JP2006515882A - 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）または組織因子経路インヒビター改変体を含有する安定化水性組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む水性組成物の安定性における有意な改善に基づくものであり、本発明による組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはＴＦＰＩ改変体の安定化水性組成物は、可溶化剤、酸化防止剤、および緩衝剤を含む。可溶化剤と酸化防止剤のこの組合せは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の保存寿命における有意な改善をもたらすことができる。本可溶化剤および酸化防止剤は、凝集および酸化によるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体劣化の作用を実質的に抑止する。

Description

この出願は、２００３年１月８日に出願された同時係属仮出願第６０／４３８，５１９号、２００３年８月１３日に出願された第６０／４９４，５７７号、２００３年１０月８日に出願された第６０／５０９，２６０号、および２００３年１０月２０日に出願された第６０／５１２，０９０号の恩典を主張するものであり、これらの同時係属仮出願は、参照により本明細書に組み入れられる。

（発明の分野）
本発明は、組織因子経路インヒビタータンパク質（ＴＦＰＩ）を含む安定化組成物に関係する。より詳細には、本発明は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、可溶化剤および酸化防止剤を含む組成物に関係する。

（発明の背景）
組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）は、長さが２７６個のアミノ酸であり、組織因子媒介性血液凝固のインヒビターとして機能する。ＴＦＰＩのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されている。ＴＦＰＩのアミノ末端は負に帯電されており、カルボキシ末端は正に帯電されている。ＴＦＰＩタンパク質は３つのＫｕｎｉｔｚ型酵素インヒビタードメインを含んでいる。ＴＦＰＩは１８個のシステイン残基を包含しており、正常にフォールディングされると９個のジスルフィド架橋を形成する。その一次配列は３つのＮ−結合型共通グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含んでいる。これらのグリコシル化部位のアスパラギン残基は位置１４５、１９５および２５６に位置している。また、ＴＦＰＩはリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）としても知られている。

ＴＦＰＩの使用は、敗血症（Ｕ．Ｓ．第６，０６３，７６４号およびＷＯ第９３／２４１４３号）、深静脈血栓症（Ｕ．Ｓ．第５，５６３，１２３号、Ｕ．Ｓ．第５，５８９，３５９号、およびＷＯ第９６／０４３７８号）、虚血（Ｕ．Ｓ．第５，８８５，７８１号、Ｕ．Ｓ．第６，２４２，４１４号、およびＷＯ第９６／４０２２４号）、再発狭窄症（Ｕ．Ｓ．第５，８２４，６４４号およびＷＯ第９６／０１６４９号）、および癌（Ｕ．Ｓ．第５，９０２，５８２号およびＷＯ第９７／０９０６３号）を含む様々な適応症の治療で提唱されている。アミノ末端にアラニン残基が付加されていることによりＴＦＰＩとは異なるＴＦＰＩ改変体（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）は、動物モデルにおいて、敗血症の治療に有効であることが示されている。Ｃａｒｒら、Ｃｉｒｃ Ｓｈｏｃｋ １９９４年 Ｎｏｖ；４４（３）：１２６−３７。

調製後、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の組成物は、保存のため、水性の形態または凍結された状態で包装される。しかし、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、水性処方物の形態で保存されている間に凝集体を形成することがある。凝集は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体分子間で相互作用が起こり、その結果、オリゴマーが形成されることにより引き起こされる。これらのオリゴマーは、可溶性のまま留まることもあれば、視覚可能な大きな凝集体を形成し、これらの凝集体が、保存中に溶液から沈降することもある。水性組成物の保存中に生じるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体による凝集体形成は、生物学的活性に悪影響を及ぼし、その結果、敗血症を含む様々な状態の治療に有効な抗凝固薬としての治療学的効能を失うことがある。その上、凝集体形成は、ＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物が注入システムを用いて投与されているときの配管、膜、またはポンプの閉塞など、他の問題も引き起こしかねない。これらの問題を最小化するため、当技術分野においては、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体の組成物を一層安定化することに対するニーズがある。

（発明の要旨）
本発明は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む水性組成物の安定性における有意な改善に基づくものであり、この改善は、そのような組成物が可溶化剤および酸化防止剤を含むときに実現される。酸化防止剤は酸素置換ガス、酸素もしくはフリーラジカル捕捉剤、またはキレート剤の形態であってよい。

本発明は少なくとも以下の実施形態を提供する。

本発明の一つの実施形態は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍｌまでのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体；（ｉ）アルギニンまたはアルギニンのアナログ、（ｉｉ）リジンまたはリジンのアナログ、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合物からなるグループから選択される約５０ｍＭから約６００ｍＭまでの可溶化剤；および（ｉ）酸素置換ガス、（ｉｉ）酸素またはフリーラジカル捕捉剤、（ｉｉｉ）キレート剤、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の混合物からなるグループから選択される酸化防止剤を含む水性組成物であり、ここで、この水性組成物は、（ａ）約４５％かそれ以上の凝集安定性パーセント；（ｂ）約４５％かそれ以上の酸化安定性パーセント；および（ｃ）約４から約８までのｐＨを有している。

本発明の別の実施形態は、水性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を調製する方法であって、この方法は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍｌまでのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む水性組成物に；（ｉ）アルギニンまたはアルギニンの誘導体、（ｉｉ）リジンまたはリジンの誘導体、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合物からなるグループから選択される約５０ｍＭから約６００ｍＭまでの可溶化剤；およびｂ）（ｉ）酸素置換ガス、（ｉｉ）酸素またはフリーラジカル捕捉剤、（ｉｉｉ）キレート剤、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の混合物からなるグループから選択される酸化防止剤を加える工程を含み、ここで、この水性組成物は、（ａ）約４５％かそれ以上の凝集安定性パーセント；（ｂ）約４５％かそれ以上の酸化安定性パーセント；および（ｃ）約４から約８までのｐＨを有している。

本発明のさらに別の実施形態は、ａ）水性組成物および薬剤学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物である。この水性組成物は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍｌまでのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体；（ｉ）アルギニンまたはアルギニンのアナログ、（ｉｉ）リジンまたはリジンのアナログ、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合物からなるグループから選択される約５０ｍＭから約６００ｍＭまでの可溶化剤；および（ｉ）酸素置換ガス、（ｉｉ）酸素またはフリーラジカル捕捉剤、（ｉｉｉ）キレート剤、ならびに（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の混合物からなるグループから選択される酸化防止剤を含み、ここで、この水性組成物は、（ａ）約４５％かそれ以上の凝集安定性パーセント；（ｂ）約４５％かそれ以上の酸化安定性パーセント；および（ｃ）約４から約８までのｐＨを有している。

（発明の詳細な説明）
本発明の水性組成物は、水性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物に（ｉ）アミノ酸可溶化剤（例えばアルギニン、リジン、またはアルギニンのアナログもしくはリジンのアナログ）および（ｉｉ）酸化防止剤を加えることにより（ここで、この水性組成物は約４から約８までのｐＨを有している）、これら２つの付加的な成分の組合せを伴うことなく調製されたＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物に比べ、保存期間中における安定性が実質的に増大されたＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物がもたらされるという発見に基づいている。本組成物のこの総合的な安定性の増大は、保存期間中における凝集を阻むだけでなく、特にはＴＦＰＩのメチオニン残基における有害な酸化にも抵抗する組成物をもたらすことに対する可溶化剤の影響力と酸化防止剤の影響力とが組み合わさることにより達成される。また、本発明の水性組成物は、生物学的活性の消失または他の望ましくない特性をもたらす他の有害な作用（例えばアンフォールディング、リフォールディング、および変性）にも抵抗する。

可溶化剤および酸化防止剤は、本質的に、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体劣化の独立したメカニズム（それぞれ、凝集およびメチオニン酸化）に作用するため、可溶化剤と酸化防止剤の組合せは、この組合せを伴わずに起こり得る状態よりも、またはこれら２つの成分のうちの一方を伴わずに起こり得る状態と比べてさえ、一層安定したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を提供する。例えば、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体のメチオニンの酸化は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が生物学的に活性な場合においてさえ望ましくないことがあり得る。

（水性組成物の安定性）
本発明の水性ＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物は、典型的には、本明細書において説明されている如き可溶化剤と酸化防止剤の組合せの不在下で調製された組成物に比べ、１つまたはそれ以上のＴＦＰＩ劣化作用（例えば、凝集およびメチオニン酸化）に関して、保存期間中における高められた安定性を有している。即ち、本発明のＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体含有組成物は高められた凝集安定性パーセントおよび高められた酸化安定性パーセントを有しているため、凝集しておらず、酸化もされていないＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の半減期を増大させることができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルの凝集安定性パーセントおよび酸化安定性パーセントは独立的に変わり得る。好適には、本発明の水性組成物におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、例えば以下で説明されている如きプロトロンビン時間アッセイで決定したときに、生物学的に活性である。

