CZ2003611A3 - Varianty lidského koagulačního faktoru VII - Google Patents

Description

sř

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález se týká nových variant lidského koagulačního faktoru Vila majících koagulační aktivitu, konstruktů nukleových kyselin kódujících tyto varianty, vektorů a hostitelských buněk obsahujících kyselinu nukleovou, léčebných složení, použití a způsobů léčby.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Srážení krve je proces, který se skládá ze souboru interakcí různých krevních složek (nebo faktorů), které nakonec dávají vznik krevní sraženiny. Obecně, krevní složky, které se účastní procesu, který byl zmíněn jako koagulační „kaskáda“, jsou enzymaticky neaktivní proteiny (proenzymy nebo zymogeny), které jsou působením aktivátoru (který je sám o sobě aktivovaný srážecí faktor) přeměněny na proteolytické enzymy. Koagulační faktory, které prodělaly tuto přeměnu jsou obecně popisovány jako „aktivní faktory“, a jsou označovány přidáním písmene „a“ ke jménu koagulačního faktoru (např. faktor Vila).

Spuštění procesu zastavujícího krvácení je vyvoláno tvorbou komplexu mezi tkáňovým faktorem odhaleným při poškození cévní stěny, a faktorem Vila. Tento komplex poté přeměňuje faktory IX a X na jejich aktivní formy. Faktor Xa přeměňuje omezené množství protrombinu na trombin na buňkách tkáně s tímto faktorem. Trombin aktivuje krevní destičky a faktory V a VIII se mění na faktory Va a Vlila, oba kofaktory v dalším procesu vedou kplné aktivaci trombinu. Tento proces zahrnuje tvorbu faktoru Xa faktorem IXa (v komplexu s faktorem Vlila) a vyskytuje se na povrchu aktivovaných krevních destiček. Trombin nakonec přeměňuje fibrinogen na fibrin za tvorby fibrinové sraženiny. V současnosti jsou faktor VII a tkáňový faktor považovány za hlavní iniciátory krevního srážení.

Faktor VII je stopový plazmatický glykoprotein, který cirkuluje v krvi jako jednořetězcový zymogen. Zymogen je katalyticky neaktivní. Jednořetězcový faktor VII může být in vitro přeměněn na dvouřetězcový faktor Vila faktorem Xa, faktorem Xlla, faktorem IXa, faktorem Vila nebo trombinem. Faktor Xa je považován za největší fyziologický aktivátor faktoru VII. Tak jako různé jiné plazmatické proteiny podílející se na zastavení krvácení, je aktivita faktoru VII závislá na vitamínu K, který je nutný pro gama karboxylaci mnohočetných zbytků kyseliny glutamové, které jsou umístěné blízko aminového konce proteinu. Tyto gama karboxyglutamáty jsou vyžadovány pro interakci faktoru Vil s fosfolipidy vyvolanou kovovými ionty. Přeměna zymogenu faktoru VII na aktivovanou dvouřetězcovou molekulu probíhá rozštěpením interní ···· ·« · · · · · · ·· • · · ·

Argi 52-Ilej 53 peptidové vazby. V přítomnosti tkáňového faktoru, fosfolipidů a vápenatých iontů dvouřetězcový faktor Vila prudce aktivuje limitovanou proteolýzou faktor X nebo faktor IX. Často je u subjektu nutné stimulovat nebo zlepšit koagulační kaskádu. Faktor Vila byl používán pro kontrolu poruch krvácení, které měly různé příčiny, jako je nedostatek koagulačního faktoru (např. hemofilie A a B nebo nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII) nebo inhibitory koagulačního faktoru. Faktor Vila byl také používán pro kontrolu nadměrného krvácení vyskytujícího se u subjektů s normálně fungující krevní koagulační kaskádou (žádné nedostatky koagulačního faktoru nebo inhibitory proti některému z koagulačních faktorů). Takové krvácení může být například způsobeno špatnou funkcí krevních destiček, trombocytopenie nebo Willebrandova choroba. Krvácení je také velký problém ve spojení s chirurgií a jinými formami poškození tkáně.

Evropský patent 200 421 (ZymoGenetics) popisuje nukleotidovou sekvenci kódující lidský faktor VII a expresi rekombinantního faktoru VII v savčích buňkách.

Dickinson et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) popisuje varianty faktoru VII, kde Lysl57, Vall58, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 nebo Lys337 byly jednotlivě nahrazeny Ala.

Iwanaga et al. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999) 466, abstract 1474) popisuje varianty faktoru Vila, kde byly zbytky 316 až 320 vyškrtnuty nebo byly zbytky 311 až 322 nahrazeny odpovídajícími zbytky z trypsinu.

Nicméně, stále zde existuje potřeba variant faktoru Vila majících koagulační aktivitu, variant s vysokou aktivitou, které by mohly být podávány v poměrně malých dávkách, a variant, které nevytvářejí nežádoucí vedlejší účinky jako je systémová aktivace koagulačního systému a krvácení, která jsou asociovány s běžnou léčbou.

PODSTATA VYNÁLEZU

Vynález poskytuje polypeptidy koagulačního faktoru Vila s koagulační aktivitou.

Z prvního hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57).

Z druhého hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala337).

• · · · • · · ·

Ze třetího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není

FVII(Ala334).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala336).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO: 1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal58).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala296).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala298).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž jedna aminokyselina nezávisle vybraná ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal 58), FVII(Ala296) nebo FVII(Ala298).

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž dvě aminokyseliny nezávisle vybrané ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž tři aminokyseliny nezávisle vybrané ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.

• · · · • · · ·

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž čtyři aminokyseliny nezávisle vybrané ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž pět aminokyselin nezávisle vybraných ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 bylo nahrazeno odlišnými aminokyselinami.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž šest aminokyselin nezávisle vybraných ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 bylo nahrazeno odlišnými aminokyselinami.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, přičemž aminokyseliny Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje variantu koagulačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl (byly) nahrazeny jiným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny, popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byly nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky, které mohou být kódovány konstrukty nukleové kyseliny; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296) nebo FVII(Ala298). Pojem ,,FVII(Alal57)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Pojem ,,FVII(Ala337)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO: 1.

Pojem ,,FVII(Ala334)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem.

• · · · • · · ·

Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Pojem ,,FVII(Ala336)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Pojem ,,FVII(Alal58)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Pojem ,,FVII(Ala296)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Pojem ,,FVII(Ala298)“, tak jak je zde použit, představuje variantu koagulačního faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen alaninem. Tento pojem například nezahrnuje varianty koagulačního faktoru VII, kde byly odlišnými aminokyselinami nahrazeny dvě nebo více aminokyselin v pozicích v SEQ ID NO:1.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje konstrukt kyseliny nukleové kódující polypeptid faktoru VII podle vynálezu.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje konstrukt kyseliny nukleové obsahující nukleotidovou sekvenci kódující variantu faktoru VII.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje rekombinantní vektor obsahující konstrukt kyseliny nukleové kódující variantu FVIIa.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje rekombinantní hostitelské buňky obsahující konstrukt kyseliny nukleové nebo vektor.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje transgenní zvíře obsahující a exprimující konstrukt kyseliny nukleové.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob výroby polypeptidu faktoru VII podle vynálezu, způsob zahrnující kultivaci buněk obsahující konstrukt kyseliny nukleové ve vhodném růstovém médiu za podmínek umožňující expresi konstruktu kyseliny nukleové a získání výsledného polypeptidu z kultivačního média.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje způsob výroby varianty faktoru VII podle vynálezu, způsob zahrnující kultivaci buněk obsahující konstrukt kyseliny nukleové ve vhodném růstovém • · · · • · • · · · médiu za podmínek umožňující expresi konstruktu kyseliny nukleové a získání výsledného polypeptidu z kultivačního média.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob výroby polypeptidu faktoru VII, způsob zahrnující získání polypeptidu z mléka produkovaného transgenním zvířetem.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje způsob výroby varianty faktoru VII, způsob zahrnující získání varianty z mléka produkovaného transgenním zvířetem.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob výroby polypeptidu faktoru VII, způsob zahrnující kultivaci buněk transgenní rostliny obsahující konstrukt kyseliny nukleové a získání polypeptidu z výsledné rostliny.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje způsob výroby varianty faktoru VII, způsob zahrnující kultivaci buněk transgenní rostliny obsahující konstrukt kyseliny nukleové a získání varianty z výsledné rostliny.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina ···· ·· ·· ···· ·· ···· • · · * · · · · · ·· · · ···· · · · ······ ···· · / ······ ····· ·· · · ·· ··· ·· · · odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje léčebné složení obsahující polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje léčebné složení obsahující variantu koagulačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové; a popřípadě, léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici

157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici

158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

• · · 4 • · • · · · • ·

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje použití polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje použití varianty koaguačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález popisuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje způsob léčby krvácivých příhod u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství varianty faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové; v případě potřeby subjektu.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje léčebné složení obsahující variantu koagulačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové;

• · · ··· · * · • · · · ···· · · · ϊ π ······ ···· ·

I v ···· · · · ···· • · · · · · ··· ·· ·· za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296), nebo FVII(Ala298); a popřípadě, léčebně vhodný nosič.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje použití varianty koagulačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296), nebo FVII(Ala298); pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

Z dalšího hlediska, vynález poskytuje způsob léčby nebo prevence krvácivých poruch u subjektu nebo pro posílení normálního hemostatického systému, způsob zahrnující podávání léčebně nebo preventivně účinného množství varianty koagulačního faktoru VII, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty kyseliny nukleové; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296), nebo FVII(Ala298); v případě potřeby subjektu.

V jednom zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde byla aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde byla aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde byla aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 nahrazena odlišnou aminokyselinou.

···· ·· ·· ·»*· ·· ··«· • · · · · · · · · • * · · ···· · · · 11 «·«· ·· · · · · ·

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde byla

aminokyselina odpovídající	Ser v pozici 336 v SEQ	ID	NO:1	nahrazena	odlišnou
aminokyselinou.
V dalším zpracování podle	vynálezu je polypeptidem faktoru	VII	polypeptid,	kde byla
aminokyselina odpovídající	Val v pozici 158 v SEQ	ID	NO:1	nahrazena	odlišnou
aminokyselinou.
V dalším zpracování podle	vynálezu je polypeptidem faktoru	VII	polypeptid,	kde byla
aminokyselina odpovídající	Glu v pozici 296 v SEQ	ID	NO:1	nahrazena	odlišnou
aminokyselinou.
V dalším zpracování podle	vynálezu je polypeptidem faktoru	VII	polypeptid,	kde byla
aminokyselina odpovídající	Met v pozici 298 v SEQ	ID	NO:1	nahrazena	odlišnou

aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde byla alespoň jedna aminokyselina ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde bylo nanejvýš 20 přídavných aminokyselin ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně nahrazeno odlišnými aminokyselinami.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselin v pozici vybírané od 159 až 170 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselin v pozici vybírané od 290 až 312 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselin v pozici vybírané od 330 až 339 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

« 4

4 4119 • 4 ·

4 4 4 4

4 4 4

4 4 • 4 4 4 4

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly a Glu.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly a Glu.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Arg, Lys a Val.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Lys, Arg, Gin a Asn.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde aminokyselina byla nahrazena odlišnou aminokyselinou, která může být kódována konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde polypeptid faktoru VII je lidský faktor VII.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid, kde polypeptid faktoru VII je lidský faktor Vila.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid nezávisle vybíraný ze skupiny zahrnující [E296VJ-FVII, [M298QJ-FVII a [S336GJ-FVII.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptidem faktoru VII polypeptid nezávisle vybíraný ze skupiny zahrnující [V158T/M298QJ-FVII, [E296V/M298QJ-FVII, [V158D/E296VJ-FVII, [V158D/M298QJ-FVII a [V158D/M298K]-FVII.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptid faktoru VII [V158D/E296V/M298QJ-FVII.

