ES2254414T3 - Composicion farmaceutica comprendiendo un factor vlla y un inhibidor tfpi. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI. Un objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, que pueden eficazmente ser usadas en el tratamiento o profilaxis de episodios de sangrado y trastornos de la coagulación. Un segundo objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones en una dosificación unitaria, que pueden eficazmente ser usadas para el tratamiento o profilaxis de episodios de sangrado o como procoagulante. Otro objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, usos médicos o kits que muestren un efecto sinergístico. Otro objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, usos médicos o kits que no muestren efectos secundarios sustanciales, como un nivel alto de activación sistémica del sistema de coagulación. Otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la lectura de la descripción presente.

Description

Composición farmacéutica comprendiendo un Factor VIIa y un inhibidor TFPI.

Campo de esta invención

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI. La invención también se refiere al uso de una combinación del factor VIIa con el inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para el tratamiento de sujetos que padecen episodios de sangrado, o para su prevención o para aumentar la formación de coágulos en un sujeto. La presente invención también se refiere a kits que comprenden estos compuestos.

Antecedentes de la invención

La hemostasis está iniciada por la formación de un complejo entre el factor tisular (TF) estando expuesto a la circulación de la sangre tras una lesión en la pared del vaso, y FVIIa que está presente en la circulación en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 1% de la masa proteínica total de FVII. Este complejo está enlazado con la célula portadora de TF y activa el FX en FXa y FIX en FIXa en la superficie de la célula. FXa activa la protrombina a trombina, la cual activa FVIII, FV, FXI y FXIII. Además, la cantidad limitada de trombina formada en esta fase inicial de hemostasis también activa las plaquetas. Después de la acción de la trombina en las plaquetas, esto cambiará la forma y expondrá los fosfolípidos cargados en su superficie. Esta superficie plaquetaria activada forma el molde para la activación del FX posterior y la generación de trombina completa. La posterior activación del FX en la superficie plaquetaria activada ocurre por medio de un complejo FIXa-FVIIIa formado en la superficie de la plaqueta activada, y FXa luego convierte la protrombina en trombina mientras que sigue en la superficie. La trombina luego convierte el fibrinógeno en fibrina que es insoluble y que estabiliza el tapón plaquetario inicial. Este proceso está localizado en el sitio de exposición a TF de ese modo minimizando el riesgo de una activación sistémica del sistema de coagulación.

FVIIa existe en el plasma principalmente como un zimógeno monocatenario, que es dividido por FXa en su forma bicatenaria, activada, FVIIa. El factor VIIa activado recombinante (rFVIIa) ha sido desarrollado como un agente prohemostático. La administración de rFVIIa ofrece una respuesta prohemostática rápida y altamente eficaz en sujetos hemofílicos con sangrados que no pueden ser tratados con productos del factor de coagulación debido a la formación de anticuerpos. También los sujetos con sangrado con una deficiencia del factor VII pueden ser tratados exitosamente con FVIIa. En estos estudios, no se han encontrado efectos secundarios desfavorables del rFVIIa (en particular la incidencia de tromboembolia).

FVIIa administrado extra exógenamente aumenta la formación de trombina en la superficie plaquetaria activada. Esto ocurre en sujetos hemofílicos carentes de FIX o FVIII y perdiendo en consecuencia la vía más potente de formación de trombina completa. También ante un número reducido de plaquetas o plaquetas con una función defectuosa, extra FVIIa aumenta la formación de trombina y es hemostáticamente eficaz en los sujetos.

Los factores de coagulación de la vía extrínseca son inhibidos por EPI (Inhibidor de la vía extrínseca) ahora llamado TFPI (Inhibidor de la vía del factor tisular). TFPI es un inhibidor de la proteasa del tipo Kunitz la cual se enlaza e inhibe el FXa. El complejo TFPI-FXa inhibe el de FVIIa-TF (Rapaport, Blood 73, p 359, 1989). La importancia del TFPI para la reacción de la coagulación todavía no ha sido establecida puesto que sólo afectan altas concentraciones no fisiológicas en los ensayos de coagulación convencionales (Broze et al., Bio-chemistry 29, p 7539, 1990). En consecuencia, la actividad del TFPI está medida en ensayos sofisticados donde TFPI puede enlazarse al FXa y el TFPI-FXa se añade a reactivos de TF-FVII que pueden activar el FIX o FX (Bajaj et al., J Clin Invest 79, p 1974, 1987; Sandset et al., Thromb Res, p 389, 1987).

Es bien sabido que los sujetos que sangran excesivamente en relación con la cirugía o un traumatismo más importante y que necesitan transfusiones de sangre, desarrollan más complicaciones que los que no experimentan ningún sangrado. No obstante, también los sangrados moderados que requieren la administración de sangre humana o productos sanguíneos (plaquetas, leucocitos, concentrados derivados del plasma para el tratamiento de defectos de coagulación, etc.) pueden conducir a complicaciones relacionadas con el riesgo de transferir virus humanos (hepatitis, VIH, parvovirus, y otros virus desconocidos hasta ahora). Los sangrados prolongados que requieren transfusiones de sangre masivas pueden conducir al desarrollo de fallos orgánicos múltiples que incluyen una función alterada del pulmón y del riñón. Una vez que un sujeto ha desarrollado estas complicaciones serias se desencadena una cascada de eventos que implican varias citoquinas y reacciones inflamatorias provocando que cualquier tratamiento resulte extremadamente difícil y desafortunadamente a menudo sin éxito. En consecuencia un objetivo más importante en cirugía al igual que en el tratamiento de un daño tisular relevante es el hecho de evitar o minimizar el
sangrado.

Para evitar o minimizar tal sangrado es importante asegurar la formación de tapones hemostáticos estables y sólidos que no sean fácilmente disueltos por enzimas fibrinolíticas. Además, es importante asegurar la formación rápida de tales tapones o coágulos.

La patente europea N°.225.160 (Novo Nordisk) se refiere a composiciones de FVIIa y métodos para el tratamiento de trastornos del sangrado no provocados por defectos del factor de coagulación o por inhibidores del factor de coagulación.

La patente europea N°. 82.182 (Baxter Travenol Lab.) se refiere a una composición del factor VIIa para el uso para contrarrestar deficiencias de los factores de la coagulación sanguínea o los efectos de los inhibidores en los factores de coagulación sanguínea en un sujeto.

La publicación de la patente internacional No. WO 93/06855 (Novo Nordisk) se refiere a la aplicación tópica de FVIIa.

La patente europea N°. 558529 (Novo Nordisk) se refiere a composiciones para el tratamiento de pacientes con un tiempo de coagulación prolongado, dicha composición conteniendo, como componente activo, un inhibidor EPI.

La publicación de patente internacional No. WO 96/28153 (Novo Nordisk) y US 5,622,988 (Novo Nordisk) se refiere a compuestos nuevos que muestran actividad inhibidora del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), y en consecuencia pueden ser usados para reducir el tiempo de coagulación en condiciones médicas caracterizadas por un sangrado en exceso o descontrolado.