本発明の水性組成物は、少なくとも４５％凝集安定性を有している。「凝集安定性パーセント」は、４０℃加速安定性アッセイで測定したときに、可溶性であるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルの割合を表す。４０℃加速安定性アッセイでは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルが４０℃で８週間インキュベートされる。インキュベーション後、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルは、０．２μｍのフィルターを通じて濾過され、溶液中に残存する可溶性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の量を決定すべく、イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）に掛けられる。ＩＥＸ−ＨＰＬＣアッセイは４５％以下で記述される。従って、例えば、６０％凝集安定性を有しているＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃加速安定性アッセイで測定したときに、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の６０％が可溶性の組成物である。８０％凝集安定性を有しているＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、４０℃加速安定性アッセイで測定したときに、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の６０％が可溶性の組成物である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凝集安定性パーセントは、４０℃加速安定性アッセイで測定したときに、好適には約４５％、５０％、６０％、７０％、または７５％かそれ以上であり、より好適には約８０％、８２％、８４％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％かそれ以上であり、例えば、４０℃加速安定性アッセイで測定したときに、約４５％かそれ以上から約９９％かそれ以上まで、約４５％かそれ以上から約７０％かそれ以上まで、約６０％かそれ以上から約８０％かそれ以上まで、約７０％かそれ以上から約９０％かそれ以上まで、約８０％かそれ以上から約９０％かそれ以上まで、または約４５％かそれ以上から約７０％かそれ以上までの範囲であってよい。

また、本発明の水性組成物は、約４５％かそれ以上の酸化安定性も有している。「酸化安定性パーセント」は、３０℃加速安定性アッセイで測定したときに、酸化されたメチオニンを含んでいないＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルの割合を表す。３０℃加速アッセイでは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルが３０℃で８週間インキュベートされる。インキュベーション後、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体サンプルは、溶液中に存在するメチオニン酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の量を決定すべく、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に掛けられる。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイについては以下で説明されている。従って、例えば、６０％酸化安定性を有しているＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、３０℃加速安定性アッセイで測定したときに、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の６０％が酸化されたメチオニンを含んでいない組成物である。８０％酸化安定性を有しているＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、３０℃加速安定性アッセイで測定したときに、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の８０％が酸化されたメチオニンを含んでいない組成物である。本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の酸化安定性パーセントは、３０℃加速安定性アッセイで測定したときに、好適には約４５％、５０％、６０％、７０％、または７５％かそれ以上であり、より好適には約８０％、８２％、８４％、８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％かそれ以上であり、例えば、３０℃加速安定性アッセイで測定したときに、約４５％かそれ以上から約９９％かそれ以上まで、約４５％かそれ以上から約７０％かそれ以上まで、約６０％かそれ以上から約８０％かそれ以上まで、約７０％かそれ以上から約９０％かそれ以上まで、または約８０％かそれ以上から約９０％かそれ以上までの範囲であってよい。

本発明の組成物におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の保存期間における半減期は、典型的には、保存温度に依存して、約１ヶ月から約３６ヶ月まで（例えば、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、１０ヶ月、１５ヶ月、２０ヶ月、２５ヶ月、３０ヶ月、３５ヶ月、または３６ヶ月まで）の範囲である。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体、可溶化剤、および酸化防止剤を含み、約４から約８までのｐＨを有する、本発明による水性組成物は、凝集および／または酸化安定性に関して、典型的には、約１５℃の温度で約８週間より長い、保存期間における半減期を有するであろう。例えば、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の保存期間における半減期は、約１５℃または約３０℃の温度で約１ヶ月から約２４ヶ月まで（例えば、約１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月、１２ヶ月、１４ヶ月、１６ヶ月、１８ヶ月、２０ヶ月、２２ヶ月、または２４ヶ月）である。

（保存温度）
本発明の水性組成物は、後で使用するために液体として保存されるか、または凍結され、使用前に解凍されるかにかかわらず、高められた保存安定性が達成される。保存温度は約−７０℃から約２５℃までの範囲（例えば、約−７０℃、−６０℃、−５０℃、−４０℃、−３０℃、−２０℃、−１０℃、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１２℃、１５℃、１８℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、または２５℃）であってよい。好適には、本発明の水性組成物は、液体の形態で保存安定性が高められているという便益性を充分に活用するため、再構成せずに容易に投与できるため、および予め充填済みの即時使用可能な注射器内における処方物を供給できるため、または、この処方物が静菌剤と適合する場合には、多回量調製物として供給できるため、液体の形態で保存される。液体処方物に対する一つの好適な保存温度は約２℃から約８℃まで（例えば、約２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃）である。

（ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ改変体）
ＴＦＰＩは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好適には、ＴＦＰＩは、微生物の宿主で発生された組換えヒトタンパク質である。ＴＦＰＩは、その生物学的活性がＷＯ第０１／２４８１４号でさらに特性描写および説明されている。

ＴＦＰＩ改変体は、ＴＦＰＩのアナログおよび誘導体、ならびにＴＦＰＩ、ＴＦＰＩアナログ、およびＴＦＰＩ誘導体のフラグメントを含む。ＴＦＰＩ改変体は、ヒトまたは他の哺乳類のソースから得ることができ、合成されてよく、または組換え技術により得ることもできる。アナログは、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、および／または付加を伴ったＴＦＰＩ分子である。アミノ酸が同様な特性を有する別のものと交換される保存的置換が好適である。保存的置換の例は、これらに限定するものではないが、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒを含む。これらは、典型的には、約１個から５個までのアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸）の範囲に収まる。付加的なアミノ酸がこの分子のあらゆる位置に加えられてよく、特にアミノ末端またはカルボキシ末端に加えられてよい。例えば、一つのＴＦＰＩアナログ、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（「ａｌａ−ＴＦＰＩ」）は、アミノ末端に付加的なアラニン残基を有している。アミノ酸の付加は１個、２個、５個、１０個、２５個、１００個、またはそれ以上の付加的なアミノ酸であってよい。融合タンパク質もこの定義の範囲内に包含される。

フラグメントは、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩアナログ、またはＴＦＰＩ誘導体の一部である。フラグメントの例は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１、２、もしくは３、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１および２、もしくは２および３、またはＮ−末端、Ｃ−末端もしくは両末端の欠失を含む。改変体を調製するための実質的な指針がＵ．Ｓ．第５，１０６，８３３号に開示されている。ＴＦＰＩのフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。例えば、フラグメントは、長さが２０個、２５個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、または２７５個の連続したアミノ酸であってよい。生物学的活性を有していないＴＦＰＩフラグメントがＵ．Ｓ．第５，１０６，８３３号に記載されている。本発明におけるそのようなフラグメントの使用も意図されている。

誘導体は、付加的な部分を有するＴＦＰＩ、ＴＦＰＩアナログ、またはＴＦＰＩフラグメントとして定義される。このような付加の例はグリコシル化、リン酸化、アセチル化、またはアミド化を含む。

ＴＦＰＩ改変体とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とのパーセント相同性は、Ｂｌａｓｔ２アラインメントプログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｅｘｐｅｃｔ１０、標準的な遺伝コード、オープンギャップ１１、エクステンションギャップ１、ギャップｘドロップオフ５０、および低コンプレキシティーフィルター・オフ）を用いて決定される。ＴＦＰＩ改変体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、一般的に約７０％かそれ以上、好適には約８０％かそれ以上、より好適には約９０％から９５％まで（例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％）かそれ以上、最も好適には約９８％か９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。

ＴＦＰＩのアミノ酸配列改変体は、ＴＦＰＩをエンコードするＤＮＡ配列の改変を為すことにより調製することができる。ヌクレオチド配列の改変を為すための方法は、当技術分野において広く知られている。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編集（１９８３年）のＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年）のＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｕ．Ｓ．第４，８７３，１９２号、およびこれらの文献で引用されている参考文献を参照のこと。

ＴＦＰＩ改変体は、好適には、実質的な量の生物学的活性を有しており、例えば以下で説明されているプロトロンビン（ＰＴ）アッセイで測定したときに、例えばＴＦＰＩの生物学的活性の１０％、３０％、５０％、６０％、８０％、９０％かそれ以上を有している。もちろん、ＴＦＰＩ改変体をエンコードするＤＮＡに為されるあらゆる改変は、その配列を読み枠の外側に位置させてはならず、また、二次ｍＲＮＡ構造を産生し得る相補的な領域を創出しないことが好ましい。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の生物学的または免疫学的活性を壊滅させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失することができるかを決定する指針は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアなどの当技術分野において広く知られているコンピュータープログラムを用いて、またはＤａｙｈｏｆｆら（１９７８年）らによるＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に見出すことができる。生物学的に活性でないＴＦＰＩ改変体の安定化も意図されている。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、Ｕ．Ｓ．第４，９６６，８５２号に示されているように、組換え技術により生産することもできる。例えば、所望のタンパク質に対するｃＤＮＡを、原核生物または真核生物において発現させるため、プラスミドに組み込むことができる。微生物を用いるタンパク質の発現について詳述している多くの参考文献が当業者に知られている。Ｕ．Ｓ．第４，８４７，２０１号、およびＭａｎｉａｔａｓら（１９８２年）によるＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。

