DE60115422T2

DE60115422T2 - PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG ENTHALTEND EINEN FAKTOR VIIa UND EINEN TFPI-INHIBITOR

Info

Publication number: DE60115422T2
Application number: DE60115422T
Authority: DE
Inventors: Marianne Kjalke
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2000-05-10
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2021-05-11
Also published as: BR0110659A; ES2247106T3; DE60115422D1; WO2001085199A1; EP1282439A1; PL365042A1; ATE300953T1; EP1593389A1; CN1429117A; ES2254414T3; EP1282438A1; AU5822801A; HUP0301868A3; WO2001085198A1; EP1282439B1; CZ20023667A3; HUP0301868A2; JP2004505016A; IL152554A0; JP2003532684A

Description

GEBIET DIESER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer umfasst. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Kombination von Faktor VIIa mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von an Blutungen leidenden Patienten oder zu deren Vorbeugung oder zur Verbesserung der Blutgerinnungsbildung in einem Patienten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch diese Verbindungen umfassende Kits.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Hämostase wird durch die Bildung eines Komplexes zwischen Gewebefaktor (TF), der nach einer Verletzung der Gefäßwand dem sich im Kreislauf befindlichen Blut ausgesetzt wird, und FVIIa, der im Kreislauf in einer Menge, entsprechend etwa 1% der gesamten FVII-Proteinmasse, vorliegt, initiiert. Dieser Komplex ist an die TF-tragende Zelle verankert und aktiviert FX zu FXa und FIX zu FIXa auf der Zelloberfläche. FXa aktiviert Prothrombin zu Thrombin, das FVIII, FV, FXI und FXIII aktiviert. Weiterhin aktiviert die beschränkte Menge an in diesem beginnenden Hämostaseschritt gebildetem Thrombin auch die Plättchen. Nach der Einwirkung von Thrombin auf die Plättchen ändern diese ihre Form und legen geladene Phospholipide auf ihrer Oberfläche frei. Diese aktivierte Plättchenoberfläche bildet das Templat für die weitere FX-Aktivierung und die vollständige Thrombinbildung. Die weitere FX-Aktivierung auf der aktivierten Plättchenoberfläche findet über einen auf der Oberfläche der aktivierten Plättchen gebildeten FIXa-FVIIIa-Komplex statt, wonach FXa Prothrombin zu Thrombin umwandelt, während es immer noch auf der Oberfläche vorliegt. Thrombin wandelt dann Fibrinogen zu Fibrin um, das unlöslich ist und den beginnenden Throm bozythenpfropf stabilisiert. Dieser Prozess findet auf der Stelle der TF-Freilegung statt, wodurch das Risiko einer systemischen Aktivierung des Blutgerinnungssystems minimiert wird.
FVIIa liegt in Plasma überwiegend als einkettiges Zymogen vor, das durch FXa in seine zweikettige, aktivierte Form, FVIIa, gespalten wird. Rekombinant aktivierter Faktor VIIa (rFVIIa) wurde als Pro-Hämostatikum entwickelt. Die Verabreichung von rFVIIa bietet ein schnelles und hoch wirksames Pro-Hämostaseansprechverhalten in Bluterpatienten mit Blutungen, die mit Blutgerinnungsfaktorprodukten auf Grund von Antikörperbildung nicht behandelt werden können. Auch können blutende Patienten mit einem Mangel an Faktor-VII erfolgreich mit FVIIa behandelt werden. In diesen Studien stieß man auf keine unvorteilhaften Nebenwirkungen von FVIIa (insbesondere das Auftreten von Thromboembolie).
Zusätzliches exogen verabreichtes FVIIa erhöht die Thrombinbildung auf der aktivierten Plättchenoberfläche. Dies findet in Bluterpatienten statt, welchen es an FIX oder FVIII mangelt und welchen deshalb der leistungsfähigste Weg zur vollständigen Thrombinbildung fehlt. Auch in Gegenwart einer gesenkten Anzahl an Plättchen oder Plättchen mit einer fehlerhaften Funktion erhöht zusätzliches FVIIa die Thrombinbildung und ist in Patienten hämostatisch wirksam.
Die Blutgerinnungsfaktoren des extrinsischen Wegs werden durch EPI (estrinsischer Weghemmer), nun TFPI (Gewebefaktorweghemmer) genannt, gehemmt. TFPI ist ein Proteasehemmer vom Kunitztyp, der FXa bindet und hemmt. Der TFPI-FXa-Komplex hemmt FVIIa-TF (Rapaport, Blood 73, Seite 359, 1989). Die Bedeutung von TFPI für die Blutgerinnungsreaktion wurde noch nicht begründet, da nur unphysiologisch hohe Konzentrationen herkömmliche Blutgerinnungstests beeinflussen (Broze et al., Bio-chemistry 29, Seite 7539,1990). Deshalb wird die TFPI-Aktivität in hoch entwickelten Tests gemessen, in welchen man TFPI an FXa binden lässt und das TFPI-FXa zu TF-FVII-Reaktanten, die FIX oder FX aktivieren können, zugesetzt wird (Bajaj et al., J Clin Invest 79, Seite 1974, 1987; Sandset et al., Thromb Res 47, Seite 389, 1987).
Es ist bekannt, dass Patienten, die in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff oder einem schweren Trauma übermäßig bluten und Bluttransfusionen benötigen, mehr Komplikationen als diejenigen, die keine Blutung erleiden, entwickeln. Jedoch können auch mäßige Blutungen, die die Verabreichung von menschlichem Blut oder menschlichen Blutprodukten (Plättchen, Leukozythen, Plasma abgeleiteten Konzentraten für die Behandlung von Blutgerinnungsdefekten usw.) benötigen, zu Komplikationen führen, die mit dem Risiko der Ubertragung von menschlichen Viren (Hepatitis, HIV, Parvovirus und andere bis jetzt unbekannte Viren) verbunden sind. Übermäßige Blutungen, die massive Bluttransfusionen benötigem, können zur Entwicklung von multiplem Organversagen, einschließlich beeinträchtigter Lungen- und Nierenfunktion führen. Nachdem ein Patient diese schweren Komplikationen entwickelt hat, beginnt eine Kaskade von eine Anzahl an Cytokinen und entzündlichen Reaktionen beteiligenden Vorfällen, wodurch jegliche Behandlung äußerst schwierig wird und unglücklicherweise häufig nicht erfolgreich ist. Deshalb ist es ein Hauptziel bei chirurgischen Eingriffen sowie bei der Behandlung von beträchtlicher Gewebebeschädigung, die Blutung zu vermeiden oder zu minimieren.
Zum Vermeiden oder Minimieren einer derartigen Blutung ist es wichtig, die Bildung von stabilen und festen hämostatischen Pfropfen zu gewährleisten, die nicht leicht durch fibrinolytische Enzyme gelöst werden. Der Weiteren ist es wichtig, die schnelle Bildung derartiger Pfropfen oder Blutgerinnsel zu gewährleisten.
Das Europäische Patent Nr. 225.160 (Novo Nordisk) betrifft FVIIa-Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Blutungsstörungen, die nicht durch Blutgerinnungsfaktordefekte oder Blutgerinnungsfaktorhemmer verursacht werden.
Das Europäische Patent Nr. 82.812 (Baxter Travenol Lab.) betrifft eine Zusammensetzung von Faktor VIIa zur Verwendung beim Entgegenwirken von fehlenden Blutgerinnungsfaktoren oder der Wirkungen von Hemmern für Blutgerinnungsfaktoren in einem Patienten.
Die Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 93/06855 (Novo Nordisk) betrifft die topische Anwendung von FVIIa.
Das Europäische Patent Nr. 558529 (Novo Nordisk) betrifft Zusammensetzungen zur Behandlung von Patienten mit verlängerter Blutgerinnungszeit, wobei die Zusammensetzung als Wirkbestandteil einen EPI-Hemmer enthält.
Die Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/28153 (Novo Nordisk) und US 5,622,988 (Novo Nordisk) betreffen neue Verbindungen, die Aktivität beim Hemmen von Gewebefaktorweghemmern (TFPI) zeigen und deshalb beim Reduzieren der Blutgerinnungszeit in medizinischen Gegebenheiten verwendet werden können, die durch übermäßige oder unkontrollierte Blutung gekennzeichnet sind.
Es bleibt auf dem Fachgebiet der Bedarf an einem verbesserten, zuverlässigen und breit anwendbaren Verfahren zum Verbessern der Thrombinbildung, der schnellen Bildung von stabilen hämostatischen Pfropfen und Erzielen der vollständigen Hämostase in Patienten, insbesondere in Patienten mit einer beeinträchtigten Thrombinbildung. Es besteht auch Bedarf an einem Verfahren, in welchen die zum Erzielen von vollständiger Hämostase benötigte Menge von FVΠa vermindert ist.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen bereitzustellen, die bei der Behandlung oder Prophylaxe von Blutungen und Blutgerinnungsstörungen wirksam verwendet werden können.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen in einer Dosierungsform bereitzustellen, die bei der Behandlung oder Prophylaxe von Blutungen oder als Pro-Blutgerinnungsmittel wirksam verwendet werden können.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen, medizinische Verwendungen oder Kits bereitzustellen, die eine synergistische Wirkung aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen, medizinische Verwendungen oder Kits bereitzustellen, die im Wesentlichen keine Nebenwirkungen wie einen hohen Grad an systemischer Aktivierung des Blutgerinnungssystems aufweisen.
Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der vorliegenden Beschreibung klar.
Die Erfinder zeigten, dass eine Kombination von FVIIa und einem TFPI-Hemmer die Blutgerinnungszeit von normalem Humanplasma sowie von FVIII-armem Plasma effizienter als entweder FVIIa oder TFPI-Hemmer allein hemmen kann. Durch Vereinigen eines FVIIa mit einer Konzentration, in welcher keine weitere Verminderung in der Blutgerinnungszeit beobachtet wurde, mit einem TFPI-Hemmer, ebenfalls mit einer Konzentration, in welcher keine Verminderung in der Blutgerinnungszeit beobachtet wurde, zeigte es sich unerwartet, dass eine weitere Reduktion in der Blutgerinnungszeit erhalten wurde. Folglich kann durch Verbessern der Blutgerinnung eine wirksamere Blutungsbehandlung im Patienten erhalten werden. Außerdem können Patienten mit relativ geringen FVIIa-Konzentrationen behandelt werden, wodurch die relativ hohen Kosten in Verbindung mit herkömmlicher Behandlung mit FVIIa allein reduziert werden. Es zeigte sich auch, dass eine Kombination von FVIIa und einem TFPI-Hemmers die Thrombinbildung in FVIII-armem Plasma effizienter als entweder FVIIa oder TFPI-Hemmer allein hemmen kann. Es zeigte sich auch, dass eine Kombination von einem FVIIa und einem TFPI-Hemmers die Blutgerinnsellysezeit in vitro in normalem Humanplasma effizienter als entweder FVIIa oder TFPI-Hemmer allein verlängern kann.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein zur intravenösen Verabreichung formuliertes Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein zur intravenösen Verabreichung formuliertes Arzneimittel, das einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von normalem Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von Faktor-VIII-armem Plasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Verlängern der Blutgerinnsellysezeit in Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Verlängern der Blutgerinnsellysezeit in normalem Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen der Thrombinbildung in Faktor-VIII-armem Plasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Verbessern der Blutgerinnung von Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von normalem Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit von Faktor-VIII-armem Plasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Verbessern der Blutgerinnung von Säugerplasma.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von beeinträchtigter Thrombinbildung in einem Patienten, einschließlich eines menschlichen Wesens. In einer Ausführungsform ist der Patient ein Patient mit mehreren Transfusionen, einschließlich eines menschlichen Wesens.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von beeinträchtigter Thrombinbildung in einem Patienten, einschließlich eines menschlichen Wesens. In einer Ausführungsform ist der Patient ein Patient mit mehreren Transfusionen, einschließlich eines menschlichen Wesens.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verlängern der Blutgerinnsellysezeit in vitro in normalem Säugerplasma, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Faktors VIIa in Kombination mit einer wirksamen Menge eines TFPI-Hemmers an einen Säuger umfasst.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, enthaltend eine Behandlung für Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung, umfassend