Sigue habiendo una necesidad de una técnica de un método mejorado, fiable y de aplicación más amplia para aumentar la generación de trombina, la formación de tapones hemostáticos estables rápidos y la realización de una hemostasis completa en los sujetos, en particular en los sujetos que tienen una generación de trombina alterada. Hay también una necesidad de un método en el que la cantidad de FVIIa necesitada para conseguir una hemostasis completa sea reducida.

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, que pueden eficazmente ser usadas en el tratamiento o profilaxis de episodios de sangrado y trastornos de la coagulación.

Un segundo objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones en una dosificación unitaria, que pueden eficazmente ser usadas para el tratamiento o profilaxis de episodios de sangrado o como procoagulante.

Otro objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, usos médicos o kits que muestren un efecto sinergístico.

Otro objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar composiciones, usos médicos o kits que no muestren efectos secundarios sustanciales, como un nivel alto de activación sistémica del sistema de coagulación.

Otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la lectura de la descripción presente.

Los presentes inventores han demostrado que una combinación de un FVIIa y un inhibidor TFPI puede reducir el tiempo de coagulación del plasma humano normal al igual que el plasma carente de FVIII más eficazmente que el FVIIa o el inhibidor TFPI solo. Combinando un FVIIa a una concentración en la que no se observara ninguna reducción adicional del tiempo de coagulación con un inhibidor TFPI también a una concentración en la que no se observara ninguna reducción adicional en el tiempo de coagulación, se demostró de forma inesperada la obtención de una reducción posterior del tiempo de coagulación. De esta manera, aumentando la coagulación se puede obtener un tratamiento más eficaz del sangrado en los sujetos. Además, los pacientes pueden ser tratados con concentraciones relativamente inferiores de FVIIa, de este modo, reduciendo los costers relativamente altos relacionados con el tratamiento convencional con FVIIa solo. También se ha demostrado que la combinación de un FVIIa y un inhibidor TFPI puede aumentar la generación de trombina en el plasma carente de FVIII más eficazmente que el FVIIa o el inhibidor TFPI solo. También se ha demostrado que la combinación de un FVIIa y un inhibidor TFPI puede prolongar el tiempo de lisis del coágulo in vitro en el plasma humano normal más eficazmente que el FVIIa o el inhibidor TFPI solo.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI como únicos agentes activos y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica formulada para la administración intravenosa que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica formulada para la administración intravenosa que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI como únicos agentes activos y, opcionalmente, un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación en el plasma mamífero normal.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma carente del factor VIII.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para prolongar el tiempo de lisis del coágulo en el plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para prolongar el tiempo de lisis del coágulo en el plasma mamífero normal.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para aumentar la generación de trombina en el plasma carente de factor VIII.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para aumentar la coagulación en el plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma mamífero normal.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación del plasma carente del factor VIII.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para aumentar la coagulación del plasma mamífero.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para tratar la generación de trombina alterada en un sujeto, incluido un ser humano. En una forma de realización el sujeto es un sujeto multitransfundido, incluido un ser humano.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI como únicos agentes activos para la producción de un medicamento para tratar la generación de trombina alterada en un sujeto, incluido un ser humano. En una forma de realización el sujeto es un sujeto multitransfundido, incluido un ser humano.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para prolongar el tiempo de lisis del coágulo in vitro en el plasma mamífero normal, este método comprende la administración a un mamífero de una cantidad eficaz de un factor VIIa en combinación con una cantidad eficaz de un inhibidor TFPI.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit conteniendo un tratamiento para episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante que comprende

a) una cantidad eficaz de un factor VIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

b) una cantidad eficaz de un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y

medios contenedores para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit conteniendo un tratamiento para episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante que consiste esencialmente en

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a) una cantidad eficaz de un factor VIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

b) una cantidad eficaz de un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y

medios contenedores para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.

En una forma de realización, el factor VIIa es el Factor VIIa recombinante.

En otra forma de realización el factor VIIa es el Factor VIIa recombinante humano.

En otra forma de realización el factor VIIa es una variante del Factor VIIa.

En otra forma de realización, las variantes del FVIIa son variantes de la secuencia de aminoácidos que no tienen más de 20 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el FVIIa de tipo salvaje (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Patente U.S. N°. 4,784,950). En otra forma de realización, las variantes de FVIIa no tienen más de 15 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del FVIIa no tienen más de 10 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del FVIIa no tienen más de 8 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del FVIIa no tienen más de 6 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados; en otra forma de realización, las variantes del FVIIa no tienen más de 5 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el FVIIa de tipo salvaje. En otra forma de realización, las variantes del FVIIa no tienen más de 3 aminoácidos sustituidos, eliminados o insertados en comparación con el FVIIa de tipo salvaje.

En otra forma de realización el inhibidor TFPI está seleccionado de inhibidores TFPI que pueden ser identificados como FVIII inhibidor de anticuerpos en el Ensayo de Bethesda como se describe en EP 0558529. En otra forma de realización el inhibidor TFPI está seleccionado de un anticuerpo policlonal o monoclonal, o un fragmento derivado, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido corto, o una molécula orgánica pequeña. Ejemplos de moléculas orgánicas pequeñas (que son inhibidores TFPI) pueden ser encontradas en WO 96/28153 y US 5,622,988.

En otra forma de realización, el plasma mamífero es plasma humano.

En otra forma de realización, el factor VIIa y el inhibidor TFPI son administrados simultáneamente y en una dosificación unitaria. En otra forma de realización, el factor VIIa y el inhibidor TFPI son administrados consecutivamente. En otra forma de realización, el factor VIIa y el inhibidor TFPI son administrados en un período de 1-2 horas entre uno y el otro, así como en un período de 30 minutos entre uno y el otro, por ejemplo en un periodo de 10 minutos entre uno y el otro, p. ej., en forma de un kit que comprende el factor VIIa en una primera forma de dosificación unitaria y el inhibidor TFPI en una segunda forma de dosificación unitaria.

En una forma de realización, la cantidad eficaz de FVIIa es de 0.05 mg/día a 500 mg/día (sujeto de 70 kg).

En una forma de realización de la presente invención, la composición farmacéutica (cuando está en forma de preparación unitaria) consiste esencialmente en un FVIIa, un inhibidor TFPI, y al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un estabilizador y/o un detergente y/o una sal neutra y/o un antioxidante y/o un conservante, y, opcionalmente, un inhibidor de proteasa.

En otra forma de realización, la composición farmacéutica (cuando está en forma de kit) consiste en una primera forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un FVIIa y al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente un estabilizador y/o un detergente y/o una sal neutra y/o un antioxidante y/o un conservante, y, opcionalmente, un inhibidor de proteasa; y una segunda forma de dosificación unitaria que consiste esencialmente en un inhibidor TFPI, y al menos unos excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente un estabilizador y/o un detergente y/o una sal neutra y/o un antioxidante y/o un conservante, y, opcionalmente, un inhibidor de proteasa.

En otro aspecto, la composición además contiene un factor VIII.

En una forma de realización, el factor VIII es FVIIIa. En otra forma de realización el factor VIII es el Factor VIIIa recombinante. En otra forma de realización el factor VIII es el Factor VIIIa recombinante humano.

