CN109666639A - 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种杀伤活性增强的NK细胞及其制备方法，所述方法包括：a.从外周血单个核细胞PBMC制备饲养细胞，和b.NK细胞扩增，所述步骤a是PBMC用CD3单抗进行初步刺激后，在含有IL‑2、IFN‑r、IL‑15和IL‑18的第一培养基中继续激活，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用γ‑射线进行辐照后作为饲养细胞，并将部分饲养细胞液氮冻存；所述步骤b是将未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞与未经液氮冻存处理的饲养细胞混合孵育，在含有IL‑2、IL‑15、OK432和烟酰胺的第二培养基中进行NK细胞的扩增培养，然后转为添加含有IL‑2、烟酰胺的第三培养基扩增培养，之后继续添加从液氮冻存复苏的饲养细胞，继续扩增培养。

Description

一种杀伤活性增强的NK细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种杀伤活性增强的NK细胞及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
人自然杀伤(natural killer，NK)细胞依靠自身表面活化性受体与肿瘤细胞表面配体之间的作用，可不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制，识别MHC-I类分子不表达或表达下调的肿瘤细胞并对其进行有效地清除和杀伤。NK细胞独特的抗肿瘤免疫功能已受到广泛的重视，并被越来越多地应用到肿瘤的过继免疫治疗中。由于NK细胞在PBMC中所占比例很少(5％-10％，加上由常规方法分离获得的NK细胞处于非活化状态，因而建立一种有效的体外激活与扩增的方法是开展NK细胞免疫治疗的基础与关键所在。
CN 102586185 A公开了一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，具体为使用跨膜IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞的方法，该发明是以K562细胞系转录稳定表达CD8。一白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；然后培养K562细胞一段时间，最后经物理、化学方式得到纯化的K562细胞，再对NK细胞进行培养。
CN 105101978 A提供能够侵袭性低、简便且迅速地使从生物体采取的血液中的NK细胞等增殖的NK细胞强化型血液制剂的生产方法。通过用包含抗CD16抗体、OK432、抗CD137抗体、和细胞因子的NK细胞增殖刺激因子刺激血液中的NK细胞，然后在生理细胞温度下培养该血液来生产NK细胞强化型血液制剂。
NK细胞具有许多优点，使其成为临床应用的理想选择。然而，现有的缺点是难以产生大量的全功能NK细胞，并且还没有建立离体NK细胞扩增的标准方法。使用抗CD3单克隆抗体结合细胞因子和其他刺激，T细胞可以离体扩增超过1000倍。然而，一般而言，NK细胞不能维持增殖，因此，无论是否与其他细胞共培养，它们对细胞因子的增殖反应都是适度和暂时的。
基于扩增的方法与转基因或经辐照的肿瘤细胞共培养，虽然这些方法有一些优点，但它们有一些主要缺点，包括：NK细胞纯度低，成本高，程序复杂，和潜在的安全问题。开发新的策略以大量产生临床相关的纯NK细胞将在基于NK细胞的免疫疗法中以提供重要的突破。
发明内容
本发明提供了一种高效扩增NK并增强其杀伤活性的方法，所述的方法是利用初步激活的PBMC作为饲养细胞并添加特殊的细胞因子用于激活NK细胞并增加其杀伤活性。通过本发明所述的方法能够得到大量纯度较高且高表达表面活化性受体的细胞。成本低廉且安全性较高。
通过本方法扩增的NK细胞，不通过与辐照的肿瘤细胞进行共培养，在使用时更加安全，通过初步刺激的自体PBMC培养的目的是获得具有抗原呈递功能的细胞和下一步刺激NK扩增的细胞因子环境，通过活化的APC(单核细胞/巨噬细胞，树突状细胞，激活淋巴细胞)分泌多种细胞因子和增加共刺激信号，能够有效扩增NK细胞的增殖。本方法减少了饲养层细胞的使用量，具有高扩增NK细胞的数量和增强最初杀伤活性。自体激活的PBMC比基因转染或经辐照的肿瘤细胞作为饲养细胞更具有安全性。本发明为浙江省重点研发计划-免疫治疗新技术应用研究-NK细胞靶向富集联合菌群调节治疗肠癌的新技术研究(项目编号：2017C03028)研究内容的一部分。
具体而言，本发明提供一种杀伤活性增强的NK细胞的制备方法，所述方法包括：
a.从外周血单个核细胞PBMC制备饲养细胞，和
b.NK细胞扩增，
所述步骤a是PBMC用CD3单抗进行初步刺激后，在含有IL-2、IFN-r、IL-15和IL-18的第一培养基中继续激活，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用γ-射线进行辐照后作为饲养细胞，并将部分饲养细胞液氮冻存；
