CZ2004543A3

CZ2004543A3 - Farmaceutický prostředek obsahující polypeptidy faktoru VII a polypeptidy faktoru V

Info

Publication number: CZ2004543A3
Application number: CZ2004543A
Authority: CZ
Inventors: Bojkjaerárasmus
Original assignee: Novoánordiskáa@S
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-05
Publication date: 2004-08-18
Also published as: WO2003039584A1; IL161544A0; HUP0401985A2; JP2005511599A; MXPA04004304A; ZA200403271B; CA2464615A1; KR20050043734A; AU2002340779B2; EP1446149A1; RU2004117534A; PL370634A1; NO20042380L; HUP0401985A3; CN1596125A; BR0213953A

Description

Farmaceutický prostředek obsahující poiypeptidy faktoru VII a polypeptidy faktoru V

Oblast vynálezu

Předmětný vynález se vztahuje na farmaceutický prostředek obsahující polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V. Vynález se také vztahuje na použití kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V pro výrobu léku pro léčbu subjektů trpících krvácivými příhodami, nebo pro jejich prevenci. Vynález se také vztahuje na metodu léčby krvácivých příhod subjektů a na metodu usnadňování vzniku sraženiny u subjektů. Vynález se také vztahuje na soupravy obsahující tyto sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

Hemostáze je iniciována vznikem komplexu mezi tkáňovým faktorem (TF) vystaveným cirkulující krvi následkem poranění cévní stěny, a FVIIa, jenž je přítomen v krevním oběhu v množství odpovídajícím přibližně 1% celkové hmotnosti proteinu FVII. Tento komplex je zakotven na buňce nesoucí TF a aktivuje FX na FXa a FIX na FIXa na povrchu buňky. FXa aktivuje protrombin na trombin, jenž aktivuje FVIII, FV, FXI a FXIII. Navíc omezené množství trombinu vzniklého v tomto počátečním stupni hemostázy také aktivuje krevní destičky. Důsledkem působení trombinu na destičky se mění jejich tvar a odkrývají se nabité fosfolipidy na jejich povrchu. Takovýto aktivovaný povrch destiček tvoří templát pro následnou aktivaci FX a kompletní tvorbu trombinu. Následná aktivace FX na aktivovaném povrchu destiček probíhá přes komplex FIX - FVIIIa, vzniklý na na povrchu aktivované destičky, a FXa potom konvertuje protrombin na trombin, a to stále na povrchu destičky. Trombin potom konvertuje fibrinogen na fibrin, jenž je nerozpustný a stabilizuje počáteční destičkovou zátku. Tento proces je rozdělen, tedy lokalizován do polohy exprese nebo expozice tkáňového faktoru (TF), čímž je minimalizováno riziko systémové aktivace koagulačního systému. Nerozpustný fibrin tvořící zátku se dále stabilizuje zesítěním fibrinových vláken katalyzovaným FXIII.

·· · • · · · · ···· · ··· • · ···· ·· ·· ··· · ···· ·· · ···· ···

FVIIa se vyskytuje v plazmě převážně jako jednořetězcový zymogen, jenž se štěpí FXa na svou dvouřetězcovou aktivovanou formu, FVIIa. Rekombinantní aktivovaný faktor Vila (rFVIIa) byl vyvinut jako prohemostatické činidlo. Podávání FVIIa dává rychlou a vysoce efektivní prohemostatickou odpověď u subjektů trpících hemofilií s krvácením, jež nemůže být léčeno produkty koagulačního faktoru kvůli vzniku protilátek. Také subjekty s krvácením s nedostatečností faktoru VII nebo subjekty s normálním koagulačním systémem, avšak prodělávající nadměrné krvácení, mohou být úspěšně léčeny pomocí FVIIa. V těchto studiích nebyly pozorovány žádné nepříznivé vedlejší účinky FVIIa (obzvláště výskyt tromboembolismu).

Dodatečně exogenně podávaný FVIIa zvyšuje vznik trombinu na aktivovaném povrchu krevních destiček. To nastává u hemofilních subjektů postrádajících FIX nebo FVIII a tedy s chybějící nejúčinnější cestou kompletního vzniku trombinu. Také za přítomnosti sníženého počtu krevních destiček nebo krevních destiček s defektní funkcí mimořádně dávkovaný FVIIa zvyšuje vznik trombinu.

Komerční preparáty rekombinantního lidského FVIIa se prodávají jako NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Denmark). NovoSeven® je indikován pro léčbu krvácivých příhod u pacientů s hemofilií A a B. NovoSeven® je jediný rekombinantní FVIIa dosažitelný na trhu pro efektivní a spolehlivou léčbu krvácivých příhod.

Faktor V je velký glykoprotein syntetizovaný jako jednořetězcová molekula, cirkulující v krvi jako inaktivní kofaktor v koncentraci 30 nM. Přibližně 25% faktoru V v krvi je přítomno v a granulích krevních destiček, zatímco zbytek se vyskytuje v plazmě. Faktor V v koagulační kaskádě funguje jako kofaktor pro aktivovaný faktor X serinové proteázy. Než může faktor V efektivně fungovat jako kofaktor, musí být aktivován limitovanou proteolýzou. To jsou schopny provést jak faktor Ha tak Xa. První cDNA sekvence faktoru V byla publikována Kaném a kol. (PNAS 83:6800, 1986), ale úplná sekvence genomu dosud není známa. Nedostatečnost faktoru V je vzácná recesivně děděná porucha přidružená ke krvácivé tendenci díky nefunkčním mutacím v genu faktoru V (Guasch a kol., Thromb. Haemost. 77:252, 1997). Zůstává ještě předmětem diskuze, zda je úplná nedostatečnost faktoru V slučitelná se životem. Publikované studie konstatují relativně mírné krvácivé tendence u zasažených jedinců. Zároveň myš s nefunkčním faktorem V vykazuje silný fenotyp a přibližně polovina jedinců nedosáhne přes polovinu období těhotenství, zatímco • · zbývající embrya snášejí normálně, avšak hynou během hodin po narození v důsledku nadměrného krvácení. V některých případech se nedostatečnost faktoru V dědí společně s nedostatečností faktoru Vlil (Seligsohn a kol., NEJM 307:1191, 1982). Nejběžnější genetický defekt faktoru V je tzv. mutace faktoru Vjeiden, která je spojena se zvýšeným trombotickým rizikem v důsledku rezistence k aktivovanému proteinu c. Tato genetická abnormalita je rozšířena u přibližně 3% Kavkazanů a mnohé studie ukázaly, že faktor V|_eiden je nejobvyklejší rizikový faktor trombózy.

Je dobře známo, že u subjektů s nadměrnou krvácivostí ve spojení s operací nebo závažným zraněním a s potřebou krevní transfúze dochází k více komplikacím než u těch, jež neprodělávají žádné krvácení. Avšak také mírná krvácení vyžadující podání lidské krve nebo krevních produktů (krevních destiček, leukocytů, plazmatických koncentrátů pro léčbu defektů koagulace atd.) mohou vést ke komplikacím spojeným s rizikem přenosu lidských virů (hepatitis, HIV, parvovirus a dalších, dosud neznámých virusů). Nadměrná krvácení vyžadující masivní krevní transfúze mohou vést k vývoji mnohočetných orgánových selhání včetně oslabení funkce plic a ledvin. Jakmile se u subjektu vyvine tato série komplikací, je nastartována kaskáda eventualit zahrnující množství cytokinových a zánětlivých reakcí. To činí jakoukoli léčbu extrémně obtížnou a bohužel často neúspěšnou. Hlavním cílem operací stejně jako léčby závažných tkáňových poškození je tedy vyhnout se nabo minimalizovat krvácení. Aby bylo možné vyhnout se anebo minimalizovat takové krvácení, je důležité zajistit vznik stabilní a pevné hemostatické zátky, jež se nesnadno rozpouští fibrinolytickými enzymy. Navíc je důležité zajistit rychlý a účinný vznik takových zátek nebo sraženin.

Subjekty prodělávající krvácivé příhody, včetně obětí zranění a subjektů krvácejících ve spojitosti s operací, jsou v současné době často léčeny množstvím injekcí nebo infúzí FVIIa, protože krátký poločas FVIIa (2,5 hod.) může vyžadovat více než jedno podání pro zachování určité úrovně hemostatické způsobilosti. Rychlejší zástava krvácení může být pro takové subjekty důležitým přínosem. Tím může být také redukce počtu podání potřebných pro zastavení krvácení a zachování hemostázy.

Evropský patent č. 225160 (Novo Nordisk) se týká směsí FVIIa a metod léčby poruch krvácení nezpůsobených defekty srážlivostních faktorů nebo inhibitory srážlivostních faktorů.

• · · ··· · · · • · · · · · ··· · · · · • · ···· · · ·· ··· · ··· ·* · ···· ·· ·

Evropský patent č. 82182 (Baxter Travenol Lab.) se týká směsi faktoru Vila pro použití u subjektu při potlačení nedostatečností krevních srážlivostních faktorů nebo působení inhibitorů na krevní srážlivostní faktory.

Mezinárodní patentová publikace č. WO 93/06855 (Novo Nordisk) se týká aktuální aplikace FVIIa.

Cripe a kol. (Biochemistry 31: 3777, 1992), Jenny a kol. (PNAS 84: 4846, 1987), Kane a kol. (Biochemistry 26: 6508, 1987), a Kane a Davie (PNAS 83: 6800, 1986) se týká struktury, aminokyselinové sekvence, a DNA kódující faktor V.

V oboru je stále potřeba zlepšené léčby subjektů prodělávajících krvácivé příhody, včetně subjektů, kde krvácivé příhody jsou důsledkem operace, zranění nebo jiných forem tkáňových poškození; indukované koagulopatie včetně koagulopatie u subjektů s opakovanými transfúzemi; vrozených nebo získaných poruch krvácivosti včetně snížené funkce jater („jaterní nemoc“); defektní funkce krevních destiček nebo sníženého množství krevních destiček; nedostatku nebo abnormálních esenciálních srážlivých „sloučenin“ (např. krevní destičky nebo protein van Willebrandova faktoru); zvýšené fibrinolýzy, antikoagulační terapie nebo trombolytické terapie; nebo transplantace kmenových buněk.

V oboru zůstává potřeba pro zlepšenou, spolehlivou a široce použitelnou metodu zvyšování koagulace, zlepšování nebo zajišťování vzniku stabilních hemostatických zátek, nebo zvyšování vhodnosti pro léčený subjekt, nebo dosažení plné hemostázy u subjektů, zvláště u subjektů s oslabenou generací trombínu. Je tu také potřeba metod, kde je doba zástavy krvácení zkrácena.

• · · · ·· » • · • · · • ···· «

Popis vynálezu

Jedním předmětem předmětného vynálezu je získávání přípravků, jež mohou být efektivně využity při léčbě nebo profylaxi krvácivých příhod a poruch krvácivosti.

Druhý předmět předmětného vynálezu je získávání prostředků v samostatné jednotkové dávkovači formě, jež může být efektivně použita při léčbě nebo profylaxi krvácivých příhod nebo jako prokoagulant. Další předmět předmětného vynálezu je zajišťovat prostředky, metody léčby nebo soupravy vykazující synergický efekt.

Další předmět předmětného vynálezu je zajišťovat prostředky, metody léčby nebo soupravy nevykazující žádné závažné vedlejší účinky, jako je vysoká hladina systémové aktivace koagulačního systému.

Další předměty předmětného vynálezu budou ozřejměny čtením tohoto popisu.

V prvním aspektu vynález zajišťuje farmaceutický prostředek zahrnující polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V.

V druhém aspektu vynález zajišťuje soupravu součástí obsahující léčebný postup pro krvácivé epizody zahrnující

a) Účinné množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a farmaceuticky přijatelný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b) Účinné množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V a farmaceuticky přijatelný nosič ve druhé jednotkové dávkovači formě;

c) Přepravní prostředek pro udržení první a druhé jednotkové dávkovači formy.

Ve třetím aspektu vynález zajišťuje použití polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII v kombinaci s polypeptidem faktoru V nebo příbuzným faktoru V pro výrobu léčiva pro léčení krvácivých příhod subjektu. V dalším aspektu vynález zajišťuje použití přípravku tak, jak je popsáno v kterémkoli z nároků 1 až 19, pro výrobu léčiva pro léčení krvácivých příhod subjektu.

Ve svých odlišných provedeních jsou léčiva určena pro zkrácení času potřebného k dosažení plné hemostázy, pro zkrácení času potřebného k udržení hemostázy, pro zkrácení srážecího času, pro prodloužení času lýzy sraženiny, a zvýšení pevnosti sraženiny.

t • · • · * · · ··· ··· • ··· · · · · · 9 ··· • · ···· · · · · ··· · ·«·

6··· ······« ·· · ♦· ·· ·· ·

V odlišných provedeních jsou léčiva určena pro léčbu subjektů trpících krvácivými příhodami v důsledku operace, zranění nebo jiných forem tkáňových poškození; koagulopatie včetně koagulopatie u subjektů s opakovanými transfúzemi; vrozených nebo získaných poruch srážlivosti nebo krvácivosti včetně snížené funkce jater („jaterní nemoc“); defektní funkce krevních destiček nebo sníženého množství krevních destiček; nedostatku nebo abnormálních esenciálních srážlivých „sloučenin“ (např. krevní destičky nebo protein van Willebrandova faktoru); zvýšené fibrinolýzy, antikoagulační terapie nebo trombolytické terapie; transplantace kmenových buněk.

V jedné sérii provedení se krvácení vyskytuje v orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha, oči, játra, plíce, nádorová tkáň, trávicí trakt; v další sérii provedení je to difúzní krvácení, jako je hemoragická gastritida a profúzní děložní krvácení. V další sérii provedení jsou krvácivé příhody krvácením spojeným s operací nebo zraněním u subjektů s akutní hemartrózou (krvácení v kloubech), chronickou hemofilickou artropatií, hematomy (např. svalovými, rertoperitoneálními, sublingválními a retrofaryngálními), krvácením v jiných tkáních, hematurií (krvácení renálního traktu), cerebrální hemoragií, u subjektů operovaných (např. hepatektomie), s dentální extrakcí, a krvácením trávícího traktu (např. krvácení UGI). V jednom provedení je léčivo určeno pro léčbu subjektu s krvácivými příhodami následkem zranění, nebo operace, nebo sníženého počtu či aktivity krevních destiček.

V dalším aspektu vynález zajišťuje metodu léčby krvácivých příhod u subjektů, metodu zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro léčbu krvácení.

V dalším aspektu vynález zajišťuje metodu zkrácení srážecího času u subjektu, metodu zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství . preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zkrácení srážecího srážlivostního času.

V dalším aspektu vynález zajišťuje metodu zvýšení hemostázy u subjektu, metodu zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zlepšení hemostázy.

