetně poškození funkce plic a ledvin. Jakmile se u jedince rozvinou tyto vážné komplikace je odstartována kaskáda dějů, zahrnující řadu cytokinů a zánětlivých reakcí, které činí jakoukoliv léčbu velmi složitou a bohužel většinou neúspěšnou. Proto je hlavním cílem v chirurgii stejně jako při léčbě vážnějších poškození tkáně vyhnout se nebo omezit krvácení.

Klíčový význam při vyhnutí se takovému krvácení nebo jeho omezení má zajištění tvorby stabilního a pevného hemostatického plaku, který není snadno rozpustný fybrinolytickými enzymy. Navíc je velmi důležité zajistit rychlé a účinné vytvoření takovýchto plaků nebo sraženin.

Japonská patentová žádost č. 2-167 234 A se zabývá adhezivy pro biotkáně, vyznačující se tím, že obsahují fibrinogen, protrombin, krevní koagulační faktor IX, krevní koagulační faktor X, krevní koagulační faktor XIII, antitrombin, inhibitor proteinázy a vápenaté ionty.

Japonská patentová žádost č. 59 -116 213 A se zabývá farmaceutickým prostředkem aerosolu, kterého lze použít jako lepidla tkání a který obsahuje jako aktivní složku krevní koagulanty. Krevní koagulanty mohou být vybrány z krevních koagulačních faktorů I,II,III,IV,V, VI, VII, Vlil, IX, X, XI, XII a XIII, prekalikreinu, vysoce polymeračního kininogenu a trombinu. Kombinace FXIII a trombinu je preferována.

WO 93/12 813 (ZymoGenetics) se týká použití FXIII pro snížení perioperativní ztráty krve u jedince, který podstupuje operaci. Farmaceutický prostředek může také obsahovat aprotitnin. FXIII je podáván jedinci jako injekce, většinou den před operací.

Evropský patent č. 225 160 (Novo Nordisk) se týká farmaceutických přípravků FVIIa a způsobů léčby poruch krvácení, které nejsou způsobeny poruchami srážecího faktoru nebo inhibitory srážecího faktoru.

Evropský patent č. 82 182 (Baxter Travenol Lab.) se týká použití farmaceutických prostředků FVIIa v působení proti poruchám faktorů srážlivosti krve nebo účinků na faktory srážlivosti krve u jedince.

Mezinárodní patentová publikace č. WO 93/06 855 (Novo Nordisk) se týká aktuálního využití FVIIa.

Kjalke et al., Thrombosis and Haemostasis, 1999 (Suppl), 095 1 se týká extra podávání exogenních FVIIa a účinků na tvorbu trombinu na povrchu aktivovaných krevních destiček u modelu systému napodobujícím hemofilii formy A nebo B.

V tomto oboru je stále poptávka po vylepšených, spolehlivých a široce využitelných způsobech zvýšení koagulace, rychlé tvorby hemostatických plaků a dosažení plné zástavy krvácení u jedinců, zvláště u jedinců, kteří mají narušenou tvorbu trombinu. Také je třeba způsobů, ve kterých je sníženo množství FVIIa potřebného pro dosažení plné zástavy krvácení.

Podstata vynálezu

Jedním z předmětů předloženého vynálezu je zajištění farmaceutických prostředků, které mohou být účinně používány při léčbě a prevenci epizod krvácení a poruch koagulace.

Druhým předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí farmaceutického prostředku ve formě jedné dávky, který může být účinně používán při léčbě nebo prevenci epizod krvácení nebo jako prokoagulant.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, způsobů léčby nebo sad, u kterých se vyskytuje synergistický účinek.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí farmaceutických prostředků, způsobů léčby nebo sad, u kterých se nevyskytuje mnoho vedlejších účinků, jakými jsou vysoká hladina systemické aktivace koagulačního systému.

Jiné předměty předloženého vynálezu budou zřejmé po přečtení předloženého popisu.

Bylo prokázáno, že kombinace faktoru Vila a faktoru XIII může snížit čas srážení normální lidské plazmy efektivněji než faktor Vila nebo faktor XIII samostatně. Také bylo prokázáno, že kombinace faktoru Vila a faktoru XIII může zvyšovat pevnost sraženiny efektivněji než faktor Vila nebo faktor XIII samostatně. Kombinací faktoru Vila při koncentraci, kdy už nebyl pozorován další nárůst v pevnosti sraženiny s faktorem XIII, také při koncentraci, kdy již nebyl pozorován další nárůst v pevnosti sraženiny, bylo nečekaně pozorováno, že bylo dosaženo dalšího nárůstu v pevnosti sraženiny. Bylo také prokázáno, že kombinací faktoru Vila a faktoru XIII lze prodloužit čas in vitro lýze sraženiny v normální lidské plazmě efektivněji než u samotného faktoru Vila nebo samotného faktoru XIII.

A tak může být zvýšením koagulace docíleno účinné léčby krvácení u daných jedinců. Navíc pacienti mohou být léčeni relativně nízkými koncentracemi faktoru Vila, a

4 ·

4 • · 4 · 4 · « • 4 4 · · 4 4 4 · • 4 4 · · · · ··· 444 ··· 4··· ·· ···· tím se značně snižují poměrně vysoké náklady v souvislosti s běžnou léčbou samotným faktorem Vila.

Z prvního hlediska se vynález týká farmaceutického prostředku, který obsahuje faktor Vila a faktor XIII a popřípadě farmaceuticky vhodný nosič.

Z dalšího hlediska se vynález týká farmaceutického prostředku, který obsahuje faktor Vila a faktor XIII jako jediné aktivní činidlo a popřípadě farmaceuticky vhodný nosič.

Z dalšího hlediska se vynález týká farmaceutického prostředku, který je vytvořen pro nitrožilní podávání a obsahuje faktor Vila a faktor XIII a popřípadě farmaceuticky vhodný nosič.

Z dalšího hlediska se vynález týká farmaceutického prostředku, který je vytvořen pro nitrožilní podávání a obsahuje faktor Vila a faktor XIII jako jediné aktivní činidlo a popřípadě farmaceuticky vhodný nosič.

V jednom z provedení je faktor Vila rekombinantním faktorem Vila a faktor XIII je rekombinantním faktorem XIII.

V jednom z provedení vynálezu je faktor Vila rekombinantním faktorem Vila.

V dalším provedení je faktor Vila je obměněným faktorem Vila.

V jednom z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 20 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených oproti divokému typu faktoru Vila (tj. u polypeptidu majícím sekvenci aminokyselin uveřejněnou v patentu US 4 784 950). V dalším z provedení mají obměny faktoru Vila ne více než 15 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených; v dalším z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 10 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených;

v dalším z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 8 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených;

v dalším z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 6 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených;

v dalším z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 5 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených;

v dalším z provedení jsou obměnami faktoru Vila obměny v sekvenci aminokyselin, které mají ne více než 3 aminokyselin nahrazených, deletovaných nebo vložených oproti divokému typu faktoru Vila. V jednom z provedení jsou obměny faktoru Vila *· ·· • * · · • · · 4 • · · · · vybrány ze seznamu [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [ L305I ]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa ] a [K337A]FVIIa.

V jednom z provedení je faktorem XIII faktor FXIII a2b2. V dalším z provedení je faktorem XIII faktor FXIII a2. V dalším z provedení je faktor XIII aktivovaným faktorem XIII (FXIIIa). V jednom z provedení je faktor XIII obměna faktoru XIII. V jednom z provedení je faktor XIII lidským faktorem XIII. V jednom z provedení je faktor XIII rekombinantní faktor XIII. V jednom z provedení je faktor XIII rekombinantní lidský faktor XIII. V jednom z provedení je faktor XIII lidský a2-dimer.

Z dalšího hlediska farmaceutický prostředek dále obsahuje TFPI inhibitor.

Z dalšího hlediska obsahuje farmaceutický prostředek ještě faktor Vlil. Z dalšího hlediska obsahuje farmaceutický prostředek dále faktor Vlil a TFPI inhibitor. V jednom z provedení obsahuje farmaceutický prostředek dále inhibitor fybrinolytického systému, tj. aprotin, ε-aminokapronovou kyselinu nebo tranexamovou kyselinu.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k sadě obsahující ošetření pro epizody krvácení, která se skládá z

a) účinného množství faktoru Vila a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

b) účinného množství faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy,

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

Z dalšího hlediska se sada skládá z

c) účinného množství TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy • · ·· ► ♦ ♦

a) účinného množství faktoru Vila a TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

b) účinného množství faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

b) účinného množství faktoru XIII a TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

a) účinného množství faktoru Vila a faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

b) účinného množství TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy.

c) účinného množství faktoru Vlil a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy, a

d) účinného množství TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve čtvrté části dávkové formy, a

θ) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé, třetí a čtvrté dávkové formy.