所述步骤b是将未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞与未经液氮冻存处理的饲养细胞混合孵育，在含有IL-2、IL-15、OK432和烟酰胺的第二培养基中进行NK细胞的扩增培养，然后转为添加含有IL-2、烟酰胺的第三培养基扩增培养，之后继续添加从液氮冻存复苏的饲养细胞，继续扩增培养。
在一个实施方式中，所述步骤a是PBMC用CD3单抗进行初步刺激2-3小时后，在含有IL-2、IFN-r、IL-15和IL-18的第一培养基中继续激活2-3小时，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用γ-射线进行辐照后作为饲养细胞，并将部分饲养细胞液氮冻存；
所述步骤b是将未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞与未经液氮冻存处理的饲养细胞混合孵育，在含有IL-2、IL-15、OK432和烟酰胺的第二培养基中进行NK细胞的扩增培养3天后，转为添加含有IL-2、烟酰胺的第三培养基扩增培养，在第7-8天时继续添加从液氮冻存复苏的饲养细胞。继续扩增培养至第14天或21天。
在一个优选实施方式中，以细胞数量计，相对于所述未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞，未经液氮冻存处理的饲养细胞的添加比例为1至10倍，更优选1倍，从液氮冻存复苏的饲养细胞的添加比例为1至10倍，更优选1倍。
在一个优选实施方式中，所述第一培养基每ml含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2，1000IU-2000IU、优选1000IU的IFN-r，20ng-30ng、优选30ng的IL-15和10ng-20ng、优选10ng的IL-18；
所述第二培养基每ml含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2，20ng-30ng、优选30ng的IL-15，0.008KE-0015KE、优选0.01KE的OK432和2.5-7.5mM、优选5mM的烟酰胺；
所述第三培养基每毫升含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2和2.5-7.5mM、优选为5mM的烟酰胺。
在一个优选实施方式中，所述方法包括在步骤a之前从外周血分离、纯化PBMC的步骤，具体方法为：
用肝素钠抗凝血袋或抗凝管采集外周血，转移至离心管，离心后，吸取上层淡黄色液体即为自体血浆，转移至新的离心管后，置于56℃水浴锅中水浴30分钟灭活，灭活后1200G离心10min，置于4℃备用，每次添加10％血浆作为培养基添加剂；
取生理盐水备用，预先将密度1.077的人淋巴细胞分离液Ficoll加入两支50mL无菌离心管，15mL每管，用生理盐水将吸取血浆后的标本还原至30mL并充分混匀，缓慢加入在Ficoll液面上，700g下室温离心20min，离心机加速为3，减速为3；
离心完毕后吸弃上层上清，小心吸取单个核细胞白膜层，移至两支50mL离心管中每管生理盐水50ml，每只分离管对应一个50mL离心管，保证生理盐水∶细胞悬液＞2∶1，并充分混匀；
经过第一次洗涤(800g 10min)、第二次洗涤(300g 10min)后得到PBMC。
在一个优选实施方式中，所述步骤b包括：
将8-10×107个PBMC预先加入已孵育好CD3单抗的培养瓶中18ml KBM581培养基和2ml的自体血浆，将其放入37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3小时，进行初步刺激，2-3小时后加入1ml的培养基含500IU的IL-2、1000IU的IFN-r、20ngIL-15、10ngIL-18继续激活3个小时，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用137CS为辐射源的γ-射线70GY进行辐照后作为饲养细胞，将另外的饲养细胞液氮冻存在第7天使用。
在一个优选实施方式中，所述步骤a包括：
将原始的PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞或可选再次进行CD56+富集的NK细胞重悬在30ml KBM581的淋巴细胞培养基中，第一天添加2-3×107个上述辐照过后的PBMC作为饲养细胞同时添加500IU的IL-2、30ngIL-15、0.01KE/ml的OK432和5mM的烟酰胺；
根据细胞密度添加含500IU的IL-2、5mM的烟酰胺的细胞扩增培养基，保证细胞密度在1.0×106，在第七天时继续添加复苏的上述辐照的已初步激活PBMC。继续扩增培养至第十四天或二十一天；收获细胞。
另外，本发明的目的还在于提供根据上述方法制备的NK细胞。
此外，本发明的目的还在于提供上述NK细胞在制备用于抗肿瘤或癌症的药物中的用途。
