KR20050043734A - 인자 ⅶ 폴리펩티드와 인자 ⅴ 폴리펩티드를 포함하는약제적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드, 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드와 응고 시간을 감소, 지혈을 향상 또는 응혈 강도를 증가시키는 것과 같은 출혈 에피소드를 치료하기 위한 이들의 사용을 포함하는 조성물과 관련된다.

Description

인자 Ⅶ 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 폴리펩티드를 포함하는 약제적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING FACTOR VII POLYPEPTIDES AND FACTOR V POLYPEPTIDES}

본 발명은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드를 포함하는 약제적 조성물과 관련된다. 본 발명은 또한 출혈 에피소드를 겪는 대상자의 치료 또는 이것의 예방을 위한 약물을 제조하기 위한 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 조합을 사용하는 것과 관련된다. 본 발명은 또한 대상자에서 출혈 에피소드를 치료하기 위한 방법과 대상자에서 응혈 형성을 향상시키기 위한 방법과 관련된다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 키트와 관련된다.

지혈은 혈관 벽의 손상 후에 순환하는 혈액에 노출된 조직 인자(TF)와 전체 Ⅶ 단백질 양의 약 1%에 대응하는 양으로 혈액에 존재하는 FⅦa 사이의 복합체의 형성으로 시작한다. 이 복합물은 TF 보유 세포에 고정되고 세포 표면에서 FX를 FXa로, FIX 를 FIXa로 활성화시킨다. FXa는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하고 트롬빈은 FⅧ, FV, FXI, FXIII를 활성화시킨다. 그리고, 지혈의 초기 단계에서 형성된 트롬빈의 제한된 양은 또한 혈소판을 활성화시킨다. 혈소판에서 트롬빈이 작용한 후에, 혈소판은 형태를 변경하고 표면에서 전하를 띤 인지질을 노출시킨다. 이 활성화된 혈소판 표면은 추가 FX 활성화와 완전한 트롬빈 생성에 대한 주형을 형성한다. 활성화된 혈소판 표면에서 추가 FX 활성화는 활성화된 혈소판의 표면에서 형성된 FIXa-FⅦl복합체를 통해 발생하고 그다음 FXa는 표면에 있는 동안 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환한다. 그다음 트롬빈은 피브리노겐을 불용성이고 초기 혈소판 플러그를 안정화시키는 피브린으로 전환한다. 이 과정은 구획화되어 있고 예를 들어, TF 발현 또는 노출 부위에 국한 되어 있어서, 응고 시스템의 조직적 활성화의 위험을 감소시킨다. 플러그를 형성하는 불용성 피브린은 피브린 섬유의 FXIII-촉매된 교차-결합으로 더 안정화한다.

FⅦa는 주로 단일 사슬 지모겐으로 혈장에 존재하고, 단일 사슬 지모겐은 FXa에 의해 2사슬, 활성화된 형태,FⅦa로 절단한다. 재조합체 활성화된 인자 Ⅶa (rFⅦa)는 전구지혈제로 발달해 왔다. rFⅦa의 투여는 항체 형성 때문에 응고 인자 생성물로 치료받을 수 없는 출혈이 있는 출혈성 대상자에서 빠르고 고도로 효과적인 전구 지혈 반응을 제공한다. 또한 인자 Ⅶ 결핍이 있는 출혈 대상자 또는 정상적 응고시스템이 있지만 과도 출혈이 있는 대상자도 FⅦa로 성공적으로 치료될 수 있다. 이러한 연구에서, rFⅦa 의 불리한 부작용(특히 혈전색전증의 발생)은 나타나지 않았다.

외부에서 투여된 FⅦa는 활성화된 혈소판 표면에서 트롬빈의 형성을 증가시킨다. 이는 FIX 또는 FⅧ이 없고 완전한 트롬빈 형성에 대한 가장 효능있는 계가 없는 출혈성 대상자에서 발생한다. 또한 적은 수의 혈소판 또는 결손된 기능이 있는 혈소판이 존재할 때, 여분의 FⅦa 는 트롬빈 형성을 증가시킨다.

재조합체 인간 FⅦa 의 상업적 제조물은 NovoSeven?? (Novo Nordisk A/S, Denmark)로 팔린다. Novoseven?瑛? 혈우병 A 와 B 환자에서 출혈 에피소드의 치료를 나타낸다. Novoseven?瑛? 출혈 에피소드의 효과적이고 믿을 수 있는 치료제에 대한 시장에서 유용한 유일한 재조합체 FⅦa이다.

인자 Ⅴ는 단일 사슬 분자로서 합성되는 큰 당단백질이고 30 nM의 농도에서 비활성 조효소로서 혈액에서 순환한다. 혈액에서 인자 Ⅴ의 약 25%가 혈소판의 α 입자에 존재하는 반면 나머지는 혈장에 존재한다. 혈액 응고 일련 반응에서, 인자 Ⅴ는 세린 프로테아제 활성화된 인자 Ｘ에 대한 조효소로 작용한다. 인자 Ⅴ가 조효소로서 효과적으로 작용하기 전에, 인자 Ⅴ는 제한된 단백질분해에 의해 활성화되어야 한다. 인자 Ⅱa와 인자 Ｘa는 제한된 단백질분해에 의해 활성화될 수 있 다. 첫번째 인자 ⅤcDNA 서열을 Kane et al.(PNAS 83:6800,1986)이 발표하였지만 완전한 게놈 서열은 아직 알려지지 않았다. 인자 Ⅴ-결핍증은 인자 Ⅴ 유전자에서 기능 상실 돌연 변이 때문에 출혈 경향과 관련된 다소 열성 유전 질병이다(Guasch et al.,Thromb. Haemost. 77:252, 1997). 완전한 인자 Ⅴ-결핍증이 생명에 지장이 없는 지에 관해 토론의 여지가 남아 있다. 출판된 연구에 의하면 감염된 개인에서 관하여 가벼운 출혈 경향이 나타난다. 동시에, 인자 Ⅴ가 결실된 쥐는 심각한 표현형을 나타내고 약 반은 잉태 중간을 넘기지 못한 반면, 남아있는 배는 정상적으로 출생하였지만 과도 출혈로 출생 후 몇 시간 내에 죽는다. 일부 경우에, 인자 Ⅴ-결핍증은 인자 Ⅲ-결핍증과 공동 유전한다(Seligsohn et al., NEJM 307:1191,1982). 인자 Ⅴ에서 가장 보편적인 유전적 결함은 이른바 인자 Ⅴ_lelden 돌연변이이고, 이것은 활성화된 단백질 저항성 때문에 증가된 혈전증 위험과 관련되어 있다. 이 유전적 이상은 Caucasians의 약 3% 에서 우세하고 여러 연구에 의하면 Ⅴ_lelden 는 혈전증에 대한 가장 보편적인 유전적 위험 인자이다.

수술 또는 주된 외상과 관련하여 과도하게 출혈하고 혈액 수혈이 필요한 대상자는 출혈을 경험하지 않는 대상자보다 합병증이 많이 발생한다는 것이 알려져 있다. 하지만, 또한 인간 혈액 또는 혈액 생성물의 투여가 필요한 중간 정도의 출혈(응고 결손등의 치료를 위한 혈소판, 백혈구, 혈장-유도된 농축액)로 인간 바이러스 (간염, HIV, 파르보바이러스와 알려지지 않은 바이러스에 의한 그 외 것들)를 이동시키는 위험과 관련 합병증이 나타나게 한다. 대량의 혈액 수혈이 필요한 과다 출혈로 손상된 폐와 신장 기능을 포함한 다장기부전이 나타난다. 대상자에 이러한 심각한 합병증이 나타나면, 많은 사이토카인과 염증 반응과 관련 일련의 사건이 시작되어 치료를 매우 어렵게 그리고 불행하게도 종종 성공하지 못하도록 만든다. 따라서, 수술과 주된 조직 손상에서 주된 목적은 출혈을 회피 또는 최소화하는 것이다. 그러한 출혈을 회피 또는 최소화하기 위해서, 피브린분해 효소에 의해 쉽게 용해되지 않는 안정한 고체 지혈 플러그의 형성을 확실히 하는 것이 중요하다. 그리고, 그러한 플러그 또는 응혈의 빠르고 효과적인 형성을 확실히 하는 것도 중요하다.

오늘날, 외상 환자를 포함한 출혈 에피소드를 겪는 대상자와 수술과 관련하여 출혈이 되는 대상자는 FⅦa 의 반감기가 짧아서(2.5 시간) 지혈 능력의 특정 수준을 유지하기 위해서 한 번 이상의 주입이 필요하기 때문에 종종 FⅦa 의 여러번 주사 또는 주입으로 치료한다. 출혈이 빨리 정지하는 것은 그러한 대상자에게 중요한 잇점이다. 출혈을 멈추고 지혈을 유지하기 위해 필요한 투여의 수를 감소시키는 것도 중요한 잇점이다.

유럽 특허 No. 225.160 (Novo Nordisk)는 FⅦa 의 조성물과 응혈 인자 결손 또는 응혈 인자 억제제에 의해 야기되지 않는 출혈 질병의 치료를 위한 방법과 관련된다.

유럽 특허 No.82.182 (Baxter Travenol Lab. )는 응혈 인자의 결핍 또는 대상자에서 응혈 인자에 대한 억제제의 영향을 중화하는데 인자 Ⅶa의 조성물을 사용하는 것과 관련된다.

국제 특허 출원 No. WO 93/06855 (Novo Nordisk)은 FⅦa의 국부적 응용과 관련된다.

Cripe et al.(Biochemistry 31: 3777,1992), Jenny et al.(PNAS 84: 4846,1987), Kane et al. (Biochemistry 26 : 6508,1987), Kane & Davie (PNAS 83: 6800,1986) 은 구조, 아미노산 서열, 인자 V를 암호화하는 DNA와 관련된다.

당업계에 수술, 외상, 또는 다수혈된 대상자에서 응고장애를 포함하는 유도된 응고장애; 감소된 간 기능("간질병 ")을 포함한 선천적 또는 획득된 응고 또는 출혈 질병; 불완전한 혈소판 기능 또는 감소된 혈소판 수 ; 필수 응혈 "화합물" 이 없거나 비정상적인 (즉 , 혈소판 또는 von Willebrand 인자 단백질);증가된 피브린용해; 항혈액응고성 요법 또는 혈전용해요법; 또는 줄기 세포 이식과 같은 조직 손상의 다른 형태 때문에 출혈 에피소드가 나타나는 대상자를 포함하여 출혈 에피소드를 경험하는 대상자의 개선된 치료에 대한 필요가 있다.

응고의 향상, 안정한 지혈 플러그의 형성을 향상 또는 보증, 또는 치료받은 대상자에 대한 편리를 향상, 또는 대상자에서, 특히 트롬빈 생성이 손상된 대상자에서 완전한 지혈을 달성하기 위한 개선된, 신뢰할만한, 널리 응용가능한 방법에 대한 필요가 당업계에 있다. 출혈을 정지하기 위한 시간을 감소시킬 방법에 대한 필요도 있다.

발명의 개요

본 발명의 한 목적은 출혈 에피소드와 응고 장애의 치료 또는 예방에서 효과적으로 사용될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 출혈 에피소드의 치료 또는 예방에서 또는 응혈원으로서 효과적으로 사용될 수 있는 1회단위 투여량 형태로 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상승 효과를 나타내는 조성물, 치료 방법 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 응고시스템의 높은 수준의 전신 활성화와 같은 실질적 부작용을 나타내지 않는 조성물, 치료 방법 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 명세서를 읽으면 명백해진다.

첫번째 양태에서 본 발명은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드,그리고 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하는 약제적 조성물을 제공한다.

두번째 양태에서, 본 발명은

a) 첫번째 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 약제적 수용가능한 담체의 제제;

b) 두번째 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 약제적 수용가능한 담체의 제제;

c) 상기 첫번째 그리고 두번째 단위 투여량 형태를 함유하는 용기 수단을 포함하는 출혈 에피소드의 치료제를 함유하는 부분들의 키트를 제공한다.

세번째 양태에서, 본 발명은 대상자에서 출혈 에피소드의 치료를 위한 약제의 제조를 위해서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 조합하여 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 사용을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 대상자에서 출혈 에피소드의 치료를 위한 약제의 제조를 위해서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기술된 조성물의 사용을 제공한다.

다른 구체예에서, 약제는 완전한 지혈을 달성하기에 필요한 시간을 감소, 지혈을 유지하기에 필요한 시간을 감소, 응혈 시간을 감소, 응혈 용해 시간을 연장, 응혈 강도를 증가시키기 위한 것이다.

다른 구체예에서, 약제는 수술, 외상 또는 다른 형태의 조직 손상으로 인한 출혈 에피소드; 여러번 수혈받은 대상자에서의 응고병증을 포함한 응고병증; 감소된 간 기능("간 질병")을 포함한 선천적 또는 후천적 응혈 또는 출혈 질병; 결손된 혈소판 기능 또는 감소된 혈소판 수; 필수적 응혈 "화합물"(예를 들어, 혈소판 또는 von Willebrand 인자 단백질)의 결핍 또는 이상; 증가된 피브린 용해; 항응고제 치료 또는 혈전용해 치료; 줄기 세포 이식을 경험하는 환자의 치료를 위한 것이다. 일련의 구체예에서, 출혈은 뇌, 내이 지역, 눈, 간, 폐, 종양 조직, 위장계와 같은 기관에서 발생한다; 또다른 일련의 구체예에서, 출혈성 위염와 자궁 출혈과 같은 발산 출혈이다. 또다른 일련의 구체예에서, 출혈 에피소드는 급성 헤마루트로시스(관절에서 출혈), 만성 출혈성 관절증, 혈종 (예를 들어, 근육, 복막후, 혀 밑과 인두후),다른 조직에서 출혈, 혈뇨(신장계에서의 출혈), 뇌 출혈, 수술(예를 들어, 간절제), 발치와 위장 출혈(예를 들어, UGI 출혈)이 있는 시험체에서 수술 또는 외상과 관련된 출혈이다. 한 구체예에서, 약제는 대상자에서 외상 또는 수술 또는 혈소판의 수 또는 활성이 낮아서 생기는 출혈 에피소드를 치료하기 위한 것이다.