V dalším zpracování podle vynálezu je polypeptid faktoru VII [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

V dalším zpracování jsou variantami faktoru VII varianty, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky, které mohou být kódovány konstrukty nukleové kyseliny, a popřípadě, kde jeden nebo více přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byl nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může • ·Φ· φφ *» ···* φ· »·»· ««· » · » V · Φ « · · · · «· · « · · . ~ »*«··> ··«· » ·«···* ..·· «« ·» ΦΦ φφφ «a ·· být kódován konstrukty nukleové kyseliny; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296) nebo FVII(Ala298).

V jednom zpracování jsou variantami faktoru VII varianty, kde jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen jinými aminokyselinovými zbytky, které mohou být kódovány konstrukty nukleové kyseliny; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296) nebo FVII(Ala298).

V dalším zpracování byl jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytek v pozici 337 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 a jeden nebo více Val zbytků v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 a jeden nebo více Asp zbytků v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Lys zbytků v pozici 337 a Asp zbytek v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 337 a jeden nebo více Asp zbytků v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Val zbytků v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 a jeden nebo více Asp zbytků v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

·« »·« · ·«·· 9· • * ·· ···· # Φ < · · · • *··· · » <· ··« ···« * • · · · · · ·

9· ··· ·· · »

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 337 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Val zbytků v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl(byly) jeden nebo více Asp zbytků v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 v SEQ ID NO:1 nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 nahrazen Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp nebo Glu; a/nebo Lys zbytek v pozici 337 byl nahrazen Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp nebo Glu; a/nebo Val zbytek v pozici 158 byl nahrazen Ser, Thr, Asn, Gin, Asp nebo Glu; a/nebo Glu zbytek v pozici 296 byl nahrazen Arg, Lys nebo Val; a/nebo Met zbytek v pozici 298 byl nahrazen Arg, Lys, Gin nebo Asn; a/nebo Asp zbytek v pozici 334 byl nahrazen Glu; a/nebo Ser zbytek v pozici 336 byl nahrazen Gly.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 nebo Lys zbytek v pozici 337 nebo Asp zbytek v pozici 334 nebo Ser zbytek v pozici 336 jediným aminokyselinovým zbytkem, který byl nahrazen.

V dalším zpracování byl Val zbytek v pozici 158 a Glu zbytek v pozici 296 a Met zbytek v pozici 298 jedinými aminokyselinovými zbytky, které byly nahrazeny.

V dalším zpracování byl poměr mezi aktivitou varianty podle vynálezu a aktivity nativního polypeptidu faktoru VII v SEQ ID NO:1 testované ve zde definovaném ,,ln Vitro hydrolyzačním rozboru“ alespoň 1,25. V jiném zpracování byl poměr alespoň 2,0; v dalším zpracování alespoň 4,0.

V dalším zpracování nebyl Gin zbytek v pozici 312 v proteinázové doméně nahrazen.

V dalším zpracování byly rekombinantní hostitelské buňky savčího původu. V dalším zpracování byly buňky vybírány ze skupiny zahrnující CHO buňky, BHK buňky nebo HEK buňky.

V dalším zpracování bylo alespoň 20 přídavných aminokyselinových zbytků ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně (pozice 153 až 406) nahrazeno. V jednom zpracování bylo nahrazeno nanejvýš 15 přídavných aminokyselinových zbytků; v dalším zpracování bylo nahrazeno nanejvýš 10 aminokyselinových zbytků; v dalším zpracování bylo nahrazeno nanejvýš 5 aminokyselinových zbytků.

• · ···· ·· • · · · · · ·· · • · · · ···· · * · .- ······ ···· · ······ ····· • · · · ·· ··· · · ··

V dalším zpracování, jeden nebo více aminokyselinových zbytků v pozicích 157, 337, 158, 296, 298, 334 nebo 336 je jediným aminokyselinovým zbytkem, který byl nahrazen.

V dalším zpracování, jeden nebo více Lys zbytků v pozicích 157 a v pozici 337 byl nahrazen neutrálním aminokyselinovým zbytkem, nebo jeden ze zbytků byl nahrazen negativně nabitým aminokyselinovým zbytkem, nebo jeden Lys zbytek byl nahrazen neutrálním aminokyselinovým zbytkem a jeden Lys zbytek byl nahrazen negativně nabitým aminokyselinovým zbytkem.

V dalším zpracování byl jeden nebo více Asp zbytků v pozici 334 a Ser zbytek v pozici 336 nahrazen aminokyselinovým zbytkem, který je schopny vytvářet vodíkové můstky a/nebo vytvářet můstky solí, nebo jeden nebo oba zbytky jsou nahrazeny malým aminokyselinovým zbytkem.

V dalším zpracování, Lys zbytek v pozici 157 a/nebo Lys zbytek v pozici 337 je jediným aminokyselinovým zbytkem, který byl nahrazen. V jednom zpracování byl nahrazen Lys zbytek v pozici 157. V jiném zpracování byl nahrazen Lys zbytek v pozici 337.

V dalším zpracování, Val zbytek v pozici 158 a/nebo Met zbytek v pozici 298 je jediným aminokyselinovým zbytkem, který byl nahrazen.

V dalším zpracování, Asp zbytek v pozici 334 a/nebo Ser zbytek v pozici 336 je jediným aminokyselinovým zbytkem, který byl nahrazen.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným z Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp a Gin. V jiném zpracování byl Lys zbytek v pozici 157 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným ze skupiny obsahující Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V dalším zpracování byl Lys zbytek v pozici 337 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným z Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp nebo Gin. V jiném zpracování byl Lys zbytek v pozici 337 nahrazen Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp nebo Glu.

V dalším zpracování byl Val zbytek v pozici 158 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným z Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp a Gin. V jiném zpracování byl Val zbytek v pozici 158 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným ze skupiny obsahující Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V dalším zpracování byl Glu zbytek v pozici 296 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným z Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp nebo Gin. V jiném zpracování byl zbytek nahrazen Arg, Lys nebo Val.

• · · · • · • · • · · ·

1/- ······ ···· ·

ΙΟ ······ ····· ·· ·· ·· <·· · · ··

V dalším zpracování byl Met zbytek v pozici 298 nahrazen aminokyselinovým zbytkem vybíraným z Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Glu, Asp nebo Gin. V jiném zpracování byl zbytek nahrazen Lys, Arg, Gin nebo Asn.

V dalším zpracování byl Asp zbytek v pozici 334 nahrazen Gly a Glu.

V dalším zpracování byl Ser zbytek v pozici 336 nahrazen Gly a Glu.

V dalším zpracování podle vynálezu byl poměr mezi aktivitou varianty podle vynálezu a aktivitou původního polypeptidu faktoru VII mající sekvenci SEQ ID NO:1 testované ve zde definovaném „In Vitro hydrolyzačním rozboru“ alespoň 1,25 (příklad 11). V jiném zpracování byl poměr alespoň 2,0; v dalším zpracování alespoň 4,0.

Z dalšího hlediska poskytuje vynález varianty FVII, které zvyšují aktivitu nezávislou na tkáňovém faktoru ve srovnání s nativním FVIIa. V jednom zpracování není zvýšená aktivita doprovázena změnami v substrátové specifičnosti. V jednom zpracování není zhoršena vazba variant na tkáňový faktor (ve srovnání s běžným typem FVIIa); v jiném zpracování mají varianty aktivitu alespoň jako běžný typ faktoru Vila, když je vázán na tkáňový faktor.

V dalším zpracování mají varianty faktoru VII, navíc kjiž zaměněným aminokyselinám v pozicích 157, 158, 296, 298, 334, 334, 336 nebo 337 a případným zaměněným aminokyselinám někde v proteinázové doméně, také zaměněny některé aminokyselinové zbytky v N-terminální Gla doméně (zbytky 1 až 37). V jednom zpracování je jeden nebo více aminokyselinových zbytků v pozicích 10 a 32 (týká se SEQ ID NO:1) faktoru VII zaměněn jiným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny.

V jednom zpracování je aminokyselinový zbytek Pro v pozici 10 nahrazen Gin, Arg, His, Gin, Asn nebo Lys; a/nebo aminokyselinový zbytek Lys v pozici 32 je nahrazen Glu, Gin nebo Asn.

V přítomném přesném popisu jsou aminokyseliny znázorněny zkratkami, tak jak je naznačeno v tabulce 1, které jsou schváleny IUPAC-IUB komisí pro biochemické názvosloví (CNB). Aminokyseliny a jejich izomery znázorněné jménem nebo následujícími zkratkami jsou v přírodní L-formě, pokud není vyznačeno jinak. Dále, levý a pravý konec aminokyselinové sekvence peptidů představuje N- a C-terminální konec, pokud není vyznačeno jinak.

• · · · ·· · · ···· • · · · · · • · · · ···· • · ··· · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ···

Tabulka 1: Zkratky aminokyselin:

aminokyselina	třípísmenný kód	jednopísmenný kód
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	Ile	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Fenylalanin	Phe	F
Tyrosin	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	W
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gin	Q
Asparagin	Asn	N
Kyselina glutamová	Glu	E
Kyselina asparagová	Asp	D
Serin	Ser	S
Threonin	Thr	T

Bylo zjištěno, že varianty FVII, kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek Lys 157, Val 158, Met298, Asp334, Ser336 nebo Lys337 (a popřípadě jeden nebo více přídavných zbytků) je nahrazen odlišným aminokyselinovým zbytkem, mají koagulační aktivitu.

Zbytky jsou umístěny v oblasti, která je považována za ovlivňující přidání aminového konce proteinázové domény a tím i tvorbu katalyticky aktivní struktury faktoru Vila, který je závislý na vazbě solí mezi terminální aminovou skupinou Hel53 a postraním řetězcem Asp343. Záměny mohou odstranit elektrostatické odpory, přidat vodíkové můstky nebo jinak usnadnit přidání aminového konce.