Z dalšího hlediska se sada skládá z

b) účinného množství faktoru Vlil a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) účinného množství faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy, a

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy

a) účinného množství faktoru Vila a faktor Vlil a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

c) účinného množství TFPI inhibitoru a faktor Vlil a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy,

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy * ·» ·· ·· •» * * · * « • · · · · • · · ♦ · · · • · · · · ····*·· · ♦ ··»·

b) účinného množství faktoru Vlil a TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

a) účinného množství faktoru Vlil a faktor XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

c) účinného množství faktoru Vila a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy,

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy

a) účinného množství faktoru XIII a TFPI inhibitoru a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

c) účinného množství faktoru Vila popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy,

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy

a) účinného množství TFPI inhibitoru a faktor Vlil a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

b) účinného množství faktoru Vila a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) účinného množství faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče ve třetí části dávkové formy,

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy

a) účinného množství TFPI inhibitoru a faktor XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v první části dávkové formy,

b) účinného množství faktoru Vlil a faktoru Vila a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

b) účinného množství faktoru Vlil a faktoru XIII a popřípadě z farmaceuticky vhodného nosiče v druhé části dávkové formy, a

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro léčbu epizod krvácení.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro snížení času srážení u jedince.

’ Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro prodloužení času lýze sraženiny v savčí plazmě.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro zvýšení pevnosti sraženiny v savčí plazmě.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby sraženiny fibrinu v savčí plazmě.

* · · ·* ·· ·· •· ♦· ·· · · « © · • · · · · · · • ·· · 9 9 9 9 9 • · · · 9 9 9 ·♦· ··· ·©*♦♦·© ·» ·»«·

V jednom z provedení je savčí plazmou lidská plazma. V dalším z provedení je savčí plazmou normální plazma, v dalším z provedení je plazmou normální lidská plazma, v jednom z provedení je plazmou plazma z jedince mající narušenou tvorbu trombinu. V jednom z provedení je plazma z jedince, který má sníženou koncentraci fibrinogenu.

V jednom z provedení prodlužuje faktor Vila a faktor XIII čas lýze sraženiny in vitro v normální lidské plazmě.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k způsobu zvýšení tvorby sraženiny fibrinu u jedince, která se skládá z podávání účinného množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII danému jedinci.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k způsobu léčby epizod krvácení u jedince sestávající z podávání účinného množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII danému jedinci.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k způsobu snížení času srážení savčí plazmy sestávající z kontaktu plazmy s plazmou mající účinné množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII. Z dalšího hlediska je účinné množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII podáváno jedinci, který takovou léčbu vyžaduje.

Z dalšího hlediska se vynález vztahuje k způsobu zvýšení tvorby sraženiny fibrinu u jedince, která sestává z podávání účinného množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII.

V jednom z provedení těchto způsobů vynálezu je faktor Vila a faktor XIII výhradní aktivní činidlo podávané jedinci. V dalším z provedení tohoto vynálezu se farmaceutický prostředek skládá z faktoru Vila a faktoru XIII jako jediného aktivního činidla.

V jednom z provedení těchto způsobů vynálezu je faktor Vila a faktor XIII podáván současněv jedné dávkové formě. V dalším z provedení tohoto vynálezu je faktor Vila a faktor XIII podáván postupně. V dalším z provedení je faktor Vila a faktor XIII podáván 1 až 2 hodiny po sobě, například v rozmezí 30 minut po sobě, nebo například 10 minut po sobě, tj. ve formě sady obsahující faktor Vila v první dávkové formě a faktor XIII ve druhé dávkové formě.

V jednom z provedení je účinné množství faktoru Vila v rozmezí od 0,05 mg/den do 500 mg/den (70-kg jedinec). V jednom z provedení je účinné množství faktoru XIII v rozmezí od 0,05 mg/den do 500 mg/den (70-kg jedinec).

• * ♦ ·· «· ·· ·* ·· · · · • » · * · · · • · * · ····· • * ♦ · · · · ··· ··· «··«^*· ·» ·«··

V jednom z provedení sestává farmaceutický prostředek (pokud se jedná o přípravek v jednoduché formě) v podstatě z faktoru Vila a faktoru XIII a popřípadě z alespoň jedné farmaceuticky vhodné inertní substance k přenosu léčebné látky nebo nosiče a/nebo stabilizátoru a/nebo neutrální soli a/nebo antioxidantu a/nebo konzervační látky a/nebo inhibitoru proteázy.

V dalším z provedení předloženého vynálezu sestává farmaceutický prostředek (pokud se jedná o přípravek v jednoduché formě) v podstatě z faktoru Vila a faktoru XIII a popřípadě z alespoň jedné farmaceuticky vhodné inertní substance k přenosu léčebné látky nebo nosiče a/nebo stabilizátoru a/nebo neutrální soli a/nebo antioxidantu a/nebo konzervační látky a/nebo inhibitoru proteázy a/nebo TFPI inhibitoru.

V dalším z provedení předloženého vynálezu sestává farmaceutický prostředek (pokud se jedná o přípravek v jednoduché formě) v podstatě z faktoru Vila a faktoru XIII a popřípadě z alespoň jedné farmaceuticky vhodné inertní substance k přenosu léčebné látky nebo nosiče a/nebo stabilizátoru a/nebo neutrální soli a/nebo antioxidantu a/nebo konzervační látky a/nebo inhibitoru proteázy a/nebo TFPI inhibitoru a/nebo faktoru Vlil.

V dalším z provedení předloženého vynálezu sestává farmaceutický prostředek (pokud se jedná o přípravek ve formě sady) z první části dávkové formy obsahující v podstatě faktor Vila a popřípadě alespoň jednu farmaceuticky vhodnou inertní substanci k přenosu léčebné látky nebo nosič a/nebo stabilizátor a/nebo povrchově aktivní látku a/nebo neutrální sůl a/nebo antioxidant a/nebo konzervační látku a/nebo inhibitor proteázy a z druhé dávkové formy obsahující v podstatě faktor XIII a popřípadě alespoň jednu farmaceuticky vhodnou inertní substanci k přenosu léčebné látky nebo nosič a/nebo stabilizátor a/nebo povrchově aktivní látku a/nebo neutrální sůl a/nebo antioxidant a/nebo konzervační látku a/nebo inhibitor proteázy.

V dalším z provedení předloženého vynálezu sestává farmaceutický prostředek (pokud se jedná o přípravek ve formě sady) z první části dávkové formy obsahující v podstatě faktor Vila a popřípadě alespoň jednu farmaceuticky vhodnou inertní substanci k přenosu léčebné látky nebo nosič a/nebo stabilizátor a/nebo povrchově aktivní látku a/nebo neutrální sůl a/nebo antioxidant a/nebo konzervační látku a/nebo inhibitor proteázy a/nebo TFPI inhibitor a z druhé dávkové formy obsahující v podstatě faktor XIII a popřípadě alespoň jednu farmaceuticky vhodnou inertní substanci k přenosu léčebné látky nebo nosič a/nebo stabilizátor a/nebo povrchově aktivní látku ♦ · · ♦ * »9 99 ♦· 99 99 9 9 9 » » ♦ ♦ ♦ · * 9 9 * 9« 9 · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 ··· ·9· »99 9999 »9 9999 a/nebo neutrální sůl a/nebo antioxidant a/nebo konzervační látku a/nebo inhibitor proteázy a/nebo TFPI inhibitor a/nebo faktor Vlil.

V dalším z provedení je jedincem člověk, v jiném provedení má jedinec zhoršenou tvorbu trombinu, v dalším provedení má jedinec sníženou koncentraci fibrinogenu v plazmě (tj. člověk vyžadující vícenásobnou transfúzi).

Z dalšího hlediska se farmaceutický prostředek skládá z faktoru Vlil. V jednom z provedení je faktor Vlil aktivovaný faktor Vlil (faktor Vlila). V dalším z provedení je faktor Vlil rekombinantní faktor Vlila. V dalším z provedení je faktor Vlil rekombinantní lidský faktor Vlila.

Z dalšího hlediska farmaceutický prostředek dále obsahuje inhibitor fibrinolytického systému, tj. aprotinin, ε-aminokapronovou kyselinu nebo tranexamovou kyselinu.

Přehled obrázků

Obrázek 1 znázorňuje, jak byla získána spontánní tvorba sraženiny citrované normální lidské plazmy (NHP) zředěné na 1/10 pufrem obsahujícím 20 nM Hepes,

150 mM NaCI a 5 mM CaCk, pH 7,4 v mikro titrační komůrce (celkový objem 250 μΙ) za 2 500 až 3 000 s. Tvorba sraženiny fibrinu byla pozorována díky nárůstu v optické denzitě při 600 nm na zařízení Spectramax™ 340. Molekulární zařízení, Sunnyvale CA.