추가 양태에서, 본 발명은 대상자에서 출혈 에피소드를 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 출혈을 치료하는 데 효과적이다.

추가 양태에서, 본 발명은 대상자에서 응혈 시간을 감소하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 응혈 시간을 감소시키는 데 효과적이다.

추가 양태에서, 본 발명은 대상자에서 지혈을 향상하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 지혈을 향상시키는 데 효과적이다.

추가 양태에서, 본 발명은 대상자에서 응혈 용해 시간을 연장하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 응혈 용해 시간을 연장하는 데 효과적이다.

추가 양태에서, 본 발명은 대상자에서 응고 강도를 증가시키기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 응고 강도를 증가시키는 데 효과적이다.

방법의 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 1회 단위 투여량 형태로 투여된다.

또다른 일련의 구체예에서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 첫번째 단위 투여량 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 두번째 단위 투여량 형태로 투여한다. 일련의 구체예에서, 첫번째 단위 투여량 형태와 두번째 단위 투여량 형태는 15 분 이하의 시간 간격으로 투여한다.

추가 양태에서, 본 발명은

d) 1회 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드, 효과적인 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 약제적으로 수용가능한 담체와;

e) 상기 1회 단위 투여량 형태를 함유하는 용기 수단을 포함하는 출혈 에피소드의 치료제를 함유하는 키트를 제공한다.

발명의 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드이다. 본 발명의 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 아미노산 서열 변이체이다. 한 구체예에서 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 활성과 본래 인간 인자 Ⅶa (야생형 FⅦa)의 활성간의 비율은 본 명세서에 기술된 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 적어도 약 1.25 이다.

발명의 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ이다. 한 구체예에서 상기 인자 Ⅶ 는 인간 인자 Ⅶ이다. 한 구체예에서 인자 Ⅶ 는 소, 돼지, 고양이, 말, 쥐과 동물 또는 연어 인자 Ⅶ이다. 또 다른 구체예에서 인자 Ⅶ 는 재조합체적으로 만들어졌다. 또다른 구체예에서 인자 Ⅶ 는 혈장에서 유도되었다. 바람직한 구체예에서 인자 Ⅶ 는 재조합체 인간 인자 Ⅶ이다. 발명의 일련의 구체예에서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 활성화된 형태이다. 발명의 한 바람직한 구체예에서 인자 Ⅶ는 재조합체 인간 인자 Ⅶa이다.

일련의 구체예에서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 아미노산 서열 변이체이다. 한 구체예에서 상기 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 활성과 본래 인간 혈장 인자 Ⅴ(야생형 FXI)의 활성 간의 비율은 본 명세서에서 기술된 "인자 Ⅴ 검정"으로 시험하였을 때 적어도 약 1.25이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 폴리펩티드이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ는 인간 인자 Ⅴ이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ는 소, 돼지, 고양이, 말, 쥐과 동물 또는 쥐 인자 Ⅴ이다. 바람직한 구체예에서 인자 Ⅴ는 재조합체적으로 만들어졌다. 또다른 구체예에서 인자 Ⅴ는 혈소판에서 유래한다. 또 다른 구체예에서 내피 세포에서 유래한다. 바람직한 구체예에서 인자 Ⅴ는 재조합체 인간 인자 Ⅴ이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ의 단편이다. 한 구체예에서 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 하이브리드 인자 Ⅴ 폴리펩티드 예를 들어, 돼지/인간 하이브리드이다.

한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 약 100:1과 약 1:100 (w/w 인자 Ⅶ: 인자 Ⅴ)사이의 질량비로 존재한다.

한 구체예에서, 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 야생형 인자 Ⅶ와 비교하여 20 개 아미노산이 치환, 삭제, 삽입된 아미노산 서열 변이체(예를 들어, 미국 특허 No. 4,784,950에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드)이다. 또 다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 변이체는 15개 아미노산이 치환, 삭제, 삽입된다; 다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 변이체는 야생형 인자 Ⅶ와 비교하여 10 아미노산보다 적은 8,6,5 또는 3 아미노산이 치환, 삭제, 삽입된다. 한 구체예에서, 인자 Ⅶ 변이체는 L305V-FⅦa, L305V/M306D/D3095-FⅦa, L3051-FⅦa, L305T-FⅦa, F374P-FⅦa, V158T/M298Q-FⅦa, V158D/E296V/M298Q-FⅦa,K337A-FⅦa, M298Q-FⅦa, V158D/M298Q-FⅦa, L305V/K337A-FⅦa,V158D/E296V/M298Q/L305V-FⅦa,V158D/E296V/M298Q/K337A-FⅦa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FⅦa, K157A-FⅦ, E296V-FⅦ, E296V/M298Q-FⅦ, V158D/E296V-FⅦ, V158D/M298K-FⅦ, S336G-FⅦ의 목록에서 선택한다.

또다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 본래 인간 응고인자 Ⅶa와 비교하여 조직 인자 독립적 활성이 증가되었다. 또다른 구체예에서, 증가된 활성은 기질 특이성에서의 변화를 수반하지 않는다. 발명의 또다른 구체예에서, 조직 인자에 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 결합은 손상되지 않고 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 조직 인자에 결합되었을 때 적어도 야생형 인자 Ⅶa의 활성을 가진다.

바람직한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 재조합체 인간 인자 Ⅶa와 재조합체 인간 인자 Ⅴ이다. 추가 바람직한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 재조합체 인간 인자 Ⅶa와 재조합체 인간 인자 Ⅴa이다.

한 구체예에서, 응혈 시간은 포유동물 혈액에서 감소한다. 또다른 구체예에서 포유동물 혈액에서 지혈이 향상되었다. 또 다른 구체예에서 포유동물 혈액에서 응혈 용해 시간은 연장되었다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 혈액 응고 강도는 증가되었다. 한 구체예에서, 포유동물 혈액은 인간 혈액이다. 또다른 구체예에서, 포유동물 혈액은 보통 인간 혈액이고; 한 구체예에서, 혈액은 트롬빈 생성이 손상된 대상자에서 유래한 혈액이다. 한 구체예에서, 혈액은 하나 또는 그 이상의 응고인자가 부족한 대상자 유래의 혈액이다; 또다른 구체예에서, 혈액은 하나 또는 그 이상의 응고인자에 대한 저해제를 갖는 대상자 유래의 혈액이다 ; 한 구체예에서, 혈액은 피브리노겐의 농도가 낮은 대상자에서 유래한다; 한 구체예에서, 혈액은 인자 Ⅴ 결핍된 인간 혈액이다. 일련의 구체예에서, 혈액은 혈장이다.

본 발명의 한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 조성물에 포함된 유일한 지혈제이다. 또다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 조성물에 포함된 유일한 활성 지혈제이다. 또다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 대상자에 투여된 유일한 응고인자이다. 본 발명의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 환자에 투여된 유일한 활성제이다. 한 구체예에서, 조성물은 실질적으로 트롬빈 또는 프로트롬빈이 없다; 또다른 구체예에서, 조성물은 실질적으로 FX가 없다; 또다른 구체예에서, 조성물은 실질적으로 FXa가 없다.

또 다른 구체예에서, 약제적 조성물은 정맥내 투여, 바람직하게 주사 또는 주입, 특히 주사용으로 제조한다. 한 구체예에서, 조성물은 적어도 하나의 약제적 수용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 조성물은 1회 단위 투여량 형태이고, 1회 단위 투여량 형태는 양 응고인자를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 조성물은 첫번째 단위 투여량 형태로서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 단위 투여량 형태로서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제와 상기 첫번째와 두번째 단위 투여량 형태를 함유하는 용기수단을 포함하는 부분들의 키트 형태이다. 한 구체예에서 응용가능한 조성물 또는 키트는 조성물 또는 각 조성물의 투여를 위한 지침서를 더 함유한다.

본 발명의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 1회-투여량 형태로 투여한다. 본 발명의 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 첫번째 단위 투여량 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 두번째 단위 투여량 형태로 투여한다.

본 발명의 한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 순차적으로 투여한다. 또다른 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 15 분, 바람직하게 10분, 더 바람직하게 5분, 더 바람직하게 2 분 시간 간격으로 투여한다. 한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 2 시간까지, 바람직하게 1 내지 2 시간, 더 바람직하게 1시간, 더바람직하게 30 분 내지 1 시간, 더바람직하게 30 분까지, 더바람직하게 15 내지 30 분 까지의 시간 간격으로 투여한다.

한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 효과적인 양은 약 0.05 mg/day 에서 약 500 mg/day(70kg 대상자)사이의 양이다. 한 구체예에서, 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 효과적인 양은 약 0.01 mg/day 에서 약 500 mg/day (70kg 대상자)까지이다.

한 구체예에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 약 100: 1와 약 1: 100(w/w 인자 Ⅶ : 인자 Ⅴ)사이의 질량비로 존재한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 약제적 조성물은 1회 투여량 형태이고 본질적으로 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제와 약제적으로 수용가능한 담체, 안정제, 계면활성제, 중성염, 항산화제, 방부제, 프로테아제 저해제의 목록에서 선택된 하나 또는 그 이상의 조성물로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 약제적 조성물은 본질적으로 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 약제적 수용가능한 담체, 안정제, 계면활성제, 중성염, 항산화제, 방부제, 프로테아제 저해제의 목록에서 선택된 하나 또는 그 이상의 조성물로 구성된 첫번째 단위 투여량 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제와 약제적 수용가능한 담체, 안정제, 계면활성제, 중성염, 항산화제, 방부제, 프로테아제 저해제의 목록에서 선택된 하나 또는 그 이상의 조성물로 구성된 두번째 단위 투여량을 가진 부분들의 키트 형태이다.

또 다른 구체예에서, 대상자는 인간이다; 또다른 구체예에서, 대상자는 트롬빈 생성이 손상된다; 한 구체예에서, 대상자의 피브리노겐의 혈장 농도가 낮다(예를 들어, 여러 번 수혈된 대상자); 한 구체예에서, 대상자는 인자Ⅷ 또는 FIX의 혈장 농도가 낮다.

또 다른 양태에서, 대상자를 유일한 혈액응고 단백질로서 인자 Ⅶ로 치료하였을 때와 비교하여 인자 Ⅶ 반응 증후군을 겪고 있는 대상자에서 지혈을 향상하기 위한 방법과 관련되고 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양이 함께 지혈을 향상하는 데 효과적이다.

또 다른 양태에서, 대상자에서 트롬빈 형성을 향상시키는 방법과 관련되고, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 트롬빈의 형성을 향상시키는 데 효과적이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대상자를 유일한 응고단백질로서 인자 Ⅶ로 치료할 때와 비교하여 인자 Ⅶ 반응 증후군을 겪고 있는 대상자에서 트롬빈 형성을 향상하기 위한 방법과 관련되며 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하며 첫번째와 두번째 양이 함께 트롬빈 형성을 향상시키는 데 효과적이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 유일한 응고인자 단백질로서 인자 Ⅶ를 대상자에 투여할 때, 필요로 하는 투여수와 비교하여 인자 Ⅶ 반응 증후군을 겪고 있는 대상자에서 지혈을 달성하기 위해 필요로 하는 혈액응고인자 단백질의 투여 횟수를 감소하기 위한 방법과 관련되며 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로 첫번째와 두번째 양이 함께 혈액 응고 인자 단백질의 투여 횟수를 감소하기에 효과적이다.

또 다른 양태에서, 발명은 인자 Ⅶ 반응 증후군을 겪고 있는 대상자에서 출혈을 치료하기 위한 방법과 관련되며, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로 그 중에 첫번째와 두번째 양은 함께 출혈을 치료하는 데 효과적이다.

한 구체예에서, 인자 Ⅶ는 인간 재조합체 인자 Ⅶa (rFⅦa)이다. 또 다른 구체예에서, rFⅦa는 NovoSeven?? (Novo Nordisk Bagsvaerd, Denmark)이다.

또 다른 양태에서, 발명은 포유동물 혈장에서 피브린 응혈 형성을 향상하기 위한 약제를 제조하기 위해서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드를 인자 Ⅴ과 조합하여 사용하는 것과 관련된다.

또 다른 양태에서, 대상자에서 피브린 응고를 향상하기 위한 방법과 관련되며 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로 첫번째와 두번째 양은 함께 출혈을 치료하는 데 효과적이다.

도 1: FⅦa를 첨가하면 응혈 시간이 현저하게 감소하고 FV를 첨가하면 더 감소된다. FV만 첨가하면 응혈 시간은 감소하지 않는다.

수술 또는 주된 외상으로 과다하게 출혈되어서 혈액 수혈이 필요로 하는 대상자는 출혈을 겪지 않은 이들보다 합병증이 더 나타난다. 하지만 또한 인간 혈액 또는 혈액 생성물(응고 결함의 치료를 위해서 혈소판, 백혈구, 혈장-유도된 농축액)를 투여해야 하면 이는 바이러스가 아닌 병원체와 인간 바이러스 (예를 들어, 간염, HIV, 파르보바이러스, 또는 다른, 지금까지 알려지지 않은 바이러스)를 전파시키는 위험과 관련되어 있기 때문에, 중간정도의 출혈이 나면 합병증이 발생한다. 대량의 혈액 수혈이 필요로 하는 과도한 출혈로 손상된 폐와 신장 기능을 포함한 다장기부전으로 발전한다. 일단 대상자에 합병증이 발생하면 많은 사이토카인과 염증반응과 관련 일련의 반응이 시작되어 치료를 매우 힘들게 하고 종종 불행하게도 성공하지 못한다. 혈액이 손실된 환자는 만성 으로 불안정하게 한다. 그러한 환자는 심방 세동을 겪을 위험이 있고 이는 심장 활성이 치명적으로 멈추거나; 손상된 신장 기능; 또는 폐에서 체액 혈관밖유출 ("젖은 폐"또는 ARDS)에 이르게 한다. 따라서, 주된 조직 손상의 치료와 수술에서 주된 목적은 출혈을 피하거나 최소화하는 것이다. 출혈을 피하거나 최소화하기 위해서 피브린 분해성 효소로 쉽게 분해되지 않는 안정하고 고체인 지혈 플러그를 형성하도록 보증하는 것이 중요하다. 그리고, 그러한 플러그 또는 응혈이 빠르고 효과적으로 형성되도록 확실하게 하는 것이 중요하다.

