KR100882482B1 - 사람 응고 인자 ｖｉｉ 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 응고 활성을 가지는 신규한 사람 응고 인자 VIIa 변이체뿐만 아니라 이러한 변이체를 코드화하는 핵산 구조체, 핵산을 포함하고 발현하는 벡터 및 숙주 세포, 약학적 조성물, 사용 및 치료 방법에 관한 것이다.
응고 인자 VII 변이체.

Description

사람 응고 인자 ＶＩＩ 변이체{HUMAN COAGULATION FACTOR VII VARIANTS}
본 발명은 응고 활성을 가지는 신규한 사람 응고 인자 VIIa 변이체 뿐만 아니라 이러한 변이체를 코드화하는 핵산 구조체, 핵산을 포함하고 발현하는 벡터 및 숙주 세포, 약학적 조성물, 사용 및 치료 방법에 관한 것이다.
혈액 응고는 궁극적으로는 피브린 클로트를 발생시키는 다양한 혈액 성분들 (또는 인자들)의 복잡한 상호작용으로 이루어지는 과정이다. 일반적으로, 응고 "캐스케이드"로 언급되는 과정에 참여하는 혈액 성분들은 전효소(proenzyme) 또는 효소원(zymogen)이며, 이것은 자체가 활성화된 응고 인자인 활성화제의 작용에 의하여 단백질 가수분해 활성을 나타내는 효소로 전환되는, 효소적으로는 비활성인 단백질이다. 그러한 전환을 진행시키고 일반적으로 "활성 인자들"로 불리는 응고 인자들은 응고 인자의 명칭 하단에 "a" 접미사를 첨가함으로써 표시된다 (예컨대 인자 VIIa).
지혈 과정의 개시는 혈관벽에의 손상으로서 노출된 조직 인자와 인자 VIIa 간의 복합체의 형성에 의해서 매개된다. 그 다음, 이 복합체는 인자 IX 및 X 를 그들의 활성 형태로 전환시킨다. 인자 Xa 는 제한된 양의 프로트롬빈을 조직 인자 함유 세포상의 트롬빈으로 전환시킨다. 트롬빈은 혈소판 및 인자 V 및 VII 를 완전한 트롬빈 방출을 유도하는 더이상의 과정에서의 보조인자인, 인자 Va 및 VIIa 로 활성화시킨다. 이 과정은 인자 IXa(인자 VIIa 과의 복합체에서)에 의한 인자 Xa 의 생성을 포함하고, 활성화된 혈소판의 표면상에서 일어난다. 트롬빈은 피브리노겐을 최종적으로 피브린 클로트의 형성을 초래하는 피브린으로 전환시킨다. 최근에, 인자 VII 및 조직 인자가 혈액 응고의 주요 개시제임이 밝혀졌다.
인자 VII 은 혈액내에서 단일-사슬 효소원으로서 순환하는 미량의 혈장내 당단백질이다. 효소원은 촉매적으로 불활성이다. 단일-사슬 인자 VII 은 인자 Xa, 인자 XIIa, 인자 IXa 또는 트롬빈에 의해 생체외에서 2-사슬 인자 VIIa 로 전환될 수 있다. 인자 Xa 는 인자 VII 의 중요한 생리적 활성화제인 것으로 여겨진다. 지혈에 포함된 여러 가지 다른 혈장 단백질들과 같이, 인자 VII 은 그것의 활성을 위해 비타민 K 에 의존적인데, 비타민 K 는 단백질의 아미노 말단 근처에서 클러스터를 형성하는 다중 글루탐산 잔기의 γ-카르복실화에 필요하다. 이들 γ-카르복실화된 글루탐산은 인자 VII 와 인지질과의 금속 이온 유도된 상호작용에 필요하다. 활성화된 2개의 사슬 분자로의 효소원 인자 VII 의 전환은 내부 Arg152-Ile153 펩티드 결합의 절단에 의해서 발생한다. 조직 인자의 존재하에서, 인지질과 칼슘 이온, 2개의-사슬 인자 VIIa 는 제한된 단백질 분해에 의해서 빠르게 인자 X 또는 인자 IX 를 활성화시킨다.
때로 환자에서 응고 캐스케이드를 자극하거나 개선시키는 것이 바람직하다. 인자 VIIa 는 혈병 인자 결핍(예를 들어, 혈우병 A 및 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII 의 결핍) 또는 혈병 인자 저해제와 같은 몇몇의 원인을 가지는 출혈 장애를 조절하는데 사용되었다. 인자 VIIa 는 또한 정상적으로 기능하는 출혈 응고 캐스케이드를 가지는 피험자에서(혈병화 인자 결핍 또는 응고 인자 중 어느 것에 대한 저해제가 없는) 발생하는 과도한 출혈을 조절하는데 사용되었다. 이러한 출혈은 예를 들어, 결함있는 혈소판 기능, 혈소판 감소증 또는 폰빌레브란드병에 의해 유발될 수 있다. 출혈은 또한 수술 및 다른 형태의 조직 손상과 연관된 중요한 문제이다.
유럽 특허출원 200,421(ZymoGenetics)은 사람 인자 VII 을 코드화하는 뉴클레오티드 서열 및 인자 VII 의 재조합체 발현에 관한 것이다.
Dickinson 등(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996) 93, 14379-14384)은 Lys 157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 또는 Lys337 이 각각 Ala 로 치환된 인자 VII 변이체에 관한 것이다.
Iwanaga 등(Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474)는 잔기 316-320 이 결실되거나 잔기 311-322 가 트립신에서 해당하는 잔기로 치환된 FVIIa 변이체에 관한 것이다.
그러나, 응고 활성을 가지는 인자 VIIa 의 변이체, 상대적으로 낮은 용량으로 투여될 수 있는 높은 활성을 가진 변이체, 및 종래의 요법과 조합되어, 각각, 응고 시스템 및 출혈의 전신 활성화와 같은 바람직하지 않은 부작용을 유발하지 않는 변이체에 대한 요구는 여전하다.
본 발명은 응고 활성을 가지는 응고 인자 VIIa 폴리펩티드를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala157)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
제 2의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala337)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
제 3의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala334)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala336)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala158)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala296)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노 산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala298)는 아닌 그것의 변이체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌 SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys, 위치 337 의 Lys, 위치 334 의 Asp, 위치 336 의 Ser, 위치 158 의 Val, 위치 296의 Glu 및 위치 298 의 Met 으로 구성되는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로, 프로테아제 도메인의 나머지 위치에서의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체로 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌, 응고 인자 VII 변이체를 제공한다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala157)"은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala337)"은 SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala334)"는 SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala336)"은 SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala158)"는 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala296)"는 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
본원에 사용될 때, 용어 "FVII(Ala298)"는 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 이 알라닌으로 치환된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 응고 인자 VII 변이체를 의미한다. 이 용어는 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 위치에서 2 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 응고 인자 VII 변이체를 포함하지 않는다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 구조체에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 인자 VII 변이체를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조체를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 FVIIa 변이체를 코드화하는 핵산 구조체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체를 함유하고 발현하는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체를 함유하고 발현하는 트랜스제닉 식물을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체의 발현을 허용하는 조건하의 적절한 증식 배지에서 핵산 구조체를 포함하는 세포를 배양하는 단계와 배지로부터 결과의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체의 발현 및 배지로부터 결과의 폴리펩티드의 회수를 허용하는 조건하의 적절한 증식 배지에서 핵산 구조체를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 인자 VII 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 트랜스제닉 동물에 의해서 생산된 밀크로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 인자 VII 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 트랜스제닉 동물에 의해서 생산된 밀크로부터 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 인자 VII 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 배양하는 단계, 및 결과의 식물로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하 는 인자 VII 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 핵산 구조체를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 배양하는 단계, 및 결과의 식물로부터 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 인자 VII 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체로 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치에서 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산에 의해 치환된, 응고 인자 VII 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 157의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 337의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 334의 Asp 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 336의 Ser 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 사용에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치에서 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체로 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된 응고 인자 VII 변이체의 사용을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방 법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드 또는 적어도 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 그것의 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법에 관한 것이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 및 위치 337의 Lys 잔기 및 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, 응고 인자 VII 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서의 출혈 사건의 치료 방법 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 및 위치 337의 Lys 잔기 및 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌, 응고 인자 VII 변이체; 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 출혈 사건의 치료 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약제의 제조를 위한, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 및 위치 337의 Lys 잔기 및 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌, 응고 인자 VII 변이체의 사용을 제공한다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 및 위치 337의 Lys 잔기 및 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기(들)가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌, 응고 인자 VII 변이체의 치료적 또는 예방적 유효량을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 출혈 장애의 치료 또는 예방 또는 정상 지혈 시스템의 증강 방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 나머지 위치의 기껏해야 20 개의 추가의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 159-170에서 선택된 위치의 아미노산에 해당하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 290-312에서 선택된 위치의 아미노산에 해당하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 330-339에서 선택된 위치의 아미노산에 해당하는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 157의 상기 Lys이 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위 치 337의 상기 Lys이 Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 334의 상기 Asp 이 Gly 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 336의 상기 Ser 이 Gly 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 158의 상기 Val 이 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 296의 상기 Glu 가 Arg, Lys, 및 Val으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 위치 298의 상기 Met 이 Lys, Arg, Gln, 및 Asn으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 아미노산이 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상이 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 상기 인자 VII 폴 리펩티드가 사람 인자 VII 인 폴리펩티드이다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 상기 인자 VII 폴리펩티드가 사람 인자 VIIa 이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 [E296V]-FVII, [M298Q]-FVII, 및 [S336G]-FVII 로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 [V158T/M298Q]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII, [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, 및 [V158D/M298K]-FVII 로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 폴리펩티드이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 [V158D/E296V/M298Q]-FVII 이다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII 이다.
