CN102732480A - N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性t细胞的绝对数量在体外扩增上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用，并且找出了其促进体外扩增的最适浓度。该方法具有安全性高、成本低廉等优点，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用。
背景技术
Ｎ-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，简称NAC）是细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）的前体，NAC分子式:C5H9NO3S,相对分子质量:163·20。NAC曾作为一种黏液溶解剂多年来应用于治疗各种呼吸系统疾病。近年又发现NAC具有肝细胞保护作用而用于治疗多种原因引起的肝细胞损害,其中NAC治疗对乙酰氨基酚致急性肝功能衰竭已获得美国FDA批准。近年研究显示,NAC具有多种药理作用,它可以直接清除自由基,增加机体抗氧化应激能力,并可减少炎性细胞因子、趋化因子和黏附分子产生。此外,NAC还可以调节机体免疫状态和细胞凋亡程序。许多文献和实验结果均显示NAC作为一种含活性巯基抗氧化剂，无毒副作用，具备较高的生物安全性，除医疗用途之外，也广泛应用于细胞系的培养，可有效地维持细胞系的存活。
由于T细胞在免疫系统中起着重要的作用，越来越多的研究小组尝试运用T细胞的过继治疗的方式来进行肿瘤治疗。中央记忆性T细胞（TCM）具有自我更新的能力，而且应答时间短，作用时间长，对人体的副作用小。今年来，多个研究组报道，发现具有记忆功能的T细胞回输肿瘤患者体内以后，治疗效果明显并且持续治疗时间长，可以减少患者的痛苦以及降低细胞体外培养次数过多的生物安全风险。但是在人体内相对数量较少，且由于体外长时间培养的T细胞会使T细胞失去活力，绝大部分细胞分化为终末分化的效应细胞，使得回输体内的T细胞存活时间过短，无法产生持续的杀伤肿瘤细胞的功能，因此如何在体外获得大量的记忆性T细胞是细胞免疫治疗的一个新的研究热点。
目前，国外的许多研究小组通过构建人工抗原提呈细胞，将其应用于T细胞的体外培养，提高T细胞的存活时间，用于过继免疫治疗，但要获得足够量的T细胞，技术要求复杂，培养的成功率较低。在进行T细胞治疗时，主要策略是先通过克隆扩增，得到足够量的具有杀伤功能的T细胞，可以与DC等提呈细胞共培养，也可以直接用相关肿瘤抗原刺激细胞克隆扩增，得到具有特定肿瘤抗原特异性的T细胞。此种办法培养得到的T细胞未经过任何转基因修饰，安全性较高。但这种肿瘤高反应性的细胞需要扩增至临床需要的109－1011治疗剂量的数量数，过程持续时间比较长，对于肿瘤患者来说时间也是一个需要更多考虑的因素。而且体外培养的时间长，细胞容易变老，活力下降，多为终末分化的细胞，在体外有较好的效果，但是在体内存活时间较短，治疗效果受影响。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用。
本发明涉及N-乙酰半胱氨酸（NAC）对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用。
本发明所述中央记忆性T细胞为CD4+ T或CD8+T细胞。
本发明还提供了N-乙酰半胱氨酸体外扩增T细胞的最适剂量为1 mmol/L~10 mmol/L。
本发明采用小分子药物NAC对CD4+ T或CD8+T中央记忆性细胞进行了有效的体外扩增，并且找出了其促进体外扩增的最适浓度，该方法具有安全性高、成本低廉等优点，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
附图说明
图1为不同浓度的NAC对CD4+ T细胞的扩增效果。
图2为NAC处理后不同时间点的两组CD4+ T细胞数量的比较。
图3为不同时间点对CD4+ T细胞中CD4+ TCM所占比例的检测。
图4为两组数据CD4+TCM的数量（15天）。
图5为不同浓度的NAC对CD8+ T细胞的扩增效果。
图6为NAC处理后不同时间点的两组CD8+ T细胞数量的比较。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面结合试验和结果来说明NAC对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用。
试验材料
人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了24份正常人的血液样本。
主要试剂：胎牛血清购自于GIBCO公司；RPMI1640培养基购自于INVERTROGEN公司；NAC购自于INVERTROGEN公司；流式细胞仪检测抗体anti-CD4-PE、anti-CD27-FITC、anti-CCR7-PECY5购自于BD公司；anti-CD45RA-ECD购自于BECKMAN公司；Annexin-V购自于南京凯基生物科技发展有限公司；淋巴细胞分离液购自于天津灏阳生物制品有限责任公司；CD4+ T细胞阴性选择磁珠购自于BD公司。
主要的实验仪器：台式高速离心机（Eppendorf Centrifuge 5810R）、流式细胞仪（Beckman Coulter公司）、CO2细胞培养箱（Thermo SCIENTIFIC）、生物安全柜（Thermo SCIENTIFIC）、倒置生物显微镜（Leica）、磁珠分选磁力架（BD Pharmigen）。
细胞培养
2.1细胞提取分离