微生物を形質転換するのに様々な技術を使用することができ、この形質転換された微生物を用いてＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が発現される。以下の方法は、可能な手法の単なる例である。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体のＤＮＡ配列を適切なコントロール配列に接続することができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体のＤＮＡ配列は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍなどの会社から商業的に入手可能なｐＵＣ１３またはｐＢＲ３２２などのプラスミドに組み込むことができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体のＤＮＡがベクターに一旦挿入されると、これを適切な宿主にクローニングすることができる。このＤＮＡは、Ｕ．Ｓ．第４，６８３，２０２号およびＵ．Ｓ．第４，６８３，１９５号に示されている技術などにより増幅することができる。ｃＤＮＡは、ＨｅｐＧ２またはＳＫＨｅｐ肝腫瘍細胞などの細胞を誘導してｍＲＮＡを作り、次いで、このｍＲＮＡを同定および単離し、ｃＤＮＡを得るべく、このｍＲＮＡを逆転写することにより得ることができる。発現ベクターがＥ．ｃｏｌｉなどの宿主に形質転換された後、バクテリアを培養し、このタンパク質を発現させることができる。バクテリアは原核微生物が好適であり、Ｅ．ｃｏｌｉが特に好適である。本発明に有用な一つの好適な微生物は、１９８４年２月１４日のＢｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙの規定の下で、現在は１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａに所在する、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに付託（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ３９６０７）されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２、菌株ＭＭ２９４である。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、バクテリアまたは酵母中で生産し、この後、精製されてよい。一般的に、Ｕ．Ｓ．第５，２１２，０９１号、Ｕ．Ｓ．第６，０６３，７６４号、およびＵ．Ｓ．第６，１０３，５００号またはＷＯ第９６／４０７８４号に示されている如き手順を使用することができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、ＷＯ第９６／４０７８４号およびＧｕｓｔａｆｓｏｎらのＰｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒ．５：２３３（１９９４年）により精製、可溶化、およびリフォールディングすることができる。例えば、ＷＯ第９６／４０７８４号の実施例９により調製する場合には、総タンパク質の量のうち重量で約８５％から９０％までを生物学的に活性なａｌａ−ＴＦＰＩとして包含するａｌａ−ＴＦＰＩの調製物が得られる。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、典型的には、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１５ｍｇ／ｍｌまで（例えば０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｇ／ｍｌ、または１５ｍｇ／ｍｌ）の量で本発明の水性組成物に加えられる。

（アミノ酸可溶化剤）
本発明のＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物に組み込まれるアミノ酸可溶化剤は、主に、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が凝集するのを防ぎ、これにより、保存期間中における本組成物の安定性を高める。アミノ酸可溶化剤を加えることによる凝集体形成の低減は濃度に依存する仕方で起こる。即ち、アミノ酸可溶化剤の濃度を高めると、それに応じて、保存期間中における凝集体形成が低減されるため、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の高められた安定性がもたらされる。

好適なアミノ酸可溶化剤は、アルギニン、リジン、またはアルギニンアナログもしくはリジンアナログである。アルギニンまたはリジンは、遊離塩基の形態または塩の形態のいずれかで存在してよく、例えば塩酸塩の形態で存在してよい。また、アルギニンまたはリジンのアナログも、遊離塩基または塩の形態で存在してよい。アルギニンアナログは、例えばアミノグアニジンアルギニンエチルエステル、アルギニンヒドロキサマート、およびアルギニンｐ−ニトロアニリドを含む。リジンアナログは、例えばリジンアミド、リジンエチルエステル、リジンヒドロキサマート、およびリジンｐ−ニトロアニリドを含む。好適には、可溶化剤は、遊離塩基の形態か塩酸塩の形態のいずれかとして存在するアルギニンである。また、アルギニンまたはリジンの天然に生じるＬ−立体異性体も可溶化剤として使用するのに好適であり、但し、本発明の安定化組成物は、Ｄ−立体異性体またはＬ−立体異性体とＤ−立体異性体の混合物も組み込んでいてよい。

アルギニンもしくはリジン可溶化剤またはこれらのアナログは、可溶化剤が加えられていない点を除いて同様な組成物と比較して、本処方物が劣化に対して改善された抵抗性を呈するように、保存期間中にＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を安定化させる所望の効果をもたらす量で本水性組成物中に組み入れられる。好適には、本組成物中における可溶化剤の合計量は約５０ｍＭから約６００ｍＭまで（例えば５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、または６００ｍＭ）であり、より好適には約１００ｍＭから約４００ｍＭまで、最も好適には約３００ｍＭである。

凝集体形成を低減し、ポリペプチドの安定性を増大させ、本組成物の保存安定性を高めるためにＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有水性組成物に加えられるべき特定のアミノ酸塩基の量の決定は、当業者に一般的に知られた種々の方法、例えば以下の実施例６で説明されている方法を用いて容易に決定することができる。例えば、水性組成物の形態で保存中のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の安定性に及ぼすアルギニン可溶化剤またはリジン可溶化剤のいずれかの効果は、長時間にわたるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の数多くの可能な特性のうちの１つまたはそれ以上の特性における変化、例えば可溶性ポリペプチドの濃度の変化などを測定することにより、容易に決定することができる。溶液中の可溶性ポリペプチドの量は、イオン排除（ＩＥＣ）−ＨＰＬＣにより定量することができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体劣化に至る主要な経路が凝集であるケースでは、改善された安定性を得るためにＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物に組み込まれるべき可溶化剤の有効量は、長時間を掛けて生じる凝集体形成の低減をもたらし、従って、溶液中の可溶性ポリペプチドを凝集していない（即ち、モノマーの）分子形態に長時間保持することができる量である。

（酸化防止剤）
また、本発明の水性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は酸化防止剤も含む。「酸化防止剤」は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の酸化、特には本分子内のメチオニンアミノ酸残基の酸化を低減する成分である。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体分子に存在するメチオニン残基の酸化は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の保存期間中における主要な劣化経路の一つである。酸化は、メチオニン残基と直接的に反応するか、酸化反応を触媒するかのいずれかの、本組成物中の汚染物質の存在と関係している。従って、このような汚染物質の影響を除去すべく特定の付加的な酸化防止剤を使用することは、本発明による可溶化剤を既に組み入れている組成物の場合においてさえ、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の一層優れた安定性をもたらす。好適には、この酸化防止剤は薬剤学的に許容可能であり、約０．０１ｍＭから約５０ｍＭまでの濃度（例えば、約０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ）、より好適には約１ｍＭから約１０ｍＭまでの濃度（例えば、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭ）で存在する。「薬剤学的に許容可能な」という用語は、その処方物を患者に投与したときに、何ら重大な生物学的悪影響が存在しないことを意味する。「患者」という用語は、ヒトと獣医学的患者の両方を包含する。

本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物に有効な３つの一般的なタイプの酸化防止剤は：酸素置換ガス、酸素またはフリーラジカル捕捉剤、およびキレート剤である。

（酸素置換ガス）
水性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物中に存在する溶存酸素は、ついにはメチオニン酸化を引き起こし、その結果として、意図された治療学的機能に対するＴＦＰＩの有効性の消失、またはＴＦＰＩもしくはＴＦＰＩ改変体ポリペプチド内における酸化された種（例えばメチオニンスルホキシド）の組込みのいずれかをもたらすことがあり、酸化された種の組込みは、未知の、または望ましくない生理学的影響を有している可能性がある。酸素置換ガスは、溶存酸素をパージまたは置換するのに有効なガスである。好適には、酸素置換ガスは、本組成物が環境条件において空気中で平衡化されているときの溶存酸素濃度と比べて、可溶性酸素濃度を有意に低減するであろう。好適には、酸素置換ガスは、酸素置換ガスを含んでいないＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の水性組成物の溶存酸素濃度と比べて、溶存酸素濃度を約１０％未満に低減する。この条件は安定性を劇的に増大させる。

好適な酸素置換ガスは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物に関して実質的に不活性であり、即ち、ＴＦＰＩ組成物を酸素置換ガスに晒したときに、何ら有意な量の化学的反応性が生じず、ＴＦＰＩの生物学的活性が維持される。適切な酸素置換ガスは、窒素、窒素富化空気、窒素富化酸素、希ガス（例えばヘリウムまたはアルゴン）、メタン、エタン、プロパン、二酸化炭素、およびこれらのガスの混合物を含む。「窒素富化空気」および「窒素富化酸素」は、大気中において見られるよりも高い窒素濃度（即ち、約７９ｖｏｌ−％より高い濃度）を有する、それぞれ、窒素と空気または酸素の混合物である。窒素は、好適な酸素置換ガスである。

酸素置換ガスは、溶解度の限界を含め、溶解度限界までのあらゆる濃度で本組成物に存在していてよい。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物中における酸素置換ガスの溶解度は、本組成物の液面上に置換ガスを包含した密閉容器中など、本組成物を加圧雰囲気中で維持することにより高めることができる。代替的に、酸素置換ガスの溶解度を低減するため、ヘッドスペースを大気圧以下に維持することもできる。

酸素置換ガスは、あらゆる通常の仕方でＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物中に導入されてよく、例えば、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物を保持したバイアルまたは他の容器の液面上のヘッドスペースを置換ガスでパージする方法により、または置換ガスでの加圧／減圧サイクルを用いて、置換ガスをＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物中にスパージングもしくはバブリングする方法により、または真空排気し、続いて、置換ガスで再加圧する方法などにより導入することができる。

酸素置換が上で述べられているようにして果たされた後、酸素置換ガスで空気から隔離することにより、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物における酸素の再可溶化が防止される。

（酸素またはフリーラジカルの捕捉剤）
本発明に有用な別のタイプの酸化防止剤は、酸素捕捉剤またはフリーラジカル捕捉剤である。一般的に、このような捕捉剤は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体とよりも酸素および／またはフリーラジカルとの方が反応性が高い。これらの捕捉剤は、利用可能な酸素と反応する「犠牲」分子として機能し、これにより、有害な酸素−ＴＦＰＩ相互作用または酸素−ＴＦＰＩ改変体相互作用を防止し、特にメチオニン残基の酸化を防止する。一つの好適な実施形態では、酸素またはフリーラジカル捕捉剤は、約０．１ｍＭから約１０ｍＭまでの濃度を有している。