a) eine wirksame Menge eines Faktors VIIa und einen pharmnazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform;
b) eine wirksame Menge eines TFPI-Hemmers und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers in einer zweiten Einheitsdosierungsform und Behälterelemente zum Beinhalten der ersten und der zweiten Dosierungsform.

In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, umfassend eine Behandlung für Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung, im Wesentlichen bestehend aus

a) einer wirksamen Menge eines Faktors VIIa und einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform;
b) einer wirksamen Menge eines TFPI-Hemmers und einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer zweiten Einheitsdosierungsform; und Behälterelemente zum Beinhalten der ersten und der zweiten Dosierungsform.

In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIIa um rekombinanten Faktor VIIa.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem der Faktor VIIa um rekombinanten Human-Faktor VIIa.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem der Faktor VIIa um eine Faktor-VIIa-Variante.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den FVIIa-Varianten um Aminosäuresequenzvarianten mit nicht mehr als 20 Aminosäuren, die verglichen mit FVIIa vom Wildtyp (d.h. einem Polypeptid mit der in US Patent Nr. 4,784,950 offenbarten Aminosäuresequenz) ersetzt, deletiert oder eingefügt sind. In einer weiteren Ausführungsform, jeweils verglichen mit dem Wildtyp, weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 15 ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer weiteren Ausführungsform weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 10 ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer weiteren Ausführungsform weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 8 ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer weiteren Ausführungsform weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 6 ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf; in einer weiteren Ausführungsform weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 5 ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf. In einer weiteren Ausführungsform weisen die FVIIa-Varianten nicht mehr als 3 verglichen mit dem Wildtyp ersetzte, deletierte oder eingefügte Aminosäuren auf.
In einer weiteren Ausführungsform ist der TFPI-Hemmer ausgewählt aus TFPI-Hemmern, die wie FVIII-hemmende Antikörper im wie in EP 0558529 beschriebenen Bethesda-Test, identifiziert werden können. In einer weiteren Ausführungsform ist der TFPI-Hemmer ausgewählt aus einem polyklonalen oder monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, einem Polypeptid, einem Oligopeptid, einem kurzen Peptid oder einem kleinen organischen Molekül. Beispiele für kleine organische Moleküle (bei welchen es sich um TFPI-Hemmer handelt) sind in WO 96/20153 und US 5,622,988 zu finden.
In einer weiteren Ausführungsform ist Säugerplasma Humanplasma.
In einer weiteren Ausführungsform werden der Faktor VIIa und der TFPI-Hemmer gleichzeitig und in Einzeldosierungsform verabreicht. In einer anderen Ausführungsform werden der Faktor VIIa und der TFPI-Hemmer nacheinender verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform werden der Faktor VIIa und der TFPI-Hemmer mit einem Abstand von 1 bis 2 Stunden, wie einem Abstand von 30 Minuten, z.B. ein einem Abstand von 10 Minuten, z.B. in Form eines Kits, umfassend Faktor VIIa in einer ersten Einheitsdosierungsform und TFPI-Hemmer in einer zweiten Einheitsdosierungsform, verabreicht.
In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge von FVIIa 0,05 mg pro Tag bis 500 mg pro Tag (Patient mit 70 kg).
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Arzneimittel (wenn es als Einzelpräparatform vorliegt) im Wesentlichen aus FVIIa, einem TFPI-Hemmer und mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und wahlweise einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und wahlweise einem Proteasehemmer.
In einer anderen Ausführungsform besteht das Arzneimittel (falls es in Form eines Kits vorliegt) im Wesentlichen aus einer ersten Einheitsdosierungsform, die im Wesentlichen aus einem FVIIa und mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und wahlweise einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und wahlweise einem Proteasehemmer besteht; und einer zweiten Einheitsdosierungsform, die im Wesentlichen aus einem TFPI-Hemmer und mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten oder Träger und wahlweise einem Stabilisator und/oder einem Detergens und/oder einem neutralen Salz und/oder einem Antioxidationsmittel und/oder einem Konservierungsmittel und wahlweise einem Proteasehemmer besteht.
In einem weiteren Aspekt enthält die Zusammensetzung des Weiteren einen Faktor VIII.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um FVIIIa. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um rekombinanten Faktor VIIIa. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Faktor VIII um rekombinanten Human-Faktor VIIIa.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Zusammensetzung des Weiteren einen Hemmer für das fibrinolytische System, z.B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Tranexaminsäure.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der eine Behandlung für Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung enthält, umfassend

a) eine wirksame Menge eines Faktors VIIa und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform;
b) eine wirksame Menge eines TFPI-Hemmers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer zweiten Einheitsdosierungsform;
c) eine wirksame Menge eines Faktors VIII oder Faktors VIIIa und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers in einer dritten Einheitsdosierungsform und
d) Behälterelemente zum Beinhalten der ersten, zweiten und dritten Dosierungsform.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der eine Behandlung für Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung enthält, umfassend

a) eine wirksame Menge eines Faktors VIIa und eines TFPI-Hemmers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform;
b) eine wirksame Menge eines Faktors VIII oder Faktor VIIIa und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer zweiten Einheitsdosierungsform;
c) Behälterelemente zum Beinhalten der ersten und zweiten Dosierungsform.