저혈소판증(혈소판이 수가 작거나 활성이 낮은)이 있는 대상자는 또한 지혈 플러그를 형성하는 피브린 플러그를 안정화시키는 데 결실이 있고 또한 손상된 트롬빈이 형성되며 조숙한 분해 되기 쉽다. 게다가, 주된 외상 또는 기관손상이 되어 따라서 수혈을 종종 받은 대상자는 피브리노겐, 인자 Ⅷ, 다른 응고 단백질의 수준이 낮고 혈소판 수가 적다. 이러한 대상자에서 손상된(또는 적은) 트롬빈이 생성한다. 따라서, 이러한 대상자는 결실이 있거나 덜 효과적으로 지혈되어, 과도한 외상과 기관손상이 된 상황에서 추가로 과다하게 방출된 효소와 같은 단백질 분해 효소로 쉽게 그리고 미숙하게 용해되는 피브린 플러그를 형성한다.

조직에서 출혈되면 또한 혈종 이 형성된다. 혈종 의 크기는 (특히 두개 사이와 척수)신경계 기능 손실의 정도, 회복의 어려움 및/또는 심각성와 회복 후 신경계 기능의 영원한 손상 정도와 긴밀하게 상호관련된다. 혈종 의 가장 심각한 결과는 환자의 죽음에 이르게 하는 뇌에 위치할 때 나타난다.

따라서, 출혈을 치료하는 주된 목적은 최소 시간 내에 지혈되도록 하여 혈액 손실을 최소로 하는 것이다.

본 발명은 따라서 그러한 치료가 필요로 하는 대상자에서 출혈 에피소드를 치료하기 위한 유익한 조성물, 치료 사용과 방법을 제공한다. 조성물, 사용과 방법은 지혈되기 전에 적은 혈액 손실, 수술 동안에 필요로 하는 적은 혈액, 지혈될 때까지 수용가능한 수준으로 유지되는 혈압, 혈압의 빠른 안정화, 치료 받은 환자가 회복하는 데 걸리는 짧은 시간, 환자를 치료하기 위한 짧은 회복 시간, 뇌에서 혈종 을 포함한 혈종 형성이 감소 또는 더 작은 혈종 의 형성, 출혈이 빨리 정지, 출혈을 멈추고 지혈을 유지하는 데 필요로 하는 투여의 수를 감소시키는 것과 같은 유익한 효과와 관련되어 있다.

인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제와 조합하여 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드, 예를 들어, 인자 Ⅶa의 제제를 투여하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ를 단독 투여할 때의 응혈 시간, 응혈 강도, 저항성과 비교하여 응혈 시간이 단축되고 응혈이 단단해지고 피브린 용해에 대한 증가된 저항성을 제공한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드, 예를 들어, 인자 Ⅶa의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제를 조합하여 투여하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ가 단독으로 투여되는 상황과 비교하여 출혈을 멈추는 데 시간이 적게 걸리고 지혈을 유지하는 데 필요로 하는 투여의 수가 감소하는 것을 제공한다. 본 발명은 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제를 동시적 또는 순차적으로 복용하면 유익한 효과를 제공한다. 본 발명에 따른 약제적 조성물은 1회 조성물 형태이거나 복합 조성물 키트(부분들의 키트)의 형태이다. 본 발명에 따른 조성물은 인간과 같은 영장류를 포함한 포유류에서 치료와 예방용 전응고제로서 유용하다. 본 발명은 사람을 포함한 대상자에서 출혈 에피소드를 치료(예방적으로 치료 또는 예방)하기 위한 방법을 더 제공한다.

언제나, 첫번째 또는 두번째 또는 세번째 등과 같은 단위투여량은 이 명세서에서 언급되어 있고 이는 투여의 바람직한 정도를 나타내지 않지만 단지 편의를 위해서 수행한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제의 조합은 짧은 응혈 시간, 지혈 플러그의 빠른 형성, 안정한 지혈 플러그가 형성되는 것을 보장하는 이로운 생성물이다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 조합은 고체, 안정하고 빨리 형성되는 지혈 플러그의 형성을 보장하는 이로운 생성물임을 본 발명자가 발견하였다.

인자 Ⅶa와 인자 Ⅴ를 조합하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ 단독보다 더 효과적으로 응혈의 강도를 증가시킬 수 있음을 본 발명자가 제시하였다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ를 조합하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ 단독보다 더 효과적으로 보통 인간 혈장에서 시험관 내 응혈 용해 시간을 연장시킬 수 있음이 제시되었다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ를 조합하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ 단독보다 더 효과적으로 보통 인간 혈장에서 반-응혈 용해 시간을 연장시킬 수 있음이 제시되었다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ를 조합하면 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ단독보다 보통 인간 혈장에서 더 효과적으로 응혈이 피브린용해 특히 tPA-중재된 피브린용해로부터 보호할 수 있음이 제시되어 있다. 따라서, 혈액 응고를 향상하여 대상자에서 출혈을 더 효과적으로 치료할 수 있다.

이론에 한정되지 않고, 고체, 안정적 지혈 플러그의 형성 그리고 지혈이 유지되기 위해서는 완전한 트롬빈 생성이 필요하다고 믿어진다. 그러한 플러그의 피브린 구조는 형성된 트롬빈의 양과 초기 트롬빈 생성의 비율에 의존한다. 손상된 트롬빈이 생성될 때, 고도로 투과적인 다공성 피브린 플러그가 형성된다. 피브린 표면에 존재하는 피브린 분해성 효소는 그러한 피브린 플러그를 쉽게 분해한다. 안정한 피브린 플러그가 형성되는 것은 트롬빈에 의해 활성화되는 인자 Ⅷa가 있는지에 따라 달라지고 따라서 트롬빈이 완전히 생성되는 지에 따라 달라진다. 게다가, 최근에 기술된 트롬빈 활성가능한 피브린 분해성 억제제, TAFI는 활성화되기 위해서는 트롬빈 양이 많이 필요하다. 적절하지 않은 트롬빈이 형성되면 TAFI이 활성화되지 않아서 보통 피브린 분해성 활성에 의해 정상적으로 용해되는 것 보다 더 쉽게 용해되는 지혈 플러그가 형성된다. 혈소판 수가 적은 상황에서, 즉 저혈소판증에서, 외부 인자 Ⅶa를 투여하면 트롬빈 형성이 더 빨라진다. 하지만 전체 트롬빈 생성은 높은 농도에서도 인자 Ⅶa에 의해 정상화되지 않는다.

피브리노겐의 혈장 최종농도가 낮은 대상자(복합 외상 또는 과도한 수술을 받아 여러번 수혈된 대상자)에서 트롬빈이 완전히 활성화되지 않는다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ를 조합하여 투여하면 더 효과적으로 지혈한다.

저혈소판증이 있는 대상자는 손상된 트롬빈이 생성되고 피브린 플러그의 안정화에 결손이 있어 미성숙 용해되기 쉬운 지혈 플러그가 형성된다. 게다가, 주된 외상 또는 기관이 손상되어 따라서 혈액 수혈을 자주 받는 대상자는 피브리노겐, 인자 Ⅷ, 다른 혈액 응고 단백질의 수준이 낮고 혈소판도 적다. 이러한 대상자는 손상된(또는 적은) 트롬빈을 생성한다. 추가로, 이들의 피브리노겐이 적기 때문에 Ⅷ의 활성화를 방해한다. 이러한 대상자는 지혈이 손상되거나 덜 효과적으로 지혈되어 단백질 분해 효소, 즉 과도한 외상과 기관손상이 특징인 상황에서 추가로 과도하게 방출된 효소에 의해 쉽게 그리고 조숙하게 용해되는 피브린 플러그가 형성된다.

대상자에서 지혈을 유지하기 위한 완전한 능력이 있는 완전하게 안정된 플러그 형성을 촉진하기 위해서, 발명에 따른 조성물이 투여된다. 이 조성물은 혈소판 수가 적은 대상자와 피브리노겐 및/또는 다른 혈액 응고 단백질의 혈장 수준이 낮은 대상자에서 특히 유익하다.

인자 Ⅶ 폴리펩티드 :

본 발명을 실행할 때, 출혈을 예방 또는 치료하는 데 효과적인 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 사용한다. 이는 혈액 또는 혈장에서 유도된, 또는 재조합체 수단에 의해 생산된 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 예를 들어, 미국 특허 No. 4,784, 950 (야생형 인간 인자 Ⅶ)에 개시된 아미노산 서열을 가진 것과 같은 인자Ⅶ 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 미국 특허 No. 4,784, 950 (야생형 인자 Ⅶ)에 개시된 인간 인자 Ⅶa이다. 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa의 특이적 생물 활성의 적어도 약 10%, 바람직하게 적어도 약 30%, 더 바람직하게 적어도 약 50%, 가장 바람직하게 적어도 약 70%을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa의 특이적 생물 활성의 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 100%, 바람직하게 적어도 약 120%, 더 바람직하게 적어도 약 140%, 가장 바람직하게 적어도 약 160%을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 미국 특허 No.4,784, 950에 개시된 야생형 인자 Ⅶ의 서열과 적어도 약 70 %, 바람직하게 적어도 약 80 %, 더 바람직하게 적어도 약 90 %, 가장 바람직하게 적어도 약 95 %의 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다.

여기에서 사용되었듯이, "인자 Ⅶ 폴리펩티드"는 제한없이 인자 Ⅶ와 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드를 포함한다. "인자 Ⅶ"는 제한없이 야생형 인간 인자 Ⅶ의 아미노산 서열 1-406 (미국 특허 No. 4,784, 950에 개시된)을 가진 폴리펩티드, 소, 돼지, 고양이, 쥐과 동물, 연어 인자 Ⅶ과 같은 다른 종에서 유래한 야생형 인자 Ⅶ, 혈액 또는 혈장에서 유래되었거나 재조합체 수단으로 생산된 상기 인자 Ⅶ를 포함한다. 이는 개인마다 존재하고 발생하는 인자 Ⅶ의 자연적 대립 변이체를 더 포함한다. 또한, 글리코실레이션 또는다른 번역 후 변경의 정도와 위치는 선택된 숙주 세포와 숙주 세포 환경의 성질에 따라 달라진다. 용어 "인자 Ⅶ관련 폴리펩티드"는 제한없이 절단되지 않은 (지모겐) 형태의 Ⅶ폴리펩티드와 단백질 분해적으로 공정되어 인자 Ⅶa로 지정된 각 생체활성적 형태를 생성하는 것들을 포함한다. 전형적으로, 인자 Ⅶ는 잔기 152와 153 사이에서 절단되어 인자 Ⅶa를 생성한다.

"인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드"는 제한없이, 인간 인자 Ⅶ에 관하여 화학적으로 변경되고/또는 인간 인자 Ⅶ 에 관하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 변경을 포함하는 인자 Ⅶ 폴리펩티드(예를 들어, 인자 Ⅶ 변이체) 및/또는 인간 인자 Ⅶ에 관하여 절단된 아미노산 서열(예를 들어, 인자 Ⅶ 단편)을 포함한다. 그러한 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 안정성, 인지질 결합, 변경된 특이적활성 등을 포함한 인간 인자 Ⅶ에 관하여 다른 성질을 나타낸다. 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 절단되지 않은 (지모겐) 형태의 폴리펩티드와 "인자 Ⅶa관련 폴리펩티드" 또는 "활성화된 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드"로 지정된 각 생체활성적 형태를 생성하도록 단백질 분해적으로 공정된 것들을 포함한다.

여기서 사용된 바와 같이, "인자 Ⅶ관련 폴리펩티드"는 제한없이 인자 Ⅶa 생물 활성이 야생형 인간 인자 Ⅶa의 활성에 관하여 변경되거나 감소된 폴리펩티드와 야생형 인간 인자 Ⅶ에 관하여 실질적으로 같거나 향상된 생물 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 제한없이, 화학적으로 변경된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 와 폴리펩티드의 생체활성을 변경 또는 파괴하는 특이적 아미노산 서열 변경이 도입된 인자 Ⅶ 변이체를 포함한다.

이는 아미노산 서열이 약간 변경된 폴리펩티드, 예를 들어, N-말단 아미노산이 치환 또는 첨가된 것을 포함한 변경된 N-말단을 가지는 폴리펩티드 및/또는 인간 인자 Ⅶa에 관하여 화학적으로 변경된 폴리펩티드를 포함한다.

야생형 인자 Ⅶ보다 같거나 더 좋은 생체활성을 나타내거나 또는, 대안적으로, 야생형 인자 Ⅶ에 관하여 실질적으로 변경되거나 감소된 생체활성을 나타내는, 인자 Ⅶ의 변이체를 포함한 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 제한없이, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 삽입, 삭제 또는 치환되어 야생형 인자 Ⅶ의 서열과 다른 아미노산 서열이 있는 폴리펩티드를 포함한다.

변이체를 포함한 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응혈 검정, 단백질 용해 검정, 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 또는 적어도 약 130%를 보이는 것들을 포함한다.

야생형 인자 Ⅶa에 관하여 실질적으로 같거나 향상된 생물 활성을 보이는 변이체를 포함한 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질 용해 검정 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 적어도 약 25%, 바람직하게적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 더 바람직하게 적어도 약 100%, 더 바람직하게 적어도 약 110%, 더 바람직하게 적어도 약 120%와 가장 바람직하게 적어도 약 130% 을 보이는 것들을 포함한다.