本发明关键技术要点在NK细胞的刺激常常需要饲养细胞如EBV转化的淋巴母细胞系(EBV-LCL)、基因修饰K562细胞中表达刺激分子：如4-1BBL配体和IL-15等。在饲养细胞用于NK细胞扩增可增加的抗肿瘤细胞毒性功能，而单纯的细胞因子在细胞增殖方面效果并不优异。本方法采用抗原表达的自体PBMC细胞作为饲养细胞同时添加细胞扩增因子刺激NK细胞扩增的方法。经过CD3、IL-2、IFN-r、IL-15和IL-18初步激活的自体PBMC能使其表达共刺激信号和抗原刺激信号，其作为饲养细胞对于NK细胞的扩增和杀伤能力有较好的刺激作用，在此基础上添加细胞因子IL-2、IL-15、OK432、烟酰胺对于NK的增殖起到很好的促进作用。
IL-2、IL-15、IL-18为常规的细胞扩增因子，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性，负责细胞间信号传导，促进T细胞和NK细胞的增殖，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。
IFN-γ主要由活化的Th细胞和NK细胞产生.其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核、巨噬细胞并增强起溶菌活性及分泌IL-1，6，8，TNF-a等.IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞，刺激血管内皮细胞和白细胞合成的粘附分子，促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。
OK432制剂是一种作用于肿瘤的药物。是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。能够与单核细胞等的细胞表面TLR结合，活化单核细胞，激活免疫反应。
烟酰胺(NAM)是一种维生素B3，是一种有效的NAD抑制剂。NAM直接参与氧化还原敏感酶，线粒体功能，细胞代谢，能量产生和细胞运动的控制。NAM涉及NK细胞粘附，极性，迁移，增殖和分化的调节。
在体外NAM增强了NK细胞在细胞培养过程中的肿瘤细胞毒性和细胞因子(TNF-α和IFN-γ)分泌。
本发明的有益结果
本发明的方法相较于常规添加基因转染的肿瘤细胞作为饲养细胞或仅添加细胞因子的方法在成本上更加低廉、安全性更高、起到很好的增殖效果。此外，通过本发明方法获得的NK细胞对肿瘤的杀伤能力显著增强。
附图说明：
图1显示本发明一个实施方式的示意性流程图。
图2显示使用本发明方法获得的NK细胞数。
图3说明NK细胞的纯度(CD3-CD56+)。
图4说明NK细胞活化受体的表达
图5说明本发明方法制得的NK细胞与新鲜未活化的NK细胞对作为靶细胞的人慢性髓系白血病细胞K562细胞的杀伤率的比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例
实施例1 NK细胞的制备
1.外周血标本的采集：肝素钠抗凝血袋或抗凝管采集患者外周血120ml，并经患者同意。
2.自体血浆的制备：将抗凝血袋的外周血转移至50ml离心管中，经800g，10min离心后，吸取上层淡黄色液体即为自体血浆，转移至新的离心管后，置于56度水浴锅中水浴30分钟灭活，灭活后1200G，10min，置于4度冰箱备用，每次添加10％血浆作为培养基添加剂。
3.分离单个核细胞：取生理盐水备用，预先将人淋巴细胞分离液Ficoll(密度1.077)，加入两支50mL无菌离心管，15mL每管。用生理盐水将吸取血浆后的标本还原至30mL每管并充分混匀(任何混匀操作避免产生气泡)，缓慢加入在Ficoll液面上(方法：将离心管倾斜45°，在Ficoll液面以上1cm处，缓慢注入稀释血，体积比为1∶2不要打乱液面界面)，700g，室温离心20min，离心机加速为3，减速为3。
4.离心完毕后吸弃上层上清(可吸至白膜层上方高度5ml处)，小心吸取单个核细胞白膜层，移至两支50mL离心管中每管生理盐水50ml，每只分离管对应一个50mL离心管(保证生理盐水∶细胞悬液＞2∶1)，并充分混匀。
5.经过第一次洗涤(800g 10min)、第二次洗涤(300g 10min)后得到纯度较高的PBMC。
6.细胞培养瓶的处理：用PH8.6的缓冲液配制浓度为1ug/ml的CD3单抗包被液，向T75的细胞培养瓶里加入6-7ml包被液，提前一天4度过夜处理，使用前去掉包被液，用生理盐水洗涤1-2次后，加入18ml的KBM581淋巴细胞培养基。
7.饲养细胞的制备：
将步骤5所得的PBMCs分为两部分，第一部分用于原始扩增NK细胞，第二部分用于刺激PBMC制备饲养层细胞，所述第一部分和第二部分细胞比为1∶2。将第二部分的PBMC(8-10×107个)预先加入已孵育好CD3单抗的培养瓶中18ml和2ml的血浆。将其放入37度，5％CO2的培养箱中培养2-3小时，进行初步刺激，2-3小时后加入1ml的培养基含500IU的IL-2、1000IU的IFN-r、20ngIL-15、10ngIL-18继续激活3个小时，获得抗原提呈的初步激活的PBMC。将上述激活的PBMC用γ-射线70GY进行辐照后作为饲养细胞。将另外饲养细胞(6-10×107)液氮冻存在第七天使用。
8.将第一部份原始的PBMC(或通过免疫磁珠分选法CD3+T淋巴细胞的去除(或再次CD56+的富集)免疫分选好的NK细胞)重悬在30mlKBM581的淋巴细胞培养基中，第一天添加上述γ射线辐照过后的PBMC(2-3×107)作为饲养细胞同时添加500IU的IL-2、30ngIL-15、0.01KE/ml的OK432、5mM的烟酰胺。