In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit, der eine Behandlung für Blutungen oder zur Blutgerinnungsbehandlung enthält, umfassend

a) eine wirksame Menge eines Faktors VIIa und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform;
b) eine wirksame Menge eines Faktors VIII oder Faktors VIIIa und eines TFPI-Hemmers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer zweiten Einheitsdosierungsform;
c) Behälterelemente zum Beinhalten der ersten und zweiten Dosierungsform.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine Kombination von einem Faktor VIIIa und einem TFPI-Hemmer umfasst. Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die eine Kombination von einem Faktor VIIa und einem TFPI-Hemmer als die einzigen Wirkstoffe umfasst. Die Zusammensetzung kann in Form einer einzelnen Zusammensetzung oder in Form eines Mehrkomponentenkits vorliegen. Die vorliegenden Zusammensetzungen sind als Therapeutikum und prophylaktisches Pro-Blutgerinnungsmittel nützlich und bilden schnell Fibrinblutgerinnsel in Säuger, einschließlich Primaten wie Menschen.
Wann immer eine erste und zweite Einheitsdosis innerhalb dieser Beschreibung erwähnt ist, weist dies nicht auf die bevorzugte Verabreichungsreihenfolge hin, sondern erfolgt nur der Einfachheit halber.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung (einschließlich prophylaktische Behandlung oder Vorbeugung) von Blutungen in einem Patienten, einschließlich eines menschlichen Wesens, z.B. auf Grund eines Traumas oder eines chirurgischen Eingriffs, oder in Patienten, welchen die Blutgerinnungsfaktoren FIX oder FVIII oder Plättchen fehlen oder bei welchen diese fehlerhaft sind, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung (einschließlich prophylaktische Behandlung oder Vorbeugung) einer beeinträchtigten Thrombinbildung in einem Patienten, einschließlich eines menschlichen Wesens, bereit. In einer Ausführungsform ist der Patient ein Patient mit mehreren Transfusionen, einschließlich eines menschlichen Wesens.
Es wurde nun gefunden, dass eine Kombination von einem FVIIa und einem TFPI-Hemmer ein vorteilhaftes Produkt ist, das die Bildung von schnellen hämostatischen Pfropfen gewährleistet.
In Gegenwart eines TFPI-Hemmers können niedrigere Konzentrationen von FVIIa zum Gewährleisten von vollständiger Hämostase ausreichend sein.
Die vollständige Thrombinbildung ist für die Bildung eines festen, stabilen hämostatischen Pfropfens nötig. Die Fibrinstruktur eines derartigen Pfropfens hängt sowohl von der gebildeten Thrombinmenge als auch der Geschwindigkeit der beginnenden Thrombinbildung ab. In Gegenwart einer beeinträchtigten Thrombinbildung wird ein poröser Fibrinpfropfen gebildet, der stark durchlässig ist. Die gewöhnlich auf der Fibrinoberfläche vorliegenden fibrinolytischen Enzyme lösen einen derartigen Fibrinpfropfen leicht. Die Bildung eines stabilen Fibrinpfropfens hängt auch von der Gegenwart von durch Thrombin aktiviertem FXIIIa und deshalb auch von der vollständigen Thrombinbildung ab. Des Weiteren benötigt der jüngst beschriebene durch Thrombin aktivierbare fibrinolytische Hemmer TAFI für seine Aktivierung sehr hohe Thrombinmengen. In Gegenwart einer nicht völlig angemessenen Thrombinbildung kann der TAFI deshalb nicht aktiviert werden, was zur Bildung eines hämostatischen Pfropfen führt, der durch die normale fibrinolytische Aktivität leichter als gewöhnlich gelöst wird.
Patienten mit Thrombozythopenie weisen eine beeinträchtigte Thrombinbildung sowie eine fehlerhafte Stabilisierung der Fibrinpfropfen auf, was zu hämostatischen Pfropfen führt, die für eine vorzeitige Auflösung anfällig sind. Des Weiteren weisen Patienten, die ein schweres Trauma oder eine organische Schädigung erlitten und infolgedessen häufige Bluttransfusionen erhielten, häufig verminderte Plättchenzählungen sowie verminderte Gehalte an Fibrinogen, FVIII und anderen Blutgerinnungsproteinen auf. Diese Patienten erleiden eine beeinträchtigte (oder gesenkte) Thrombinbildung. Zudem stört deren verminderter Fibrinogengehalt die Aktivierung von FXIII nachteilig. Diese Patienten weisen deshalb eine fehlerhafte oder weniger effiziente Hämostase auf, was zur Bildung von Fibrinpfropfen führt, die durch proteolytische Enzyme, wie Enzyme, die zusätzlich übermäßig in durch ein übermäßiges Trauma und eine Organschädigung gekennzeichneten Situationen freigesetzt werden, leicht und vorzeitig gelöst werden.
Zum Erleichtern der Bildung von völlig stabilisierten Pfropfen mit vollständiger Fähigkeit zum Beibehalten von Hämostase in einem Patienten wird eine erfindungsgemäße Zusammensetzung verabreicht. Diese Zusammensetzung ist insbesondere bei Patienten mit einer verminderten Plättchenanzahl und bei Patienten mit verminderten Plasmagehalten an Fibrinogen und/oder anderen Blutgerinnungsproteinen nützlich.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Faktor VIIa kann aus Blut gereinigt oder durch rekombinante Mittel hergestellt werden. Es ist klar, dass die Durchführung der hier beschriebenen Verfahren davon unabhängig ist, woher der gereinigte Faktor VIIa erhalten wird, weshalb erwogen wird, dass die vorliegende Erfindung die Verwendung eines beliebigen zur Verwendung hier geeigneten Faktor-VIIa-Präparats abdeckt. Bevorzugt ist Human-FVIIa. Auch können genetisch manipulierte Varianten von FVIIa, die deren charakteristische mit Hämostase verbundene Aktivität beibehalten, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Fragmente von Faktor VIIa oder Faktor-VIIa-Varianten, die deren cha rakteristische mit Hämostaseverbundene Aktivität beibehalten, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete TFPI-Hemmer kann wie FVIII-hemmende Antikörper in wie in EP 0558529 beschriebenen Bethesta-Test identifiziert werden.
Nicht beschränkende Beispiele für Faktor-VII-Varianten mit, verglichen mit dem Faktor VIIa vom Wildtyp, im Wesentlichen derselben oder einer besseren biologischen Aktivität schließen diejenigen ein, die in den Dänischen Patentanmeldungen Nr. PA 2000 00734, PA 2000 01360, PA 2000 01361 und PA 2001 00477 beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Nicht beschränkende Beispiele schließen [L305V]-FVIIa, [L305V/M306D/D309S]-FVIIa, [L305I]-FVIIa, [L305T]-FVIIa, [F374P]-FVIIa, [V158T/M298Q]-FVIIa, [V158D/E296V/M298Q]-FVIIa und [K337A]-FVIIa ein.
Es ist dem Fachmann klar, dass Substitutionen außerhalb der für die Funktion des VIIA oder TFPI-Hemmermoleküls entscheidenden Regionen durchgeführt werden können und immer noch zu einem aktiven Polypeptid führen. Aminosäurereste, die für die Aktivität des FVII-Polypeptids (oder wahlweise des TFPI-Hemmerpolypeptids) wichtig sind, und deshalb vorzugsweise nicht einer Substitution unterzogen werden, können gemäß auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanningmutagenese (siehe z.B., Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085) identifiziert werden. In der letzteren Technik werden Mutationen an jedem positiv geladenen Rest im Molekül eingebracht und die erhaltenen Mutantmoleküle auf Blutgerinnungs- bzw. Vernetzungsaktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind. Stellen der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können ebenfalls durch Analyse der wie durch derartige Techniken wie Kernmagnetresonanzanalyse, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkieren bestimmten dreidimensionalen Struktur bestimmt werden (siehe z.B., de Vos et al., 1992, Science 255: 306–312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899–904; Wlodaver et al., 1992, FEHS Letters 309: 59–64).
Die Einbringung einer Mutation in die Nukleinsäuresequenz zum Austausch von einem Nukleotid für ein anderes Nukleotid kann durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung eines beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden. Besonders nützlich ist das Verfahren, das einen Supercoil-Doppelstrang-DNA-Vektor mit einer Einfügung von Interesse und zwei die gewünschte Mutation enthaltenen synthetischen Primern verwendet. Die jeweils zu den entgegengesetzten Strängen des Vektors komplimentären Oligonukleotidprimer verlängern sich während des Temperaturkreislaufs durch Pfu-DNA-Polymerase. Beim Einbringen der Primer wird ein mutiertes Plasmid, das versetzte Kerben enthält, gebildet. Nach dem Temperaturkreislauf wird das Produkt mit für methylierte und hemimethylierte DNA spezifischem DpnI behandelt, um das parentale DNA-Templat zu verdauen und auf Mutationen enthaltende synthetisierte DNA zu selektieren. Andere auf dem Fachgebiet zum Bilden, Identifizieren und Isolieren von Varianten bekannte Verfahren wie z.B. Genverschieben oder Farbendisplaytechniken können ebenfalls verwendet werden.
Im vorliegenden Kontext wurden die Dreibuchstaben- oder Einbuchstaben-Angaben der Aminosäuren in ihrer wie in Tabelle 2 angegebenen herkömmlichen Bedeutung verwendet. Wenn nicht ausdrücklich angegeben, handelt es sich bei den hier erwähnten Aminosäuren um L-Aminosäuren. Es ist klar, dass der erste Buchstabe, z.B. K337 die Aminosäure darstellt, die auf natürliche Weise in der angegebenen Position des nativen (Wildtyp) Human-Faktors VIIa vorliegt, und dass z.B. [K337A]-FVIIa die FVII-Variante bezeichnet, in welcher die durch den Einbuchstabenkode K dargestellte Aminosäure auf natürliche Weise in der angegebenen Position im nativen (Wildtyp) Human-Faktor VIIa vorliegt, durch die durch den Einbuchstabenkode A dargestellte Aminosäure ersetzt ist.
Tabelle 2: Abkürzungen für Aminosäuren