En otro aspecto, la composición además comprende un inhibidor del sistema fibrinolítico, p. ej., aprotinina, ácido \varepsilon-aminocaproico o ácido tranexámico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit conteniendo un tratamiento para episodios de sangrado o para el tratamiento coagulante que comprende

a) una cantidad eficaz de un factor VIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

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b) una cantidad eficaz de un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria;

c) una cantidad eficaz de un factor VIII o factor VIIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una tercera forma de dosificación unitaria ; y

d) medios contenedores para contener dicha primera, segunda y tercera formas de dosificación.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que contiene un tratamiento para episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante que comprende

a) una cantidad eficaz de un factor VIIa y un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

b) una cantidad eficaz de un factor VIII o factor VIIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y

c) medios contenedores para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit conteniendo un tratamiento para episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante que comprende

a) una cantidad eficaz de un factor VIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

b) una cantidad eficaz de un factor VIII o factor VIIIa y un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y

c) medios contenedores para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.

La presente invención proporciona una composición que comprende una combinación de un factor VIIa y un inhibidor TFPI. La invención también proporciona una composición que comprende una combinación de un factor VIIa y un inhibidor TFPI como únicos ingredientes activos. La composición puede estar en forma de una única composición o puede estar en forma de kit de varios componentes. Estas composiciones son útiles como procoagulante terapéutico y profiláctico y forman coágulos de fibrina rápidos en mamíferos, incluidos los primates como los seres humanos.

Siempre que se menciona una primera o segunda dosis unitarias en toda esta especificación no se indica el orden preferido de administración, esto sólo se ha hecho por motivos de conveniencia.

La presente invención además proporciona el uso de las composiciones de la invención (incluyendo el tratamiento profiláctico o prevención) de episodios de sangrado en un sujeto, incluido un ser humano, p. ej., debido al traumatismo o cirugía, o en sujetos que carecen o que tienen factores de coagulación sanguínea FIX o FVIII o plaquetas defectuosos.

La presente invención además proporciona el uso de las composiciones de la invención (incluyendo el hecho de tratar profilácticamente o prevenir) una generación de trombina alterada en un sujeto, incluido un ser humano. En una forma de realización el sujeto es un sujeto multitransfundido, incluido un ser humano.

Hasta ahora se ha encontrado que una combinación de un FVIIa y un inhibidor TFPI es un producto ventajoso que asegura la formación de tapones hemostáticos rápidos.

Ante un inhibidor TFPI pueden ser suficientes unas concentraciones inferiores de FVIIa para asegurar una hemostasis completa.

La generación de trombina completa es necesaria para que se forme un tapón sólido hemostático estable. La estructura de la fibrina de este tapón dependerá a la vez de la cantidad de trombina formada y del nivel de la generación de trombina inicial. Ante una generación de trombina alterada se formará un tapón de fibrina poroso, que es altamente permeable. Las enzimas fibrinolíticas normalmente presentes en la superficie de la fibrina disolverán fácilmente este tapón de fibrina. La formación de un tapón de fibrina estable es también dependiente de la presencia de FXIIIa, que está siendo activado por la trombina y en consecuencia también es dependiente de la generación de trombina completa. Además, el inhibidor fibrinolítico activable por trombina recientemente descrito, TAFI, requiere más bien altas cantidades de trombina para su activación. Ante una formación de trombina no completamente adecuada, el TAFI puede en consecuencia no ser activado dando como resultado la formación de un tapón hemostático, que resulta más fácil de disolver de lo normal por la actividad fibrinolítica normal.

Los sujetos con trombocitopenia tienen una generación de trombina alterada al igual que una estabilización defectuosa de los tapones de fibrina dando como resultado tapones hemostáticos propensos a la disolución prematura. Además, los sujetos sometidos a traumatismos más importantes o daños orgánicos y que, como consecuencia, han obtenido transfusiones de sangre frecuentes a menudo tienen recuentos de plaquetas reducidos al igual que niveles reducidos de fibrinógenos, FVIII, y otras proteínas de coagulación. Estos sujetos experimentan una generación de trombina alterada (o reducida). Además, su nivel reducido de fibrinógenos interfiere negativamente con la activación de FXIII. Estos sujetos, en consecuencia, tienen una hemostasis defectuosa, o menos eficaz, conduciendo a la formación de tapones de fibrina que son fácilmente y prematuramente disueltos por enzimas proteolíticas, tales enzimas además son liberadas extensamente en situaciones caracterizadas por traumatismos extensos y daños orgánicos.

Para facilitar la formación de tapones completamente estabilizados con capacidad completa para mantener la hemostasis en un sujeto, se administra una composición según la invención. Esta composición es especialmente provechosa en sujetos con un número reducido de plaquetas y en sujetos con niveles plasmáticos reducidos de fibrinógeno y/u otras proteínas de coagulación.

El factor VIIa usado en la presente invención puede ser purificado de la sangre o producido por medios recombinantes. Es evidente que la práctica de los métodos descritos en la presente es independiente de cómo se deriva el Factor VIIa purificado y, en consecuencia, la presente invención está contemplada para cubrir el uso de cualquier preparación de factor VIIa adecuada para el uso en la presente. Es preferido el FVIIa humano. También las variantes de FVIIa creadas por ingeniería genética que retienen su actividad relacionada con la hemostasis característica pueden ser usadas en las invenciones presentes. Los fragmentos de factor VIIa, o variantes de FVIIa que retienen su actividad relacionada con la hemostasis característica pueden también ser usados en la presente invención. El inhibidor TFPI usado en la presente invención puede ser identificado como el FVIII inhibidor de los anticuerpos en el Ensayo de Bethesda como se describe en EP 0558529.

Ejemplos no limitativos de variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma o mejor actividad biológica en comparación con el Factor VIIa de tipo salvaje incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Solicitudes de patente Danesas Nos. PA 2000 00734, PA 2000 01360, PA 2000 01361, y PA 2001 00477. Ejemplos no limitativos incluyen [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVII, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa y [K337A]-FVIIa.

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden hacer sustituciones fuera de las regiones fundamentales para la función del FVIIa o molécula del inhibidor TFPI y además resultarán en un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido del FVII (u opcionalmente el polipéptido del inhibidor TFPI), y por lo tanto preferiblemente no sometidos a sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, como mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis de rastreo de alanina (ver, p. ej., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por su actividad coagulante, respectivamente de entrecruzamiento, para identificar los residuos de aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción de la enzima-sustrato pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según está determinado por técnicas tales como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (ver, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis sitio dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Particularmente útil es el procedimiento que utiliza un vector de ADN superenrollado, bicatenario con una inserción de interés y dos cebadores sintéticos conteniendo la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a las cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación cíclica de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. Al incorporar los cebadores, se genera un plásmido mutado que contiene mellas escalonadas. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con Dpnl, que es específico para el ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN parental y para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación. Otros procedimientos conocidos en la técnica para crear, identificar y aislar variantes pueden también ser usados, tales como, por ejemplo, la transposición de genes o técnicas de exposición en el fago.