9.3天后根据细胞密度添加细胞扩增培养基含500IU的IL-2、5MM的烟酰胺。保证细胞密度在1.0×106，在第七天时继续添加复苏的上述辐照的已初步激活PBMC。继续扩增培养至第十四天或二十一天，收获细胞。
实施例2NK细胞的表征
收集所获得的细胞，计算所获的细胞数量、活率并用流式细胞仪分析NK细胞的纯度(CD3-CD56+)如图及活化性受体的表达情况。
将细胞与适当浓度的荧光染料偶联的抗体与CD3(克隆号UCHT1)、CD56(克隆号B159)、NKG2D(克隆号149810)、NKp30(克隆号p30-15)、NKp44(克隆号p44-8.1)和NKp46(克隆号9E2)混合，所有抗体均购自BD(FranklinLakes，NJ，USA)通过流式细胞仪上机测试以上抗体的组合来测定NK活化受体的表达。
实验结果显示在图2至4中。
实施例3 NK细胞对作为靶细胞的人慢性髓系白血病细胞K562细胞的杀伤率
将NK细胞(效应细胞：E)与K562(靶细胞：T)按照不同E与T之比(E∶T)混合。K562靶细胞在PBS中用1ng/ml荧光染料CFSE(invitrogen)于37℃下标记15min，15min内向细胞中加入小牛血清，随后冲洗细胞并再悬浮于RPMI介质中。将100ul的K562细胞按照5X103个细胞/孔的浓度置于96孔圆底孔板中。将100uL的未染色已活化NK细胞(实验组)和未经活化的NK细胞(对照组)按照E∶T比为5∶1、2.5∶1、1∶1(分别为2.5X104、1.25X104、5X103细胞/孔)加入到K562细胞中。在2至28h之后，细胞系中的靶细胞K562的杀伤作用通过FACS(流式细胞荧光分选技术)作为碘化丙咤(PI)一阳性(死亡)CFSE一标记细胞百分数进行测定。白血病细胞的杀伤作用通过采用FACS计数其用NK细胞培养之后培养基中剩余的CFSE染色细胞的数目而进行测定。较低的CFSE+细胞数表明较高的杀伤水平。
实验结果显示在图5中。
通过对比培养前和培养后的细胞对靶细胞的杀伤活性及细胞活化性受体的表达可以看出，通过添加自体激活的PBMC作为饲养细胞同时添加细胞因子的扩增方法，经过饲养细胞信号的激活，相较于未激活的NK细胞，增强了NK细胞的杀伤活性，对靶细胞的杀伤作用也明显增强，细胞数量由千万数量级扩增至数十亿细胞数量级，为提高NK细胞临床应用的疗效提供了可行性方案。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (9)

1.一种杀伤活性增强的NK细胞的制备方法，所述方法包括：
a.从外周血单个核细胞PBMC制备饲养细胞，和
b.NK细胞扩增，
所述步骤a是PBMC用CD3单抗进行初步刺激后，在含有IL-2、IFN-r、IL-15和IL-18的第一培养基中继续激活，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用γ-射线进行辐照后作为饲养细胞，并将部分饲养细胞液氮冻存；
所述步骤b是将未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞与未经液氮冻存处理的饲养细胞混合孵育，在含有IL-2、IL-15、OK432和烟酰胺的第二培养基中进行NK细胞的扩增培养，然后转为添加含有IL-2、烟酰胺的第三培养基扩增培养，之后继续添加从液氮冻存复苏的饲养细胞，继续扩增培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述步骤a是PBMC用CD3单抗进行初步刺激2-3小时后，在含有IL-2、IFN-r、IL-15和IL-18的第一培养基中继续激活2-3小时，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用γ-射线进行辐照后作为饲养细胞，并将部分饲养细胞液氮冻存；
所述步骤b是将未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞与未经液氮冻存处理的饲养细胞混合孵育，在含有IL-2、IL-15、OK432和烟酰胺的第二培养基中进行NK细胞的扩增培养3天后，转为添加含有IL-2、烟酰胺的第三培养基扩增培养，在第7-8天时继续添加从液氮冻存复苏的饲养细胞；继续扩增培养至第14天或21天。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以细胞数量计，相对于所述未经上述激活的原始PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞并可选地再次富集CD56+后的NK细胞，未经液氮冻存处理的饲养细胞的添加比例为1至10倍，更优选1倍，从液氮冻存复苏的饲养细胞的添加比例为1至10倍，更优选1倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述第一培养基每ml含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2，1000IU-2000IU、优选1000IU的IFN-r，20ng-30ng、优选30ng的IL-15和10ng-20ng、优选10ng的IL-18；