Der Begriff „Faktor VIIa", „Faktor VIIa" oder „FVIIa" kann austauschbar verwendet werden. Der Begriff Faktor VIIa schließt Zymogen-Faktor VII (einkettiger Faktor VII) ein.
Der Begriff „Faktor VIII" hat seine übliche Bedeutung (Blutgerinnungsfaktor VIII und schließt aktivierten Faktor VIII (bezeichnet als FVIIIa) und seine charakteris tische Blutgerinnungsaktivität beibehaltende trunkierte Formen von Faktor VIII ein.
Der Begriff „TFPI-Hemmer" bedeutet Verbindungen, die die Antiblutgerinnungsaktivität von TFPI (Gewebefaktorhemmer) hemmen. Der Begriff schließt Verbindungen wie diejenigen, die im Europäischen Patent Nr. 558 529 definiert sind, und diejenigen, die in WO 96/26253 und US 5,622,988 beschrieben sind, ein.
In der vorliegenden Erfindung ist eine „wirksame Menge" von FVIIa und eine „wirksame Menge" von TFPI-Hemmer als die Menge von FIIa und TFPI-Hemmer definiert, die zum derartigen Vorbeugen oder Reduzieren von Blutungen oder Blutverlust, dass die Erkrankung und ihre Komplikationen ausgeheilt, gelindert oder teilweise zur Ruhe gebracht wird, ausreichend ist.
Die FVIIa-Menge und die Menge an TFPI-Hemmer, die erfindungsgemäß verabreicht werden, können typischerweise in einem Verhältnis von etwa 1:100 bis etwa 100:1 (μg FVIIa:μg TFPI-Hemmer) variieren.
In diesem Kontext bedeutet „Patienten mit einer beeinträchtigten Thrombinbildung" Patienten, die keinen vollständigen Thrombinstoß auf der aktivierten Plättchenoberfläche bilden können und schließt Patienten mit einer geringeren Thrombinbildung als die Thrombinbildung in Patienten mit einem vollständig funktionierenden, normalen hämostatischen System, einschließlich einer normalen Menge und Funktion an Blutgerinnungsfaktoren, Plättchen und Fibrinogen, und Patienten, welchen FIX und/oder FVIII (hämophiler A oder B) fehlen oder fehlerhafte FIX und/oder FVIII oder Hemmer gegen FIX und/oder FVIII aufweisen; Patienten, welchen FXI fehlt; Patienten mit einer verminderten Anzahl an Plättchen oder Plättchen mit einer fehlerhaften Funktion (z.B. Thrombozytopenie oder Thromboplastenie-Glanzmann oder Patienten mit übermäßigen Blutungen); Patienten mit verminderten Gehalten an Prothrombin, FX oder FVII; Patienten mit verminderten Plasmakonzentrationen von Fibrinogen (z.B. Patienten mit mehreren Transfusionen infolge von mehrfachem Trauma oder einem übermäßigen chirurgischen Eingriff) ein.
Der Begriff „vollständige Hämostase" bedeutet die Bildung eines stabilen und festen Fibringerinnsels oder Pfropfens an der Verletzungsstelle, der die Blutung wirksam stoppt und durch das fibrinolytische System nicht leicht gelöst wird.
Der Begriff „Aktivität von FVIIa" oder „FVIIa-Aktivität" bedeutet die Fähigkeit, Thrombin zu erzeugen, wobei der Begriff auch die Fähigkeit zum Erzeugen von Thrombin auf der Oberfläche von aktivierten Plättchen in Abwesenheit von Gewebefaktor einschließt.
Der Begriff „Verbesserung des normalen hämostatischen Systems" bedeutet eine Verbesserung der Fähigkeit zur Thrombinnildung.
Wie hier verwendet gibt der Begriff „Blutungsstörung" einen beliebigen angeborenen, erworbenen oder herbeigeführten Defekt zellulären oder molekularen Ursprungs wieder, der sich in Blutungen manifestiert. Beispiele sind Blutgerinnungsfaktormängel (z.B. Hämophilie A und B oder ein Mangel an Blutgerinnungsfaktoren IX oder VII), Blutgerinnungsfaktorhemmmer, fehlerhafte Plättchenfunktion, Thrombozytopenie oder von-Willebrand-Krankheit.
Der Begriff „Blutungen" bedeutet, dass er eine unkontrollierte und übermäßige Blutung einschließt, bei welcher es sich um ein Hauptproblem in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff und anderen Formen von Gewebebeschädigung handelt. Eine unkontrollierte und übermäßige Blutung kann in Patienten mit einem grundsätzlich normalen Blutgerinnungssystem (diese Patienten entwickeln jedoch infolge der Blutung – Verdünnung von Blutgerinnungsproteinen, erhöhte Fibrinolyse und verminderten Plättchen auf Grund eines Verdünnungseffekts der Blutung eine Blutgerinnungsstörung) und Patienten mit Blutgerinnungs- und Blutungsstörungen auftreten. Blutgerinnungsfaktormängel (Hämophilia A und B, Mangel an Blutgerinnungsfaktoren XI oder VII) oder Blutgerinnungsfaktorhemmer können die Ursache von Blutungsstörungen sein. Ubermäßige Blutungen treten auch in Patienten mit einer normal funktionierenden Blutgerinnungskaskade (keine Gerinnungsfaktormängel oder -hemmer gegen beliebige der Blutgerinnungsfaktoren) auf und können durch eine fehlerhafte Plättchenfunktion, Thrombozytophenie oder von-Willebrand-Krankheit verursacht werden. In derartigen Fällen können die Blutungen mit denjenigen Blutungen in Verbindung gesetzt werden, die durch Hämophilie verursacht werden, da das hämostatische System wie bei Hämophilie einen Mangel an wichtigen Gerinnungs „Verbindungen" (wie Plättchen oder von-Willebrand-Faktorprotein) aufweisen oder diese abnormal sind, was beträchtliche Blutungen verursacht. In Patienten, die eine übermäßige Gewebeschädigung in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff oder einem enormen Trauma erleiden, kann der normale hämostatische Mechanismus durch die Notwendigkeit unmittelbarer Hämostase überrannt werden, und sie können trotz eines grundsätzlich (vor dem Trauma) normalen hämostatischen Mechanismus Blutungen entwickeln. Das Erzielen von zufrieden stellender Hämostase ist auch problematisch. wenn Blutungen in Organen wie dem Gehirn, der Innenohrregion und den Augen mit eingeschränkter Möglichkeit für eine chirurgische Hämostase auftreten. Dasselbe Problem kann beim Prozess der Entnahme von Biopsin von verschiedenen Organen (Leber, Lunge, Tumorgewebe, Magendarmtrakt), sowie bei einer Laparoskopieoperation auftreten. All diesen Situationen ist die Schwierigkeit gemein, Hämostase durch chirurgische Techniken (Nahtmaterial, Clips usw.) bereitzustellen, was auch der Fall ist, wenn die Blutung ausbreitend ist (hämorrhagische Gastritis oder profuse Gebärmutterblutung). Akute und übermäßige Blutungen können auch in Patienten bei einer Antiblutgerinnungstherapie auftreten, in welchen eine fehlerhafte Hämostase durch die verabreichte Therapie induziert wurde. Derartige Patienten können in dem Falle chirurgische Eingriffe benötigen, in welchem der Antiblutgerinnungswirkung schnell entgegengewirkt werden muss. Eine radikale retropubische Prostatektomie ist eine allgemein durchgeführte Prozedur für Patienten mit lokalisiertem Prostatakrebs. Die Operation wird häufig durch einen beträchtlichen und manchmal massiven Blutverlust kompliziert. Der beträchtliche Blutverlust während der Prostatektomie ist hauptsächlich mit der komplizierten anatomischen Situation, mit verschiedenen verdichteten vaskularisierten Stellen, die für eine chirurgische Hämostase nicht leicht zugänglich sind und zu einer ausbreitenden Blutung über einen großen Bereich führen können, verbunden. Eine andere Situation, die im Falle von nicht zufrieden stellender Hämostase Probleme verursachen kann, ist, wenn Patienten mit einem normalen hämostatischen Mechanismus eine Antiblutgerinnungstherapie verabreicht wird, um eine thromboembolische Erkrankung zu verhindern. Eine derartige Therapie kann Herparin, andere Formen von Proteoglycanen, Warfarin oder andere Formen von Vitamin-K-Antagonisten sowie Aspirin und andere Plättchenaggregationshemmer einschließen.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Blutung mit Hämophilie verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit Hämophilie mit erworbenen Hemmern verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit Thrombozytopenie verbunden In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit von-Willbrand-Krankheit verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit schwerer Gewebeschädigung verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit schwerem Trauma verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einem chirurgischen Eingriff verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einer Laparoskopieoperation verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit hämorrhagischer Gastritis verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung eine übermäßige Gebärmutterblutung. In einer anderen Ausführungsform findet die Blutung in Organen mit einer eingeschränkten Möglichkeit der mechanischen Hämostase statt. In einer anderen Ausführungsform findet die Blutung im Gehirn, in der Innenohrregion oder in den Augen statt. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit dem Verfahren der Entnahme einer Biopsie verbunden. In einer anderen Ausführungsform ist die Blutung mit einer Antiblutgerinnungstherapie verbunden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann des Weiteren einen Faktor VIII umfassen. Eine derartige Zusammensetzung sollte vorzugsweise Patienten verabreicht werden, die keine Hemmer für FVIII aufweisen.
Jede mögliche Kombination von zwei oder mehreren der hier beschriebenen Ausführungsformen soll im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein.
In diesem Kontext bedeutet der Begriff „Behandlung", dass er sowohl die Vorbeugung einer erwarteten Blutung wie z.B. bei einem chirurgischen Eingriff als auch die Regulation einer schon stattfindenden Blutung, wie z.B. bei Hämophilie oder Trauma, mit dem Zwecke des Hemmens oder Minimierens der Blutung einschließt. Eine prophylaktische Verabreichung von FVIIa und TFPI-Hemmer ist folglich im Begriff „Behandlung" eingeschlossen.
Der Begriff „Patient" soll wie hier verwendet jedes beliebige Tier, insbesondere Säuger wie Menschen bedeuten und kann, wo geeignet, mit dem Begriff „Patient" austauschbar verwendet werden.
Abkürzung