En este contexto las indicaciones de tres letras o de una letra de los aminoácidos han sido usadas en su significado convencional según se indica en la tabla 2. A menos que se indique explícitamente, los aminoácidos mencionados en la presente son L-aminoácidos. Debe entenderse, que la primera letra en, por ejemplo, K337 representa el aminoácido naturalmente presente en la posición indicada del factor VIIa humano nativo (tipo salvaje), y que, por ejemplo, [K337A]-FVIIa designa la variante de FVII donde el aminoácido representado por el código de una letra K presente de forma natural en la posición indicada en el factor VIIa humano nativo (salvaje tipo) está sustituido por el aminoácido representado por el código de una letra A.

TABLA 2 Abreviaturas para aminoácidos

Aminoácido	Código de tres letras	Código de una letra
Glicina	Gly	G
Prolina	Pro	P
Alanina	Ala	A
Valina	Val	V
Leucina	Leu	L
Isoleucina	IIe	I
Metionina	Met	M
Cisteína	Cys	C
Fenilalanina	Phe	F
Tirosina	Tyr	Y
Triptófano	Trp	W
Histidina	His	H
Lisina	Lys	K
Arginina	Arg	R
Glutamina	Gln	Q
Asparragina	Asn	N
Ácido Glutámico	Glu	E
Ácido Aspártico	Asp	D

El término "factor VIIa", "Factor VIIa" o "FVIIa" puede ser usado de forma intercambiable. El término factor VIIa incluye el factor VII zimógeno (factor VII monocatenario).

El término "factor VIII" tiene su significado usual (factor VIII de la coagulación) e incluye el factor VIII activado (designado FVIIIa) y formas truncadas del factor VIII que retienen su actividad coagulante característica.

El término "inhibidor TFPI" se refiere a compuestos que inhiben la actividad anticoagulante del TFPI (inhibidor de la vía del factor tisular). El término incluye compuestos como aquellos definidos en la Patente Europea N°. 558 529, y aquellos descritos en WO 96/28153 y US 5,622,988.

En la presente invención una "cantidad eficaz" de FVIIa y una "cantidad eficaz" de inhibidor TFPI se define como la cantidad de FVIIa e inhibidor TFPI suficiente para prevenir o reducir el sangrado o pérdida de sangre, para polimerizar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones.

La cantidad de FVIIa y la cantidad de inhibidor TFPI administrada según la presente invención, normalmente, puede variar de una proporción de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1 (\mug de FVIIa: \mug de inhibidor TFPI).

En este contexto, "sujetos con una generación de trombina alterada" se refiere a sujetos que no pueden generar una explosión de trombina completa en la superficie activada de las plaquetas e incluye sujetos que tienen una generación de trombina inferior a la generación de trombina en sujetos que tienen un sistema hemostático normal que funciona completamente, incluyendo una cantidad y función normal de factores de coagulación, plaquetas y fibrinógeno, e incluye sujetos carentes de FIX y/o FVIII (hemofilia A y B) o que tienen un FIX y/o FVIII defectuosos o que tienen inhibidores contra FIX y/o FVIII; sujetos carentes de FXI; sujetos con un número reducido de plaquetas o plaquetas con una función defectuosa (p. ej., trombocitopenia o trombastenia Glanzmann o sujetos con sangrado excesivo); sujetos que tienen niveles reducidos de protrombina, FX, o FVII; sujetos con concentraciones plasmáticas reducidas del fibrinógeno (p. ej., sujetos multitransfundidos como consecuencia de un traumatismo múltiple o cirugía
extensa).

El término "hemostasis completa" significa la formación de un coágulo de fibrina estable y sólido o un tapón en el lugar de la lesión que detiene eficazmente el sangrado y que no es fácilmente disuelto por el sistema fibrinolítico.

El término "actividad del FVIIa" significa la capacidad para generar trombina, el término también incluye la capacidad para generar trombina en la superficie de las plaquetas activadas en ausencia del factor tisular.

El término "mejora del sistema hemostático normal" significa una mejora de la capacidad para generar trombina.

Tal y como se utiliza en este caso el término "trastorno del sangrado" refleja cualquier falta, congénita, adquirida o inducida, de origen celular o molecular manifestada en los sangrados. Ejemplos son deficiencias del factor de coagulación (p. ej. hemofilia A y B o deficiencia de Factores de coagulación XI o VIII), inhibidores del factor de coagulación, función de las plaquetas defectuosa, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand.

El término "episodios de sangrado" incluye un sangrado descontrolado y excesivo que es un problema más importante relacionado con la cirugía y con otras formas de daño tisular. Un sangrado descontrolado y excesivo puede ocurrir en sujetos con un sistema de coagulación básicamente normal (estos sujetos no obstante desarrollan una coagulopatía como resultado del sangrado - dilución de proteínas de coagulación, fibrinólisis aumentada y reducción de las plaquetas debido a un efecto de dilución del sangrado) y en sujetos con trastornos de coagulación o de sangrado. Las deficiencias del factor de coagulación (hemofilia A y B, deficiencia de factores de coagulación XI o VII) o inhibidores del factor de coagulación pueden ser la causa de trastornos de sangrado. Los sangrados excesivos también ocurren en sujetos con una cascada de coagulación sanguínea que funcione normalmente (sin deficiencias del factor de coagulación o inhibidores contra cualquiera de los factores de coagulación) y pueden ser provocados por una función defectuosa de las plaquetas, trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand. En tales casos, los sangrados pueden ser parecidos a los sangrados provocados por la hemofilia porque el sistema hemoestático, como en la hemofilia, carece o tiene "compuestos" de coagulación esencial anormal (como plaquetas o proteína del factor von Willebrand) que causan sangrados más importantes. En sujetos que experimentan daños tisulares extensivos asociados con la cirugía o un traumatismo grande, el mecanismo hemoestático normal puede verse desbordado por la demanda de hemostasis inmediata y puede desarrollar el sangrado a pesar de un mecanismo hemoestático básicamente (pre- traumático) normal. El hecho de conseguir una hemostasis satisfactoria también es un problema cuando los sangrados ocurren en órganos como el cerebro, la región interna de la oreja y los ojos con limitada posibilidad de hemostasis quirúrgica. El mismo problema puede surgir en el proceso de tomar biopsias de varios órganos (hígado, pulmón, tejido tumoral, tracto gastrointestinal) al igual que en cirugía laparoscópica. Es común para todas estas situaciones la dificultad de proporcionar la hemostasis por técnicas quirúrgicas (sutura, clips, etc.) que también es el caso cuando el sangrado está difundido (gastritis hemorrágica y sangrado uterino profuso). Los sangrados agudos y profusos pueden también ocurrir en sujetos bajo terapia anticoagulante en los que se haya inducido una hemostasis defectuosa por la terapia dada. Estos sujetos pueden precisar intervenciones quirúrgicas en caso de que el efecto anticoagulante tenga que ser contrarrestado rápidamente. La prostatectomía retropúbica radical es un procedimiento realizado de forma común para sujetos con cáncer de próstata localizado. La operación es frecuentemente complicada por una pérdida de sangre significante y a veces masiva. La pérdida de sangre considerable durante la prostatectomía está principalmente relacionada con la situación anatómica complicada, con varios sitios densamente vascularizados que no son fácilmente accesibles para la hemostasis quirúrgica, y que pueden resultar en un sangrado de un área grande. Otra situación que puede causar problemas en el caso de una hemostasis no satisfactoria es cuando se da una terapia anticoagulante a los sujetos con un mecanismo hemoestático normal para prevenir una enfermedad tromboembólica. Esta terapia puede incluir la heparina, otras formas de proteoglicanos, la warfarina u otras formas de antagonistas de la vitamina K así como la aspirina y otros inhibidores de la agregación
plaquetaria.