酸素またはフリーラジカルの適切な捕捉剤は、本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物において安定である。好適な、薬剤学的に許容可能な酸素またはフリーラジカル捕捉剤は、メチオニン、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−、ＤＬ−またはＤ−αトコフェロールおよびＬ−、ＤＬ−またはＤ−αトコフェロールアセタート、ベータカロテン、セレン、ピリチノール、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む。酸素またはフリーラジカル捕捉剤に対する適切な相は、当然のことながら、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物との適合性に依存するであろう。一般的には、アスコルビン酸またはアルファ−トコフェロールの酢酸塩（即ち、αトコフェロールアセタート）などの親水性酸化防止剤を本発明の組成物に適切に組み入れることができる。

メチオニンのあらゆる立体異性体（Ｌ−、Ｄ−、またはＤＬ−異性体）またはこれらの異性体の組合せを使用することができる。特に好適な酸化防止剤はメチオニン、特にＬ−メチオニンである。一般的に、優れた結果は、加えられたメチオニンが、モルベースで、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体に存在する量と少なくとも等しい量に相当するときに得られる。未変性の形態では、ＴＦＰＩは、１つのタンパク質分子当たり５個のメチオニン残基を含んでいる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体タンパク質の一部であるメチオニンは、酸化防止剤として本組成物に加えられ、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体タンパク質の一部ではないメチオニンと区別するため、「ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニン」と名付けられる。もちろん、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニンではないポリペプチドのメチオニンも、本発明のための酸素捕捉剤として機能することができる。例えば、ポリ（メチオニン）を含むポリペプチドは、本組成物に加えられる遊離メチオニンと同様な仕方で、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニンの酸化速度を低減することができよう。従って、上で定義されている通りの「ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニン」と、遊離した形態またはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ではないポリペプチドに結合された形態のいずれかで本組成物に加えられるあらゆるメチオニン残基を含む「非−ＴＦＰＩまたは非−ＴＦＰＩ改変体」メチオニンとを区別することが重要である。

好適には、メチオニンは、非−ＴＦＰＩまたは非−ＴＦＰＩ改変体メチオニンとＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニンとのモル比が約１：１から約１０，０００：１まで、より好適には約１：１から約５，０００：１まで、より一層好適には約１００：１から約１，０００：１まで、さらに一層好適には約３００：１から約１，０００：１まで、尚も一層好適には約５００：１から約１，０００：１までとなるような量で存在する。絶対濃度の観点で言えば、メチオニンは、好適には、本組成物中に約１ｍＭから約１０ｍＭまで（例えば、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭ）の濃度で存在する。しかし、使用されるメチオニンの濃度は、本発明の組成物中におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の濃度に依存して様々に変わってよい。メチオニンまたは他の酸素捕捉剤の一つの重要な効果は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体が生物学的に活性であり得るケースにおいてさえ、生理学的な条件下で望ましくない、または未知の影響をもたらしかねないＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体メチオニンスルホキシド残基の形成を防止することである。従って、加えられる酸化防止剤の量は、加えられたメチオニンの酸化で発生するメチオニンスルホキシドの量が取り締まり機関の意にかなうように、メチオニン残基の酸化を抑制するのに充分な量であるべきである。典型的には、これは、本組成物が、メチオニンスルホキシドとしてメチオニン残基の約１０％から約３０％までより多くを含まないことを意味する。

（キレート剤）
本発明に有用な別のタイプの酸化防止剤は、遷移金属イオン（例えばＦｅ^＋３）を効果的に結合するキレート剤であり、金属イオン封鎖剤としても知られている。本組成物中に遷移金属イオンが存在する場合があり、これらの遷移金属イオンは、タンパク質の劣化および凝集をもたらす有害な酸化反応を触媒する可能性がある。キレート剤は、本組成物の他の成分と殆どまたは全く化学的に反応せず、また、本組成物の望ましい生理学的特性（例えばｐＨおよび浸透圧）の維持と総体的に適合するように選択される。従って、維持またはｐＨもしくは浸透圧などの目的で遷移金属カチオンが本組成物に熟慮せずに加えられている場合には、組成物にキレート剤を使用することが好適である。

キレート剤は、好適には、薬剤学的に許容可能である。好適な、薬剤学的に許容可能なキレート剤は、溶液中の１つまたはそれ以上の遷移金属イオンと共に金属−配位子錯体を形成する能力を有する様々なアミノカルボキシラート化合物を含む。このようなアミノカルボキシラートは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチルトリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ならびに１つまたは多数のカルボキシラート基を有する他のアミノカルボキシラート化合物を含む。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物中に存在する遊離遷移金属イオンと共に錯体を形成する幾分かの能力がキレート剤に残っていることを条件として、これらのアミノカルボキシラートキレート剤のあらゆる誘導体塩の形態、例えば二ナトリウム塩の形態も使用することができる。また、塩の形態以外のこれらのキレート剤の形態も有効であり、そのような形態は、これらの化合物の様々なエステル、無水物、およびハロゲン化された形態を含む。

（緩衝剤）
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物のｐＨはタンパク質の溶解度に影響を及ぼし、従って、安定性にも影響を及ぼす。Ｃｈｅｎら（１９９９年）によるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８８（９）：８８１−８８８を参照のこと。本発明の組成物に対する好適なｐＨの範囲は約４から約８まで（例えば４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、または８）であり、より好適には約５から約６．５までである。ｐＨはＴＦＰＩの溶解度における重要な因子であるため、適切なｐＨを維持するための緩衝剤の使用は、本処方物の安定性を一層改善することができる。従って、本発明の水性組成物は、さらに、溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を含むことができる。好適には、緩衝剤は、実質的に塩の形態を含まない酸、塩の形態の酸、または酸と酸の塩の形態との混合物である。

好適には、本組成物のｐＨは、実質的に塩の形態を含まない酸との組合せにおいて、塩基の形態のアルギニンまたはリジンアミノ酸可溶化剤を用いて維持される。このような組合せは、酸および酸の塩の形態が、アミノ酸塩基との組合せにおいて、緩衝剤として使用される場合よりも、この溶液の浸透圧を低くすることができる。このような組合せの利点は、溶液の等張性を超過することなく、高めの濃度のアルギニンまたはリジンアミノ酸可溶化剤および／または酸化防止剤（例えばメチオニン）を水性組成物に組み入れることができることである。「実質的に塩の形態を含まない酸」という用語は、水性組成物内において緩衝剤として機能する酸が、典型的には、この酸の塩の形態を約２％未満しか含んでいないことを意味する。

典型的には、酸を含む緩衝剤が水性組成物において使用される場合、緩衝剤は、酸の塩の形態、または酸と酸の共役塩基の塩の形態の組合せを用いて調製される。従って、例えば、緩衝剤は、酸と、この酸の共役塩基のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、および／またはマグネシウム塩とを用いて調製することができる。緩衝剤が、塩の形態を実質的に含まない酸との組合せにおいて、アルギニンまたはリジン可溶化剤の塩基の形態を含むべく選択される場合、好適な緩衝剤は、クエン酸、コハク酸、リン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、およびアスパラギン酸から選択される。クエン酸およびコハク酸は、遊離塩基の形態のアルギニンとの組合せにおける緩衝剤として使用するのに特に好適である。そうでない場合には、先に述べられているように、アルギニンを、アルギニンのＨＣｌ塩の形態などの塩の形態で使用することができる。このケースでは、緩衝剤は、一般的に、上で述べられている如き酸と、この酸の共役塩基の塩の形態との組合せを含むであろう。使用され得る他の緩衝剤はヒスチジンおよびイミダゾールを含む。全般的に、緩衝剤の好適な濃度は、約０ｍＭから約５０ｍＭまで（例えば、０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ）であり、より好適な濃度は約５ｍＭから約３０ｍＭまでである。

使用される緩衝剤がアミノ酸塩基と塩の形態を実質的に含まない酸である場合、塩化ナトリウムなどの付加的な等張化剤を含める必要性を伴うことなく、実質的に等張性であるＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物を調製することができる。実質的に等張性の組成物は、生体内への投与後、周囲の細胞の膜を横切る水の流動を最小程度にしかもたらさず、または水の流動を全くもたらさない。一般的に、水性組成物の等張性は、投与時の痛みを低減し、また、組成物が高張性または低張性であることと関わりを有する潜在的な溶血作用を最小化するため、望ましい。この等張状態は、溶液の浸透圧が、本発明において好適である、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌから約３４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌまで（例えば、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２７０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、２９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または３４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）であることに相当する。より好適には、実質的に等張な状態は約２９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧において達成される。