더 이상의 구체예에서, 인자 VII 변이체는 SEQ ID NO:1 의 위치 157의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 선택적으로 프로테아제 도메인의 나머지 위치의 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산으로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌 변이체이다.
한 구체예에서, 인자 VII 변이체는 SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체로 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된, FVII(Ala157), FVII(Ala334), FVII(Ala336), FVII(Ala337), FVII(Ala158), FVII(Ala296) 또는 FVII(Ala298)는 아닌 변이체이다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337의 Lys 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기와 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상이 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기와 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코 드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 잔기와 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 잔기와 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기와 위치 334 의 Asp 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 잔기는 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 잔기는 핵산 구조체 에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기가 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157 의 Lys 잔기는 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp 또는 Glu 으로 치환되고; 및/또는 위치 337 의 Lys 잔기는 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp 또는 Glu 으로 치환되고; 및/또는 위치 158 의 Val 잔기는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp 또는 Glu 으로 치환되고; 및/또는 위치 296 의 Glu 잔기는 Arg, Lys 또는 Val 으로 치환되고; 및/또는 위치 298 의 Met 잔기는 Arg, Lys, Gln 또는 Asn 으로 치환되고; 및/또는 위치 334 의 Asp 잔기는 Glu 으로 치환되고; 및/또는 위치 336 의 Ser 잔기는 Gly 로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157 의 Lys 잔기 또는 위치 337 의 Lys 잔기 또는 위치 334 의 Asp 잔기 또는 위치 336 의 Ser 잔기는 치환된 유일한 아민노산 잔기이다.
더 이상의 구체예에서, 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기는 치환된 유일한 아미노산 잔기이다.
더 이상의 구체예에서, 본 발명에 따른 변이체의 활성과 SEQ ID NO:1 으로 나타낸 천연 인자 VII 폴리펩티드의 활성비는 본원에 구체화된 "생체외 가수분해 검정"에서 시험될 때 적어도 약 1.25 이다. 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 2.0; 다른 구체예에서, 적어도 약 4.0 이다.
더 이상의 구체예에서, 프로테아제 도메인의 위치 312 에서 Gln 잔기는 치환되지 않았다.
더 이상의 구체예에서, 재조합 숙주 세포는 포유동물 기원의 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 CHO 세포, BHK 세포 또는 HEK 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.
더 이상의 구체예에서, 프로테아제 도메인의 나머지 위치(위치 153-406)의 기껏해야 20 개의 추가의 아미노산 잔기가 치환된다. 한 구체예에서, 기껏해야 15 개의 추가의 아미노산 잔기가 치환된다; 다른 구체예에서, 기껏해야 10 개의 아미노산 잔기가 치환된다; 다른 구체예에서, 기껏해야 5 개의 아미노산 잔기가 치환된다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157, 337, 158, 296, 298, 334 또는 336 의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157 및 위치 337 의 Lys 잔기의 하나 또는 양 잔기가 중성 아미노산 잔기로 치환되었거나, 또는 하나의 잔기가 음으로 하전된 아미노산 잔기로 치환되었거나, 또는 하나의 Lys 잔기가 중성 아미노산 잔기로 치환되었고, 하나의 다른 Lys 잔기가 음으로 하전된 아미노산 잔기로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하 나 또는 양 잔기가 수소 결합을 형성할 수 있고 및/또는 염 다리를 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 치환되었거나, 또는 하나 또는 2개의 잔기가 작은 아미노산 잔기로 치환된다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157 의 Lys 잔기 및/또는 위치 337 의 Lys 잔기 는 치환된 유일한 아미노산 잔기(들)이다. 한 구체예에서, 위치 157 의 Lys 잔기가 치환되었다. 다른 구체예에서, 위치 337 의 Lys 잔기가 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 158의 Val 잔기 및/또는 위치 298 의 Met 잔기는 치환된 유일한 아미노산 잔기이다.
더 이상의 구체예에서, 위치 158의 Val 잔기 및/또는 위치 336 의 Ser 잔기는 치환된 유일한 아미노산 잔기이다.
더 이상의 구체예에서, 위치 157의 Lys 잔기는 Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp, 및 Gln의 목록에서 선택된 아미노산 잔기로 치환되었다. 다른 구체예에서, 위치 157 의 Lys 잔기는 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 337 의 Lys 잔기는 Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Arg, His, Asp 또는 Gln 에서 선택된 아미노산 잔기로 치환되었다. 다른 구체예에서, 위치 337 의 Lys 잔기는 Gly, Val, Ser, Thr, Asn 또는 Glu 에 의해서 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 158 의 Val 잔기는 Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 및 Gln의 목록에서 선택된 아미노산으로 치환되었다. 더 이상의 구체예에서, 위치 158 의 Val 잔기는 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 296 의 Glu 잔기는 Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Asp 또는 Gln의 목록에서 선택된 아미노산으로 치환되었다. 더 이상의 구체예에서, 잔기는 Arg, Lys 또는 Val 으로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 298 의 Met 잔기는 Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Lys, Arg, His, Glu, Asp 또는 Gln의 목록에서 선택된 아미노산 잔기로 치환되었다. 다른 구체예에서, 잔기는 Lys, Arg, Gln 또는 Asn 으로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 334 의 Asp 잔기는 Gly 및 Glu 으로 치환되었다.
더 이상의 구체예에서, 위치 336 의 Ser 잔기는 Gly 및 Glu 으로 치환되었다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 변이체의 활성과 SEQ ID NO:1 으로 나타낸 천연 인자 VII 폴리펩티드의 활성비는 본원에 특정된 "생체외 가수분해 검정"에서 시험되었을때, 적어도 약 1.25 이다(실시예 11). 다른 구체예에서, 비율은 적어도 약 2.0 이고; 또 다른 구체예에서, 적어도 약 4.0 이다.
더이상의 양태에서, 본 발명은 천연 FVIIa 에 비교할 때, 증가된 조직 인자-비의존성 활성을 가지는 FVIIa 변이체를 제공한다. 그것의 한 구체예에서, 증가된 활성은 기질 특이성에서의 변화를 수반하지 않는다. 한 구체예에서, (야생형과 비교하였을 때) 조직 인자와 변이체의 결합이 손상되지 않는다; 다른 구체예에서, 조직 인자에 결합되었을 때, 변이체는 적어도 야생형 인자 VIIa 의 활성을 가진다.
더 이상의 구체예에서, 이미 실험된 위치 157, 158, 296, 334, 336 또는 337 의 아미노산 치환 및 프로테아제 도메인의 어는 위치의 선택적인 아미노산 치환에 추가하여, 인자 VII 변이체는 또한 N-말단 Gla 도메인(잔기 1-37)에서 어떤 아미노산 치환을 가진다. 한 구체예에서, 인자 VII 의 위치 10 내지 32(SEQ ID NO:1으로 명명)의 아미노산 잔기의 하나 이상은 핵산 구조체로 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 한 구체예에서, 위치 10 의 아미노산 잔기 Pro 는 Gln, Arg, His, Gln, Asn 또는 Lys 으로 치환되고; 및/또는 위치 32 의 아미노산 잔기 Lys 은 Glu, Gln 또는 Asn 으로 치환된다.
도 1은 천연 사람 응고 인자 VII(SEQ ID NO:1)의 전 아미노산 서열을 도시한다.
본 명세서에서, 아미노산은 표 1에 나타난 바와 같이 생화학 명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회(CBN)가 승인한 약어를 사용하여 표현된다. 명칭 또는 다음의 약어로 표시된 동족체를 가지는 아미노산등은 다르게 설명되지 않는 한, 천연 L-형이다. 더욱이, 펩티드의 아미노산 서열의 왼쪽 말단과 오른쪽 말단은 다르게 특정되 지 않는 한, 각각 N- 및 C-말단이다.
아미노산 약어
아미노산 3문자 코드 1문자 코드
글리신 Gly G
프롤린 Pro P
알라닌 Ala A
발린 Val V
루신 Leu L
이소루신 Ile I
메티오닌 Met M
시스테인 Cys C
페닐알라닌 Phe P
티로신 Tyr T
트립토판 Trp T
히스티딘 His H
리신 Lys L
아르기닌 Arg A
글루타민 Gln G
아스파라긴 Asn A
글루탐산 Glu G
아스파르트산 Asp A
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
현재 아미노산 잔기 Lys157, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 또는 Lys337 (및 선택적으로 하나 이상의 추가의 잔기)의 적어도 하나의 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 FVIIa 변이체가 응고 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
잔기는 프로테아제 도메인의 아미노 말단의 삽입에 영향을 주는 것으로 여져지는 영역에 위치함으로써 Ile153의 말단 아미노기와 Asp343 의 측쇄간의 염 다리에 의존적인 인자 VIIa 의 촉매적으로 활성 배좌를 형성시킨다. 치환은 정전기 반발력을 제거할 수 있고, 수소 결합을 첨가하거나 그렇지 않으면 아미노 말단의 삽입을 촉진할 수 있다.
천연 FVIIa 에 비교할 때, 설명된 인자 VIIa 변이체의 더 높은 내재적 활성 에 기인하여, 더욱 적은 용량으로 작용의 부위에 기능적인 적당한 농도를 얻는 것이 가능한 것으로 예견되므로 출혈 사건을 가지거나 정상 지혈 시스템의 증강을 필요로 하는 피험자에게 더욱 적은 용량을 투여하는 것이 가능할 것이다.
상기에 간단하게 언급한 대로, 본 발명자들은 위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상의 잔기를 치환함에 의해서, 인자 VIIa 가 조직 인자에 의해서 정상적으로 유도되어야만 하는 더욱 활성화된 배좌에 자발적으로 도달될 것이라는 것을 가정한다. 이러한 인자 VIIa 변이체는 많은 용량의 NovoSeven
Figure 112003008838060-pct00001
이 투여되는 때와 같은 전응고 활성이 조직 인자(혈소판 표면에서 인자 Xa 생성) 독립적인 상황에서 치료적으로 유용할 수 있다.