•· · ·· ·· ··· • · · · · · · · · • ··· · · · · · · · · · • ······· ·· · · · · ··«·

-j · · · ·······

V dalším aspektu vynález zajišťuje metodu prodloužení času lýzy sraženiny u subjektu, metodu zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro prodloužení času lýzy sraženiny.

V dalším aspektu vynález zajišťuje metodu zvýšení pevnosti sraženiny u subjektu, metodu zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení pevnosti sraženiny.

V jedné sérii provedení metod se polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávají v samostatné jednotkové dávkovači formě.

V další sérii provedení se polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávají ve formě první jednotkové dávkovači formy zahrnující přípravu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhé jednotkové dávkovači formy zahrnující přípravu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V. V sérii těchto forem se první jednotková dávkovači forma a druhá jednotková dávkovači forma podává s časovou prodlevou ne delší než 15 minut.

V dalším aspektu vynález zajišťuje soupravu obsahující léčebný postup krvácivých příhod zahrnujících

d) Účinné množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a účinné množství polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, a farmaceuticky přijatelný nosič v samostatné jednotkové dávkovači formě; a

e) Přepravní prostředek pro udržení samostatné jednotkové dávkovači formy.

V jedné sérii provedení vynálezu je polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII polypeptid příbuzný faktoru VII. V jedné sérii provedení vynálezu je polypeptid příbuzný faktoru VII varianta aminokyselinové sekvence faktoru VII. V jednom provedení je poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského lidského faktoru Vila (divoký typ FVIIa) nejméně •· · ·· ·* ·· • ♦ · · · · · • ··· · ···· · • ······· ·· ♦ · · • · · ····«·· • · · · · ·· ·· · * · • · · • ·· · · přibližně 1,25 při testování v „hydrolytickém testu in vitro, jak je uvedeno v příslušném popise.

V jedné sérii provedení vynálezu je polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII faktor VII. V jednom provedení je faktor VII lidský faktor VII. V jednom provedení je faktor VII hovězí, prasečí, psí, koňský, vačičí nebo lososí faktor VII. V jiném provedení je faktor VII připravován rekombinantně. V jiném provedení pochází faktor VII z plazmy. Ve výhodném provedení je faktor VII rekombinantní lidský faktor VII. V jedné sérii provedení vynálezu je polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII ve své aktivované formě. V jednom výhodném provedení vynálezu je faktor VII rekombinantní lidský faktor Vila.

V jedné sérii provedení vynálezu je polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V polypeptid příbuzný faktoru V. V jednom provedení je polypeptid příbuzný faktoru V varianta aminokyselinové sekvence faktoru V. V jednom provedení je poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru V a aktivitou přirozeného lidského lidského faktoru V (divoký typ faktor V) nejméně přibližně 1,25 při testování v „testu faktoru V“, jak je uvedeno v příslušném popise. V jednom provedení je polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V polypeptid faktoru V. V jednom provedení je faktor V lidský faktor V. V jednom provedení je faktor V hovězí, prasečí, psí, koňský, vačičí, krysí nebo lososí faktor V. Ve výhodném provedení je faktor Vil připravován rekombinantně. V jiném provedení pochází faktor VII z plazmy. V jiném provedení pochází faktor V z krevních destiček. Ve výhodném provedení je faktor V rekombinantní lidský plazmatický faktor V. V jiném provedení je faktor V lidský aktivovaný faktor V (FVa). V jednom provedení je polypeptid příbuzný faktoru V fragment faktoru V. V jednom provedení je polypeptid příbuzný faktoru V polypeptid hybridního faktoru V, např. prasečí/lidský hybrid.

V jednom provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V přítomny v poměru hmotností mezi 100:1 a 1:100 (w/w faktor Vllíaktor V).

V jednom provedení jsou polypeptidy příbuzné faktoru VII varianty aminokyselinové sekvence, nemající více než 20 aminokyselin nahrazených, vynechaných nebo vložených ve srovnání s divokým faktorem VII (tj. polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci popsanou v US patentu č. 4784950), v jiném provedení nemají varianty faktoru VII více než 15 aminokyselin nahrazených, vynechaných nebo vložených; v jiných provedeních nemají varianty faktoru VII více

9 9 9

9 9 9 • ·999 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 · · · · · • · • · · • ···· než 10 aminokyselin, například 8, 6, 5 nebo 3 aminokyseliny, nahrazených, vynechaných nebo vložených ve srovnání s divokým faktorem VII. V jednom provedení jsou varianty faktoru VII zvoleny ze seznamu: L305V-FVIIa, L305V/M306D/D309S-FVIIa, L305l-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158T/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa,

K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII,

V158D/M298K-FVII, a S336G-FVII.

V dalším provedení mají polypeptidy příbuzné faktoru VII zvýšenou aktivitu nezávislou na tkáňovém faktoru ve srovnání s přirozeným lidským koagulačním faktorem Vila. V jiném provedení není zvýšená aktivita doprovázena změnami v substrátové specificitě. V jiném provedení vynálezu není vazba polypeptidů příbuzných faktoru VII ke tkáňovému faktoru oslabena a polypeptidy příbuzné faktoru VII mají přinejmenším aktivitu divokého faktoru Vila navázaného na tkáňový faktor.

Ve výhodném provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V rekombinantní lidský faktor V. V jiném výhodném provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V rekombinantní lidský faktor Vila a rekombinantní lidský faktor Va.

V jednom provedení je srážecí čas v savčí krvi redukován. V jiném provedení je hemostáze v savčí krvi zvýšena. V jiném provedení je čas lýzy sraženiny v savčí krvi prodloužen. V jiném provedení je pevnost sraženiny v savčí krvi zvýšena. V jiném provedení je savčí krev lidská krev. V jiném provedení je savčí krev normální lidská krev; v jiném provedení je krev krví subjektu majícího oslabenou generaci trombinu. V jiném provedení je krev krví subjektu majícího nedostatečnost jednoho nebo více koagulačních faktorů; v jiném provedení je krev krví subjektu majícího inhibitory proti jednomu nebo více koagulačním faktorům; v jiném provedení je krev krví subjektu majícího sníženou koncentraci fibrinogenu; v jiném provedení je krev lidskou krví s deficientním faktorem V. V jedné sérii provedení je krev plazma.

V jednom provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru Vil nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V jediná hemostatická činidla obsažená v prostředku. V jiném provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V jediná aktivní hemostatická ·· · ΦΦ ΦΦ • · Φ ΦΦΦ • Φ · · Φ Φ ΦΦΦ • Φ φ φ Φ Φ · Φ ·· • Φ Φ ΦΦΦ • · Φ · · · Φ • Φ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ činidla obsažená v přípravku. V jiném provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V jediné koagulační faktory podávané subjektu. V jiném provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V jediná aktivní činidla podávaná pacientovi. V jednom provedení je přípravek téměř bez trombinu nebo protrombinu; v jiném provedení je přípravek téměř bez FX; v jiném provedení je přípravek téměř bez FXa.

V jiném provedení je farmaceutický prostředek připravován pro intravenózní dávkování, s výhodou injekce nebo infúze, zvláště injekce. V jednom provedení přípravek obsahuje přinejmenším jeden farmaceuticky přijatelný masťový základ nebo nosič.

V jednom provedení vynálezu je prostředek v samostatné jednotkové dávkovači formě, kde samostatná jednotková dávkovači forma obsahuje oba koagulační faktory. V jednom provedení vynálezu je prostředek ve formě soupravy součástí zahrnující přípravu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII jako první jednotkové dávkovači formy a přípravu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V jako druhé jednotkové dávkovači formy, a zahrnující přepravní prostředek pro udržení první a druhé jednotkové dávkovači formy. V jednom provedení použitelný prostředek nebo souprava dále obsahuje instrukce pro dávkování prostředku anebo samostatných komponent.

V jednom provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány v samostatné dávkovači formě. V jednom provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány v první jednotkové dávkovači formě zahrnující přípravu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a ve druhé jednotkové dávkovači formě zahrnující přípravu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V.

V jednom provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány simultánně. V jiném provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány postupně. V jiném provedení vynálezu jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány s časovou prodlevou ne delší než 15 minut, s výhodou 10, výhodněji 5, ještě výhodněji 2 minuty. V jednom provedení jsou ·· · ·· ·· ·· · • · · · · · ·*· • ·· · · · ··· · · · ·

9 9999 99 99 999 9 999 ·· · ·♦ ·· .· · polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány s časovou prodlevou do 2 hodin, výhodněji od 1 do 2 hodin, ještě výhodněji do 1 hodiny, ještě výhodněji od 30 minut do 1 hodiny, ještě výhodněji do 30 minut, ještě výhodněji od 15 minut do 30 minut.

V jednom provedení je účinné množství polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII od 0,05 mg/den do 500 mg/den (70 kg subjekt). V jednom provedení je účinné množství polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V od 0,01 mg/den do 500 mg/den (70 kg subjekt).

V jednom provedení jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V přítomny v poměru hmotností mezi 100:1 a 1:100 (w/w faktor VII :faktor V).

V jednom provedení předmětného vynálezu je farmaceutický prostředek v samostatné jednotkové dávkovači formě a jeho podstatnou částí je preparát polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a preparát polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V, a jedna nebo více komponent zvolených ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních prostředků, a proteázových inhobitorů.

V jiném provedení předmětného vynálezu je farmaceutický prostředek ve formě soupravy součástí s první jednotkovou dávkovači formou sestávající z podstatné části z preparátu polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a jedné nebo více komponent zvolených ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních prostředků, a proteázových inhobitorů; a s druhou jednotkovou dávkovači formou sestávající z podstatné části z preparátu polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V, a jedné nebo více komponent zvolených ze seznamu farmaceuticky přijatelných nosičů, stabilizátorů, detergentů, neutrálních solí, antioxidantů, konzervačních prostředků, a proteázových inhobitorů.

V dalším provedení je subjekt člověk, v jiném provedení má subjekt oslabenou generaci trombinu; v jednom provedení má subjekt sníženou koncentraci fibrinogenu v plazmě (např. subjekt po opakovaných transfúzích); v jednom provedení má subjekt sníženou koncentraci faktorů Vlil nebo FIX v plazmě.

V dalším aspektu se vynález týká metody zvýšení hemostáze u subjektu trpícího responzivním syndromem faktoru VII ve srovnání se subjektem léčeným faktorem VII jako jediným koagulačním proteinem, metody zahrnující podávání »* · ·· ·« ·· ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 999 9 999

99999 9 9 99 999 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 •9 9 99 99 99 9 potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení hemostáze.

V dlaším aspektu se vynález týká metody zvýšení tvorby trombinu u subjektu, metody zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení tvorby trombinu.

V dlaším aspektu se vynález týká metody zvýšení tvorby trombinu u subjektu trpícího responzivním syndromem faktoru VII ve srovnání se subjektem léčeným faktorem VII jako jediným koagulačním proteinem, metody zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro zvýšení tvorby trombinu.

V dlaším aspektu se vynález týká metody redukce počtu podání proteinu koagulačního faktoru potřebného pro dosažení hemostázy u subjektu trpícího responzivním syndromem faktoru Vil ve srovnání s potřebným počtem podání, je-li faktor VII subjektu podáván jako jediný koagulační protein, metody zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro redukci počtu podání proteinu koagulačního faktoru.

V dlaším aspektu se vynález týká metody léčby krvácení u subjektu trpícího responzivním syndromem faktoru VII, metody zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro léčbu krvácení.

V jednom provedení je faktor VII lidský rekombinantní faktor Vila (fFVIIa). V další formě je rFVIIa od NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

V dalším aspektu se vynález vztahuje na použití polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII v kombinaci s faktorem V pro výrobu léku zvyšujícího tvorbu fíbrinové sraženiny v savčí plazmě.

• t · »· *· ♦ · « • · · · · · » · · • ·· · · · ·*· · · · · • ······· « · 9 9 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 •9 9 99 99 99 9

V dalším aspeltu se vynález vztahuje k metodě zvyšování tvorby fibrinové sraženiny u subjektu, metoda zahrnuje podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhého množství preparátu polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství společně je účinné pro léčbu krvácení.

SEZNAM OBRÁZKŮ

OBr. 1: přidání FVIIa vede ke značnému zkrácení srážecího času, dále zkráceného přidáním FV. Samotné přidání FV nezktracuje srážecí čas.

Podrobný popis vynálezu

U subjektů s nadměrnou krvácivostí ve spojení s operací nebo závažným zraněním, a tedy s potřebou krevní transfúze, dochází k více komplikacím než u těch, jež neprodělávají žádné krvácení. Avšak také mírná krvácení mohou vést ke komplikacím, pokud vyžadují podání lidské krve nebo krevních produktů (krevních destiček, leukocytů, plazmatických koncentrátů pro léčbu defektů koagulace atd.), protože to je spojeno s rizikem přenosu lidských virů (např. hepatitis, HIV, parvovirus a dalších, dosud neznámých virusů), stejně jako nevirových patogenů. Nadměrná krvácení vyžadující masivní krevní transfúze mohou vést k vývoji mnohočetných orgánových selhání včetně oslabení funkce plic a ledvin. Jakmile se u subjektu vyvine tato série komplikací, je nastartována kaskáda eventualit zahrnující množství cytokinových a zánětlivých reakcí. To činí jakoukoli léčbu extrémně obtížnou a bohužel často neúspěšnou. Pacient prodělávající závažnou ztrátu krve se stává klinicky nestabilním. U takových pacientů je riziko vzniku atriální fibrilace, jež může vést k fatálnímu zastavení srdeční aktivity; oslabení funkce ledvin, nebo výronu tekutiny do plic (tzv. „voda na plicích“ nebo ARDS). Hlavním cílem operací stejně jako léčby závažných tkáňových poškození je tedy vyhnout se nebo minimalizovat krvácení. Aby bylo možné vyhnout se anebo minimalizovat takové krvácení, je důležité zajistit vznik stabilní a pevné hemostatické zátky, jež se nesnadno rozpouští fibrinolytickými enzymy. Navíc je důležité zajistit rychlý a účinný vznik takových zátek nebo sraženin.

Subjekty s trombocytopenií (snížený počet nebo aktivita krevních destiček) mají také oslabenou generaci trombinu, stejně jako defektní stabilizaci fibrinové zátky • 9 9 99 99 99 9 • •9 999 999 •999 99 999 9 9 · 9

9 9999 ·9 99 999 9 9999

9 9999 99 9 •9 9 9· 99 99 9 vedoucí k hemostatické zátce náchylné k předčasnému rozpouštění. Navíc subjekty, vystavené závažnému zranění nebo poškození orgánů, a ty, které v důsledku toho prodělaly četné krevní transfúze, mají často snížený počet krevních destiček a také snížené úrovně fíbrinogenu, faktoru Vlil a dalších koagulačních proteinů. U těchto subjektů dochází k oslabení generace trombinu. Tyto subjekty tedy mají defektní nebo méně účinnou hemostázu vedoucí ke vzniku fibrinových zátek, jež jsou snadno a předčasně rozpouštěny proteolytickými enzymy, jako jsou enzymy navíc nadměrně uvolňované v situacích charakteristických pro rozsáhlá zranění a poškození orgánů.