しかし、ある場合には、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の維持されるべき望ましい特性（例えばｐＨおよび浸透圧）に依存して、緩衝剤として使用される酸は、酸の塩の形態、または酸と酸の塩の形態との混合物であってよい。このケースでは、好適な緩衝剤は、酸と酸の塩の形態との混合物である。この酸は、例えば、クエン酸、コハク酸、リン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、およびアスパラギン酸であってよい。酸の塩の形態は、この酸の共役塩基のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、またはマグネシウム塩であってよい。特に好適な緩衝剤は、共役塩基の塩がナトリウム塩の形態の緩衝剤である。このような緩衝剤は、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、リン酸／リン酸ナトリウム、グルタミン酸／グルタミン酸ナトリウム、マレイン酸／マレイン酸ナトリウム、リンゴ酸／リンゴ酸ナトリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、およびアスパラギン酸／アスパラギン酸ナトリウムを含む。アルギニンが可溶化剤として使用されるときには、それが遊離塩基の形態であっても、好適な緩衝剤はクエン酸／クエン酸ナトリウムまたはコハク酸／コハク酸ナトリウムである。このケースでは、緩衝剤の濃度は、好適には約５ｍＭから約３０ｍＭまで（例えば５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、または３０ｍＭ）であり、より好適には約２０ｍＭである。

塩の形態を実質的に含まない酸によって緩衝されたアミノ酸塩基の組合せを用いるときには、酸と酸の塩の形態との混合物である緩衝系を用いた場合に達成され得る状態よりも高い濃度の安定化アミノ酸を有する近等張性処方物が可能である。このようなケースにおける、実質的に等張性の組成物との関わり合いを有する可溶化剤の比較的高い濃度も、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の改善された安定性をもたらし、従って、保存寿命を増大させることができる。

例えば、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含み、５．５のｐＨを有する水性処方物に加えられたアルギニン塩基を緩衝するためにクエン酸が使用されるときには、アルギニンの濃度は、この処方物の等張性を尚も維持しながら、３００ｍＭにまで増大させることができる。これは、５０℃におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の保存寿命を略３５％増大させる結果をもたらす。同じアルギニン濃度および緩衝剤としてのクエン酸／クエン酸ナトリウムを用いて同様なＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体保存寿命を達成することができるが、アルギニンは、同様なｐＨを達成するために、酸性の形態で加えられねばならず、また、結果として得られる処方物は高張性である。より高濃度のアミノ酸を一次的な安定化剤として使用できることにより、潜在的なウイルス汚染のため、望ましさに劣る安定化剤であるウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどのもっと伝統的なＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体可溶化剤の必要性が排除される。

（付加的な安定化剤）
本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物は、酸化防止剤と組み合わせたアミノ酸可溶化剤により達成される一次的な安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の有効性を増大させ、またはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の望ましい質を促進させる他の化合物を含むことができる。例えば、本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の凍結解凍による、または本発明のＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の加工中に生じる機械的な剪断によるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体ポリペプチドの劣化は、溶液−空気界面における表面張力を低下させるために本組成物に界面活性剤を組み入れることにより抑制することができる。適切な界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）などのポリオキシエチレンソルビトールエステル；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８などのポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンエステル；Ｂｒｉｊ３５などのポリオキシエチレンアルコール；シメチコン；ＰＥＧ４００などのポリエチレングリコール；リゾホスファチジルコリン；およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などのポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノールを含む。界面活性剤または乳化剤による製剤の古典的な安定化は、例えば、Ｌｅｖｉｎら（１９９１年）によるＪ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４５（３）：１６０−１６５に記載されている。本発明の実践において使用される一つの好適な界面活性剤はポリソルベート８０である。

アルブミンなどの他の安定化剤は、本ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体組成物の安定性をさらに増強させるため、場合によって加えることができる。アルブミンの量は、約１％ｗ／ｖかそれ以下で加えることができる。糖または糖アルコールも本発明のＴＦＰＩ含有またはＴＦＰＩ改変体含有組成物に含めることができる。単糖、二糖もしくは多糖、または水溶性グルカンなどのあらゆる糖（例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース−Ｎａ）を使用することができる。スクロースが最も好適な糖添加剤である。糖アルコール（即ち、−ＯＨ基を有するＣ_４−Ｃ_８炭化水素）、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール、ズルシトール、キシリトール、またはアラビトルムを使用することができる。マンニトールが最も好適な糖アルコール添加剤である。上で述べられている糖または糖アルコールは個別的に使用されてよく、または組み合わせて用いられてもよい。糖または糖アルコールが液体調製物に可溶性であり、且つ、本発明の方法を用いて達成される安定化作用に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に固定の限界はない。好適には、糖または糖アルコールの濃度は約１％ｗ／ｖから約１５％ｗ／ｖまでの間であり、より好適には約２％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖまでの間である。

（安定した組成物の調製）
本発明の組成物は、好適には、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を組み入れる前に、可溶化剤、酸化防止剤、場合による緩衝剤、およびあらゆる他の賦形剤を予め混合することにより調製される。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の高められた安定性を達成すべく、好適な量の可溶化剤および酸化防止剤を加えた後、本組成物のｐＨを、好適には、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体にとって最適な、本明細書で開示されている範囲内に調節することができる。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を加えた後にｐＨを調節することもできるが、好適には、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を加える前にｐＨが調節され、これにより、変性のリスクを低減することができる。この後、適切な機械的装置を用いて、成分の適正な混合を果たすことができる。

（薬学的組成物）
好適には、本発明の水性組成物は、被検者に投与され得る形態であるか、または被検者に投与され得る処方物を調製するために使用することができる形態であるかのいずれかである。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体を含む水性組成物は、一回量で調合されてよく、また、溶液、懸濁液、または乳濁液などの注射可能な形態もしくは注入可能な形態であってよい。好適には、本発明の水性組成物は、本発明により達成された、高められた保存安定性を活用するため、以下で概要説明されている如く、水性処方物の形態で保存される。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体薬学的組成物は、好適には、膜濾過により滅菌され、密封されたバイアルまたはアンプルなどの一回量もしくは多回量容器内で保存される。また、このような組成物を凍結することもできる。

一般的に組成物を調合するための付加的な方法が当技術分野において知られており、それらの方法は、本明細書で開示されている可溶化剤、酸化防止剤、および緩衝剤の有益な効果に悪影響を及ぼさないことを条件として、水性ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体薬学的組成物の保存安定性をさらに高めるために使用することができる。薬剤学的に許容可能な担体、可溶化剤などの調合および選択に関する綿密な検討は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０年）（第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）に見出すことができる。

以下の実施例は例証のために提示されたものであり、限定することを目的としたものではない。この開示で引用されているすべての特許、特許出願、および参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

（実験）
以下のプロトコルを下記の実施例１−６で用い、特定の可溶化剤および／または酸化防止剤が、水性組成物の形態で保存期間中におけるＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の劣化および安定性に及ぼす効果を決定した。

（逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ）
Ｖｙｄａｃ ２１４ＢＴＰ５４ Ｃ_４カラムおよびＶｙｄａｃ ２１４ＧＣＣプレカラム（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｈｅｓｐａｒｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、７１７オートサンプラーを備えたＷａｔｅｒｓ ６２６ ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｉｎｅ）でＲＰ−ＨＰＬＣを実施した。これらのカラムは、最初に移動相Ａ（１０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ）で平衡化された。このＲＰ−ＨＰＬＣ法はモノマーのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体種をメインピークとして検出する。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体のアセチル化およびカルバミル化された形態を表すピークに加えて、このタンパク質の単一および多数の酸化されたメチオニン残基を含む他のピークを分解することができる。

（イオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ））
上述のＣｈｅｎらの説明の如く、７１７ヒーター／クーラー・オートサンプラーを伴うＷａｔｅｒｓ ６２６ ＬＣシステムを用いて、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ−Ｓ ＨＲ ５／５ガラスカラムでイオン交換（ＩＥＸ）−ＨＰＬＣを実施した。カラムは、８０％の移動相Ａ（７０：３０ ｖ／ｖ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム：アセトニトリル、ｐＨ５．４）および２０％の移動相Ｂ（７０：３０ ｖ／ｖ、２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１Ｍの塩化アンモニウム：アセトニトリル、ｐＨ５．４）を用いて平衡化された。注入後、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、０．７ｍｌ／分の流量において、移動相Ｂを２１分掛けて８５％まで高めることにより溶出された。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体は、単一のピークとして約１６．５分で溶出され、Ｗａｔｅｒｓ ４８６吸光度検出器を用いて、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度により検出された。データの取得および処理は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍシステムで実施された。タンパク質濃度は、ピーク面積を積分し、その積分値を既知濃度のサンプルから作成した標準曲線と比較することにより見積もられた。

（ｐＨおよび浸透圧の測定）
様々な処方物の溶液ｐＨは、Ｏｒｉｏｎ（Ｍｏｄｅｌ ６１１、Ｏｒｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｇｒｏｕｐ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手したｐＨ計により測定された。ｐＨ計は、ｐＨ４標準液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＢ１０１−５００）およびｐＨ７標準液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＢ１０７−５００）を用いて、製造業者により提案された２点−緩衝液キャリブレーション法により校正された。

これらの処方物の溶液浸透圧は、Ｗｅｓｃｏｒから入手したＶａｐｏｒ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ５５００、Ｗｅｓｃｏｒ Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）により測定された。浸透圧計は、製造業者により供給された以下の２つの標準液により校正された：２９０ｍｍｏｌ／ｋｇ標準液（Ｗｅｓｃｏｒ、Ｒｅｏｒｄｅｒ Ｎｏ．ＯＡ−０１０）および１，０００ｍｍｏｌ／ｋｇ標準液（Ｗｅｓｃｏｒ、Ｒｅｏｒｄｅｒ Ｎｏ．ＯＡ−０２９）。