위치 157 의 Lys 잔기 및 위치 337 의 Lys 잔기 및 위치 158 의 Val 잔기 및 위치 296 의 Glu 잔기 및 위치 298 의 Met 잔기 및 위치 334 의 Asp 잔기 및 위치 336 의 Ser 잔기의 하나 이상 잔기의 치환에 의해서 얻어진 효과에 추가하여, 프로테아제 도메인에서의 추가의 아미노산 잔기의 치환이 분자의 활성화된 배좌의 형성을 더욱 촉진시킬 것이다. 그러나, 대부분의 공표된 효과는 상기 언급된 돌연변이가 이들 7개의 잔기의 부근(순차적 또는 3차원)에서 발생된 때에 보여질 것이다.
인자 FVII 의 N-말단 Gla 도메인(잔기 1-37)에서 몇몇의 아미노산 잔기의 치환은 조직 인자 함유 세포 또는 혈소판의 멤브레인 인지질과 같은, 멤브레인 인지질에 대하여 실질적으로 높은 친화성을 가진 단백질을 제공할 수 있다. 따라서, 상 기에 언급된 인자 VII 변이체의 위치 157, 158, 296, 298, 334, 336 또는 337 에서 이미 수행된 아미노산 치환 및 프로테아제 도메인의 어느곳에서든지의 선택적인 아미노산 치환에 추가하여 또한 N-말단 Gla 도메인에서 치환된 어떤 아미노산 잔기를 가짐으로써, 천연 인자 VII 에 비교할 때, 증가된 활성뿐만 아니라 멤브레인 인지질에 대한 증가된 친화성을 가지는 단백질을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 인자 VII 의 위치 10 내지 32(SEQ ID NO:1으로 말하여짐)내의 아미노산 잔기는 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 상기 언급된 위치에 통합될 수 있는 바람직한 아미노산 잔기의 예는 다음과 같다: 위치 10의 아미노산 잔기 Pro 는 Gln, Arg, His, Gln, Asn 또는 Lys 으로 치환되고;및/또는 위치 32의 아미노산 잔기 Lys 는 Glu, Gln 또는 Asn 으로 치환된다.
다른 인지질 친화성 및 비타민 K-의존성 플라스마 단백질의 서열에 기초하여, GlA 도메인에서의 다른 잔기가 또한 치환에 고려될 수 있다.
본원에서, 3문자는 그것의 종래이 의미에서 사용되었던 아미노산을 나타낸다. 명확하게 나타내지 않는 한, 본원에 언급된 아미노산은 L-아미노산이다.
용어 "N-말단 GLA-도메인"은 FVII 의 아미노산 서열 1-37 을 의미한다.
용어 "프로테아제 도메인"은 FVII 의 아미노산 서열 153-406 을 의미한다(FVIIa 의 중쇄).
3-문자 표시 "GLA"는 4-카르복시글루탐산(γ-카르복시글루타메이트)을 의미한다.
용어 "중성 아미노산 잔기"(pH 6-8)는 Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln 의 목록에서 선택된 아미노산을 포함하도록 의도된다.
용어 "작은 아미노산"은 Gly, Glu 및 Ala 에서 선택된 아미노산을 포함하도록 의도된다.
용어 "음으로 하전된 아미노산 잔기"(pH 6-8)는 Asp 및 Glu 에서 선택된 아미노산을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용될 때, 용어 "인자 VII 폴리펩티드"는 천연 사람 인자 VII(SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열 1-406 을 포함하는 어떤 단백질 또는 그것의 변이체를 의미한다. 이것은 사람 인자 VII, 사람 인자 VIIa 및 그것의 변이체를 제한없이 포함한다.
본원에 사용될 때 용어 "인자 VII" 는 불활성 단일-사슬 효소원 인자 VII 분자 뿐만 아니라 활성화된 2개의 사슬 인자 VII 분자(인자 VIIa)를 포함하도록 의도된다. 이것은 천연 사람 인자 VII 또는 인자 VIIa 의 아미노산 서열 1-406 을 가지는 단백질을 포함한다. 이것은 또한 이러한 단백질이 실질적으로 인자 VIIa 의 활성을 보유하는 한, 예를 들어, N-말단 아미노산 결실 또는 추가를 포함하는 변형된 N-말단 및 약간 변형된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인자 VIIa" 또는 "VIIa"는 활성화된 형태로 이루어지는 생성물을 의미한다(인자 VIIa). 상기 정의에서 "인자 VII" 또는 "인자 VIIa"는 또한 한 개인 또는 다른 개인간에 존재하고 발생할 수 있는 중성 대립유전자 변이체를 포함한다. 또한, 글리코실화의 정도 및 위치 또는 다른 번역후 변형은 선택된 숙주 세포 및 숙주 세포 환경의 성질에 따라서 다양할 수 있다.
본원에 사용될 때, 용어 "변이체" 또는 "변이체들"은 모 단백질의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고 및/또는 모 단백질의 하나 이상의 아미노산이 결실되고 및/또는 하나 이상의 아미노산이 단백질에 삽입되고 및/또는 하나 이상의 아미노산이 모 단백질에 첨가된, SEQ ID NO:1 의 서열을 가지는 인자 VII 을 나타내도록 의도된다. 이러한 첨가는 모 단백질의 N-말단 또는 C-말단 또는 양쪽 모두에서 발생할 수 있다. 이 정의내에서 "변이체" 또는 "변이체들"은 그것의 활성화된 2개의 사슬 분자 형태에서 FVII 활성을 가진다. 한 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1 의 서열과 65% 동일하다. 한 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1의 서열과 80% 동일하다. 다른 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1 의 서열과 90% 동일하다. 더이상의 구체예에서, 변이체는 SEQ ID NO:1 의 서열과 95% 동일하다.
본원에 사용될 때, 용어 "핵산 구조체"는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 반합성 DNA, RNA 기원 또는 혼합된 기원의 어떤 핵산 분자를 의미하도록 의도된다. 용어 "구조체"는 단일 또는 이중-사슬일 수 있고, 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 완전한 또는 부분적인 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기초할 수 있는 핵산 단편을 나타내도록 의도된다. 구조체는 선택적으로 다른 핵산 단편을 함유한다. 유사한 방식으로, "핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 아미노산 잔기"는 상기에 정의된 핵산 구조체에 의해서 코드화 될 수 있는 아미노산 잔기, 즉, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 및 Gln 과 같은 아미노산이다.
본원에 사용될 때, 용어 "다른 아미노산"은 그 위치에 본래 존재하는 아미노산과 다른 아미노산을 의미한다. 이것은 핵산 구조체에 의해서 코드화될 수 있는 아미노산에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 다른 아미노산은 천연 L-형태이고 핵산 구조체로 코드화될 수 있다. 구체적인 예는 L-시스테인이다(Cys).
본 문맥에서, 용어 "치료"는 출혈의 저해 또는 최소화라는 취지에서, 예를 들어 수술에서와 같은 예상된 출혈의 예방, 및 예를 들어 외상에서와 같은 이미 발생한 출혈의 조절 모두를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 인자 VIIa 변이체의 예방적 투여가 용어 "치료"에 포함된다.
본원에 사용될 때, 용어 "활성"은 인자 VII 폴리펩티드 또는 그것의 변이체가 그것의 기질 인자 X 를 활성 인자 Xa 로 변환시키는 능력을 의미한다. 인자 VII 폴리펩티드의 활성은 "체외 단백질분해 검정"으로 측정될 수 있다. 용어 "내재적 활성"은 또한 조직 인자의 부재하에 활성화된 혈소판의 표면에서 트롬빈을 생성하는 능력을 포함한다.
용어 "정상 지혈 시스템의 증강"은 트롬빈을 생성하는 능력의 증강을 의미한다.
본원에 사용될 때, 용어 "출혈 장애"는 출혈시 명백해지는 세포 또는 분자 기원의 선천적, 후천적 또는 유도된 어떤 결함을 반영한다. 예는 혈병 인자 결핍(예를 들어, 혈우병 A 및 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍), 혈병 인자 저해제, 결함있는 혈소판 기능, 혈소판감소증 또는 폰빌레브란드병이다.