TF

Gewebefaktor

FVII

Faktor VII in seiner einkettigen, unaktivierten Form

FVIIa

Faktor VII in seiner aktivierten Form

rFVIIa

rekombinanter Faktor VII in seiner aktivierten Form

FVIII

Faktor VIII in seiner zymogenen, unaktivierten Form

rFVIII

rekombinanter FVIII

FVIIIA

Faktor VIII in seiner aktivierten Form

rFVIIIa

rekombinanter FVIIIa

TFPI

Gewebefaktorweghemmer

Herstellung von Zusammensetzungen
Gereinigter Human-Faktor-VIIa, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird vorzugsweise durch rekombinante DNA-Technologie, z.B. wie beschrieben in Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412–2416, 1986 oder wie im Europäischen Patent Nr. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.) beschrieben durchgeführt. Der durch rekombinante Technologie hergestellte Faktor VIIa kann ein authentischer Faktor VIIa oder ein mehr oder weniger modifizierter Faktor VIIa sein, mit der Maßgabe, dass ein derartiger Faktor VIIa im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität für die Blutgerinnung wie der authentische Faktor VIIa aufweist. Ein derartiger modifizierter Faktor VIIa kann durch Modifizieren der den Faktor VIIa kodierenden Nukleinsäuresequenz entweder durch Abändern der Aminosäurekodone oder durch Entfernen von einigen der Aminosäurekodone in der den natürlichen FVII kodierernden Nukleinsäure durch bekannte Mittel, z.B. durch stellenspezifische Mutagenese hergestellt werden.
Faktor VII kann auch durch die von Broze und Majerus, J. Biol. Chem. 255(4): 1242–1247, 1980 und Hedner und Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836–1841, 1983, beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren stellen den Faktor VII ohne nachweisbare Mengen an anderen Blutgerinnungsfaktoren bereit. Ein noch weiter gereinigtes Faktor-VII-Präparat kann durch Einschluss einer zusätzlichen Gelfiltration als Endreinigungsschritt erhalten werden. Faktor VII wird dann durch bekannte Mittel, z.B. durch mehrere verschiedene Plasmaproteine wie Faktor XIIa, IX oder Xa zu aktiviertem FVIIa umgewandelt. In einer anderen Ausführungsform kann Faktor VII wie von Bjoem et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, Seite 564–565) beschrieben aktiviert werden, indem er durch eine Ionenaustauschchromatographiesäule wie Mono Q^® (Pharmacia fine Chemicals) oder dergleichen geleitet wird.
Wie dem Fachmann klar, ist es bevorzugt, einen TFPI-Hemmer und einen Faktor VIIa zu verwenden, die mit dem Patienten genidentisch sind, um das Risiko des Induzierens einer Immunantwort zu reduzieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung eines derartigen TFPI-Hemmers und Faktor VIIa in Veterinärprozeduren.
Verabreichung und Arzneimittel
Zur Behandlung in Verbindung mit überlegten Eingriffen werden der Faktor VIIa und der TFPI-Hemmer typischerweise innerhalb etwa 24 Stunden vor der Durchführung des Eingriffs und für eine Dauer von mehr als 7 Tagen oder mehr danach verabreicht. Die Verabreichung als Blutgerinnungsmittel kann durch eine Vielzahl von hier beschriebenen Wegen erfolgen.
Die typische Dosis des Faktors VIIa liegt je nach Gewicht des Patienten und Schwere des Zustands im Bereich von etwa 0,05 mg bis etwa 500 mg/Tag, vorzugsweise etwa 1 mg bis etwa 200 mg/Tag und stärker bevorzugt etwa 10 mg bis etwa 75 mg/Tag für einen Patienten mit 70 kg als Initial- und Erhaltungsdosen.
Die Zusammensetzungen und Kits der vorliegenden Erfindung sind in der Human- und Veterinärmedizin wie z.B. bei der Behandlung oder Prophylaxe von an Blutungen oder Blutgerinnungsstörungen leidenden Patienten nützlich. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden der Faktor VIIa und der TFPI-Hemmer wahlweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert. Vorzugsweise werden die Arzneimittel parenteral, d.h. intravenös, subkutan oder intramuskulär verabreicht oder können durch kontinuierliche oder rhythmische Infusion verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann der TFPI-Hemmer in dem Falle, in welchen ein kleines organisches Molekül wie dasjenige, das in WO96/28153 und US 5,622,988 offenbart ist, erwogen ist, oral verabreicht werden.
Formulierungen können des Weiteren ein oder mehrere Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Exzipienten usw. einschließen und in derartigen Formen wie Flüssigkeiten, Pulver, Emulsionen, Mittel mit kontrollierter Freisetzung usw. bereitgestellt werden. Der Fachmann kann die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einer geeigneten Weise und gemäß akzeptierten Praktiken wie denjenigen, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, offenbart sind, formulieren. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen den Faktor VII und den TFPI-Hemmer in Kombination mit, vorzugsweise gelöst in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern wie Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen kann verwendet werden. Die Faktor-VII-Varianten der Erfindung können auch zur Abgabe an oder zum Zielen auf die Verletzungsstelle zu Liposompräparaten formuliert werden. Die Liposompräparate sind z.B. in U.S. 4,837,028 , U.S. 4,501,728 und U.S. 4,975,282 allgemein beschrieben.
Ein typisches Arzneimittel zur intravenösen Infusion könnte derart hergestellt werden, dass es 250 ml sterile Ringer-Lösung und 10 mg der Faktor-VII-Variante enthält. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von paranteral verabreichbaren Zusammensetzungen sind dem Fachmann klar und detaillierter z.B. in Remingten's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990), beschrieben.
Kurz gesagt werden die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeigneten Zusammensetzungen durch Mischen des FVIIa oder des TFPI-Hemmers oder des FVIIa in Kombination mit dem TFPI-Hemmer vorzugsweise in gereinigter Form mit geeigneten Hilfsstoffen und einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel hergestellt. Geeignete physiologisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel schließen steriles Wasser und Kochsalzlösung ein. Die Zusammensetzungen kön nen für annähernd physiologische Bedingungen erforderliche pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen wie den pH-Wert einstellende und Puffermittel, die Tonizität einstellende Mittel und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid usw. enthalten. Geeignete Hilfsstoffe können Calcium, Proteine (z.B. Albumine) oder andere inerte Peptide (z.B. Glycylglycin) oder Aminosäuren (z.B. Glycin oder Histidin) einschließen, um den gereinigten Faktor VIIa und/oder TFPI-Hemmer zu stabilisieren. Andere physiologisch verträgliche Hilfsstoffe sind nicht reduzierende Zucker, Polyalkohole (z.B. Sorbit, Mannit oder Glycerin), Polysaccharide wie Dextrine mit niedrigem Molekulargewicht, Detergenzien (z.B. Polysorbat und Antioxidationsmittel (z.B. Bisulfit und Ascorbat). Die Hilfsstoffe liegen im Allgemeinen in einer Konzentration von 0,001 bis 4% G/V vor. Das Arzneimittel kann auch Protesaehemmer, z.B. Aprotenin oder Tranexaminsäure und Konservierungsmittel enthalten. Weiterhin kann das Präparat auch einen Faktor VIII enthalten.