（他の材料および方法）
処方物緩衝液はＣｈｉｒｏｎ Ｔｅｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅにより調製された。以下の研究で使用するため、１０−ｃｃタイプ−Ｉ管状ガラス製バイアルおよびＤａｉｋｙｏ Ｇｕｍｍｉ積層非シリコーン処理ストッパーを入手した。

ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体バイアルの溶存酸素レベルは、Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ２００により測定された。ＴＦＰＩ酸化に対する見掛け一次速度定数の見積もりは、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ^(R)（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）ソフトウェアプログラムを用いて実施された。

（実施例１）
（プロトロンビン時間アッセイ）
適切なプロトロンビン時間アッセイは米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ第９６／４０７８４号に記載されている。簡単に言えば、プロトロンビン時間は凝固計（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａから入手可能なＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ ＭＴＸ ＩＩ）を用いて測定することができる。適切なアッセイ緩衝液は、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含み、ｐＨ７．５に調節された５０ｍＭのＴｒｉｓである。必要な付加的試薬は、正常ヒト血漿（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｖｅｒｉｆｙ １」）、トロンボプラスチン試薬（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃｅｌ」）、およびＴＦＰＩ標準液（例えば、１ｍｌのアッセイ緩衝液当たり２０μｇの１００％純粋なａｌａ−ＴＦＰＩ（またはこれの同等物））である。

標準曲線は、ＴＦＰＩ標準液の希釈列、例えば１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌまでにわたる最終濃度への希釈列の凝固時間を分析することにより得られる。凝固時間を測定する場合、先ず、サンプル、またはＴＦＰＩ標準液がアッセイ緩衝液中に希釈される。この後、正常ヒト血漿が加えられる。凝固反応は、トロンボプラスチン試薬を加えることにより開始される。この後、機器が凝固時間を記録する。対数凝固時間−対−対数ＴＦＰＩ濃度のプロットから直線的なＴＦＰＩ標準曲線が得られる。この標準曲線は、ＴＦＰＩ標準液の純度に基づいて、１００％純粋な標準液の等価ＴＦＰＩ濃度に対応させるべく調整される。例えば、標準液が、生化学的に９７％純粋なａｌａ−ＴＦＰＩの調製物である（即ち、ＴＦＰＩの生物学的活性を有していない分子種を重量で３％含んでいる）場合には、ＴＦＰＩの実際の濃度を与えるべく、標準液の各希釈の濃度に０．９７が掛け算される。従って、１ｍｌの９７％純粋な調製物当たりの実際の重量に基づいて１．０μｇ／ｍｌであるＴＦＰＩ標準液は、１．０×０．９７、即ち０．９７μｇ／ｍｌの濃度と等価であり、０．９７μｇ／ｍｌの濃度として扱われる。敗血症ならびに数多くの他の適応症の治療におけるＴＦＰＩの有効性に関する他の尺度も可能であり、このような尺度は、２８日間以内におけるすべての原因による死亡率の低減の測定、およびプラシーボとの比較における幾つかの多臓器機能障害（ＭＯＤ）スコアの改善の測定などを含む
（実施例２）
（様々な組成物におけるＬ−アルギニン濃度がａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に及ぼす効果）
５．５のｐＨで０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ最終濃度を有するａｌａ−ＴＦＰＩ組成物は、透析により緩衝液交換された０．６ｍｇ／ｍｌのストック溶液から調製され、結果として得られたａｌａ−ＴＦＰＩ濃度をＵＶ／Ｖｉｓ分光法を用いて分析し、クエン酸ナトリウムの付加を伴い、またはクエン酸アトリウムの付加を伴わずに、クエン酸緩衝液を用いて０．１５ｍｇ／ｍｌの開始目標濃度に希釈した。クエン酸ナトリウムの付加は、Ｌ−アルギニン可溶化剤がＬ−アルギニンＨＣｌとして存在するサンプルに対してのみ使用され、一方、Ｌ−アルギニン塩基を含有する組成物を緩衝するためにはクエン酸のみが使用された。

次いで、これらの溶液を安定性保存用に３−ｃｃバイアルに（１ｍｌずつ）小分けした。開始時点の濃度測定用に充分な数のバイアルをとっておいた。残りのバイアルは、加速安定性試験のため、５０℃のインキュベーターに入れた。５．５のｐＨで０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩを有する４つのサンプル組成物における可溶化剤および緩衝剤の濃度が以下に記載されている：
１）２０−１５０ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ可溶化剤、および１０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝剤；
２）クエン酸でｐＨ５．５に滴定された、２０−１５０ｍＭのＬ−アルギニン塩基可溶化剤；
３）１００−３００ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ可溶化剤、および１０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝剤；および
４）クエン酸でｐＨ５．５に滴定された、１００−３００ｍＭのＬ−アルギニン塩基可溶化剤。

３日目、７日目、１４日目、および３０日目に各バイアルの内容物を１．７ｍｌ用のマイクロ遠心分離管に移した後、１０，０００ｒｐｍで約２分間遠心分離した。遠心分離後、サンプル中の可溶性タンパク質を凝集／沈降タンパク質から分離した。可溶性タンパク質の量をＩＥＸ−ＨＰＬＣ法（Ｃｈｅｎら（１９９９年）によるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８（９）８８１−８８８）により測定した。この後、保存時間の関数としての濃度データを一次指数崩壊モデル（Ｙ＝Ｙ_０ｅ^−ｋｔ）に当てはめ、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ^(R)図形ソフトウェアを用いて、残存する可溶性タンパク質に対する保存期間中の半減期を算出した。

ａｌａ−ＴＦＰＩ処方物に対する保存期間中の半減期（ｔ_１／２）の値がＬ−アルギニン濃度の関数として図１にプロットされている。これらのデータは、Ｌ−アルギニンの濃度が増大するに連れて、保存期間中におけるａｌａ−ＴＦＰＩの半減期が増大することを示している。Ｌ−アルギニン可溶化剤を単独で用いた場合、これらの組成物は、可溶化剤を殆どまたは全く加えていない組成物と比べ、保存期間中における半減期の有意な増大を示す。

（実施例３）
（ａｌａ−ＴＦＰＩ処方物の劣化動態）
２−８℃で保存中のａｌａ−ＴＦＰＩに対する主要な劣化経路の一つは、メチオニン残基の酸化である。メチオニン酸化種は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法により、メインピーク種よりも早く溶出する種として分解することができる。図６は、ａｌａ−ＴＦＰＩサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムであり、酸化された種の分解を示している。ピークＡは多数のＭｅｔＳＯ種を含み、ピークＣは単一のＭｅｔＳＯ種を含み、ピークＤはノルバリン置換ａｌａ−ＴＦＰＩ含有材料であり、ピークＥおよびＦはアセチル化および／またはカルバミル化されたａｌａ−ＴＦＰＩである。ピークＡおよびＣ種は独立的に積分した。メインピークならびにピークＤ、Ｅ、およびＦを含むすべての残りの種は、メインピーク種として一緒にグループ化した。

３０℃における劣化動態を理解するため、複数の２ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩサンプルを実施例２で説明されているようにして調製し、各サンプルは、０．１５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝剤、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含んだ。これらのサンプルを１０−ｃｃ用ガラス製バイアル（それぞれに２ｍｌのサンプル）に充填し、３０℃でインキュベートした。凝集／沈降により可溶性タンパク質が損失する現象はＨＰＬＣに基づく合計ピーク面積の減少をもたらすものと考えられるため、凝集／沈降による可溶性タンパク質の損失を初めに調べた。３０℃における８週間の保存後、これらの安定性サンプルは、ＩＥＸ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣの両方で、２％から５％までの合計ピーク面積の減少を示し、上述の調合を用いるａｌａ−ＴＦＰＩの凝集／沈降量が比較的少量であることが示された。この後、３０℃における保存時間の関数としてＲＰ−ＨＰＬＣによるメインピーク種、ピークＡ種、およびピークＣ種をプロットすることにより、メチオニン酸化による劣化を評価した。メインピーク種が減衰すると共に、ピークＣ種およびピークＡ種が増加した。８週間の保存後、それぞれ、単一のＭｅｔＳＯ種および多数のＭｅｔＳＯ種として約１１％および９％の酸化された種が形成された。これは、利用可能な検出方法に基づき、メチオニン酸化が標準的な保存条件下での重大な劣化経路であることを示唆している。表１に示されているこれらの結果は、ＭｅｔＳＯ種の形成が温度と共に増大することも示している。

（表１．温度がａｌａ−ＴＦＰＩ酸化に及ぼす影響）

（実施例４）
（溶存酸素がａｌａ−ＴＦＰＩ安定性に及ぼす影響）
実施例３で述べられている通りの組成を有するサンプルを調製した。この後、ファーメンター機構を介してバイアルのヘッドスペースを窒素／空気置換ガス混合物でパージすることにより、溶存酸素レベルを変えた。各サンプルを５．５のｐＨに緩衝した。ヘッドスペースと液体との間での置換ガスの平衡化を促進するため、パージしながら、バイアルを２００ｒｐｍで１時間振盪した。この後、バイアルを３０℃に維持し、安定性分析のため、指定された時点でａｌａ−ＴＦＰＩサンプルを採取した。安定性分析のための種々の時点で各バイアルの溶存酸素レベルを再度測定した。