용어 "출혈 사건"은 수술 및 어떤 형태의 조직 손상에 모두 관련된 주된 문 제인 제어되지 않는 과도한 출혈을 포함하는 것을 의미한다. 제어되지 않는 과도한 출혈은 기본적으로 정상 응고 시스템을 갖는 피험자 및 응고 또는 출혈 장애를 갖는 피험자에서 일어날 수 있다. 혈병화 인자 결핍(혈우병 A 및 B, 응고 인자 XI 또는 VII의 결핍) 또는 혈병화 인자 저해제는 출혈 장애의 원인일 수 있다. 또한, 과도한 출혈은 정상적으로 기능중인 혈액 혈병화 캐스캐이드를 갖는 피험자(혈병화 인자 결핍 또는 응고 인자 중 어느 것에 대한 저해제가 없는)에서 발생하며, 결함있는 혈소판 기능, 혈소판감소증 또는 폰빌레브란드병에 기인할 수 있다. 그러한 경우에 출혈은 혈우병에 기인하는 출혈과 유사할 수 있으며, 이는 혈우병에서처럼 지혈 시스템이 위험한 출혈을 일으킬 수 있는 비정상적인 필수 혈병화 "화합물"(혈소판 또는 폰빌레브란드 인자 단백질과 같은)을 결여하거나 또는 이를 가지기 때문이다. 수술 또는 큰 외상에 관련된 과도한 조직 손상을 경험한 피험자에서, 정상 지혈 메카니즘은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 압도될 수 있으며, 그것들은 정상인 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈을 발생시킬 수 있다. 또한, 만족스러운 지혈을 달성하는 것은, 외과적 지혈에 대해 제한된 가능성을 갖는 뇌, 내이 영역 및 눈과 같은 기관에서 출혈이 일어날 때 문제가 된다. 동일한 문제가 여러 기관(간, 폐, 종양 조직, 위장관)으로부터 바이옵시스를 취하는 과정에서 뿐만 아니라 복강경 수술에서도 발생할 수 있다. 모든 이들 상황에 공통적인 것은 외과적 기술(봉합, 클립 등)에 의한 지혈을 제공하는 것이 어렵다는 점이며, 이것은 또한 출혈이 확산(성기 출혈 및 대량 자궁 출혈)될 때도 마찬가지다. 또한, 급성 및 대량 출혈이 항응고제 치료중인 피험자에서 발생할 수 있으며, 이 경우 결함있는 지혈이 주어진 치료법에 의해 유도된다. 그러한 피험자는 항응고제 효과가 빠르게 상쇄되지 않는 경우에 외과적 개입이 필요할 수 있다. 근치적 치골후 전립선 절제술은 국부적 전립전암을 갖는 피험자를 위해 흔하게 수행되는 과정이다. 이 수술은 유의한 언젠가의 대량 혈액 손실에 의해 자주 악화된다. 전립선 절제술 동안의 상당한 혈액 손실은 외과적 지혈을 위해 쉽게 접근할 수 없는 다양한 조밀하게 혈관화된 부위를 갖는 악화된 해부학적 상황에 주로 관계되며, 이것은 큰 영역으로부터 출혈의 확산을 가져올 수 있다. 만족스럽지 않은 지혈의 경우에 문제를 일으킬 수 있는 다른 상황은 혈전색전증 질환을 예방하기 위해서 정상적인 지혈 메카니즘을 갖는 피험자에게 항응고제 치료를 제공할 때이다. 그러한 치료법은 헤파린, 다른 형태의 프로테오글리칸, 와파린 또는 다른 형태의 비타민 K-길항제 뿐만 아니라 아스피린 및 다른 혈소판 응고 저해제를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서 출혈은 혈우병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 후천적 저해제를 갖는 혈우병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 혈소판감소증에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 폰빌레브란드병에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 심한 조직 손상에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 심한 외상에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 수술에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 복강경 수술에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 성기 출혈에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 대량 자궁 출혈에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 메카니즘적 지혈에 대한 제한된 가능성을 갖는 기관에서 발생한다. 다른 구체예에서 출혈은 뇌, 내이 영역 또는 눈에서 발생한다. 다른 구체예에서 출혈은 바이옵시스를 취하 는 과정에 관련된다. 다른 구체예에서 출혈은 항응고제 치료에 관련된다.
본원에 사용된 용어 "피험자"는 어떤 동물, 특히 포유류, 예를 들어 사람을 포함하도록 의도되며, 적합한 경우 용어 "환자"와 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "적절한 증식 배지"는 세포의 성장 및 본 발명의 인자 VII 변이체를 코드화하는 핵산 서열의 발현에 요구되는 영양소와 다른 성분을 함유하는 배지를 의미한다.
인자 VII 변이체의 제조
본원에 설명된 인자 VII 변이체는 재조합 핵산 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 클론된 야생형 인자 VII 핵산 서열은 원하는 단백질을 코드화하도록 변형된다. 이 변형된 서열은 다음 단계로 발현 벡터안에 삽입되고, 계속해서 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙션시킨다. 고등 진핵 세포, 특히 배양된 포유동물 세포들이 숙주 세포로서 바람직하다. 사람의 인자 VII 에 대한 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 알려져 있다(미국 특허 제 4,784,950 호를 참조하면, 재조합 사람 인자 VII 의 클로닝 및 발현에 대해 설명되어 있다). 소의 인자 VII 서열은 다케야 등의 문헌에 발표되어 있다(Takeya et al., J. Biol. Chem., 263:14868-14872 (1988)).
아미노산 서열 변경은 다양한 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 핵산 서열의 변형은 부위-특이적 돌연변이 생성법에 의하여 이루어질 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 생성에 대한 기법은 당해 기술분야에 공지이며, 예를 들어, Zoller 및 Smith(DNA 3:479-488, 1984) 또는 "Spricing by extension overlap", Horton 등, Gene 77, 1989, pp.61-68에 개시된다. 그러므로, 인자 VII 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 사용하면 누구든지 선택한 변경(들)을 도입시킬 수 있다. 마찬가지로, 특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응을 사용하여 DNA 구조체를 제조하는 과정이 당업계에 공지된다(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA 참조).
본 발명의 인자 VII 변이체를 코드화하는 핵산 구조체는 적당하게는 게놈 또는 cDNA 기원일 수 있고, 이것은 예를 들어, 표준 기법에 따라서, 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제작하고, 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 혼성화함에 의해서 폴리펩티드의 전체 또는 부분을 코딩하는 DNA 서열을 스크리닝함으로써 얻어진다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
인자 VII 변이체를 코드화하는 핵산 구조체는 예를 들어, Beaucage 및 Caruthers, Tetrahedron Letters 22(1981), 1859-1869 에 개시된 포스포아미다이트 방법, 또는 Mattes 등, EMBO Journal 3(1984), 801-805 에 개시된 방법과 같은 확립된 표준 방법에 의해서 합성으로 제조될 수 있다. 포스포아미다이트 방법에 따라서, 예를 들어, 자동화 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드가 합성, 정제, 어닐링, 라이게이션되고, 적당한 벡터에 클로닝된다.
더욱이, 핵산 구조체는 표준 기법에 따라서, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편(적당하게), 전 핵산 구조체의 다양한 부분에 해당하는 단편을 라이게이션함에 의해서 제조된 혼합된 합성 및 게놈, 혼합된 합성 및 cDNA 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다.
핵산 구조체는 바람직하게는 DNA 구조체이다.
본 발명에 따른 인자 VII 변이체 제조에 사용되는 DNA 서열은 적절한 번역후 프로세싱(예를 들어, 글루탐산 잔기의 γ-카르복실화) 및 숙주 세포로부터의 분비를 얻기 위하여 전형적으로 인자 VII 의 아미노-말단에서 프레-프로 폴리펩티드를 코드화할 것이다. 프레-프로 폴리펩티드는 인자 VII 의 것이거나 다른 비타민 K-의존성 플라스마 단백질 예를 들어, 인자 IX, 인자 X, 프로트롬빈, 단백질 C 또는 단백질 S 의 프레-프로 폴리펩티드일 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 항응고제로서 작용하는 단백질의 능력을 유의할만한 정도로 손상시키지 않는 그러한 변형이 추가로 인자 VII 변이체의 아미노산 서열내에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 인자 VII 변이체는 미국 특허 제 5,288,629 호에서 보편적으로 설명된 바와 같이, 효소원 인자 VII 이 그것의 활성화된 2-사슬 형태로 전환되는 것이 억제되도록 활성화 절단 부위에서 또한 변형될 수 있다.
인자 VIIa 변이체를 발현시키는데 사용하기 위한 발현 벡터는 클론된 유전자 또는 cDNA 의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 배양된 포유동물 세포에 사용하기에 바람직한 프로모터는 바이러스성 프로모터와 세포성 프로모터를 포함한다. 바이러스성 프로모터로는 SV40 프로모터(Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1:854-864, 1981) 및 CMV 프로모터(Boshart et al., Cell, 41:521-530, 1985)가 있다. 특히 바람직한 바이러스성 프로모터는 아데노바이러스 2 로부터 유래된 주요 후기 프로모터이다(Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982). 세포성 프로모터로는 마우스 카파 유전자 프로모터(Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983) 및 마우스 VH 프로모터(Loh et al., Cell 33:85-93, 1983)를 포함한다. 특히 바람직한 세포성 프로모터는 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터이다(Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983). 발현 벡터는 또한 프로모터로부터 아래쪽에 위치하고 인자 VII 서열 자체에 대한 삽입 부위로부터 위쪽에 위치한 한 세트의 RNA 스플라이스 부위를 함유할 수 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 부위는 아데노바이러스 및/또는 면역글로불린 유전자로부터 얻어질 수 있다. 또한 발현 벡터에는 삽입 부위 아래쪽에 위치한 폴리아데닐화 신호가 함유되어 있다. 특히 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40 으로부터 유래되는 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호(Kaufman and Sharp, 상기 동일 문헌 참조), 아데노바이러스 5 Elb 영역으로부터 유래되는 폴리아데닐화 신호, 사람 성장 호르몬 유전자 터미네이터(Denoto et al., Nuc. Acids Res., 9:3719-3730, 1981) 또는 사람 인자 VII 유전자 또는 소의 인자 VII 유전자로부터 유래되는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 발현 벡터는 또한 비코딩 바이러스 리더 서열, 예를 들면 프로모터와 RNA 스플라이스 부위 사이에 위치한 아데노바이러스 2 의 세부분으로 나누어진 리더 서열; 및 인핸서 서열, 예를 들면 SV40 인핸서를 함유할 수 있다.
클론된 DNA 서열은 배양된 포유동물 세포 안에, 예를 들면 인산 칼슘-중재된 트랜스펙션(Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) 또는 일렉트로포레이션(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)에 의해 도입된다. 외인성 DNA 를 발현하는 세포를 확인하고 선택하기 위해서는, 일반적으로 선택가능한 표현형(선택가능한 마아커)을 부여하는 유전자가 관심의 유전자 또는 cDNA 와 함께 세포안에 도입된다. 바람직한 선택가능한 마아커는 예컨대 네오마이신, 하이그로마이신, 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자들을 포함한다. 선택가능한 마아커는 증폭가능한 선택성 마아커이다. 바람직한 증폭가능한 선택성 마아커는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 서열이다. 선택가능한 마아커에 대해서는 틸리에 의해 문헌에서 개괄적으로 설명되어 있다(Thilly, Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA). 선택가능한 마아커의 선택은 당해 기술분야의 통상적인 기술수준내에 있다.