所述第二培养基每ml含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2，20ng-30ng、优选30ng的IL-15，0.008KE-0015KE、优选0.01KE的OK432和2.5-7.5mM、优选5mM的烟酰胺；
所述第三培养基每毫升含有500IU-1000IU、优选500IU的IL-2和2.5-7.5mM、优选为5mM的烟酰胺。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤a之前从外周血分离、纯化PBMC的步骤，具体方法为：
用肝素钠抗凝血袋或抗凝管采集外周血，转移至离心管，离心后，吸取上层淡黄色液体即为自体血浆，转移至新的离心管后，置于56℃水浴锅中水浴30分钟灭活，灭活后1200G离心10min，置于4℃备用，每次添加10％血浆作为培养基添加剂；
取生理盐水备用，预先将密度1.077的人淋巴细胞分离液Ficoll加入两支50mL无菌离心管，15mL每管，用生理盐水将吸取血浆后的样本还原至30mL每管并充分混匀，缓慢加入在Ficoll液面上，700g下室温离心20min，离心机加速为3，减速为3；
离心完毕后吸弃上层上清，小心吸取单个核细胞白膜层，移至两支50ml离心管中每管生理盐水50ml，每只分离管对应一个50ml离心管，保证生理盐水∶细胞悬液＞2∶1，并充分混匀；
经过第一次洗涤(800g 10min)、第二次洗涤(300g 10min)后得到PBMC。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b包括：
将8-10×107个PBMC预先加入已孵育好CD3单抗的培养瓶中18ml KBM581培养基和2ml的自体血浆，将其放入37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3小时，进行初步刺激，2-3小时后加入1ml的培养基含500IU的IL-2、1000IU的IFN-r、20ngIL-15、10ngIL-18继续激活3个小时，获得抗原呈递的初步激活的PBMC，将上述激活的PBMC用137CS为辐射源的γ-射线70GY进行辐照后作为饲养细胞，将另外的饲养细胞液氮冻存在第7天使用。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a包括：
将原始的PBMC或通过免疫磁珠分选法去除CD3+T淋巴细胞或可选再次进行CD56+富集的NK细胞重悬在30ml KBM581的淋巴细胞培养基中，第一天添加2-3×107个上述辐照过后的PBMC作为饲养细胞同时添加500IU的IL-2、30ngIL-15、0.01KE/ml的OK432和5mM的烟酰胺；
根据细胞密度添加含500IU的IL-2、5mM的烟酰胺的细胞扩增培养基，保证细胞密度在1.0×106，在第七天时继续添加复苏的上述辐照的已初步激活PBMC。继续扩增培养至第十四天或二十一天；收获细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法制备的NK细胞。
9.权利要求7所述的NK细胞在制备用于抗肿瘤或癌症的药物中的用途。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195041A (zh) * 2019-06-20 2019-09-03 威海正生生物科技有限公司 利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法
CN110354191A (zh) * 2019-07-16 2019-10-22 广州沙艾生物科技有限公司 一种含有免疫细胞的药物组合物及其应用
CN110951694A (zh) * 2019-12-30 2020-04-03 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自体滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法
CN111303267A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 卓尔康(北京)生物科技有限公司 一种具有增强nk细胞杀伤活性的多肽及其应用
CN112029721A (zh) * 2020-09-09 2020-12-04 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种活性增强型nk细胞的制备方法
CN113088489A (zh) * 2021-04-28 2021-07-09 安徽医科大学第二附属医院 一种起始免疫细胞活化扩增体系及其应用
CN113881629A (zh) * 2020-07-03 2022-01-04 山东荆卫生物科技有限公司 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法