Díky vyšší vlastní aktivitě popisované varianty faktoru Vila ve srovnání s původním faktorem Vila se očekává, že nižší dávka je přiměřená pro získání funkčně dostatečné koncentrace v místě působení a tím bude možné subjektu s krvácejícími příhodami nebo při nutnosti posílení normálního hemostatického systému podávat nižší dávku.

Jak bylo diskutováno výše, předpokládá se, že nahrazením jednoho nebo více Lys zbytků v pozici 157 a Lys zbytku v pozici 337 a Val zbytku v pozici 158 a Glu zbytku v pozici 296 a Met zbytku v pozici 298 a Asp zbytku v pozici 334 a Ser zbytku v pozici 336, dosáhne faktor Vila samovolně aktivnější struktury, která musí být normálně vyvolána tkáňovým faktorem.

• · · · ·· ·· ···· ·· ···· ··· · · * ·· · «· · · · · · · · · · • · ··· · ··· · · ······ ····· ·· ·· ····· ·· ··

Takové varianty faktoru Vila vykazují vlastní aktivitu, která může být léčebně použitelná v situacích, kdy prokoagulační aktivita je nezávislá na tkáňovém faktoru (tvorba faktoru Xa na povrchu krevních destiček), jako například, když jsou podávány vysoké dávky NovoSeven®. Nahrazení přídavných aminokyselinových zbytků v proteinázové doméně, navíc k účinku získanému nahrazením jednoho nebo více Lys zbytku v pozici 157 a Lys zbytku v pozici 337 a Val zbytku v pozici 158 a Glu zbytku v pozici 296 a Met zbytku v pozici 298 a Asp zbytku v pozici 334 a Ser zbytku v pozici 336, dále usnadňuje tvorbu aktivní struktury molekuly. Nicméně se předpokládá, že nejvýraznější účinky budou zjištěny, když výše zmiňované mutace budou provedeny v sousedství (následné nebo trojrozměrné) těchto sedmi zbytků.

Nahrazení několika aminokyselinových zbytků v N-terminální Gla doméně (zbytky 1 až 37) faktoru VII může poskytnout protein s podstatně vyšší afinitou pro membránové fosfolipidy, jako jsou membránové fosfolipidy na buňkách s tkáňovým faktorem nebo na krevních destičkách. Tak mohou výše zmiňované varianty faktoru VII, navíc již provedené záměně aminokyselin v pozicích 157, 158, 296, 298, 334, 336 nebo 337 a k případným záměnám aminokyselin jinde v proteinázové doméně, mít také některé aminokyselinové zbytky nahrazeny v N-terminální Gla doméně, a tím získat protein mající zvýšenou aktivitu stejně tak jako zvýšenou afinitu pro membránové fosfolipidy ve srovnání s nativním faktorem VII. Výhodně mohou být nahrazeny aminokyselinové zbytky v pozicích 10 a 32 (týká se SEQ ID NO:1) ve faktoru VII jiným aminokyselinovým zbytkem, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny. Příklady výhodných aminokyselinových zbytků, které jsou vmezeřeny ve výše zmiňovaných pozicích jsou: Aminokyselinový zbytek Pro v pozici 10 je nahrazen Gin, Arg, His, Gin, Asn nebo Lys; a/nebo aminokyselinový zbytek Lys v pozici 32 je nahrazen Glu, Gin nebo Asn.

Pro náhradu mohou být použity také jiné zbytky v Gla doméně, které jsou založeny na různých fosfolipidových afinitách a sekvencích plasmatických proteinů závislých na vitamínu K.

V širší souvislosti zde byly použity třípísmenné zkratky aminokyselin v jejich běžném významu. Pokud není jasně vyznačeno, jsou zde zmiňované aminokyseliny L-aminokyseliny.

Pojem „N-terminální Gla doména“ znamená aminokyselinovou sekvenci 1 až 37 v FVII.

Pojem „proteinázová doména“ znamená aminokyselinovou sekvenci 153 až 406 v FVII (těžký řetězec FVIIa).

Třípísmenná zkratka „Gla“ znamená 4-karboxyglutamová kyselina (γ-karboxyglutamát).

Pojem „neutrální aminokyselinový zbytek“ (při pH 6 až 8) představuje aminokyseliny vybírané z Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin.

Pojem „malá aminokyselina“ představuje aminokyseliny vybírané z Gly, Glu a Ala.

« · · · ··· ··· ·· · • · · · ···· · · · _ln ······ ···· ·

IV ······ ····· »· · · ·· · · · · · ··

Pojem „negativně nabitý aminokyselinový zbytek“ (při pH 6 až 8) představuje aminokyseliny vybírané z Asp a Glu.

Zde užívaný pojem „polypeptid faktoru VII“, představuje jakýkoliv protein mající aminokyselinovou sekvenci 1 až 406 nativního lidského faktoru VII (SEQ ID NO:1) nebo její varianty. To zahrnuje lidský faktor VII, lidský faktor Vila a jejich varianty.

Zde užívaný pojem „faktor VII“ představuje neaktivní jednořetězcový zymogen faktor VII, stejně tak jako aktivovanou dvouřetězcovou molekulu faktoru VII (faktor Vila). Zahrnuje proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 406 nativního lidského faktoru VII nebo faktoru Vila. Dále zahrnuje proteiny s mírně pozměněnou aminokyselinovou sekvencí, například, pozměněný N-terminální konec zahrnující odstraňování nebo přidávání na Nterminálním aminokyselinovém konci, pokud si tyto proteiny v podstatě ponechají aktivitu faktoru Vila. Zde užívaný pojem „faktor Vila“ nebo „FVII“, znamená produkt skládající se z aktivní formy (faktor Víla). „Faktor VII“ nebo „faktor Víla“ v rámci výše zmíněné definice může zahrnovat přírodní alelické variace, které mohou existovat a vyskytovat se u jednoho i druhého jedince. Dále se může lišit stupeň a místo glykosylace nebo jiné post-translační změny v závislosti na vybraných hostitelských buňkách a povaze hostitelského buněčného prostředí.

Zde užívaný pojem „varianta“ nebo „varianty“ představuje faktor VII mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde jedna nebo více aminokyselin původního proteinu bylo nahrazeno jinou aminokyselinou, a/nebo kde jedna nebo více aminokyselin původního proteinu bylo odstraněno, a/nebo kde jedna nebo více aminokyselin bylo vloženo do proteinu, a/nebo kde jedna nebo více aminokyselin bylo přidáno k původnímu proteinu. Toto přidání může probíhat jak na N-terminálním konci nebo na C-terminálním konci původního proteinu, nebo na obou. „Varianta“ nebo „varianty“ v rámci této definice mají FVII aktivitu ve své aktivované dvouřetězcové molekulové formě. V jednom zpracování je varianta v 65 % identická se sekvencí SEQ ID NO:1. I jiném zpracování je varianta v 80 % identická se sekvencí SEQ ID NO:1. V dalším zpracování je varianta v 90 % identická se sekvencí SEQ ID NO:1. V dalším zpracování je varianta v 95 % identická se sekvencí SEQ ID NO:1.

Zde používaný pojem „konstrukt kyseliny nukleové“ představuje jakoukoli molekulu nukleové kyseliny cDNA, genomovou DNA, syntetickou DNA, polosyntetickou DNA, může být původem RNA nebo míchaného původu. Pojem „konstrukt“ představuje segment kyseliny nukleové, který může být jedno nebo dvouřetězcový, a může být založen na celkové nebo částečné přirozeně se vyskytující sekvenci kódující polypeptid. Konstrukt může popřípadě obsahovat jiné segmenty nukleové kyseliny. Podobně, pojem „aminokyselinový zbytek, který může být kódován konstrukty nukleové kyseliny“ zahrnuje aminokyselinové zbytky, které mohou být kódovány ···· · · ·· ···· ·· ···· ··· ··· · · · • · · · ···· · · · ·· ··· · ··· · · on r · · · · · ·····

Ζυ · · · · ·· ··· ·· ·· konstrukty kyseliny nukleové, tak jak je definováno výše, tj. aminokyseliny jako jsou Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp a Gin.

Zde používaný pojem „odlišná aminokyselina“ znamená aminokyselinu, která je odlišná od aminokyseliny přirozeně se vyskytující v této pozici. To zahrnuje aminokyseliny, které mohou být kódovány konstrukty nukleové kyseliny. Nejvhodněji je odlišná aminokyselina v přírodní L-formě a může být kódována konstruktem nukleové kyseliny. Specifickým příkladem je L-cystein (Cys).

V přítomné souvislosti pojem „léčba“ zahrnuje jak prevenci očekávaného krvácení ve spojitosti s chirurgií, tak i regulaci již probíhajícího krvácení, při traumatu, z důvodu potlačení nebo snížení krvácení. Preventivní podávání varianty faktoru Vila podle vynálezu je také zahrnuto v pojmu „léčba“.

Zde používaný pojem „aktivita“ znamená schopnost polypeptidu faktoru VII nebo jeho varianty přeměnit jeho substrát faktor X na aktivní faktor Xa. Aktivita polypeptidu faktoru VII může být měřena „In Vitro proteolytickým rozborem“. Pojem „základní aktivita“ také zahrnuje schopnost tvořit trombin na povrchu aktivovaných krevních destiček v nepřítomnosti tkáňového faktoru. Pojem „podpora normálního hemostatického systému“ znamená podporu schopnosti tvořit trombin.

Zde používaný pojem „porucha krvácení“ odráží jakoukoli poruchu, vrozenou, získanou nebo vyvolanou, buněčného nebo molekulárního původu, která se projevuje krvácením. Příkladem jsou poruchy srážecího faktoru (např. hemofilie A a B nebo nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII), inhibitory koagulačního faktoru, špatná funkce krevních destiček, trombocytopenie nebo von Willebrandova choroba.