Obrázek 1 znázorňuje, že 10 nM rekombinantního faktoru Vila (rVIla) od Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko zkrátilo čas srážení na 1600 s (n = 2). Další zkrácení času srážení bylo získáno pokud bylo přidáno 30 nM faktoru XIII (FXIII) od American Diagnostica inc, Greenwich, CT spolu s 10 nM rFVIIa (n = 3). Sraženina vytvořená v přítomnosti FXIII byla více jasná (menší maximální OD) než při jeho nepřítomnosti, což naznačuje, že výsledkem přídavku FXIII je lépe zesítněná gelová struktura fibrinu s tenkými vlákny.

·· ·· • « · • t * • · · * · ♦ ·* ·♦··

Obrázek 2 znázorňuje, že extra dodaný FXIII (30 nM) prodlužuje čas lýze fibrinové sraženiny u těch sraženin, které byly vytvořeny v přítomnosti rFVIIa a v přítomnosti aktivátoru tkáňového plasminogenu (t-PA). Tvorba sraženiny byla indukována v přítomnosti nebo nepřítomnosti 30 nM XIII přidáním 25 μΙ NHP do 225 μΙ 20 nM Hepes, 150 mM NaCI, mM CaCb , pH 7,4 obsahujícího 50 nM rFVIIa a 0,5 nM rekombinantního t-PA od Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko. Tvorba sraženiny a následná lýze sraženiny indukovaná aktivací plasminogenu prostřednictvím t-PA byla pozorována díky zařízení Spectramax™ 340 při 600 nm jako nárůst při 600 nm následovaný reverzí nepatrného množství na bazální hladinu. Obrázek 2 ukazuje, že čas lýze sraženiny za těchto podmínek byl výrazně prodloužen v přítomnosti FXIII.

Obrázek 3 znázorňuje účinek rFVIIa a FXIII na maximální pevnost sraženiny (MCF) stejně jako na odolnost sraženiny vůči lýzi prostřednictvím t-PA. Před přidáním rFVIIa a/nebo FXIII byla získaná MCF 25 mm a čas potřebný na lýzi poloviny sraženiny byl 12,3 minuty (Obrázek 3). Přidání FXIII o vzrůstající koncentraci (0 - 40 nM) nezměnilo MCF, nicméně bylo pozorováno prodloužení času potřebného k lýzi poloviny sraženiny v závislosti na dávce, optimální byl při 30 nM FXIII (čas lýze poloviny sraženiny: 14,3 minuty, Obrázek 3). Obdobně bylo přidání rFVIIa (1 nM) výsledkem ochránění sraženiny před fibrinolyzí způsobenou t-PA (čas lýze poloviny sraženiny: 16,4 minuty) bez jakéhokoli účinku na MCF (Obrázek 3). Nicméně po přidání fFVIIa (1 nM) společně s FXIII (30 nM) byl pozorován jak nárůst v MCF (29 mm), tak nesmírná ochrana před fibrinolyzí (čas lýze poloviny sraženiny: 27,1 minuty) (Obrázek 3). Vše shrnuto, tyto výsledky dokazují, že přídavek rFVIIa a FXIII k plazmě synergistickým způsobem zlepšují mechanickou sílu sraženiny a její odolnost vůči fybrinolýze prostřednictvím t-PA.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález poskytuje farmaceutický prostředek obsahující kombinaci faktoru Vila a faktoru XIII. Tento vynález také poskytuje farmaceutický prostředek obsahující kombinaci faktoru Vila a faktoru XIII jako jediného aktivního činidla.

Farmaceutický prostředek může být ve formě jednoduchého farmaceutického prostředku nebo ve formě sady s několika částmi. Předložený farmaceutický prostředek je využitelný jako terapeutické a profylaktické prokoagulační a sraženinu fibrinu stabilizující činidlo tvoří rychlé sraženiny fibrinu u savců, včetně primátů jakými jsou lidi.

Nicméně i když je první, druhá nebo třetí část, atd. dávky zmíněna v celém tomto přesném popisu, neznamená to preferované pořadí podávání, ale je to uvedeno pouze pro praktické účely.

Předložený vynález dále poskytuje způsob léčby (včetně profylaktické léčby nebo prevence) epizod krvácení u jedinců, včetně lidí, například kvůli traumatu nebo operaci nebo u jedinců postrádajících nebo majících defektní faktory krevní koagulace FIX a FVIII nebo defektní krevní destičky.

Bylo nyní objeveno, že kombinace faktoru Vila a faktoru Xllla je výhodný produkt, který zajišťuje tvorbu pevného, stabilního a rychlého hemostatického plaku.

Úplná tvorba trombinu je nezbytná pro vytvoření pevného, stabilního hemostatického plaku. Struktura fibrinu takového plaku závisí jak na množství vytvořeného trombinu, tak na rychlosti počáteční tvorby trombinu. V přítomnosti poškozené tvorby trombinu, je vytvářen pórovitý plak fibrinu, který je vysoce propustný. Fibrinolytické enzymy běžně se vyskytující na povrchu fibrinu mohou snadno takový plak fibrinu rozpustit. Tvorba stabilního plaku fibrinu je také závislá na úplné tvorbě trombinu. Navíc v poslední době popsaný aktivovatelný fibrinolytický inhibitor, TAFI, vyžaduje dosti vysoká množství trombinu pro svou aktivaci. V přítomnosti ne plně dostatečné tvorby trombinu nemusí být proto TAFI aktivován a výsledkem je tvorba hemostatického plaku, který je snadněji rozpouštěn než normální hemostatícký plak již normální fibrinolytickou aktivitou.

Nárůstem tvorby trombinu poskytuje faktor Vila základ pro úplnou aktivaci faktoru XIII, na kterém nesmírně záleží při tvorbě plně stabilizovaného hemostatického plaku a proto na něm záleží zachování zástavy krvácení. V případech sníženého počtu krevních destiček, trombocytopénie, je rychlejší tvorba trombinu iniciována extra podáváním exogenního faktoru Vila. Nicméně celková tvorba trombinu není normalizována faktorem Vila i když se podá vysoká koncentrace.

Kombinací faktoru Vila a faktoru XIII, zvláště faktoru XIII alfa řetězce (a2 dimer), je usnadněna úplná aktivace faktoru XIII, která zvyšuje hemostatícký účinek na faktor Vila.

Navíc u jedinců se sníženou koncentrací fibrinu v plazmě (jedinci s násobnou transfúzí jako následek po mnoha traumatech nebo rozsáhlých operacích) se nevyskytuje úplná aktivace faktoru XIII. Více účinné zástavy krvácení je pak dosaženo díky podávání kombinace faktoru Vila a faktoru XIII.

Další cestou jak zvýšit stabilitu fibrinových hemostatických plaků je zajištění přítomnosti faktoru Xllla (aktivovaného faktoru XIII).

Jedinci s trombocytopénií mají poškozenou tvorbu trombinu stejně jako defektní stabilizaci fibrinových plaků, což má za následek, že takové plaky mají sklon k předčasnému rozpouštění. Navíc jedinci vystavení závažným traumatům nebo poškození orgánů a ti, kteří následkem toho dostávali často krevní transfúze mají většinou snížený počet krevních destiček stejně jako snížené hladiny fibrinogenu, faktoru Vlil a dalších koagulačních proteinů. Takoví jedinci trpí poškozenou (nebo sníženou) tvorbou trombinu. Kromě toho jejich snížená hladina fibrinogenu negativně zasahuje do aktivace faktoru XIII. Takoví jedinci mají proto defektní nebo méně účinnou zástavu krvácení hlavně kvůli tvorbě fibrinových plaků, které jsou snadno a předčasně rozpouštěny proteolytickými enzymy, takové enzymy bývají navíc značně uvolňovány v případech popsaných jako rozsáhlá traumata nebo poškození orgánů.

Aby byla usnadněna tvorba úplně stabilizovaných plaků s úplnou kapacitou za účelem udržení zástavy krvácení u jedince je podle tohoto vynálezu podáván farmaceutický prostředek. Tento farmaceutický prostředek je zvláště prospěšný u jedinců se sníženým počtem krevních destiček a u jedinců se sníženými hladinami fibrinogenu a/nebo dalších koagulačních proteinů.

V přítomnosti faktoru XIII již nízké koncentrace faktoru Vila mohou být dostatečné k zajištění dostatečné zástavy krvácení.

Jak je uvedeno výše faktor XIII existuje v plazmě jako tetramerní zymogen sestávající ze dvou alfa podjednotek a dvou beta podjednotek (označované a2b2), ale je nalezen i v jiných tkáních jako například krvi, kde se vyskytuje jako a2 - dimer.

Každá z těchto forem zymogenu nebo aktivovaného faktoru XIII (faktoru Xllla) může být použita v předloženém vynálezu stejně jako v obměnách faktoru XIII získaných pomocí genetického inženýrství, který si ponechá svou charakteristickou zesíťovací aktivitu.