야생형 인자 Ⅶa에 관하여 실질적으로 감소된 생물 활성이 있는 변이체를 포함한 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 응고 검정, 단백질 용해 검정, 또는 TF 결합 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅶa의 특이적 활성의 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하 , 더 바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1 % 이하인 것들이다. 야생형 인자 Ⅶ에 관하여 실질적으로 변경된 생물 활성이 있는 인자 Ⅶ 변이체는 제한 없이 TF 독립적 인자 X 단백질 분해 활성을 보이는 인자 Ⅶ 변이체과 인자 X을 절단하지 않지만 TF에 결합하는 것들을 포함한다.

일부 구체예에서 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드이고 특정 변이체에서 "시험관 내 가수분해 검정"(하기 "검정" 참조)에서 테스트하였을 때 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성과 본래 인간 인자 Ⅶa(야생형 FⅦa)의 활성 간의 비율이 적어도 약 1.25 인 변이체이다: 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 2.0 ; 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 4.0 이다. 본 발명의일부 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드이고, 특정 변이체에서 "시험관 내 가수분해 검정" (하기 "검정" 참조)에서 테스트하였을 때 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 활성과 본래 인간 인자 Ⅶa (야생형 FⅦa)의 활성 간의 비율이 적어도 약 1.25 이다: 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 4.0 ; 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 8. 0 이다.

일부 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 미국 특허 No. 4,784, 950 (야생형 인자 Ⅶ)에 개시된 바와 같은 인간 인자 Ⅶ이다. 일부 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa이다. 일련의 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅶa의 특이적생물 활성의 적어도 약 10%, 바람직하게적어도 약 30%, 더바람직하게적어도 약 50%, 가장 바람직하게 적어도 약 70% 를 나타내는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 삽입, 삭제 또는 치환되어 야생형 인자 Ⅶ의 서열과 다른 아미노산 서열을 가진다.

야생형 인자 Ⅶa와 비교하여 같거나 더 좋은 생물 활성이 있는 인자 Ⅶ 변이체의 제한되지 않은 구체예는 덴마크 특허 출원 Nos. PA 2000 00734, PA 2000 01360 (WO 01/83725에 대응하는), PA 2000 01361 (WO 02/22776 에 대응하는)에서 기술된 것을 포함한다. 야생형 인자 Ⅶ와 비교하여 같거나 더 좋은 생물 활성이 있는 인자 Ⅶ 변이체의 구체예는 S52A-FⅦ, S60A-FⅦ (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192,1998); L305V-FⅦ, L305V/M306D/D309S-FⅦ, L305I-FⅦ, L305T-FⅦ, F374P-FⅦ, V158T/M298Q-FⅦ, V158D/E296V/M298Q-FⅦ, K337A-FⅦ, M298Q-FⅦ, V158D/M298Q-FⅦ, L305V/K337A-FⅦ, V1 58D/E296V/M298Q/L305V-FⅦ, V1 58D/E296V/M298Q/K337A-FⅦ, V158D/E296V/M298Q/

L305V/K337A-FⅦ, K157A-FⅦ, E296V-FⅦ, E296V/M298Q-FⅦ, V158D/E296V-FⅦ, V158D/M298K-FⅦ,와 S336G-FⅦ ; 미국 특허 No. 5,580, 560에 개시된 바와 같이 증가된 단백질 분해 안정성을 나타내는 FⅦa 변이체; 잔기 290 와 291 또는 잔기 315 외 316 사이에서 단백질 분해적으로 절단된 인자 Ⅶa(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505,1995); 인자 Ⅶa의 산화된 형태(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54,1999)를 포함한다. 야생형 인자 Ⅲ와 비교하여 감소 또는 변경된 생물 활성이 있는 인자 Ⅶ 변이체의 제한되지 않은 구체예는 R152E-FⅦa (Wildgoose et al., Biochem 29: 3413-3420,1990), S344A-FⅦa (Kazama et al., J. Biol.Chem. 270: 66-72,1995), FFR-FⅦa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15: 515-520, 1998), Gla 영역이 부족한 인자 Ⅶa (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317: 245-Z49, 1993)을 포함한다. 화학적으로 변경된 인자 Ⅶ 폴리펩티드와 서열 변이체의 제한되지 않은 구체예는 미국 특허 No. 5,997, 864에 기술되어 있다.

혈액 응고에서 인자 Ⅶa의 생물 활성은 (ⅰ)조직 인자 (TF)에 결합하는 능력과 (ⅱ)활성화된 인자 IX 또는 X(각각 인자 IXa 또는 Xa)를 생산하기 위한 인자 IX 또는 인자 X의 단백질 분해 절단을 촉매하는 능력에서 유래한다.

본 발명의 목적을 위해서, 인자 Ⅶ 폴리펩티드 ("인자 Ⅶ 생물 활성")의 생물 활성은 미국 특허 No. 5,997, 864.에 기술된 바와 같이 인자 Ⅶ 결핍된 혈장과 트롬보플라스틴을 이용하여 응혈을 촉진하기 위한 제제의 능력을 측정하여 생물 활성한다. 이 검정에서, 생물 활성은 대조군 샘플과 관하여 응혈 시간의 감소로 표현되고 1 단위/ml 인자 Ⅶ 활성을 포함하는 혼주된 인간 혈청 표준과 비교하여 "인자 Ⅶ 단위"로 전환한다. 대안적으로, 인자 Ⅶa 생물 활성은

(i) 지질막에 끼워진 TF와 인자 X를 포함하는 시스템에서 활성화된 인자 X (인자 Xa)을 생산하는 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드의 능력을 측정 (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924,1997) ;

(ii) 수용액 시스템에서 인자 X 가수분해를 측정 ("시험관 내 단백질 용해 검정", 하기 참조) ;

(iii)표면 플라스몬 공명 인자에 근거한 도구를 이용하여 Ⅶa 또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드가 TF의 물리적 결합을 측정(Persson, FEBS Lettes.413: 359-363,1997)하고;

(iv) 인자 Ⅶa 및/또는 인자 Ⅶa관련 폴리펩티드에 의한 합성 기질의 가수분해를 측정("시험관 내 가수분해 검정", 하기 참조) ;

(v) TF-독립적 시험관 내 시스템에서 트롬빈 생성을 측정하여 정량화한다.

용어 "인자 Ⅶ 생물 활성"또는"인자 Ⅶ 활성"은 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다; 이 용어는 또한 조직 인자가 없을 때 활성화된 혈소판의 표면에서 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다.

본 발명에 따라 사용되는 인자 Ⅶa 제제는 제한 없이 NovoSeven?? (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)이다.

PAT-1 폴리펩티드 :

본 발명은 Gils et al., Biochim Biophys Acta. 1998 Sep 8 ; 1387 (1- 2) : 291-7 ; Sui et al. Biochem J. 1998 Apr 15; 331 (Pt 2): 409-15; Ginsburg, et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986); US Patent No. 6,303, 338 ; US Patent No. 6,103, 498 or Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986) (야생형 인자 Ⅴ)에 개시된 아미노산 서열을 가진 것과 같은 인자 Ⅴ 폴리펩티드의 사용을 포함한다.

본 발명을 수행할 때, 출혈을 예방 또는 치료하는 데 효과적인 인자 Ⅴ 폴리펩티드가 사용한다. 이는 혈액 또는 혈장에서 유도된 인자 Ⅴ 폴리펩티드, 재조합체 수단에 의해 생산된 것을 포함한다. 용어"인자 Ⅴ"는 구조적으로 활성 형태 예를 들어, 인자 Ⅴ(14-1b, Molecular Innovation)를 포함하는 활성 입체구조와 잠재적 입체구조에서 모든 자연적으로 발생하는 인자 Ⅴ 폴리펩티드를 포함한다.

여기에서 사용된 바와 같이,"인자 Ⅴ 폴리펩티드"는 제한없이 인자 Ⅴ과 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "인자 Ⅴ"는 제한없이 Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10), 2539-2544 (1986), Gils et al., Biochim Biophys Acta. 1998 Sep 8; 1387 (1-2):291-7 ; Sui et al. Biochem J. 1998 Apr 15 ; 331 (Pt 2): 409-15; Ginsburg, et al., J. Clin. Invest., vol. 78, pp. 1673-1680 (1986)에 기술된 아미노산 서열 또는; US Patent No. 6,303, 338; US Patent No. 6,103, 498 에 기술된 것과 소, 돼지, 고양이, 쥐과 동물, 쥐 인자 Ⅴ와 같은 다른 종에서 유래한 야생형 인자 Ⅴ 을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.

이는 개인마다 존재하고 발생하는 인자 Ⅴ의 자연적 대립 변이체를 더 포함한다. 또한, 글리코실레이션의 정도와 위치 또는 다른 번역 후 변경은 선택된 숙주 세포와 숙주 세포 환경의 성질에 따라서 달라진다. 용어 "인자 Ⅴ"는 지모겐 형태의 인자 Ⅴ 폴리펩티드와 각 생물 활성적 형태를 생성하도록 공정된 것을 포함한다.

"인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드"는 제한없이, 인간 인자 인자 Ⅴ 에 관하여 화학적으로 변경되고/또는 인간 인자 인자 Ⅴ에 관하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 변경 (예를 들어,인자 Ⅴ 변이체)을 포함하고/또는 인간 인자 Ⅴ에 관하여 절단된 아미노산 서열(예를 들어, 인자 Ⅴ 단편)을 포함하는 인자 Ⅴ 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 인간 인자 Ⅴ에 관하여 안정성, 인지질 결합, 변경된 특이적 활성과 기타 같은 종류를 포함한 다른 성질을 나타낸다.

용어 "인자 Ⅴ"는 지모겐 형태의 그러한 폴리펩티드와 각 생물 활성적 형태를 생성하도록 공정된 것들을 포함한다.

여기서 사용된 바와 같이 ,"인자 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드"는 제한없이 야생형 인간 인자 Ⅴ의 활성에 관하여 실질적으로 같거나 향상된 생물 활성을 보이는 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 생물적 활성이 야생형 인간 인자 Ⅴ의 활성에 관하여 실질적으로 변경되거나 감소된 생물 활성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 제한없이, 화학적으로 변경된 인자 Ⅴ 또는 폴리펩티드의 생체활성을 변경 또는 파괴하는 특이적 아미노산 서열 변경이 도입된 인자 Ⅴ 변이체를 포함한다.

이는 또한 아미노산 서열이 약간 변경된 폴리펩티드, 예를 들어, N-말단 아미노산이 치환 또는 첨가된 것을 포함한 N-말단이 변경된 폴리펩티드 및/또는 인간 인자 Ⅴ에 관하여 화학적으로 변경된 폴리펩티드를 포함한다.

인자 Ⅴ의 변이체를 포함한 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 야생형 인자 Ⅴ 보다 실질적으로 같거나 향상된 생물활성을 보이거나 대안적으로 야생형 인자 Ⅴ 에 대하여 실질적으로 변경되거나 감소된 생물활성을 보이던지 제한없이, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 삽입, 삭제 또는 치환된 야생형 인자 Ⅴ의 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

변이체를 포함한 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인자 Ⅴ 활성 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅴ의 특이적 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120% 와 적어도 약 130% 을 보이는 것들을 포함한다.

야생형 인자 Ⅴ에 관하여 같거나 향상된 생물 활성이 있는, 변이체를 포함한 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 특이적 인자 Ⅴ 활성 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅴ의 특이적 활성의 적어도 약 25%, 바람직하게 적어도 약 50%, 더 바람직하게 적어도 약 75%, 더 바람직하게 적어도 약 100%, 더 바람직하게 적어도 약 110%, 더 바람직하게 적어도 약 120%, 가장 바람직하게 적어도 약 130% 을 보이는 것들을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 인자 Ⅴ 생물 활성은 여기에 기술된 바와 같이 tPA-중재된 응혈 용해 또는 플라스민-중재된 응혈 용해를 억제하기 위한 제제의 능력을 평가하여 정량화한다. 양 검정에서, 생물 활성은 대조군 샘플에 대한 응혈 용해 시간에서 감소로 표현한다. 대안적으로, 인자 Ⅴ 생물 활성은 Chandler et al. Clinical Chemistry, 35(5) 787-793(1989) 또는 기능적 인간 인자 Ⅴ에 대한 효소면역측정법(HPAIKT, Molecular Innovations) 또는 당업계에 공지된 다른 검정에 기술된 바와 같은 tPA 아미노분해 활성의 인자 Ⅴ 및/또는 인자 Ⅴ 동등 억제로 정량화한다.

야생형 인자 Ⅴ에 관하여 실질적으로 감소된 생물 활성이 있는 변이체를 포함한 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 상기 기술된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 특이적 인자 Ⅴ 활성 검정에서 시험하였을 때 같은 세포 유형에서 생산된 야생형 인자 Ⅴ의 특이적 활성의 약 25% 이하, 바람직하게 약 10% 이하, 더 바람직하게 약 5% 이하, 가장 바람직하게 약 1 % 이하인 것들이다.

인자 Ⅴ 등가물의 제한되지 않은 구체예는 미국 특허 Nos. 6103498에 기술된 인자 Ⅴ 등가물을 포함한다.

일부 구체예에서 인자 Ⅴ는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드이고, "인자 Ⅴ 검정"(Chandler et al. Clinical Chemistry, 35 (5) 787- 793 (1989), 상기 참조);에서 시험하여 상기 인자 Ⅴ 폴리펩티드의 활성과 본래 인간 인자 Ⅴ (야생형 인자 Ⅴ)의 활성 비율이 적어도 약 1.25이고; 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 2.0 ; 추가 구체예에서, 비율은 적어도 약 4.0이다.

인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 또한 독특한 지혈 관련 활성을 가지는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 단편을 포함한다. 인자 Ⅴ 폴리펩티드의 지혈 관련 활성은, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 인자 Ⅴ 활성 검정을 사용하여 측정한다.