Die Zusammensetzungen können durch herkömmliche, bekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die erhaltenen wässrigen Lösungen können zur Verwendung verpackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen wässrigen Lösung kombiniert wird.
Die Konzentration von Faktor VIIa, TFPI-Hemmer oder FVIIa in Kombination mit TFPI-Hemmer in diesen Formulierungen kann breit, d.h. von weniger als etwa 0,5 Gew.-%, gewöhnlich bei oder mindestens um 1 Gew.-% bis mehr als 15 oder 20 Gew.-% variieren und wird gemäß dem besonderen ausgewählten Verabreichungsmodus primär durch Fluidvolumina, Viskositäten usw. ausgewählt.
Die Verabreichung durch Injektion oder Infusion, insbesondere Injektion ist bevorzugt. Folglich werden der Faktor VIIa und TFPI in einer zur intravenösen Verabreichung geeigneten Form wie als Präparat, das entweder ein gelöstes lyophilisiertes Pulver oder eine flüssige Formulierung, enthaltend sowohl den Faktor VIIa und den TFPI-Hemmer in einer Dosierungsform, oder ein gelöstes lyophilisiertes Pulver oder eine flüssige Formulierung, enthaltend den Faktor VIIa in einer Dosierungsform, und ein gelöstes lyophilisiertes Pulver oder eine flüssige Formulierung, enthaltend den TFPI-Hemmer in einer anderen Dosierungsform, ist, hergestellt.
Die lokale Abgabe des Faktors VIIa und TFPI-Hemmers wie z.B. die topische Applikation kann z.B. durch ein Spray, eine Perfusion, Doppelballonkatheter, einen Stent, eingebracht in Gefäßimplantate oder Stents, zum Beschichten von Ballonkathetern verwendeten Hydrogele oder andere etablierte Verfahren durchgeführt werden. Für ambulante Patienten, die tägliche Erhaltungsgehalte erfordern, kann der Faktor VIIa und TFPI-Hemmer durch kontinuierliche Infusion unter Verwendung z.B. eines tragbaren Pumpsystems verabreicht werden. In jedem Fall sollten die Arzneimittel eine Menge an Faktor VIIa und TFPI-Hemmer bereitstellen, die zum wirksamen Behandeln des Patienten ausreichend ist.
Die Kombination von einem Faktor VIIa und einem TFPI-Hemmer zeigt eine synergistische Wirkung in einem verdünnten zeitabhängigen Protothrombin-Blutgerinnungstest in vitro. Außerdem zeigt die Kombination von einem Faktor VIIa und einem TFPI-Hemmer eine synergistische Wirkung beim Verbessern der Blutgerinnung.
Die den Faktor VIIa und TFPI-Hemmer enthaltenden Zusammensetzungen können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. In therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem schon an einer wie vorstehend beschriebenen Erkrankung leidenden Patienten in einer Menge, die zum Verhindern oder Reduzieren der Blutung oder des Blutverlusts derart ausreichend ist, verabreicht, dass die Erkrankung und diese Komplikationen ausgeheilt, gelindert oder teilweise zur Ruhe gebracht werden. Eine Menge, die zum Erzielen dessen angemessen ist, ist als „wirksame Menge" oder „therapeutisch wirksame Menge" definiert. Wie dem Fachmann klar, hängen für die sen Zweck wirksame Mengen von der Schwere der Erkrankung oder Verletzung sowie vom Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten ab.
Es ist zu berücksichtigen, dass die Materialien der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen in schweren Krankheits- oder Verletzungsstadien, d.h. in lebensbedrohlichen oder möglicherweise lebensbedrohlichen Situationen eingesetzt werden. In derartigen Fällen ist es im Hinblick auf die Minimierung von belanglosen Substanzen und das allgemeine Fehlen von Immunogenizität von Human-Faktor-VII-Varianten in Menschen möglich und kann durch den behandelnden Arzt als erwünscht empfunden werden, einen beträchtlichen Überschuss dieser Variant-Faktor VII-Zusammensetzungen zu verabreichen.
In prophylaktischen Anwendungen werden den Faktor VIIa und TFPI-Hemmer enthaltende Zusammensetzungen einem Patienten verabreicht, der für einen Krankheitszustand oder eine Verletzung anfällig ist oder ein anderes damit verbundenes Risiko aufweist, um die dem Patienten eigene Blutgerinnungsfähigkeit zu verbessern. Eine derartige Menge ist als „prophylaktisch wirksame Dosis" definiert.
Einzel- oder Mehrfachverabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosisgehalten und -mustern durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt ausgewählt werden. Die Zusammensetzungen können ein oder mehrmals pro Tag oder Woche verabreicht werden. Eine wirksame Menge eines derartigen Arzneimittels ist die Menge, die gegen die Blutungen eine klinisch bedeutsame Wirkung bereitstellt. Derartige Mengen hängen teilweise von dem bestimmten zu behandelnden Zustand, dem Alter, Gewicht und der allgemeinen Gesundheit des Patienten und anderen dem Fachmann verständliche Faktoren ab.
Die Zusammensetzung wird im Allgemeinen als Einzeldosis vor der erwarteten Blutung oder bei Beginn der Blutung verabreicht. Sie kann jedoch auch je nach verabreichter Dosis und Zustand des Patienten in mehreren Dosen, vorzugsweise mit Intervallen von 2–4–6–12 Stunden verabreicht werden.
Die Zusammensetzung kann in Form eines sowohl FVIIa als auch TFPI-Hemmer in geeigneten Konzentrationen umfassenden Einzelpräparats vorliegen. Die Zusammensetzung kann auch in Form eines Kits vorliegen, der aus einer FVIIa umfassenden ersten Einheitsdosierungsform und einer TFPI-Hemmer umfassenden zweiten Einheitsdosierungsform und wahlweise einer oder mehreren weiteren einen Faktor VIII umfassenden Einheitsdosierungsformen besteht. In diesem Falle sollten der FVIIa und der TFPI-Hemmer nacheinander, vorzugsweise mit einem Abstand von 1–2 Stunden wie einem Abstand von 30 Minuten oder vorzugsweise einem Abstand von 10 Minuten, stärker bevorzugt 5 Minuten verabreicht werden. Eine der beiden Einheitsdosierungsformen kann zuerst verabreicht werden.
Da die vorliegende Erfindung die Vorbeugung oder Behandlung von Blutungen oder die Blutgerinnungsbehandlung durch Behandlung mit einer Kombination von Wirkstoffen, die getrennt verabreicht werden können, betrifft, betrifft die Erfindung auch das Kombinieren von getrennten Arzneimitteln in Kitform. Der Kit schließt mindestens zwei getrennte Arzneimittelzusammensetzungen ein. Der Kit schließt Behälterelemente zum Beinhalten der getrennten Zusammensetzungen wie eine unterteilte Flasche oder ein unterteiltes Folienpaket ein. Typischerweise schließt der Kit Anweisungen für die Verabreichung der getrennten Bestandteile ein. Die Kitform ist besonders vorteilhaft, wenn die getrennten Bestandteile vorzugsweise in unterschiedlichen Dosierungsformen verabreicht werden, mit unterschiedlichen Dosierungsintervallen verabreicht werden oder eine Titration der einzelnen Bestandteile der Kombination durch den verschreibenden Arzt erwünscht ist.
Assays
Test auf FVIIa-Aktivität
Ein geeigneter Assay zum Testen auf FVIIa-Aktivität und dadurch Auswählen von geeigneten Faktor-VIIa-Varianten kann als einfacher vorangehender Test in vitro durchgeführt werden:
Hydrolysassay in vitro
Nativer (Wildtyp) Faktor VIIa und Faktor VIIa-Variante (beide hier nachstehend als „Faktor VIIa" bezeichnet) können auf spezifische Aktivitäten untersucht werden. Sie können auch parallel untersucht werden, um deren spezifische Aktivität direkt zu vergleichen. Der Assay wird in einer Mikrotiterplatte (Max-iSorp, Nunc, Dänemark) durchgeführt. Das chromogene Substrat D-Ile-Pro-Arg-p-Nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Schweden), Endkonzentration 1 mM, wird dem Faktor VIIa in 50 mM Hepes, pH 7,4, enthaltend 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl₂ und 1 mg/ml Rinderserumalbumin zugesetzt (Endkonzentration 100 nM). Die Absorption bei 404 nm wird kontinuierlich in einem Plattenlesegerät des Typs SpectraMax^TM 340 (Molecular Devicse, USA) gemessen. Die sich innerhalb einer 20-minütigen Inkubation entwickelnde Absorption wird nach der Subtraktion der Absorption in einer kein Enzym enthaltenden Blindmulde zum Berechnen des Verhältnisses zwischen den Aktivitäten von Variante und Faktor VIIa vom Wildtyp verwendet: Verhältnis = (A405 nm Faktor-VIIa-Variante)/(A405 nm Faktor-VIIa vom Wildtyp).
Auf der Basis davon können Faktor-VIIa-Varianten mit einer Aktivität, die mit derjenigen von nativem Faktor VIIa vergleichbar oder höher als diese ist, wie z.B. Varianten, in welchen das Verhältnis zwischen der Aktivität der Variante und der Aktivität des nativen Faktors VII um versus über 1,0 liegt, identifiziert werden.
Die Aktivität von Faktor VIIa oder Faktor-VIIa-Varianten kann auch unter Verwendung eines physiologischen Substrats wie Faktor X, geeigneterweise mit einer Konzentration von 100–1000 nM, gemessen werden, wobei der gebildete Faktor Xa nach der Zugabe eines geeigneten chromogenen Substrats (z.B. S-2765) gemessen wird. Zudem kann der Aktivitätsassay bei Körpertemperatur durchgeführt werden.
Die Fähigkeit von Faktor VIIa oder Faktor-VIIa-Varianten zur Thrombinbildung kann auch in einem Assay gemessen werden, der alle relevanten Blutgerinnungsfaktoren und Hemmer bei physiologischen Konzentrationen (minus Faktor VIII, wenn Hämophilie-A-Bedingungen nachgeahmt werden) und aktivierte Plättchen (wie beschrieben auf der Seite 343 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 543–547) umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die jedoch den Schutzumfang nicht beschränken sollen. Die in der vorstehenden Beschreibung offenbarten Merkmale und die folgenden Beispiele können sowohl separat als auch in beliebiger Kombination davon Material zum Verwirklichen der Erfindung in ihren unterschiedlichen Formen sein.
BEISPIELE
Anti-TFPI-IgG kann nach dem im Experimentalteil von EP 558529 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Beispiel 1
Die hier dargestellten Daten zeigen, dass die Kombination von rFVIIa mit einer die eine maximale Verkürzung der Blutgerinnungszeit bereitstellenden Konzentration und Anti-TFPI-IgG mit einer die eine maximale Verkürzung der Blutgerin nungszeit bereitstellenden Konzentration die Blutgerinnungszeit von normalen Humanplasma sowie von Faktor-VIII-armen Plasma mehr als rFVIIa und Anti-TFPI-IgG allein verkürzt.
Verfahren
Blutgerinnungsassay
Die Blutgerinnungszeiten wurden in einem verdünnten PT-Blutgerinnungsassay gemessen. Ein Volumen von 180 μl Faktor-VIII-armen Plasma (Helena Laboratories) oder normalem Humanplasmapool wurde mit 20 μl Probe, enthaltend rFVIIa, Anti-TFPI-IgG oder Puffer (50 mM Imidazol, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml BSA, pH 7,4) gemischt und für eine Dauer von 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Blutgerinnungszeiten wurden dann auf einem Blutgerinnungsgerät des Typs ACL 300R gemessen, wobei 75 μl der Proben mit 75 μl Thromboplastin/CaCl₂-Reagens, enthaltend eine 1:1200-Verdünnung von Innovin (Dade) und 8,33 mM CaCl₂, im Imidazolpuffer gemischt wurden.
Ergebnisse
Die Blutgerinnungszeiten von normalem Humanplasma, das mit Verdünnungen von rFVIIa und Anti-TFPI-IgG vorinkubiert war, wurden bestimmt (vergleiche 1).
Sowohl rFVIIa als auch Anti-TFPI-IgG verkürzten die Blutgerinnungszeit von normalem Humanplasma in einem verdünnten PT-Assay. rFVIIa mit 0,04 bis 1 mM stellte eine dosisabhängige Verminderung der Blutgerinnungszeit bereit. Bei rFVIIa-Konzentrationen über 5 nM wurde keine weitere Verminderung der Blutgerinnungszeit beobachtet. Anti-TFPI-IgG mit Konzentrationen von 0,1–1 μg/ml verkürzte die Blutgerinnungszeit in dosisabhängiger Weise. Die Verkürzung der Blutgerinnungszeit war geringer als für rFVIIa beobachtet. Mit Anti-TFPI-IgG- Konzentrationen über 2 μg/ml wurde keine weitere Verkürzung der Blutgerinnungszeit beobachtet.
rFVIIa und Anti-TFPI-IgG mit eine maximale Verkürzung der Blutgerinnungszeit bereitstellenden Konzentrationen (5 nM bzw. 2,4 μg/ml) und eine teilweise Verkürzung der Blutgerinnungszeit bereitstellenden Konzentrationen (0,5 nM bzw. 0,1 μg/ml) wurden normalem Humanplasma oder Faktor-VIII-armen Plasma zugesetzt, und die Blutgerinnungszeiten wurden bestimmt (Tabelle 1). Durch Kombinieren von rFVIIIa und Anti-TFPI-IgG wurde die Blutgerinnungszeit mehr verkürzt, als wenn rFVIIa oder Anti-TFPI-IgG einzeln zugesetzt wurde. Dies zeigt, dass eine Kombination von rFVIIa und Anti-TFPI-IgG zur Verbesserung der Blutgerinnung von Hämophiliepatienten sowie für normale Individuen verwendet werden kann.
Tabelle 1. Wirkung von rFVIIa und Anti-TFPI-IgG allein oder in Kombination auf die Blutgerinnungszeit von normalem Humanplasma oder Faktor-VIII-armen Plasma. Die Werte sind Mittelwerte von zwei Proben.
Beispiel 2
Verfahren
Die Untersuchung wurde im Wesentlichen wie in Kjalke, M., Oliver, J. A., Monroe, D. M., Hoffman, M., Ezban, M., Hedner, U. & Roberts, H. R. (1997) The effect of active site-inhibited factor VIIa on tissue factor-initiated coagulation using platelets before and after aspirin administration. Thrombosis and Haemostasis, 78, 1202–1208. (Hereinafter Kjalke et al. 1997) beschrieben durchgeführt. Einkernige Zellen wurden von mit Citrat stabilisiertem periphärem Blut durch Dichtezentrifugation isoliert und der Prozentanteil von Monozyten durch Fließzytometrie nach Markieren mit an Pycoerythrin konjugiertem Anti-CD14-Antikörper (BD Pharmingen) bestimmt. Die Zellen wurden in Makrophagenserum-freiem Medium (Life Technologies) mit 0,5 μg/ml LPS (Sigma L2755) erneut suspendiert und in 96-Mulden-Gewebekulturplatten mit einer Dichte von 20.000 Monozyten pro Mulde aufgestrichen. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 36°C in 5% CO₂ wurden nicht anhaftende Zellen, hauptsächlich Lymphozyten, durch Waschen entfernt, und es wurde weiter über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die nicht aktivierten Plättchen von peripherem Blut, enthaltend 5 μg/ml Prostaglandin E, (Sigma), durch Dichtezentrifugation und Gelfiltration auf einer Sepharose-CL2B-Säule, equilibriert mit calciumfreiem Tyrodespuffer (15 mM Hepes, 3,3 mM Na₂PO₄, pH 7,4, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5,5 mM Dextrose), enthaltend 1 mg/ml BSA, isoliert. Die Plättchen wurden durch Fließzytrometrie unter Verwendung von Tru-Count-Röhrchen (BD) gezählt und die Plättchendichte mit Tyrodespuffer eingestellt. rFVIIa (Endkonzentration 0,1 nM oder 50 nM, vgl. Thim, L., Bjoern, S., Christensen, M., Nicolaisen, E. M., Lund-Hansen, T. Pedersen, A. H. & Hedner, U. (1988) Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells. Biochemistry, 27, 7785–7793. (hier nachstehend Thim et al. (1988)) wurde mit Faktor X (8 μg/ml, Haematologic Technologies Inc.), Faktor IX (5 μg/ml, Mononone, Armour Pharmaceutical), Faktor XI (5 μg/ml, Haematologic Technologies Inc.), Prothrombin (86 μg/ml, Haematologic Technologies Inc), TFPI (0,1 μg/ml, vgl. Pedersen, A. H., Nordfang, O., Norris, F., Wiberg, F. C., Christensen, P. M., Moeller, K. B., Meidahl-Pedersen, J., Beck, T. C., Norris, K., Hedner, U. & Kisief, W. (1990) Recombinant human extrinsic pathway inhibitor. Production, isolation, and characterization of its inhibitory activity on tissue factor-initiated coagulation reactions. Journal of Biological Chemistry, 265, 16786–16793 (hier nachstehend Pedersen et al. (1990)), ATIII (120 μg/ml, Haematologic Technologies Inc), Faktor V (7 μg/ml, Haematologic Technologies Inc), Faktor VIII (1 U/ml, McJATE, New York blood center) und Calciumchlorid (3 mM) gemischt. Einige der Proteine wurden wie beschrieben vorbehandelt (Kjalke et al. (1997).) Proteine und Plättchen wurden den Monozyten zugesetzt, und die Thrombinaktivität wurde durch Überführen von Aliquoten in 9 Volumina HBS, enthaltend 1 mg/ml BSA, 1 mM EDTA, 50 μM Pefabloc Xa (Pentapharm) und 0,5 mM Chromozyme TH (Boehringer Mannheim) gemessen. Die Farbentwicklung wurde mit 2 M Essigsäure gestoppt, und A405 wurde gemessen. Human-α-Thrombin (Boehringer Mannheim) wurde als Standard verwendet.
Ergebnisse
Hämophilie ist durch eine beeinträchtigte Thrombinbildung gekennzeichnet. Dies ist in einem Modell auf Zellbasis von Gewebefaktor-initiierter Blutgerinnung veranschaulicht (Monroe, D. M., Roberts, H. R. & Hoffman, M. (1994) Platelet procoagulant complex assembly in a tissue factor-initiated system. British Journal of Haematology, 88, 364–371; (hier nachstehend Monroe et al. 1994)); (Kjalke et al. 1997), wobei die maximale Geschwindigkeit der Thrombinbildung vermindert, die Zeit zur maximalen Thrombinaktivität verzögert und der Spitzengrad der Thrombinaktivität bei Hämophilie-A-ähnlichen Bedingungen verglichen mit normalen Bedingungen vermindert war (2). Bei Zugabe von Anti-TFPI-IgG zu Hämophilie-A-ähnlichen Bedingungen wurde eine dosisabhängige Zunahme der Thrombinbildungsgeschwindigkeit, eine Verkürzung der Zeit zur maximalen Thrombinaktivität und eine Erhöhung im Spitzengrad der Thrombinaktivität beobachtet (2A). Bei Konzentrationen über 10 μg/ml Anti-TFPI-IgG wurde keine weitere Wirkung auf die Thrombinbildung beobachtet. rFVIIa mit 50 nM erhöhte ebenfalls die Thrombinbildung bei Hämophilie-A-ähnlichen Bedingungen, wie in 2 dargestellt. Uberraschenderweise stellte das Kombinieren von 50 nM rFVIIa mit 10 μg/ml Anti-TFPI-IgG einen früheren Thrombinbildungspeak bereit, als dessen Erhalt mit Anti-TFPI-IgG allein möglich war. Bei Zugabe von rFVIIa mit erhöhenden Dosen zu Hämophilie-A-ähnlichen Bedingungen war eine maximale Wirkung, d.h. eine maximale Zunahme der Dosen zu Hämophilie-A-ähnlichen Bedingungen, eine maximale Wirkung, d.h. ein maximale Zunahme in der maximalen Geschwindigkeit der Thrombinbildung, eine maximale Verkürzung der Zeit zur maximalen Thrombinaktivität und eine maximale Erhöhung im Spitzengrad der Thrombinaktivität mit 1 μM rFVIIa ersichtlich (3A) Die Zugabe von höheren Konzentrationen von rFVIIa beeinflusste die Thrombinbildungskurve nicht weiter. Zusätzlich erhöhte die Zugabe von 10 μg/ml Anti-TFPI-IgG zu der Probe mit 1 μM rFVIIa überraschenderweise die Thrombinbildung mehr, als es mit rFVIIa allein möglich war, wie durch eine erhöhte maximale Thrombinbildungsgeschwindigkeit, eine Verkürzung der Zeit zur maximalen Thrombinaktivität und einen erhöhten Maximalgrad an Thrombinaktivität ersichtlich (3B). Unsere Daten zeigen, dass das Kombinieren von rFVIIa und Anti-TFPI-IgG eine zusätzliche Wirkung aufwies, als das einfache Erhöhen der Konzentration von einem der Bestandteile allein.
Beispiel 3
VERFAHREN
Normales Humanplasma, verdünnt auf das 10-Fache mit Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, pH 7,4), enthaltend Innovin (Dade Behring, 2000-fache Verdünnung), rFVIIa (wie angegeben) und t-PA (Plasminogenaktivator vom Gewebetyp, 8 nM; American Diagnostica), wurde zu 96-Mulden-ELISA-Platten zugesetzt und die Trübheit bei 650 nm bei Raumtemperatur gemessen. Wo angezeigt, wurde zusätzlich ein Schaf-Anti-TFPI-IgG (Enzyme Research Laboratories) eingeschlossen.
ERGEBNISSE:
4 zeigt, dass die Zugabe von rFVIIa zu einer dosisabhängigen Verlängerung der Blutgerinnungslysezeit führte. Diese Wirkung war bei 10 nM FVIIa optimal; keine zusätzliche Wirkung wurde durch die Zugabe 15 nM rFVIIa erhalten. Jedoch führte die Zugabe eines Schaf-Anti-TFPI (aTFPI) zu einer deutlichen (p < 0.005) weiteren Verlängerung der Blutgerinnungslysezeit (siehe 5). Die Wirkung war dosisabhängig und bei 1,6 μg/ml aTFPI optimal. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Kombinieren von rFVIIa und Anti-TFPI-IgG eine Wirkung auf die Blutgerinnungslyse in vitro zeigt, die durch einfaches Erhöhen der Konzentration von einer der Bestandteile alleine nicht erhalten werden kann.

Claims

Arzneimittel, umfassend einen Faktor VIIa und einen TFPI-Hemmer.
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Faktor VIIa Human-FVIIa ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Faktor VIIa rekombinanter FVIIa ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Arzneimittel des Weiteren einen FVIII enthält.
Kit, enthaltend eine Behandlung von Blutungen, umfassend a) eine wirksame Menge eines Faktors VIIa und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer ersten Einheitsdosierungsform, b) eines wirksame Menge eines TFPI-Hemmers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer zweiten Einheitsdosierungsform und c) Behälterelemente zum Beinhalten der ersten und zweiten Einheitsdosierungsform.
Kit nach Anspruch 5, des Weiteren umfassend eine wirksame menge eines Faktors VIII und einen pharmazeutisch verträglichen Träger in einer dritten Einheitsdosierungsform und ein Behälterelement zum Beinhalten der dritten Einheitsdosierungsform.
Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Blutgerinnungszeit in einem Patienten.
Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Blutungen in einem Patienten.
Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zur Verlängerung der Blutgerinnsellysezeit in einem Patienten.
Verwendung eines Faktors VIIa in Kombination mit einem TFPI-Hemmer zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Thrombinbildung in einein Patienten mit Faktor-VIII-armem Plasma.