Pojem „krvácivé příhody“ představuje nekontrolovatelné nebo nadměrné krvácení, které je hlavním problémem ve spojitosti s chirurgií a dalšími formami tkáňového poranění. Nekontrolovatelné a nadměrné krvácení se může vyskytovat u subjektů s normálním koagulačním systémem a u subjektů s poruchami koagulaci nebo krvácení. Nedostatek koagulačních faktorů (hemofilie A a B, nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII) nebo inhibitory koagulačního faktoru mohou být příčinou poruch krvácení. Nadměrná krvácení se vyskytují u subjektů s normálně fungující krevní koagulační kaskádou (žádný nedostatek koagulačního faktoru nebo inhibitory proti koagulačním faktorům) a mohou být způsobeny špatnou funkcí krevních destiček, trombocytopenií nebo von Willebrandovou chorobou. V těchto případech mohou být krvácení přirovnány k těm krvácením, které jsou způsobeny hemofilií, neboť hemostatický systém, jako při hemofilií, nemá, nebo má nenormální nezbytné koagulační „složky“ (jako jsou krevní destičky nebo von Willebrandův faktor), které způsobují závažná • · · · · · ··· ··· ·· · ·· · · ···· · · ·

-)1 ······ ···· « ······ ····· • · · · ·· · · · · · ·· krvácení. U subjektů s nadměrným tkáňovým poškozením ve spojitosti s chirurgií nebo rozsáhlým trauma může být normální hemostatický mechanismus ochromený nárokem bezprostředního zastavení krvácení a může dojít ke krvácení namísto normálního hemostatického mechanismu. Dosažení dostatečné zástavy krvácení je také problém při krvácení vyskytující se v orgánech, jako je mozek, oblast středního ucha a oči, kde je omezená možnost chirurgické zástavy krvácení. Stejný problém může nastat při odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, nádorová tkáň, gastrointestinální trakt), stejně tak jako při laparoskopické chirurgii. Při všech těchto situacích je těžké zajistit zastavení krvácení chirurgickými technikami (stehy, svorky, apod.), což je také v případě, kdy je krvácení rozšířené (krvácející gastritida a nadměrné děložní krvácení). Akutní a nadměrná krvácení se mohou vyskytovat také u subjektů podstupující protisrážlivou léčbu, kde bylo podstoupenou léčbou vyvolána špatná srážlivost krve. Tyto subjekty potřebují chirurgický zásah, v případě, že protisrážlivý účinek musí být rychle neutralizován. Pro subjekty s lokalizovanou rakovinou prostaty je radikální odstranění prostaty běžně používaným postupem. Operace je velmi často komplikována značnou až někdy masivní ztrátou krve. Značná ztráta krve během odstranění prostaty se týká hlavně komplikované anatomické situace s různými hustě cévnatými místy, která nejsou snadná pro udržení chirurgické zástavy krvácení, a která mohou vyústit v rozsáhlé krvácení z velké oblasti. Jiná situace, která může představovat problémy v nedostatečném zastavení krvácení, může nastat, když subjekt s normálním hemostatickým mechanismem podstupuje protisrážlivou léčbu pro prevenci tromboembolického onemocnění. Tato léčba může zahrnovat heparin, jiné formy proteoglykanů, warfarin nebo jiné formy antagonistů vitamínu K, stejně tak jako aspirin a jiné inhibitory shlukování krevních destiček.

V jednom zpracování podle vynálezu může být krvácení spojováno s hemofilií. V jiném zpracování je krvácení spojováno s hemofilií s inhibitory. V jiném zpracování je krvácení spojováno s trombocytopenií. V jiném zpracování je krvácení spojováno s von Willebrandovou chorobou. V jiném zpracování je krvácení spojováno s různým poškozením tkáně. V jiném zpracování je krvácení spojováno s různým traumatem. V jiném zpracování je krvácení spojováno s chirurgií. V jiném zpracování je krvácení spojováno s laparoskopickou chirurgií.

V jiném zpracování je krvácení spojováno s krvácivou gastritidou. V jiném zpracování je krvácením rozsáhlé děložní krvácení. V jiném zpracování je krvácení vyskytující se v orgánech s omezenou možností mechanického zastavení krvácení. V jiném zpracování je krvácení vyskytující se v mozku, v oblasti středního ucha nebo očí. V jiném zpracování je krvácení spojováno s postupem odebírání biopsií. V jiném zpracování je krvácení spojováno s protisrážlivou léčbou.

···· ·· ·· ···· · · ···· • · · ··· ·· · ·· · · ···· · · · ·· ··· · ··· · · η-) ·····« ·····

4.4. «· ··«·· ·· ··

Zde používaný pojem „subjekt“ představuje jakéhokoliv živočicha, obzvláště savce, jako jsou lidé, á kde je to vhodné, může být zaměnitelně použit pojem „pacient“.

Zde používaný pojem „vhodné růstové médium“ představuje médium obsahující živiny a jiné složky nutné pro růst buněk a expresi nukleové sekvence kódující variantu faktoru VII podle vynálezu.

Příprava variant faktoru VII

Zde popisované varianty faktoru VII mohou být produkovány pomocí technik rekombinantní kyseliny nukleové. Obecně, klonovaná sekvence nukleové kyseliny původního typu faktoru VII je pozměněna tak, že kóduje požadovaný protein. Tato pozměněná sekvence je poté vložena do expresního vektoru, který je transformován nebo transfektován do hostitelských buněk. Nej vhodnějšími hostitelskými buňkami jsou vyšší eukaryotické buňky, zvláště kultivované savčí buňky. Jsou známy kompletní nukleotidové a aminokyselinové sekvence lidského faktoru VII (viz US 4 784 950, kde je popsáno klonování a exprese rekombinantního lidského faktoru VII). Sekvence hovězího faktoru VII je popsána vTakeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)).

Úpravy aminokyselinových sekvencí mohou být prováděny různými technikami. Změna sekvence nukleové kyseliny může být provedena místně specifickou mutagenezí. Techniky pro místně specifické mutageneze jsou velmi dobře známé v současném stavu techniky a jsou popsány například vZoller and Smith (DNA 3:479-488, 1984) nebo v „Splicing by extension overlap“, Horton et al., Gene 77, 1989, str. 61-68. Změny mohou být prováděny podle vlastní volby na nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci faktoru VII. Podobně, způsoby přípravy DNA konstruktu při použití polymerázové řetězcové reakce a specifických primerů jsou velmi dobře známy odborníkům v současném stavu techniky (PCR Protocols, 1990, Academie Press, San Diego, Califomia, USA).

Konstrukt kyseliny nukleové kódující variantu faktoru VII podle vynálezu může být vhodně genomického nebo cDNA původu, například může být získán přípravou genomové nebo cDNA knihovny a nalezením DNA sekvence kódující všechny nebo část polypeptidu hybridizací, s použitím syntetických oligonukleotidových značek podle standardních technik (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Konstrukt nukleové kyseliny varianty faktoru VII může být připraven synteticky zavedenými standardními metodami, např. fosfoamiditovou metodou popsanou v Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, nebo způsobem popsaným v Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. Podle fosfoamiditové metody jsou oligonukleotidy syntetizovány, • · např. v automatickém DNA syntezátoru, pak vyčištěny, spojovány a klonovány do vhodných vektorů.

Navíc, konstrukt kyseliny nukleové může být smíchaného syntetického a genomového, smíchaného syntetického a cDNA nebo smíchaného genomového a cDNA původu, který je podle standardních technik připraven spojením fragmentů syntetického, genomového nebo cDNA původu (podle vhodnosti), fragmentů odpovídajících různým částem celého konstruktu nukleové kyseliny.

Nejvhodněji je konstruktem nukleové kyseliny DNA konstrukt.

DNA sekvence pro produkci variant faktoru VII podle navrhovaného vynálezu, bude typicky kódovat pre-propolypeptid na aminovém konci faktoru VII, aby došlo ke vhodnému posttranslačnímu zpracování (např. gamma karboxylace zbytků glutamové kyseliny) a pro sekreci z hostitelských buněk. Pre-propolypetid může být faktor VII nebo jiný plazmatický protein závislý na vitamínu K, jako je faktor IX, faktor X, protrombin, protein C nebo protein S. Odborníci v současném stavu techniky ocení, že přídatné změny mohou být v aminokyselinové sekvenci variant faktoru VII provedeny tam, kde tyto změny významně neovlivňují schopnost proteinu působit jako srážedlo. Například, varianty faktoru VII mohou být také pozměněny v aktivačním štěpném místě, aby došlo k inhibici přeměny zymogenu faktoru VII na jeho aktivovanou dvouřetězcovou formu, jak je obecně popsáno v US 5 288 629.

Expresní vektory pro použití u variant expresního faktoru Vila budou obsahovat promotor schopný řízené transkripce klonovaného genu nebo cDNA. Nej vhodnější promotory pro použití v kultivovaných savčích buňkách zahrnují virové promotory a buněčné promotory. Virové promotory zahrnují SV40 promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981) a CMV promotor (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985). Zvláště vhodným virovým promotorem je hlavní pozdní promotor z adenoviru 2 (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). Buněčné promotory zahrnují myší kappa genový promotor (Bergman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) a myší NH promotor (Loh et al.. Cell 33:85-93, 1983). Zvláště vhodným buněčným promotorem je myší metalothionein-I promotor (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983). Expresní vektory mohou také obsahovat sadu RNA sestřihových míst umístěných ve směru od promotoru a proti směru od místa vložení samotné sekvence faktoru VII. Nejvhodnější RNA sestřihová místa mohou být získána z adenoviru a/nebo z imunoglobulinových genů. Expresní vektory obsahují také polyadenylační signál, který je umístěn ve směru místa vložení. Nejvhodnější polyadenylační signály zahrnují časný nebo pozdní polyadenylační signál z SV40 (Kaufman and Sharp), polyadenylační signál z adenoviru 5 Elb oblasti, terminátor genu pro lidský růstový hormon (DeNoto et al., Nucl. Acids Res. 9:3719• · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · ·

-3730, 1981) nebo polyadenylační signál z genu pro lidský faktor VII nebo genu pro hovězí faktor VII. Expresní vektory mohou také zahrnovat nekódující virovou vedoucí sekvenci, jako je třísložková vedoucí sekvence adenoviru 2, umístěná mezi promotorem a místy sestřihu RNA; a sekvenci zesilovačů, jako je zesilovač SV40.

Klonované sekvence DNA jsou vloženy do kultivovaných savčích buněk, například transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456467, 1973) nebo elektroporací (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). Pro rozpoznání a výběr buněk, které exprimují cizí DNA, je obyčejně do buněk vedle genu nebo cDNA, který nás zajímá, vložen také gen s volitelným fenotypem (volitelný znak). Nejvhodnější volitelné znaky poskytují geny, které udělují odolnost proti léčivům, jako je neomycin, hygromycin a methotrexát. Volitelným znakem může být zesilovací volitelný znak. Nejvhodnějším zesilovacím volitelným znakem je sekvence dihydrofolát reduktázy (DHFR). Volitelné znaky jsou popisovány v Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, zde začleněn odkazem). Odborník v současném stavu techniky snadno vybere vhodné volitelné znaky.

Volitelné znaky mohou být do buněk zavedeny na samostatném plazmidu ve stejnou dobu jako gen zájmu, nebo mohou být zavedeny na stejném plazmidu. Jestliže jsou zavedeny na stejném plazmidu, mohou být volitelný znak a gen zájmu řízeny různými promotory nebo stejným promotorem, s pozdějším uspořádáním za vzniku dicistronního produktu. Konstrukty tohoto typu jsou v současném stavu techniky známy (například, Levinson and Simonsen, US 4 713 339). Výhodné může být také přidání přídatné DNA, známé jako „nosičová DNA“, ke směsi, která je vložena do buněk.