V jednom z provedení je faktor XIII lidský faktor XIII, v dalším z provedení je faktor XIII lidský a2 - dimer, v dalším z provedení je faktor XIII aktivovaný lidský faktor Xllla.

• A · »· ·· ·« • · * · · · · · · « φ • ♦ · · · · · • · · · · · · · · • · · « · · » ·«» »·» »····«« »· ·«··

Faktor XIII a faktor Vila použitý v tomto provedení může být přečištěn z lidské krve nebo vyprodukován rekombinantními způsoby. Je zřejmé, že použití způsobů popsaných v tomto vynálezu nezávisí na postupu jakým jsou odvozeny přečištěný faktor XIII a přečištěný faktor Vila. Předložený vynález má v úmyslu pokrýt použití farmaceutického prostředku jakéhokoli faktoru XIII a faktoru Vila, vhodného pro použití v tomto dokumentu.

Výhodné jsou lidský faktor Vila a lidský faktor XIII. Taktéž geneticky modifikované obměny faktoru Vila a faktoru XIII, které si ponechávají své charakteristické se zástavou krvácení spojené aktivity, mohou být použity v předložených vynálezech. Části faktoru Vila nebo faktoru XIII nebo obměny faktoru Vila nebo obměny faktoru XIII ponechávajících si své charakteristické se zástavou krvácení spojené aktivity, mohou být použity v předložených vynálezech. Charakteristické se zástavou krvácení spojené aktivity faktoru Vila mohou být měřeny například kvantitativním rozborem s využitím aktivity Vila popsaného v předloženém přesném popisu. Charakteristické se zástavou krvácení spojené aktivity faktoru XIII, mohou být měřeny například kvantitativním rozborem s využitím aktivity XIII popsaného v předloženém přesném popisu.

Neomezené příklady obměn faktoru VII mající v podstatě stejnou nebo lepší biologickou aktivitu ve srovnání s divokým typem faktoru Vila zahrnují, ale nejsou omezeny na takové příklady, které jsou popsány v dánské patentové přihlášce č. PA 2000 00 734, PA 2000 01 360, PA 2000 01 361 a PA 2001 00 477. Neomezené příklady zahrnují [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [ L305I ]-FVIIa, [L305T]FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVlla ] a [K337A]FVIIa.

V předloženém kontextu bylo použito tří-písmenné nebo jedno-písmenné označení aminokyselin v jejich běžném významu, jak je naznačeno v tabulce 1. Pokud není jasně označeno, představují aminokyseliny přirozeně se vyskytující aminokyseliny v uvedeních pozicích divokého typu faktoru VII a tak například [K337A]-FVIIa znamená obměnu FVII, kde je aminokyselina reprezentovaná jedno-písmenným kódem K přirozeně se vyskytující v uvedené pozici nahrazena aminokyselinou reprezentovanou jedno-písmenným kódem A.

• 4	«	4»	9«
*> »	*	·* t 9	• 9	•
•	♦	♦ ·	• 9	9
9	* ·	• «	• 9 ·	•
t	a	9 9	• 9	•
49 ·			• 9	a 9 a 9

Tabulka 1: Zkratky pro aminokyseliny:

Aminokyselina	Tří-písmenný kód	Jedno-písmenný kód
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	Ile	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Fenylalanin	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	w
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gin	Q
Asparagin	Asn	N
Glutamová kyselina	Glu	E
Aspartová kyselina	Asp	D

Výraz „faktor Vila“ nebo „FVIIa“ může být používán zaměnitelně. Výraz faktor Vila zahrnuje zymogenový faktor VII (jednořetezcový faktor VII). Výraz „faktor XIII“ nebo „FXIII“ může být používán zaměnitelně. Výraz „faktor Vlil“ nebo „FVIII“ může být používán zaměnitelně.

·· · • 4 4 • 4 • 44 «44

•	«4	44	94
44	• 4	4 4	V
•	4	• 4	«
•	4 4	• r	4
•	•	« 4	•
		94	4944

Odborníkům bude zřejmé, že substituce mohou být provedeny mimo oblasti důležité pro funkci molekuly faktoru Vila nebo faktoru XIII a výsledkem musí stále být aktivní polypeptid. Zbytky aminokyselin nezbytné pro aktivitu polypeptidu faktoru Vila nebo XIII, které proto nejsou předmětem záměny, mohou být identifikovány pomocí postupů, které jsou odborníkům známy, mezi ně patří místně řízená mutageneze nebo alalnin skenující mutageneze (viz například Cunnigham a Wells, 1989, Science 244: 1081-1085).

V pozdějším postupu jsou mutace zavedeny do každého pozitivně nabitého zbytku v molekule a výsledné mutantní molekuly jsou testovány na koagulační popřípadě zesíťovací aktivitu, s cílem identifikovat zbytky aminokyselin, které jsou důležité pro aktivitu dané molekuly. Místa interakce substrát - enzym mohou být také zjištěna pomocí analýzy třírozměrné struktury, stejně jako takovými technikami jakými je analýza nukleární magnetické rezonance, krystalografie nebo fotoafinitní značení (viz například de Vos et al., 1992, Science 255:306 - 312, Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899 - 904, Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59 - 64).

Zavedení mutace do sekvence nukleové kyseliny s cílem zaměnit jeden nukleotid za druhý nukleotid, může být provedeno pomocí místně řízené mutageneze s využitím metod, které jsou známy v oboru. Zvláště použitelný je postup, který využívá super svinutý, dvouvláknový DNA vektor s inzertem, který nás zajímá a dva syntetické primery obsahující požadovanou mutaci. Oligonukleotidy primerů, kdy každý je komplementární k opačnému vláknu vektoru, se prodlužuje během teplotního cyklu díky Pfu polymeráze. Na včlenění primerů je vytvořen mutovaný plazmid obsahující zlomy. Po teplotním cyklu je produkt podroben restrikci Dpnl, který specificky štěpí methylované a hemimethylované původní DNA templáty a tím se odliší mutace obsažené nesyntetizované DNA. Ostatní postupy známé v oboru pro vytváření, identifikaci a izolaci obměn mohou být také použity, mezi ně patří například „shiffling“ nebo postupy vizualizace fága.

Výraz „faktor Vlil“ nebo „FVIH“ zahrnuje aktivovaný faktor Vlil (označovaný jako faktor Vlila), obměny a zkrácené formy faktoru Vlil ponechávající si svou charakteristickou koagulační aktivitu. V jednom z provedení je faktor Vlil lidský faktor Vlil.

·· ·· • ·

Výraz „TFPI inhibitor“ označuje sloučeniny inhibující antikoagulační aktivitu TFPI (inhibitor dráhy tkáňového faktoru). Výraz zahrnuje sloučeniny, které jsou zveřejněny v evropském patentu č. 558 529, WO 96/28 153 a US 5 622 988. „TFPI“ a „EPI“ (inhibitor vnější dráhy) může být zaměnitelně použit.

V předloženém vynálezu „účinné množství“ faktoru Vila a „účinné množství“ faktoru XIII definuje množství faktoru Vila a faktoru XIII, které je dostatečné pro prevenci nebo pro snížení krvácení nebo ztrátě krve, stejně jako k léčbě, zmírnění nebo zastavení nemoci a jejích komplikací.

Množství faktoru Vila a množství faktoru XIII podávaného podle předloženého vynálezu se může lišit od poměru 1:100 až do poměru 100:1 (pg faktoru Vila: pg faktoru XIII).

V tomto kontextu výraz „jedinci s poškozenou tvorbou trombinu“ označuje jedince, kteří nejsou schopni tvořit úplnou dávku trombinu na povrchu aktivovaných krevních destiček a zahrnuje jedince, kteří mají menší tvorbu trombinu než jedinci, kteří mají plně funkční, normální hemostatický systém, včetně normálního množství a funkce koagulačních faktorů, krevních destiček a fibrinogenu a označují jedince postrádající FIX a/nebo FVIII (hemofilie A a B) nebo mající defektní FIX a/nebo FVIII nebo mající inhibitory proti FIX a/nebo FVIII, jedince postrádající FXI, jedince se sníženým počtem krevních destiček nebo s krevními destičkami, které mají poškozenou funkci (tj. trombocytopénie nebo trombasténie Glanzmann nebo jedinci s nadměrnou krvácivostí) a jedinci mající snížené hladiny protrombinu, FX nebo FVII.

Jedinci se sníženou koncentrací fibrinogenu v plazmě (tj. jedinci vyžadující násobnou transfúzi jako následek po mnoha traumatech nebo rozsáhlé operaci) také trpí tvorbou uvolněných a nestabilních plaků fibrinu, které jsou snadno rozpouštěny.