Krvácení ve tkáních může také vést ke vzniku hematomů. Velikosti (zvláště interkraniálních a zádových) hematomů se úzce vztahují k rozsahu ztráty neurologické funkce, rehabilitačních obtíží, nebo/a závažnosti a stupně permanentního oslabení neurologické funkce následkem rehabilitace. Nejzávažnější hematomové komplikace jsou pozorovány tehdy, jsou-li lokalizovány v mozku, kde mohou dokonce vést ke smrti pacienta.

Hlavním cílem léčby krvácení je tedy dosažení hemostázy v minimálním čase, a tedy udržení krevní ztráty na minimu.

Předmětný vynález tedy zajišťuje výhodného prostředku, použití a metody léčby krvácivých příhod u subjektů s potřebou takové léčby. Přípravky, použití a metody mohou být spojeny s prospěšnými účinky, jako je dosažená nižší ztráta krve před hemostázou, nižší potřeba krve během operace, udržení krevního tlaku na přijatelné úrovni před dosažením hemostáze, rychlejší stabilizace krevního tlaku, kratší regenerační čas léčeného pacienta, kratší rehabilitační čas léčeného pacienta, snížení vzniku hematomů nebo vznik menších hematomů, včetně hematomů v mozku, omezení počtu podání potřebných pro zástavu krvácení a zachování hemostázy.

Podávání preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, např. faktoru Vila, v kombinaci s preparátem polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, přináší zkrácení srážecího času, pevnější sraženinu a zvýšenou odolnost k fibrinolýze ve srovnání se srážlivostním časem, pevností sraženiny a odolnosti tehdy, je-li buďto faktor Vila nebo faktor V podáván jednotlivě.

Podávání preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, např. faktoru Vila, v kombinaci s preparátem polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, přináší zkrácení času potřebného pro zastavení krvácení a snížení počtu podání potřebných k udržení hemostázy ve srovnání se situací, kdy buďto faktor Vila ·· · ** ·· ·· · ··· ··· · ·· ♦ · · · · · ··♦ · · · · • · ···· · · ·· · · · · ···· • ♦ · ··«·«·« ·· * ·· ·· ·· · nebo faktor V je podáván jednotlivě. Předmětný vynález zajišťuje prospěšný účinek simultánního nebo postupného dávkování preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, a preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII. Farmaceutický prostředek podle předmětného vynálezu může být ve formě jednoduché kompozice nebo může být ve formě multikomponentní soupravy součástí. Prostředek podle předmětného vynálezu je použitelný jako terapeutický a profylaktický prokoagulant u savců, včetně primátů jako jsou lidé. Předmětný vynález dále zajišťuje metodu léčby (včetně profylaktické léčby či prevence) krvácicých příhod subjektu, včetně lidí.

Kdykoli je v této specifikaci zmíněna první nebo druhá nebo třetí, atd. jednotková dávka, neoznačuje to preferované pořadí dávek, je to udáno pouze pro evidenční účely.

Kombinace preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V je výhodný produkt zajišťující krátké srážlivostní časy, rychlý vznik hemostatické zátky, a vznik stabilní hemostatické zátky. Předmětným vynálezcem bylo zjištěno, že kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V je výhodný produkt zajišťující vznik pevných, stabilních a rychle utvořených hemostatických zátek.

Předmětní vynálezci ukázali, že kombinace faktoru VII a faktoru V může zvýšit pevnost sraženiny účinněji než buďto faktor Vila anebo faktor V jednotlivě. Bylo také ukázáno, že kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a faktoru V může prodloužit čas lýzy sraženiny in vitro v normální lidské plazmě účinněji než jako buď faktor Vila anebo faktor V jednotlivě. Bylo také ukázáno, že kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a faktoru V může prodloužit poločas lýzy sraženiny v normální lidské plazmě účinněji než jako buď faktor Vila anebo faktor V jednotlivě. Bylo také ukázáno, že kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a faktoru V může chránit sraženinu před fíbrinolýzou, obzvláště před tPA zprostředkovanou fíbrinolýzou v normální lidské plazmě, účinněji než jako buď faktor Vila anebo faktor V jednotlivě. Takto může být zvýšením koagulace dosaženo účinnější léčby krvácivosti subjektů.

Bez omezování teorií se má za to, že kompletní generace trombinu je nezbytná pro vznik pevné, stabilní hemostatické zátky, a tedy pro zachování hemostázy. Fibrinová struktura takové zátky je závislá jak na množství vzniklého ·· · ·* *· ·· 9 • 9 · ··· ·«·

9 9 9 9 9 999 · · · ·

9 9999 99 99 999 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 9 trombinu, tak na rychlosti generace iniciálního trombinu. Při výskytu oslabené generace trombinu se tvoří fibrinová zátka, jež je vysoce propustná. Fibrinoiytické enzymy normálně přítomné na povrchu fibrinu takovou fibrinovou zátku snadno rozpouštějí. Vznik stabilní fibrinové zátky je také závislý na přítomnosti faktoru Xllla, jenž je aktivován trombinem a tedy také závislý na kompletní generaci trombinu. Navíc nedávno popsaný trombinem aktivovatelný fibrinolytický inhibitor, TAFI, vyžaduje pro svou aktivaci poněkud vysoká množství trombinu. Při výskytu ne plně adekvátního vzniku trombinu TAFI nemusí tedy být aktivováno, což vede ke vzniku hemostatické zátky, jež je snadněji než normálně rozpouštěna normální fibrinolytickou aktivitou. V situacích se sníženým množstvím krevních destiček je iniciována trombocytopénie, rychlejší generace trombinu, podáváním exogenního dodaného faktoru Vila. Úplná generace trombinu však není normalizována faktorem Vila dokonce ani ve vysokých koncentracích.

U subjektů se sníženou koncentrací fibrinogenu v plazmě (např. subjekt po opakovaných transfúzích následkem vícenásobného zranění nebo rozsáhlé operace) se neobjevuje plná aktivace trombinu. Účinnější hemostáze je potom dosažena podáním kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a faktoru V.

Subjekty s trombocytopénií mají oslabenou generaci trombinu, stejně jako defektní stabilizaci fibrinové zátky vedoucí k hemostatické zátce náchylné k předčasnému rozpouštění. Navíc subjekty, vystavené závažnému zranění nebo poškození orgánů, a ty, které v důsledku toho prodělaly četné krevní transfúze, mají často snížený počet krevních destiček a také snížené úrovně fibrinogenu, faktoru Vlil a dalších koagulačních proteinů. U těchto subjektů dochází k oslabení generace trombinu. Navíc jejich snížené úrovně fibrinogenu interferují s aktivací faktoru XIII. Tyto subjekty tedy mají defektní nebo méně účinnou hemostázi vedoucí ke vzniku fibrinových zátek, jež se snadno a předčasně rozpouštějí proteolytickými enzymy, tyto enzymy jsou navíc nadměrně uvolňované v situacích charakteristických pro rozsáhlá zranění a poškození orgánů.

Pro usnadnění vzniku plně stabilizovaných zátek s plnou schopností udržet hemostázu u subjektu se podává prostředek podle předmětného vynálezu. Tento prostředek je zvláště prospěšný u subjektů se sníženým množstvím krevních destiček a u subjektů se sníženou úrovní fibrinogenu v plazmě nebo/a dalších koagulačních proteinů.

·· · • Φ ·· * • · · ··· · « « • · · · · · ··♦ · · · · • · ···· # · ·· ··· · ···· • · · ····«·· 99 9 99 99 99 9

Polypeptidy faktoru Vil:

V praxi předmětného vynálezu může být použit jakýkoli polypeptid faktoru VII, jenž je účinný při prevenci nebo léčbě krvácení. To zahrnuje polypeptidy faktoru VII pocházející z krevní plazmy, nebo připravované rekombinantními způsoby.

Předmětný vynález zahrnuje polypeptidy faktoru VII, jako jsou například peptidy mající aminokyselinovou sekvenci popsanou v US patentu č. 4784950 (divoký lidský faktor VII). V některých provedeních je polypeptid faktoru VII lidský faktor Vila, jak je například popsáno v US patentu č. 4784950 (divoký faktor VII). V jedné sérii provedení zahrnují polypeptidy faktoru VII polypeptidy, jež vykazují nejméně 10%, výhodně nejméně 30%, výhodněji nejméně 50%, a nejvýhodněji nejméně 70% specifické biologické aktivity lidského faktoru Vila. V jedné sérii provedení zahrnují polypeptidy faktoru VII polypeptidy, jež vykazují nejméně 90%, výhodně nejméně 100%, výhodněji nejméně 120%, výhodněji nejméně 140%, a nejvýhodněji nejméně 160% specifické biologické aktivity lidského faktoru Vila. V jedné sérii provedení zahrnují polypeptidy faktoru VII polypeptidy, jež vykazují nejméně 70%, výhodně nejméně 80%, výhodněji nejméně 90%, a nejvýhodněji nejméně 95% identity se sekvencí divokého typu faktoru VII, jak je popsáno v US patentu č. 4784950.

Jak je používán v tomto dokumentu, pojem „polypeptid faktoru VII“ zahrnuje, bez omezení, faktor VII stejně tak jako polypeptidy příbuzné faktoru VII. Termín „faktor VII“ zamýšlí zahrnovat, bez omezení, polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci 1 až 406 divokého typu lidského faktoru VII (jak je popsáno v US patentu č. 4784950), stejně jako divokého typu faktoru VII odvozeného z jiných druhů, jako je hovězí, prasečí, psí, vačičí nebo lososí faktor VII, faktor VII je odvozen z krve nebo plazmy, nebo produkován rekombinantními způsoby. Dále to zahrnuje přirozené alelické variace faktoru VII, jež mohou existovat a vyskytovat se individuálně. Také stupeň a poloha glykosylace a dalších posttranslačních modifikací se může měnit v závislosti na zvolených hostitelských buňkách a na podstatě prostředí hostitelských buněk. Termín „faktor VII také zamýšlí zahrnovat polypeptidy faktoru VII v jejich neštěpené (zymogenní) formě, stejně jako ty, jež jsou profylakticky zpracovány tak, aby poskytovaly své jednotlivé bioaktivní formy, jež mohou být označovány jako faktor Vila. Typicky se faktor VII štěpí mezi zbytky 152 až 153 za vzniku faktoru Vila.

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9 ·· · • · * • · · · • · ···· · • · · ·

9 9

9 999

9 9 9

9 9 „Polypeptidy příbuzné faktoru VII“ zahrnují, bez omezení, polypeptidy faktoru VII, jež jsou chemicky modifikovány vzhledem k lidskému faktoru VII nebo/a obsahují jednu nebo více změn v aminokyselinových sekvencích vzhledem k lidskému faktoru VII (tj. variant faktoru VII), nebo/a obsahují zkrácené aminokyselinové sekvence vzhledem k lidskému faktoru VII (tj. fragmenty faktoru VII). Takové polypeptidy příbuzné faktoru VII mohou vykazovat odlišné vlastnosti vzhledem k lidskému faktoru VII, včetně stability, vázání fosfolipidů, modifikované specifické aktivity a podobně. Termín „polypeptidy příbuzné faktoru VII“ zamýšlí zahrnovat takové polypeptidy v jejich neštěpené (zymogenní) formě, stejně jako ty, jež jsou profylakticky zpracovány tak, aby poskytovaly své jednotlivé bioaktivní formy, jež mohou být označovány jako „polypeptidy příbuzné faktoru VII“ nebo „aktivované polypeptidy příbuzné faktoru VII“.

Jak je používán v tomto dokumentu, pojem „polypeptidy příbuzné faktoru VII“ zahrnuje, bez omezení, polypeptidy vykazující v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu lidského faktoru VII, stejně jako polypeptidy, u nichž byla biologická aktivita faktoru Vila zásadně modifikována nebo omezena vzhledem k aktivitě divokého typu lidského faktoru Vila. Tyto polypeptidy zahrnují, bez omezení, faktor VII nebo faktor Vila, jež jsou chemicky modifikovány, a varianty faktoru VII, u nichž byly zavedeny změny aminokyselinové sekvence, jež mění nebo ruší bioaktivitu polypeptidu.

Dále jsou zahrnuty polypeptidy s mírně modifikovanou aminokyselinovou sekvencí, například polypeptidy mající modifikovaný N-konec včetně delece nebo adice N-koncové aminokyseliny, nebo/a polypeptidy chemicky modifikované vzhledem k lidskému faktoru Vila.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant faktoru VII, ať už vykazují v zásadě stejnou nebo lepší bioaktivitu než divoký faktor VII, nebo alternativně vykazují zásadně modifikovanou nebo omezenou bioaktivitu vzhledem k divokému faktoru VII, včetně, bez omezení, polypeptidu majících aminokyselinovou sekvenci lišící se od sekvence divokého typu faktoru VII inzercemi, delecemi nebo substitucemi jedné nebo více aminokyselin.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, zahrnují ty, jež vykazují nejméně 10%, nejméně 20%, nejméně 25%, nejméně 30%, nejméně 40%, nejméně 50%, nejméně 60%, nejméně 70%, nejméně 75%, nejméně 80%, nejméně 90%, nejméně 100%, nejméně 110%, nejméně 120%, nebo nejméně 130% specifické

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9 ·· · • · · • · · · • · · ·· · · • · · ·· · • · · • · · · · • · · · • 9 9 9

9 9 biologické aktivity divokého typu faktoru Vila, při testování v jednom nebo více srážecích testech, proteolytickém testu, nebo v testu vázání TF, popsaných výše.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, mající v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru Vila, zahrnují ty, jež vykazují nejméně 25%, výhodně nejméně 50%, ještě výhodněji nejméně 75%, ještě výhodněji nejméně 100%, ještě výhodněji nejméně 110%, ještě výhodněji nejméně 120%, nejvýhodněji nejméně 130% specifické aktivity divokého typu faktoru Vila produkovaného ve stejném buněčném typu, při testování v jednom nebo více srážecích testech, proteolytickém testu, nebo v testu vázání TF, popsaných výše.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, mající podstatně omezenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru Vila jsou takové, jež vykazují méně než 25%, výhodněji méně než 10%, ještě výhodněji méně než 5%, a nejvýhodněji méně než 1% specifické aktivity divokého typu faktoru Vila produkovaného ve stejném buněčném typu, při testování v jednom nebo více srážecích testech, proteolytickém testu, nebo v testu vázání TF, popsaných výše. Varianty faktoru VII mající podstatně modifikovanou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru VII zahrnují, bez omezení, varianty faktoru VII vykazující proteolytickou aktivitu faktoru X nezávislou na TF, a ty, jež váží TF ale neštěpí faktor X.