Poté co buňky přijmou DNA, jsou kultivovány ve vhodném růstovém médiu pro expresi žádaného genu, typicky 1 až 2 dny. Médiem použitým pro kultivaci buněk může být jakékoliv konvenční médium vhodné pro růst hostitelských buněk, jako jsou jednoduchá nebo složitá média obsahující vhodné doplňky. Vhodná média jsou dostupná od komerčních dodavatelů, nebo mohou být připravena podle publikovaných návodů (např. v katalozích American Type Culture Collection). Média jsou připravována postupy známými v současném stavu techniky (viz např. odkazy pro bakterie a kvasinky; Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academie Press, CA, 1991). Růstová média obyčejně obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, esenciální cukry, vitamíny, soli, fosfolipidy, proteiny a růstové faktory. Pro produkci variant gamma karboxylovaného faktoru VII médium obsahuje vitamín K, nejvhodněji v koncentraci 0,1 mg/ml až 5 mg/ml. Poté je použito určité léčivo pro omezení růstu buněk, které exprimují vybraný znak stálým způsobem. Pro buňky, které byly transfektovány s zesjleným vybraným znakem, by měla být koncentrace léčiva zvýšena pro zvýšený počet kopií klonované sekvence, a tím i zvýšení hladiny exprese. Klony stabilně transfektovaných buněk jsou poté kontrolovány pro expresi požadované varianty faktoru VII.

Nejvhodnější savčí buněčné linie zahrnují CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), buňky ledvin křečků (BHK) a 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) buněčné linie. Nej vhodnější BHK buněčnou linií je tk’ tsl 3 BHK buněčná linie (Waechter and Baserga, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), dále používaná jako BHK 570 buněčná linie. BHK 570 buněčná linie je dostupná od American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, pod ATCC katalogovým číslem CRL 10314. Tk' tsl3 BHK buněčná linie je také dostupná od ATCC pod katalogovým číslem CRL 1632. Dále může být použito mnoho dalších buněčných linií, jako je Rat Hep I (krysí nádorové buňky jater; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (krysí nádorové buňky jater; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), buňky lidských plic (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9,1) a DUKX buňky (Urlaub and Cahsin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

K přípravě variant faktoru VII podle vynálezu může být použita technologie transgenních zvířat. Nejvhodnější je produkovat proteiny v savčích žlázách hostitelské savčí samice. Exprese v savčích žlázách a následná sekrece požadovaného proteinu do mléka překonává mnoho potíží, které se vyskytují při izolaci proteinů z jiných zdrojů. Mléko je snadno sbíráno, je dostupné ve velkém množství aje biochemický dobře charakterizováno. Navíc, hlavní proteiny mléka jsou v mléce přítomny ve vysokých koncentracích (typicky 1 až 15 g/1).

Z komerčního hlediska je jasné, že nejvhodnější je použití takových hostitelských druhů, které dávají vysoký mléčný výtěžek. I když mohou být používány menší zvířata, jako jsou myši a krysy (a jsou vhodné z hlediska teorie), je vhodné použít hospodářská zvířata, která především zahrnují prasata, kozy, ovce a dobytek. Ovce jsou obzvláště vhodné kvůli dříve zmiňovaným faktorům, jako je průběh transgeneze u těchto druhů, výtěžek mléka, cena a okamžitá dostupnost zařízení pro sběr ovčího mléka (viz například, WO 88/ 00239 pro srovnání faktorů ovlivňujících výběr hostitelských druhů). Obecně je vyžadováno vybírat chov hostitelských zvířat, které jsou chovány pro denní použití, jako je East Friesland ovce, nebo získat mléčné zásoby chovem transgenní linie v pozdější době. V každém případě, měla by být používána známá a zdravá zvířata.

Pro dosažení exprese v savčí žláze je používán transkripční promotor z genu mléčného proteinu. Geny pro mléčný protein zahrnují geny kódující kaseiny (viz US 5 304 489), beta-laktoglobulin, a-laktalbumin, a syrovátkový kyselý protein. Nejvhodnější je promotor beta-laktoglobulinu • · · «·* ·· · • · · · » · · · · · · • · ··· · ··· · · ······ ····· ·· ·· · · ··· ·· ·· (BLG). V případě genu ovčího beta-laktoglobulinu bude obyčejně použita oblast alespoň proximálních 406 bp 5' koncové sekvence genu, ačkoliv jsou vhodnější větší části 5' koncové sekvence, až do 5 kbp, jako je ~4,25 kbp DNA segment obsahující 5' koncový promotor a nekódující část beta-laktoglobulinového genu (viz Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31-39 (1992)). Podobné fragmenty DNA promotoru z jiných druhů jsou také vhodné.

Aby mohly být genomové oblasti genu exprimovány, mohou být do konstruktů vloženy také jiné oblasti beta-laktoglobulinového genu. Obecně je v současném stavu techniky uznáváno, že konstrukty neobsahující introny, například vykazují slabší expresi ve srovnání s konstrukty, které takové DNA sekvence obsahují (viz Brinster et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343; a WO 91/02318, každý zde vložen odkazem). V této souvislosti je obecně vhodné, tam kde je to možné, použít genomovou sekvenci obsahující všechny nebo některé z původních intronů genu kódujících požadovaný protein nebo polypeptid, a tak je vhodné další zařazení alespoň některých intronů z např. beta-laktoglobulinového genu. Jednou takovou oblastí je DNA segment, který umožňuje sestřih intronů a RNA polyadenylaci z 3' nekódující oblasti ovčího beta-laktoglobulinového genu. Když je zaměněna za vlastní 3' nekódující sekvence genu, tento ovčí beta-laktoglobulinový segment zvyšuje a stabilizuje hladinu exprese požadovaného proteinu nebo polypeptidu. V jiných zpracování je oblast obklopující počáteční ATG sekvence varianty faktoru VII zaměněna za odpovídající sekvence z genu mléčného specifického proteinu. Tato záměna poskytuje údajné tkáňově specifické spuštění pro zesílení exprese. Je vhodné nahradit pre-pro a 5' nekódující sekvence celé varianty faktoru VII například sekvencemi BLG genu, ačkoliv mhou být nahrazeny menší oblasti.

Pro expresi variant faktoru VII v transgenních zvířatech může být DNA segment kódující variantu faktoru VII závislý na přídavných DNA segmentech vyžadovaných pro jejich expresi a tvorbu expresních jednotek. Takové přídavné segmenty zahrnují výše zmiňovaný promotor, stejně tak jako sekvence, které poskytují ukončení transkripce a polyadenylaci mRNA. Expresní jednotky budou dále zahrnovat DNA segment kódující sekvenci sekrečního signálu, která je závislá na segmentu kódující pozměněný faktor VII. Sekvence sekrečního signálu může představovat vlastní sekvence sekrečního signálu faktoru VII nebo může být z jiného proteinu, jako je mléčný protein (viz například, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986); a Meade et al., US 4 873 316, které jsou zde vloženy odkazem).

Konstrukce expresních jednotek pro použití v transgenních zvířatech je vhodně provedena vložením sekvence varianty faktoru VII do plazmidu nebo fágového vektoru obsahující přídavné DNA segmenty, ačkoli expresní jednotka může být sestavena v podstatě z jakékoliv sekvence ligací. Obzvláště vhodné je poskytovat vektor obsahující DNA segment kódující mléčný protein a zaměnit kódující sekvenci pro mléčný protein za sekvenci polypeptidu varianty faktoru VII; a tím splynutí genů, které zahrnují expresi kontrolních sekvencí genu mléčného proteinu. V každém případě, klonování expresních jednotek do plazmidů nebo jiných vektorů usnadňuje zdvojení sekvence varianty faktoru VII. Zdvojení probíhá obyčejně v bakteriálních hostitelských buňkách (např. E. coli), a tak vektory budou typicky zahrnovat počátek replikace a volitelný funkční znak v bakteriálních hostitelských buněk. Expresní jednotka je poté vložena do oplodněných vajíček (zahrnující časné zárodky) vybraných hostitelských druhů. Zavedení heterologní DNA může být provedeno jedním z různých způsobů, zahrnující mikroinjekci (např. US 4 873 191), retrovirovou infekci (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) nebo místně řízeným začleněním při použití embryonálních kmenových buněk (ES), (Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Vajíčka jsou poté zasazena do vejcovodů nebo do dělohy pseudogravidních samic a je jim umožněn vývoj do doby porodu. Potomci nesoucí vnesenou DNA ve svých zárodečných buňkách mohou přenést DNA na svoje potomstvo normálním způsobem (podle Mendela), a umožňují vývoj transgenních stád. Základní postupy tvorby transgenních zvířat jsou známy v současném stavu techniky (viz například, Hogan et al., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985) Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-839-8 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); US 4 873 191; US 4 873 316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; a GB 87/00458). Techniky vpravení cizí DNA sekvence do savců a jejich zárodečných buněk byly původně vyvinuty u myši (viz např. Gordon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); a Hogan et al. (tamtéž). Tyto techniky byly následně přizpůsobeny pro použití větších zvířat, které zahrnují také druhy hospodářských zvířat, (viz např., WO 88/00239, WO 90/05188, a WO 92/11757; a Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988)). Pro shrnutí, nejúčinnějším způsobem produkce transgenních myší nebo hospodářských zvířat používaným do dnešní doby, je vpravení spousty různých lineárních molekul požadované DNA do jednoho jádra vajíčka nebo spermatu v oplodněném vajíčku podle stanovených technik. Může být použito také vložení DNA do cytoplazmy zygoty.

Produkce může probíhat také v transgenních rostlinách. Exprese může být všeobecná, nebo může být směřována do konkrétního orgánu, jako je hlíza (viz, Hiatt, Nátuře 344: 469-479 (1990);

• · • ··»· · · · ··· «··· · • · · · · · · ·· ··· ·· · ·

Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12: 449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8: 217-221 (1990); a EP 0 255 378).

Varianty faktoru VII podle vynálezu jsou získávány z buněčné kultury v médiu nebo z mléka. Varianty faktoru VII podle navrhovaného vynálezu mohu být přečištěny mnoha postupy, které jsou známy v současném stavu techniky, které zahrnují chromatografii (např., výměna iontů, afinní, hydrofóbní, chromatofokusace a rozdělení podle velikosti), elektroforetické postupy (např., preparativní izoelektrická fokusace (IEF), diferenciální rozpustnost (např., amonium sulfátové srážení) nebo extrakce (viz. např., Protein Purification, J. C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989). Výhodně mohou být přečištěny afmitní chromatografií na koloně s protilátkami proti faktoru VII. Obzvláště výhodné je použití na vápníku závislých monoklonálních protilátek, jak je popsáno v Wakabayashi et al., J. Bio. Chem. 261: 11097-11108 (1986) a Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793 (1988). Další přečištění může být dosaženo běžnými chemickými čistícími způsoby, jako je vysoce výkonná plynová chromatografie. Další způsoby čištění jsou známy v současném stavu techniky, jako je srážení citrátem barnatým, a mohou být použity pro přečištění zde popisovaných nových variant faktoru VII (viz například, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag. N.Y., 1982).