Výraz „úplná zástava krvácení“ označuje tvorbu stabilního a pevného fibrinu nebo plaku v místě zranění, který účinně zastavuje krvácení a který není snadno rozpouštěn fibrinolytickým systémem.

Výraz „aktivita faktoru Vila“ nebo „aktivita Vila faktoru “označuje schopnost tvorby trombinu, výraz také zahrnuje schopnost tvorby trombinu na povrchu aktivovaných krevních destiček v nepřítomnosti tkáňového faktoru.

Výraz „posílení normálního hemostatického systému“ označuje posílené schopnosti tvořit trombin.

• · ·» · · • · ·

Jak je použito v tomto dokumentu výraz „porucha krvácení“ vyjadřuje jakoukoli poruchu, vrozenou, získanou nebo indukovanou, buněčného nebo molekulárního původu, která se projevuje krvácením. Příkladem je nedostatek srážecích faktorů (tj. hemofilie A nebo B nebo nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII), inhibitory srážecích faktorů, poruchy funkce krevních destiček, trombocytopénie nebo Willebrandova nemoc.

Výraz „epizody krvácení“ označují nekontrolovatelné a rozsáhlé krvácení, které je hlavním problémem jak ve spojení s operací tak jinými formami poškození tkáně. Nekontrolovatelné a rozsáhlé krvácení se může vyskytovat u jedinců mající v podstatě normální koagulační systém (u těchto jedinců se nicméně objevuje koagulopatie jako následek krvácení - zředění koagulačních proteinů, nárůst fibrinolýze a snížený počet krevních destiček kvůli zřeďujícímu účinku krvácení) a u jedinců majících poruchy koagulace nebo krvácení. Nedostatek srážecích faktorů (hemofilie A nebo B, nedostatek koagulačních faktorů XI a VII) nebo inhibitory srážecích faktorů mohou být příčinou epizod krvácení.

Rozsáhlé krvácení se může také vyskytovat u jedinců s normálně fungující kaskádou srážení krve (není nedostatek srážecích faktorů nebo žádné inhibitory vůči jakýmkoli koagulačním faktorům) a může být způsobeno porušenou funkcí krevních destiček, trombocytopénií nebo von Willebarndovou nemocí. V takových případech může být krvácení spojeno s takovými krváceními, která jsou způsobena hemofilií, protože hemostatický systém, stejně jako u hemofilie, postrádá nebo má abnormální nezbytné srážecí „sloučeniny“ (jako jsou krevní destičky nebo proteinový von Willebrandův faktor), které způsobují závažná krvácení. U jedinců, kteří trpí rozsáhlým poškozením tkání ve spojitosti s operací nebo rozsáhlým traumatem, může být normální hemostatický mechanismus ochromený požadavkem okamžité zástavy krvácení a může se krvácení rozvinout navzdory normálnímu hemostatickému mechanismu (prétrauma). Dosažení uspokojivé zástavy krvácení je také problémem pokud se krvácení vyskytuje v orgánech jakými je mozek, vnitřní část ucha a vnitřní část očí, kde je omezená možnost chirurgické zástavy krvácení. Stejný problém může vyvstat v procesu provádění biopsií v různých orgánech (játra, plíce, tkáň nádoru, gastrointestinální trakt) stejně jako u laparoskopických operací.

Společné pro všechny tyto situace je problém zabezpečit zástavu krvácení pomocí operačních technik (stehy, svorky atd.) které jsou také pro případ, kdy je krvácení neohraničené (hemoragická gastritida a silné děložní krvácení). Akutní a silná krvácení se mohou také vyskytnout u jedinců, kteří podstupují antikoagulační léčbu, u kterých byla díky této léčbě indukována porucha zástavy krvácení. Takoví jedinci mohou potřebovat chirurgický zásah v případě, že antikoagulační účinek musí být okamžitě zrušen. Radikální retropubická prostatekomie (chirurgické odstranění části prostaty nebo celé prostaty) je běžně prováděný postup u jedinců s lokalizovanou rakovinou prostaty. Operace je často komplikována závažnou a někdy značnou ztrátou krve. Značná ztráta krve během prostatekomie se týká především komplikované anatomické situace, s různými hustě cévnatými místy, která nejsou snadno přístupná pro chirurgickou zástavu krvácení a která mohou vyústit v neohraničené krvácení z velké plochy. Další situace, která může být problematická v případě nedostatečné zástavy krvácení je u jedinců s normálním hemostatickým mechanismem, kteří byli podrobeni antikoagulační léčbě, za účelem prevence tromboebolické nemoce. Taková léčba může zahrnovat podávání heparinu, jiné formy proteoglykanů, warfarinu nebo jiných forem antagonistů vitamínu K, stejně tak i aspirinu a dalších inhibitorů agregace krevních destiček.

V jednom z provedení vynálezu je krvácení spojeno s hemofilií. V dalším z provedení je krvácení spojeno s trombocytopénií. V dalším z provedení je krvácení spojeno s von Willebrandovou nemocí. V dalším z provedení je krvácení spojeno s vážnými poškozeními tkání. V dalším z provedení je krvácení spojeno s vážnými traumaty. V dalším z provedení je krvácení spojeno s operací. V dalším z provedení je krvácení spojeno s hemoragickou gastritidou. V dalším z provedení je krvácení silné děložní krvácení. V dalším z provedení se krvácení vyskytuje v orgánech s omezenou možností mechanické zástavy krvácení. V dalším z provedení se krvácení vyskytuje v mozku, vnitřní části ucha nebo vnitřní části očí. V dalším z provedení je krvácení spojeno s procesem provádění biopsie. V dalším z provedení je krvácení spojeno s antikoagulační léčbou.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může dále obsahovat TFPI inhibitor. Takový farmaceutický prostředek může být s výhodou podáván jedincům mající hemofilií A nebo B.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu může dále obsahovat faktor Vlil. Takový farmaceutický prostředek může být s výhodou podáván jedincům, kteří nemají inhibitory vůči faktoru Vlil.

V tomto kontextu výraz „léčba“ označuje jak prevenci předpokládaného krvácení, tak například již vyskytující se krvácení při operaci nebo regulaci krvácení v případě hemofílie nebo traumatu, s cílem zastavit nebo minimalizovat krvácení. Profylaktické podávání faktoru Vila a faktoru XIII je proto zahrnuto pod výraz „léčba“.

Výraz „jedinec“, který je zde použit znamená jakékoli zvíře, zvláště savce, jako je člověk a může, pokud je to vhodné, být zaměněno s výrazem „pacient“.

Zkratky

TF

FVII

FVIIa rFVIIa

FXIII

FXIIIa rFXIII rFXIIIa a2 b2

FXIIIa2

FX|lla2b2

FVIII rFVIII

FVIIIa rFVIIIa

TFPI tkáňový faktor faktor VII a jeho aktivovaná forma faktor VII ve své aktivované formě rekombinantní faktor VII ve své aktivované formě faktor XIII ve své zymogenové, neaktivované formě faktor XIII ve své aktivované formě rekombinantní FXIII rekombinantní FXIIIa alfa nebo a-řetězec FXIII nebo rFXIII beta nebo b-řetězec FXIII nebo rFXIII dimerová forma FXIII obsahující dva a.řetězce tetramerní forma FXIII obsahující dva a- a dva b-řetězce faktor Vlil ve své zymogenové, neaktivované formě rekombinantní FVIII faktor Vlil ve své aktivované formě rekombinantní FVIIIa inhibitor dráhy tkáňového faktoru

Příprava sloučenin

Lidský přečištěný faktor Vila vhodný pro použití v předloženém vynálezu je výhodně vyroben pomocí DNA rekombinantní technologie, například jak je popsáno v Hagen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:2412-2416,1986 nebo jak je popsáno v evropském patentu č. 200 421 (ZymoGenetics, lne.). Faktor Vila vyrobený rekombinantní technologií může být původní faktor Vila nebo více nebo méně modifikovaný faktor Vila za předpokladu, že takový faktor má v podstatě stejnou biologickou aktivitu pro koagulaci krve jako původní faktor Vila (divoký typ faktoru Vila). Takto modifikovaný faktor Vila může být vyroben buď pomocí modifikace sekvence nukleové kyseliny, která kóduje divoký typ faktoru Vila nebo změnou kodonů aminokyselin nebo odstraněním některých kodonů aminokyselin v nukleové kyselině kódující přirozený faktor VII pomocí známých způsobů, například místně řízenou mutagenezř.

Faktor VII může být také vyroben způsoby popsanými v Brože and Majerus, J. Biol. Chem. 255:1242-1247,1980 a v Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841, 1983. Tyto způsoby dávají faktor VII bez detegovatelných množství jiných faktorů koagulace krve. A i způsob s více přečištěným faktorem VII lze získat, zařadí-li se dodatečná gelová filtrace jako poslední purifíkační krok. Faktor VII je potom přeměněn na aktivovaný faktor Vila pomocí známých postupů, například pomocí několika různých proteinů plazmy, jakými jsou faktor Xlla, IX a nebo Xa. Z dalšího hlediska jak je popsáno v Bjoem et al., (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), faktor VII lze aktivovat pomocí průtoku kolonou při iontově výměnné chromatografii, jakou je kolona Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) a nebo pomocí kolon podobných.