V některých provedeních je polypeptid faktoru VII lidský faktor VII, jak je popsáno např. v US patentu č. 4784950 (divoký faktor VII). V některých provedeních je polypeptid faktoru VII lidský faktor Vila. V jedné sérii provedení jsou polypeptidy faktoru VII polypeptidy příbuzné faktoru VII, jež vykazují nejméně 10%, výhodně nejméně 30%, výhodněji nejméně 50%, a nejvýhodněji nejméně 70% specifické biologické aktivity lidského faktoru Vila. V některých provedeních mají polypeptidy faktoru VII aminokyselinovou sekvenci lišící se od sekvence divokého typu faktoru VII inzercemi, delecemi nebo substitucemi jedné nebo více aminokyselin.

Neomezující příklady variant faktoru VII mající v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru VII zahrnují, ale nejsou omezeny na takové, jež jsou popsány v dánských patentových přihláškách č. PA 200000734 a PA 200001360 (odpovídající WO 01/83752), a PA 200001361 (odpovídající WO 02/22776). Neomezující příklady variant faktoru VII mající v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu jako divoký typ faktoru VII zahrnují S52A-FVII, S60A-FVII (lino a kol., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998);

9

9 9

9 9 9

99999

9 9

9

9 9 9

99

9 9

9 9 9

9 9999 9

9 9

9

L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337-FVIIa, M298Q-FVII,

V158T/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII,

V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII,

K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII,

V158D/M298K-FVII, a S336G-FVII; varianty FVIIa vykazující zvýšenou proteolytickou aktivitu, jak je popsáno v US patentu č. 5580560; faktor Vila, jenž je proteolyticky štěpen mezi zbytky 290 až 291 nebo mezi zbytky 315 až 316 (Mollerup a kol., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); a oxidované formy faktoru Vila (Komfelt a kol., Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54, 1999). Neomezující příklady variant faktoru VII mající podstatně omezenou nebo modifikovanou biologickou aktivitu vzhledem k divokému faktoru VII zahrnují R152E-FVIIa (Wildgoose a kol., Biochem 29: 3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama a kol., J. Biol. Chem. 270: 66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst a kol., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520, 1998), a faktor Vila postrádající Gla doménu (Nicolaisen a kol., FEBS Letts. 317: 245-249, 1993). Neomezující příklady chemicky modifikovaných polypeptidů faktoru VII a sekvenční varianty jsou popsány např. v US patentu č. 5997864.

Biologická aktivita faktoru Vila při krevním srážení se odvozuje od jeho schopnosti (i) vázat tkáňový faktor (TF) a (ii) katalyzovat proteolytické štěpení faktoru IX nebo faktoru X za vzniku aktivovaného faktoru IX nebo X (faktor IXa nebo faktor Xa, v tomto pořadí).

Pro účely vynálezu může být biologická aktivita polypeptidů faktoru VII („biologická aktivita faktoru VII“) kvantifikována schopností preparátu podporovat srážení krve za použití faktor VII deficitní plazmy a tromboplastinu, jak je popsáno např. v US patentu č. 5997864. V tomto testu je biologická aktivita vyjádřena jako omezení srážecího času vzhledem ke kontrolnímu vzorku a je konvertována na „jednotky faktoru VII“ srovnáním s mixovaným standardem lidského séra obsahujícím 1 jednotku/ml aktivity faktoru VII. Alternativně může být biologická aktivita faktoru Vila kvantifikována pomocí (i) Měření schopnosti faktoru Vila nebo polypeptidu příbuzného faktoru Vila produkovat aktivovaný faktor X (faktor Xa) v systému obsahujícím TF uložený v lipidové membráně a faktor X. (Persson a kol., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997);

·» · ** ·♦ ·· « • <* · · 9 · ··· • ·t · · 9 99· 9 9 9 9

9 9999 9 9 99 999 9 999 • 99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 · (ii) Měření hydrolýzy faktoru X ve vodném systému („proteolytický test in vitro“, viz níže);

(iii) Měření fyzikálního vázání faktoru Vila nebo polypeptidu příbuzného faktoru Vila k TF za použití přístroje založeného na povrchové plasmonové rezonanci (Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997); a (iv) Měření hydrolýzy syntetického substrátu pomocí faktoru Vila nebo/a polypeptidu příbuzného faktoru Vila („hydrolytický test in vitro“, viz níže); a (v) Měření generace trombinu v na TF nezávislém systému in vitro.

Termín „biologická aktivita faktoru VII“ nebo „aktivita faktoru VII“ zamýšlí zahrnovat schopnost generovat trombin; termín také zahrnuje schopnost generovat trombin na povrchu krevních destiček při absenci tkáňového faktoru.

Preparát faktoru Vila, jenž může být použit podle vynálezu, je, bez omezení, NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

Polypeptidy faktoru V:

Předmětný vynález zahrnuje polypeptidy faktoru V, jako jsou např. takové, jež mají aminokyselinovou sekvenci popsanou v Cripe a kol., (Biochemistry 31: 3777, 1992), Jenny a kol. (PNAS 84: 4846, 1987), Kane a kol., (Biochemistry 26: 6508, 1987), a Kane & Davie (PNAS 83: 6800, 1986) (divoký typ lidského faktoru V).

V praxi předmětného vynálezu může být použit polypeptid faktoru V, jenž je účinný v prevenci nebo léčbě krvácení. To zahrnuje polypeptidy faktoru V získané z krve nebo plazmy, nebo produkované rekombinantními způsoby.

Tak, jak je používáno v tomto dokumentu „polypeptid faktoru V“ zahrnuje, bez omezení, faktor V, stejně jako polypeptidy příbuzné faktoru V. Termín „faktor V“ zamýšlí zahrnovat, bez omezení, polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci popsanou v Cripe a kol., (Biochemistry 31: 3777, 1992), Jenny a kol. (PNAS 84: 4846, 1987), Kane a kol., (Biochemistry 26: 6508, 1987), a Kane & Davie (PNAS 83: 6800, 1986) (divoký typ lidského faktoru V), stejně jako divoký typ faktoru V odvozený od jiných druhů, jako je hovězí, prasečí, psí, koňský, vačičí, krysí nebo lososí faktor V. Dále zahrnuje přirozené alelické variace faktoru V, jež mohou existovat a vyskytovat se individuálně. Také stupeň a poloha glykosylace a dalších posttranslačních modifikací se může měnit v závislosti na zvolených hostitelských

·* ·· • · » • · ··· • · · *·«·· « · • · · • 9 · · ···· • · « · ·· · buňkách a na podstatě prostředí hostitelských buněk. Termín „faktor V také zamýšlí zahrnovat polypeptidy faktoru V v jejich zymogenní formě, stejně jako ty, jež jsou zpracovány tak, aby poskytovaly své jednotlivé bioaktivní formy.

„Polypeptidy příbuzné faktoru V“ zahrnují, bez omezení, polypeptidy faktoru V, jež jsou buď chemicky modifikovány vzhledem k lidskému faktoru V nebo/a obsahují jednu nebo více změn v aminokyselinových sekvencích vzhledem k lidskému faktoru V (tj. variant faktoru V), nebo/a obsahují zkrácené aminokyselinové sekvence vzhledem k lidskému faktoru V (tj. fragmenty faktoru V). Takové polypeptidy příbuzné faktoru V mohou vykazovat odlišné vlastnosti vzhledem k lidskému faktoru V, včetně stability, vázání fosfolipidů, modifikované specifické aktivity a podobně.

Termín „polypeptidy příbuzné faktoru V“ zamýšlí zahrnovat takové polypeptidy v jejich zymogenní formě, stejně jako ty, jež jsou zpracovány tak, aby poskytovaly své jednotlivé bioaktivní formy.

Jak je používán v tomto dokumentu, termín „polypeptidy příbuzné faktoru V“ zahrnuje, bez omezení, polypeptidy vykazující v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu lidského faktoru V, stejně jako polypeptidy, u nichž byla biologická aktivita faktoru V zásadně modifikována nebo omezena vzhledem k aktivitě divokého typu lidského faktoru V. Tyto polypeptidy zahrnují, bez omezení, faktor V, jenž je chemicky modifikován, a varianty faktoru V, u nichž byly zavedeny změny aminokyselinové sekvence, jež mění nebo ruší bioaktivitu polypeptidu.

Dále jsou zahrnuty polypeptidy s mírně modifikovanou aminokyselinovou sekvencí, například polypeptidy mající modifikovaný N-konec včetně delece nebo adice N-koncové aminokyseliny, nebo/a polypeptidy chemicky modifikované vzhledem k lidskému faktoru V.

Polypeptidy příbuzné faktoru V, včetně variant faktoru V, ať už vykazují v zásadě stejnou nebo vyšší bioaktivitu než divoký faktor V, nebo alternativně vykazují zásadně modifikovanou nebo omezenou bioaktivitu vzhledem k divokému faktoru V, včetně, bez omezení, polypeptidů majících aminokyselinovou sekvenci lišící se od sekvence divokého typu faktoru V inzercemi, delecemi nebo substitucemi jedné nebo více aminokyselin.

Polypeptidy příbuzné faktoru V, včetně variant, zahrnují ty, jež vykazují nejméně 10%, nejméně 20%, nejméně 30%, nejméně 40%, nejméně 50%, nejméně 60%, nejméně 70%, nejméně 80%, nejméně 90%, nejméně 100%, nejméně 110%, • · ·*· · · · ··· • · · · · · · ·· · · · · • · ···· · · · · · · · · ···

ΛΛ ··· ······· ·· · ·· ·· ·· · nejméně 120%, nebo nejméně 130% specifické biologické aktivity divokého typu faktoru V, produkované ve stejném buněčném typu, při testování v aktivitním testu faktoru V, popsaném v předmětné specifikaci.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII, včetně variant, mající v zásadě stejnou nebo zvýšenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru V, zahrnují ty, jež vykazují nejméně 25%, výhodně nejméně 50%, ještě výhodněji nejméně 75%, ještě výhodněji nejméně 100%, ještě výhodněji nejméně 110%, ještě výhodněji nejméně 120%, nejvýhodněji nejméně 130% specifické aktivity divokého typu lidského faktoru

V produkovaného ve stejném buněčném typu, při testování v jednom nebo více specifických testech aktivity faktoru V, popsaných výše. Pro účelu vynálezu může být biologická aktivita faktoru V kvantifikována měřením schopnosti preparátu srážet plazmu, jak je popsáno např. v Thorelli a kol., Thromb. Haemost. 80: 92, 1998.

V těchto testech je biologická aktivita vyjádřena jako omezení srážecího času vzhledem ke kontrolnímu vzorku.

Polypeptidy příbuzné faktoru V, včetně variant, mající podstatně omezenou biologickou aktivitu vzhledem k divokému typu faktoru V jsou takové, jež vykazují méně než 25%, výhodněji méně než 10%, ještě výhodněji méně než 5%, a nejvýhodněji méně než 1% specifické aktivity divokého typu faktoru V produkovaného ve stejném buněčném typu, při testování v jednom nebo více specifických testech aktivity faktoru V, popsaných výše.

Nevyčerpávající příklady ekvivalentů faktoru V zahrnují lidský faktor V získaný z plazmy, jak je popsáno např. v Dahlback, J. Clin. Invest. 66: 583-591, 1980; Kane & Majerus, J. Biol. Chem. 256: 1002-1007, 1981; nebo Katzmann a kol., PNAS, USA 78: 162-166; rekombinantní lidský faktor V, popsaný např. v Kane & Davie, PNAS,

USA 83: 6800-6804, 1986 nebo Jenny a kol., PNAS, USA 84: 4846-4850, 1987); faktor V pocházející z krevních destiček, popsaný např. v Tracy a kol., Blood 60:

59-63, 1982 nebo v Tracy a kol., J. Biol. Chem. 260: 2119-2124, 1985, bovinní faktor V, popsaný např. v Nesheim a kol., J. Biol. Chem. 254: 508-517, 1979a, nebo v Esman, J. Biol. Chem. 254: 964-973, 1979.

V jednom provedení jsou faktor V ekvivalenty faktoru V, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru V a aktivitou přirozeného lidského lidského faktoru V (divoký typ faktoru V) je nejméně přibližně 1,25 při testování v „testu faktoru V“ (Thorelli a kol., viz výše); v jiných formách je poměr nejméně 2,0; v dalších formách je poměr nejméně 4,0.

• · · · · · · • ··· · ···· · • · ···· · · ·· ··· · ··· *··* · *·· ·· ·· ·

Polypeptidy příbuzné faktoru V také zahrnují fragmenty polypeptidu faktoru V nebo příbuzných faktoru V zachovávající si svou charakteristickou aktivitu vztahující se k hemostáze.

Definice

V této souvislosti je používán třípísmenný nebo jednopísmenný kód aminokyselin v jejich konvenčním významu, jak je uvedeno v tabulce 1. Aniž by bylo eplicitně uváděno, jsou zde zmíněné aminokyseliny L-aminokyseíiny. Rozumí se, že první písmeno například v K337 představuje aminokyselinu přirozeně se vyskytující v označené pozici divokého typu faktoru VII, a že například [K337A]-FVIIa značí variantu FVII, kde je aminokyselina označovaná jednopísmenným kódem K přirozeně se vyskytující v označené poloze nahrazena aminokyselinou označovanou jednopísmenným kódem A.

• · • ·

Tabulka 1: Zkratky aminokyselin:

aminokyselina	třípísmenný kód	jednopísmenný kód
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	lle	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Fenylalanín	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	W
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gin	Q
Asparagin	Asn	N
Glutamová kyselina	Glu	E
Asparagová kyselina	Asp	D
Serin	Ser	S
Threonin	Thr	T

Termíny „faktor Vila „ nebo FVIIa“ jsou zaměnitelné.

Termín „subjekty s oslabenou generací trombinu“ v této souvislosti znamená subjekty, jež nejsou schopny generovat plné trombinové vzplanutí na aktivovaném povrchu krevních destiček, a zahrnuje subjekty mající nižší generaci trombinu, než je generace trombinu u subjektů majících plně funkční, normální hemostatický systém, včetně normálního množství koagulačních faktorů, krevních destiček a fibrinogenu (např. jako v shromážděné, normální lidské plazmě), a zahrnuje, bez omezení, subjekty postrádající faktor Vlil; subjekty mající snížený počet krevních destiček nebo krevních destiček s defektní funkcí (např. trombocytopénie nebo Glanzmannova trombasténie nebo subjekty s nadměrnou krvácivostí); subjekty mající sníženou • ··· • · · · • · · » · • ······· · · ··· • · · · · · · · • · · · · · · hladinu protrombinu, FX nebo FVII; subjekty mající sníženou úroveň více koagulačních faktorů (např. v důsledku nadměrného krvácení jakožto následku zranění nebo rozsáhlé operace); a subjekty se sníženou koncentrací fibrinogenu v plazmě (např. subjekty po opakovaných transfúzích).

