BR112016006999B1 - Anticorpos neutralizantes antiinfluenza a seus usos, seu método de produção, composição que os compreendem, ácido nucleico e vetor - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS NEUTRALIZANTES ANTI- INFLUENZA A E SUAS UTILIZAÇÕES. A presente invenção refere-se a anticorpos e seus fragmentos de ligação que são capazes de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza A e neutralizar pelo menos um subtipo do grupo 1 e pelo menos 1 subtipo do grupo 2 do vírus influenza A. Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação de acordo com a invenção é capaz de ligar a e/ou neutralizar um ou mais subtipos do grupo 1 do vírus Influenza A selecionado de: H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 e suas variantes; e um ou mais subtipos do grupo 2 do vírus influenza A selecionado de: H3, H4, H7, H10, H14 e H15 e suas variantes.

Description

Campo da Invenção
[001] A invenção refere-se a anticorpos que têm atividade neutra- lizante ampla contra o vírus influenza A e a utilizações de tais anticorpos.
Antecedentes da Invenção
[002] Os vírus Influenza causam epidemias de gripe anuais e pandemias ocasionais, que representam uma ameaça significativa à saúde pública em todo o mundo. A infecção sazonal de influenza está associada com 200.000-500.000 mortes por ano, principalmente em crianças pequenas, doentes imunocomprometidos e idosos. A taxa de mortalidade normalmente aumenta ainda mais durante as estações com surtos de gripe pandêmica. Continua a existir uma significativa necessidade médica não satisfeita de desenvolver potentes agentes terapêuticos antivirais para a prevenção e tratamento de infecções de gripe, nomeadamente em populações carentes.
[003] Existem três tipos de vírus influenza, tipos A, B e C. Os ví rus influenza A podem infectar uma grande variedade de aves e mamíferos, incluindo humanos, porcos, galinhas e furões. Os vírus influenza A podem ser classificados em subtipos com base em variações aléli- cas nas regiões antigênicas de dois genes que codificam para glico- proteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). A HA é a glicoproteína de ligação ao receptor e de fusão da membrana, a qual medeia a ligação viral e entrada nas células alvo; HA é o principal alvo da resposta imune humoral de proteção. A proteína HA é tri- mérica em estrutura e é composta de três cópias idênticas de um único precursor de polipeptídeo, HA0, o qual após a maturação proteolíti- ca, é clivado em um intermediário dependente de pH, metaestável contendo a cabeça globular (HA1) e na região da haste (HA2). A "cabeça globular" na membrana distal constitui a maior parte da estrutura HA1 e contém o bolso de ligação de ácido siálico para a entrada viral e principais domínios antigênicos. A estrutura "haste" na membrana proximal, montada a partir de HA2 e alguns resíduos HA1, contém a maquinaria de fusão, que sofre uma alteração conformacional no ambiente de baixo pH de endossomos tardios para provocar a fusão de membrana e a penetração nas células. O grau de homologia de sequência entre os subtipos influenza A é menor na região HA1 (34%-59% de homologia entre subtipos) do que na HA2 (51%-80% de homologia). Anticorpos neutralizantes obtidos pela infecção por vírus influenza são normalmente focados na cabeça globular HA1 variável para impedir ligação ao receptor viral e são geralmente específicos de estirpe. Raramente, anticorpos monoclonais com reatividade cruzada ampla que foram identificados têm como alvo a cabeça globular da HA (Krause J.C. et al. 2011 J. Virol.85; Whittle J. et al., 2011 PNAS 108; Ekiert DC et al., 2012 Nature 489; Lee PS et al., 2012 PNAS 109). Em contraste, a estrutura da região da haste é relativamente conservada e um grupo de anticorpos amplamente neutralizantes foram recentemente identificados que se ligam à haste da HA para evitar o passo de fusão desencadeado pelo pH para a entrada viral (Ekiert D.C. et al., 2009 Sci-ence 324; Sui J. et al., Nat Struct Mol Biol 16; Wrammert J et al., 2011 J Exp Med 208; Ekiert D. C et al., 2011 Science 333; Corti D et al., 2010 J Clin Invest 120; Throsby M 2008 PLoS One 3). A maioria destes anticorpos neutralizantes reativos de haste são específicos para os vírus influenza A do grupo 1 ou específicos para os vírus do grupo 2. Muito recentemente, foram isolados anticorpos de ligação a haste que tinham reação cruzada aos vírus de ambos os grupos 1 e 2 (Corti D. et al., 2011 Science 333; Li GM et al., 2012 PNAS 109 e Cyrille D et al., 2012 Science 337; Nakamura G et al., 2013, Cell Host & Microbe 14).
[004] Até à data, não existem anticorpos comercializados que neutralizem ou inibam amplamente todas as infeções do vírus influenza A ou atenuem a doença causada pelo vírus influenza A. Portanto, continua a haver uma necessidade de novos anticorpos que protegem contra subtipos múltiplos do grupo 1 e grupo 2 do vírus influenza A.
Descrição da Invenção
[005] A invenção fornece um anticorpo para o vírus influenza A ou um seu fragmento de ligação que é capaz de se ligar à hemagluti- nina do vírus influenza A e neutralizar pelo menos um subtipo do grupo 1 e pelo menos 1 subtipo do grupo 2 do vírus influenza A.
[006] Preferencialmente, os anticorpos ou os fragmentos de liga ção da invenção são capazes de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza A e neutralizar, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 subti- po do grupo 1 do vírus influenza A e, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 subtipo do grupo 2 do vírus influenza A. Ainda mais preferencialmente, os anticorpos ou os fragmentos de ligação da invenção são capazes de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza A e neutralizar, pelo menos, 5 subtipos do grupo 1 do vírus influenza A e, pelo menos, um ou dois subtipos do grupo 2 do vírus influenza A.
[007] Os subtipos de hemaglutinina do vírus influenza A se divi dem em dois grandes agrupamentos filogenéticos, identificado como grupo 1, que inclui os subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 e H17 e grupo 2, que inclui os subtipos H3, H4, H7, H10, H14 e H15. Em uma modalidade, um anticorpo ou um fragmento de ligação de acordo com a invenção é capaz de se ligar e/ou neutralizar um ou mais subtipos do grupo 1 do vírus influenza A selecionado de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 e H17 e suas variantes e um ou mais subtipos do grupo 2 do vírus influenza A selecionado de H3, H4, H7, H10, H14 e H15 e suas variantes. Em uma outra modali- dade, um anticorpo ou um fragmento de ligação de acordo com a invenção é capaz de se ligar e/ou neutralizar os subtipos do vírus influenza A do grupo 1, H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 e H17 e os subtipos do vírus influenza A do grupo 2, H3, H4, H7, H10, H14 e H15. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação é capaz de se ligar e/ou neutralizar os subtipos do grupo 1, H1, H2, H5, H6, e H9 e os subtipos do grupo 2, H3 e H7. Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou fragmento de ligação é capaz de se ligar e/ou neutralizar os subtipos do grupo 1, H1, H2, H5 e H6 e os sub- tipos do grupo 2, H3 e H7.
[008] A invenção é baseada no isolamento de um anticorpo mo noclonal (mAb) humano, que está presente naturalmente, a partir de células B de memória IgG que foram recolhidas de dadores individuais como material de partida. Otimização foi utilizada para gerar variantes de anticorpos com características melhoradas, tal como aqui descrito. As variantes de anticorpos otimizadas não estão presentes naturalmente; elas são geradas usando técnicas recombinantes. O anticorpo ou os seus fragmentos da invenção se ligam à região da haste da HA e neutralizam a infecção de mais de um subtipo do vírus influenza A selecionado entre os subtipos do grupo 1 e grupo 2, respectivamente. Os anticorpos da invenção, que são anticorpos anti-influenza A de ligação à haste HA, demonstraram uma abrangência de cobertura maior ou uma melhor atividade neutralizadora contra o vírus influenza A, em comparação com um anticorpo da literatura publicada (Anticorpo FI6v4, descrito em WO2013/011347A1) e mostrado na Tabela 6 do Exemplo 5. Além disso, os anticorpos da invenção podem ser mais eficazes do que o(s) outros mAb(s) no bloqueio da maturação da HA, como mostrado na Figura 1 do Exemplo 6.