En una forma de realización de la invención, el sangrado está asociado con la hemofilia. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la hemofilia con inhibidores adquiridos. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la trombocitopenia. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la enfermedad de von Willebrand. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con un daño tisular severo. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con un traumatismo severo. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la cirugía. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la cirugía laparoscópica. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la gastritis hemorrágica. En otra forma de realización, el sangrado es sangrado uterino profuso. En otra forma de realización, el sangrado se produce en órganos con una limitada posibilidad de hemostasis mecánica. En otra forma de realización, el sangrado se produce en el cerebro, en la región interna de la oreja o los ojos. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con el proceso de tomar biopsias. En otra forma de realización, el sangrado está asociado con la terapia anticoagulante.

La composición según la invención puede además comprender un factor VIII. Esta composición debería preferiblemente ser administrada a sujetos que no tengan inhibidores de FVIII.

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Cualquier combinación posible de dos o más de las formas de realización descritas en la presente, se prevé comprendida dentro del campo de la presente invención.

En este contexto, el término "tratamiento" se entiende que incluye la prevención de un sangrado previsto, como, por ejemplo, en cirugía, y también la regulación de un sangrado ya ocurrido, como, por ejemplo, en la hemofilia o en un traumatismo, con el propósito de inhibir o minimizar el sangrado. La administración profiláctica de FVIIa y el inhibidor TFPI está por lo tanto incluida en el término "tratamiento".

El término "sujeto" como se utiliza en este caso pretende significar cualquier animal, en particular mamíferos, como seres humanos, y puede, cuando sea apropiado, ser usado de forma intercambiable con el término "paciente".

Abreviaturas

TF

factor tisular

FVII

factor VII en su forma monocatenaria, inactivada

FVIIa

factor VII en su forma activada

rFVIIa

factor VII recombinante en su forma activada

FVIII

factor VIII en su forma zimogénica, inactivada

rFVIII

FVIII recombinante

FVIIIa

factor VIII en su forma activada

rFVIIIa

FVIIIa recombinante

TFPI

inhibidor de la vía del factor tisular

Preparación de compuestos

Un factor VIIa humano purificado adecuado para el uso en la presente invención es preferiblemente hecho mediante la tecnología de ADN recombinante, p. ej. según se describe por Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986 o según se describe en la Patente Europea N°. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.). El factor VIIa producido por tecnología recombinante puede ser auténtico factor VIIa o un factor VIIa más o menos modificado a condición de que este factor VIIa tenga sustancialmente la misma actividad biológica para la coagulación sanguínea que el factor VIIa auténtico. Este factor modificado VIIa puede ser producido modificando la secuencia de ácidos nucleicos que codifican el factor VII sea alterando los codones del aminoácido o por eliminación de algunos codones del aminoácido en el ácido nucléico que codifican el FVII natural por medios conocidos, p. ej. por mutagénesis sitio-específica.

El factor VII puede también ser producido por los métodos descritos por Broze y Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 y Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Estos métodos producen un factor VII sin cantidades detectables de otros factores de coagulación sanguínea. Una preparación del factor VII aún más purificada puede ser obtenida mediante la inclusión de una filtración en gel adicional como la fase de purificación final. El factor VII es luego convertido en FVIIa activado por unos medios conocidos, p. ej. por diferentes proteínas plasmáticas, como el factor XIIa, IX a o Xa. De forma alternativa, según se describe por Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 Septiembre 1986, pp. 564-565), el factor VII puede ser activado pasando a través de una columna de cromatografía de intercambio fónico, como Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o similares.

Como apreciarán los expertos en la técnica, se prefiere usar un inhibidor TFPI y un factor VIIa singénico con el sujeto para reducir el riesgo de inducir una respuesta inmunitaria. La presente invención también comprende el uso de este inhibidor TFPI y factor VIIa en procedimientos veterinarios.

Administración y composiciones farmacéuticas

Para el tratamiento relacionado con intervenciones previstas, el Factor VIIa e inhibidor TFPI normalmente serán administrados aproximadamente dentro de las 24 horas antes de que se realice la intervención, y durante como máximo 7 días o más después de ésta. La administración como coagulante puede hacerse por una variedad de vías como se describe en este caso.

La dosis típica del Factor VIIa varía de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 500 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg/día, y más preferiblemente de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 175 mg/día para un sujeto de 70 kg como dosis de carga y de mantenimiento, dependiendo del peso del sujeto y de la gravedad de la enfermedad.

Las composiciones y kits de la presente invención son útiles en medicina humana y veterinaria, como, por ejemplo, en el tratamiento o profilaxis de sujetos que padecen episodios de sangrado o trastornos coagulantes. Para el uso en la presente invención, el factor VIIa e inhibidor TFPI están formulados, opcionalmente con un portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, es decir, por vía intravenosa, subcutánea, o intramuscularmente, o bien pueden ser administradas por infusión continua o pulsátil. Alternativamente, el inhibidor TFPI puede ser administrado oralmente, en el caso de que se considere una molécula orgánica pequeña, tales como las descritas en WO 96/28153 y US 5,622,988.

Las formulaciones pueden además incluir uno o más diluyentes, emulsionantes, conservantes, tampones, excipientes, etc. y pueden ser proporcionadas en formas como líquidos, polvos, emulsiones, descarga controlada, etc. los expertos en esta técnica pueden formular las composiciones de la invención de una manera apropiada, y de acuerdo con prácticas aceptadas, tales como las descritas en Reminaton's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Las composiciones para la administración parenteral comprenden el Factor VII y el inhibidor TFPI en combinación con, preferiblemente disueltas en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Se puede usar una variedad de portadores acuosos, tales como agua, agua tamponado, 0.4% de solución salina, 0.3% de glicina y similares. Las variantes del Factor VII de la invención pueden también ser formuladas en preparaciones de liposomas para ser entregadas o dirigirse a los lugares de la lesión. Las preparaciones de liposomas están generalmente descritas en, p. ej., U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728, y U.S. 4,975,282.

Una composición farmacéutica típica para la infusión intravenosa podría ser realizada de tal manera que contenga hasta 250 ml de solución estéril de Ringer y 10 mg de la variante del Factor VII. Los métodos reales para preparar composiciones administrables parenteralmente serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y están descritos con más detalle en, por ejemplo, Reminaton's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

En resumen, las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso según la presente invención se hacen mediante la mezcla del FVIIa, o del inhibidor TFPI, o del FVIIa en combinación con el inhibidor TFPI, preferiblemente en forma purificada, con adyuvantes adecuados y un portador adecuado o diluyente. Portadores o diluyentes fisiológicos aceptables adecuados incluyen agua estéril y solución salina. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores del pH y amortiguadores, agentes reguladores de la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Adyuvantes adecuados también incluyen calcio, proteínas (p. ej. albúminas), u otros péptidos inertes (p. ej. glicilglicina) o aminoácidos (p. ej. glicina, o histidina) para estabilizar el factor VIIa purificado y/o el inhibidor TFPI. Otros adyuvantes aceptables fisiológicos son azúcares no reductores, polialcoholes (p. ej. sorbitol, manitol o glicerol), polisacáridos como dextrinas de bajo peso molecular, detergentes (p. ej. polisorbato) y antioxidantes (p. ej. bisulfito y ascorbato). Los adyuvantes están generalmente presentes en una concentración del 0.001 al 4% p/v. La composición farmacéutica puede también abarcar inhibidores de proteasa, p. ej. aprotinina o ácido tranexámico, y agentes conservantes. Además, la preparación puede también contener un factor VIII.