将外周成分血与PBS缓冲液（含2% BSA、0.5% EDTA）按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g 30 min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的PBS（含0.5% BSA、2% EDTA）稀释，混合均匀后，300×g 15 min；重复上一步骤一次；孵育CD4+ T或CD8+T细胞阴选一抗，15 min；10倍体积的PBS（含0.5% BSA、2% EDTA）稀释，混合均匀后，300×g 12 min；孵育带有磁珠的二抗，30 min；过柱进行细胞分选，得到CD4+ T或CD8+T细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度；
2.2培养条件
在5% CO2、饱和湿度及37oC下，将5×105个/孔的CD4+ T细胞置于1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。
细胞铺板及加药处理
3.1铺板
将分选出来的CD4+T或CD8+T细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔预期的细胞数为5×105。铺板后用血球计数板和台盼蓝染色法进行细胞计数，每孔实际的活细胞数为4.88×105±1.18×104；
3.2加药处理
对铺板后的CD4+T或CD8+T细胞进行5种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并在细胞培养的第4天，第7天，第10天，第13天施加相应刺激；
| 分组 | 处理 |
| 第一组 | 空白对照（不做任何处理） |
| 第二组 | 1μg/ml（终浓度） Anti-CD3抗体 + 1μg/ml（终浓度） Anti-CD28抗体 |
| 第三组 | 1μg/ml（终浓度） Anti-CD3抗体 + 1μg/ml（终浓度） Anti-CD28抗体 + 1 nM （终浓度）NAC |
| 第四组 | 1μg/ml（终浓度） Anti-CD3抗体 + 1μg/ml（终浓度） Anti-CD28抗体 + 5 nM （终浓度）NAC |
| 第五组 | 1μg/ml（终浓度） Anti-CD3抗体 + 1μg/ml（终浓度） Anti-CD28抗体 + 10 nM （终浓度）NAC |
3.3细胞检测
在细胞培养的第14天，用血球计数板和台盼蓝染色法对每孔的活细胞进行计数，计算出不同处理作用下的CD4+T或CD8+T细胞的体外扩增倍数。在后续的实验中，选出最有利于CD4+T或CD8+T细胞体外扩增的刺激方式，进行下一步针对CD4+T、CD4+中枢记忆T细胞和CD4+效应记忆T细胞或CD8+T、CD8+中枢记忆T细胞和CD8+效应记忆T细胞的体外扩增实验。
4、细胞亚群分析及细胞数量的检测
细胞培养0 天、5 天、10 天、15 天后，分别吸取不同供体（n=24）的培养孔中的细胞，用细胞计数仪进行计数；从相对应的培养孔中吸取5×105个细胞、300×g 15 min，用PBS洗涤细胞两次，孵育检测CD4+或CD8+ TCM的流式抗体（CD45RA、CD27、CD4、CCR7）半个小时；洗掉流式抗体，加入PBS稀释到相应浓度，运用流式细胞仪检测。对照组与实验组均为同一供体的CD4+ T 或CD8+T细胞，每个时间点分别取不同供体的细胞进行检测。
统计学软件及统计方法
采用SPSS13.0分析软件进行统计学分析。计量资料所有结果均用均数±标准差表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0.01为有显著性差异。
实验结果
6.1不同浓度的NAC对于CD4+ T细胞扩增效果的检测
选取NAC处理第10天的时间点进行检测，不加入NAC的对照组的细胞数量为(6.1±0.02)×106；NAC浓度为1 mmol/L的细胞数量为 (1.43±0.05)×107；NAC浓度为5 mmol/L的细胞数量为 (2.1±0.1)×107；NAC浓度为10 mmol/L的细胞数量为 (2.93±0.15)×107；NAC浓度为20 mmol/L的细胞数量为 (2.5±0.26)×107。实验结果表明，不同浓度的NAC对于CD4+ T细胞的扩增作用在低于10 mmol/L的情况下存在剂量依赖的趋势，如图1所示；
6.2 NAC对CD4+ T扩增细胞数量的检测
使用NAC（10 mmol/L）处理细胞后，分别选取4个时间点检测CD4+ T细胞的数量。药物处理0天，对照组细胞数量为(5±0.3)×105，实验组细胞数量为(5±0.2)×105；第5天，对照组细胞数量为(3.6±0.45)×106，实验组细胞数量为(4.7±0.54)×106；第10 天，对照组细胞数量为(6.1±0.67)×106，实验组细胞数量为(2.9±0.2)×107；第15 天，对照组细胞数量为(8±0.67)×106，实验组细胞数量为(5.73±0.37)×107，实验结果如图2所示。选取第15天的两组细胞数量进行比较，运用SPSS 进行统计学分析，显示两组间细胞数量差别有统计学意义（P<0.01），如表1所示。
表1 NAC处理第15天的两组CD4+ T细胞数量的比较
| 组别 | 细胞数量 | |
| 对照组 | (8±0.67)×106 | |
| 实验组 | (5.73±0.37)×107 | |
| t | 30.6473 | |
| P | <0.01 |
6.3 NAC对CD4+ TCM在CD4+ T细胞中所占比例的影响
在CD4＋T细胞中，CD4+ TCM的比例随着体外扩增时间的延长而逐渐增加，从起始比例~ 1%扩增至15天后的~ 10%；加入NAC后对于CD4+ TCM在CD4+ T细胞中的比例无影响，如图3所示；
6.4 NAC对CD4+ T细胞数量的影响