[009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li gação do mesmo inclui um conjunto de seis CDRs, em que o conjunto de seis CDRs é selecionado a partir do grupo consistindo em:
[0010] (a) HCDR1 de SEQ ID NO.: 3, HCDR2 de SEQ ID NO.: 4, HCDR3 de SEQ ID NO.: 5, LCDR1 de SEQ ID NO.: 8, LCDR2 de SEQ ID NO.: 9 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 10;
[0011] (b) HCDR1 de SEQ ID NO.: 13, HCDR2 de SEQ ID NO.: 14, HCDR3 de SEQ ID NO.: 15, LCDR1 de SEQ ID NO.: 18, LCDR2 de SEQ ID NO.: 19, LCDR3 de SEQ ID NO.: 20;
[0012] (c) HCDR1 de SEQ ID NO.: 23, HCDR2 de SEQ ID NO.: 24, HCDR3 de SEQ ID NO.: 25, LCDR1 de SEQ ID NO.: 28, LCDR2 de SEQ ID NO.: 29 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 30;
[0013] (d) HCDR1 de SEQ ID NO.: 33, HCDR2 de SEQ ID NO.: 34, HCDR3 de SEQ ID NO.: 35, LCDR1 de SEQ ID NO.: 38, LCDR2 de SEQ ID NO.: 39 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 40;
[0014] (e) HCDR1 de SEQ ID NO.: 43, HCDR2 de SEQ ID NO.: 44, HCDR3 de SEQ ID NO.: 45, LCDR1 de SEQ ID NO.: 48, LCDR2 de SEQ ID NO.: 49 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 50;
[0015] (f) HCDR1 de SEQ ID NO.: 53, HCDR2 de SEQ ID NO.: 54, HCDR3 de SEQ ID NO.: 55, LCDR1 de SEQ ID NO.: 58, LCDR2 de SEQ ID NO.: 59 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 60;
[0016] (g) HCDR1 de SEQ ID NO.: 63, HCDR2 de SEQ ID NO.: 64, HCDR3 de SEQ ID NO.: 65, LCDR1 de SEQ ID NO.: 68, LCDR2 de SEQ ID NO.: 69 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 70;
[0017] (h) HCDR1 de SEQ ID NO.: 73, HCDR2 de SEQ ID NO.: 74, HCDR3 de SEQ ID NO.: 75, LCDR1 de SEQ ID NO.: 78, LCDR2 de SEQ ID NO.: 79 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 80;
[0018] (i) HCDR1 de SEQ ID NO.: 83, HCDR2 de SEQ ID NO.: 84, HCDR3 de SEQ ID NO.: 85, LCDR1 de SEQ ID NO.: 88, LCDR2 de SEQ ID NO.: 89, LCDR3 de SEQ ID NO.: 90;
[0019] (j) HCDR1 de SEQ ID NO.: 93, HCDR2 de SEQ ID NO.: 94, HCDR3 de SEQ ID NO.: 95, LCDR1 de SEQ ID NO.: 98, LCDR2 de SEQ ID NO.: 99 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 100;
[0020] (k) HCDR1 de SEQ ID NO.: 103, HCDR2 de SEQ ID NO.: 104, HCDR3 de SEQ ID NO.: 105, LCDR1 de SEQ ID NO.: 108, LCDR2 de SEQ ID NO.: 109 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 110;
[0021] (l) HCDR1 de SEQ ID NO.: 113, HCDR2 de SEQ ID NO.: 114, HCDR3 de SEQ ID NO.: 115, LCDR1 de SEQ ID NO.: 118, LCDR2 de SEQ ID NO.: 119 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 110;
[0022] (m) HCDR1 de SEQ ID NO.: 123, HCDR2 de SEQ ID NO.: 124, HCDR3 de SEQ ID NO.: 125, LCDR1 de SEQ ID NO.: 128, LCDR2 de SEQ ID NO.: 129 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 130;
[0023] (n) HCDR1 de SEQ ID NO.: 133, HCDR2 de SEQ ID NO.: 134, HCDR3 de SEQ ID NO.: 135, LCDR1 de SEQ ID NO.: 138, LCDR2 de SEQ ID NO.: 139 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 140; e
[0024] (o) HCDR1 de SEQ ID NO.: 143, HCDR2 de SEQ ID NO.: 144, HCDR3 de SEQ ID NO.: 145, LCDR1 de SEQ ID NO.: 148, LCDR2 de SEQ ID NO.: 149 e LCDR3 de SEQ ID NO.: 150;
[0025] (p) um conjunto de seis CDRs de acordo com qualquer um de (a) a (o) compreendendo uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos;
[0026] (q) um conjunto de seis CDRs de acordo com qualquer um de (a) a (p), compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 ou 25 substituições de amino- ácidos;
[0027] (r) um conjunto de seis CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 de acordo com qualquer um de (a) a (q), compreendendo:
[0028] (i) uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos idên tica a, ou compreendendo 3 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos em relação à SEQ ID NO: 3;
[0029] (ii) uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos idên- tica a, ou compreendendo 5 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos em relação à SEQ ID NO:4;
[0030] (ii) uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos idên tica a, ou compreendendo 6 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos em relação à SEQ ID NO:5;
[0031] (iv) uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos idêntica a, ou compreendendo 5 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos e / ou uma deleção em relação à SEQ ID NO:6;
[0032] (v) uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos idên tica a, ou compreendendo 5 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos em relação à SEQ ID NO:7; e
[0033] (vi) uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos idêntica a, ou compreendendo 1 ou menos substituições de resíduos de aminoácidos em relação à SEQ ID NO:8;
[0034] (s) um conjunto de seis CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 de acordo com qualquer um de (a) a (r), compreendendo:
[0035] (i) um HCDR1 no qual:
[0036] resíduo Kabat 31 é S,
[0037] resíduo Kabat 32 é N ou Y,
[0038] resíduo Kabat 33 é N, S ou R,
[0039] resíduo Kabat 34 é A,
[0040] resíduo Kabat 35 é V ou T,
[0041] resíduo Kabat 35A é W
[0042] resíduo Kabat 35B é N;
[0043] (ii) um HCDR2 no qual:
[0044] resíduo Kabat 50 é R,
[0045] resíduo Kabat 51 é T,
[0046] resíduo Kabat 52 é Y,
[0047] resíduo Kabat 52A é Y,
[0048] resíduo Kabat 53 é R,
[0049] resíduo Kabat 54 é S,
[0050] resíduo Kabat 55 é K ou G,
[0051] resíduo Kabat 56 é W,
[0052] resíduo Kabat 57 é Y,
[0053] resíduo Kabat 58 é N ou Y,
[0054] resíduo Kabat 59 é D,
[0055] resíduo Kabat 60 é Y,
[0056] resíduo Kabat 61 é A,
[0057] resíduo Kabat 62 é E, V ou D,
[0058] resíduo Kabat 63 é S ou F,
[0059] resíduo Kabat 64 é V ou L,
[0060] resíduo Kabat 65 é K;
[0061] (iii) um HCDR3 no qual:
[0062] resíduo Kabat 95 é S ou G,
[0063] resíduo Kabat 96 é G,
[0064] resíduo Kabat 97 é H,
[0065] resíduo Kabat 98 é I,
[0066] resíduo Kabat 99 é T,
[0067] resíduo Kabat 100 é V ou E,
[0068] resíduo Kabat 100A é F,
[0069] resíduo Kabat 100B é G,
[0070] resíduo Kabat 100C é V ou L,
[0071] resíduo Kabat 100D é N,
[0072] resíduo Kabat 100E é V ou I,
[0073] resíduo Kabat 100F é D,
[0074] resíduo Kabat 100G é A,
[0075] resíduo Kabat 100F é F ou Y,
[0076] resíduo Kabat 101 é D,
[0077] resíduo Kabat 102 é M, I ou V;
[0078] (iv) um LCDR1 no qual:
[0079] resíduo Kabat 24 é R,
[0080] resíduo Kabat 25 é T, A ou ausente,
[0081] resíduo Kabat 26 é S ou A,
[0082] resíduo Kabat 27 é Q,
[0083] resíduo Kabat 28 é S ou R,
[0084] resíduo Kabat 29 é L,
[0085] resíduo Kabat 30 é S, N ou R,
[0086] resíduo Kabat 31 é S,
[0087] resíduo Kabat 32 é Y,
[0088] resíduo Kabat 33 é L, T ou D,
[0089] resíduo Kabat 34 é H;
[0090] (v) um LCDR2 no qual:
[0091] resíduo Kabat 50 é A,
[0092] resíduo Kabat 51 é A, T ou S,
[0093] resíduo Kabat 52 é S ou T,
[0094] resíduo Kabat 53 é S ou T,
[0095] resíduo Kabat 54 é L ou R,
[0096] resíduo Kabat 55 é Q, L ou G,
[0097] resíduo Kabat 56 é S; e,
[0098] (vi) um LCDR3 no qual:
[0099] resíduo Kabat 89 é Q,
[00100] resíduo Kabat 90 é Q ou L,
[00101] resíduo Kabat 91 é S,
[00102] resíduo Kabat 92 é R, e
[00103] resíduo Kabat 93 é T.
[00104] A invenção fornece anticorpos e seus fragmentos de ligação compreendendo um conjunto de seis CDRs: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que o conjunto de seis CDRs é mostrado nas Tabelas 11 e 13.
[00105] As variantes das sequências do anticorpo da invenção podem partilhar 75% ou mais (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências referidas na aplicação. Em algumas modalidades a identidade de sequência é calculada em relação ao comprimento total da sequência de referência (isto é, a sequência referida no pedido). Em algumas modalidades adicionais, a percentagem de identidade, como aqui referida, é como determinada utilizando BLAST versão 2.1.3 usando os parâmetros padrão especificados pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information; http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /) ["Blosum 62 matrix"; "gap open penalty"=l 1 e "gap extension penal- ty"=l].
[00106] Variantes de anticorpos também estão incluídas dentro do âmbito da invenção. Assim, as variantes das sequências referidas na aplicação são também incluídas dentro do âmbito da invenção. As variantes das sequências de anticorpo possuindo uma afinidade e/ou potência melhorada podem ser obtidas utilizando métodos conhecidos na técnica e estão incluídas dentro do âmbito da invenção. Por exemplo, as substituições de aminoácidos podem ser usadas para se obter anticorpos com afinidade adicionalmente melhorada. Em alternativa, a otimização de códon da sequência de nucleotídeos pode ser usada para melhorar a eficiência de tradução em sistemas de expressão para a produção do anticorpo. Além disso, os polinucleotídeos compreendendo uma sequência otimizada para a especificidade do anticorpo ou atividade de neutralização mediante a aplicação de um método de evolução dirigida a qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da invenção estão também dentro do âmbito da invenção.
[00107] A invenção fornece um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, de acordo com a invenção compreendendo uma VH que tem pelo menos 75% de identidade e/ou uma VL que tem pelo menos 75% de identidade com uma VH e/ou VL selecionada de entre o grupo consistindo em:
[00108] (a) VH de SEQ ID NO.: 2 e VL de SEQ ID NO.: 7,
[00109] (b) VH de SEQ ID NO.: 12 e VL de SEQ ID NO.: 17,
[00110] (c) VH de SEQ ID NO.: 22 e VL de SEQ ID NO.: 27,
[00111] (d) VH de SEQ ID NO.: 32 e VL de SEQ ID NO.: 37,
[00112] (e) VH de SEQ ID NO.: 42 e VL de SEQ ID NO.: 47,
[00113] (f) VH de SEQ ID NO.: 52 e VL de SEQ ID NO.: 57,
[00114] (g)VH de SEQ ID NO.: 62 e VL de SEQ ID NO.: 67,
[00115] (h) VH de SEQ ID NO.: 72 e VL de SEQ ID NO.: 77,
[00116] (i) VH de SEQ ID NO.: 82 e VL de SEQ ID NO.: 87,
[00117] (j) VH de SEQ ID NO.: 92 e VL de SEQ ID NO.: 97,
[00118] (k) VH de SEQ ID NO.: 102 e VL de SEQ ID NO.: 107,
[00119] (l) VH de SEQ ID NO.: 112 e VL de SEQ ID NO.: 117,
[00120] (m) VH de SEQ ID NO.: 122 e VL de SEQ ID NO.: 127,
[00121] (n) VH de SEQ ID NO.: 132 e VL de SEQ ID NO.: 137,
[00122] (o) VH de SEQ ID NO.: 144 e VL de SEQ ID NO.: 147 e
[00123] (p) VH de SEQ ID NO: 152 e VL de SEQ ID NO.: 157.