Faktor XIII použitý v rozsahu tohoto vynálezu může být připraven z plazmy podle již známých způsobů, jakými jsou ty, které jsou uveřejněny v Cooke and Holbrook (Biochem. J. 141:79 - 84, 1974) a Curtis a Lorand (Methods Enzymol. 45:177 -191, 1976), které jsou zde začleněny odkazem. Forma a2-dimer faktoru XIII může být připravena z placenty jak je popsáno v US patentu č. 3 904 751, 3 931 399, 4 597 899 a 4 285 933 začleněné zde odkazem. Pokud je nicméně preferováno použití • · · · · · · · · «· ·· ·· · · · © · • · · 9 9 9 ·

9 9 · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 rekombinantního faktoru XIII za účelem vyhnutí se použití produktů odvozených od krve nebo tkáně, které jsou rizikové z hlediska přenosu nemocí, jsou odborníkům známy způsoby přípravy rekombinantního faktoru XIII. Viz například Davie et al., EP 268 772 Grundman et al., AU-A-69 896/87, Bishop et al., Biochemistry 1990, 29:1861-1869, Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63:235-240, Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86:279-283 a Broker et al., FEBS Lett., 1989, 248:105-110, které jsou zde včleněny odkazem v celém svém rozsahu. V jednom z provedení je a2-dimer faktoru XIII připraven cytoplazmaticky v kvasince Sacharomyces cerevisiae jak je uveřejněno v US patentu č. 07/741 263, který je zde včleněn odkazem v celém svém rozsahu. Buňky jsou sklizeny a zlyzovány a je takto připraven čistý lyzát. Lyzát je frakciován pomocí iontově výměnné chromatografie v neutrálním až slabě alkalickém prostředí s použitím kolony derivatizované agarózy jako je DEAE Fast-Flow Sepharose (TM) (Pharmacia) nebo obdoba této kolony. Faktor XIII je potom vysrážen z eluátu v koloně pomocí zakoncentrování eluátu a upravení jeho pH na 5,2 až 5,5, podobně jako pomocí diafiltrace oproti pufru se sukcinátem amonným. Sraženina je potom rozpuštěna a dále přečištěna pomocí běžných chromatografických technik jako je gelová filtrace a chromatografie založená na hydrofóbních interakcích.

Jak bude oceněno odborníky, je lépe používat proteiny faktoru XIII a faktoru Vila geneticky podobné nebo identické a tedy imunologicky slučitelné s jedincem, za účelem snížení rizika vyprovokování imunitní odpovědi. Příprava a charakterizace nelidského faktoru XIII byla uveřejněna v Nakamura et al., (J. Biochem. 78:1247-1266, 1975). Předložený vynález také zahrnuje použití těchto proteinových faktorů XIII a Vila u veterinárních postupů.

Podávání a farmaceutické prostředky

Při léčbě spojené s promyšleným zásahem je podáván faktor VII a faktor XIII 24 hodin před vykonáním zásahu a potom po dobu 7 dní nebo i déle. Podávání koagulantu může být provedeno různými cestami jak je popsáno v tomto dokumentu.

Dávka faktoru VII se pohybuje v rozmezí od 0,05 mg do 500 mg/den, například od 1 mg do 200 mg/den nebo například od 10 mg do 175 mg/den pro

70-kg jedince jako první dávka i jako udržující dávka, v závislosti na hmotnosti jedince a na stavu a vážnosti stavu.

Dávka faktoru XIII se pohybuje v rozmezí od 0,05 mg do 500 mg/den, například od 1 mg do 200 mg/den nebo například od 10 mg do 175 mg/den pro 70-kg jedince jako první dávka i jako udržující dávka, v závislosti na hmotnosti jedince a na stavu a vážnosti stavu.

Farmaceutické prostředky a sady předloženého vynálezu jsou užitečné jak humánní tak veterinární medicíně, jako je například při léčbě nebo prevenci u jedinců trpících epizody krvácení nebo poruchami koagulace. Pro použití v předloženém vynálezu jsou vytvořeny faktory Vila a XIII, popřípadě jsou doplněny farmaceuticky vhodným nosičem. Výhodně jsou farmaceutické prostředky podávány parenterálně, například intravenózně, injekcí pod pokožku nebo intramuskulámě nebo mohou být podávány kontinuální nebo pulsační infúzí.

Farmaceutické přípravky mohou dále obsahovat jedno nebo více ředidel, emulgačních činidel, konzervačních látek, pufrů, inertních substancí k přenosu léčebné látky atd. a mohou být dodávány v takových formách jako jsou kapaliny, pudry, emulze s postupným uvolňováním. Odborník tak může vytvořit tyto farmaceutické prostředky tohoto vynálezu vhodným způsobem a v souladu s akceptovanými praktikami, které jsou uveřejněny v Remingtonů Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Farmaceutické prostředky pro parenterální podávání se skládají z kombinace faktoru VII a faktoru XIII výhodně rozpuštěné ve farmaceuticky vhodném nosiči, především vodném nosiči. Může být použita řada různých vodných nosičů jako je například voda, pufrovaná voda, 0,4% solný roztok, 0,3% glycin a podobně. Obměny faktoru VII tohoto vynálezu mohou být také vytvořeny v přípravcích lipozómů pro přenos nebo zásah místa zranění. Přípravky lipozomů jsou obecně popsány například v patentu US 4 837 028, v patentu US 4 501 728 a patentu US 4 975 282.

Typický farmaceutický přípravek pro intravenózní infúzi může být vyroben tak, aby obsahoval 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg faktoru Vila a/nebo faktoru XIII. Nynější způsoby přípravy parenterálně podávaných farmaceutických přípravků budou odborníkům zřejmé nebo jasné a jsou detailně popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

Ve zkratce, farmaceutické prostředky vhodné pro použití podle předloženého vynálezu jsou vyrobeny smísením faktoru Vila nebo faktoru XIII nebo faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII, výhodně v čisté formě s vhodnými látkami na podporu léčiva a vhodnými nosiči nebo ředidly. Vhodné fyziologicky přijatelné nosiče nebo ředidla obsahují sterilní vodu a sole. Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku, která napomáhá udržovat fyziologické podmínky, mezi takové látky patří činidla na úpravu pH a pufrační činidla, tonus upravující činidla a činidla jim podobná, například octan sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd. Vhodné pomocné látky také zahrnují kalcium, proteiny (například albuminy) nebo jiné inertní peptidy (například glycylglycin) nebo aminokyseliny (například glycin nebo histidin) za účelem stabilizace čistého faktoru Vila a/nebo faktoru XIII. Další fyziologicky přijatelné pomocné látky jsou neredukující cukry, polyalkoholy (například sorbitol, manitol nebo glycerol), polysacharidy jako například nízkomolekulární dextriny, povrchově aktivní činidla (například polysorbát) a antioxidanty (například disulfid a askorbát). Pomocné látky jsou obecně přítomny v koncentracích od 0,001 do 4 % hmotn./objem. Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat inhibitory proteáz, například aprotinin nebo tranexamová kyselina a konzervační činidla. Dále mohou farmaceutické přípravky obsahovat TFPI inhibitor a faktor Vlil.

Farmaceutické prostředky mohou být sterilizovány pomocí běžných dobře známých technik. Výsledný vodný roztok může být balen pro další použití nebo filtrován za aseptických podmínek a lyofilizovaný farmaceutický přípravek může být před podáním smíchán.

Koncentrace faktoru Vila, faktoru XIII nebo faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII v těchto farmaceutických přípravcích se může pohybovat v širokém rozmezí, například od méně než 0,5 %hmotn., obyčejně od alespoň 1 % hmotn. do 15 až 20 % hmotn. a jsou vybrány především podle objemu tekutiny, viskozity atd. v souladu s konkrétním způsobem podání, který byl vybrán.

Podávání injekcí nebo infúzí, zvláště pak injekcí je preferováno. Proto jsou faktory Vila a faktory XIII připraveny ve formě vhodné pro intravenózní podávání, tj. ve farmaceutickém prostředku, který je buď rozpuštěný lyofilizovaný pudr nebo tekutý farmaceutický prostředek obsahující jak faktor Vila tak faktor XIII v jedné dávkové formě nebo rozpuštěný lyofilizovaný pudr nebo tekutý farmaceutický prostředek obsahující • · faktor Vila v jedné dávkové formě a rozpuštěný lyofilizovaný pudr nebo tekutý farmaceutický prostředek obsahující faktor XIII v další dávkové formě.