最初の予備的試験で、（１００％飽和状態で２１％の酸素含量であると仮定して）空気飽和の０％、２０％、１００％、および２００％を表す溶存酸素レベルを有するａｌａ−ＴＦＰＩバイアルを準備した。３０℃における安定性評価の結果が図２に示されている。これらの結果は、酸素レベルが空気飽和の略０％（液体上の雰囲気が本質的に純粋な窒素置換ガスの雰囲気であることを意味する）に低減されたときに、ａｌａ−ＴＦＰＩ酸化が実質的に抑制されたことを示している。これとは対照的に、溶存酸素を空気飽和の２００％から２０％へ低減することによりもたらされる安定性の改善は比較的小さかった。

次いで、空気飽和の０％から１２％までの範囲の溶存酸素を有するａｌａ−ＴＦＰＩサンプルの安定性に関する性能をもっと詳細に評価するため、第二の試験を実施した。安定性に及ぼす実質的な効果がこの範囲で見出された。３０℃で保存中のａｌａ−ＴＦＰＩの半減期と溶存酸素レベルとの関係が図３に示されている。サンプルの酸素レベルを空気飽和の５％（約１％の酸素含量）以下に低減したときに、ａｌａ−ＴＦＰＩ安定性の劇的な改善が達成された。個々のサンプルバイアルの溶存酸素レベルもａｌａ−ＴＦＰＩ濃度分析に対応する種々の時点で測定されたが、これらのバイアルの溶存酸素レベルには有意な変化が観測されなかった。これらの結果は、充分な量の酸素を置換するために窒素などの置換ガスを使用することによって溶存酸素濃度が充分に低いレベルにまで低減される場合には、ａｌａ−ＴＦＰＩの保存安定性を劇的に改善できることを示している。従って、窒素などの置換ガスは、これらのガスがａｌａ−ＴＦＰＩの酸化を抑制するため、酸化防止剤であると考えられる。

（実施例５）
（金属キレーターがａｌａ−ＴＦＰＩ酸化に及ぼす効果）
１０ｍｇ／ｍｌにおけるａｌａ−ＴＦＰＩバルク溶液を、１ｍＭまたは４ｍＭのいずれかの濃度で金属キレーターＥＤＴＡまたはＤＴＰＡを含有する緩衝液で０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈した。また、これらの組成物は、可溶化剤として２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムおよび３００ｍＭのＬ−アルギニンも含んだ。希釈されたａｌａ−ＴＦＰＩ溶液を１０−ｃｃ用ガラス製バイアル（それぞれに２ｍｌのサンプル）に充填し、安定性分析用に２−８℃または３０℃のいずれかの温度で保存した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を用いた、３０℃の保存温度における残存メインピーク面積の安定性曲線が図４に示されている。２−８℃と３０℃の両条件におけるこの試験から得られた、保存期間中の半減期データが以下の表２に与えられている。金属キレーターの存在は濃度に依存する仕方でａｌａ−ＴＦＰＩを安定化し、ａｌａ−ＴＦＰＩメチオニン残基の酸化が溶液中の金属イオンにより触媒されることを示唆した。実際のメカニズムがどうであるかにかかわらず、金属キレーターはａｌａ−ＴＦＰＩの酸化を防ぐべく機能し、従って、酸化防止剤として有効である。

（実施例６）
（遊離メチオニンアミノ酸がａｌａ−ＴＦＰＩの酸化に及ぼす効果）
１０ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩバルク溶液を、メチオニンを含有する緩衝液で０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈した。また、これらの組成物は、可溶化剤として２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムおよび３００ｍＭのＬ−アルギニンも含んだ。希釈されたａｌａ−ＴＦＰＩ溶液を１０−ｃｃ用ガラス製バイアル（それぞれに２ｍｌのサンプル）に充填し、安定性分析用に２−８℃または３０℃のいずれかの温度で保存した。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を用いた、３０℃の保存温度における残存メインピーク面積の安定性曲線が図５に示されている。２−８℃と３０℃の両条件におけるこの試験から得られた、保存期間中の半減期データが以下の表２に与えられている。これらのデータは、ａｌａ−ＴＦＰＩメチオニン残基の酸化が、本組成物に２ｍＭから１０ｍＭのメチオニンを含めることにより効果的に抑制されることを示している。実際、２−８℃の保存温度においては、６ヶ月の保存後、ａｌａ−ＴＦＰＩの酸化による劣化は、２ｍＭから１０ｍＭのメチオニンの存在下で全く検出されなかった。またも、Ｌ−アルギニン可溶化剤を含有したａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性は、酸化防止剤（このケースでは酸素捕捉剤メチオニン）を使用することによりさらに増強された。どのような特定の理論にも拘束されることなく、遊離メチオニンは、タンパク質に結合されたメチオニン残基が影響を受けにくくなるように「犠牲的な」メチオニンを提供することにより、ａｌａ−ＴＦＰＩの酸化を抑制するものと確信される。

メチオニンの酸化は、金属イオン、溶存酸素、および過酸化物の存在を含む多くの要因によって引き起こされ得る。キレート剤、酸素捕捉剤、還元剤、および置換ガスなど、タンパク質におけるメチオニンの酸化を防止するための幾つかの酸化防止剤が同定されている。キレート剤は、酸化反応を触媒する金属イオンに結合する。酸素捕捉剤は、優先的な酸化によって酸素と反応し、これにより、酸化のソースを取り除くことによってタンパク質を保護する。還元剤は、オキシダントがタンパク質の酸化に及ぼす影響を軽減する。置換ガスは、オーバーヘッドの酸素分圧を低減し、その結果として、溶存酸素濃度を低減する。

実施例４で試験されたものなどの金属キレート剤、およびａｌａ−ＴＦＰＩの酸化を低減するための酸素捕捉剤メチオニンの有効性が表２で比較されている。０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝剤、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含有する対照サンプル（実施例３で与えられた処方物）と比較し、酸化防止剤はすべて、ａｌａ−ＴＦＰＩの保存期間中における半減期を増大させた。評価したすべての条件の中でもとりわけ、ａｌａ−ＴＦＰＩ処方物に１０ｍＭのメチオニンを含める方法が、酸化に対してａｌａ−ＴＦＰＩタンパク質を安定化させる上で特に効果的であることが判明した。

（表２．酸化防止剤がａｌａ−ＴＦＰＩの安定性に及ぼす効果の比較）

（実施例７）
（ａｌａ−ＴＦＰＩタンパク質濃度がａｌａ−ＴＦＰＩの酸化に及ぼす影響）
０．１５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌまでの範囲にわたるａｌａ−ＴＦＰＩ濃度で、ａｌａ−ＴＦＰＩ濃度がａｌａ−ＴＦＰＩの酸化に及ぼす影響を調べた。１０ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩバルク組成物を実施例３で用いた２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液で３ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、および０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈することにより、安定性サンプルを調製した。また、これらのサンプルは３００ｍＭのＬ−アルギニンも含んだ。この後、未希釈および希釈バルクサンプルを１０−ｃｃ用ガラス製バイアル（それぞれに２ｍｌのサンプル）に充填し、ストッパーを装着し、安定性評価用に２−８℃または３０℃のいずれかで保存した。

ＲＰ−ＨＰＬＣによる、３０℃の加速温度条件と２−８℃の実際の保存条件との両条件における残存メインピークに対する安定性曲線は、ａｌａ−ＴＦＰＩの保存期間中における半減期が逆数の関係でタンパク質濃度に強く依存することを示している。これらの安定性曲線の半減期が表３に記載されている。酸化速度は、タンパク質濃度が低いほど増大する。どのような特定の理論にも拘束されることなく、我々は、どのような速度の増大であろうとも、酸化速度の増大は、溶液中のオキシダントとタンパク質分子との比が増大することによって引き起こされ得るものと確信している。

（表３．３０℃または２−８℃のいずれかで保存した後の、種々の異なる濃度における、フェーズ３ＴＦＰＩに対するＲＰ−ＨＰＬＣによる残存メインピークの保存期間中における半減期）

（実施例８）
（生存試験）
新たに調製された臨床グレードロットの組換えａｌａ−ＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）（ＴＦＰＩ ９２）を部分的に脱アミド化および酸化された臨床グレードの材料（ＴＦＰＩ ７８）と比較するため、マウスの盲腸結紮および穿刺試験を実施した。このモデルは、直接的な便汚染による多菌性の腹腔内および全身性感染、ならびに盲腸の壊死、厳密に模倣したヒト腹腔内敗血症を誘発する。Ｏｐａｌら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｃｉｎｅ ２９、１３−１８、２００１年。

ＴＦＰＩの両調製物は、２００３年８月１３日に出願された第６０／４９４，５４６号、２００３年１０月８日に出願された第６０／５０９，２７７号、および２００３年１０月２０日に出願された第６０／５１２，１９９号に記載されている如くにして調製された。これらの出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。ｒＴＦＰＩ ７８、ｒＴＦＰＩ ９２または希釈対照のいずれかが盲検的な仕方で４８時間（ＳＱ ｑ１２時間×４回の投与）にわたって与えられた。外科的処置の前および４８時間後に血液を採取し、定量的な菌血症、内毒素およびサイトカイン（腫瘍壊死因子−アルファおよびインターロイキン−６）のレベルを測定した。これらの動物を毎日観察し、死亡が生じたときにそれを記録した。実験期間の最後に、器官損傷および定量的細菌学の組織学的証拠を得るため、すべての動物が検死評価を受けた。

Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットが図７に描かれている。部分的に酸化され、脱アミド化された形態のｒＴＦＰＩの場合と比べ、新たに調製されたｒＴＦＰＩを投与されたマウスの場合には有意な生存上の優越性があった。両ｒＴＦＰＩグループ共、対照グループで希釈薬を投与されたマウスよりも良好であった。期待通り、疑似手術（盲腸の確認は行うが、結紮および穿刺を行わない外科的介入）を受けたマウスは７日間の試験期間を生き抜いた。２つのｒＴＦＰＩ治療グループ間に、菌血症、内毒素血症、またはサイトカイン産生に関する二次的な終点の有意差はなかった。

この試験は、ＴＦＰＩが、バクテリア、内毒素、またはサイトカインの血中レベルでは説明の付かないメカニズムによって生存上の優越性をもたらすと考えられることを示している。脱アミド化され、酸化されたＴＦＰＩは、新たに調製されたＴＦＰＩよりも劣る保護をもたらした。

図１は、５０℃におけるアルギニン濃度の関数として、イオン交換高圧液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により分析された、４種類の標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の保存期間中における半減期（ｔ_１／２、日数単位）を示している。すべての処方物は、Ｌ−アルギニン塩基とクエン酸、またはＬ−アルギニンＨＣｌと１０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウムのいずれかでｐＨ５．５に緩衝された０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩを含んだ。個々のａｌａ−ＴＦＰＩ処方物は：（ａ）２０−１５０ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、緩衝剤としての１０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム；（ｂ）クエン酸で滴定された２０−１５０ｍＭのＬ−アルギニン塩基；（ｃ）１００−３００ｍＭのＬ−アルギニンＨＣｌ、緩衝剤としての１０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム；（ｄ）クエン酸で滴定された１００−３００ｍＭのＬ−アルギニン塩基を含んだ。 図２は、空気で完全に飽和された状態の百分率として表された、溶存酸素濃度の関数としての、標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性を示している。３０℃で保存された安定性サンプル中に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの百分率は、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣにより分析された。この標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物は、０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含んだ。ｐＨは５．５であった。 図３は、空気で完全に飽和された状態の百分率として表された、溶存酸素濃度の関数としての、標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の保存期間中における半減期（ｔ_１／２、週単位）を示している。３０℃で保存された安定性サンプル中に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの百分率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析された。この標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物は、０．１５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含んだ。ｐＨは５．５であった。 図４は、０ｍＭ、１ｍＭ、または４ｍＭの量で加えられたキレート剤ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡを含む標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性を示している。３０℃で保存された安定性サンプル中に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの百分率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析された。この標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物は、０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含んだ。ｐＨは５．５であった。 図５は、０ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、または１０ｍＭの量で加えられた酸素捕捉剤のメチオニンを含む標準的なａｌａ−ＴＦＰＩ組成物の安定性を示している。３０℃で保存された安定性サンプル中に残存する可溶性ａｌａ−ＴＦＰＩの百分率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析された。この標準的なＴＦＰＩ組成物は、０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、２０ｍＭのクエン酸／クエン酸ナトリウム、および３００ｍＭのＬ−アルギニンを含んだ。ｐＨは５．５であった。 図６は、ａｌａ−ＴＦＰＩサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。ピークＡ−Ｆについては実施例１で説明されている。 図７は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存プロットである。Ｘ−軸、生存；Ｙ−軸、時間（時間数）。

【配列表】

Claims (32)

1. 水性組成物であって、該水性組成物は、以下：
   約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体；
   （ｉ）アルギニンまたはアルギニンのアナログ、（ｉｉ）リジンまたはリジンのアナログ、ならびに（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合物からなる群より選択される、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭまでの可溶化剤；と
   （ｉ）酸素置換ガス、（ｉｉ）酸素またはフリーラジカル捕捉剤、（ｉｉｉ）キレート剤、および（ｉｖ）これらの混合物からなる群より選択される酸化防止剤；
   を含有する水性組成物であって、該水性組成物は、以下：
   約４５％以上の凝集安定性パーセント；
   約４５％以上の酸化安定性パーセント；および
   約４〜約８までのｐＨ；
   を有する、水性組成物。
2. ＴＦＰＩ改変体を含有する請求項１に記載の組成物であって、該ＴＦＰＩ改変体がＴＦＰＩ（配列番号１）と約７０％以上相同である、組成物。
3. 前記ＴＦＰＩ改変体が、ａｌａ−ＴＦＰＩである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記可溶化剤がアルギニンであり、該アルギニンは、塩酸塩、Ｌ−アルギニン、および遊離塩基からなる群より選択される形態である、請求項１に記載の組成物。
5. 約３００ｍＭの可溶化剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
6. 前記酸化防止剤が、酸素置換ガスである、請求項１に記載の組成物。
7. 前記酸素置換ガスを含まないＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ改変体の水性組成物の溶存酸素濃度と比べて約１０％未満である溶存酸素濃度を有する、請求項６に記載の組成物。
8. 前記酸素置換ガスが、窒素富化空気、窒素富化酸素、窒素、希ガス、メタン、エタン、プロパン、二酸化炭素、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
9. 前記置換ガスが窒素である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記酸化防止剤が、酸素もしくはフリーラジカル捕捉剤、またはキレート剤であり、該酸化防止剤が約０．０１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
11. 前記酸化防止剤が約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度を有する、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記酸化防止剤が酸素またはフリーラジカル捕捉剤であり、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
13. 前記酸化防止剤が、酸素、または、メチオニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−αトコフェロール、ＤＬ−αトコフェロール、Ｄ−αトコフェロール、酢酸Ｌ−αトコフェロール、酢酸ＤＬ−αトコフェロール、酢酸Ｄ−αトコフェロール、βカロテン、セレン、ピリチノール、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシトルエンメチオニン、およびこれらの混合物からなる群より選択されるフリーラジカル捕捉剤である、請求項１に記載の組成物。
14. 前記酸化防止剤がメチオニンであり、該メチオニンがＬ−メチオニンである、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記酸化防止剤がメチオニンであり、該メチオニンは、前記組成物が約１：１から約１０００：１までのモル比のＴＦＰＩメチオニンに対する非ＴＦＰＩメチオニンを含むような量で存在する、請求項１３に記載の組成物。
16. 前記酸化防止剤が、（ｉ）アミノカルボン酸塩化合物またはアミノカルボン酸塩化合物の誘導体；（ｉｉ）ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの誘導体；（ｉｉｉ）ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡの誘導体；（ｉｖ）ＢＡＰＴＡまたはＢＡＰＴＡの誘導体；（ｖ）ＥＧＴＡまたはＥＧＴＡの誘導体；ならびに（ｖｉ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および（ｖ）の混合物からなる群より選択されるキレート剤である、請求項１に記載の組成物。
17. 約５〜約６．５までのｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
18. 約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約６００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌまでの浸透圧を有する、請求項１に記載の組成物。
19. 約２９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの浸透圧を有する、請求項１８に記載の組成物。
20. 約３０℃の温度において、約１ヶ月から約２４ヶ月の保存の間の半減期を有する、請求項１に記載の組成物。
21. さらに、（ｉ）塩の形態を実質的に含まない酸；（ｉｉ）塩の形態の酸；ならびに（ｉｉｉ）酸およびその塩の形態との混合物からなる群より選択される緩衝剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
22. 前記緩衝剤が塩の形態を実質的に含まない酸であり、該酸はクエン酸、コハク酸、リン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、およびアスパラギン酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
23. 請求項２１に記載の組成物であって、前記緩衝液が、酸および該酸の塩の形態の混合物を含有し、ここで：
    該酸が、クエン酸、コハク酸、リン酸、グルタミン酸、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、およびアスパラギン酸からなる群より選択され；そして、
    該酸の塩の形態が、該酸の共役塩基のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩からなる群より選択される、
    組成物。
24. 請求項２３に記載の組成物であって、前記緩衝剤が、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、リン酸／リン酸ナトリウム、グルタミン酸／グルタミン酸ナトリウム、マレイン酸／マレイン酸ナトリウム、リンゴ酸／リンゴ酸ナトリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、およびアスパラギン酸／アスパラギン酸ナトリウムからなる群より選択される、組成物。
25. 前記緩衝剤が、約５ｍＭ〜約３０ｍＭまでの濃度を有する、請求項２１に記載の組成物。
26. 前記凝集安定性パーセントが約４５％以上〜約５０％以上までである、請求項１に記載の組成物。
27. 前記凝集安定性パーセントが約４５％以上〜約９９％以上までである、請求項１に記載の組成物。
28. 前記酸化安定性パーセントが約８９％以上である、請求項１に記載の組成物。
29. 前記酸化安定性パーセントが約４５％以上〜約９９％以上までである、請求項１に記載の組成物。
30. 薬学的組成物であって、以下：
    請求項１に記載の水性組成物；および
    薬剤学的に受容可能な賦形剤；
    を含有する、薬学的組成物。
31. 前記凝集安定性パーセントが約４５％以上〜約９９％以上までである、請求項３０に記載の薬学的組成物。
32. 前記酸化安定性パーセントが約４５％以上〜約９９％以上までである、請求項３０に記載の薬学的組成物。

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