[00124] Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, de acordo com a invenção pode compreender uma VH e uma VL selecionada entre o grupo consistindo em:
[00125] (a) VH de SEQ ID NO.: 2 e VL de SEQ ID NO.: 7,
[00126] (b) VH de SEQ ID NO.: 12 e VL de SEQ ID NO.: 17,
[00127] (c) VH de SEQ ID NO.: 22 e VL de SEQ ID NO.: 27,
[00128] (d) VH de SEQ ID NO.: 32 e VL de SEQ ID NO.: 37,
[00129] (e) VH de SEQ ID NO.: 42 e VL de SEQ ID NO.: 47,
[00130] (f) VH de SEQ ID NO.: 52 e VL de SEQ ID NO.: 57,
[00131] (g) VH de SEQ ID NO.: 62 e VL de SEQ ID NO.: 67,
[00132] (h) VH de SEQ ID NO.: 72 e VL de SEQ ID NO.: 77,
[00133] (i) VH de SEQ ID NO.: 82 e VL de SEQ ID NO.: 87,
[00134] (j) VH de SEQ ID NO.: 92 e VL de SEQ ID NO.: 97,
[00135] (k) VH de SEQ ID NO.: 102 e VL de SEQ ID NO.: 107,
[00136] (l) VH de SEQ ID NO.: 112 e VL de SEQ ID NO.: 117,
[00137] (m) VH de SEQ ID NO.: 122 e VL de SEQ ID NO.: 127,
[00138] (n) VH de SEQ ID NO.: 132 e VL de SEQ ID NO.: 137,
[00139] (o) VH de SEQ ID NO.: 144 e VL de SEQ ID NO.: 147 e
[00140] (p) VH de SEQ ID NO: 152 e VL de SEQ ID NO.: 157.
[00141] Um anticorpo ou um seu fragmento de ligação de acordo com a invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo com enxerto CDR, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um Fv ligado por dissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de especificidade dupla, e um anticorpo biespecífico.
[00142] Um anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com a invenção pode compreender uma VH compreendendo uma estrutura de linha germinal humana, preferencialmente VH6-1 e / ou uma VL compreendendo uma estrutura de linha germinal humana, preferencialmente VK1-39. Preferencialmente um anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com a invenção compreende uma VH compreendendo uma estrutura de linha germinal humana VH6-1 e uma VL compreendendo uma estrutura de linha germinal humana VK1-39. A estrutura VH6 raramente é usada em anticorpos.
[00143] Um anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com a invenção pode compreender uma região Fc, preferencialmente o anticorpo é uma IgG1, IgG2 ou IgG4, ou um fragmento de ligação das mesmas.
[00144] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende um domínio constante de IgG humana possuindo uma ou mais substituições de aminoácidos em relação a um domínio constante da IgG humana de tipo selvagem. Um anticorpo da invenção pode compreender um domínio constante de IgG humana possuindo as substituições de aminoácidos M252Y, S254T, e T256E ("YTE"), em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice EU como em Kabat.
[00145] A invenção também fornece um anticorpo para o vírus influenza A ou um seu fragmento de ligação que é capaz de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza A e neutralizar pelo menos um subti- po do grupo 1 e pelo menos um subtipo do grupo 2 do vírus influenza A, caracterizado pelo fato do anticorpo ou seu fragmento de ligação competir para a ligação à hemaglutinina do vírus influenza A com um anticorpo desta invenção, descrito acima. Em conformidade, a invenção compreende um anticorpo, ou seu fragmento, que se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo da invenção, ou um anticorpo que compete para a ligação com um anticorpo da invenção.
[00146] A invenção fornece adicionalmente um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção. Preferencialmente, o ácido nucleico é um cDNA. A invenção também inclui sequências de ácido nucleico que codificam parte ou a totalidade das cadeias leves e pesadas e CDRs dos anticorpos da presente invenção. Assim, se fornece aqui as sequências de ácidos nucleicos que codificam parte ou a totalidade das cadeias leve e pesada e CDRs de exemplos de anticorpos da invenção. Os números de SEQ ID para as sequências de ácidos nucleicos que codificam as CDRs, regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve dos exemplos de anticorpos da invenção são fornecidos. Devido à redundância do código genético, variantes destas sequências existirão que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.
[00147] A invenção fornece ainda um vector compreendendo um ácido nucleico isolado de acordo com a invenção; preferencialmente, o vector é um vector de expressão.
[00148] Além disso, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico isolado ou um vector de acordo com a invenção. As células hospedeiras adequadas incluem linhas celulares de mamíferos, tais como as derivadas de células HEK ou CHO.
[00149] Adicionalmente, a invenção fornece um método para a produção de um anticorpo ou fragmento da invenção, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira da invenção sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou seu fragmento.
[00150] Tais métodos podem compreender adicionalmente o isolamento do anticorpo ou seu fragmento a partir da cultura de células hospedeiras e, opcionalmente, formular o anticorpo isolado ou seu fragmento em uma composição.
[00151] A invenção ainda fornece adicionalmente uma composição compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00152] Também fornecida pela invenção é uma composição compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção, histidina e NaCl a um pH na gama de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, preferencialmente cerca de pH 6,0; ainda mais preferencialmente compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção, de 20 a cerca de 30 mM de histidina e cerca de 0,1 a cerca de 0,2 M de NaCl, a um pH na gama de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, preferencialmente cerca de pH 6,0; mais preferencialmente compreendendo His 25 mM e NaCl 0,15 M a um pH na gama de cerca de 5,5 a cerca de 6,5, por exemplo, a cerca de pH 6,0.
[00153] Adicionalmente, a invenção fornece:
[00154] - um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção para utilização na profilaxia ou tratamento de infecção por influenza A num sujeito;
[00155] - o uso de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção na produção de um medicamento para a profilaxia ou tratamento de infecção por Influenza A em um sujeito;
[00156] - um método para a profilaxia ou tratamento de infecção por influenza A em um sujeito que compreende a administração de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção;
[00157] - o uso de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção para prevenir o passo de fusão desencadeado pelo pH para a entrada viral do Influenza A nas células; ou
[00158] - o uso de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a invenção para inibir a maturação da HA do vírus Influenza A.
[00159] Exemplos de anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitados a: Anticorpo 3, Anticorpo 5, Anticorpo 6, Anticorpo 8, Anticorpo 10, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 13, Anticorpo 14, e Anticorpo 15.
[00160] A invenção também fornece a utilização de um anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com a invenção no diagnóstico in vitro da infecção por influenza A em um sujeito.
Descrição Detalhada Introdução
[00161] A presente invenção fornece anticorpos, incluindo formas humanas, bem como fragmentos, derivados/conjugados e composições dos mesmos que se ligam à hemaglutinina (HA) do vírus Influenza A e neutralizam infecções pelo vírus influenza A dos subtipos do grupo 1 e grupo 2 como aqui descrito; tais anticorpos contra o vírus influenza A de ligação à haste HA são aqui referidos como os anticorpos da invenção.
[00162] Tal como aqui utilizado, o termo "neutralizar" se refere à capacidade de um anticorpo, ou seu fragmento de ligação, para se li- gar a um agente infeccioso, tal como o vírus influenza A, e reduzir a atividade biológica, por exemplo, a virulência, do agente infeccioso. O requisito mínimo para a neutralização é a capacidade para o anticorpo, ou seu fragmento de ligação, para se ligar ao agente infeccioso. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção se liga imunoespecificamente a pelo menos um epitopo especificado ou antigênico determinante do vírus Influenza A. Em uma modalidade mais particular, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção se liga imunoespecificamente a pelo menos um epitopo especificado ou antigênico determinante da proteína da haste HA do vírus Influenza A.
[00163] Um anticorpo pode neutralizar a atividade de um agente infeccioso, tal como o vírus Influenza A, em vários momentos durante o ciclo de vida do vírus. Por exemplo, um anticorpo pode interferir com a ligação viral a uma célula alvo por interferência com a interação do vírus e um ou mais receptores da superfície celular. Em alternativa, um anticorpo pode interferir com um ou mais interações após a ligação do vírus com os seus receptores, por exemplo, por interferência com a internalização viral por endocitose mediada pelo receptor.
[00164] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação neutraliza a atividade do Influenza A interferindo com o processo de fusão, por exemplo, por interferir com a fusão das membranas virais e endossomais. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação interfere com a clivagem de HA0 mediada por protease, interferindo assim com a maturação viral e a formação do peptídeo de fusão viral HA2. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação interfere com a clivagem de HA0 mediada por protease, necessária para a ativação do vírus Influenza A.
[00165] Tal como aqui utilizados, os termos "anticorpo" e "anticor- pos", também conhecido como imunoglobulinas, englobam anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de camelídeos, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples, anticorpos de domínio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticorpos que exibam a atividade biológica desejada (p.ex., a porção de ligação ao antígeno), Fvs ligados por dissulfeto (dsFv), e anticorpo anti- idiotípico (anti-Id) (incluindo, p.ex., anticorpos anti-Id para anticorpos da presente invenção), intracorpos, e fragmentos de ligação a epitopos de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm pelo menos um local de ligação ao antígeno. As moléculas de imunoglobulina pode ser de qualquer isotipo (p.ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisoti- pos (p.ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou alótipo (p.ex., Gm, p.ex., G1m(f, z, a ou x), G2m (n), G3m (g, b ou c), Am, Em, e Km(1, 2 ou 3)).