Las composiciones pueden ser esterilizadas por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada estando combinada con una solución acuosa estéril antes de su administración.

La concentración de Factor VIIa, inhibidor TFPI o FVIIa en combinación con inhibidor TFPI en estas formulaciones pueden variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente del 0.5% en peso, normalmente a o al menos aproximadamente al 1% en peso hasta como mucho el 15 o 20% en peso y serán seleccionadas principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según el modo particular de administración seleccionado.

Se prefiere la administración por inyección o infusión, en particular por inyección. Así, el factor VIIa y el inhibidor TFPI son preparados en una forma adecuada para la administración intravenosa, como por ejemplo una preparación que consiste en un polvo disuelto liofilizado o una formulación líquida conteniendo el factor VIIa y también el inhibidor TFPI en una dosificación unitaria, o un polvo disuelto liofilizado o una formulación líquida que contiene el factor VIIa en una dosificación unitaria y un polvo disuelto liofilizado o una formulación líquida conteniendo el inhibidor TFPI en otra dosificación unitaria.

La entrega local del Factor VIIa e inhibidor TFPI, como, por ejemplo, la aplicación tópica puede ser realizada, por ejemplo, mediante una pulverización, perfusión, catéteres de balón doble, stent, incorporada en injertos o stents vasculares, hidrogeles usados para revestir catéteres de balón, u otros métodos bien establecidos. Para sujetos ambulatorios que requieren niveles de mantenimiento diarios, el Factor VIIa y el inhibidor TFPI puede ser administrado por infusión continua usando p. ej. un sistema de bomba portátil. De cualquier manera, las composiciones farmacéuticas deberían de proporcionarían una cantidad de Factor VIIa e inhibidor TFPI suficiente para tratar al sujeto
eficazmente.

La combinación de un factor VIIa y un inhibidor TFPI muestra un efecto sinergístico en un ensayo de coagulación in vitro del tiempo de la protrombina diluida. Además, la combinación de un factor VIIa y un inhibidor TFPI muestra un efecto sinergístico para el aumento de la coagulación.

Las composiciones que contienen el Factor VIIa y el inhibidor TFPI pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En usos terapéuticos, las composiciones son administradas a un sujeto que ya padece una enfermedad, según el modo descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir el sangrado o pérdida de sangre, para curar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguirlo se define como una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz". Como será entendido por el experto en la técnica las cantidades eficaces para este propósito dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión al igual que del peso y del estado general del sujeto.

Hay que tener en cuenta que los materiales de la presente invención pueden generalmente ser empleados en enfermedades graves o estados de lesión, es decir, situaciones que ponen en peligro la vida o que la ponen en peligro de forma potencial. En tales casos, vista la minimización de sustancias extrañas y falta general de inmunogenicidad de variantes del Factor VII humano en los seres humanos, es posible y puede ser estimado deseable por el médico tratante el hecho de administrar un exceso sustancial de estas composiciones de la variante del Factor VII.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones conteniendo el Factor VIIa y el inhibidor TFPI son administradas a un sujeto susceptible de o de lo contrario en riesgo de un estado de enfermedad o lesión para aumentar la capacidad coagulante propia del sujeto. Esta cantidad está definida como una "dosis profilácticamente eficaz."

Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones puede llevarse a cabo con niveles de dosis y modelos que son seleccionados por el médico tratante. Las composiciones pueden ser administradas una o más veces al día o a la semana. Una cantidad eficaz de tal composición farmacéutica es la cantidad que proporciona un efecto clínicamente significante contra los episodios de sangrado. Tales cantidades dependerán, en parte, de la condición particular que se deba tratar, edad, peso, y salud general del sujeto, y de otros factores evidentes para los expertos en la técnica.

La composición es generalmente administrada en una dosis individual, antes del sangrado supuesto o al principio del sangrado. No obstante también se puede dar en dosis múltiples, preferiblemente con intervalos de 2-4-6-12 horas, dependiendo de la dosis dada y de la condición del sujeto.

La composición puede estar en forma de una única preparación que comprende ambos FVIIa e inhibidor TFPI en concentraciones adecuadas. La composición puede también estar en la forma de un kit consistente en una primera forma de dosificación unitaria que comprende FVIIa y una segunda forma de dosificación unitaria adicional que comprende el inhibidor TFPI y opcionalmente una o más formas de dosificación unitarias que comprenden un factor VIII. En este caso, el FVIIa y el inhibidor TFPI deberían de ser administrados consecutivamente, preferiblemente en 1-2 horas entre uno y el otro, como por ejemplo en 30 minutos entre uno y el otro, o preferiblemente en 10 minutos o, más preferiblemente, en 5 minutos entre uno y el otro. Cualquiera de las dos formas de dosificación unitarias pueden ser administradas primero:

Puesto que la presente invención se refiere a la prevención o tratamiento de episodios de sangrado o para un tratamiento coagulante por tratamiento con una combinación de ingredientes activos que pueden ser administrados separadamente, la invención también se refiere a la combinación de composiciones farmacéuticas separadas en forma de kit. El kit incluye al menos dos composiciones farmacéuticas separadas. El kit incluye unos medios contenedores para contener las composiciones separadas como una botella separada o un sobre separado. Normalmente el kit incluye instrucciones para la administración de los componentes separados. La forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados son preferiblemente administrados en formas de dosificación diferentes, cuando son administrados a intervalos de dosificación diferentes, o cuando la valoración de los componentes individuales de la combinación es deseada por el médico prescriptor.

Ensayos Prueba de la actividad del FVIIa

Un ensayo adecuado para evaluar la actividad del FVIIa y de ese modo seleccionar las variantes del Factor VIIa adecuadas puede ser realizado como una prueba preliminar simple in vitro:

Ensayo de Hidrólisis in vitro

Se pueden evaluar el Factor VIIa nativo (tipo salvaje) y la variante del Factor VIIa (ambos denominados en adelante "Factor VIIa") para actividades específicas. También pueden ser evaluados en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de microvaloración (Max-iSorp, Nunc, Denmark). El sustrato cromogénico D-IIe-Pro- Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final de 1 mM, es añadido al Factor VIIa (concentración final 100 nM) en 50 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0.1 m NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbencia en un pocillo blanco sin enzimas, es utilizada para calcular la proporción entre las actividades de la variante y del tipo salvaje del Factor VIIa:

Proporción = (A_{405nm} Factor VIIa variante)/(A_{405nm} Factor VIIa tipo salvaje).