Pro léčebné účely je výhodné, aby varianty faktoru VII podle vynálezu byly v podstatě čisté. Proto ve vhodném zpracování vynálezu je varianta faktoru VII podle vynálezu přečištěna do alespoň 90 až 95 % stejnorodosti, výhodněji do alespoň 98 % stejnorodosti. Čistota může být stanovena např. geiovou elektroforézou a sekvenováním aminového konce aminokyselin.

Varianta faktoru VII je štěpena v jeho aktivačním místě, aby došlo k jeho přeměně na jeho dvouřetězcovou formu. Aktivace může probíhat podle postupu známých v současném stavu techniky, jako jsou techniky popsané vOsterud et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, US 4 456 591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); nebo Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983). Nebo jinak, jak je popsáno vBjoem et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), faktor VII může být aktivován prostoupením skrze chromatografickou kolonou s výměnou iontů, jako je Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) nebo podobně. Poté může být vytvořena výsledná aktivovaná varianta faktoru VII a může být podávána tak, jak je popsáno níže.

Rozbory

Vynález poskytuje také vhodné rozbory pro výběr výhodných variant faktoru Vila podle vynálezu. Tyto rozbory mohou být provedeny jako jednoduchý předběžný in vitro test.

Takto, příklad 11 zde popisuje jednoduchý test (pojmenovaný „In vitro hydrolyzační rozbor“) aktivity variant faktoru Vila podle vynálezu. Podle toho jsou varianty faktoru Vila, o které je ··· ··« · · · ·· · · ···· · · · • « · · · · · · · · · ···· ·· · ···· ···· ····· ···· konkrétní zájem takové varianty, kde poměr mezi aktivitou varianty a aktivitou přirozeného faktoru VII na obr. 1 nad 1,0, např. alespoň 1,25, výhodně alespoň 2,0, výhodněji alespoň 3,0, nebo nejvýhodněji alespoň 4,0, pokud jsou testovány zde popisovaným „in vitro hydrolyzačním rozborem“.

Aktivita variant může být měřena také při použití fyziologického substrátu, jako je faktor X (In vitro proteolytický rozbor, viz příklad 12), ve vhodné koncentraci 100 až 1000 nM, přičemž vzniklý faktor Xa je měřen po přidání vhodného chromogenního substrátu (př. S-2765). Navíc, rozbor aktivity může probíhat při fyziologické teplotě.

Schopnost variant FVIIa vytvářet trombin může být měřena také rozborem, který obsahuje důležité koagulační faktory a inhibitory ve fyziologických koncentracích (bez faktoru VII pří napodobování podmínek hemofilie A) a aktivované krevní destičky (jak je popsáno na str. 543 v Monroe et al. (1997), Brit. J. Haematol. 99, 542-547, které jsou zde zařazeny jako odkaz). Podávání a léčebná složení

Varianty faktoru VII podle navrhovaného vynálezu mohou být používány pro kontrolu poruch krvácení, které mají různé příčiny, jako je nedostatek koagulačního faktoru (např. hemofilie A a B nebo nedostatek koagulačních faktorů XI nebo VII) nebo inhibitory koagulačního faktoru, nebo mohou být použity pro kontrolu nadměrného krvácení, které se vyskytuje u subjektů s normálně fungující krevní koagulační kaskádou (žádné nedostatky koagulačního faktoru nebo inhibitory proti některému z koagulačních faktorů). Takové krvácení může být například způsobeno špatnou funkcí krevních destiček, trombocytopenií nebo Willebrandovou chorobou. Může se vyskytovat také u subjektů, u kterých byla různými podněty navozena zvýšená fibrinolytická aktivita.

U subjektů, u kterých došlo k rozsáhlému poškození tkáně ve spojitosti s chirurgií nebo poškození cév, může být hemostatický mechanismus ochromený nutností nastolení okamžité zástavy krvácení a místo normálního hemostatického mechanismu se může vyvinout krvácení. Dosažení dostatečné zástavy krvácení je také problémem, když ke krvácení dochází v orgánech, jako je mozek, oblast středního ucha a oči a může být také problémem v případech rozšířených krvácení (krvácivá gastritida a silné děložní krvácení), kdy je obtížné určit zdroj. Stejný problém může nastat při odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, nádorová tkáň, gastrointestináltní trakt) stejně tak jako při laparoskopické chirurgii. Při těchto situacích je těžké docílit zástavy krvácení chirurgickými způsoby (švy, svorky atd). Akutní a silná krvácení se mohou také vyskytovat u subjektů na protisrážlivé léčbě, u kterých může být podávanou léčbou navozena špatná zástava krvácení. Tyto subjekty, v případě, že musí být protisrážlivý účinek nastolen rychle, potřebují chirurgický zásah. Jiná situace, která může způsobovat problémy v případě • * · ··«. · · · • · · · ···· · · ·

-> z-l ·········· «.

······ ····· • · · · ·· ··· ·· ·· nedostatečné zástavy krvácení, představuje subjekty s normálním hemostatickým mechanismem, který< podstupuje protisrážlivou léčbu pro prevenci tromboembolického onemocnění. Taková léčba může zahrnovat heparin, další formy proteoglykanů, warfarin nebo jiné formy antagonistů vitamínu K, stejně tak jako aspirin a další inhibitory shlukování krevních destiček.

Systémová aktivace koagulační kaskády může vést k roztroušené intravaskulámí koagulaci (DIC). Nicméně, tyto komplikace nebyly zpozorovány u subjektů léčených vysokými dávkami rekombinantního FVIIa díky místnímu hemostatickému procesu vyvolanému tvorbou komplexu mezi FVIIa a TF, který je vystaven v místě narušení cévní stěny. Varianty faktoru VII podle vynálezu tak mohou být užívány také v jejich aktivované formě, aby tak kontrolovaly nadměrná krvácení ve spojitosti s normálním hemostatickým mechanismem.

Při léčbě spolu se záměrným zásahem budou varianty faktoru VII podle vynálezu typicky podávány během 24 hodin před provedením zásahu, a poté po dobu 7 dní nebo déle. Srážedlo může být podáváno různými způsoby, jak je zde popsáno.

Dávka variant faktoru VII se pohybuje v rozmezí 0,05 mg až 500 mg denně, výhodně 1 mg až 200 mg denně, a výhodněji 10 mg až 175 mg denně, pro 70 kg vážící subjekt jako zátěžové a udržovací dávky, v závislosti na hmotnosti subjektu a na dalších podmínkách.

Léčebné prostředky jsou zamýšleny především pro mimostřevní podávání pro preventivní a/nebo léčebnou kůru. Výhodně, léčebné prostředky jsou podávány mimostřevně, tj., intravenózně, pod kůži nebo nitrosvalově, nebo mohou být podávány plynulou nebo pulsační infuzí. Prostředky pro mimostřevní podávání obsahují variantu faktoru VII podle vynálezu v kombinaci s léčebně vhodným nosičem, nejlépe v něm rozpuštěné, nejlépe ve vodném nosiči. Může být použito množství vodných nosičů, jako je voda, upravená voda, 0,4 % solný roztok, 0,3 % glycine a podobně. Varianty faktoru VII podle vynálezu mohou být také vytvořeny jako lipozómové přípravky pro podávání nebo směrování do míst zranění. Lipozómové přípravky jsou obecně popsány v např. US 4 837 028, US 4 501 728 a US 4 975 282. Prostředky mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami. Výsledné vodné roztoky mohou být baleny pro použití, nebo mohou být za sterilních podmínek fdtrovány a sublimačně sušeny, sublimačně sušené přípravky jsou před podáváním smíchány se sterilním vodným roztokem. Prostředky mohou obsahovat léčebně přijatelné pomocné částice, jak je vyžadováno pro přibližné fyziologické podmínky, jako je upravení pH a vyrovnávající činidla, činidla pro upravení napětí a podobně, například, acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý apod.

Koncentrace varianty faktoru VII v těchto formách se může velmi lišit, tj. může činit méně než 0,5 % hmotnosti, obyčejně alespoň 1 % hmotnosti až do množství 15 nebo 20 % hmotnosti a • * • ·

9 9 9 • · · · · · • · « · · # • · · · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 • · · · ·· ··· bude zvolena především objemem tekutiny, lepkavostí apod., podle zvoleného konkrétního způsobu podávání.

Takto může typický léčebný prostředek pro intravenózní infuzi obsahovat 250 ml sterilního Ringer's roztoku a 10 mg varianty faktoru VII. Konkrétní způsoby přípravy mimostřevně podávaných prostředků budou známy nebo budou zřejmé odborníkům v současném stavu techniky a jsou blíže popsány například v Remington's Rharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Prostředky obsahující varianty faktoru VII podle navrhovaného vynálezu mohou být podávány preventivně a/nebo léčebně. V léčebném využití jsou prostředky podávány subjektu, který již trpí nemocí, jak je popsáno výše, v množství dostatečném pro vyléčení, pro ulehčení nebo částečné zastavení nemoci a jejích komplikací. Množství odpovídající dosažení těchto účinků je definováno jako „léčebně účinné množství“. Odborník v současném stavu techniky bude rozumět, že množství účinné pro tyto účely bude záviset na vážnosti nemoci nebo zranění, stejně tak jako na hmotnosti a celkovém stavu subjektu. Obecně, i když je účinné množství v rozmezí 0,05 mg až 500 mg varianty faktoru VII denně pro 70 kg subjekt, běžně se užívají dávky 1,0 mg až 200 mg varianty faktoru VII denně.

Musíme mít na paměti, že materiály podle navrhovaného vynálezu mohou být obyčejně používány u stavů vážných chorob nebo zranění, což jsou život ohrožující nebo potenciálně život ohrožující situace. V takových případech, vzhledem k minimalizaci cizích částic a nedostatečně imunogenních lidských variant faktoru VII u lidí, je možné a ošetřujícím lékařem také vyžadováno, aby byl podáván podstatný nadbytek prostředků těchto variant faktoru VII.

U preventivního využití jsou prostředky obsahující variantu faktoru VII podle vynálezu podávány subjektu náchylnému nebo jinak ohroženému nemocí nebo zraněním, aby došlo ke zlepšení vlastní schopnosti srážení. Takové množství je definováno jako „preventivně účinná dávka“. U preventivních využití je přesná dávka opět závislá na zdravotním stavu a hmotnosti subjektu, ale dávka se obyčejně pohybuje v rozmezí 0,05 mg až 500 mg denně pro 70 kg subjekt, běžněji 1,0 mg až 200 mg denně pro 70 kg subjekt.

Jednotlivé nebo vícenásobné podávám prostředků může probíhat v dávkách a způsoby podle ošetřujícího lékaře. Pro ambulantně léčené subjekty, kteří vyžadují denní udržovací hladiny mohou být varianty faktoru VII podávány plynulou infuzi s použitím např. přenosného pumpového systému.