[00166] Os anticorpos humanos são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dis- sulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes (CH). Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante (CL) na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. As cadeias leves são classificadas como cadeias lambda ou cadeias kappa com base na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia leve. O domínio variável de uma cadeia leve kappa pode também ser aqui denominado como VK.
[00167] Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos de comprimento total ou intato, fragmentos de anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, anticorpo de sequência nativa ou variantes de aminoácidos, anticorpos humanos, humanizados, modificados pós-translacionalmente, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados e seus fragmentos funcionais. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer as funções efetoras desejadas ou meia- vida no soro. Como discutido em mais detalhe nas seções abaixo, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu ("naked antibody") ligado à superfície celular pode induzir citotoxicidade, p.ex., via citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou por recrutamento de complemento na citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ou através do recrutamento de células citotóxicas inespecíficas que expressam um ou mais ligandos efetores que reconhecem o anticorpo ligado na haste HA do vírus Influenza A e subsequentemente causa a fagocitose das células em fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), ou algum outro mecanismo. Em alternativa, onde é desejável eliminar ou reduzir a função efetora, de modo a minimizar os efeitos secundários ou complicações terapêuticas, podem ser utilizadas determinadas outras regiões Fc. A região Fc dos anticorpos da invenção pode ser modificada para aumentar a afinidade de ligação para FcRn e assim aumentar a meia-vida do soro. Em alternativa, a região Fc pode ser conjugada com PEG ou albumina para aumentar a meia-vida no soro, ou alguma outra conjugação que resulte no efeito desejado.
[00168] Os anticorpos contra o vírus influenza A de ligação à haste HA da presente invenção são úteis para diagnosticar, prevenir, tratar e/ou minorar um ou mais sintomas da infecção do vírus Influenza A em um mamífero.
[00169] A invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo contra o vírus influenza A de ligação à haste HA da invenção e um veículo. Para efeitos de prevenção ou tratamento de infecção pelo vírus Influenza A, as composições podem ser administradas ao paciente em necessidade de tal tratamento. A invenção também fornece formulações compreendendo um anticorpo contra o vírus influenza A de ligação à haste HA da invenção e um veículo. Em uma modalidade, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00170] Em certas modalidades, a invenção fornece métodos úteis para a prevenção ou tratamento de infecção por influenza A em um mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz do anticorpo a um mamífero. As composições terapêuticas do anticorpo podem ser administradas a curto prazo (agudamente), cronicamente, ou intermitentemente, conforme indicado pelo médico.
[00171] Em certas modalidades, a invenção fornece também artigos de produção compreendendo pelo menos um anticorpo contra o vírus influenza A de ligação à haste HA, tais como formas de dosagem estéreis e kits. Kits podem ser fornecidos contendo os anticorpos para a detecção e quantificação do vírus Influenza A in vitro, p.ex., por ELISA ou por Western blot. Tal anticorpo útil para a detecção pode ser fornecido com um marcador, tal como um radioativo ou fluorescente.
Terminologia
[00172] Antes de descrever a presente invenção em detalhe, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a composições ou etapas do processo específicas, que como tal podem variar. Deve ser salientado que, como utilizado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem as referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[00173] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual esta invenção está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisto, 2000, Oxford University Press, fornece a um perito na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção.
[00174] Os aminoácidos podem ser aqui referidos por qualquer dos seus vulgarmente conhecidos símbolos de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão da Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos pelos seus códigos de uma letra normalmente aceites.
[00175] A numeração dos aminoácidos no domínio variável, regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e regiões estruturais (FR), de um anticorpo segue, a menos que indicado em contrário, a definição de Kabat, conforme estabelecido em Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção de, uma FR ou CDR no domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (p.ex., resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da cadeia pesada FR. A numeração dos resíduos segundo Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência Kabat "padrão" numerada. O alinhamento máximo de resíduos estruturais frequentemente requer a inserção de resíduos "espaçadores" no sistema de numeração, para ser usado para a região Fv. Além disso, a identidade de certos resíduos individuais em qualquer determinado número do local Kabat pode variar de cadeia de anticorpo para cadeia de anticorpo, devido à divergência entre espécies ou alélicas.
Anticorpos contra o vírus influenza A de ligação à haste HA
[00176] Em certas modalidades, os anticorpos são isolados e/ou purificados e/ou anticorpos isentos de pirogênio. O termo "purificado" tal como aqui utilizado refere-se a outras moléculas, p.ex., molécula de polipeptídeo, ácido nucleico que foi identificada e separada e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Assim, em uma modalidade os anticorpos da invenção são anticorpos purificados em que estes foram separados de um ou mais componentes do seu ambiente natural. O termo "anticorpo isolado" tal como aqui utilizado refere- se a um anticorpo que é substancialmente isento de outras moléculas de anticorpos que possuem diferentes especificidades antigênicas (p.ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente à haste HA do vírus Influenza A é substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente a antígenos que não aqueles da haste HA do vírus Influenza A). Assim, em uma modalidade os anticorpos da invenção são anticorpos isolados em que estes foram separados de anticorpos com uma especificidade diferente. Tipicamente, um anticorpo isolado é um anticorpo monoclonal. Além disso, um anticorpo isolado da invenção pode ser substancialmente isento de outros, um ou mais, materiais celulares e/ou produtos químicos e é aqui referido a um anticorpo isolado e purificado. Em uma modalidade da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos que possuem diferentes especificidades e são combinados em uma composição bem definida. Os métodos de produção e de purifica- ção/isolamento de anticorpos são descritos abaixo em mais detalhe.
[00177] Os anticorpos isolados da presente invenção compreendem as sequências de aminoácidos de anticorpos aqui divulgadas codificadas por qualquer polinucleotídeo adequado, ou qualquer anticorpo isolado ou formulado.
[00178] Os anticorpos da invenção se ligam imunoespecificamente a pelo menos um epitopo específico indicado para a proteína da haste HA do vírus Influenza A. O termo "epitopo" como aqui usado se refere a um determinante proteína capaz de se ligar a um anticorpo. Os epitopos geralmente incluem grupos de moléculas na superfície quimicamente ativas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos con- formacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de a ligação aos primeiros, mas não aos últimos, é perdida na presença de solventes desnaturantes.
[00179] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação se liga a um epitopo que é conservado entre pelo menos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 ou H17 ou todos os subtipos HA de influenza A. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação se liga a um epitopo que é conservado entre um ou mais, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 subtipos do grupo 1 do vírus influenza A selecionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 e H16 e um ou mais, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 subtipos do grupo 2 selecionados de H3, H4, H7, H10, H14 e H15.
[00180] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação se liga a pelo menos 17H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 ou H17 ou a todos os subtipos de influenza A com uma EC50 entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 5 μg/mL, ou entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 0,5 μg/mL, ou entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 0,1 μg/mL, ou menos do que cerca de 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,1 μg/mL, ou 0,05 μg/mL. Em outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação se liga a um ou mais, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 subtipos do grupo 1 do vírus influenza A selecionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 e H16 e um ou mais, ou pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 subti- pos do grupo 2 selecionados de H3, H4, H7, H10, H14 e H15, com uma EC50 entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 5 μg/mL, ou entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 0,5 μg/mL, ou entre cerca de 0,01 μg/mL e cerca de 0,1 μg/mL, ou menos do que cerca de 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,1 μg/mL, ou 0,05 μg/mL.
[00181] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação reconhece um epitopo que é ou um epitopo linear, ou epitopo contínuo. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação reconhece um epitopo não linear ou conformacional. Em uma modalidade, o epitopo está localizado na região da haste altamente conservada de HA2. Em uma modalidade mais particular, o anticorpo ou fragmento de ligação se liga a um epitopo conformacional na região da haste altamente conservada de HA2. Em uma modalidade, o epito- po inclui um ou mais aminoácidos selecionados de: posições 18, 19, 42, 45 na região da haste HA2 (posições são numeradas de acordo com o sistema de numeração de H3 como descrito em Weiss et al., J. Mol. Biol. (1990) 212, 737-761 (1990)) como resíduos de contato. Em uma modalidade mais particular, o epitopo inclui um ou mais aminoá- cidos selecionados de 18, 19, 42 e 45 na região da haste HA2, como resíduos de contato. Em uma modalidade adicional, o epitopo inclui os aminoácidos 18, 19, 42 e 45 na região da haste HA2 como resíduos de contato. Em ainda uma modalidade adicional, o epitopo inclui os ami- noácidos 18, 19 e 42 na região da haste HA2 como resíduos de contato.
[00182] O epitopo ou epitopos reconhecidos pelo anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção podem ter uma série de utilizações. Por exemplo, o epitopo na forma purificada ou sintética pode ser usado para aumentar as respostas imunes (i.e., como uma vacina, ou para a produção de anticorpos para outras aplicações) ou para o rastreio de soros de anticorpos que imunoreagem com o epitopo. Em uma modalidade, um epitopo reconhecido pelo anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção, ou um antígeno possuindo um tal epitopo, pode ser utilizado como uma vacina para produzir uma resposta imune. Em uma outra modalidade, os anticorpos e fragmentos de ligação da invenção pode ser utilizado para monitorar a qualidade de vacinas, por exemplo, determinando se o antígeno em uma vacina contém o epito- po imunogênico correto na conformação correta.