선택가능한 마아커들은 동시에 관심의 유전자로서 별도의 플라스미드상에 놓여 세포안에 도입될 수 있거나, 또는 마아커들은 동일한 플라스미드상에 도입될 수 있다. 만약 동일한 플라스미드상에 놓인다면, 선택가능한 마아커와 관심의 유전자는 상이한 프로모터 또는 동일한 프로모터의 조절하에 놓일 수 있으며, 후자의 배열로는 이시스트론성 메시지를 생성한다. 이런 유형의 구성은 당해 기술분야에 공지이다 (예를 들면, Levinson and Simonsen, 미국 특허 제 4,713,339 호 참조). 또한 "담체 DNA"로서 알려져 있는 추가의 DNA 를 세포에 도입되는 혼합물에 첨가하는 것이 유리할 수도 있다.
세포가 DNA 를 흡수한 후에, 세포는 적절한 증식 배지에서 전형적으로는 1 내지 2 일동안 성장하여 관심의 유전자를 발현시키기 시작한다. 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 종래의 어떤 배지, 예를 들어, 적절한 보충물을 함유하는 미네랄 또는 복합 배지일 수 있다. 적절한 배지는 상공급업자로부터 구입할 수 있거나, 공개된 방법(예를 들어, 아메리칸 타잎 컬춰 콜렉션의 카탈로그에 설명된 방법)에 따라서 제조될 수 있다. 배지는 당업계에 공개된 방법을 사용하여 제조된다(예를 들어, 박테리아와 효모에 대한 참고문헌; Bennett, J.W. 및 LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991을 참조하시오). 증식 배지는 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 필수 당, 비타민, 염, 인지질, 단백질 및 성장 인자들을 함유하고 있다. γ-카르복실화된 변형 인자 VII 의 생성을 위해서는, 배지에는 바람직하게는 약 0.1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 농도의 비타민 K 가 함유될 것이다. 그런 다음 약물 선택이 안정한 방식으로 선택가능한 마아커를 발현하는 세포의 성장에 대해 선택하기 위하여 적용된다. 증폭가능한 선택성 마아커로 트랜스펙션된 세포에 대해서는 클론된 서열의 증가된 복사수를 선택하기 위하여 약물 농도가 증가될 수 있으며, 그로써 발현 수준이 증가된다. 안정하게 트랜스펙션된 세포들의 클론은 다음 단계로 바람직한 인자 VII 변이체의 발현에 대하여 스크린된다.
바람직한 포유동물 셀라인은 CHO(ATCC CCL 61) COS-1(ATCC CRL 1650), 어린 햄스터 신장 (BHK) 및 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)셀라인을 포함한다. 바람직한 BHK 셀라인은 tk_ ts13 BHK 셀라인(Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982)으로, 본원에서는 이하 BHK 570 세포로 언급된다. BHK 570 셀라인은 미국 메릴랜드주 록빌 파크로운 드라이브 12301 에 소재하는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 ATCC 승인번호 CRL 10314 로 기탁되었다. tk- ts13 BHK 셀라인도 또는 ATCC 로부터 승인 번호 CRL 1632 하에 활용될 수 있다. 또한, Rat Hep I (쥐의 간암; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (쥐의 간암; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 사람 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), 및 DUKX 세포(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)를 포함하여 많은 다른 셀라인이 사용될 수 있다.
트랜스제닉 동물 기법이 인자 VII 변이체를 제조하기 위하여 사용될 수도 있다. 숙주인 암컷 포유류의 유선내에서 단백질을 제조하는 것이 바람직하다. 유선 내에서의 발현 및 후속되는 관심의 단백질의 밀크안으로의 분비는 다른 공급원으로부터 단백질을 단리할 때 부딪히는 많은 어려움을 극복하게 해준다. 밀크는 쉽게 수집되며, 대량으로 활용가능하고, 생화학적으로도 특성확인이 잘 되어 있다. 나아가, 주요 밀크 단백질이 고농도 (전형적으로 약 1 내지 15 g/l)로 밀크에 존재한다.
상업적인 관점에서, 숙주로서 대량의 밀크를 생산하는 종을 사용하는 것이 분명히 바람직하다. 마우스 및 쥐와 같은 더 작은 동물들도 사용될 수 있는 한편 (이런 동물들은 기본 단계의 증명에 바람직하다), 그것에 제한되는 것은 아니지만 돼지, 염소, 양 및 소와 같은 가축 포유동물을 사용하는 것이 바람직하다. 양이 특히, 이 종에서의 트랜스제네시스 (transgenesis)의 이전의 역사, 밀크 생산율, 비용 및 양의 밀크를 수집하기 위한 장비의 용이한 이용성과 같은 인자들로 인하여 바람직하다(숙주 종의 선택에 영향을 미치는 인자들의 비교를 위해서는 WIPO 공보 WO 88/00239 호를 참조한다). 일반적으로 유제품 사용을 위하여 사육된 숙주 동물, 예를 들면 이스트 프리슬랜드 양과 같은 동물의 사육을 선택하거나, 또는 나중에 유전자교환 라인의 사육에 의하여 유제품 원액을 도입시키는 것이 바람직하다. 어느 경우든, 건강 상태가 양호한 공지의 동물이 사용되어야 한다.
유선에서의 발현을 얻기 위하여, 밀크 단백질 유전자로부터 얻어지는 전사 프로모터가 사용된다. 밀크 단백질 유전자로는 카제인을 코드화하는 유전자 (미국 특허 제 5,304,489 호), β-락토글로불린을 코드화하는 유전자, a-락트알부민을 코드화하는 유전자, 및 유장의 산성 단백질을 코드화하는 유전자가 있다. β-락토글로불린(BLG) 프로모터가 바람직하다. β-락토글로불린 유전자의 5' 플랭킹 프로모터와 비-코딩 부분을 포함하는 약 4.25 kbp 의 DNA 단편과 같은 약 5 kbp 이하의 보다 큰 5' 플랭킹 서열의 부분이 바람직하긴 하지만, 양의 β-락토글로불린 유전자의 경우에, 유전자의 5' 플랭킹 서열의 최소한 기부의 406 bp 의 영역이 일반적으로 사용될 것이다 (Whitelaw et al., Biochem. J. 286:31-39 (1992) 참조). 다른 종으로부터 유래되는 프로모터 DNA 의 유사한 단편도 또한 적당하다.
β-락토글로불린 유전자의 다른 영역도 또한 발현될 유전자의 게놈성 영역이 그러한 것처럼 구성체에 통합될 수 있다. 인트론이 결여된 구성체는 예를 들면 그러한 DNA 서열을 함유하는 구성체와 비교하여 불충분하게 발현된다는 것은 일반적으로 당해 기술분야에서 받아들여지고 있다 (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:478-482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1:3-13 (1991); 본원에 참고문헌으로 수록된 WO 89/01343; 및 WO 91/02318 참조). 이런 견지에서, 일반적으로는, 가능하다면, 관심의 단백질 또는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자의 천연 인트론을 전부 또는 일부 함유하고 있는 게놈 서열을 사용하는 것이 바람직하며, 그로써 예를 들면 β-락토글로불린 유전자로부터 유래되는 최소한 약간의 인트론이 추가로 함유되는 것이 바람직하다. 그러한 한 영역은 양의 β-락토글로불린 유전자의 3' 비-코딩 영역으로부터 인트론 스플라이싱 및 RNA 폴리아데닐화를 제공하는 DNA 단편이다. 유전자의 천연 3' 비-코딩 서열에 대하여 치환되는 경우, 이 양의 β-락토글로불린 단편은 관심의 단백질 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 증강시키고 또 안정화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 인자 VII 변이체 서열의 개시 코돈 ATG 를 둘러싸고 있는 영역은 밀크 특이적 단백질 유전자로부터 유래된 상응하는 서열로 치환된다. 그러한 치환은 발현을 증강시키기 위한 추정되는 조직-특이적 개시 환경을 제공한다. 비록 더작은 영역도 치환될 수 있지만, 전체의 변이체 인자 VII 프레-프로 및 5' 비-코딩 서열을, 예를 들면 BLG 유전자의 그것들로 치환하는 것이 편리하다.
트랜스제닉 동물에서의 인자 VII 변이체의 발현을 위해서는, 인자 VII 변이체를 코드화하는 DNA 단편이 발현 유니트를 생성하기 위하여 그것의 발현에 요구되는 추가의 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 그러한 추가의 단편은 상기 언급된 프로모터 뿐만 아니라 mRNA 의 전사 및 폴리아데닐화의 종결을 제공하는 서열을 포 함한다. 발현 유니트는 추가로 변형된 인자 VII 을 코드화하는 단편에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 코드화하는 DNA 단편을 포함할 것이다. 분비 신호 서열은 천연 인자 VII 분비 신호 서열이거나 또는 다른 단백질, 예를 들면 밀크 단백질의 분비 신호 서열일 수 있다(예컨대 본원에 참고문헌으로 수록된 von Heinje, Nuc. Acids Res. 14:4683-4690 (1986); 및 Meade 등의 미국 특허 제 4,873,316 호 참조).