CN115197909A (zh) * 2021-04-12 2022-10-18 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种nk细胞的体外培养方法
CN115197907A (zh) * 2021-04-12 2022-10-18 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种用于自体或通用nk细胞体外培养的刺激细胞的制备方法
WO2022262805A1 (zh) * 2021-06-17 2022-12-22 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备饲养层细胞库的方法
CN116218781A (zh) * 2022-12-30 2023-06-06 四川阿思科力生物科技有限公司 Robo1 car-nk92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法
CN116254233A (zh) * 2022-12-30 2023-06-13 四川阿思科力生物科技有限公司 一种robo1 car nk细胞的复苏及培养方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102268405A (zh) * 2011-07-06 2011-12-07 安徽省立医院 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基
CN102781449A (zh) * 2009-12-29 2012-11-14 加米达细胞有限公司 增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法
CN104321425A (zh) * 2012-05-07 2015-01-28 高丽大学校产学协力团 用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法
CN107022524A (zh) * 2017-03-14 2017-08-08 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
CN107400660A (zh) * 2017-09-26 2017-11-28 上海莱馥医疗科技有限公司 一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法
US20180155690A1 (en) * 2016-09-28 2018-06-07 Korea Institute Of Radiological & Medical Sciences Method for preparing natural killer cells using irradiated pbmcs, and anti-cancer cell therapeutic agent comprising the nk cells

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102781449A (zh) * 2009-12-29 2012-11-14 加米达细胞有限公司 增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法
CN102268405A (zh) * 2011-07-06 2011-12-07 安徽省立医院 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基
CN104321425A (zh) * 2012-05-07 2015-01-28 高丽大学校产学协力团 用于诱导和扩增源自外周血单个核细胞的自然杀伤细胞的方法
US20180155690A1 (en) * 2016-09-28 2018-06-07 Korea Institute Of Radiological & Medical Sciences Method for preparing natural killer cells using irradiated pbmcs, and anti-cancer cell therapeutic agent comprising the nk cells
CN107022524A (zh) * 2017-03-14 2017-08-08 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
CN107400660A (zh) * 2017-09-26 2017-11-28 上海莱馥医疗科技有限公司 一种高效激活和扩增nkt细胞的新方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANITA S.-E CHONG等: "Gamma-Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells Can Express LAK Activity", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CELL CLONING》 *