Regiões Variáveis
[00183] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo de origem" refere-se a um anticorpo que é codificado por uma sequência de aminoá- cidos utilizada para a preparação da variante ou derivado, como aqui definido. O polipeptídeo de origem pode compreender uma sequência de anticorpo nativa (i.e., uma que ocorre naturalmente, incluindo uma variante alélica que ocorre naturalmente) ou uma sequência de anticorpo com modificações preexistentes na sequência de aminoácidos (tais como outras inserções, deleções e/ou substituições) de uma sequência que ocorre naturalmente. O anticorpo de origem pode ser um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. Em modalidades es- pecíficas, os anticorpos da invenção são variantes do anticorpo de origem. Tal como aqui utilizado, o termo "variante" refere-se a um anticorpo, que difere na sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos do anticorpo "de origem" em virtude da adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduo(s) de aminoácidos na sequência do anticorpo de origem.
[00184] A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Tem sido demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombi- nantes, por um ligante sintético que permite que estes sejam produzidos como uma proteína de cadeia única, em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser englobados no termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas de peritos na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o são os anticorpos intatos. Porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimáti- ca ou química de imunoglobulinas intatas.
[00185] Os anticorpos da invenção compreendem pelo menos um domínio de ligação ao antígeno, compreendendo um domínio VH e um VL aqui descritos.
[00186] Em certas modalidades, os anticorpos purificados compreendem uma VH e/ou VL que possui uma determinada percentagem de identidade com pelo menos uma das sequências VH/VL divulgadas na Tabela 1. Como aqui utilizado, o termo "percentagem (%) de identidade de sequência", também incluindo "homologia", é definido como a percentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas sequências de referência, tais como a sequência do anticorpo de origem, após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para atingir a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EUA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que usam estes algoritmos (GAP, BEST- FIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Ma- dison, Wis.).
[00187] Os anticorpos da invenção podem compreender uma sequência de aminoácidos de VH tendo pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou tendo 100% de identidade com as sequências de aminoácidos de VH aqui descritas. Os anticorpos podem ter uma sequência de aminoácidos de VH tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou tendo 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de VH aqui descrita.
[00188] Os anticorpos da invenção podem compreender uma sequência de aminoácidos de VL tendo pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou tendo 100% de identidade com as sequências de aminoácidos de VL aqui descritas. Os anticorpos podem ter uma sequência de aminoácidos de VL tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou tendo 100% de identidade com a sequência de aminoácidos de VL aqui descrita.
[00189] Os anticorpos dentro do âmbito da presente invenção são capazes de neutralizar um ou mais subtipos do grupo 1 e um ou mais subtipos do grupo 2 do vírus Influenza A, como aqui descrito.
Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs)
[00190] Embora o domínio variável (VH e VL) compreende a região de ligação ao antígeno, a variabilidade não está distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos anticorpos. Está concentrada em segmentos denominados Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs), tanto na cadeia leve (VL ou VK) e nos domínios variáveis de cadeia pesada (VH). As porções mais conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões estruturais (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FR, adoptando largamente uma configuração de folha- β, ligadas por três CDRs, que formam alças que ligam, e em alguns casos fazendo parte da, estrutura de folha-β. As CDRs em cada ca- deia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno dos anticorpos (ver, Kabat et al., Supra). As três CDRs da cadeia pesada são designadas CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, e as três CDRs da cadeia leve são designadas CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. O sistema de numeração de Kabat é aqui utilizado. Como tal, CDR-H1 começa aproximadamente no aminoácido 31 (i.e., cerca de 9 resíduos após o primeiro resíduo de cisteína), inclui cerca de 5-7 aminoácidos, e termina no resíduo de tirosina seguinte. CDR-H2 começa no resíduo décimo quinto após o fim de CDR- H1, inclui cerca de 16-19 aminoáci- dos, e termina no resíduo de arginina ou lisina seguinte. CDR-H3 começa aproximadamente no resíduo de aminoácido trigésimo terceiro após o final de CDR-H2; inclui 3-25 aminoácidos; e termina na sequência W-G-X-G, em que X é qualquer aminoácido. CDR-L1 começa aproximadamente no resíduo 24 (i.e., após um resíduo de cisteína); inclui cerca de 10-17 resíduos; e termina no resíduo de tirosina seguinte. CDR-L2 começa aproximadamente no resíduo décimo sexto após o final de CDR-L1 e inclui cerca de 7 resíduos. CDR-L3 começa aproximadamente no trigésimo terceiro resíduo após o final de CDR-L2; inclui cerca de 7-11 resíduos e termina na sequência F-G-X-G, em que X é qualquer aminoácido. Deve ser salientado que as CDR variam consideravelmente de anticorpo para anticorpo (e, por definição, não exibem homologia com as sequências Kabat consenso).
[00191] A presente invenção abrange anticorpos neutralizantes antiInfluenza A de ligação à haste HA compreendendo os aminoácidos em uma sequência que é substancialmente a mesma que uma sequência de aminoácidos aqui descrita. As sequências de aminoácidos que são substancialmente as mesmas que as sequências descritas na presente invenção incluem sequências compreendendo substituições conser- vativas de aminoácidos, bem como deleções e/ou inserções de ami- noácidos em uma sequência de aminoácidos de, por exemplo, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 13, Anticorpo 14 ou Anticorpo 15, ou em uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 102, 112, 122, 132, ou 142. Uma substituição de aminoácidos conser- vativa refere-se à substituição de um primeiro aminoácido por um segundo aminoácido que tem propriedades química e/ou físicas (p.ex., carga, estrutura, polaridade, hidrofobicidade/hidrofilicidade) que são semelhantes às do primeiro aminoácido. As substituições conservati- vas incluem a substituição de um aminoácido por outro dentro dos seguintes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D e E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleuci- na (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), metionina (M), cisteí- na (C) e glicina (G); F, W e Y; C, S e T.
Regiões Estruturais
[00192] Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve compreendem cada um quatro regiões estruturais (FR1, FR2, FR3, FR4), que são as porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis. As quatro FR de cadeia pesada são designadas FR-H1, FR-H2, FR-H3 e FR-H4, e as quatro FR de cadeia leve são designadas FR-L1, FR- L2, FR-L3 e FR-L4. O sistema de numeração de Kabat é aqui utilizado, Ver Tabela 1, Kabat et al., Supra. Como tal, FR-H1 começa na posição 1 e termina aproximadamente no aminoácido 30, FR-H2 é aproximadamente do aminoácido 36 ao 49, FR-H3 é aproximadamente do ami- noácido 66 ao 94 e FR-H4 é aproximadamente do aminoácido 103 ao 113. FR-L1 começa no aminoácido 1 e termina aproximadamente no aminoácido 23, FR-L2 é aproximadamente do aminoácido 35 ao 49, FR-L3 é aproximadamente do aminoácido 57 ao 88 e FR-L4 é aproxi-madamente do aminoácido 98 ao 107. Em certas modalidades, as regiões estruturais podem conter substituições de acordo com o sistema de numeração de Kabat, p.ex., inserção em 106A na FR-L1. Além de substituições que ocorrem naturalmente, uma ou mais alterações (p.ex., substituições) dos resíduos da FR podem também ser introduzidos em um anticorpo da invenção, desde que retenha a capacidade de neutralização. Em certas modalidades, estas resultam em uma melhoria ou otimização da afinidade de ligação do anticorpo para a haste HA do vírus Influenza A. Os exemplos de resíduos da região estrutural a modificar incluem os que ligam diretamente o antígeno de forma não covalente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interagem com/influenciam a conformação de uma CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); e/ou participam na interface VL-VH (Patente US No. 5.225.539).
[00193] Em uma outra modalidade, a FR pode compreender uma ou mais alterações de aminoácidos para os fins de "germlining". Por exemplo, as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve de anticorpos selecionados são comparadas com sequências de aminoá- cidos das cadeias pesada e leve da linha germinal e em que determinados resíduos estruturais das cadeias VL e/ou VH selecionadas diferem da configuração da linha germinal (p.ex,, como um resultado de mutação somática dos genes de imunoglobulina utilizados para preparar a biblioteca de fagos), pode ser desejável "reverter a mutação" dos resíduos estruturais alterados dos anticorpos selecionados para a configuração de linha germinal (i.e., alterar as sequências estruturais de aminoácidos dos anticorpos selecionados de modo que sejam os mesmos que as sequências estruturais de aminoácidos da linha germinal). Tal "reversão da mutação" (ou "germlining") de resíduos estruturais pode ser realizada por métodos de biologia molecular padrão para a introdução de mutações específicas (p.ex., mutagênese dirigida; mutagênese mediada por PCR e semelhantes).
Sequências de Nucleotídeos que codificam os anticorpos da invenção
[00194] Para além das sequências de aminoácidos descritas acima, a presente invenção fornece ainda sequências de nucleotídeos correspondendo às sequências de aminoácidos e que codificam para os anticorpos humanos da invenção. Em uma modalidade, a presente invenção fornece polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui descrito ou seus fragmentos. Estes incluem, mas não estão limitadas a, sequências de nucleo- tídeos que codificam para as sequências de aminoácidos acima referenciadas. Assim, a presente invenção também fornece sequências de polinucleotídeos que codificam regiões estruturais VH e VL incluindo CDRs e FRs de anticorpos aqui descritos, assim como vetores de expressão para a expressão eficiente nas células (p.ex. células de mamífero). Os métodos para preparar os anticorpos utilizando polinucleotí- deos são descritos abaixo em mais detalhe.
[00195] A invenção também abrange polinucleotídeos que hibridam em condições de hibridação rigorosas ou menos rigorosas, p.ex., tal como aqui definido, com polinucleotídeos que codificam um anticorpo da invenção aqui descrito. O termo "rigoroso", tal como aqui utilizado refere-se a condições experimentais (por exemplo, temperatura e concentração de sal) de uma experiência de hibridação para indicar o grau de homologia entre a sonda e o ácido nucleico ligado à membrana; quanto maior o rigor, mais elevada a percentagem de homologia entre a sonda e o ácido nucleico ligado à membrana.