En base a esto, las variantes del factor VIIa con una actividad comparable a o superior al Factor VIIa nativo pueden ser identificadas, como, por ejemplo, variantes en las que la proporción entre la actividad de la variante y la actividad del Factor VII nativo es de alrededor de, versus superior a 1.0.

La actividad del Factor VIIa o de las variantes del Factor VIIa pueden también ser medidas usando un sustrato fisiológico como el factor X, idóneamente a una concentración de 100-1000 nM, donde el factor Xa generado es medido después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo. S-2765). Además, el ensayo de la actividad puede ser realizado a la temperatura fisiológica.

La capacidad del Factor VIIa o de las variantes de FVIIa para generar trombina puede también ser medida en un ensayo que comprende todos los factores de coagulación pertinentes e inhibidores a concentraciones fisiológicas (menos el factor VIII cuando imita las condiciones de la hemofilia A) y las plaquetas activadas (como se describe en p. 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547).

La presente invención es ilustrada con mayor detalle por los ejemplos siguientes, los cuales, no obstante, no deben de ser construidos como limitadores del objetivo de protección. Las características descritas en la descripción precedente y en los ejemplos siguientes pueden, ambos por separado y en cualquiera de sus combinaciones, ser materiales para realizar la invención de diversas formas.

Ejemplos

Anti-TFPI IgG puede ser obtenido siguiendo el proceso descrito en la parte experimental de EP 558529.

Ejemplo 1

Los datos presentados en la presente muestran que la combinación de rFVIIa a una concentración que da la reducción máxima del tiempo de coagulación y anti-TFPI IgG a una concentración que da la reducción máxima del tiempo de coagulación reduce el tiempo de coagulación del plasma humano normal al igual que del plasma carente del factor VIII más que rFVIIa y anti-TFPI IgG solos.

Métodos Ensayo de coagulación

Los tiempos de coagulación fueron medidos en un ensayo de coagulación de PT diluido. Un volumen de 180 \mul de una reserva de plasma carente de factor VIII (Helena Laboratories) o de plasma humano normal fue mezclado con 20 \mul de muestra conteniendo rFVIIa, anti TFPI-IgG o tampón (50 mM de imidazol, 0.1 M de NaCl, 1 mg/ml de BSA, pH 7.4) y se incubó 15 minutos a temperatura ambiente. Los tiempos de coagulación fueron luego medidos en un instrumento de coagulación ACL 300R, en el que se mezclaron 75 \mul de las muestras con 75 \mul de reactivo de tromboplastina/CaCl_{2} conteniendo una dilución 1:1200 de Innovin (Dade) y 8.33 mM de CaCl_{2} en el tampón de imidazol.

Resultados

Los tiempos de coagulación del plasma humano normal preincubado con diluciones de rFVIIa y anti TFPI-IgG fueron determinados (ver Figura 1).

Ambos rFVIIa y anti TFPI-IgG redujeron el tiempo de coagulación del plasma humano normal en un ensayo de PT diluido. rFVIIa a 0.04 - 1 nM dio una reducción dosis-dependiente en el tiempo de coagulación. A concentraciones de rFVIIa superiores a 5 nM no se observó ningún decrecimiento adicional del tiempo de coagulación. Anti-TFPI IgG a concentraciones de 0.1 -1 \mug/ml redujeron el tiempo de coagulación de una forma dosis-dependiente. La reducción del tiempo de coagulación fue inferior a la observada para rFVIIa. Con un anti-TFPI IgG a concentraciones superiores a 2 \mug/ml no se observó ninguna reducción adicional del tiempo de coagulación.

rFVIIa y anti-TFPI IgG a concentraciones que daban una reducción máxima del tiempo de coagulación (5 nM y 2.4 \mu/ml, respectivamente) y concentraciones que daban una reducción parcial del tiempo de coagulación (0.5 nM y 0.1 \mug/ml, respectivamente) fueron añadidos al plasma humano normal o plasma carente de factor VIII y se determinaron los tiempos de coagulación (Tabla 1). Combinando rFVIIa y anti-TFPI IgG el tiempo de coagulación fue más reducido que cuando se añadió rFVIIa o anti-TFPI IgG individualmente. Esto muestra que una combinación de rFVIIa y anti-TFPI IgG puede ser usada para aumentar la coagulación de pacientes hemofílicos al igual que para individuos normales.

TABLA 1

El efecto de rFVIIa y anti-TFPI IgG por separado o en combinación en el tiempo de coagulación del plasma
humano normal y del plasma carente de factor VIII. Los valores son medias de dos muestras.
	Tiempo de coagulación (seg)
	Plasma humano	Plasma carente de
	normal	Factor VIII
Control del tampón	93.8	108.6
rFVIIa a 0.5 nM	63.2	69.3
rFVIIa a 5 nM	57.2	61.6
anti-TFPI IgG a 0.1 \mug/ml	85.4	103.8
anti-TFPI IgG a 2.4 \mug/ml	83.4	97.2
rFVIIa (0.5 nM) + anti-TFPI IgG	61.8	67.2
(0.1 \mug/ml)
rFVIIa (5 nM) + anti-TFPI IgG	52.6	57.0
(2.4 \mug/ml)

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Ejemplo 2 Métodos

El ensayo fue realizado esencialmente como se describe en Kjalke, M., Oliver, J.A., Monroe, D.M., Hoffman, M., Ezban, M., Hedner, U. & Roberts, H.R. (1997) The effect of active site-inhibited factor VIIa on tissue factor-initiated coagulation using platelets before and alter aspirin administration.Thrombosis and Haemostasis, 1202- 1208. (en adelante Kjalke et al. 1997). Las células mononucleares fueron aisladas de la sangre periférica estabilizada con citrato por centrifugación de densidad, y el % de monocitos determinado por citometría de flujo después del marcado con un anticuerpo anti CD14 conjugado con picoeritrina (BD Pharmingen). Las células fueron resuspendidas en un medio sin suero del macrófago (Life Technologies) con 0.5 \mug/ml de LPS (Sigma L2755) y colocadas en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos a una densidad de 20,000 monocitos/pocillo. Después de una incubación a 37°C en CO_{2} al 5%, las células no adherentes, en su mayor parte linfocitos, fueron eliminadas mediante lavado, y la incubación continuó durante la noche. Al día siguiente fueron inactivadas las plaquetas aisladas de la sangre periférica conteniendo 5 \mug/ml de prostaglandina E_{1} (Sigma) por centrifugado de densidad y filtración en gel en una Columna de Sefarosa CL2B equilibrada con un tampón de tyrodes sin calcio (15 mM de HEPES, 3.3 mM de Na_{2}PO_{4}, pH 7.4, 138 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 1 mM de MgCl_{2}, 5.5 mM de dextrosa) conteniendo 1 mg/ml de BSA. Las plaquetas fueron contadas por citometría de flujo usando tubos Tru-Count (BD), y la densidad de las plaquetas fue ajustada con un tampón de tyrodes. rFVIIa (concentración final 0.1 nM o 50 nM, ver Thim, L., Bjoern, S., Christensen, M., Nicolaisen, E.M., Lund-Hansen, T., Pedersen, A.H. & Hedner, U. (1988) Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells.Biochemistry, 27, 7785-7793. (en adelante Thim et al (1988)) fueron mezclados con factor X (8 \mug/ml, Haematologic Technologies Inc.), factor IX (5 \mug/ml, Mononone, Armour Pharmaceutical), factor XI (5 \mug/ml, Haematologic Technologies Inc.), protrombina (86 \mug/ml, Haematologic Technologies Inc.), TFPI (0.1 \mug/ml, ver Pedersen, A.H., Nordfang, O., Norris, F., Wiberg, F.C., Christensen, P.M., Moeller, K.B., Meidahl-Pedersen, J., Beck, T.C., Norris, K., Hedner, U. & Kisiel, W. (1990) Recombinant human extrinsic pathway inhibitor. Production, isolation, and characterization of its inhibitory activity on tissue factor-initiated coagulation reactions. Journal of Biological Chemistry, 265, 16786-16793. (en adelante Pedersen et al. (1990)), ATIII (120 \mug/ml, Haematologic Technologies Inc), factor V (7 \mug/ml, Haematologic Technologies Inc), factor VIII (1 U/ml, McIATE, Centro de Sangre de Nueva York), y cloruro de calcio (3 mM). Algunas proteínas fueron pretratadas como se describe (Kjalke et al. (1997). Se añadieron proteínas y plaquetas a los monocitos, y se midió la actividad de la trombina transfiriendo partes alícuotas a 9 volúmenes de HBS conteniendo 1 mg/ml de BSA, 1 mM de EDTA, 50 \muM de Pefabloc Xa (Pentapharm), y 0.5 mM de Chromozyme TH (Boehringer Mannheim). El desarrollo del color fue detenido con 2 M de ácido acético, y se midió el A405. Se usó \alpha-trombina humana (Boehringer Mannheim) como estándar.