Termín „hladina generace trombinu“ nebo „normální generace trombinu“ znamená hladinu pacientovy hladiny generace trombinu ve srovnání s hladinou u zdravých subjektů. Tato hladina je určena jako procento normální úrovně. Kde je to vhodné, mohou být termíny používány zaměnitelně.

Termín „zvýšení hemostatického systému“ znamená zvýšení schopnosti generovat trombin. Termín „zvýšení hemostázy“ zamýšlí zahrnovat situace, kdy je měřená generace trombinu týkající se testovaného vzorku obsahujícího preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a preparát polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V prodloužena vzhledem k individuální generaci trombinu v kontrolním vzorku obsahujícím pouze polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, při testování ve stejném testu generace trombinu. Generace trombinu může být stanovena tak, jak je popsáno v testu generace trombinu podle předmětného popisu (viz část „testy“).

„Univerzální“ činidla nebo faktory, jak je používáno v tomto dokumentu, se týká situací, v nichž jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V jedinými hemostatickými činidly, nebo aktivními hemostatickými činidly, nebo koagulačními faktory obsaženými ve farmaceutickém prostředku nebo soupravě, nebo jsou jedinými hemostatickými činidly, nebo aktivními hemostatickými činidly, nebo koagulačními faktory podávanými pacientovi v průběhu specifické léčby, jako je tomu např. během specifické krvácivé příhody. Rozumí se, že tyto situace zahrnují takové, při nichž další hemostatická činidla nebo koagulační faktory, pokud jsou vhodné, nejsou přítomny ani v dostatečném množství ani aktivitě, aby mohly významně ovlivnit jeden nebo více koagulačních parametrů.

Čas lýzy sraženiny, pevnost sraženiny, vznik fibrinové sraženiny, a čas srážení jsou klinické parametry používané pro stanovení statusu hemostatického systému pacientů. Vzorky krve se odebírají pacientům ve vhodných intervalech a jeden nebo více parametrů se stanovuje například pomocí tromboelastografie, jak je popsáno např. v Meh a kol., Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001; 12: 627-637, Vig a kol., Hematology, Vol. 6 (3), str. 205-213 (2001); Vig a kol., Blood Coagulation & Fibrinolysis, Vol. 12 (7) str. 555-561 (2001) Oct; Glidden a kol., Clinical and applied • · · ·· ·· 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9999 9 999

9999999 99 999 9999

Λ-7 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 £( 99 9 99 99 99 9 thrombosis/hemostasis, Vol. 6 (4) str. 226-233 (2000) Oct; McKenzie a kol., Cardiology, Vol. 92 (4) str. 240-247 (1999) Apr; nebo Davis a kol., Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 6 (4) str. 1250-1255 (1995).

Termín „prodloužení času lýzy sraženiny“ zamýšlí zahrnovat situace, kdy je měřený čas lýzy sraženiny týkající se testovaného vzorku obsahujícího preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V prodloužena vzhledem k individuálnímu času lýzy sraženiny v kontrolním vzorku obsahujícím pouze polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, při testování ve stejném testu lýzy sraženiny. Čas lýzy sraženiny může být stanoven tak, jak je popsáno výše.

Termín „zvýšení pevnosti sraženiny“ zamýšlí zahrnovat situace, kdy je měřená pevnost sraženiny, například mechanická pevnost týkající se testovaného vzorku obsahujícího preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V zvýšena vzhledem k individuálnímu času lýzy sraženiny v kontrolním vzorku obsahujícím pouze polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, při testování ve stejném testu pevnosti sraženiny. Pevnost sraženiny může být stanovena tak, jak je popsáno například v Carr akol., 1991 (Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation.

Am. J. Med Sci. 1991; 302: 13-8), nebo jak je popsáno výše pomocí tromboelastog rafie.

Termín „zvýšení vzniku fíbrinové sraženiny“ zamýšlí zahrnovat situace, kdy je měřený poměr nebo stupeň vzniku fíbrinové sraženiny týkající se testovaného vzorku obsahujícího preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V zvýšen vzhledem k individuálnímu poměru nebo stupni vzniku fíbrinové sraženiny v kontrolním vzorku obsahujícím pouze polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, při testování ve stejném srážlivostním testu. Vznik fíbrinové sraženiny může být stanoven tak, jak je popsáno výše.

Termín „zkrácení srážlivostního času“ zamýšlí zahrnovat situace, kdy je měřený čas pro vznik sraženiny (srážlivostní čas) týkající se testovaného vzorku obsahujícího preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V zvýšen vzhledem k individuálnímu srážecímu času v kontrolním vzorku obsahujícím pouze polypeptid faktoru VII nebo ·· · ·· ·♦ ·* « • · · ··» ··· • ··· * **·· · · · · __ * · ···· »· ·· ··« · ··· ··» ···· · · · ·· · ·· ·· ·· · příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V při testování ve stejném srážlivostním testu. Srážlivostní čas může být stanoven pomocí standardních PT nebo aPTT testů, jež jsou známy všeobecně kvalifikovaným osobám.

Termín „snížený počet nebo aktivita krevních destiček“ se vztahuje na množství krevních destiček (trombocytů) přítomných v plazmě subjektů a na aktivitu vztahující se ke koagulaci těchto krevních destiček. Snížený počet může být důsledkem například zvýšené destrukce krevních destiček, snížené produkce krevních destiček, a nahromadění většího než normálního podílu krevních destiček ve slezině. Například trombocytopénie se definuje jako počet krevních destiček nižší než 150000 destiček na mikrolitr, za horní limit normálního počtu destiček se obecně považuje 350000 až 450000 destiček na mikrolitr. Počet krevních destiček může být měřen na automatických počítačích destiček, což je pro zkušené pracovníky známá metoda. Syndromy způsobené sníženým počtem krevních destiček zahrnují, bez omezení, trombocytopénii, koagulopatii. „Aktivita“ zahrnuje, bez omezení, agregaci, adhezi, a koagulační aktivitu krevních destiček. Snížená aktivita může být způsobena například abnormalitami glykoproteinů, abnormální interakcí membránového cytoskeletonu, abnormalitami granulí krevních destiček, abnormalitami koagulační aktivity krevních destiček, abnormalitami signální transdukce a sekrece. Aktivita krevních destiček včetně agregace, adheze, a koagulační aktivity se měří standardními metodami zkušenému pracovníku známými, např. Platelets, A Practical Approach, Ed. S.P. Watson & K.S. Authi: Clinical Aspects of Platelet Disorders (K.J. Clemetson) 15:299-318, 1996, Oxford University Press; Williams Hematology, Sixth Edition, Eds. Beutler, Lichtman, Coller, Kipps & Seligsohn, 2001, McGraw-Hill. Syndromy způsobené sníženou aktivitou krevních destiček zahrnují, bez omezení, Glanzmannovu trombasténii, Bernardův-Soulierův syndrom, antikoagulační léčbu a trombolytickou léčbu. „Snížený“ se vztahuje k počtu a aktivitě vzorku testované plazmy ve srovnání s počtem a aktivitou ve vzorku normální plazmy, měřenými ve stejném testu.

Tak, jak je používán v tomto dokumentu, zohledňuje termín „poruchy krvácivosti“ jakýkoli defekt, vrozený, získaný nebo vyvolaný, buněčného nebo molekulárního původu, jenž se manifestuje při krvácivých příhodách. Příklady poruch krvácivosti zahrnují, ale neomezují se na, nedostatečnost srážlivostního faktoru (například nedostatečnost koagulačních faktorů Vlil, IX, XI nebo VII), inhibitorů ·· ·

OQ · · · · · · · fcí/ ··· · · » * srážlivostního faktoru, defektní funkci krevních destiček (např. Glanzmannova trombasténie a Bernardův-Soulierův syndrom), trombocytopénii, von Willebrandovu nemoc, a koagulopatii, jako je taková, jež je způsobena dilucí koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzu a snížený počet krevních destiček v důsledku krvácení nebo/a trnsfúzí (např. u subjektů s opakovanými transfúzemi, jež prodělaly operaci nebo zranění).

Krvácení se vztahuje na výron krve z jakékoli složky oběhového systému. Termín „krvácivé příhody“ zamýšlí zahrnovat nechtěné, nekontrolované a často nadměrné krvácení ve spojení s operací, zraněním, nebo jinými formami tkáňového poškození, stejně jako nechtěná krvácení u subjektů trpících poruchami krvácivosti. Krvácivé příhody se mohou vyskytovat u subjektů majících v zásadě normální koagulační systém, avšak trpícími (dočasnou) koagulopatii, stejně jako u subjektů majících vrozené nebo získané poruchy koagulace nebo krvácivosti. U subjektů s defektní funkcí krevních destiček může být krvácení podobné krvácení způsobenému hemofílií, poněvadž hemostatický systém, jak je tomu při hemofílii, postrádá nebo má abnormální esenciální srážlivé „sloučeniny“ (např. krevní destičky nebo protein van Willebrandova faktoru). U subjektů prodělávajících rozsáhlé tkáňové poškození, například ve spojení s operací nebo závažným zraněním, může být normální hemostatický mechanismus překonán potřebou okamžité hemostáze, a může se u nich vyvinout nadměrná krvácivost navzdory v zásadě normálnímu (předtraumatickému nebo předoperačnímu) hemostatickému mechanismu. U takových subjektů, jež dále často prodělaly opakované transfúze, se vyvíjí (dočasná) koagulopatie v důsledku krvácení nebo/a transfúzí (tj. zředění koagulačních proteinů, zvýšené fibrinolýze a sníženému počtu krevních destiček v důsledku krvácení nebo/a transfúzí). Krvácení se může také vyskytovat v orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha a oči; což jsou oblasti s omezenými možnostmi chirurgické hemostáze, a tedy s problémy při dosahování dostačující hemostáze. Podobné problémy mohou vyvstat u procesů odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, nádorová tkáň, trávicí trakt), stejně jako u laparoskopické operace a radikální retropubické prostatektomie. Pro všechny tyto situace je obvyklá obtížnost zajištění hemostáze chirurgickými technikami (šití, svorky aj.), což je obdobné v případě, kdy je krvácení difusní (hemoragická gastritida a profúzní děložní krvácení). Krvácení se také může vyskytovat u subjektů s antikoagulační terapií, u nichž byla defektní hemostáze vyvolána danou terapií; tato krvácení jsou často akutní a • * ·· profúzní. Antikoagulační terapie je často užívána pro prevenci tromboembolického onemocnění. Taková terapie může zahrnovat heparin, jiné formy proteoglykanů, warfarin nebo jiné formy antagonistů vitaminu K, stejně tak jako aspirin nebo jiné inhibitory agregace krevních destiček, jako jsou například protilátky nebo jiné inhibitory aktivity GP llb/llla. Krvácení může být také následkem tzv. trombolytické terapie, jež zahrnuje kombinovanou léčbu s antidestičkovým činidlem, (např. kyselina acetylsalicylová), antikoagulantem (např. heparinem), a fibrinolytickým činidlem (např. aktivátorem tkáňového plasminogenu, tPA). Krvácivé příhody také mají zahrnovat, bez omezení, nekontrolované a nadměrné krvácení ve spojení s operací nebo zraněním u subjektů s akutní hemartrózou (krvácení v kloubech), chronickou hemofilickou artropatií, hematomy, (např. svalovými, rertoperitoneálními, sublingválními a retrofaryngálními), krvácením v jiných tkáních, hematurií (krvácení renálního traktu), cerebrální hemoragií, u subjektů operovaných (např. hepatektomie), s dentální extrakcí, a krvácením trávícího traktu (např. krvácení UGI). Krvácivé příhody mohou být spojeny s inhibitory faktoru VII; hemofílií A; hemofílií A s inhibitory; hemofílií B; nedostatečností faktoru VII; nedostatečností faktoru V; trombocytopénií, nedostatečností von Willebrandova faktoru (von Willebrandova nemoc); závažnými tkáňovými poškozeními, závažnými zraněními, operacemi; laparoskopickými operacemi; hemoragickými gastritidami; odebíráním biopsií; antikoagulační terapií; krvácením horního trávicího traktu (UGI); nebo transplantací kmenových buněk. Krvácivé příhody mohou být profúzní děložní krvácení; může se vyskytovat v orgánech s omezenou možností mechanické hemostázy; v mozku; v oblasti vnitřního ucha; nebo v očích. Termíny „krvácivé příhody“ nebo „krvácení“ mohou být, pokud je to vhodné, používány zaměnitelně.

Termín „léčba“ v této souvislosti zamýšlí zahrnovat jak prevenci neočekávaného krvácení, jako je tomu například při operaci, tak regulaci již se vyskytujícího krvácení, jako je tomu například při zranění, s účelem inhibice nebo minimalizování krvácení. Výše uváděné „očekávané krvácení“ může být krvácení, jehož výskyt se očekává v konkrétních tkáních nebo orgánech, nebo to může být nespecifikované krvácení. Profylaktické podávání preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V je tak zahrnuto v termínu „léčba“.

Termín „subjekt“ používaný v tomto dokumentu zamýšlí znamenat jakéhokoli živočicha, obzvláště savce jako jsou lidé, a může být zaměnitelně používán, je-li to • · · ·♦ ·· ·· · ··· ··· ···

9 9 9 99 999 9 999 • 9 9999 9 9 99 999 9 999

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 99 99 9 vhodné, s termínem „pacient. Předmětný vynález také zahrnuje použití polypeptidů faktoru VII nebo příbuzných FVII, a tPA inhibitory v rámci veterinárních procedur.

Polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII a polypeptidy faktoru V nebo příbuzné faktoru V, tak, jak jsou definovány v předmětné specifikaci, mohou být podávány simultánně nebo postupně. Faktory mohou být doplňovány v samostatné dávkovači formě, kde samostatná dávkovači forma obsahuje oba koagulační faktory, nebo ve formě soupravy součástí obsahující preparát polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII jako první jednotková dávkovači forma a preparát polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V jako druhá jednotková dávkovači forma. Kdykoli je v této specifikaci zmíněna první nebo druhá nebo třetí, atd. jednotková dávka, neoznačuje to preferované pořadí dávek, je to dáno pouze pro evidenční účely.

„Simultánním“ podáváním preparátu polypeptidů faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V je míněno podání proteinů koagulačního faktoru v samostatné dávkovači formě, nebo podání prvního proteinu koagulačního faktoru následované podáním druhého proteinu koagulačního faktoru s časovou prodlevou ne delší než 15 minut, s výhodou 10, výhodněji 5, ještě výhodněji 2 minuty. Kterýkoli z faktorů může být podán jako první.