[00196] Condições de hibridação rigorosas incluem, mas não se limitam a, hibridação de DNA ligado a membrana em 6X citrato de cloreto de sódio/hidróxido de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/SDS a 0,1% a cerca de 50- 65 °C, condições altamente rigorosas, tais como hibridação de DNA ligado a membrana em 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/SDS a 0,2% a cerca de 65 °C, ou quais- quer outras condições de hibridação rigorosas conhecidas dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley and Sons, Inc., NI nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3).
[00197] Sequências substancialmente idênticas podem ser sequências polimórficas, i.e., sequências alternativas ou alelos em uma população. Uma diferença alélica pode ser tão pequena como um par de bases. Sequências substancialmente idênticas podem também compreender sequências mutagenizadas, incluindo sequências compreendendo mutações silenciosas. Uma mutação pode compreender uma alteração de um ou mais resíduos, uma deleção de um ou mais resíduos ou uma inserção de um ou mais resíduos adicionais.
[00198] Os polinucleotídeos podem ser obtidos, e a sequência de nucleotídeos dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos do anticorpo é conhecida, um polinucleotídeo que codifica para o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (p.ex., tal como descrito em Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonu- cleotídeos com sobreposição a partes da sequência que codifica o anticorpo, hibridação e ligação destes oligonucleotídeos, e em seguida a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.
[00199] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo pode também ser gerado a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica para a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (p.ex., uma biblioteca de cDNA de anticorpos, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de, ou ácido nucleico, preferencialmente po- liA+RNA, isolado a partir de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tal como as células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por PCR utilizando iniciadores sintéticos capazes de hibridar com as extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem utilizando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência particular do gene para identificar, p.ex., um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser então clo- nados em vectores de clonagem reproduzíveis utilizando qualquer método bem conhecido na técnica.
[00200] Uma vez sendo determinada a sequência de nucleotídeos e a correspondente sequência de aminoácidos do anticorpo, a sequência de nucleotídeos do anticorpo pode ser manipulada usando processos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequências de nucleotídeos, p.ex., técnicas de DNA recombinante, mutagênese dirigida, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I. e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NI), para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar as substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos.
Características da Ligação
[00201] Como descrito acima, os anticorpos contra o vírus influenza A de ligação à haste HA da invenção se ligam imunoespecificamente pelo menos a um epitopo especificado ou antigênico determinante da proteína da haste HA do vírus Influenza A, peptídeo, subunidade, fragmento, porção ou qualquer combinação dos mesmos, quer exclusivamente ou preferencialmente no que diz respeito a outros polipeptí- deos. O termo "epitopo" ou "determinante antigênico", tal como aqui utilizado refere-se a um determinante proteico capaz de se ligar a um anticorpo, em que o termo "ligação" aqui preferencialmente utilizado refere-se a uma ligação específica. Estes determinantes proteicos ou epitopos geralmente consistem em grupos de moléculas na superfície quimicamente ativas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, e geralmente possuem umas características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de a ligação aos primeiros, mas não aos últimos, é perdida na presença de solventes desnaturantes. O termo "epitopo descontínuo", tal como aqui utilizado, refere-se a um epitopo confor- macional num antígeno de proteína que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína.
[00202] As interações entre antígenos e anticorpos são os mesmos que para as outras interações proteína-proteína não covalentes. Em geral, existem quatro tipos de interações de ligação entre antígenos e anticorpos: (i) ligações de hidrogênio, (ii) forças de dispersão, (iii) forças eletrostáticas entre ácidos de Lewis e bases de Lewis, e (iv) interações hidrofóbicas. Interações hidrofóbicas são um fator determinante para a interação anticorpo-antígeno, e são baseadas na repulsão de água por grupos não polares mais do que na atração de moléculas (Tanford, 1978). No entanto, certas forças físicas também contribuem para a ligação antígeno-anticorpo, por exemplo, o ajuste ou complementaridade das formas do epitopo com diferentes locais de ligação ao anticorpo. Além disso, outros materiais e antígenos podem reagir de forma cruzada com um anticorpo, assim competindo por anticorpo livre disponível.
[00203] A medição da constante de afinidade e especificidade de ligação entre o antígeno e o anticorpo é um elemento fundamental pa ra determinar a eficácia dos métodos profilácticos, terapêuticos, de di-agnóstico e de investigação utilizando os anticorpos da invenção. "Afinidade de ligação" refere-se geralmente à força da soma total das interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (p.ex., um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (p.ex., um antíge- no). A menos que indicado em contrário, tal como aqui utilizado, o termo "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros de um par de ligação (p.ex., anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para o seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação de equilíbrio (Kd), que é calculado como a razão entre koff/kon. Ver, p.ex., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles aqui descritos e exemplificados. Um exemplo de um sistema comercialmente disponível para caracterização cinética inclui a família de instrumentos OCTET®. Os anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam o antígeno lentamente e tendem a dissociar-se facilmente, enquanto os anticorpos de elevada afinidade ligam-se geralmente antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer mais tempo ligados. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os fins da presente invenção.
[00204] Determinação da afinidade de ligação pode ser medida utilizando as técnicas específicas descritas posteriormente na seção de Exemplos, e métodos bem conhecidos na técnica. Um tal método inclui a medição da constante de dissociação "Kd" por um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antígeno, tal como descrito pelo seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação de solução de Fab para o antígeno equilibrando Fab com uma concentração mínima de antí- geno marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de an- tígeno não marcado, então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida por anticorpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas de microtitulação (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 μg/mL de um anticorpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa não adsor- vente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno [125I] são misturados com diluições em série de um Fab de interesse (p.ex., consistente com a análise de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (p.ex., 65 horas) para assegurar que o equilíbrio é alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para a incubação à temperatura ambiente (p.ex., durante uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com Tween-20 0,1% em PBS. Quando as placas secaram, é adicionado 150 μl/poço de líquido de cintilação (Microscint-20, Packard), e as placas são detectadas num detector de radiação gama Topcount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que resultaram em menos de ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidos para utilização nos ensaios de ligação competitiva.
[00205] Em um outro exemplo, o valor de Kd pode ser medido usando ensaios de ressonância de plasma de superfície utilizando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C, com antígeno imobilizado em chips CM5 a “10 unidades resposta (RU). Resumidamente, chips biossensores de dextrano car- boximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fabricante. O antígeno é diluído com acetato de sódio 110 mM, pH 4,8, para 5 μg/mL (“0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μL/minuto para se obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, IM etanolamina é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para as medições de cinética, duas diluições em série de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween 20 0,05% (PBST) a 25 °C com uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μL/min. As constantes de associação (kon) e constantes de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo de ligação de Langmuir simples um a um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) pelo ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação.
[00206] Se a constante de ligação exceder 106 M-1 S-1 pelo ensaio de ressonância de plasma de superfície acima, então a constante de ligação pode ser determinada usando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa banda 16 nm), a 25 °C de um anticorpo antiantígeno a 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno tal como medido em um espectrofotômetro, tal como um es- pectrofotômetro equipado com válvula "stop-flow" (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada. Uma "constante on" ou "constante de associação" ou "constante de formação" ou "kon" de acordo com esta invenção também pode ser determinada com a mesma técnica de res-sonância de plasma de superfície descrita anteriormente na presente invenção utilizando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIA- core, Inc., Piscataway, NJ), como descrito acima.
[00207] Métodos e reagentes adequados para a determinação das características de ligação de um anticorpo da presente invenção, ou um derivado modificado/mutante do mesmo (discutido abaixo), são conhecidos na técnica e/ou estão disponíveis comercialmente (Patentes U.S. Nos. 6.849.425; 6.632.926; 6.294.391; 6.143.574). Além disso, os equipamentos e software projetados para tais análises cinéticas estão disponíveis comercialmente (p.ex. instrumentos Biacore® A100 e Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Suécia).
[00208] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção, incluindo os seus fragmentos ou variantes de ligação, também podem ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação para os polipeptídeos do vírus Influenza A. Tipicamente, os anticorpos com elevada afinidade têm Kd inferior a 10-7 M. Em uma modalidade, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ligam os polipeptídeos de Influenza A, ou seus fragmentos ou variantes, com uma constante de dissociação ou Kd inferior ou igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5xi0-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M ou 10-15 M. Os polipeptídeos de Influenza A podem incluir polipeptídeos de HA. Em uma modalidade mais particular, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ligam os polipeptídeos de Influenza A, ou seus fragmentos ou variantes, com uma constante de dissociação ou Kd inferior ou igual a 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M ou 10-12 M. A invenção engloba anticorpos que se ligam a polipeptídeos de influenza A com uma constante de dissociação ou Kd que está dentro de uma gama entre qualquer um dos valores individuais enumerados.
[00209] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou os seus fragmentos da invenção ligam polipeptídeos de Influenza A ou seus fragmentos de ligação ou variantes, com uma constante off (koff) de menos do que ou igual a 5x10-2 s-1, 10-2 s-1, 5x10-3 s-1 or 10-3 s-1, 5x10-4 s-1, 10-4 s-1, 5x10-5 s-1, ou 10-5 s-1, 5x10-6 s-1, 10-6 s-1, 5x10-7 s-1 ou 10-7 s-1. Em uma modalidade mais particular, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação da invenção ligam polipeptídeos de Influenza A ou seus fragmentos ou variantes, com uma constante off (koff) inferior ou igual a 5x10-4 s-1, 10—4 s-1, 5xi0-5 s-1, or io-5 s-1, 5xio-6 s-1, io—6 s-1, 5x10—7 s-1 ou 10-7 s-1. A invenção também abrange anticorpos que se ligam a polipeptídeos de Influenza A com uma constante off (koff) que está dentro de uma gama entre qualquer um dos valores individuais enumerados.
[00210] Em uma outra modalidade, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação da invenção ligam polipeptídeos de Influenza A ou seus fragmentos ou variantes, com uma constante on (kon) maior do que ou igual a 103 M-1 s-1, 5x103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5x104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5x105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5x106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1, ou 5x107 M-1 s-1. Em uma modalidade mais particular, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação da invenção ligam polipeptídeos de Influenza A ou seus fragmentos ou variantes, com uma constante on (kon) maior do que ou igual a 105 M-1 s-1, 5x105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5x106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1 or 5x107 M-1 s-1. A invenção abrange anticorpos que se ligam a poli- peptídeos de Influenza A com uma constante on (kon) que está dentro de uma gama entre qualquer um dos valores individuais enumerados.