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Resultados

La hemofilia está caracterizada por la generación de trombina alterada. Esto está ilustrado en un modelo a base de células de una coagulación iniciada por factor tisular (Monroe, D.M., Roberts, H.R. & Hoffman, M. (1994) Platelet procoagulant complex assembly in a tissue factor-initiated system. British Journal of Haematology, 88, 364-371; (en adelante Monroe et al. 1994)); (Kjalke et al. 1997), donde el nivel máximo de generación de trombina fue reducido, el tiempo hasta la actividad de trombina máxima fue retardado, y el nivel máximo de actividad de trombina fue reducido hasta unas condiciones similares a las de la hemofilia A comparadas con las condiciones normales (Figura. 2). Cuando se añadió anti-TFPI IgG a condiciones similares a las de la hemofilia A, un aumento dosis-dependiente del nivel de generación de trombina, una reducción del tiempo hasta la actividad de trombina máxima, y se observó un aumento del nivel máximo de actividad de la trombina (Figura 2A). A concentraciones superiores a 10 \mug/ml de anti-TFPI IgG no se observó ningún efecto adicional en la generación de trombina. rFVIIa a 50 nM también aumentó la generación de trombina a condiciones similares a las de la hemofilia A como se muestra en la Figura 2B. Sorprendentemente, la combinación de 50 nM de rFVIIa con 10 \mug/ml de anti-TFPI IgG dio un valor máximo de generación de trombina anterior que el que se pudo obtener con anti-TFPI IgG solo. Cuando se añadió rFVIIa a unas dosis en aumento hasta las condiciones similares a las de la hemofilia A, un efecto máximo, es decir un aumento máximo en ing dosis hasta unas condiciones similares a las de la hemofilia A, se observó un efecto máximo, es decir un aumento máximo en el nivel máximo de generación de trombina, una reducción máxima en el tiempo hasta la actividad de trombina máxima y un aumento máximo en la concentración máxima de la actividad de trombina fue vista a 1 \muM de rFVIIa (Figura. 3A). La adición de concentraciones más altas de rFVIIa no tuvo ningún efecto adicional en la curva de generación de trombina. La adición de 10 \mug/ml de anti-TFPI IgG a la muestra con 1 \muM de rFVIIa sorprendentemente aumentó la generación de trombina más de lo que fue posible con rFVIIa solo, como se ha visto por un nivel máximo aumentado de generación de trombina, una reducción del tiempo hasta la actividad máxima de la trombina, y un nivel máximo aumentado de la actividad de la trombina (Fig. 3B). Nuestros datos muestran, que la combinación de rFVIIa y anti-TFPI IgG tiene un efecto adicional que el simple aumento de la concentración de uno de los componentes individualmente.

Ejemplo 3 Métodos

Plasma humano normal diluido 10 veces con tampón (20 mM de deHEPES, 150 mM NaCl, 5 mM de CaCl, pH 7.4) conteniendo Innovin (Dade Behring, dilución a 2000 veces), rFVIIa (según lo indicado) y t-PA (activador del plasminógeno del tipo tisular, 8 nM; American Diagnostica) fueron añadidos a placas ELISA de 96 pocillos y se midió la turbidez a 650 nm a la temperatura ambiente. En los lugares indicados, se incluyó adicionalmente un anti-TFPI IgG de oveja (Enzyme Research Laboratories).

Resultados

Figura 4 demuestra que la adición de rFVIIa ocasiona una prolongación dosis-dependiente del tiempo de lisis del coágulo. Este efecto fue óptimo a 10 nM de FVIIa; no se obtuvo ningún efecto adicional al añadir 15 nM de rFVIIa. No obstante, la adición de un anti-TFPI IgG de oveja (aTFPI) resultó en una prolongación adicional significante
(p< 0.005) del tiempo de lisis del coágulo (ver figura 5). El efecto fue dosis-dependiente y óptimo a 1.6 \mug/ml de aTFPI. Al unirse, los datos muestran que combinando rFVIIa y anti-TFPI IgG tiene un efecto en la lisis del coágulo in vitro que no puede ser obtenido simplemente aumentando la concentración de uno de los componentes individualmente.

Claims (10)

1. Una composición farmacéutica que comprende un Factor VIIa y un inhibidor TFPI.

2. La composición según la reivindicación 1 donde el Factor VIIa es FVII humano.

3. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde el Factor VIIa es FVIIa recombinante.

4. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la composición además contiene un FVIII.

5. Un kit conteniendo un tratamiento para episodios de sangrado que comprende

a)

una cantidad eficaz de un factor VIIa y un portador farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria;

b)

una cantidad eficaz de un inhibidor TFPI y un portador farmacéuticamente aceptable en una segunda forma de dosificación unitaria; y

c)

medios contenedores para contener dicha primera y segunda formas de dosificación.

6. Un kit según la reivindicación 5, que además comprende una cantidad eficaz de un factor VIII y un portador farmacéuticamente aceptable en una tercera forma de dosificación unitaria; y medios contenedores para contener dichas terceras formas de dosificación.

7. Uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para reducir el tiempo de coagulación en un sujeto.

8. Uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para tratar episodios de sangrado en un sujeto.

9. Uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para prolongar el tiempo de lisis del coágulo en un sujeto.

10. Uso de un factor VIIa en combinación con un inhibidor TFPI para la producción de un medicamento para aumentar la generación de trombina en un sujeto con plasma carente de factor VIII.