„Postupným podáváním je míněno podávání prvního proteinu koagulačního faktoru následované podáním druhého proteinu koagulačního faktoru s časovou prodlevou 2 hodin, výhodněji od 1 do 2 hodin, ještě výhodněji do 1 hodiny, ještě výhodněji od 30 minut do 1 hodiny, ještě výhodněji do 30 minut, ještě výhodněji od 15 minut do 30 minut. Kterákoli z obou jednotkových dávkovačích forem nebo proteinů koagulačního faktoru může být podána jako první. S výhodou jsou oba produkty injikovány stejným intravenózním vstupem.

„Hladinou faktoru V“ je míněna hladina aktivity faktoru V pacienta ve srovnání s hladinou u zdravých subjektů. Tato hladina je určena jako procento normální úrovně. Kde je to vhodné, mohou být termíny používány zaměnitelně.

„Snížením hladiny faktoru V“ je míněno snížení přítomnosti nebo aktivity faktoru V v krevním řečišti ve srovnání se střední hladinou faktoru V v populaci subjektů nemajících nedostatečnost faktoru V nebo inhibitory faktoru V. Hladina cirkulujícího faktoru V se může stanovovat buďto srážlivostním nebo imunologickým testem. Aktivita faktoru V se stanovuje schopností pacientovy plazmy korigovat srážecí čas faktor V deficitní plazmy (např. APTT testu, viz níže; viz též část „testy“ v předmětném popisu).

• · * · · · • · · · · · ··· • · ···· · · · · • · · 9 9 9 ·· 9 9 9 99

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

Jedna jednotka faktoru V se definuje jako množství faktoru V přítomné v 1 ml normální shromážděné lidské plazmy (odpovídající hladině faktoru V 100%).

Jedna jednotka faktoru VII se definuje jako množství faktoru VII přítomné v 1 ml normální plazmy, odpovídající přibližně 0,5 pg proteinu. Po aktivaci 50 jednotek odpovídá přibližně 1pg proteinu.

„Nedostatečností“ je míněno snížení přítomnosti nebo aktivity například faktoru V v plazmě ve srovnání s hodnotami u normálních zdravých jedinců. Termín může být, pokud je to vhodné, používán zaměnitelně se „sníženou hladinou faktoru V“.

„APTT“ nebo „aPTT“ je míněn aktivovaný dílčí tromboplastinový čas (popsaný např. v Proctor RR, Rapaport SI: The partial tromboplastin time with kaolin; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiences. Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961).

„Responzivním syndromem faktoru V“ je míněn syndrom, kdy exogenní faktor VII, výhodně faktor Vila, podávaný potřebnému subjektu, může předcházet, léčit nebo zmírňovat symptomy, okolnosti nemocí, ať už očekávaných nebo probíhajících, způsobených syndromem. Zahrnuty jsou, bez omezení, syndromy způsobené sníženou hladinou srážecích faktorů Vlil, IX, XI nebo VII, inhibitorů srážlivostního faktoru, defektní funkcí krevních destiček (např. Glanzmannova trombasténie a Bernardův-Soulierův syndrom), trombocytopénií, von Willebrandovou nemocí, a koagulopatií, jako je taková, jež je způsobena dilucí koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzou a sníženým počtem krevních destiček v důsledku krvácení nebo/a trnsfúzí (např. u subjektů s opakovanými transfúzemi, jež prodělaly operaci nebo zranění).

„Poločas“ se týká času potřebného pro snížení koncentrace polypeptidu faktoru Vil nebo příbuzného faktoru VII, nebo polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V v plazmě z konkrétní hodnoty na polovinu této hodnoty.

„Primární hemostázou“ se míní počáteční generace trombinu pomocí FXa a TF faktoru Vila, následná aktivace krevních destiček a vznik prvotní nepevné zátky aktivovaných, přilnutých destiček, které dosud nejsou stabilizované fibrinem a, nakonec, zesítěným fibrinem. Není-li zátka stabilizována fibrinem vzniklým během druhého stupně hemostatického procesu (udržená hemostáze), snadno se rozpouští fibrinolytickým systémem.

• * ·· · • 9 9 • · · 9 • 9 9999

9 9

9

9 9 • · ···

9 9 9 9

9 9 9

9

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9 „Sekundární hemostázou“ nebo „trvající hemostázou“ se míní sekundární, úplný a hlavní, nárůst nebo generace trombinu nastávající na povrchu aktivovaných destiček a katalyzovaný faktorem Vlila, následný vznik fibrinu a stabilizace počáteční destičkové sraženiny. Stabilizace zátek fibrinem vede k úplné hemostázi.

„Kompletní hemostázi“ se míní vznik stabilní a pevné fibrinové sraženiny nebo zátky na místě zranění, jež účinně zastavuje krvácení, a jež se nerozpouští snadno fibrinolytickým systémem. V této souvislosti bude termín hemostáze používán pro označení úplné hemostáze, jak je popsána výše.

Celkové množství proteinu v přípravku může být stanoveno obecně známými metodami, např. měřením optické hustoty. Množství proteinu faktoru V nebo faktoru VII („antigenu“) mohou být měřena obecně známými metodami jako je standardní ELISA. V obecných podmínkách je takový test prováděn například skontaktováním roztoku preparátu obsahujícího protein faktoru V s antitrombomodulinovou protilátkou imobilizovanou na ELISA destičce, následně kontaktováním imobilizovaného komplexu protilátky faktoru V s druhou protilátkou proti faktoru V nesoucí markér, jehož množství je potom ve třetím kroku měřeno. Množství každého koagulačního faktoru mohou být měřena podobným způsobem za použití příhodných protilátek. Celkové množství proteinu koagulačního faktoru v přípravku se stanovuje přidáním množství individuálních proteinů koagulačního faktoru. V jedné formě preparát obsahuje izolovaný koagulační faktor. V jiné formě je preparát v zásadě bez koagulačního faktoru II a koagulačního faktoru Ha (protrombinu a trombinu) nebo/a faktoru X nebo Xa.

Tak, jak je použit v tomto dokumentu, se termín „izolovaný“ týká koagulačních faktorů, např. polypeptidů faktoru V nebo příbuzného faktoru V, jež byly separovány z buněk, v nichž byly syntetizovány, nebo z média, v němž se přirozeně nacházejí (např. plazma nebo krev). Separace polypeptidů z buněk jejich původu může být provedena jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, odstranění média buněčné kultury obsahujícího žádaný produkt z adherentní buněčné kultury; centrifugace nebo filtrace pro odstranění neadherentních buněk, a podobně. Separace polypeptidů z média přirozeného výskytu může být dosažena jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, afinitní chromatografií, jako je například separace na koloně buď s anti-faktorem VII nebo s protilátkou k anti-faktoru VII; chromatografií hydrofobních interakcí; ionexovou chromatografií; vylučovací chromatografií, elektroforetickými procesy (např. preparativní isoelektrickou fokusací • · ·· · • · · • « · · • · ···· • · · ·· · ·· • · · • · ··* • · · · · • · · · • · · · ·· · • · · • · · · • · · ·· · • · * ·· · (IEF)), na základě rozdílné rozpustnosti (např. srážením v síranu amonném), extrakcí a podobně.

V mezích předmětného vynálezu je „účinné množství“ polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V definováno jako množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, např. FVIIa, a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, jež společně postačují k zabránění nebo omezení krvácení nebo krevní ztráty, a také k léčení, zmírnění nebo zastavení nemoci a jejích komplikací.

Termín „aktivita faktoru Vila“ zahrnuje schopnost generovat trombin; termín také zahrnuje schopnost generovat trombin na povrchu aktivovaných krevních destiček při absenci tkáňového faktoru.

Zkratky:
TF	tkáňový faktor
FVII	faktor VII ve své jednořetězcové, neaktivované formě
FVIIa	faktor VII ve své aktivované formě
rFVIIa	rekombinantní faktor VII ve své aktivované formě
TAFI	TAFI ve své zymogenní, neaktivované formě
Faktor V	faktor V ve své zymogenní, neaktivované formě
Faktor Va	faktor V ve své aktivované formě
rFaktor V	rekombinantní faktor V
rFaktor Va	rekombinantní faktor Va

Příprava sloučenin

Lidský čištěný faktor Vila vhodný pro použití v předmětném vynálezu se s výhodou připravuje rekombinantní DNA technologií, popsanou např. v Hagen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, nebo v evropském patentu č. 200421 (ZymoGenetics, lne.).

Faktor VII také může být připravován metodami popsanými v Brože a Majerus, J, Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 a v Hedner a Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Tyto metody poskytují faktor VII bez detegovatelných množství jiných krevních srážecích faktorů. A ještě čistší preparát faktoru VII může být získán ·· · ·· ·· 99 9 ·«· ··· · t· • ·· · 9 9 999 9 999

9 9999 99 99 999 9 999 OC 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

OJ 99 9 99 99 99 9 zahrnutím další gelové filtrace jako finálního purifikačního kroku. Faktor VII je potom konvertován na aktivovaný faktor Vila známými způsoby, např. pomocí odlišných plazmových proteinů, jako jsou faktory Via, IXa nebo Xa. Alternativně, jak je popsáno v Bjoern a kol. (Research Disclosure, 269 Sept. 1986, str. 564-565), může být faktor VII aktivován průchodem přes ionexovou chromatografickou kolonu, jako je Mono Q® (Pharmacia Fine Chemicals) a podobně.

Polypeptidy příbuzné faktoru VII mohou být připravovány modifikací divokého typu faktoru VII nebo rekombinantní technologií. Polypeptidy příbuzné faktoru VII s pozměněnou aminokyselinovou sekvencí ve srovnání s divokým typem mohou být připravovány modifikací sekvence nukleových kyselin kódující divoký faktor VII, buď změnou aminokyselinových kodónů nebo odstraněním některého z aminokyselinových kodónů v nukleové kyselině kódující přirozený faktor VII známými prostředky, např. místně specifickou mutagenezí.

Osobám zběhlým v oboru bude zřejmé, že mohou být provedeny substituce mimo oblasti kritické pro funkce molekul faktoru Vila nebo faktoru V a stále je výsledkem aktivní polypeptid. Zbytky aminokyselin nepostradatelné pro aktivitu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, a tedy pokud možno nevystavené substituci, mohou být identifikovány pomocí procedur známých v oboru, jako je místně řízená mutageneze nebo mutageneze alaninového skenu (viz např. Cunningham a Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). V posledně jmenované technice jsou mutace zaváděny na místo každého pozitivně nabitého zbytku v molekule, a výsledné mutované molekuly se testují na svou koagulační či zesíťovací aktivitu, čímž jsou identifikovány zbytky aminokyselin kritické pro aktivitu molekuly. Polohy inerakce enzym - substrát mohou být také určeny analýzou třídimenzionální struktury determinované takovými technikami jako je nukleární magnetická resonance, krystalografie nebo fotoafinitní značení (viz. např. de Vos a kol., 1992, Science 255: 306-312;, Smith a kol., 1992,

Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver a kol., 1992, FEBS Letters 309:

59-64).

Zavedení mutace do sekvence nukleových kyselin za účelem zaměnit jeden nukleotid jiným nukleotidem může být usutečněno místně řízenou mutagenezí používající jakoukoli z metod známých v oboru. Obzvláště výhodná je procedura používající super stočený, dvouvláknový DNA vektor se zájmovou inzercí a dva syntetické primery obsahující požadovanou mutaci. Oligonukleotidové primery, »· · ·* ·· « · « · · « • ··· · ···· • · ···· * · · · · ♦ « · « · · · · ·· · ·· ·· ·· · • 9 9

9 9 9

9 99 9

9 9

9 9 každý z nich komplementární k protilehlým vláknům vektoru, se prodloužují během tepelné cyklizace pomocí Pfu DNA polymerázy. Při vkládání těchto primerů vzniká mutovaný plazmid obsahující uspořádané zářezy. Po teplotním cyklování se na produkt působilo Dpnl specifickým pro methylovanou a hemimethylovanou DNA, aby byl stráven parentální templát DNA a vybrána syntetizovaná DNA obsahující mutaci. Pro vznik, identifikaci a izolaci variant mohou být použity i další procedury známé v oboru, jako jsou například technika gene shuffling nebo fágového displeje.

Separace polypeptidů z buněk jejich původu může být provedena jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, odstranění média buněčné kultury obsahujícího žádaný produkt z adherentní buněčné kultury; centrifugace nebo filtrace pro odstranění neadherentních buněk, a podobně.

Volitelně mohou být polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII dále čištěny. Čištění může být dosaženo jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, afinitní chromatografií, jako je například separace na koloně s protilátkou k anti-faktoru VII (viz např. Wakabayashi a kol., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; a Thim a kol., Biochem. 27:7785, 1988); chromatografií hydrofobních interakcí; ionexovou chromatografií; vylučovací chromatografií, elektroforetickými procesy (např. preparativní isoelektrickou fokusací (IEF)), na základě rozdílné rozpustnosti (např. srážením v síranu amonném), extrakcí a podobně. Viz obecně Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; a Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. Po čištění preparát výhodně obsahuje méně než 10% hmotnostních, výhodněji méně než 5% hmotnostních a nejvýhodněji méně než 1% hmotnostní látek, jež nejsou polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII, získaných z hostitelské buňky.

Polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII mohou být získány proteolytickým štěpením za použití faktoru Via nebo jinými proteázami majícími trypsinovou specificitu, jako je např. faktor IXa, kallikrein, faktor Xa, a trombin. Viz např. Osterud a kol., Biochem. 11:2853 (1972), Thomas, US patent č. 4456591; Hedner a kol., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983). Alternativně mohou být polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII aktivovány průchodem přes ionexovou chromatografickou kolonu, jako je Mono Q® (Pharmacia Fine Chemicals) a podobně. Vzniklé polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII mohou potom být připravovány a podávány tak, jak je popsáno níže.

*· 9

9 9 9 9 9 9 9 9 • 999 9 9 999 · » fc · • ····· 99 99 999 9 9999

ΟΎ · · · 9 9 9 9 9 9 9

Ol 99 9 9999 999

Faktor V pro použití v rámci předmětného vynálezu může být izolován z plazmy pomocí známých metod, jako jsou ty popsané v Katzmann a kol., Proč. Nati.

Acad. Sci. USA, 78: 162, 1981. Je však výhodné používat rekombinantní faktor V s cílem vyhnout se použití produktů získaných z krve nebo tkáně, jež přinášejí riziko přenosu nemoci. Metody přípravy rekombinantního faktoru V jsou v oboru známé; víz např. Kane a Davie, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 6800, 1986. Aktivovaný faktor V je popsán např. v Esmon, J. Biol. Chem. 254: 964-973, 1979; Nesheim a kol., J. Biol.