[00211] Em uma modalidade, um ensaio de ligação pode ser realizado tanto como ensaios de ligação direta ou como ensaios de ligação de competição. A ligação pode ser detectada utilizando ensaios ELISA padrão ou Citometria de Fluxo padrão. Em um ensaio de ligação direta, um anticorpo candidato é testado para a ligação ao seu antígeno cognato. O ensaio de ligação de competição, por outro lado, avalia a capacidade de um anticorpo candidato para competir com um anticorpo ou outro composto conhecido que se liga à haste HA do vírus Influenza A. Em geral qualquer método que permite a ligação de um anticorpo com a haste HA do vírus Influenza A que pode ser detectado é englobado no âmbito da presente invenção para detectar e medir as características de ligação dos anticorpos. Um perito na técnica irá reconhecer estes métodos conhecidos e, por essa razão não são apresentados em pormenor aqui. Estes métodos também são utilizados para pesquisar um painel de anticorpos para aqueles que fornecem as características desejadas.
[00212] Um anticorpo da invenção se liga imunoespecificamente à haste HA do vírus Influenza A e é capaz de neutralizar a infecção pelo vírus Influenza A. Ensaios de neutralização podem ser realizados tal como é aqui descrito na seção de Exemplos ou usando outros métodos conhecidos na técnica. O termo "concentração inibitória 50%" (abreviado como "IC50") representa a concentração de um inibidor (p.ex., um anticorpo da presente invenção) que é necessária para neutralizar a 50% o vírus Influenza A. Será entendido por um vulgar perito na técnica que um valor de IC50 mais baixo corresponde a um inibidor mais potente.
[00213] Em uma modalidade, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação de acordo com a invenção tem uma potência de neutralização expressa como concentração inibitória 50% (IC50 μg/mL) na gama de desde cerca de 0,01 μg/mL a cerca de 50 μg/mL, ou no intervalo de cerca de 0,01 μg/mL a cerca de 5 μg/mL de anticorpo, ou na gama de desde cerca de 0,01 μg/mL a cerca de 0,1 μg/mL de anticorpo por neutralização do vírus Influenza A em um ensaio de microneutralização. A concentração mais elevada de anticorpo utilizada no ensaio de micro- neutralização descrito no presente documento foi de 50 μg/mL. A alta potência dos anticorpos da presente invenção indica que as concentrações mais baixas de anticorpo podem ser usadas para atingir 50% de neutralização do vírus influenza A.
[00214] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem induzir a morte celular. Um anticorpo que "induz a morte celular" é aquele que faz com que uma célula viável se torne não viável. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de células efetoras de complemento e imunitárias para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, o ensaio para morte celular pode ser efetuado utilizando soro inativado por calor (i.e., na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunitárias. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir morte celular, a perda de integridade da membrana é avaliada pela captação de iodeto de propídio (PI), azul de tripan (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)), 7AAD, ou outros métodos bem conhecidos na técnica podem ser analisados em relação às células não tratadas.
[00215] Em uma modalidade específica, os anticorpos da presente invenção podem induzir a morte celular por apoptose. Um anticorpo que "induz apoptose" é um que induz morte celular programada, tal como determinado através da ligação de anexina V, fragmentação de DNA, encolhimento celular, dilação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas membranares (chamadas corpos apoptóticos). Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidilserina (PS) pode ser medida através da ligação de anexina; a fragmentação do DNA pode ser avaliada por meio de escada de DNA; e condensação nuclear/cromatina juntamente com a fragmentação do DNA pode ser avaliada por qualquer aumento das células hipodiploides. Preferencialmente, o anticorpo que induz apop- tose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferencialmente cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferencialmente cerca de 10 a 50 vezes, indução da ligação da anexina em relação a células não tratadas em um ensaio de ligação da anexina.
[00216] Em uma outra modalidade específica, os anticorpos da presente invenção podem induzir a morte celular através de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade mediada por células dependente de complemento (CDC) e/ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP). A expressão de atividade de ADCC e atividade de CDC dos anticorpos das subclasses IgG1 humana geralmente envolve a ligação da região Fc do anticorpo a um receptor para um anticorpo (daqui em diante referido como "FCYR") existente na superfície das células efetoras, tais como as células assassinas, células assassinas naturais ou macrófagos ativados. Vários componentes do complemento podem ser ligados. No que respeita à ligação, tem sido sugerido que vários resíduos de aminoácidos na região da dobradiça e do segundo domínio da região C (a partir daqui designado como "domínio CY2") do anticorpo são importantes Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) e que uma cadeia de açúcar no domínio CY2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) é também importante.
[00217] Para avaliar a atividade de ADCC de um anticorpo de interesse, um ensaio de ADCC in vitro pode ser utilizado, tal como o descrito na Patente U.S. No. 5.500.362. O ensaio pode também ser realizado utilizando um kit disponível comercialmente, p.ex., CytoTox 96 ® (Promega). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem, mas não estão limitadas a células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK, "Natural Killer"), e linhas de células NK. As linhas de células NK que expressam um receptor Fc transgênico (p.ex. CD16) e o polipeptídeo de sinalização associado (p.ex. FCεRI-Y) também podem servir como células efetoras (WO 2006/023148). Por exemplo, a capacidade de qualquer anticorpo em particular para mediar a lise por ativação do complemento e/ou ADCC pode ser analisada. As células de interesse são cultivadas e marcadas in vitro; o anticorpo é adicionado à cultura de células em combinação com as células imunes que podem ser ativadas pelos complexos de antígeno-anticorpo; i.e., as células efetoras envolvidas na resposta de ADCC. O anticorpo também pode ser testado para a ativação do complemento. Em ambos os casos, a citólise é detectada pela libertação de marcador a partir das células lisadas. A extensão da lise de células pode também ser determinada pela detecção da libertação de proteínas citoplasmáticas (p.ex. LDH) no sobrenadante. De fato, os anticorpos podem ser selecionados utilizando o próprio soro do paciente como uma fonte do complemento e/ou células do sistema imunológico. Os anticorpos que são capazes de mediar ADCC humana no teste in vitro podem então ser utilizados terapeuticamente nesse paciente em particular. A atividade de ADCC da molécula de interesse pode também ser avaliada in vivo, p.ex., em um modelo animal tal como o di-vulgado em Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Além disso, as técnicas para modulação (i.e., aumento ou diminuição) do nível de ADCC, e opcionalmente a atividade CDC, de um anticorpo são bem conhecidos na especialidade (p.ex., Patentes U.S. Nos. 5.624.821; 6.194.551; 7.317.091). Os anticorpos da presente invenção podem ser capazes ou podem ter sido modificados para ter a capacidade de induzir ADCC e/ou CDC. Ensaios para determinar a função de ADCC podem ser realizados utilizando células efetoras humanas para avaliar a função de ADCC humano. Tais ensaios podem também incluir os destinados a selecionar anticorpos que induzem, medeiam, melhoram, bloqueiam a morte celular por mecanismos necrótico e/ou apoptótico. Tais métodos, incluindo ensaios utilizando corantes viáveis, os métodos de detecção e análise de caspases, e ensaios que medem quebras no DNA podem ser utilizados para avaliar a atividade apoptótica de células cultivadas in vitro com um anticorpo de interesse.
Produção de Anticorpos
[00218] Em seguida são descritos exemplos de técnicas para a produção de anticorpos úteis na presente invenção.
Anticorpos Monoclonais
[00219] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na especialidade, incluindo o uso de hibridoma (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.I., 1981), tecnologias recombinante e de phage display, ou uma combinação das mesmas. O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos ou isolados, p.ex., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra o mesmo determinante no antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Segue-se uma descrição dos métodos representativos para a produção de anticorpos monoclonais, que não se destina a ser limitativa, e podem ser utilizados para produzir, por exemplo, anticorpos monoclonais de mamífero, quimérico, humanizado, humano, domínio, diacorpos, "vaccibodies", linear e multiespecífi- cos.
Técnicas do Hibridoma
[00220] Os métodos para a produção e rastreio de anticorpos específicos usando a tecnologia de hibridoma são usuais e bem conhecidos na técnica. No método do hibridoma, ratinhos ou outros animais hospedeiros apropriados, tal como hamster, são imunizados como descrito acima para obter linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se irão ligar especificamente ao antígeno utilizado para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e depois fundidos com uma linha celular de mieloma utilizando um agente de fusão adequado ou parceiro de fusão, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Prin-ciples and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Em certas modalidades, as células de mieloma selecionadas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável de alto nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células genitoras não fundidas. Em um aspecto, as linhas celulares de mieloma são as linhas de mieloma murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EUA, e SP-2 e derivadas, p.ex., células X63- Ag8-653 disponíveis na Coleção Americana de Culturas Tipo (ATCC), Rockville, MD. EUA. Linhas celulares de mieloma humano e de hete- romieloma de ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).
[00221] Uma vez identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a desejada especificidade, afinidade e/ou ativida- de, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e cultivados por métodos padrão (Goding, Supra). Meios de cultura adequados para este objetivo incluem, por exemplo, meio D- MEM ou meio RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascites em um animal, p.ex., por injeção i.p. das células em ratinhos.
[00222] Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascites, ou soro, por procedimentos de purificação de anticorpo convencionais tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (p.ex., utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de troca iônica, marcadores de afinidade, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise, etc. Exemplos de métodos de purificação são descritos em mais detalhe adiante.