트랜스제닉 동물에 사용하기 위한 발현 유니트의 구성은, 비록 발현 유니트가 본질적으로는 어떠한 서열의 라이게이션에 의해서든지 구성될 수 있다 하여도, 편리하게는 변이체 인자 VII 서열을 추가의 DNA 단편을 함유하고 있는 플라스미드 또는 파지 벡터안에 삽입시킴으로써 수행된다. 특히 밀크 단백질을 코드화하는 DNA 단편을 함유하고 있는 벡터를 제공하고 밀크 단백질에 대한 코딩 서열을 변이체 인자 VII 폴리펩티드의 코딩 서열로 치환시킴으로써 밀크 단백질 유전자의 발현 조절 서열을 포함하는 유전자 융합물을 생성하는 것이 편리하다. 어떤 경우에든지, 발현 벡터를 플라스미드 또는 다른 벡터안에 클로닝하는 것은 인자 VII 변이체 서열의 증폭을 용이하게 해준다. 증폭은 편리하게는 박테리아(예컨대 대장균) 숙주 세포에서 수행되며, 그로써 벡터는 전형적으로 박테리아 숙주 세포에서 작용할 수 있는 복제 기원 및 선택가능한 마아커를 포함하게 된다. 그런 다음 발현 유니트는 선택된 숙주 종의 수정란(초기-단계 배를 포함함) 안에 도입된다. 이종 DNA 의 도입은 미소주사 (예컨대 미국 특허 제 4,873,191 호), 레트로바이러스 감염 (Jaenisch, Science 240:1468-1474 (1988)) 또는 배의 줄기(ES) 세포를 사용하는 부위-특정 통합 (Bradley et al., Bio/Technology 10:534-539 (1992))을 포함하여 여러 가지 경로중 한 가지에 의하여 이루어질 수 있다. 그런 다음 수정란은 위임신 상태의 암컷의 난관 또는 자궁에 이식되어 일정 기간동안 발생되도록 허용된다. 자신의 생식세포(germ line)에 도입된 DNA 를 함유하고 있는 자손은 멘델의 법칙대로 정상적으로 그들의 자손에게 DNA 를 계대시킬 수 있으며, 따라서 대량의 트랜스제닉 개발이 가능해진다. 트랜스제닉 동물을 제조하는 일반적인 과정은 당해 기술분야에 알려져 있다. (예를 들어 Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32:645-651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9:835-838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9:844-847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49:113-120 (1992); 미국 특허 제 4,873,191 호 및 4,873,316 호; WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; 및 GB 87/00458 참조). 외래 DNA 서열을 포유동물 및 그것들의 생식 세포안에 도입시키는 기법들이 처음에는 마우스에서 개발되었다. (예를 들어 Gordon et al., Proc. Natl. Acsd. Sci. USA 77:7380-7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214:1244-1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41:343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985); 및 Hogan et al., 상기 동일 문헌 참조.) 이들 기법은 계속해서 가축 종을 포함하여 보다 큰 동물에 사용하기 위하여 채택되었다 (예컨대 WIPO 공보 WO 88/00239, WO 90/05188, 및 WO 92/11757; 및 Simons et al., Bio/Technology 6:179-183 (1988)). 요약하면, 트랜스제닉 마우스 또는 가축의 생성에 지금까지 사용된 가장 효과적인 경로에서는, 관심의 DNA 의 수백개의 선형 분자들이 확립된 기법을 따라 수정란의 전핵 (pro-nuclei)중 하나에 주사된다. 접합체의 세포질안에 DNA 를 주사하는 방법도 또한 사용될 수 있다.
트랜스제닉 식물에서의 제조도 또한 사용될 수 있다. 발현은 일반화될 수도 있고 또는 특정 기관, 예컨대 뿌리혹에 특정될 수도 있다 (Hiatt, Nature 344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); 및 유럽 특허 공보 EP 255,378 호 참조).
본 발명의 인자 VII 변이체는 세포 배지 또는 밀크로부터 회수된다. 본 발명의 인자 VII 변이체는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배척), 전기영동 과정(예를 들어, 예비 등전 집적(IEF), 상이한 용해성(에를 들어, 암모니움 술페이트 침전), 또는 추출(예를 들어, Protein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)을 제한없이 포함하는 다양한 과정에 의해서 정제될 수 있다. 바람직하게는, 인자 VII 변이체는 항-인자 VII 항체 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다. 문헌 (Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108 (1986) 및 Thim et al., Biochem. 27:7785-7793 (1988))에서 설명된 바와 같이, 칼슘-의존성 단클론성 항체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 추가의 정제는 종래의 화학적 정제방법, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 시트르산 바륨 침전법을 포함한 다른 정제 방법들도 당해 기술분야에 공지이며, 본원에서 설명된 신규한 변형 인자 VII 의 정제에도 적용될 수 있다(예를 들어, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982 참조).
치료적 목적을 위하여 본 발명의 인자 VII 변이체는 실질적으로 순수한 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 인자 VII 변이체는 적어도 약 90 내지 95 % 의 균질성으로 정제되고, 바람직하게는 적어도 약 98% 균질성으로 정제된다. 순도는 예를 들어, 겔 전기영동 및 아미노-말단 아미노산 시퀀싱으로 평가될 수 있다.
인자 VII 변이체는 그것의 활성화 부위에서 절단되어 그것의 2-사슬 형태로 전환된다. 활성화는 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정, 예컨대 문헌에 기재되어 있는 과정(Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, 미국 특허 제 4,456,591 호; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); 또는 Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983))을 따라 수행될 수 있다. 대안으로, Bjoern 등의 문헌(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)에 설명된 대로, 인자 VII 은 이온 교환 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 Mono Q
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(Pharmacia fine Chemicals)등과 같은 칼럼을 통하여 인자 VII 을 통과시킴으로써 활성화 될 수 있다. 그 결과의 분자는 정제되고 하기 설명되는 바와 같이 투여된다.
검정
본 발명은 또한 본 발명에 따른 바람직한 인자 VIIa 변이체를 선택하기 위한 적합한 검정을 제공한다. 이러한 검정은 간단한 예비적인 생체외 시험에 의해 수행될 수 있다.
그러므로, 본원의 실시예 11은 본 발명의 인자 VIIa 변이체의 활성에 대한 간단한 시험("생체외 가수분해 검정")을 설명한다. 이를 근거로, 본원에 정의된 "생체외 가수분해 검정"에서 시험될 때, 특정 관심의 인자 VIIa 변이체는 도1에 나타낸 변이체의 활성과 천연 인자 VII의 활성비가 1.0 이상, 예를 들어, 적어도 약 1.25, 바람직하게는 적어도 약 2.0, 적어도 약 3.0 과 같은, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 4.0 인 변이체이다.
또한, 변이체의 활성이 적합하게 100 내지 1000nM의 농도로 인자 X와 같은 생리학적인 기질을 사용하여 측정될 수 있으며(생체외 단백질가수분해 검정, 실시예 12 참조), 이 경우 생성된 인자 Xa가 적합한 색원체 기질(예를 들어, S-2765)의 첨가 후 측정된다. 게다가, 활성 분석은 생리학적인 온도에서 수행될 수 있다.
또한, 변이체의 트롬빈 생성력이 생리학적인 농도의 모든 관련된 응고 인자(혈우병 A 상태를 의태하는 경우는 인자 VIII를 뺀다) 및 저해제 및 활성화된 혈소판을 포함하는 검정에서 측정될 수 있다(본원에 참고자료로 수록된 Monroe 등 (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, p 543에 설명됨).
투여 및 약학적 조성물
본 발명에 따른 인자 VII 변이체는 혈병 인자 결핍(예를 들어, 혈우병 A 및 B 또는 응고 인자 XI 또는 VII 의 결핍) 또는 혈병 인자 저해제와 같은 몇몇의 원 인을 가지는 출혈 장애를 조절하기 위해 사용될 수 있거나, 변이체는 정상적으로 기능중인 혈액 혈병화 캐스케이드를 갖는 피험자에서(혈병화 인자 결핍 또는 응고 인자 중 어느 것에 대한 저해제가 없는) 발생하는 과도한 출혈을 조절하는데 사용될 수 있다. 출혈은 결함있는 혈소판 기능, 혈소판 감소증 또는 폰빌레브란드병에 의해서 야기될 수 있다. 이것은 다양한 자극으로 유도된 증가된 피브린 분해 활성을 가진 피험자에게서 보여질 수 있다.
수술 또는 큰 외상에 관련된 과도한 조직 손상을 경험한 피험자에서, 정상 지혈 메카니즘은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 압도될 수 있으며, 그것들은 정상인 지혈 메카니즘에도 불구하고 출혈을 발생시킬 수 있다. 또한, 만족스러운 지혈을 달성하는 것은, 외과적 지혈에 대해 제한된 가능성을 갖는 뇌, 내이 영역 및 눈과 같은 기관에서 출혈이 일어날 때 문제가 된다. 동일한 문제가 여러 기관(간, 폐, 종양 조직, 위장관)으로부터 바이옵시스를 취하는 과정에서 뿐만 아니라 복강경 수술에서도 발생할 수 있다. 모든 이들 상황에 공통적인 것은 외과적 기술(봉합, 클립 등)에 의한 지혈을 제공하는 것이 어렵다는 점이다. 급성 및 대량 출혈이 항응고제 치료중인 피험자에서 발생할 수 있으며, 이 경우 결함있는 지혈이 주어진 치료법에 의해 유도된다. 그러한 피험자는 항응고제 효과가 빠르게 상쇄되지 않는 경우에 외과적 개입이 필요할 수 있다. 만족스럽지 않은 지혈의 경우에 문제를 일으킬 수 있는 다른 상황은 혈전색전증 질환을 예방하기 위해서 정상적인 지혈 메카니즘을 갖는 피험자에게 항응고제 치료를 제공할 때이다. 그러한 치료법은 헤파린, 다른 형태의 프로테오글리칸, 와파린 또는 다른 형태의 비타민 K-길항제 뿐만 아니라 아스피린 및 다른 혈소판 응고 저해제를 포함한다.