Chem. 254: 1326-1334, 1979; Suzuki akol., J. Biol. Chem. 257: 6556-6564, 1982; Nesheim a kol., J. Biol. Chem. 259: 3187-3196, 1984a; a Jenny a kol., Proč. Nati.

Acad. Sci. 84: 4846, 1987. Varianty faktoru V mohou být produkovány pomocí místně specifické mutageneze, jak je popsáno níže.

Polypeptidy příbuzné faktoru V mohou být produkovány modifikací divokého typu faktoru V nebo rekombinantní technologií. Polypeptidy příbuzné faktoru V mohou být produkovány modifikací sekvence nukleových kyselin kódující divoký faktor V, buď změnou aminokyselinových kodónů nebo odstraněním některého z aminokyselinových kodónů v nukleové kyselině kódující přirozený faktor V známými prostředky, např. místně specifickou mutagenezí, jak je detailněji popsáno níže. Separace polypeptidů z buněk jejich původu může být provedena jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, odstranění média buněčné kultury obsahujícího žádaný produkt z adherentní buněčné kultury; centrifugace nebo filtrace pro odstranění neadherentních buněk, a podobně. Volitelně mohou být polypeptidy faktoru V nebo příbuzné faktoru V dále čištěny. Čištění může být dosaženo jakoukoli metodou známou v oboru, včetně, bez omezení, afinitní chromatografií, jako je například separace na koloně s protilátkou k anti-faktoru V; chromatografií hydrofobních interakcí; ionexovou chromatografií; vylučovací chromatografií, elektroforetickými procesy (např. preparativní isoelektrickou fokusací (IEF)), na základě rozdílné rozpustnosti (např. srážením v síranu amonném), extrakcí a podobně, jak je podrobněji popsáno výše. Po čištění preparát výhodně obsahuje méně než 10% hmotnostních, výhodněji méně než 5% hmotnostních a nejvýhodněji méně než 1% hmotnostní polypeptidů jiných než faktoru V nebo příbuzných faktoru V, získaných z hostitelské buňky. Vzniklé polypeptidy faktoru V nebo příbuzné faktoru V mohou potom být připravovány a podávány tak, jak je popsáno níže.

Jak ocení osoby zběhlé v oboru, je výhodné používat polypeptidy faktoru VII syngenicky se subjektem s cílem redukovat riziko vzbuzení imunitní odpovědi.

·· · ·* ·* ·» « • · * · · · «·· • * « · · · ··· · · · · • · ···· ·· ·· · · · · • · · ·«·«*·· ·· · ·· ·φ ·· «

Příprava a charakterizace jiného než lidského faktoru V je popsáno například v Katzmann a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78: 162-166, 1981. Předmětný vynález také zahrnuje použití takových proteinů faktoru V a faktoru Va v rámci veterinárních procedur.

Farmaceutické prostředky a metody použití

Preparáty předmětného vynálezu mohou být použity k léčbě jakéhokoli responzivního syndromu faktoru VII, jako jsou např. poruchy krvácivostí zahrnující, ale neomezují se na, syndromy způsobené sníženou hladinou srážlivostních faktorů Vlil, IX, XI nebo VII, inhibitorů srážlivostního faktoru, defektní funkci krevních destiček (např. Glanzmannova trombasténie a Bernardův-Soulierův syndrom), trombocytopénii, von Willebrandovu nemoc, a koagulopatii, jako je taková, jež je způsobena dilucí koagulačních proteinů, zvýšenou fibrinolýzu a sníženým počtem krevních destiček v důsledku krvácení nebo/a trnsfúzí (např. u subjektů s opakovanými transfúzemi, jež prodělaly operaci nebo zranění).

Farmaceutické prostředky obsahující preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a preparát polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V podle předmětného vynálezu jsou primárně určeny pro parenterální podávání pro profylaktickou nebo/a terapeutickou léčbu. S výhodou jsou farmaceutické příklady podávány parenterálně, tj intravenózně, subkutanózně anebo intramaskulárně, přičemž podávání intravenózně je nejvýhodnější. Také mohou být podávány kontinuální nebo pulzatilní infuzí.

Farmaceutické prostředky a lékové formy podle předmětného vynálezu zahrnují polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, buď připravované v samostatné jednotkové dávkovači formě nebo ve formě soupravy součástí, s výhodou rozpouštěné ve farmaceuticky přijatelném nosiči, s výhodou ve vodném nosiči nebo ředidle. Stručně řečeno jsou farmaceutické prostředky vhodné pro použití podle předmětného vynálezu připravovány míšením polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, nebo faktoru V, nebo polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII v kombinaci s faktorem V, s výhodou v čištěné formě, s vhodnými adjuvans a vhodnými nosiči nebo ředidly. Může být použita široká škála vodných nosičů, jako je voda, pufrovaná voda, 0,4% solný roztok, 0,3% glycin a podobně. Preparáty tohoto vynálezu mohou být • ··· také připravovány za použití nevodných nosičů, jako je tomu např. ve formě gelu nebo jako lipozómové preparáty pro dopravu nebo zacílení na místa zranění. Lipozómové preparáty jsou obecně popsány např. v US patentech č. 4837028, 4501728, a 4975282. Přípravky mohou být sterilizovány konvenčními, dobře známými sterilizačními technikami. Vzniklé vodné roztoky mohou být pro použití baleny nebo filtrovány za aseptických podmínek a lyofilizovány, lyofilizované preparáty se míchají se sterilním vodným roztokem před podáváním.

Kompozice mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky nebo adjuvans, včetně, bez omezení, činidel pro nastavování pH a pufrování, nebo/a činidel pro nastavování tonicity, jako jsou například octan sodný, mléčnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd.

Lékové formy mohou zahrnovat jeden nebo více ředitel, emulgátorů, konzervačních látek, pufrů, masťových základů atd. a mohou být zajišťovány v takových formách jako jsou kapaliny, prášky, emulze, kontrolované uvolňování, atd. Osoba zběhlá v oboru může připravovat prostředky podle předmětného vynálezu vhodným způsobem a ve shodě s akceptovanou praxí, jak je popsáno v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Takto lze připravit typický farmaceutický prostředek pro intravenózní infúzi, obsahující 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg preparátu.

Prostředek obsahující preparát podle předmětného vynálezu může být podáván pro profylaktickou nebo/a terapeutickou léčbu. U terapeutických aplikací se prostředky podávají subjektu již trpícímu nemocí, jak je popsáno výše, v množství postačujícím pro léčení, zmírnění nebo částečné zastavení klinických manifestací nemoci a jejích komplikací. Množství adekvátní pro dosažení tohoto stavu se definuje jako „terapeuticky účinné množství“. Účinné množství pro každý účel závisí na závažnosti nemoci nebo zranění, stejně jako na váze a celkovém stavu subjektu. Rozumí se, že určení vhodné dávky lze provést použitím rutinních experimentů, sestavením matrice hodnot a testováním různých bodů v matrici.

Lokální dodání preparátu podle předmětného vynálezu, jako je například místní aplikace, může být provedeno například sprejem, perfúzí, dvoubalónkovým katetrem, stentem, vložením do vaskulárních roubů nebo stentů, hydrogelú použitých pro potahování balónkových katetrů, nebo jiných dobře zavedených metod. V každém případě mají farmaceutické prostředky zajišťovat takové množství varianty preparátu, jež je dostatečné pro efektivní léčbu stavu.

e · • ·

·........

Koncentrace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, nebo polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII v kombinaci s polypeptidem faktoru V nebo příbuzným faktoru V v tomto přípravku se může široce měnit, tj. od méně než 0,5% hmotnostních, obvykle nejméně od 1% hmotnostního, až do 15 nebo 20% hmotnostních, a vybírají se primárně podle objemu kapalin, viskozit, atd., ve shodě se zvoleným způsobem podávání. Výhodné je podávání injekčně nebo infúzí, obzvláště injekčně. Polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V se tedy připravuje ve formě vhodné pro intravenózní podávání, jako je preparát, jímž je buď rozpuštěný lyofilizát, anebo kapalná léková forma obsahující jak polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII, tak polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V v jedné dávkovači formě, nebo rozpuštěný lyofilizát nebo kapalná léková forma obsahující polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII v jedné dávkovači formě, a rozpuštěný lyofilizát nebo kapalná léková forma obsahující polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V v jiné dávkovači formě.

Rozumí se, že množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a množství polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V dohromady obsahují úhrnné účinné množství pro léčbu krvácivých příhod.

Je třeba mít na paměti, že látky podle předmětného vynálezu mohou obecně být využity při stavech vážného onemocnění nebo zranění, tedy v situacích ohrožujících život nebo potencionálně ohrožujících život. V takových případech, se zřetelem k minimalizaci cizorodých látek a všeobecnému nedostatku imunogenicity faktoru Vila a faktoru V u lidí, je možné a ošetřujícím lékařem může být pociťováno jako žádoucí podávat značný nadbytek přípravku.

U profylaktických aplikací se podává prostředek obsahující preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a preparát polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V subjektům v podezření nebo jinak v nebezpečí stavu nemoci nebo zranění, jež může zvýšit vlastní koagulaění schopnost subjektu. Takové množství se definuje jako „profylakticky účinná dávka“. Rozumí se, že množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a množství polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V dohromady obsahují úhrnné účinné množství pro léčbu krvácivých příhod.

Jednorázové nebo vícenásobné podávání prostředku může být prováděno s hladinou nebo způsobem dávky zvolenými ošetřujícím lékařem. Prostředek může být • · podáván jedenkrát nebo vícekrát denně nebo týdně. Účinné množství takového farmaceutického prostředku je množství, jež zajišťuje klinicky významný účinek na krvácivé příhody. Tato množství částečně závisejí na specifických podmínkách léčby, věku, váze a obecném zdravotním stavu subjektu, a na dalších faktorech zřejmých osobám zběhlým v oboru.

Prostředek podle vynálezu se obecně podává v samostatné dávce před očekávaným krvácením nebo při začátku krvácení. Může však být podávána opakovaně (ve vícenásobných dávkách), s výhodou s intervaly 2-4-6-12 hodin, v závislosti na dané dávce a stavu subjektu.

Pro léčbu ve spojení s uvážovanými zásahy se polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V typicky podává během 24 hodin před provedením zásahu, a až po 7 dní nebo více po zásahu. Podávání jakožto koagulantu může být provedeno množstvím způsobů, jak je v tomto dokumentu popsáno.

Prostředek může být ve formě samostatného preparátu (samostatné dávkovači formy) obsahujícího jak preparát z preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, tak preparát z preparátu polypeptidu faktoru V nebo vztahujícího se k faktoru V, ve vhodných koncentracích. Prostředek také může být ve formě soupravy součástí sestávající z první jednotkové dávkovači formy obsahující preparát z preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a z druhé jednotkové dávkovači formy obsahující preparát z preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V. V takovém případě se mají polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávat jeden po druhém, s výhodou během 15 minut navzájem, například během 10 minut navzájem, nebo s výhodou během 5 minut navzájem, nebo výhodněji během 10 minut navzájem. Kterákoli ze dvou jednotkových dávkovačích forem může být podána jako první.

Souprava zahrnuje nejméně dva samostatné farmaceutické prostředky. Souprava zahrnuje přepravní prostředek pro udržení samostatných kopozic jako jsou dělené lahve nebo dělený fóliový balíček. Souprava typicky zahrnuje instrukce pro podávání samostatných komponent. Forma soupravy je obzvláště výhodná, tehdy, jsou-li samostatné komponenty s výhodou podávány v odlišných dávkovačích formách, podávány v odlišných dávkovačích intervalech, nebo je-li předepisujícím lékařem požadována titrace jednotlivých komponent kombinace.

• · · · · « · • ·

Množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a množství polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V podávané podle předmětného vynálezu se mohou měnit od poměru mezi 1:100 do 100:1 (w/w). Poměr faktoru VII vzhledem k faktoru V může tak například být přibližně 1:100, nebo 1:90, nebo 1:80, nebo 1:60, nebo 1:50, nebo 1:40, nebo 1:30, nebo 1:20, nebo 1:10, nebo 1:5, nebo 1:2, nebo 1:1, nebo 2:1, nebo 5:1, nebo 10:1, nebo 20:1, nebo 30:1, nebo 40:1, nebo 50:1, nebo 60:1, nebo 70:1, nebo 80:1, nebo 90:1, nebo 100:1; nebo mezi 1:90 do 1:1, nebo mezi 1:80 do 1:2, nebo mezi 1:70 do 1:5, nebo mezi 1:60 do 1:10, nebo mezi 1:50 do 1:25, nebo mezi 1:40 do 1:30, nebo mezi 90:1 do 1:1, nebo mezi 80:1 do 2:1, nebo mezi 70:1 do 5:1, nebo mezi 60:1 do 10:1, nebo mezi 50:1 do 25:1, nebo mezi 40:1 do 30:1.

Dávka polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII se mění od hodnot odpovídajících přibližně 0,05 mg do 500 mg/den divokého typu faktoru VII, např. od 1 mg do 200 mg/den, nebo např. od 1 mg do 175 mg/den u 70 kg subjektu jako iniciační a udržovací dávky, v závislosti na váze subjektu a závažnosti podmínek.

Kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V vykazuje synergický efekt v testu stanovení srážecího času in vitro.

Prostředek může být ve formě samostatného preparátu obsahujícího jak polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII, tak polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V, ve vhodných koncentracích. Prostředek také může být ve formě soupravy součástí sestávající z první jednotkové dávkovači formy obsahující polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII, a z druhé jednotkové dávkovači formy obsahující polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V. V takovém případě se mají polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávat jeden po druhém, s výhodou během 1-2 hodin navzájem, například během 30 minut navzájem, nebo s výhodou, během 10 minut navzájem, nebo výhodněji během 5 minut navzájem. Kterákoli ze dvou jednotkových dávkovačích forem může být podána jako první.

Jestliže se předmětný vynález vztahuje na prevenci nebo léčbu krvácivých příhod nebo koagulační léčbu, a to léčbou s kombinací aktivních ingrediencí, jež mohou být podávány samostatně, vztahuje se vynález také na kombinování samostatných farmaceutických prostředků ve formě soupravy. Souprava obsahuje nejméně dva samostatné farmaceutické prostředky. Souprava zahrnuje přepravní • · • · • · prostředek pro udržení samostatných kopozic jako jsou dělené lahve nebo dělený fóliový balíček. Souprava typicky zahrnuje instrukce pro podávání samostatných komponent. Forma soupravy je obzvláště výhodná tehdy, jsou-li samostatné komponenty s výhodou podávány v odlišných dávkovačích formách, podávány v odlišných dávkovačích intervalech, nebo je-li předepisujícím lékařem požadována titrace jednotlivých komponent kombinace.