Varianty faktoru VII podle navrhovaného vynálezu mohou být použity pro místní podávání, jako je například aktuální použití, například prostřednictvím spreje, postříkáním, dvojitými balónovými katetry, vložením do cévních štěpů, hydrogelů použitých pro pokrytí balónových • · · · ·« tt · · · · · β ♦ · · »·* ·· · » · · · ·*·· » · · * · ··· · · · · · · ···· ·· · ···· • · · · ·· · · · ·· ·· • ·· · katetrů, nebo dalšími zavedenými způsoby. V každém případě by léčebné prostředky měly poskytovat množství variant faktoru VII dostatečných pro účinnou léčbu subjektu.

Navrhovaný vynález je dále doložen následujícími příklady, které nicméně nejsou pojímány jako omezující možnost ochrany. Znaky obsažené v dřívějším popisu a v následujících příkladech mohou, odděleně a v jakékoliv kombinaci, být předlohou pro provedení vynálezu v různých formách.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. 1 znázorňuje celou aminokyselinovou sekvenci původního lidského koagulačního faktoru VII (SEQ ID NO:1).

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Terminologie aminokyselinových záměn užívaná v následujících příkladech je následovně:

První písmeno představuje aminokyselinu přirozeně se vyskytující v pozici SEQ ID NO:1. Následující číslo představuje pozici v SEQ ID NO:1. Druhé písmeno představuje odlišnou aminokyselinu zaměněnou za původní aminokyselinu. Příkladem je M298Q, kde metionin v pozici 298 v SEQ ID NO:1 je nahrazen glutaminem. V jiném příkladě, V158T/M298Q je valin v pozici 158 v SEQ ID NO:1 zaměněn treoninem a metionin v pozici 298 v SEQ ID NO:1 je zaměněn glutaminem ve stejném polypeptidů faktoru VII.

PŘÍKLAD 1.

DNA kódující [V158T/M298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII a [V158D/E296VJ-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298KJ-FVII, [V158D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [S336GJ-FVII, [K337A]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

Konstrukty DNA kódující [V158T/M298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298QJ-FVII a [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298QJ-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [VI 58D/E296V/M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [V 158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII, [S336G]-FVII a [K337AJ-FVII byly připraveny místně řízenou mutagenezi při použití spirálovitého, dvoušroubovicového DNA vektoru s požadovaným inzertem a dvou syntetických primerů obsahující požadovanou mutaci. Byly použity následující dvojice primerů:

Pro [K157A]-FVII:

5-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3' (SEQ ID NO:2)

5-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3' (SEQ ID NO:3) • · · ·

Pro [K158DJ-FVII:

5-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID NO:4)

5-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID N0:5)

Pro [K158TJ-FVII:

5-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID N0:6)

5'-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID NO:7)

Pro [E296V/M298Q]-FVII:

5-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID N0:8)

5-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID N0:9)

Pro [M298Q]-FVII:

5-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO: 10)

5-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID NO:11)

Pro [M298K]-FVII:

-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3' (SEQ ID NO: 12)

5-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID NO: 13)

Pro [S336G]-FVII:

5'-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3' (SEQ ID NO: 14)

5-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3' (SEQ ID NO: 15)

Pro [K337AJ-FVII:

5-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO: 16)

5-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO: 17)

Oligonukleotidově primery, každý komplementární k opačnému řetězci vektoru, byly prodlouženy během teplotních cyklů pomocí Pfu DNA polymerázy. Byl vytvořen mutovaný plazmid obsahující rozložené zářezy. Po teplotních cyklech byl produkt opracován s Dpnl, který je specifický pro metylovanou a polometylovanou DNA, aby došlo k rozštěpení původní molekuly DNA a pro nalezení syntetizované DNA obsahující mutaci.

9·99

Postupy přípravy DNA konstruktu při použití polymerázové řetězové reakce a při použití specifických primerů jsou dobře známy odborníkům v současném stavu techniky (viz. PCR Protocols, 1990, Academie Press, San Diego, Califomia, USA).

PŘÍKLAD 2.

Příprava [V158T/M298QJ-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [V158T/M298Q]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [V158T/M298Q]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [V158T/M298QJ-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 3

Příprava [K157A]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [K157A]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně: Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM ··» 4 ··

4 · · 4

4 4 4

4 4 4 • 4 ·4 •» »·«··

CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [K157A]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [K157AJ-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 4

Příprava [V158D/M298Q]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [V158D/M298QJ-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [V158D/M298QJ-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [V158D/M298Q]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

·«*· ·« > 9 • · ·» ·*·» » · 9 « · · • ····· · · · • * »··· » * · · · β <»·· ·· ·♦ ·· 4Φ· r* ··

PŘÍKLAD 5

Příprava [V158D/M298KJ-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [V158D/M298K]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [V158D/M298K]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [V158D/M298KJ-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca . Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 6

Příprava [V158D/E296V/M298Q]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno drive (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [V158D/E296V/M298Q]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [V158D/E296V/M298Q]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia • ft ftftftft • ft ft··· ···· ftft • ftftft* ·· · • ft · · ftftftft β ft · • ft ftftft · · · · ft · n ······ ftftft··

Jt ·· ftft ·· ··· ·· ftft

Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 rfíM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [V158D/E296V/M298Q]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VIJ v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 7

Příprava [M298QJ-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [M298QJ-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně: Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [M298QJ-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [M298Q]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 8

Příprava [S336G]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [S336G]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidáhí 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [S336GJ-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [S336G]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 9

Příprava [K337A]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány vpodstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [K337A]-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně: Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [K337A]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [K337A]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

···· · ♦ '»· ··· ··* ·· · • · · · ···· · · · • · »·· · · · · · · · · · · ·· · ····

-⁷⁷ ·· · · ι| · · · · · · · ·

PŘÍKLAD 10

Příprava [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII.

BHK buňky byly transfektovány v podstatě tak, jak bylo popsáno dříve (Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby bylo dosaženo exprese varianty [V158D/E296V/M298Q/K337AJ-FVII. Varianta faktoru VII byla přečištěna následovně:

Upravené médium bylo naneseno na 25 ml kolonu Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech), po přidání 5 mM EDTA, 0,1 % Triton-X-100 a 10 mM Tris bylo upraveno pH na 8,0 a vodivost byla upravena na 10 až 11 mS/cm přidáním vody. Protein byl z kolony vymyt nejlépe přechodem od 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 na 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0. Frakce obsahující [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII byly slity dohromady a byly naneseny na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátky F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) navázanými na CNBr-aktivovanou Sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Kolona byla uvedena do rovnováhy 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahující 10 mM CaCl₂, 100 mM NaCl a 0,02 % Triton X-100. Po promytí roztokem udržujícím rovnováhu a roztokem udržujícím rovnváhu obsahujícím 2 M NaCl, byl navázaný materiál vymyt vyvážujícím roztokem obsahujícím 10 mM EDTA místo CaCl₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán přebytek CaCl₂ nad EDTA nebo byl [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII přemístěn do roztoku obsahující Ca²⁺. Výtěžek v každém kroku byl sledován měřením faktoru VII v ELISA testech a přečištěný protein byl analyzován SDS elektroforézou.

PŘÍKLAD 11

In Vitro Hydrolyzační rozbor.

Původní (kontrolní) faktor Vila a varianta faktoru Vila (oba zde používané jako „faktor Vila“) jsou souběžně měřeny pro přímé porovnání jejich specifických aktivit. Rozbor probíhá v mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). K faktoru Vila (konečná koncentrace 100 nM) v 50 mM Hepes, pH 7,4 obsahující 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl₂ a 1 mg/ml hovězí sérový albumin je přidán chromogenní substrát D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Sweden), v konečné koncentraci 1 mM. Je měřena plynule absorbance při 405 nm na SpectraMax™ 340 destičkovém snímači (Molecular Devices, USA). Pro výpočet poměru mezi aktivitami varianty a kontrolního faktoru Vila byla použita absorbance změřená během 20 minut inkubace po odečtení absorbance v kontrolní jamce, která neobsahuje enzym:

Poměr = (A405 _nm varianty faktoru VIIa)/(A₄₀5 nm původního faktoru).

PŘÍKLAD 12

In Vitro proteolytický rozbor.

Původní (kontrolní) faktor Vila a varianta faktoru Víla (oba zde používané jako „faktor Víla“) jsou souběžně měřeny pro přímé porovnání jejich specifických aktivit. Rozbor probíhá v mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Faktor Víla (10 nM) a faktor X (0,8 μΜ) v 50 μΜ Hepes, pH 7,4 obsahující 0,1 M NaCl, 5 mM CaCf a 1 mg/ml hovězí sérový albumin, jsou inkubovbány po dobu 15 min. Štěpení faktoru X je poté zastaveno přidáním 50 μΐ 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahující 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA a 1 mg/ml hovězí sérový albumin. Množství vytvořeného faktoru Xa je měřeno přidáním chromogenního substrátu Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2765, Chromogenix, Sweden), v konečné koncentraci 0,5 mM. Je měřena plynule absorbance při 405 nm na SpectraMax™ 340 destičkovém snímači (Molecular Devices, USA). Pro výpočet poměru mezi proteolytickými aktivitami varianty a kontrolního faktoru Víla byla použita absorbance vyvinutá během 10 minut inkubace po odečtení absorbance v kontrolní jamce, která neobsahuje FVIIa:

Poměr = (A405 nm varianty faktoru VIIa)/(A405 nm přirozeného faktoru).

PŘÍKLAD 13

Poměrné aktivity variant FVIIa měřené v rozborech popisovaných v příkladech 11 a 12.

Varianta Poměr v příkladu 11 Poměr v příkladu 12

K157A	0,9	nebyl stanoveno
V158T/M298Q-FVIIa	3,8	10
V158D/M298Q-FVIIa	2,0	2,7
V158D/M298K-FVIIa	0,3	nebyl stanoven
V158D/E296V/M298Q-FVIIa	7,8	28
M298Q-FVIIa	3,4	5,5
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa	11,0	47
S336G-FVIIa	0,6	nebyl stanoven
K337A-FVIIa	3,9	4,4
kontrolní FVIIa	1,0	1,0

Claims (40)

1. PATENTOVÉ NÁROKY • · ··· · · ·· iv

   1. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57).
2. 2. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ' ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala337).
3. 3. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala334).
4. 4. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala336).
5. 5. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal58).
6. 6. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala296).
7. 7. Polypeptid faktoru VII, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Ala298).
8. 8. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, kde aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
9. 9. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1, 3 až 8, kde aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
10. 10. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2, 4 až 9, kde aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.