CD4+ T细胞经过15天的扩增后，通过流式细胞仪和细胞计数仪检测，得到对照组和实验组中CD4+TCM细胞的细胞数量分别为(7.2±0.54)×105，(5.1±0.47)×106 ，实验结果如图4所示。用SPSS进行统计学分析，显示两组间有统计学意义（P<0.01），如表2所示。
表2 两组CD4+ TCM细胞数量的比较
| 组别 | 细胞数量 | |
| 对照组 | (7.2±0.54)×105 | |
| 实验组 | (5.1±0.47)×106 | |
| t | 30.13957 | |
| P | <0.01 |
6.5不同浓度的NAC对于CD8+ T细胞扩增效果的检测
选取NAC处理第10天的时间点进行检测，不加入NAC的对照组的细胞数量为(1.5±0.87)×107；NAC浓度为1 mmol/L的细胞数量为 (2.43±0.05)×107；NAC浓度为5 mmol/L的细胞数量为 (3.3±0.97)×107；NAC浓度为10 mmol/L的细胞数量为 (5.93±0.2×107；NAC浓度为20 mmol/L的细胞数量为 (3.9±0.66)×107。实验结果表明，不同浓度的NAC对于CD4+ T细胞的扩增作用在低于10 mmol/L的情况下存在剂量依赖的趋势，如图5所示；
6.6 NAC对CD8+ T扩增细胞数量的检测
使用NAC（10 mmol/L）处理细胞后，分别选取4个时间点检测CD8+ T细胞的数量。药物处理0天，对照组细胞数量为(5±0.24)×105，实验组细胞数量为(5±0.2)×105；第5天，对照组细胞数量为(7.6±0.55)×106，实验组细胞数量为(1.07±0.63)×107；第10 天，对照组细胞数量为(1.5±0.87)×107，实验组细胞数量为(5.9±0.2)×107；第15 天，对照组细胞数量为(3.2±0.45)×107，实验组细胞数量为(1.03±0.78)×108，实验结果如图6所示。选取第15天的两组细胞数量进行比较，运用SPSS 进行统计学分析，显示两组间细胞数量差别有统计学意义（P<0.01），如表3所示。
表3 NAC处理第15天的两组CD8+ T细胞数量的比较
| 组别 | 细胞数量 | |
| 对照组 | (3.2±0.45)×107 | |
| 实验组 | (1.03±0.78)×108 | |
| t | 16.631 | |
| P | <0.01 |
结果分析
本发明首次应用小分子药物NAC对CD4+或CD8+ 中央记忆性T细胞进行体外扩增。在实验组中，CD4+ T细胞的数量有着显著的增加；与对照组相比，CD4+ TCM在CD4+T细胞中所占比例没有明显的差异；通过对CD4+ TCM数量的检测，在实验组中发现CD4+ TCM细胞绝对数量有显著的扩增。在实验过程中，也进一步找出了体外扩增CD4+ TCM的NAC的最适浓度：10 mmol/L。试验发现，使用较低剂量（<10 mmol/L）的NAC处理细胞后，CD4+ T细胞的扩增存在显著的剂量依赖关系；而当NAC的浓度达到20 mmol/L时，CD4+ T细胞的扩增效果明显下降，这可能是由于药物浓度过大使得细胞的生长环境发生了较大的改变而影响了细胞的正常生长。在本实验中，之所以对CD4+ TCM细胞数量的检测选取在药物处理后第15天，是由于在外周血中CD4+ TCM的数量非常少，CD4+ T细胞需要较长的时间才能在anti-CD3与anti-CD28共同刺激下逐渐形成CD4+ TCM。此外，CD4+ TCM在CD4+ T细胞中所占的比例随着培养时间的增加也是不断上升的。实验结果也表明选择培养较长时间后方进行检测可获得更好的效果。
本研究采用小分子药物NAC对CD4+或CD8+T中央记忆性细胞的绝对数量进行了有效的体外扩增，并且找出了其促进体外扩增的最适浓度。该方法具有安全性高、成本低廉等优点，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
Claims (5)
1.N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述中央记忆性T细胞为CD4+ T或CD8+T细胞。
3.根据权利要求1所述的N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1 mmol/L~10 mmol/L。
4.根据权利要求1所述的N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2% BSA和0.5% EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g 30 min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5% BSA和2% EDTA 的PBS稀释，混合均匀后，300×g 15 min；重复上一步骤一次；孵育CD4+ T或CD8+T细胞阴选一抗，15 min；用10倍体积的含0.5% BSA和2% EDTA 的PBS稀释，混合均匀后，300×g 12 min；孵育带有磁珠的二抗，30 min；过柱进行细胞分选，得到CD4+ T或CD8+T细胞。
5.根据权利要求1所述的N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性T细胞的绝对数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述T细胞的培养方法是在5% CO2、饱和湿度及37oC条件下将5×105个/孔的CD4+ T或CD8+T细胞置于1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。
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