Testy:

Test aktivity faktoru Vila:

Vhodný test pro testování aktivity faktoru Vila a tedy zvolení vhodných variant faktoru Vila může být prováděn jako jednoduchý předběžný test in vitro·.

Hydrolyticky test in vitro

Přirozený (divoký typ) faktor Vila a varianta faktoru Vila (obě jsou zde níže označovány jako „faktor Vila“) mohou být testovány na své specifické aktivity. Také mohou být testovány paralelně pro přímé porovnání jejich specifických aktivit. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Chromogenní substrát D-lle-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Sweden), finální koncentrace 1 mM, se přidává k faktoru Vila (finální koncentrace 100 nM) v 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícímu 0,1 M NaCI, 5 mM CaCI₂ a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na přístroji SpectraMax™ se sledováním 340 pozic na destičce (Molecular Devices, USA). Absorbance dosažená během 20 minutové inkubace, po odečtení absorbance v jamce blanku neobsahující enzym, se používá pro výpočet poměru mezi aktivitami varianty a divokého typu faktoru Vila:

Poměr = (A405 nm varianty faktoru Vlla)/(A4os nm divokého typu faktoru Vila).

Na tomto základě mohou být varianty faktoru Vila s aktivitou srovnatelnou nebo vyšší než u přirozeného faktoru Vila ztotožněny například s takovými variantami, kde poměr mezi aktivitou varianty a aktivitou přirozeného faktoru VII (divoký typ FVII) je okolo nebo nad 1,0.

• ·

Aktivita faktoru Vila nebo variant faktoru Vila může být také měřena za použití fyziologického substrátu jako je faktor X, vhodně v koncentraci 100 - 1000 nM, kde je vzniklý faktor Xa měřen po přidání vhodného chromogenního substrátu (např.

S-2765). Navíc může být aktivitní test prováděn při fyziologické teplotě.

Proteolyticky test in vitro

Přirozený (divoký typ) faktoru Vila a varianty faktoru Vila (obě jsou zde níže označovány jako „faktor Vila“) se testují paralelně pro přímé porovnání jejich specifických aktivit. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Faktor Vila (10 nM) a faktor X (0,8 μΜ) ve 100 μΙ 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím 0,1 M NaCI, 5 mM CaCk a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu se inkubují 15 minut. Štěpení faktoru X se pak zastaví přidáním 50 μΙ 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím 0,1 M NaCI, 20 mM EDTA a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Množství vzniklého faktoru X se měří přidáním chromogenního substrátu Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilidu (S-2765, Chromogenix, Sweden), finální koncentrace 0,5 mM. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na přístroji SpectraMax™ se sledováním 340 pozic na destičce (Molecular Devices, USA). Absorbance dosažená během 10 minutové inkubace, po odečtení absorbance v jamce blanku neobsahující FVIIa, se používá pro výpočet poměru mezi aktivitami varianty a divokého typu faktoru Vila:

Poměr = (A405 nm varianty faktoru Vlla)/(A4os nm divokého typu faktoru Vila).

Test generace trombinu:

Schopnost polypeptidů faktoru VII nebo příbuzných faktoru VII nebo polypeptidů (např. variant) faktoru V nebo příbuzných faktoru V generovat trombin se může měřit testem skládajícím se za všech podstatných koagulačních faktorů a inhibitorů ve fyziologické koncentraci a aktivovaných krevních destiček (jak je • · • · · · · » · · · · · • · · · * · · · · · • ······· ·· · · ·

Λίζ »· · ···· · *tw «» · ·· ·· · · popsáno na str. 543 v Monroe a kol., (1997) Brit J. Haematol. 99, 542-547, popsaném zde v referenci).

Test aktivity faktoru V:

Polypeptidy faktoru V použitelné podle předmětného vynálezu mohou být zvoleny pomocí vhodných testů, jež mohou být prováděny jako jednoduché předběžné testy in vitro, jako je například srážecí test popsáný např. v Thorelli a kol., Thromb. Haemost. 80: 92, 1998 („testu faktoru V“).

Předmětný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nemají být vykládány jako omezující rozsah ochrany. Body popsané v následujícím popisu a v následujících příkladech mohou být, buď separátně nebo v jakékoli jejich kombinaci, materiálem pro realizaci vynálezu v jeho rozmanitých formách.

·· * • *

PŘÍKLADY

Příklad 1

METODY:

Srážlivostní test: Alokvóty (55μΙ) FVIIa (1 pg/ml) v 50 mM Pipes, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1% BSA, pH 7,2, se inkubují po dobu 5 min. s 55 μΙ alikvótu obsahujícího 100 μΜ PC/PS vesikula a 50 mM CaCb ve stejném pufru. Pak se přidá 55 μΙ alikvótu buďto normální lidské plazmy (NHP) nebo faktor VII deficitní plazmy (FVIII-DP) a následuje srážení po dobu 400 sec. v ACL srážecím stroji za použití standardního programu APTT. Pokud dojde k indikaci, je obsažen faktor V (30 nM).

VÝSLEDKY:

Srážlivostní test: Před přidáním faktoru Vila nebo faktoru V NHP ani FVIII-DP nesráží během 400 sec. monitorovacího času. Přidání faktoru Vila (1 pg/ml) redukuje srážecí čas na 184,0 ±1,1 sec. v NHP a 126,6 ± 3,1 sec. v FVIII-DP (obr. 1). Přidání jak faktoru Vila (1 pg/ml) tak faktoru V (30 nM) redukuje srážecí čas na 116,2 ± 0,8 sec. v NHP a 109,8 ± 1,41 sec. v FVIII-DP (obr. 1).

• · · • · ·

99

9

9 9

9 9 9 • · ···· • · ♦

9 9

ZÁVĚR:

Tyto výsledky prokazují, že přidání faktoru Vila a faktoru V k plazmě synergickým způsobem zkracuje srážecí čas normálního a FVIII-DP.

• · • · · * · · · • ·

Průmyslová využitelnost

Předmětný vynález může být využit pro přípravu farmaceutických prostředků zahrnujících polypeptidy faktoru VII nebo příbuzné faktoru VII nebo polypeptidy faktoru V nebo příbuzné faktoru V. Vynález také může být využit pro použití kombinace polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V pro výrobu léku pro léčbu subjektů trpících krvácivými příhodami, nebo pro jejich prevenci. Vynález také může být využit pro metodu léčby krvácivých příhod subjektů a pro metodu usnadňování vzniku sraženiny u subjektů.

Claims

Patentové nároky

1. Farmaceutický prostředek obsahující polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII, a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V.
2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je polypeptid příbuzný faktoru VII.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, kde polypeptid příbuzný faktoru VII je varianta aminokyselinové sekvence faktoru VII.
4. Farmaceutický prostředek podle nároku 2 nebo nároku 3, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila (divokého typu FVIIa) je nejméně přibližně 1,25 při testování v „hydrolytickém testu in vitro“, jak je uvedeno v příslušném popise.
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je faktor VII.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5, kde faktor VII je lidský faktor VII.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, kde faktor VII je rekombinantní lidský faktor VII.
8. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je ve své aktivované formě.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, kde faktor VII je rekombinantní lidský faktor Vila.
10. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, kde polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V je polypeptid příbuzný faktoru V.

• · · • ···· ·· ♦ · • · · • ♦ ··♦ • · · ·· · • · • · · • ···
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, kde polypeptid příbuzný faktoru V je varianta aminokyselinové sekvence faktoru V.
12. Farmaceutický prostředek podle nároku 10 nebo nároku 11, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru V a aktivitou přirozeného lidského faktoru V (divokého typu faktoru V) je nejméně přibližně 1,25 při testování v „testu faktoru V“, jak je uvedeno v příslušném popise.
13. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, kde polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V je polypeptid faktoru V.
14. Farmaceutický prostředek podle nároku 13, kde faktor V je lidský faktor V.
15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14, kde faktor V je faktor V získaný z krevních destiček nebo plazmy.
16. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 nebo nároku 15, kde faktor V je rekombinantní lidský faktor V.
17. Farmaceutický prostředek podle nároku 16, kde faktor V je rekombinantní lidský aktivovaný faktor V.
18. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 17, kde jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V v poměru hmotností mezi 100:1 a 1:100 (w/w faktor Vlkfaktor V).
19. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 18, kde prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelné masťové základy vhodné pro injekce a infúzi, zvláště infúzi.

·· · • · · • · · · • · · · · · • ♦ · ·« »· • · · • · ·♦ · • · · • » · <· *· ·· ♦ · • · · • ··· • ♦ *
20. Souprava součástí obsahující součásti pro léčebný postup krvácivých příhod zahrnující

a) Účinné množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a farmaceuticky přijatelný nosič v první jednotkové dávkovači formě;

b) Účinné množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V a farmaceuticky přijatelný nosič v druhé jednotkové dávkovači formě;

c) Přepravní prostředek pro podržení první a druhé dávkovači formy.
21. Souprava podle nároku 20, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je polypeptid příbuzný faktoru VII.
22. Souprava podle nároku 20, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII jsou varianty aminokyselinové sekvence faktoru VII.
23. Souprava podle nároku 21 nebo nároku 22, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu příbuzného faktoru VII a aktivitou přirozeného lidského faktoru Vila (divokého typu faktoru FVIIa) je nejméně přibližně 1,25 při testování v „hydrolytickém testu in vitro“, jak je uvedeno v příslušném popise.
24. Souprava podle nároku 20, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je faktor VII.
25. Souprava podle nároku 24, kde faktor VII je lidský faktor VII.
26. Souprava podle nároku 25, kde polypeptid faktoru VII je rekombinantní lidský faktor VII.
27. Souprava podle kteréhokoli z nároků 20 až 26, kde polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII je ve své aktivované formě.
28. Souprava podle nároku 27, kde faktor VII je rekombinantní lidský faktor Vila.
29. Souprava podle kteréhokoli z nároků 20 až 28, kde polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V je polypeptid příbuzný faktoru V.

• 9 • 9 9 9 9

9 9999

999 ·· • · • · · • 9999 9 9
30. Souprava podle nároku 29, kde polypeptid příbuzný faktoru V je varianta aminokyselinové sekvence faktoru V.
31. Souprava podle nároku 29 nebo nároku 30, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu vztahujícího se k faktoru V a aktivitou přirozeného lidského faktoru V (divokého typu faktoru V) je nejméně přibližně 1,25 při testování v „testu faktoru V“, jak je uvedeno v příslušném popise.
32. Souprava podle kteréhokoli z nároků 20 až 28, kde polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V je faktor V.
33. Souprava podle nároku 32, kde faktor V je lidský faktor V.
34. Farmaceutický prostředek podle nároku 33, kde faktor V je faktor V získaný z krevních destiček nebo plazmy.
35. Farmaceutický prostředek podle nároku 33 nebo nároku 34, kde faktor V je rekombinantní lidský faktor V.
36. Farmaceutický prostředek podle nároku 35, kde faktor V je rekombinantní lidský aktivovaný faktor V.
37. Souprava podle kteréhokoli z nároků 20 až 36, kde jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V v poměru hmotností mezi 100:1 a 1:100 (w/w faktor VII:faktor V).
38. Použití polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII v kombinaci s polypeptidem faktoru V nebo příbuzným faktoru V pro výrobu léku pro léčení krvácivých příhod.
39. Použití farmaceutického prostředku podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 pro výrobu léku pro léčení krvácivých příhod.

• · ···· ·· ·« • · · • · ··· • · · * • ♦ · · ♦ · ·· • · • · · • ···« • · ♦
40. Použití podle nároku 38 nebo nároku 39, kde lék slouží pro zkrácení srážecího času.
41. Použití podle nároku 38 nebo nároku 39, kde lék slouží pro prodloužení času lýzy sraženiny.
42. Použití podle nároku 38 nebo nároku 39, kde lék slouží pro zvýšení pevnosti sraženiny.
43. Použití podle nároku 38 nebo nároku 39, kde se lék připravuje pro injekce nebo infúze, obzvláště injekce.
44. Použití podle kteréhokoli z nároků 38 až 43, kde jsou krvácivé příhody důsledkem zranění, operace, nebo sníženého počtu nebo aktivity krevních destiček.
45. Použití podle kteréhokoli z nároků 38 až 43, kde jsou krvácivé příhody důsledkem sníženého množství nebo aktivity koagulačních faktorů Vlil nebo IX nebo von Willebrandova faktoru.
46. Použití podle kteréhokoli z nároků 38 až 45, kde je lék v samostatné dávkovači formě.
47. Použití podle kteréhokoli z nároků 38 až 45, kde se lék připravuje ve formě první jednotkové dávkovači formy zahrnující preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhé jednotkové dávkovači formy zahrnující preparát polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V.
48. Metoda pro léčbu krvácivých příhod u subjektu, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství dohromady jsou účinné množství pro léčbu krvácení.

·♦ • · • · · • ···· • ♦ * ·· · • · · • · ··· • · · · * • 9 9 9

99 99

9 9 9

9 9 9 9 • · ···* • · · ·· *
49. Metoda pro redukci srážecího času u subjektu, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství dohromady jsou účinné pro redukci srážecího času.
50. Metoda pro zvýšení hemostáze u subjektu, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného k faktoru V, kde první a druhé množství dohromady jsou účinné pro zvýšení hemostáze.
51. Metoda pro prodloužení času lýzy sraženiny u subjektu, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství dohromady jsou účinné pro prodloužení času lýzy sraženiny.
52. Metoda pro zvýšení pevnosti sraženiny u subjektu, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu prvního množství preparátu polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a druhého množství preparátu polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V, kde první a druhé množství dohromady jsou účinné pro zvýšení pevnosti sraženiny.
53. Metoda podle kteréhokoli z nároků 48 až 52, kde jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány v samostatné dávkovači formě.
54. Metoda podle kteréhokoli z nároků 48 až 52, kde jsou polypeptid faktoru VII nebo příbuzný faktoru VII a polypeptid faktoru V nebo příbuzný faktoru V podávány ve formě první dávkovači formy obsahující preparát polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII, a druhé dávkovači formy obsahující preparát polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V.

• · · • ··· · • · · · · • · · · ·· · • · • · · • ··· • ♦
55. Metoda podle nároku 54, kde jsou první dávkovači forma a druhá dávkovači forma podávány s časovou prodlevou ne delší než 15 minut.
56. Souprava součástí obsahující součásti pro léčebný postup krvácivých příhod zahrnující

a) Účinné množství polypeptidu faktoru VII nebo příbuzného faktoru VII a účinné množství polypeptidu faktoru V nebo příbuzného faktoru V a farmaceuticky přijatelný nosič v samostatné jednotkové dávkovači formě; a

b) Přepravní prostředek pro podržení samostatné jednotkové dávkovači formy.