정의

본문에서 아미노산을 세문자 또는 한 문자로 나타내는 것이 표 1에 제시된 통상적인 의미에서 사용한다. 뚜렷히 명시되지 않으면, 여기에서 언급된 아미노산은 L-아미노산이다. 예를 들어, K337에서 첫번째 글자는 제시된 위치 야생형 인자 Ⅶ에 자연적으로 존재하는 아미노산을 나타내고 예를 들어, [K337A]-FⅦa는 제시된위치에 자연적으로 존재하는 한 문자 코드K로 나타낸 아미노산이 한 문자 코드A로 나타낸 아미노산으로 치환된 FⅦ변이체를 지정한다.

용어 "인자 Ⅶa" 또는 "FⅦa"는 교환적으로 사용한다.

본문에서, "트롬빈 생성이 손상된 대상자"는 활성화된 혈소판 표면에서 완전한 트롬빈 파열을 생성하지 못하는 대상자를 의미하고 응고인자, 혈소판, 피브리노겐(예를 들어,혼주된 보통 인간 혈장에서처럼)의 보통 양과 기능을 포함한 완전히 기능하고 보통 지혈 시스템를 가진 대상자보다 트롬빈을 적게 생성하는 대상자를 포함하며 제한없이, 인자 Ⅷ가 없는 대상자; 혈소판의 수가 적거나 결손된 기능이 있는 혈소판을 가진 대상자(예를 들어, 저혈소판증 또는 트롬바스테니아 글란즈맨 또는 과다하게 출혈한 대상자); 프로트롬빈, FX 또는 FⅦ의 수준이 낮은 대상자 ; 여러 응고인자의 수준이 낮은 대상자(외상 또는 과도한 수술로 과다한 출혈 때문에); 피브리노겐의 혈장 농도가 적은 대상자(예를 들어, 여러번 수혈받은 대상자)를 포함한다.

" 트롬빈 생성 수준" 또는 "정상적 트롬빈 생성"은 건강한 대상자와 비교한 대상자의 트롬빈 생성 수준을 의미한다. 수준은 보통 수준의 비율로 지정한다. 용어는 적절하게 교환적으로 사용한다.

용어 "지혈성 시스템의 향상"은 트롬빈을 생성하는 능력이 향상됨을 의미한다. 용어 "지혈을 향상"은 각각 같은 트롬빈 생성 검정에서 시험하였을 때 오직 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하는 대조군 표본의 각 트롬빈 생성에 대한 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 시험 샘플에 대해 측정된 트롬빈 생성이 연장된 상황을 포함한다. 트롬빈 생성은 본 명세서의 트롬빈 생성 검정에 기술된 것처럼 검정한다.("검정 부분"참조).

여기에서 사용된 것처럼 "단독"제 또는 인자는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드가 함께 약제적 조성물 또는 키트에 포함된 유일한 지혈제, 또는 활성적인 지혈제, 또는 응고인자인 상황 또는 즉 특정 출혈 에피소드 과정에서처럼 특정 치료 과정에서 환자에 투여된 유일한 지혈제, 또는 활성적인 지혈제, 또는 응고인자인 상황을 말한다. 이러한 상황은 응용 가능한 다른 지혈제 또는 응고인자가 하나 또는 그 이상의 응고인자에 영향을 주도록 충분한 양 또는 활성으로 존재하지 않는 것을 포함한다는 것이 이해한다.

응혈 용해 시간, 응혈 강도, 피브린 응혈 형성, 응혈 시간은 임상의 인자 환자의 지혈성 시스템 상황에서 검정용으로 사용되는 임상 인자이다. 혈액샘플은 적절한 간격으로 환자에서 추출하고 하나 또는 그 이상의 인자를 예를 들어, Meh et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001 ; 12: 627- 637; Vig et al., Hematology, Vol. 6 (3) pp. 205-213 (2001); Vig et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis, Vol. 12 (7) pp. 555-561 (2001) Oct ; Glidden et al.,clinical and applied thrombosis/hemostasis, Vol. 6 (4) pp. 226-233 (2000) Oct; McKenzie et al., Cardiology, Vol. 92 (4) pp. 240-247 (1999) Apr ; 또는 Davis et al., Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 6 (4) pp. 1250-1255 (1995)에 기술된 트롬보엘라스토그래피로 검정하였다.

용어 "응혈 용해 시간을 연장"은 각각 같은 응혈 검정에서 시험하였을 때 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 함유하는 시험 샘플에 대한 측정된 응혈 용해 시간이, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 함유하는 대조군 샘플의 각 응혈 용해 시간에 관하여 연장된 상황을 포함한다. 응혈 용해 시간은 상기 기술된 바와 같이 검정한다.

용어" 응고 강도를 증가"는 같은 응고 강도 검정에서 시험하였을 때 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 함유하는 시험 샘플에 대한 측정된 응고 강도, 예를 들어, 기계적 강도와 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 함유하는 대조군샘플의 각 응혈 용해 시간에 관해서 증가하는 상황을 포함한다. 응고 강도는 즉 Carr et al, 1991. (Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation. AM J MED Sci 1991; 302: 13-8)에 기술된 바와 같이 또는 트롬보엘라스토그래피를 수단으로 상기 기술된 바와 같이 검정한다.

용어" 피브린 응혈 형성의 향상"은 같은 응혈 강도 검정에서 시험하였을 때 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 함유하는 대조군 샘플의 피브린 응혈 형성의 각 비율 또는 정도에 관하여 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 함유하는 시험 샘플에 대한 피브린 응혈 형성의 정도가 증가하는 상황을 포함한다. 피브린 응혈 형성은 상기 기술된 바와 같이 검정한다.

용어 "응혈 시간을 단축"은 같은 응고 강도 검정에서 시험되었을 때 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하는 대조군샘플의 각 응혈 시간에 관하여 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 시험 샘플에 대한 응고 형성(응혈 시간)에 대해 측정된 시간이 증가하는 상황을 포함한다. 능숙한 사람에게 공지된 표준 PT 또는 aPTT 검정을 수단으로 응혈 시간을 검정한다.

용어" 혈소판의 수가 작거나 활성이 낮음"은 대상자의 혈장에 존재하는 혈소판(트롬보사이트)의 수, 그러한 혈소판의 생물학적, 응고관련 활성을 말한다. 증가된 혈소판 파괴, 감소된 혈소판 생산, 지라에 있는 혈소판의 보통 부분보다 큰 부분의 혼주때문에 수가 적어진다. 예를 들어, 저혈소판증은 마이크로리터당 150,000이하의 혈소판 수로 정의한다;정상적 혈소판 수의 상위 한계는 마이크로리터당 350,000 와 450,000 사이의 혈소판으로 간주한다. 혈소판 수는 자동화된 혈소판 카운터로 측정한다; 이는 능숙한 이들에게 잘 알려진 방법이다. 혈소판 수가 적어서 생기는 증후군은 제한없이, 저혈소판증, 응고병증을 포함한다. "활성"은 제한없이, 혈소판의 응고, 부착, 혈액 응고 활성을 포함한다. 당단백질의 이상, 막-세포골격 상호작용의 이상, 혈소판 미립의 이상, 혈소판 응고제활성의 이상, 신호 전달과 분비의 이상 때문에 활성이 감소한다. 응고, 부착, 응고제 활성을 포함한 혈소판 활성은 능숙한 이들에게 공지된 표준 방법을 사용하여 측정한다. 예를 들어, Platelets. A Practical Approach, Ed. S. P.Watson & K. S. Authi: clinical aspects of platelet Disorders (K. J. Clemetson) 15: 299-318,1996, Oxfor d University Press; Williams Hematology, Sixth Edition, Eds. Butler, Lichtman, Coller, Kipps & Seilgsohn, 2001, McGraw-Hill 참조. 혈소판 활성이 낮아서 발생하는 증후군은 제한없이 Glanzmann thrombathensis, Bernard-Soulier 증후군, 항응혈성 치료, 혈전용해치료를 포함한다. "낮은"은 같은 검정에서 측정하였을 때 보통 혼주혈장의 샘플에서의 수 또는 활성과 비교하여 시험 혈장 샘플의 수 또는 활성을 말한다.

여기에서 사용된 것처럼 용어 "출혈 질병"은 출혈 에피소드에서 명백한 세포 또는 분자 기원의 선천적인, 획득한 또는 유도된 결함을 말한다. 출혈 질병의 실시예는 제한없이, 응고 인자 부족 (즉 응고인자 Ⅷ, IX, XI 또는 Ⅶ의 부족), 응고 인자 저해제, 결손된 혈소판 기능 (예를 들어,Glanzmann thombasthenia와 Bernard-Soulier 증후군), 저혈소판증, von Willebrand's disease 와 응고단백질의 희석, 증가된 피브린용해, 출혈 및 /또는 수혈(예를 들어, 수술 또는 외상때문에 수혈받은 대상자)때문에 혈소판의 적은 수가 적은 응고병증을 포함한다.

출혈은 순환 시스템 조성물에서 유래한 혈액의 분출을 말한다. 용어 "출혈 에피소드"는 수술, 외상, 또는 조직 손상의 다른 형태와 출혈 질병이 있는 대상자에서 원하지 않는 출혈과 관련 원하지 않는, 제어되지 않는 그리고 종종 과도한 출혈을 포함하는 것을 의미한다. 선천적인 또는 획득한 응고또는 출혈 질병이 있는 대상자와 기본적으로 보통 응고시스템이 있지만 (일시적) 응고병증을 겪는 대상자에서 출혈 에피소드는 발생한다. 혈우병에서처럼 지혈성 시스템은 정상적인 필수적 혈액 응고 "화합물"(예를 들어, 혈소판 또는 von Willebrand 인자 단백질)이 부족하거나 비정상적이기 때문에 혈소판 기능이 결손된 대상자에서 출혈은 혈우병에 의해 야기된 출혈과 관련되어 있다. 예를 들어 수술 또는 심각한 외상과 관련하여 과도한 조직 손상이 있는 대상자에서 기본적으로(외상전 또는 수술전) 보통 지혈성 시스템에도 불구하고 보통 지혈성 시스템은 즉각적 지혈이 필요하고 과다한 출혈이 나타난다. 여러번 수혈된 그러한 대상자는 출혈 및/또는 수혈 (예를 들어, 출혈 및/또는 수혈로 인한 응고 단백질의 희석, 증가된 피브린 용해, 적은 수의 혈소판)의 결과로서 (일시적) 응고병증이 나타난다. 출혈은 또한 뇌, 내이 지역과 눈과 같은 기관에서 발생한다; 이들은 외과적 지혈 가능성이 제한되고 만족스런 지혈을 달성하기에 문제가 있는 지역이다. 복강경 수술과 기초적 치골뒤 전립선 절제술과 다양한 기관(간, 폐, 종양 조직, 위장계)유래의 생검을 다루는 공정에서 비슷한 문제가 발생한다. 이러한 상황에 보편적인 것은 출혈이 발산된(예를 들어, 출혈 위염와 과다 자궁 출혈)경우인 외과적 기술(봉합, 결찰 등)으로 인한 지혈성을 제공하는 어려움이다. 출혈은 주어진 치료에 의해 결손된 지혈성이 유도된 항응고제 치료에서의 대상자에서도 발생한다; 이러한 출혈은 종종 급성이고 과다이다. 혈전색전증을 예방하기 위해 항응고제치료를 한다. 그러한 치료는 헤파린, 다른 형태의 프로테오글리칸, 와파린 또는 다른 형태의 비타민 K 길항제, 아스피린과 예를 들어 GP IIb/Ⅲa 활성의 항체 또는 다른 저해제와 같은 다른 혈소판 응고 저해제 를 포함한다. 출혈은 항혈소판제 (예를 들어, 아세틸살리실산), 항응혈제(예를 들어, 헤파린), 피브린 분해제(예를 들어,조직 플라스미노겐 활성제, tPA)와 조합된 치료를 포함하는 혈전용해치료 때문이다. 출혈 에피소드는 급성 헤마루트로시스(관절에서 출혈), 만성 출혈성 관절증, 혈종(예를 들어, 근육, 복막뒤, 혀밑과 인두뒤), 다른 조직에서 출혈, 혈뇨(신장계에서 출혈), 뇌출혈, 수술(예를 들어, 간절제), 발치와 위장 출혈(예를 들어, UGI 출혈)이 있는 대상자에서 수술 또는 외상 때문에 제어되지 않은 과다한 출혈을 포함하는 것을 의미한다. 출혈 에피소드는 인자 Ⅷ에 대한 저해제; 혈우병 A ; 저해제가 있는 혈우병 A ; 혈우병 B; 인자 Ⅶ의 결핍; 인자 Ⅴ의 결핍; 저혈소판증; von Willebrand 인자의 결핍(von Willebrand's disease); 심한 조직 손상; 심한 외상; 수술; 복강경 수술; 출혈 위염; 생검 실시; 항응고제치료; 상부 위장 출혈(UGI); 또는 줄기 세포 이식과 관련이 있다. 출혈 에피소드는 과다한 자궁 출혈; 기계적지혈 가능성이 제한적인 기관 에서 발생; 뇌에서 발생; 내이 지역에서 발생; 또는 눈에서 발생한다. 용어 "출혈 에피소드"와 "출혈"은 적절하게 교환적으로 사용한다.

본문에서, 용어 "치료"는 예를 들어, 수술과 같이 예상된 출혈의 예방과 예를 들어, 외상에서와 같이 출혈을 억제 또는 최소화할 목적으로 이미 발생한 출혈의 조절을 포함하는 것을 의미한다. 상기 인용된 "예상된 출혈"은 특정 조직 또는 기관에서 발생할 것으로 예상되는 출혈 또는 구체적이지 않은 출혈이다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제의 치료용 투여는 용어 "치료"에 포함된다.

용어"대상자"는 여기에서 사용된 것처럼 는 인간과 같은 동물 특히 포유동물을 포함하고 적절하게 용어"환자"와 교환적으로 사용한다. 본 발명은 또한 수의학 과정 내에 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 tPA 억제제의 사용을 포함한다.