    • · · · · · ·· ·· · · ···
11. 11. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, 5 až 10, kde aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
12. 12. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, 6 až 11, kde aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
13. 13. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, 7 až 12, kde aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO.l byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
14. 14. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, 8 až 13, kde aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
15. 15. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kde alespoň jedna aminokyselina ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
16. 16. Polypeptid faktoru VII podle nároku 15, kde nanejvýše 20 přídavných aminokyselin ve zbývajících pozicích v proteinázové doméně bylo nahrazeno odlišnými aminokyselinami.
17. 17. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 15 až 16, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v pozici vybírané z 159 až 170 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
18. 18. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v pozici vybírané z 290 až 312 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
19. 19. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18, kde alespoň jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v pozici vybírané z 330 až 339 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou.
20. 20. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde jedna aminokyselina nezávisle zvolená ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO. l byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; za podmínky, že varianta není FVII(Alal57), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Alal58), FVII(Ala296) nebo FVII(Ala298).

    * • · • · · ·
21. 21. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde dvě aminokyseliny nezávisle zýolené ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.
22. 22. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde tři aminokyseliny nezávisle zvolené ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.
23. 23. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde čtyři aminokyseliny nezávisle zvolené ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.
24. 24. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde pět aminokyselin nezávisle zvolených ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 bylo nahrazeno odlišnými aminokyselinami.
25. 25. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde šest aminokyselin nezávisle zvolených ze skupiny obsahující Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 bylo nahrazeno odlišnými aminokyselinami.
26. 26. Polypeptid faktoru VII, který má sekvenci SEQ ID NO:1, kde aminokyseliny Lys v pozici 157, Lys v pozici 337, Asp v pozici 334, Ser v pozici 336, Val v pozici 158, Glu v pozici 296 a Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byly nahrazeny odlišnými aminokyselinami.
27. 27. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, 20 až 26, kde Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.
28. 28. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 2, 9, 20 až 26, kde Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

    • ·
29. 29. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 3, 10, 20 až 26, kde Asp v pozici 334 v'SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly a Glu.
30. 30. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 4, 11, 20 až 26, kde Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Gly a Glu.
31. 31. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 5, 12, 20 až 26, kde Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.
32. 32. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 6, 13, 20 až 26, kde Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Arg, Lys a Val.
33. 33. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 7, 14, 20 až 26, kde Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byl nahrazen odlišnou aminokyselinou vybíranou ze skupiny obsahující Lys, Arg, Gin a Asn.
34. 34. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, kde aminokyselina byla nahrazena odlišnou aminokyselinou, která může být kódována konstrukty nukleové kyseliny.
35. 35. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34, kde polypeptid faktoru VII je lidský faktor VII.
36. 36. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34, kde polypeptid faktoru VII je lidský faktor Vila.
37. 37. Polypeptid faktoru VII podle nároku 20, přičemž polypeptid faktoru VII je nezávisle zvolen ze skupiny obsahující [E296V]-FVII, [M298Q]-FVII a [S336G]-FVII.
38. 38. Polypeptid faktoru VII podle nároku 21, přičemž polypeptid faktoru Vlije nezávisle zvolen ze skupiny obsahující [V158T/M298QJ-FVII, [E296V/M298QJ-FVII, [V158D/M298QJ-FVII a [V158D/M298KJ-FVII.
39. 39. Polypeptid faktoru VII podle nároku 22, který představuje [V158D/E296V/M298Q]-FVII.

    • · • · ···· · · · ··· · 9·· · • » · · · · · ·· · · · · · · ·

    42,

    43.

    46,

    47.

    Polypeptid faktoru VII podle nároku 23, který představuje [V158D/E296V/M298Q/K337A]FVII.

    Konstrukt kyseliny nukleové, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40.

    Konstrukt kyseliny nukleové podle nároku 41, který představuje vektor.

    Rekombinantní hostitelské buňky, které obsahují konstrukt kyseliny nukleové podle nároku

    41.

    Rekombinantní hostitelské buňky podle nároku 43, které jsou savčího původu.

    Rekombinantní hostitelské buňky podle nároku 44, kde buňky jsou zvoleny ze skupiny obsahující CHO buňky, BHK buňky nebo HEK buňky.

    Transgenní zvíře, které obsahuje a exprimuje konstrukt kyseliny nukleové podle nároku 41.

    Transgenní rostlina, která obsahuje a exprimuje konstrukt kyseliny nukleové definovaný v nároku 41.

    Způsob výroby polypeptidu faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk podle kteréhokoliv z nároků 43 až 45 ve vhodném růstovém médiu za podmínek umožňujících expresi konstruktu kyseliny nukleové a získání výsledného polypeptidu z kultivačního média.

    Způsob výroby polypeptidu faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, vyznačujíc i se tím, že zahrnuje získání varianty z mléka produkovaného transgenním zvířetem podle nároku 46.

    Způsob výroby polypeptidu faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněk transgenní rostliny podle nároku 47 a získání varianty z výsledné rostliny.

    Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    jr ······ ·····
40. 40 ·· ·« ·· ··· ·· ··

    52. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    53. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    54. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    55. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    56. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    57. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    58. Léčebné složení, které obsahuje polypeptid faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, a popřípadě léčebně přijatelný nosič.

    59. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    ·· · · ···· · · · ······ ···· · «····· ····· 47 ···· ····· · · ·«

    60. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo jéjí variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    61. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    62. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    63. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    64. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    65. Použití polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, kde alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    66. Použití polypeptidu faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, pro přípravu léku pro léčbu krvácivých příhod nebo pro posílení normálního hemostatického systému.

    67. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Lys

    ΛΟ « · · · ·· · ····

    40 «· «· ··· ·· ·» v pozici 157 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    68. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Lys v pozici 337 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    69. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Asp v pozici 334 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    70. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO.T nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Ser v pozici 336 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    71. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Val v pozici 158 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    72. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidů faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NOT nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Glu v pozici 296 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    73. Způsob léčby krvácivých příhod u subjektu, nebo způsob posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1 nebo její variantu, přičemž alespoň aminokyselina odpovídající Met v pozici 298 v SEQ ID NO:1 byla nahrazena odlišnou aminokyselinou; v případě potřeby subjektu.

    74. Způsob léčby nebo prevence krvácivých příhod u subjektu, nebo posílení normálního hemostatického systému, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání léčebného nebo preventivně účinného množství polypeptidu faktoru VII podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, v případě potřeby subjektu.

    »· · · ·· ···· ··· ··« · · * »· · · ···· · · · ·· ··· · ··· · · ··· ·· · ···· • · ··· ·· ·« /1/ J-éV/

    Obr. 1. - aminokyselinová sekvence původního lidského koagulačního faktoru VII

    Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-ieu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys5 10 15

    GLA-GLA~Gln-Cys-Ser~Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GAA-Ile-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg20 25 30 35

    Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro40 45 . 50

    Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys55 60 65 70

    Leu-Pro-Ala-Píie-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile75 -80 85 90

    Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr95 100 105

    Lys-Arg-Ser-Cys -Ar g-Cys -His -Glu-Gly-Tyr-Ser-leu-Leu-Al a-Asp-Gly- Val-Se r110 115 120 125

    Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile-Leu-Glu-Lys-Arg130 135 140

    Asn-Ala-Ser-Lys -Pro-Gln-Gly-Arg-I le - Val -Gly-Gly-Ly s -Val-Cy s-Pro-Ly s -Gly145 150 155 160

    Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly165

    170

    175

    180

    Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-Kis-Cys~Phe-Asp-Lys-Ile185 190 195

    Obr. 1

    Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His200 205 210 215

    Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr220 225 230

    Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln-Pro-Val235 240 245 250

    Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Leu.-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Set—Glu255 260 265 270

    Arg-Th,rleu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-rrp-Gly-Gln-Leu-Leu275 280 285

    Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leú-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met290 295 300 305 306

    Thr-Gln-Asp-Cys-Leu-Gln-Gln-Sex-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-lle-Thr310 315 320

    Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys-Lys-Gly325 330 335 340

    Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Txp-Tyr-Leu-Thr-Gly345 350 355 360

    Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr365 370 375

    Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg380 385 390 395

    Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro-Plie-Pro 400 405 406

    Obr. 1 pokračování » · · · · · * · · · 4 • · « ♦ · * ·

    I · · · ···· · ·· · · · · · · »

    Přehled sekvencí

    SEQ ID NO.T (aminokyselinová sekvence původního lidského koagulačniho faktoru VII):

    Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys5 '10 15

    GXjA-GLA-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA.-Ile-Phe-LyS“Asp-Ala-GIA-Arg20 25 30 35

    Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Aisp-Gin-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro“ 40 45 50

    Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys55 60 65 70 leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile75 80 85 90

    Cya-Val-Asn^Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thx-Gly-Thr95 100 105

    Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser110 115 120 125

    Cys-rhr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile-Leu-Glu-Lys-Arg130 135 140

    Asn-Ala-Ser-Lys-pro-Gln-Gly-Arg-XIe-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly145 150 155 160

    Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly165 170 175 180

    Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile185 190 195

    Lys-Asn-Trp-Aig-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His200 205 210 215

    Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr220 225 230

    Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-leu-Leu-Arg-Iíeu-His-Gln-Pro-Val235 240 245 250

    Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Leu-Fro-Glu^Arg-Thr-Kie-Ser-Glu“ 255 260 265 270

    Arg-Thx-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-Leu-Leu275 280 28S

    Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-teu-Glu-Leu-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met290 295 300 305

    Thr-Gln-Asp-Cys-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr310 315 320

    Glu-Tyr~Met~Phe-Cys-AJ.a~Gly-Tyr“Ser-Asp-Gly-Ser-Ly3-Asp-Ser~Cys-Lys-Gly~ 325 330 335 340

    Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Hís-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly345 350 355 360 lie-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr365 370 375

    Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Px-o-Arg380 385 390 395

    Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro 400 405 406

    SEQ ID NO:2 (DNA primer pro přípravu [K157AJ-FVII):

    5 -CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3'

    SEQ ID NO:3 (DNA primer pro přípravu [K157AJ-FVII):

    5-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3 • φ • ΦΦΦ φ φ • ΦΦΦ • · · ·

    SEQ ID Ν0:4 (DNA primer pro přípravu [V158A]-FVII): 5-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3'

    SEQ ID N0:5 (DNA primer pro přípravu [V158DJ-FVII):

    5-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3'

    SEQ ID N0:6 (DNA primer pro přípravu [V158T]-FVII):

    5-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3'

    SEQ ID N0:7 (DNA primer pro přípravu [V158T]-FVII);

    5-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3'

    SEQ ID N0:8 (DNA primer pro přípravu [E296V/M298Q]-FVII):

    5-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3'

    SEQ ID N0:9 (DNA primer pro přípravu [E296V/M298Q]-FVII):

    5-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3'

    SEQ ID NO: 10 (DNA primer pro přípravu [M298Q]-FVII):

    5-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3'

    SEQ ID NO: 11 (DNA primer pro přípravu [M298Q]-FVII):

    5-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3'

    SEQ ID NO: 12 (DNA primer pro přípravu [M298KJ-FVII):

    5 -GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3'

    V SEQ ID NO: 13 (DNA primer pro přípravu [M298K]-FVII): 5-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3'

    SEQ ID NO: 14 (DNA primer pro přípravu [S336G]-FVII):

    5-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3' • o*