JÜRGEN LUHM等: "Large-Scale Generation of Natural Killer Lymphocytes", 《JOURNAL OF HEMATOTHERAPY & STEM CELL RESEARCH》 *
MARÍA DELSO-VALLEJO等: "Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》 *
YONG-OON AHN等: "Irradiated and Activated Autologous PBMCs Induce Expansion of Highly Cytotoxic Human NK Cells in Vitro", 《J IMMUNOTHER》 *
潘梅萍等: "NK细胞体外扩增的影响因素", 《药物生物技术》 *
胡桂等主编: "《病原微生物学与免疫学实验技术》", 31 January 2015, 中国医药科技出版社 *
马东来等主编: "《实用临床免疫学基础》", 30 June 1993, 长春出版社 *
马杰等: "不同刺激因子组合诱导NK 细胞体外扩增及其功能的研究", 《免疫学杂志》 *
马杰等: "辐照后的AlloMNCs诱导NK细胞体外扩增", 《免疫学杂志》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195041A (zh) * 2019-06-20 2019-09-03 威海正生生物科技有限公司 利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法
CN110354191A (zh) * 2019-07-16 2019-10-22 广州沙艾生物科技有限公司 一种含有免疫细胞的药物组合物及其应用
CN110951694A (zh) * 2019-12-30 2020-04-03 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种自体滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法
CN111303267A (zh) * 2020-03-03 2020-06-19 卓尔康(北京)生物科技有限公司 一种具有增强nk细胞杀伤活性的多肽及其应用
CN111303267B (zh) * 2020-03-03 2021-09-24 卓尔康(北京)生物科技有限公司 一种具有增强nk细胞杀伤活性的多肽及其应用
CN113881629A (zh) * 2020-07-03 2022-01-04 山东荆卫生物科技有限公司 一种体外高效扩增nk细胞的培养基及培养方法
CN112029721A (zh) * 2020-09-09 2020-12-04 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种活性增强型nk细胞的制备方法
CN115197909B (zh) * 2021-04-12 2023-11-17 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种nk细胞的体外培养方法
CN115197907B (zh) * 2021-04-12 2024-07-19 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种用于自体或通用nk细胞体外培养的刺激细胞的制备方法
CN115197909A (zh) * 2021-04-12 2022-10-18 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种nk细胞的体外培养方法
CN115197907A (zh) * 2021-04-12 2022-10-18 北京和斯瑞生物技术有限公司 一种用于自体或通用nk细胞体外培养的刺激细胞的制备方法
CN113088489B (zh) * 2021-04-28 2022-01-07 安徽医科大学第二附属医院 一种起始免疫细胞活化扩增体系及其应用
CN113088489A (zh) * 2021-04-28 2021-07-09 安徽医科大学第二附属医院 一种起始免疫细胞活化扩增体系及其应用
WO2022262805A1 (zh) * 2021-06-17 2022-12-22 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备饲养层细胞库的方法
CN116218781A (zh) * 2022-12-30 2023-06-06 四川阿思科力生物科技有限公司 Robo1 car-nk92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法
CN116254233A (zh) * 2022-12-30 2023-06-13 四川阿思科力生物科技有限公司 一种robo1 car nk细胞的复苏及培养方法

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