본 명세서에서 정의된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 동시에 또는 연속적으로 투여한다. 인자는 1회-투여량 형태는 양 응고 인자를 함유하는 1회 투여량 형태로 제공되거나 첫번째 단위 투여량 형태로서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 단위 투여량 형태로서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 부분들의 키트 형태로 제공된다. 본 명세서에서 첫번째 또는 두번째 또는 세번째, 단위투여량이 본 명세서에서 언급되면 이는 투여의 바람직한 정도를 나타내지 않으며 편의를 위해서 수행한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제의 "동시 투여"는 15 분, 바람직하게 10분, 더 바람직하게 5분, 더바람직하게 2 분의 시간 간격으로 1회-투여량 형태로 응고인자 단백질의 투여 또는 첫번째 응고인자 단백질 투여 후 두번째 응고인자 단백질의 투여를 의미한다. 양 인자는 첫번째로 투여한다.

"연속적" 투여는 첫번째 응고인자 단백질의 투여한 후 두번째 응고인자 단백질을 2 시간, 바람직하게 1 에서 2 시간, 더바람직하게 1 시간, 더바람직하게 30 분 내지 1 시간, 더 바람직하게 30 분, 더 바람직하게 15 내지 30 분의 시간 간격으로 두번째 응고인자 단백질의 투여를 의미한다. 두 단위 투여량 형태, 또는 응고인자 단백질은 첫번째로 투여한다. 바람직하게, 양 생성물은 같은 정맥내 접근을 통해 주사한다.

"인자 Ⅴ의 수준 "또는 "인자 Ⅴ 수준"은 건강한 대상자에서의 수준과 비교하여 환자의 인자 Ⅴ의 수준을 의미한다. 수준은 보통 수준의 비율로 지정한다. 용어는 적절하게 교환적으로 사용한다.

"인자 Ⅴ의 감소된 수준" 또는 "감소된 인자 Ⅴ 수준"은 인자 Ⅴ 결핍 또는 인자 Ⅴ의 저해제가 없는 대상자 집단에서 평균 인자 Ⅴ 수준과 비교하여 혈액 흐름에서 인자 Ⅴ의 존재 또는 활성이 감소하는 것을 의미한다. 인자 Ⅴ 순환수준은 혈액응고성 또는 면역 검정으로 측정할 수 있다. 인자 Ⅴ 활성은 인자 Ⅴ 결핍 혈장의 응혈 시간을 수정하는 환자의 혈장 능력으로 결정한다(예를 들어, APTT 검정, 하기 참조 ; 또한 본 명세서의 "검정 부분" 참조).

인자 Ⅴ의 한 단위는 보통 (혼주)인간 혈장의 밀리리터에 존재하는 인자 Ⅴ의 양으로 정의한다(100 %의 인자 Ⅴ 수준에 대응).

인자 Ⅶ의 한 단위는 약 0.5 ㎍ 단백질에 대응하는 보통 혈장 1 ml에 존재하는 인자 Ⅶ의 양으로 정의한다. 활성화 후 50 유닛은 약 1 ㎍ 의 단백질에 대응한다.

"부족"은 보통 건강한 개인에서의 존재 또는 활성과 비교하여 혈장에서 인자 Ⅴ의 존재 또는 활성의 감소를 의미한다. 용어는 적절하게 "감소된 인자 Ⅴ 수준"과 교환적으로 사용될 수 있다.

"APTT" 또는 "aPTT"는 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(예를 들어, proctor RR, Rapaport SI: The partial thromboplastin time with kaolin ; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficencies. Am J Clin Pathol 36: 212, 1961에 기술된 것처럼)을 의미한다.

"인자 Ⅴ반응 증후군"은 필요에 의하여 대상자에 투여된 외부 인자 Ⅴ가 증후군에 의해 야기된, 예측 혹은 존재하는 증상, 상태 또는 질병을 예방, 치료, 개선하는 것을 의미한다. 포함된 것은 제한없이, 인자 Ⅴ의 감소된 수준에 의해 야기된 증후군 예를 들어, 인자 Ⅴ에 대한 저해제에 의해 야기된 출혈 질병이다. 인자 Ⅴ 반응 증후군은 또한 본 발명에 따른 조성물로 치료한다.

"인자 Ⅶ반응 증후군"은 필요에 의하여 대상자에 투여된 외부 인자 Ⅶ, 바람직하게 인자 Ⅶa가 증후군에 의해 야기된 증상, 상태 또는 병을 예방, 치료 또는 개선하는 것을 의미한다. 포함된 것은 제한없이, 응고 인자 Ⅷ, IX, XI 또는 Ⅶ의 감소된 수준, 응혈 인자 저해제, 결손된 혈소판 기능에 의해 야기된 증후군(예를 들어, Glanzmann thombasthemia와 Bernard-Soulier증후군), 저혈소판증, von Willebrand's disease와 응혈 단백질의 희석, 출혈 및/또는 수혈(예를 들어, 수술 또는 외상 때문에 여러번 수혈된 대상자)로 인한 증가된 피브린 용해와 적은 수의 혈소판에 의해 야기된 것과 같은 응고병증이다.

"반감기"는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 혈장 농도의 특정값을 그 값의 반으로 감소시키는 데 필요로 하는 시간을 말한다.

"일차 지혈"은 FXa와 TF: 인자 Ⅶa에 의한 트롬빈의 초기 생성, 혈소판의 후속하는 활성화, 피브린과 최종적으로, 교차결합된 피브린에 의해 아직 안정화되지 않은 활성화된, 부착된 혈소판의 초기 느슨한 플러그의 형성을 의미한다. 지혈과정의 두번째 단계(유지된 지혈)동안에 형성된 피브린에 의해 안정화되지 않으면 , 플러그는 피브린 분해 시스템에 의해 쉽게 용해한다.

"이차 지혈" 또는"유지된 지혈"은 활성화된 혈소판의 표면에서 발생하는 트롬빈의 두번째 완전한 주된 파열 또는 생성을 의미하고 인자 Ⅶla와 인자 Ⅶla, 피브린의 후속하는 형성과 초기 혈소판 플러그의 안정화에 의해 촉매한다.

"완전한 지혈"은 출혈을 효과적으로 멈추고 피브린 분해성 시스템에 의해 쉽게 분해되지 않는 상처의 부위에서 안정한 고체 피브린 혈병 또는 플러그의 형성을 의미한다. 본문에서, 용어 지혈은 상기 기술된 바와 같이 완전한 지혈을 나타내는 데 사용한다.

제제에서 단백질의 전체 양은 일반적으로 알려진 방법 예를 들어, 광학 밀도를 측정하여 측정한다. 인자 Ⅴ 응고 또는 인자 Ⅶ 단백질 ("항원")의 양은 제제의 단백질 전체 양은 표준 엘리자 면역 검정과 같은 일반적으로 알려진 방법으로 측정한다. 일반적 용어에서, 인자 Ⅴ 단백질을 함유하는 제제의 용액과 엘리자 플레이트에 부동적인 항-트롬보모튤린 항체와 접촉하고 부동적 항체-인자 Ⅴ 복합체와 마커를 가지는 두번째 항-인자 Ⅴ 항체와 연속적으로 접촉시켜 그러한 검정을 수행하고 세번째 단계에서 그 양을 측정한다. 각 응고인자의 양은 적절한 항체를 사용하여 비슷한 방식으로 측정한다. 제제에 존재하는 응고인자 단백질의 전체 양은 각 응고인자 단백질의 양을 첨가하여 결정한다. 한 실시예에서, 제제는 분리된 응고인자를 포함한다. 또다른 구체예에서 제제는 응고인자 II와 응고인자 IIa (프로트롬빈와 트롬빈) 및/또는 인자 X 또는 Xa가 없다.

여기에서 사용된 것처럼, 용어 "분리된"은 혈액 응고인자 즉 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드가 합성되는 세포 또는 자연적으로 발견되는 매체 (예를 들어, 혈장 또는 혈액)로부터 분리되는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 말한다. 세포로부터 폴리펩티드를 분리하는 것은 제한없이, 부착 세포 배양물로부터 바람직한 생성물을 함유하는 세포 배양 매체를 제거; 비부착 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과;등을 포함한 당업계에 공지된 방법으로 수행한다. 자연적으로 발생하는 매체에서 폴리펩티드의 분리는 제한없이, 각각 항-인자 Ⅶ 또는 항-인자 Ⅴ 항체 칼럼과 같은 친화 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 과정 (예를 들어, 예비 등전점 분리법(IEF)), 차별적 용해성(예를 들어, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출을 포함한 당업계에 공지된 방법으로 수행한다.

본 발명 내에서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 "효과적인 양"은 병과 합병증을 치료, 개선, 부분적으로 정지하기 위해서 출혈 또는 혈액 손실을 예방 또는 감소하기에 충분한 인자 Ⅶ 폴리펩티드의 양 즉 FⅦa와 인자 Ⅴ 폴리펩티드의 양으로 정의한다.

용어 "인자 Ⅶa의 활성" 또는 "인자 Ⅶa-활성"은 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다; 용어는 또한 조직 인자가 없을 때 활성화된 혈소판의 표면에서 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다,

축약

TF 조직 인자

FⅦ 단일 사슬, 비활성화된 형태의 인자 Ⅶ

FⅦa 활성화된 형태의 인자 Ⅶ

rFⅦa 활성화된 형태의 재조합체 인자 Ⅶ

TAFI 지모겐, 비활성화된 형태의 TAFI

인자 Ⅴ 지모겐, 비활성화된 형태의 인자 Ⅴ

인자 Ⅴa 활성화된 형태의 인자 Ⅴ

r인자 Ⅴ 재조합체 인자 Ⅴ

r인자 Ⅴa 재조합체 인자 Ⅴa

화합물의 제제 :

본 발명에서 사용하기에 적절한 인간 정제된 인자 Ⅶa는 바람직하게 Hagen et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416,1986, 또는 유럽 특허 No. 200.421(ZymoGenetics, Inc.)에 기술된 바와 같은 DNA 재조합체 기술로 제조한다.

인자 Ⅶ는 또한 Broze와 Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980와 Hednerand Kisiel, J. Clin. lnvest. 71: 1836-1841,1983.에 기술된 방법으로 생산한다. 이러한 방법으로 다른 혈액 응고인자의 검출가능한 양이 없는 인자 Ⅶ을 생성한다. 최종 정제 단계로서 추가 젤 여과를 포함한 방법으로 더 정제된 인자 Ⅶ 제제를 획득한다. 인자 Ⅶ는 공지된 수단, 즉 인자 Xlla, IX a 또는 Xa와 같은 여러가지 다른 혈장 단백질에 의해 활성화된 인자 Ⅶa로 전환한다. 대안적으로, Bjoern et al.(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 기술된 바와 같이, 인자 Ⅶ는 Mono Q??(Pharmacia fine Chemical) 등과 같은 이온-교환 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜 활성화한다.

인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 야생형 인자 Ⅶ의 변이체 또는 재조합체 기술로 제조한다. 야생형 인자 Ⅶ와 비교하여 아미노산 서열이 변경된 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 아미노산 코돈을 변경 또는 예를 들어, 위치 특이적 변이체와 같은 공지된 수단으로 자연 인자 Ⅶ을 암호화하는 핵산에서 아미노산 코돈의 일부를 제거함으로써 야생형 인자 Ⅶ를 암호화하는 핵산 서열을 변경하여 제조한다.

당업계에서 능숙한 사람에게 인자 Ⅶa 또는 인자 Ⅴ분자의 기능에 중대한 지역 외부에서 치환될 수 있고 활성적인 폴리펩티드를 형성하는 것이 분명하다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 활성 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 활성에 필수적이고 치환되지 않은 아미노산 잔기는 위치 특이적 변이체 또는 알라닌 스캐닝 변이체(참조, 예를 들어, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085)과 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인한다. 후 기술에서, 분자에서 모든 양으로 전하된 잔기에서 변이체가 도입되고 형성된 변이체 분자는 분자의 활성에 중대한 아미노산 잔기를 확인하기 위한 응고 교차 결합 활성에 대해서 시험한다. 기질-효소 상호작용의 부위는 핵 자기 공명 분석, 크리스탈로그래피 또는 광친화 라벨링과 같은 3차원적 구조의 분석으로 결정할 수 있다(de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular biology 224 : 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64참조).

하나의 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 교환하기 위해서 변이체를 핵산 서열에 도입하는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 부위 특이적 변이유발로 수행한다. 해당 인서트와 원하는 변이체를 포함하는 2개의 합성 프라이머가 있는 고도로 꼬아진 이중 가닥 DNA 벡터를 이용하는 과정이 특히 유용하다. 벡터의 맞은 편 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 폴리머라아제를 수단으로 온도 싸이클동안에 증폭된다. 프라이머가 결합되자마자, 엇갈린 닉을 함유하는 변경된 플라스미드가 생성된다. 온도 싸이클 후에, 생성물은 모 DNA 템플레이트를 소화하고, 변이체를 함유하는 합성된 DNA를 선택하기 위한 메틸화된 그리고 헤미메틸화된 DNA에 특이적인 Dpnl로 처리한다. 변이체를 생성, 확인하고 분리하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 유전자 셔플링 또는 파지 전시 기술등이 사용될 수 있다.

세포에서 폴리펩티드를 분리하는 것은 부착 세포 배양물로부터 바람직한 생성물을 포함하는 세포 배양 매체의 제거; 부착되지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과; 기타 등을 포함하는 당업계에 공지된 방법으로 수행한다.