응고 캐스케이드의 전신 활성은 파종성 혈관내 응고증(DIC)을 유발할 수 있다. 그러나, 다량의 재조합 FVIIa 로 치료된 피험자에서는 혈관벽 손상 부위에 노출된 FVIIa 및 TF 간의 복합체 형성으로 유도된 국부화된 지혈 과정에 기인하여, 이러한 합병증이 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 인자 FVII 변이체는 정상 지혈 메카니즘에 관련된 이러한 과도한 출혈을 조절하기 위해서 그들의 활성화된 형태로 사용될 수 있다.
의도적인 개입과 관련된 치료에 대해서, 인자 VII 및 인자 XIII는 전형적으로 개입을 수행하기 전 약 24시간 내에 투여되며, 그후 약 7일 이상 정도 투여될 것이다. 응고제로서의 투여는 본원에 설명된 여러 경로에 의할 수 있다.
인자 VII의 용량은 로딩 및 유지 용량으로서 70kg 피험자에 대해 약 0.05mg 내지 약 500mg/일의 범위이며, 예를 들어 약 1mg 내지 약 200mg/일, 또는 예를 들어 약 10mg 내지 약 175mg/일이고, 이것은 피험자의 체중, 상태 및 상태의 심함에 의존한다.
약학적 조성물은 1차적으로는 예방적 및/또는 치료적 치료를 위하여 비경구용으로 의도된다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 비경구적으로, 즉 정맥내, 피하 또는 근육내적으로 투여되거나, 또는 연속 또는 박동성 주입에 의해 투여된다. 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게 수성 담체와 조합하여, 바람직하게는 이 중에 용해하여 인자 VII 및 인자 XIII를 포함한다. 물, 완충수, 0.4% 살린, 0.3% 글리신 등과 같은 여러 가지 수성 담체가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 인자 VII 변이체가 상처 부위로 송달하거나 또는 상처 부위를 표적화 하기 위해 리포솜 제제로 조제될 수 있다. 리포솜 제제는 일반적으로 예를 들어 U.S. 4,837,028, U.S. 4,501,728 및 U.S. 4,975,282에 설명된다. 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균 기술에 의해서 멸균될 수 있다. 결과이 수성 용액은 사용을 위해서 패키지 되거나, 또는 무균 상태에서 여과되고 동결건조되며, 이 동결 건조된 제제가 투여전에 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 생리학적인 조건에 가깝게 할 필요에 따라서 pH 조정 및 완충제, 강직성 조정제, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등과 같은 약학적으로 허용가능한 보조제 물질을 함유할 수 있다.
이러한 제제에서 인자 VII 변이체의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 즉 약 0.5중량% 미만에서부터, 통상 약 1중량% 또는 적어도 약 1%, 15 또는 20중량% 정도까지이고, 이것은 선택된 특정한 투여 모드에 따라서 유체 부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.
따라서, 정맥내 주입용의 전형적인 약학적 조성물은 멸균 링거액 250ml 및 인자 VII 변이체 10mg을 함유하도록 만들어질 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 명백할 것이며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Pubilshing Company, Easton, PA (1990)에 더욱 상세히 설명된다.
본 발명에 따른 인자 VII 변이체를 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 용도에서, 조성물은 상술된 바와 같은 질 환으로 이미 고통받고 있는 피험자에게 이 질환 및 질환의 합병증을 치유, 완화 또는 부분적 정지시키는데 충분한 양으로 투여된다. 이것을 달성하는데 적합한 양은 '치료적 유효량'으로 정의된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 이 목적을 위한 효과적인 양은 질환 또는 상처의 심함 뿐만 아니라 피험자의 체중 및 일반적 상태에 의존할 것이다. 그런, 유효량은 일반적으로 70kg 피험자에 대해 인자 FVII 변이체의 약 0.05mg 내지 약 500mg/일의 범위이며, 예를 들어 약 인자 VII 변이체의 1mg 내지 약 200mg/일의 용량이다.
본 발명의 물질이 일반적으로 심각한 질환 또는 상처의 상태, 즉 생명을 위협하거나 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용될 수 있다는 것을 기억해야 한다. 그러한 경우, 외래적 물질 및 사람에서 인자 VIIa 및 인자 XIII에 대한 면역성의 일반적인 결여를 최소화한다는 관점에서, 치료의에 의해 이들 조성물을 실질적으로 과량 투여하는 것이 가능하며 바람직할 수 있다.
예방적 용도에서, 인자 VIIa 및 인자 XIII를 함유하는 조성물은 피험자 자신의 응고 능력을 증진시키기 위해서 질환 상태 또는 상처로 의심되거나 또는 달리 이런 위험에 처한 피험자에게 투여될 수 있다. 그러한 양은 '예방적 유효 용량'으로 정의된다. 예방적 이용에서, 정확한 양은 일단 피험자의 건강 상태 및 체중에 의존하지만, 용량은 일반적으로 70kg 피험자에 대해 약 0.05 내지 약 500mg/일이고, 더욱 일반적으로는 70kg 피험자에 대해 약 1.0 내지 약 200mg/일이다.
조성물의 단일 또는 다수 투여가 치료의에 의해 선택되는 용량 레벨 및 패턴을 사용하여 수행될 수 있다. 일일 유지 수준을 요구하는 보행 피험자의 경우에, 인자 VII 변이체는 예를 들어, 휴대용 펌프 시스템과 같은 연속적인 주입에 의해서 투여될 수 있다.
본 발명의 인자 VII 변이체의 국부적 송달이 예를 들어 분무, 관류, 2겹 풍선 카테테르, 스텐트, 혈관 이식편 또는 스텐트에의 결합, 풍선 카테테르를 코팅하는데 사용되는 하이드로겔, 또는 다른 잘 확립된 방법에 의해 수행될 수 있다. 어떤 사건에서든 약학적 조성물은 피험자를 효과적으로 치료하는데 충분한 양의 인자 VIIa 및 인자 XIII를 제공해야 한다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 예시되지만, 이것이 보호의 범위를 제한하지는 않는다. 전술한 명세서 및 다음의 실시예에 개시된 특징은 개별적으로 및 그것들의 어떤 조합으로 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료일 수 있다.
다음 실시예에 사용된 아미노산 치환기에 대한 용어는 다음과 같다. 제1의 문자는 SEQ ID NO:1 의 위치에 본래 존재하는 아미노산을 나타낸다. 다음 숫자는 SEQ ID NO:1 에서의 위치를 나타낸다. 제2의 문자는 천연 아미노산을 (대체하기 위해서) 치환하는 다른 아미노산을 나타낸다. 예로서, SEQ ID NO:1 의 위치 298 에서 메티오닌이 글루타민으로 치환된 경우에는 M298Q 이다. 다른 예에서, V158T/M298Q 는 동일한 인자 VII 폴리펩티드에서 SEQ ID NO:1 의 위치 158 에서의 발린이 트레오닌으로 치환되고, SEQ ID NO:1 의 위치 298에서 메티오닌이 글루타민으로 치환된다.
(실시예 1)
[V158T/M298Q]-FVII, fK157A1-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII 및 [V158D/E296V]-FVII, [V158D/M298Q]-FVII, [V158D/M298K]-FVII, [V158D/E296V/ M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [S336G]-FVII, [K337A]-FVII, [158D/E296V/M298Q/ K337A]-FVII를 코드화하는 DNA.
[V158T/M298Q]-FVII, [K157A]-FVII, [E296V]-FVII, [E296V/M298Q]-FVII 및 [Vl58D/E296V]-FVII, [Vl58DIM298Q)-FVII, [Vl58D/M298K]- FVII, [V158D/E296V/ M298Q]-FVII, [M298Q]-FVII, [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII, [S336G]-FVII, 및 [K337A]-FVII 를 코드화하는 DNA 구조체를 원하는 돌연변이를 포함하며, 관심의 삽입체와 2개의 합성 프라이머를 가지는 초나선, 2중 사슬 DNA 벡터를 사용하여 부위-특정 돌연변이생성법으로 제조하였다. 다음의 프라이머 쌍이 사용되었다.
[K157A]-FVII:
5'-CCG AAT TGT GGG GGG CGC GGT GTG CCC CAA AGG G-3' (SEQ ID NO : 2)
5'-CCC TTT GGG GCA CAC CGC GCC CCC CAC AAT TCG G-3' (SEQ ID NO : 3)
[V158D]-FVII :
5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID NO : 4)
5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID NO : 5)
[V1 58T]-FVII :
5'-GTG GGG GGC AAG ACG TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID NO : 6)
5'-CCC CTT TGG GGC ACG TCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID NO : 7)
[E296V/M298Q]-FVII :
5'-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO : 8)
5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID NO : 9)
[M298Q]-FVII :
5'-GCC CTG GAG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID NO : 10)
5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID NO : 11)
[M298K]-FVII :
5'-GCC CTG GAG CTC AAG GTC CTC AAC GTG-3' (SEQ ID NO : 12)
5'-CAC CTT GAG GAC CTT GAG CTC CAG GGC-3' (SEQ ID NO : 13)
[S336G]-FVII :
5'-GGC TAC TCG GAT GGC GGC AAG GAC TCC TGC AAG-3' (SEQ ID NO : 14)
5'-CTT GCA GGA GTC CTT GCC GCC ATC CGA GTA GCC-3' (SEQ ID NO : 15)
[K337A]-FVII :
5'-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO : 16)
5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO : 17)
벡터의 반대 사슬에 대하여 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 폴리머라제에 의해서 온도 순환동안 연장되었다. 프라이머 통합시에, 지그재그 닉크(staggered nick)를 함유하는 돌연변이된 플라스미드가 생성되었다. 온도 순환에 이어서, 생성물을 메틸화 및 반메틸화 DNA 에 특이적인 DpnI 으로 처리하여 모 DNA 주형을 분해하고 돌연변이를 함유하는 합성된 DNA 를 선택하였다.