Lokální dodání faktoru Vila a faktoru XIII jako například topikální aplikace může být provedeno například farmaceutickými prostředky ve spreji, perfúzí, balónovým katétrem, zábrana včleněná do vaskulárního transplantátu nebo zábrany, hydrogely používané k pokrytí balónových katétrů nebo další dobře známé postupy. Pro pohybu schopné jedince, kteří vyžadují denně udržovat hladiny, mohou být faktory VII a XII podávány kontinuální infúzí s využitím například přenosného čerpacího systému.

V každém případě by měl farmaceutický prostředek zajistit dostatečné množství faktoru Vila a faktoru XIII k účinné léčbě daného jedince.

Kombinace faktoru Vila a faktoru XIII ukazuje synergistický účinek u in vitro sraženiny - kvantitativné rozbory pevnosti a fibrinolýzi v závislosti na čase. Navíc kombinace faktoru Vila a faktoru XIII ukazuje synergistický účinek na tvorbu sraženiny fibrinu, zvyšující čas poloviční lýze sraženiny, zvyšující pevnost sraženiny a zvyšující odolnost vůči fibrinolýzi.

Farmaceutické prostředky obsahující faktor Vila a XIII mohou být podávány jako profylaktické a/nebo léčebná terapie. V léčebných aplikacích jsou farmaceutické prostředky podávány jedinci již trpícím nemocí, jak je popsáno výše, v množství dostatečném k léčbě, zmírnění nebo částečnému zastavení nemoce nebo jejích komplikací.

Postačující množství pomocí kterého toho lze dosáhnout, je definováno jako „účinné množství“ nebo „terapeuticky účinné množství“. Jak bude odborníkům známo, množství účinná pro tento účel budou záviset na vážnosti nemoci nebo zranění stejně tak jako na hmotnosti a celkovém stavu jedince. Nesmí se však zapomínat na to, že materiály předloženého vynálezu lze všeobecně používat ve stavech nemoce nebo zranění, která ohrožují život nebo v situacích eventuálně život ohrožujících. V takových případech s ohledem na minimalizaci cizorodých látek a celkový nedostatek imunogenicity faktoru Vila a faktoru XIII u lidí, je možné a ošetřujícím lékař to může považovat za vhodné, podávat dostatečný přebytek těchto farmaceutických prostředků.

Při prevenčních použití, jsou jedinci podávány farmaceutické prostředky obsahující faktor Vila a faktor XIII, které ovlivňují v případě rizika, stavu nemoce nebo zranění zvýšení vlastní jedincovi koagulační schopnosti. Takové množství je definováno jako „prevenčně účinná látka“.

• · · « • •44 · • · ♦ ·

Jednorázové nebo několikanásobné podávání těchto farmaceutických přípravků může být provedeno s dávkovými hladinami a podle modelů, které jsou vybírány ošetřujícím lékařem. Takové farmaceutické prostředky mohou být podávány jednou nebo několikrát během dne nebo týdne. Účinné množství těchto farmaceutických prostředků je takové množství, které zajišťuje klinicky výrazný účinek proti epizodám krvácení. Takové množství bude záviset do jisté míry na konkrétních podmínkách dané léčby, věku, hmotnosti a celkovému zdravotnímu stavu jedince a dalších faktorech, které jsou zřejmé odborníkům v dané oblasti.

Farmaceutický prostředek je všeobecně podáván v jednorázové dávce před očekávaným krvácením nebo na počátku krvácení. Nicméně může být také podán v několikanásobné dávce, výhodně v intervalech od 2 do 4 do 6 a do 12 hodin, v závislosti na dané dávce a stavu daného jedince.

Farmaceutický prostředek může být ve formě jednorázového přípravku, který obsahuje jak faktor Vila, tak faktor XIII ve vhodných koncentracích. Farmaceutický přípravek může být také ve formě sad, skládajících se z první části dávkové formy obsahující faktor Vila a druhé dávkové formy obsahující faktor XIII a popřípadě jedné nebo více dalších částí dávkových forem obsahujících faktor Vlil a/nebo TFPI inhibitor. V takovém případě by měly být faktory Vila a faktory XIII podávány postupně, výhodně v rozmezí 1 až 2 hodiny po sobě, například 30 minut po sobě nebo výhodněji 10 minut po sobě nebo ještě lépe 5 minut po sobě. Nezáleží na pořadí jednotlivých dávkových forem.

I když se předložený vynález týká prevence nebo léčby epizod krvácení nebo koagulační léčby pomocí léčby v kombinaci s aktivními složkami, které mohou být podávány odděleně, týká se předložený vynález také zkombinovaných farmaceutických prostředků ve formě sady.

Sada zahrnuje alespoň dva oddělené farmaceutické prostředky. Sada také zahrnuje nádobky pro skladování oddělených farmaceutických prostředků, jakými jsou oddělené lahvičky nebo prostory oddělené folií. Hlavně ale sada obsahuje návod pro podávání jednotlivých složek. Forma sady je v podstatě výhodná, pokud je lépe podávat jednotlivé složky odděleně, především v odlišných dávkových formách, nebo pokud jsou dávky podávány v různých časových intervalech nebo pokud je vyžadována titrace jednotlivých složek dané kombinace ošetřujícím lékařem.

«4 ♦ 4 4 • · ·

4 4

4444

Kvantitativní rozbory

Test aktivity faktoru Vila:

Vhodný kvantitativní rozbor k testování aktivity faktoru Vila a tím pádem i výběru vhodné obměny faktoru Vila může být proveden jako jednoduchý předběžný in vitro test:

In vitro kvantitativní rozbor hydrolýzy

Původní (divoký typ) faktoru Vila a obměna faktoru Vila (oba zmiňované v tomto dokumentu jako „jako faktor Vila“) mohou být podrobeny kvantitativnímu rozboru specifických aktivit. Kvantitativní rozbor je prováděn na mikro titrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Dánsko). Chromogenní substrát D-lle-Pro-Arg-p-nitranilid (S-2 288, Chromgenix, Švédsko), konečná koncentrace 1mM, je přidán k faktoru Vila (konečná koncentrace 100 nM) v 50 mM Hepes, pH 7,4 obsahující 0,1 M NaCI, 5 mM CaCk a 1 mg/ml séra hovězího albuminu. Kontinuálně je měřena absorbance při 405 nm v přístroji SpectraMax (tm) 340 (Molecular Devices, USA). Absorbance vyvinutá během 20 minutové inkubace, po odečtení absorbance slepého pokusu (komůrka neobsahující žádný enzym), je použita k výpočtu poměru mezi aktivitami obměny a divokého typu faktoru Vila:

Poměr (A405nm obměna faktoru Vila/ A^nm původní typ faktoru Vila).

Na základě tohoto, mohou být určeny obměny faktoru Vila s aktivitou srovnatelnou nebo vyšší než původní faktor Vila, tak jak tomu je například u obměn, kde poměr mezi aktivitou obměny a aktivitou původního faktoru VII je ukázán na obrázku 1 a kdy je tento poměr přibližně 1 ku číslu nad 1.

Aktivita faktoru Vila nebo obměny faktoru Vila může být také měřena s použitím fyziologického substrátu jako je například faktor X, vhodný při koncentracích od 100 do 1000 nM, kde je vznikající faktor Xa měřen po přidání vhodného chromogenního substrátu (například S-2 765). Navíc kvantitativní rozbor aktivity může být prováděn za fyziologické teploty.

Schopnost faktoru Vila a obměn faktoru Vila vytvářet trombin může být měřena také pomocí kvantitativního rozboru sestávajícího z příslušných koagulačních faktorů a

«9 99

9 ·

9 9 9

9 9 ·« 9«·· inhibitorů při fyziologických koncentracích (bez faktoru Vlil pokud se podobá stavům hemofilie A) a aktivovaných krevních destičkách Q'ak je popsáno na str. 543 v Monroe et al., (1997) Brit. J. Heamatol. 99, 542-547, který je v tomto dokumentu včleněn odkazem).

Test aktivity faktoru XIII

Vhodný kvantitativní rozbor k testování transglutaminázové aktivity faktoru XIII a tím nástroj k výběru vhodných obměn faktoru XIII, může být proveden jako jednoduchý in vitro test popsaný například v Methods of Enzymology, Vol. 45 (1976), Proteolytic Enzymes, Part B, str. 177-191 (Ed. Lorand, L.).

Předložený vynález je dále objasněný na následujících příkladech, které nicméně nejsou pojímány jako omezující rámec ochrany. Znaky uveřejněné v předcházejícím popisu a v následujících příkladech mohou být jak samostatně nebo v jakýchkoli kombinacích materiálem pro realizaci vynálezu odlišných forem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Faktor Vlil zvyšuje tvorbu sraženiny fibrinu indukovanou faktorem Vila

Citrovaná normální lidská plazma (NHP) byla zředěna 1/10 v pufru, který obsahoval 20 nM HEPES, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI₂, pH 7,4 v mikro titrační komůrce (celkový objem 250 μΙ) a tvorba sraženiny fibrinu byla pozorována pomocí nárůstu optické denzity při vlnové délce 600 nm na přístroji Specramax (tm) 340 (Molecular Devices, Sunnyvale CA).