선택적으로, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드를 더 정제될 수 있다. 정제는 제한없이, 항-인자 Ⅶ 항체 칼럼과 같은 친화 크로마토그래피를 포함한 당업계에 공지된 방법(참조, 예를 들어, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097,1986 ;and Thim et al., Biochem. 27: 7785,1988); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 과정 (예를 들어, 예비 등전점 분리법(IEF), 차별적 용해성(예를 들어, 암모늄 설페이트 침전), 또는 추출 등으로 수행한다. 일반적으로, Scopes, protein purification, Springer-Verlag, New York, 1982;and protein purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. 참조. 후속하는 정제, 제제는 바람직하게 숙주 세포에서 유도된 비인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 중량 약 10% 미만, 더 바람직하게 약 5% 미만, 가장 바람직하게 약 1 % 미만을 포함한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 IXa, kallikrein, 인자 Xa와 트롬빈과 같은 트립신 유사 특이성이 있는 인자 Ⅴ 또는 다른 프로테아제를 사용하여 단백질 분해 절단으로 활성화한다. Osterud et al., biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, US Patent No. 4,456, 591; and Hedner et al., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983)참조. 대안적으로, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 Mono Q?? (Pharmacia) 등과 같은 이온-교환 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜서 활성화한다. 형성된 활성화된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드는 하기 기술된 바와 같이 제제되고 투여한다.

본 발명에서 사용하기 위한 인자 Ⅴ를 공지된 방법에 따라 혈소판 또는 내피 세포로부터 분리한다; 하지만, 병 감염 위험이 있는 혈액 또는 조직유도된 생성물을 사용하는 것을 회피하기 위해서 재조합체 인자 Ⅴ를 사용하는 것이 바람직하다. 재조합체 인자 Ⅴ를 분리하고 재조합체 인자 Ⅴ를 준비하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Pannekoek et al., JOURNAL EMBO J. 5 (10),2539-2544 (1986), Gils et al., Biochim Biophys Acta. 1998 Sep 8 ; 1387 (1-2): 291-7; Sui et al. Biochem J.1998 Apr 15 ; 331 (Pt 2) : 409-15; Ginsburg, et al., J. Clin. Invest.,vol. 78, pp. 1673-1680 (1986); or US patent Nos. 6,303, 338 and 6,103, 498 참조. 인자 Ⅴ 변이체를 상기 기술된 바와 같은 부위 특이적 변이유발로 제조한다.

인자 Ⅴ관련 폴리펩티드를 야생형 인자 Ⅴ의 변경 또는 재조합체 기술로 생산한다. 야생형 인자 Ⅴ와 비교하여 아미노산 서열이 변경된 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드를 상기 더 구체적으로 기술된 것과 같이 부위-특이적 변이유발과 같은 공지된 수단으로 자연 인자 Ⅴ를 암호화하는 핵산에서 아미노산 코돈을 변경 또는 아미노산 코돈의 일부를 제거하여 야생형 인자 Ⅴ를 암호화하는 핵산 서열을 변경하여 제조한다. 원료의 세포로부터 폴리펩티드의 분리는 부착 세포 배양물로부터 원하는 생성물을 함유하는 세포 배양 매체의 제거; 부착하지 않은 세포를 제거하기 위한 원심분리 또는 여과;등을 포함한 당업계에 공지된 방법으로 달성한다. 선택적으로, 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 더 정제한다. 정제는 더 자세히 기술된 바와 같이 항-인자 Ⅴ 항체 칼럼에서와 같은 친화 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 과정(예를 들어, 예비 등전점 분리법 (IEF), 차별적 용해성 (예를 들어, 암모늄 설페이트 침전), 추출 등을 포함한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 달성한다. 정제 후에, 제제는 바람직하게 숙주 세포에서 유도된 비-인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 약 10 중량 % , 더바람직하게 약 5% 미만 가장 바람직하게 약 1 % 미만을 포함한다. 생성된 활성화된 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 하기 기술된 바와 같이 제제되거나 투여한다.

당업계에서 능숙한 이들이 평가한 바와 같이, 면역 반응을 유도하는 위험을 감소시키기 위해서 대상자와 동질유전자적 인자 Ⅴ 폴리펩티드와 인자 Ⅶa 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 인간이 아닌 인자 Ⅴ의 제조와 특성 규명은 예를 들어, Katzmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:162, 1981에 개시되어 있다. 본 발명은 또한 수의학 공정내에서 인자 Ⅴ 폴리펩티드와 인자 Ⅶ 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다.

약제적 조성물과 사용 방법

본 발명의 제제는 제한없이, 응고 인자 Ⅷ, IX, XI 또는 Ⅶ의 수준이 감소하여 생긴 증후군, 혈액 응고 인자 저해제에 의해 야기된 증후군, 결손된 혈소판 기능에 의해 야기된 증후군(예를 들어, Glanzmann thombasthemia 와 Bernard-Soulier 증후군), 저혈소판증, von Willebrand's disease와 응고단백질의 희석, 피브린용해의 증가, 출혈 및/또는 수혈로 인한 혈소판 수의 감소(예를 들어, 수술 또는 외상 때문에 여러 번 수혈된 대상자에서)에 의해 야기된 응고병증을 포함한 예를 들어 출혈 장애와 같은 인자 Ⅶ 반응 증후군을 치료하는 데 사용한다. 본 발명에 따른 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제를 포함하는 약제적 조성물은 예방적 및/또는 건강유지에 도움이 되는 예방적으로 비경구 투여용이다. 바람직하게, 약제적 조성물은 장관외적으로, 예를 들어, 정맥내로, 피하로 또는 근육내부; 가장 바람직하게 정맥내로 투여한다. 이는 지속적 또는 박동성 주입으로 투여한다.

본 발명에 따른 약제적 조성물 또는 제제는 인자Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하고, 1회-단위 투여량 형태 또는 약제적 수용가능한 담체로, 바람직하게 수용성 담체 또는 희석제에 희석된 부분들의 키트의 형태로 제조한다. 간략하게, 본 발명에 따라 사용하기에 적절한 약제적 조성물은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드, 또는 인자 Ⅴ, 또는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드를 바람직하게 정제된 형태의 인자 Ⅴ와 조합하여 적절한 보조제와 적절한 담체 또는 희석제와 혼합하여 만든다. 물, 완충된 물, 0.4% 염용액, 0.3% 글리신과 유사물과 같은 다양한 수용성 담체가 사용한다. 발명의 제제는 상처 부위에 송달 또는 표적인 젤 또는 리포좀 제제의 형태로 비수용성 담체를 사용하여 제조한다. 리포좀 제제는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 Nos. 4,837, 028, 4,501, 728 과 4,975, 282에 기술되어 있다. 조성물은 통상적, 공지된 멸균 기술로 멸균한다. 형성된 수용액은 사용하기 위해 포장 또는 무균 조건에서 여과하고 동결건조하며 동결건조된 제제는 투여 전에 살균된 수용액과 결합한다.

조성물은 예를 들어, 나트륨 아세테이드, 나트륨 락테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘등과 같은 pH 조정제와 버퍼제 및/또는 탄력성 조정제 등을 포함한 약학적으로 수용가능한 보조 물질 또는 보조제를 함유한다.

제제는 하나 또는 그 이상의 희석제, 유화제, 방부제, 버퍼, 첨가제를 더 포함하고 액, 가루, 유제, 제어된 방출 등을 포함한다. 당업계에서 능숙한 사람은 Remington's pharmaceutical Sciences. Gennaro, ed. , Mack PublishIng Co. , Easton, PA, 1990 에 개시된 것과 같은 용인된 관행에 따라 적절한 방식으로 본 발명의 조성물을 제제한다. 따라서, 정맥내주입을 위한 전형적 약제적 조성물은 멸균 Ringer 용액 250 ml와 제제의 10 mg을 포함하도록 만든다.

본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 예방용 및/또는 치료용 치료제로 투여될 수 있다. 치료적 응용에서, 상기 기술된 바와 같이 병을 이미 겪은 대상자에 병과 이의 합병증의 임상적 명시를 치료, 완화 또는 부분적으로 정지시키기에 충분한 양의 조성물을 투여한다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적으로 효과적인양"으로 정의한다. 각 목적에 효과적인 양은 대상자의 체중과 일반적인 상태와 병 또는 상처의 심각성에 따라 달라진다. 적절한 투여량을 결정하는 것은 값의 메트릭스를 작성하고 메트릭스의 다른 위치를 시험하여 통상적 시험을 사용하여 달성할 수 있음을 이해해야 한다.

국부적 응용과 같은 본 발명의 제제의 국부적 송달은 관접목 또는 스턴트로 통합된 스프레이, 살포, 이중 풍선 카테터, 스턴트, 풍선 카테터를 코팅하기 위해 사용되는 하이드로젤 또는 다른 설정된 방법을 사용하여 수행한다. 어떠한 경우에도, 약제적 조성물은 상태를 치료하기에 충분히 효과적인 제제의 양을 제공해야 한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드, 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 농도는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 이러한 제제에서 조합하면 즉 약 0.5 중량% 미만, 또는 적어도 약 1중량 % 에서 15 또는 20 중량 % 까지 널리 변할 수 있고 선택된 투여의 특정 방식에 따라서 체액 부피, 점성등에 의해 선택할 수 있다. 주사 또는 주입에 의한 투여, 특히 주사가 바람직하다. 따라서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 한 투여량 형태에 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 함유하는 동결건조된 가루 또는 액체 제제, 또는 한 투여량 형태에 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드를 함유하는 용해된 동결건조된 가루 또는 액체 제제와 다른 투여량 형태에 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 함유하는 용해된 동결건조된 가루 또는 액체 제제와 같은 정맥내투여에 적절한 형태로 제조한다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 양과 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 양은 함께 출혈 에피소드를 치료하는 데 집합적인 효과적인 양을 포함한다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명의 물질은 심각한 질병 또는 상처 상태 즉 생명을 위협하거나 잠정적으로 생명을 위협하는 상황에서 일반적으로 사용됨을 명심해야 한다. 그러한 경우에, 인간에서 외부 물질의 최소화와 인자 Ⅶa와 인자 Ⅴ의 면역성이 일반적으로 부족하다는 관점에서 이러한 조성물의 실질적 초과량을 외과 의사가 투여하는 것이 가능하고 바람직하다.

예방적 응용에서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 제제를 함유하는 조성물은 대상자의 응고 능력을 향상하기 위해서 질병 상태 또는 상처의 위험에 민감한 대상자에 투여한다. 그러한 양은 "예방적으로 효과적인 양"으로 정의한다. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 양과 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 양은 함께 출혈 에피소드를 예방하기에 집합적인 효과적인 양을 포함한다는 것을 이해해야 한다.

조성물의 1회 또는 복합 투여는 외과 의사가 선택한 투여량 수준과 패턴으로 수행할 수 있다. 조성물은 일 또는 주마다 한 번 이상 투여한다. 그러한 약제적 조성물의 효과적인 양은 출혈 에피소드에 대해 만성 으로 중요한 효과를 제공하는 양이다. 그러한 양은 치료되는 특정 상태, 나이, 무게, 대상자의 일반적 건강, 당업계에 능숙한 이들에게 명백한 다른 인자에 의존한다.

발명의 조성물은 일반적으로 예상된 출혈 전 또는 출혈의 시작에 1회투여량 형태로 투여한다. 또한 주어진 투여량과 대상자의 상태에 따라 바람직하게 2-4-6-12 시간 간격으로 반복적으로(복합투여량 형태로) 투여한다.

고의적으로 개입된 치료를 하기 위해서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 개입을 수행하기 전에 약 24 시간 내에 7일 또는 그 이상동안 투여한다. 혈액 응고제로서 투여는 여기에서 기술된 바와 같이 다양한 계가 될 수 있다.

조성물은 적절한 농도에서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 1회 제제 (1회-투여량 형태)이다. 조성물은 또한 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 첫번째 단위 투여량 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 두번째 단위 투여량 형태로 구성된 부분들의 키트 형태이다. 이 경우에, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 바람직하게 약 15 분 내에, 예를 들어 10 분 내 또는, 바람직하게 5 분 내 또는 더 바람직하게, 2 분 내로 차례차례 투여되어야 한다. 두 단위 투여량 형태중 각각은 첫번째로 투여될 수 있다.

키트는 적어도 2개의 별개 약제적 조성물을 포함한다. 키트는 분리된 병 또는 분리된 포일 파켓과 같은 별개 조성물을 포함하는 용기 수단을 포함한다. 전형적으로 키트는 별개 조성물의 투여를 위한 지침서를 포함한다. 키트 형태는 별개 조성물이 다른 투여량 형태로 바람직하게 투여될 때 특히 이롭고, 다른 투여량 간격으로 투여되거나, 외과 의사가 조합의 각 조성물의 적정을 선호할 때 특히 유용하다.

본 발명에 따른 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 양과 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 투여된 양은 비율에서 약 1: 100 내지 약 100: 1 (w/w)로 변할 수 있다. 인자 Ⅴ에 대한 인자 Ⅶ의 비율은, 예를 들어, 약 1 : 100, 또는 1 : 90, 또는 1 : 80, 또는 1 : 70 또는 1 : 60, 또는 1 : 50, 또는 1 : 40, 또는 1 : 30, 또는 1 : 20, 또는 1 : 10, 또는 1 : 5, 또는 1 : 2, 또는 1: 1, 또는 2: 1, 또는 5: 1, 또는 10: 1, 또는 20: 1, 또는 30.1, 또는 40: 1, 또는 50: 1, 또는 60: 1, 또는 70: 1, 또는 80: 1, 또는 90: 1, 또는 100: 1; 또는 약 1: 90 내지 약 1: 1, 또는 약 1: 80 내지 약 1: 2, 또는 약 1: 70 내지 약 1: 5, 또는 약 1: 60 내지 약 1: 10, 또는 약 1: 50 내지 약 1 : 25, 또는 약 1: 40 내지 약 1: 30, 또는 약 90: 1 내지 약 1: 1, 또는 약 80: 1 내지 약 2: 1, 또는 약 70: 1 내지 약 5: 1, 또는 약 60: 1 내지 약 10: 1, 또는 약 50: 1 내지 약 25: 1, 또는 약 40: 1 내지 약 30: 1이다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 투여량은 야생형 인자 Ⅶ의 약 0.05 mg 내지 약 500 mg/day 범위 예를 들어, 대상자의 무게, 상태와 상태의 심각성에 따라서 로드와 유지양으로서 70 kg 대상자에 대해 약 1 mg 내지 약 200 mg/day까지, 또는, 예를 들어, 약 5 mg 내지 약 175 mg/day이다.