특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응을 사용하여 DNA 구조체를 제조하는 과정은 당업자에게 잘 알려진다(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA 참조).
(실시예 2)
[V158T/M298Q]-FVII의 제조
변이체 [V158T/M298Q]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [V158T/M298Q]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨 가하거나 [V158T/M298Q]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 3)
[K157A]-FVII의 제조
변이체 [K157A]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [K157A]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [K157A]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 4)
[V158D/M298Q]-FVII의 제조
변이체 [V158D/M298Q]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [V158D/M298Q]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [V158D/M298Q]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 5)
[V158D/M298K]-FVII의 제조
변이체 [V158D/M298Q]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [V158D/M298K]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하 는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [V158D/M298K]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 6)
[V158D/E296V/M298Q]-FVII의 제조
변이체 [V158D/E296V/M298Q]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [V158D/E296V/M298Q]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [V158D/E296V/M298Q]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 7)
[M298Q]-FVII의 제조
변이체 [M298Q]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [M298Q]-FVII 를 함 유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [M298Q]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 8)
[S336G]-FVII의 제조
변이체 [S336G]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [S336G]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [S336G]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 9)
[K337A]-FVII의 제조
변이체 [K337A]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [K337A]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [K337A]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 10)
[V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII의 제조
변이체 [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII 를 발현시키기 위해서, BHK 세포를 이미 설명된 대로 본질적으로 트랜스펙션시켰다(Thim 등(1988)Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielson(1996)FEBS Lett. 385,241 243). 인자 VII 변이체를 다음과 같이 정제하였다:
조정 배지를 5mM EDTA, 0.1% Triton X-100 및 10mM Tris의 첨가후에 물을 첨가하여 pH 8.0 과 10-11mS/cm 의 전도율로 조정된, Q 세파로스 고속 유동(Pharmacia Biotech)의 25ml 칼럼상에 로딩하였다. 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM Tris 의 경우에 pH 8.0, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% Triton X-100, pH 8.0 에서 단계적으로 단백질을 용출시켰다. [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII 를 함유하는 분획을 모아서 CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia Biotech)에 결합된 단일클론 항체 F1A2(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)를 함유하는 25ml 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 10 mM CaCl2, 100 mM NaCI 및 0.02% Triton X-100 을 함유하는 pH 7.5 의 50 mM Hepes 로 평형화시켰다. 평형 완충액 및 2M NaCl 을 함유하는 평형 완충액으로 세척한 후에, 결합된 물질을 CaCl2 대신에 10mM EDTA 를 함유하는 평형 완충액으로 용출시켰다. 사용 또는 저장전에, EDTA 이상의 과량의 CaCl2 를 첨가하거나 [V158D/E296V/M298Q/K337A]-FVII 를 Ca2+-함유 완충액에 옮겼다. 각 단계의 수율을 인자 VII ELISA 로 측정하였고 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
(실시예 11)
생체외 가수분해 검정
천연(야생형) 인자 VIIa 및 인자 VIIa 변이체(이하에서는 모두 "인자 VIIa"라고 함)를 그들의 특이적 활성을 직접적으로 비교하기 위해서 평행하게 분석한다. 검정은 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다(MaxiSorp, Nunc, Denmark). 최종 농도 1mM 의 색원체 기질 D-Ile-Pro-Arg-p-니트로아닐리드(S-2288, Chromogenix, Sweden)를 0.1M NaCl, 5mM CaCl2 및 1mg/ml 소혈청 알부민을 함유하는 50mM Hepes 내의 인자 VIIa(최종 농도 100nM)에 첨가한다. 405 nm 에서의 흡광도를 SpectrMaxTM340 플레이트 해독기상(Molecular Devices, USA)에서 연속적으로 측정한다. 효소를 함유하지 않는 블랭크 웰에서의 흡광도를 뺀후에, 20분 인큐베이션동안에 전개된 흡광도가 변이체와 야생형 인자 VIIa 의 활성비를 계산하는데 사용된다:
비율=(A405nm 인자 VIIa 변이체)/(A405nm 인자 VII 야생형)
(실시예 12)
생체외 단백질 가수분해 검정
천연(야생형) 인자 VIIa 및 인자 VIIa 변이체(이하에서는 모두 "인자 VIIa"라고 함)를 그들의 활성을 직접 비교하기 위하여 평행하게 분석한다. 분석은 마이크로타이터 플레이트(MaxiSorp, Nunc, Denmark)에서 수행된다. 0.1M NaCl, 5mM CaCl2 및 1mg/ml 소혈청 알부민을 함유하는 pH 7.4, 100μL 50mM Heps 내의 인자 VIIa(10nM) 및 인자 X(0.8μM)를 15분동안 인큐베이션한다. 그 다음, 인자 X 절단을 0.1M NaCl, 20mM EDTA 및 1mg/ml 소혈청 알부민을 함유하는 pH 7.4 의 50㎕ 50mM Hepes 를 첨가함으로써 중지시킨다. 발생된 인자 Xa 의 양을 최종 농도 0.5mM 의 색원체 기질 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-니트로아날라이드(S-2765, Chromogenix, Sweden)을 첨가함으로써 측정한다. 405nm 에서의 흡광도를 SpectrMaxTM 340 플레이트 해독기(Molecular Devices, USA)에서 연속적으로 측정한다. FVIIa를 함유하지 않는 블랭크 웰에서의 흡광도를 뺀후에, 10분안 전개된 흡광도를 변이체와 야생형 인자 VIIa 의 단백질 분해 활성비를 계산하는데 사용한다:
비율=(A405nm 인자 VII 변이체)/(A405nm 인자 VII 야생형)
(실시예 13)
실시예 11 및 12에 설명된 검정법에서 측정된 FVII 변이체의 상대적 활성도
변이체 실시예 11에서의 비율 실시예 12에서의 비율
K157A 0.9 결정되지 않음
V158T/M298Q-FVlla 3.8 10
V158D/M298Q-FVlla 2.0 2.7
V158D/M298K-FVlla 0.3 결정되지 않음
V158D/E296V/M298Q-FVlla 7.8 28
M298Q-FVlla 3.4 5.5
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVlla 11.0 47
S336G-FVlla 0.6 결정되지 않음
K337A-FVlla 3.9 4.4
wt-FVlla 1.0 1.0
<110> NOVO NORDISK A/S <120> HUMAN COAGULATION FACTOR VII VARIANTS <150> DK PA 2000 01361 <151> 2000-09-13 <150> US 60/236,455 <151> 2000-09-29 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (6)..(7) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <220> <221> VARIANT <222> (16) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <220> <221> VARIANT <222> (19)..(20) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <220> <221> VARIANT <222> (25)..(26) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <220> <221> VARIANT <222> (29) <223> Xaa is GLA (4-carboxyglutamic acid). <400> 1 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer for preparation of [K157A]-FVII <400> 2 ccgaattgtg gggggcgcgg tgtgccccaa aggg 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer for preparation of [K157A]-FVII <400> 3 ccctttgggg cacaccgcgc cccccacaat tcgg 34 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> DNA primer for preparation of [K337A]-FVII <400> 17 cccttgcagg agtccgcgct gccatccg 28 <210> 18 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Thr Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 19 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Val Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 20 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 21 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Lys Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 22 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Val Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 23 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Val Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Ala Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (74)

  1. SEQ ID NO:1 의 서열에 대하여 치환변이를 가지는 변이된 인자 VII 폴리펩티드로서,
    i) SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것;
    ii) SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 Arg, Lys, 및 Val 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것;
    iii) SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 Lys, Arg, Gln, 및 Asn 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것; 및
    iv) SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것; 으로부터 선택된 하나 이상의 치환변이를 가지는 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 의 위치 157 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 의 위치 334 의 Asp 에 해당하는 아미노산이 Gly, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  4. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 의 위치 336 의 Ser 에 해당하는 아미노산이 Gly, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인자 VII 폴리펩티드는 사람 인자 VII 인 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 인자 VII 폴리펩티드는 사람 인자 VIIa 인 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  7. 제 1항에 있어서, 변이된 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:21 로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 아미노산 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  8. 제 1항에 있어서, 변이된 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:22 에 따른 아미노산 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  9. 제 1항에 있어서, 변이된 인자 VII 폴리펩티드는 SEQ ID NO:23 에 따른 아미노산 서열을 가지는 인자 VII 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 변이된 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 구조체.
  11. 제 10항에 있어서, 핵산 구조체가 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  12. 제 10항에 따른 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 기원인 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포, BHK 세포, 및 HEK 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
  15. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 변이된 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 변이된 인자 VII 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계와 배지로부터 결과의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이된 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  16. SEQ ID NO:1 의 서열에 대하여 치환변이를 가지는 변이된 인자 VII 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 출혈 사건의 치료용 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약학적 조성물로서, 상기 변이된 인자 VII 폴리펩티드는
    (i) SEQ ID NO:1 의 위치 158 의 Val 에 해당하는 아미노산이 Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것;
    (ii) SEQ ID NO:1 의 위치 296 의 Glu 에 해당하는 아미노산이 Arg, Lys, 및 Val 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것;
    (iii) SEQ ID NO:1 의 위치 298 의 Met 에 해당하는 아미노산이 Lys, Arg, Gln, 및 Asn 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것; 및
    (iv) SEQ ID NO:1 의 위치 337 의 Lys 에 해당하는 아미노산이 Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, 및 Glu 으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 것; 으로부터 선택된 하나 이상의 치환변이를 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 변이된 인자 VII 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 출혈 사건의 치료용 또는 정상 지혈 시스템의 증강용 약학적 조성물.
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