Samovolné tvorby sraženiny bylo dosaženo během 2 500 až 3 000 sekund. Obrázek 1 znázorňuje, že 10 nM rekombinantního faktoru Vila (rFVIIa) (Novo Nordisk A/S Bagsvaerd, Dánsko) zkrátil čas srážení na 1 600 sekund (n = 2). Další zkrácení času srážení bylo dosaženo, když 30 nM faktoru XIII (FXIII) (American Diagnostika inc., Greenwich, CT) bylo přidáno spolu s 10 nM rFVIIa (n = 3). Sraženina vytvořená v přítomnosti FXIII byla více jasná (nižší maximální OD) než v jeho nepřítomnosti, což

• · • · • · • « ·*·· «* ·· ukazuje, že přídavek FXIII má za následek lepší zesítnění gelové struktury fibrinu se slabými vlákny.

Příklad 2

Přítomnost doplňkového faktoru XIII během tvorby sraženiny indukované faktorem Vila má za následek zvýšenou odolnost k fibrinolytické degradaci

Sraženina fibrinu sestávající ze slabých vláken je mechanicky silnější a je složitější jí degradovat než sraženinu, která sestává ze stejného množství fibrinu, který je uspořádán jako silná vlákna a nebo méně propojená vlákna s křížovými vazbami. Pokus ukázaný na obrázku 2 znázorňuje, že extra přídavek faktoru FXIII (30 nM) prodlužuje čas lýze sraženiny fibrinu u těch sraženin, které byly vytvořeny v přítomnosti rFVIIa a tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-PA, American Diagnostica). Tvorba sraženiny byla indukována v přítomnosti nebo nepřítomnosti 30 nM FXIII přidáním 25 μΙ NHP k 225 μΙ 20 nM HEPES, 150 mM NaCI, 5 mM CaCI₂, pH 7,4 obsahujícího 50 nM rFVIIa a 0,5 nM rekombinantního t-PA. Tvorba sraženiny a následná lýze sraženiny indukovaná aktivací plasminogenu, kterou zprostředkovává t-PA byla pozorována pomocí přístroje

Spectramax ® 340 při vlnové délce 600 nm jako nárůst OD 6oonm. po které následovala inverze nepatrných množství na původní hladinu. Obrázek 2 znázorňuje, že čas lýze sraženiny za těchto podmínek byl výrazně prodloužen v přítomnosti FXIII.

Příklad 3

Kombinace faktoru Vila a faktoru XIII zvyšuje maximální pevnost sraženiny a zvyšuje odolnost sraženiny vůči fibrinolýzi.

Trombelastografická měření byla provedena na cifrované normální lidské plazmě přidané k 6 nM druhu rekombinantního tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-PA, American Diagnostica) a byl analyzován účinek přídavku 1 nM rFVIIa (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánsko) jak samotného, tak v kombinaci s různými koncentracemi faktoru XIII (FXIII, Haematologic Technologies, HCXIII - 0160, Lot N 1212). Srážení

4444

4

4 · * •

4 4 4 4 «

4 · 4

4 9 9 4

4 4 « bylo odstartováno pomocí přídavku Inovinu (koncová koncentrace 2 000 krát ředěná, Dade Behring č. 526 945) a kalcia (konečná koncentrace 15 mM) v 20 mM HEPES,

150 mM NaCI, pufru o pH 7,4.

Trombelastografická měření byla použita k analýze účinku rFVIIa a FXIII na maximální pevnost sraženiny (MCF) stejně jako na odolnost sraženiny vůči lýzi zprostředkované t-PA. Před přídavkem rFVIIa a/nebo FXIII byla dosžena MCF 25 mm a čas potřebný k lýzi poloviny sraženiny :12,3 minut (obrázek 3). Přídavek zvyšujících se koncentrací FXIII (0 až 40 nM) nezměnil MCF, nicméně bylo pozorováno prodloužení lýze poloviny sraženiny v závislosti na dávce , optimální při 30 nM FXIII (čas lýze poloviny sraženiny: 14,3 minut). Obdobně přídavek rFVIIa (1 nM) měl za následek ochranu sraženiny vůči fibrinolýzi zprostředkované t-PA (FXIII (čas lýze poloviny sraženiny: 16,4 minut) bez vlivu na MCF (obrázek 3). Nicméně po přidání rFVIIa (1 nM) společně s FXIII (30 nM) byl pozorován jak nárůst v MCF (29 mm), tak větší ochrana vůči fibrinolýzi (čas lýze poloviny sraženiny: 27,1 minut) (obrázek 3).

V souhrnu tedy tyto výsledky ukazují, že přídavek rFVIIa a FXIII k plazmě zlepšují synergistickým způsobem mechanickou pevnost sraženiny a odolnost vůči fibrinolýzi zprostředkované t-PA.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje faktor Vila a faktor XIII.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor Vila je obměna faktoru Vila.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že faktor Vila je lidský faktor Vila.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo nároku 3, vyznačující se tím, že faktor Vila a faktor XIII je rekombinantní lidský faktor Vila a rekombinantní lidský faktor XIII.
5. Farmaceutický prostředek podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že faktor XIII je a2-dimer faktoru XIII.
6. Farmaceutický prostředek podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že faktor XIII je aktivovaný faktor XIII.
7. Farmaceutický prostředek podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje TFPI inhibitor.
8. Farmaceutický prostředek podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje faktor Vlil.
9. Sada obsahující ošetření pro epizody krvácení, vyznačující se tím, že se skládá z

a) účinného množství faktoru Vila a farmaceuticky přijatelného nosiče v první části dávkové formy.

b) účinného množství faktoru XIII a farmaceuticky přijatelného nosiče ve druhé části dávkové formy.

44 4« « 4 • 4

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy.
10. Sada podle nároku 9, vyznačující se tím, že se skládá z

a) účinného množství faktoru Vila a farmaceuticky přijatelného nosiče v první části dávkové formy.

b) účinného množství faktoru XIII a farmaceuticky přijatelného nosiče ve druhé části dávkové formy.

c) účinného množství faktoru TFPI inhibitoru a farmaceuticky přijatelného nosiče ve třetí části dávkové formy a

d) nádobek obsahujících zmíněné první, druhé a třetí dávkové formy.
11. Sada obsahující ošetření epizod krvácení, vyznačující se tím, že se skládá z

a) účinného množství faktoru Vila a TFPI inhibitoru farmaceuticky přijatelného nosiče v první části dávkové formy.

b) účinného množství faktoru XIII a farmaceuticky přijatelného nosiče ve druhé části dávkové formy.

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy.
12. Sada obsahující ošetření epizod krvácení, vyznačující se tím, že se skládá z

a) účinného množství faktoru Vila farmaceuticky přijatelného nosiče v první části dávkové formy.

b) účinného množství faktoru XIII a TFPI inhibitor farmaceuticky přijatelného nosiče ve druhé části dávkové formy.

c) nádobek obsahujících zmíněné první a druhé dávkové formy.

• <9

4 4 · · * ♦ *

4 · · · · · · · * • · · · · · · ··· »«· **· ···· ·* «·*·
13. Sada podle nároků 9 až 12 , vyznačující se tím, že obsahuje faktor Vlil buď vytvořený v oddělené části dávkové formy nebo obsažený v části dávkové formy obsahující také jednu nebo více sloučenin vybraných z faktoru Vila, faktoru XIII nebo TFPI inhibitoru.
14. Použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro léčbě epizod krvácení u jedince.
15. Použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro snížení času srážení u jedince.
16. Použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro prodloužení času lýze sraženiny v normální savčí plazmě.
17. Použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro zvýšení pevnosti sraženiny v normální savčí plazmě.
18. Použití faktoru Vila v kombinaci s faktorem XIII pro výrobu léčiva pro zvýšení tvorby sraženiny fibrinu v normální savčí plazmě.
19. Způsob zvýšení tvorby sraženiny fibrinu u jedince, vyznačující se tím, že se podá účinné množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII.
20. Způsob léčby epizod krvácení u jedinců, vyznačující se tím, že se podá jedinci účinné množství faktoru Vila v kombinaci s účinným množstvím faktoru XIII.
21. Způsob podle nároku 19 nebo nároku 20, vyznačující se tím, že se podá faktor Vila a faktor XIII ve formě jedné dávky.
22. Způsob podle nároku 19 nebo nároku 20, vyznačující se tím, že se podá faktor Vila a faktor XIII postupně.