인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 투여량은 야생형 인자 Ⅴ의 약 0.05 mg 내지 약 500 mg/day 범위 예를 들어, 대상자의 무게, 상태와 상태의 심각성에 따라서 로드와 유지양으로서 70kg 대상자에 대해 약 1 mg 내지 약 200 mg/day까지, 또는, 예를 들어, 약 1 mg 내지 약 175 mg/day이다.

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 조합하면 시험관 내 응고 강도와 피브린용해 시간 검정에서 상승 효과를 보인다. 그리고, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 조합하면, 안정한 피브린 혈액 응고를 형성할 때 반-응혈 용해 시간을 증가, 응혈 강도를 증가, 피브린 용해에 대한 저항성을 증가시키는 상승 효과를 보인다.

조성물은 적절한 농도에서 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하는 단일 제제의 형태이다. 조성물은 또한 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드를 포함하는 첫번째 단위 투여량 형태, 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 포함하는 두번째 단위 투여량 형태로 구성된 키트의 형태이다.

이 경우에, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 순차적으로, 바람직하게 약 1-2 시간 내에, 예를 들어 30 분 내 또는, 바람직하게, 10 분 내 또는, 더 바람직하게, 5 분 내로 투여되어야 한다. 두 개의 단위 투여량 형태중 각각은 첫번째로 투여되어야 한다.

본 발명은 출혈 에피소드의 예방 또는 치료 개별적으로 투여되는 활성적인 성분을 조합하여 치료에 의한 응고 치료하는 것과 관련있기 때문에, 발명은 또한 키트 형태의 개별적 약제적 조성물을 조합하는 것과 관련된다. 키트는 적어도 두개의 개별적 약제적 조성물을 포함한다. 키트는 분리된 병 또는 분리된 포일 파켓과 같은 개별적 조성물을 포함하는 용기 수단을 포함한다. 전형적으로 키트는 개별 조성물의 투여를 위한 지침서를 포함한다. 키트 형태는 별개 조성물이 다른 투여량 형태로 바람직하게 투여될 때, 다른 투여량 간격으로 도입될 때, 조합의 각 조성물의 적정이 바람직할 때 특히 유용하다.

검정 :

인자 Ⅶa 활성 시험 :

인자 Ⅶa 활성을 시험하고 적절한 인자를 선택하기 위한 적절한 검정

Ⅶa 변이체가 단순한 예비 시험관 내 시험으로 검정될 수 있다:

시험관 내 가수분해 검정

본래 (야생형) 인자 Ⅶa와 인자 Ⅶa 변이체를("인자 Ⅶa"로 언급됨) 특이적 활성에 대해 검정한다. 특이적활성과 직접적으로 비교하기 위해 동시에 검정할 수 있다. 검정은 미세적정 플레이트(MaxiSorp, Nunc,Denmark)에서 수행한다. 발색성 기질 D-lle-Pro-Arg-p-니트로아닐리드(S-2288, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 1 mM은 pH 7.4에서 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl₂ 와 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 50 mM Hepes에 있는 인자 Ⅶa (최종 농도 100 nM)에 첨가한다. 405 nm에서 흡수도는 SpectraMax 340 plate reader (Molecular Devices, USA)와 연속적으로 측정한다. 효소를 함유하지 않는 블랭크 웰에서 흡수도를 뺀 후에 20분 배양하는 동안 발생한 흡수도는 변이체와 야생형 인자 Ⅶa의 활성 간의 비율을 계산하는 데 사용한다 :

비율= (A_{405 nm} 인자 Ⅶa 변이체)/ (A_{405 nm} 인자 Ⅶa 야생형).

이에 근거하여, 본래 인자 Ⅶa와 비교할 만한 또는 더 높은 활성이 있는 인자 Ⅶa 변이체, 예를 들어, 변이체의 활성과 본래 인자 Ⅶ의 활성 (야생형 FⅦ) 비율이 약 1.0.이상인 변이체를 확인할 수 있다.

인자 Ⅶa와 인자 Ⅶa 변이체의 활성은 적절한 발색성 기질(예를 들어 S-2765)을 첨가한 후 생성된 인자 Xa를 측정하는 적절하게 100-1000 nM의 농도에서 인자 X와 같은 생리적 기질을 사용하여 측정한다. 추가로, 활성 검정은 생리적 온도에서 수행된다.

시험관 내 단백질용해 검정

본래 (야생형) 인자 Ⅶa와 인자 Ⅶa 변이체 ("인자 Ⅶa"로 언급된)은 특이적활성을 직접적으로 비교하기 위해서 동시에 검정한다. 검정은 미세적정 플레이트 (MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행한다. 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl₂와 1 ㎎/ml 소 혈청 알부민을 함유하는 100㎖ 50 mM Hepes에서 인자 Ⅶa(10 nM)와 인자 X (0.8 microM)을 pH 7.4에서 15분 동안 배양한다. 인자 X 절단은 0.1 M NaCl, 20 mM EDTA와 1 mg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 50 microL 50 mM Hepes, pH 7.4을 첨가하면 중단된다. 생성된 인자 Xa의 양은 발색성 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아닐리드(S-2765, Chromogenix, Sweden), 최종 농도 0.5 mM을 첨가하여 측정한다. 405 nm 에서 흡광도는 SpectraMax^TM 340 plate reader (Molecular Devices, USA)로 연속적으로 측정한다. FⅦa을 포함하지 않는 블랭크 웰에서의 흡광도를 뺀 후에 10 분 동안 발생한 흡광도는 변이체의 단백질 분해 활성과 야생형 인자 Ⅶa의 비율을 계산하는데 사용한다 :

비율= (A405 nm 인자 Ⅶa 변이체)/ (A405 nm 인자 Ⅶa 야생형).

이에 근거하여, 변이체의 활성과 본래 인자 Ⅶ(야생형 FⅦ)의 활성사이의 비율이 약 1.0 이상인 변이체와 같은 본래 인자 Ⅶa 과 비교할 만하거나 더 높은 활성이 있는 인자 Ⅶa 변이체를 확인할 수 있다.

트롬빈 생성 검정 :

인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드 또는 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드 (예를 들어, 변이체)의 트롬빈을 생성하는 능력은 생리적 농도와 활성화된 혈소판에서 모든 적절한 응고 인자와 저해제를 포함하는 검정에서 측정할 수 있다(여기에 참고문헌으로 통합된 p. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,542-547 에서 기술된 바와 같이).

인자 Ⅴ 활성에 대한 시험 :

본 발명에 따라 유용한 인자 Ⅴ 폴리펩티드는 Thorelli et al., Thromb Haemost 80: 92, 1998 ("인자 Ⅴ 검정")에 기술된 응혈 검정과 같은 시험관 시험에서 단순한 예비 실험으로 수행될 수 있는 적절한 검정으로 선택한다.

본 발명은 다음 실시예로 예시되지만 보호의 범위를 제한하도록 구성되지 않았다. 앞서 말한 명세서와 다음 실시예에 기술된 특징은 개별적으로 그리고 조합하여 다양한 형태의 발명을 인지하기 위한 재료이다.

실시예 1

방법 :

응혈 검정: 50 mM 관에 있는 rFVlla(1 ㎍/ml)의 일정분량(55 ㎕), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% BSA, pH 7.2 를 같은 버퍼에 100 uM PC/PS 소포와 50 mM CaCl₂ 를 함유하는 55 ㎕ 일정분량으로 5분 동안 배양하였다. 정상적 인간 혈장(NHP) 또는 인자 Ⅷ-결핍 혈장 (FVIII-DP)의 55 ㎕ 일정량을 첨가하고 표준 APTT 프로그램을 사용하여 ACL 응혈 기계에서 400 초 동안 응혈이 후속한다. 표시된 곳에서, 인자 V(30 nM) 가 포함된다.

결과:

응혈 검정: 인자Vlla 또는 인자 V를 첨가하기 전에, FⅧ-DP와 NHP 는 400 초 조정 시간 내에 응혈하지 않았다. 인자 Vlla (1 ㎍/ml)을 첨가하면 응혈 시간을 NHP 에서 184.0±1.1 초 그리고 FⅧ-DP에서 126.6±3.1 초로 감소시켰다. 인자 Vlla (1 ㎍/ml)와 인자 V (30 nM)를 첨가하면 응혈 시간을 NHP 에서 116.2±0.8 초 그리고 FⅧ-DP에서 109.8±1.41 초로 각각 감소시켰다(도 1).

결론: 이러한 결과에 의하면 인자 Vlla 과 인자 V 를 상승 방식으로 혈장에 첨가하면 정상 그리고 FⅧ-DP의 응혈 시간을 줄인다.

Claims (56)

1. 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드를 포함하는 약제적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 아미노산 서열 변이체인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 "시험관 내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 활성과 본래의 인간 인자 Ⅶa (야생형 FⅦa)의 활성간의 비율은 적어도 약 1.25인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ는 인간 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ는 재조합체 인간 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 활성화된 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ는 재조합체 인간 인자 Ⅶa인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 아미노산 서열 변이체인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 "인자 Ⅴ 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 활성과 본래의 인간 혈장 인자 Ⅴ(야생형 FXI)의 활성간의 비율은 적어도 약 1.25인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 인간 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 혈소판 또는 혈장에서 유래한 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 재조합체 인간 인자Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 재조합체 인간 활성화된 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 상기 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 약 100:1 과 약 1: 100 (w/w 인자 Ⅶ:인자 Ⅴ)사이의 질량비로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 또는 주입, 특히 주사에 적절한 약제적으로 수용가능한 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
20. a) 첫번째 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 약제적 수용가능한 담체의 제제;

    b) 두번째 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 약제적 수용가능한 담체의 제제;

    c) 상기 첫번째 그리고 두번째 투여량 형태를 함유하는 용기 수단을 포함하는 출혈 에피소드의 치료제를 함유하는 부분들의 키트.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 키트.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ 아미노산 서열 변이체인 것을 특징으로 하는 키트.
23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 "시험관내 가수분해 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 활성과 본래의 인간 인자 Ⅶa(야생형 FⅦa)의 활성간의 비율은 적어도 약 1.25인 것을 특징으로 하는 키트.
24. 제 20 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 키트.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 는 인간 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 키트.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 폴리펩티드는 재조합체 인간 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 키트.
27. 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드는 활성화된 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ는 재조합체 인간 인자 Ⅶa인 것을 특징으로 하는 키트.
29. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 키트.
30. 제 29 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ 아미노산 서열 변이체인 것을 특징으로 하는 키트.
31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 "인자 Ⅴ 검정"에서 시험하였을 때 상기 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 활성과 본래의 인간 인자 Ⅴ(야생형 인자 Ⅴ)의 활성간의 비율은 적어도 약 1.25인 것을 특징으로 하는 키트.
32. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 키트.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 인간 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 키트.
34. 제 33 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 혈소판 또는 혈장에서 유래한 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 재조합체 인간 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 인자 Ⅴ는 재조합체 인간 활성화된 인자 Ⅴ인 것을 특징으로 하는 조성물.
37. 제 20 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드는 약 100:1 과 약 1: 100 (w/w 인자 Ⅶ: 인자 Ⅴ)사이의 질량비로 존재하는 것을 특징으로 하는 키트.
38. 출혈 에피소드의 치료를 위한 약제를 제조하기 위해서 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 조합하여 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 사용.
39. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 에피소드를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 조성물의 사용.
40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 약제는 응혈 시간을 감소시키기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
41. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 약제는 응혈 분해 시간을 연장시키기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
42. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 약제는 응혈 강도를 증가시키기 위한 것임을 특징으로 하는 사용.
43. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 약제는 주사 또는 주입, 특히 주사용으로 제제된 것임을 특징으로 하는 사용.
44. 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 에피소드는 외상 또는 수술 또는 혈소판의 적은 수나 낮은 활성으로 인한 것임을 특징으로 하는 사용.
45. 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 에피소드는 응고 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ 또는 von Willebrand 인자의 적은 양이나 낮은 활성으로 인한 것임을 특징으로 하는 사용.
46. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제는 1회 투여 형태인 것을 특징으로 하는 사용.
47. 제 38 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 첫번째 단위 투여 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 두번째 단위 투여 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 사용.
48. 시험체에서 출혈 에피소드를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양은 함께 출혈을 치료하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 시험체에서 응혈 시간을 감소시키기 위한 방법으로, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양은 함께 응혈 시간을 감소시키는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
50. 시험체에서 지혈을 향상시키는 방법으로, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양은 함께 지혈을 향상시키는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
51. 시험체에서 응혈 용해 시간을 연장시키는 방법으로, 상기 방법은 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양은 함께 응혈 용해 시간을 연장시키는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
52. 시험체에서 응혈 강도를 증가시키기 위한 방법으로, 첫번째 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드의 제제와 두번째 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드의 제제가 필요한 시험체에 투여하는 것을 포함하며, 첫번째와 두번째 양은 응고 강도를 증가시키는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
53. 제 48 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드는 1회 투여량 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
54. 제 48 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드를 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 첫번째 투여량 형태와 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ관련 폴리펩티드의 제제를 포함하는 두번째 투여량 형태로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
55. 제 54 항에 있어서, 첫번째 투여량 형태와 두번째 투여량 형태는 15분 이하의 시간 간격으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
56. a) 1회 단위 투여량 형태의 효과적인 양의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶ 관련 폴리펩티드와 효과적인 양의 인자 Ⅴ 또는 인자 Ⅴ 관련 폴리펩티드와 약제적 수용가능한 담체와;

    b) 상기 1회 단위 투여량 형태를 함유하는 용기 수단을 포함하는 출혈 에피소드의 치료제를 함유하는 키트.