Técnicas de DNA Recombinante
[00223] Os métodos para a produção e rastreio de anticorpos específicos usando a tecnologia de DNA recombinante são usuais e são bem conhecidos na técnica (p.ex., Patente U.S. No. 4.816.567). O DNA que codifica os anticorpos monoclonais pode ser prontamente isolado e/ou sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de macaco, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinan- tes. Os artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA codificando o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opini- on in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). Tal como descrito abaixo para os anticorpos gerados por phage display e a humanização de anticorpos, o DNA ou o material genético de anticorpos recombinantes pode ser obtido a partir de fonte(s) além de hibridomas para criar anticorpos da invenção.
[00224] A expressão recombinante de um anticorpo ou uma sua variante geralmente requer a construção de um vector de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. A invenção fornece assim vectores replicáveis compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção dos mesmos, ou uma cadeia pesada ou leve da CDR, operativamente ligada a um promotor. Tais vectores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, p.ex., Patentes U.S. Nos 5.981.216; 5.591.639; 5.658.759 e 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um tal vector para a expressão da cadeia leve completa, ou ambas as cadeias pesada e leve completas.
[00225] Uma vez que o vector de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais, as células trans- fectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou seus fragmentos, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ou uma sua porção, ou um anticorpo de cadeia simples da invenção, operacionalmente ligado a um promotor heterólogo. Em certas modalidades para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vectores que codificam ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão da molécula completa de imunoglo- bulina, tal como detalhado adiante.
[00226] As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiras para a expressão de anticorpos recombinantes são bem conhecidas na especialidade e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis da Coleção Americana de Culturas Tipo (ATCC), incluindo mas não se limitando a células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), células epiteliais humanas de rim 293, e um número de outras linhas celulares. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-translacional e modificação de proteínas e produtos de genes. As linhas celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento correto do anticorpo ou uma sua porção expressa. Para este fim, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto gênico. Tais células hospedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitadas a células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NS0 (uma linha celular de mieloma murino que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina funcionais), SP20, CRL7O3O e HsS78Bst. Linhas de células humanas desenvolvidas através da imor- talização de linfócitos humanos podem ser utilizadas para produzir de forma recombinante anticorpos monoclonais. A linha de células humanas PER.C6. (Crucell, Holanda) pode ser utilizada para produzir de forma recombinante anticorpos monoclonais.
[00227] Outras linhas celulares que podem ser utilizadas como hospedeiros para a expressão de anticorpos recombinantes incluem, mas não estão limitadas a células de inseto (p.ex., Sf21/Sf9, Bti- Tn5b1-4 de Trichoplusia ni) ou células de levedura (p.ex., S. cerevisi- ae, Pichia, US7326681; etc), células vegetais (US20080066200); e células de galinha (WO2008142124).
[00228] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são expressos em uma linha celular com expressão estável do anticorpo. A expressão estável pode ser usada para a produção de longo prazo, de alto rendimento de proteínas recombinantes. Por exemplo, as linhas celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo podem ser geradas. As células hospedeiras podem ser transformadas com um vector apropriadamente desenhado compreendendo a expressão de elementos de controle (p.ex., promotor, potenciador, termi- nadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um gene marcador selecionável. Após a introdução do DNA exógeno, as células podem ser deixadas em cultura durante 1-2 dias em um meio enriquecido, e depois são transferidas para um meio seletivo. O marcador de seleção no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células que estavelmente têm integrado o plasmídeo nos seus cromossomos continuem em cultura para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Métodos para produzir linhas celulares estáveis com um elevado rendimento são bem conhecidos na técnica e reagentes estão geralmente disponíveis comercialmente.
[00229] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são expressos em uma linha celular com expressão transiente do anticorpo. A transfecção transitória é um processo em que o ácido nucleico introduzido em uma célula não se integra no genoma ou no DNA dos cromossomos da referida célula. É de fato mantido como um elemento extracromossômico, p.ex. como um epissoma, na célula. Os processos de transcrição do ácido nucleico do epissoma não são afetados e uma proteína codificada pelo ácido nucleico do epissoma é produzida.
[00230] A linha celular, transfectada de modo estável ou transiente, é mantida em meio de cultura de células e condições bem conhecidas na técnica resultando na expressão e produção de anticorpos mono- clonais. Em certas modalidades, o meio de cultura de células de mamífero se baseia em formulações de meios disponíveis comercialmente, incluindo, por exemplo, DMEM ou Ham F12. Em outras modalidades, o meio de cultura de células é modificado para suportar o aumen-to do crescimento celular e da expressão da proteína biológica. Tal como aqui utilizados, os termos "meio de cultura de células", "meio de cultura" e "formulação do meio" referem-se a uma solução nutritiva para a manutenção, cultura, propagação, ou expansão de células em um ambiente in vitro artificial fora de um organismo multicelular ou tecido. O meio de cultura de células pode ser otimizado para uma utilização específica de cultura de células, incluindo, por exemplo, meio de cres-cimento de cultura de células que é formulado para promover o crescimento celular, ou meio de cultura de células de produção que é formulado para promover a produção de proteína recombinante. Os termos nutriente, ingrediente e componente são aqui utilizados indiferentemente para se referir a todos os componentes que constituem um meio de cultura de células.
[00231] Em uma modalidade, as linhas celulares são mantidas usando um método descontínuo com alimentação. Tal como aqui utilizado, "método descontínuo com alimentação", refere-se a um método pelo qual uma cultura de células descontínua com alimentação é fornecida com nutrientes adicionais depois de serem inicialmente incubadas com um meio basal. Por exemplo, um método descontínuo com alimentação pode compreender a adição de meios suplementares de acordo com uma distribuição de alimentação determinada dentro de um determinado período de tempo. Assim, uma "cultura de células descontínua com alimentação" refere-se a uma cultura de células em que as células, tipicamente de mamíferos, e meio de cultura são for- necidos inicialmente ao frasco de cultura e nutrientes de cultura adicionais são aplicados, continuamente ou em incrementos discretos, na cultura durante a cultura, com ou sem colheita de células periódica e/ou do produto antes do término da cultura.
[00232] O meio de cultura de células utilizado e os nutrientes nele contidos são conhecidos de um perito na técnica. Em uma modalidade, o meio de cultura de células compreende um meio basal e pelo menos um hidrolisado, p.ex., hidrolisado à base de soja, um hidrolisa- do baseado em levedura, ou uma combinação dos dois tipos de hidro- lisadosresultando em um meio basal modificado. Em uma outra modalidade, os nutrientes adicionais podem incluir apenas um meio basal, tal como um meio basal concentrado, ou podem incluir apenas, hidroli- sados ou hidrolisados concentrados. Meios basais adequados incluem, mas não estão limitados a Meio Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM), DME/F12, Meio Mínimo Essencial (MEM), Meio Basal Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Meio α-Minimo Essencial (α-MEM), Meio Mínimo Essencial Glasgow's (G-MEM), PF CHO (ver, p.ex., meio livre de proteína CHO (Sigma) ou Meio EX-CELL™ 325 PF CHO Serum-Free para CHO Cells Protein-Free (SAFC Bioscience), e Meio Iscove's Modified Dulbecco's. Outros exemplos de meios basais que podem ser utilizados na invenção incluem Meio Basal BME (Gibco-Invitrogen; Ver também Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36); Meio Dul- becco Modified Eagle (DMEM, em pó) (Gibco-Invitrogen (# 31600); ver também Dulbecco e Freeman (1959) Virology 8, 396; Smith et al. (1960) Virology 12, 185. Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6:2, 93); Meio CMRL 1066 (Gibco-Invitrogen (# 11530); ver também Parker R. C. et al. (1957) Special Publications, N.I. Academy of Sciences, 5, 303).
[00233] O meio basal pode ser livre de soro, o que significa que o meio não contém soro (p.ex., soro fetal de bovino (FBS), soro de cava- lo, soro de cabra, ou qualquer outro de soro derivado de animal conhecido de um perito na técnica) ou meios livres de proteína animal ou meios quimicamente definidos.
[00234] O meio basal pode ser modificado, a fim de remover certos componentes não nutritivos encontrados em meio basal padrão, tais como vários tampões inorgânicos e orgânicos, tensoativo(s), e cloreto de sódio. A remoção de tais componentes do meio de cultura basal permite um aumento da concentração dos componentes nutricionais restantes, e pode melhorar em geral a cultura celular e a expressão da proteína. Além disso, os componentes omitidos podem ser adicionados de volta ao meio de cultura de células contendo o meio de cultura basal modificado de acordo com as exigências das condições da cultura de células. Em certas modalidades, o meio de cultura de células contém um meio de cultura basal modificado, e, pelo menos, um dos seguintes nutrientes, uma fonte de ferro, um fator de crescimento re- combinante; um tampão; um tensoativo; um regulador de osmolarida- de; uma fonte de energia; e hidrolisados não animais. Além disso, um meio de cultura basal modificado pode opcionalmente conter aminoá- cidos, vitaminas, ou uma combinação de aminoácidos e vitaminas. Em uma outra modalidade, o meio basal modificado contém adicionalmente glutamina, p.ex., L-glutamina, e/ou metotrexato.
[00235] A produção de anticorpos pode ser realizada em grande quantidade por um processo de biorreator utilizando métodos conhecidos na técnica de biorreator descontínuo com alimentação, descontínuo, de perfusão ou alimentação contínua. Biorreatores de grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, preferencialmente cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes biorreatores podem utilizar impulsores com agitação para distribuir oxigênio e nutrientes. Biorreatores de pequena escala refere-se geralmente a cultura de células em não mais do que aproximadamente 100 litros de capacida- de volumétrica, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros. Alternativamente, biorreatores de uso único (SUB) podem ser utilizados tanto para a cultura em grande escala ou em pequena escala.
[00236] Temperatura, pH, agitação, aeração e a densidade de inó- culo pode variar dependendo das células hospedeiras utilizadas e da proteína recombinante a ser expressa. Por exemplo, uma cultura celular de proteína recombinante pode ser mantida a uma temperatura entre 30 e 45 °C. O pH do meio de cultura pode ser monitorizado durante o processo de cultura de tal modo que o pH se mantém a um nível ótimo, que pode ser para certas células hospedeiras, dentro de um intervalo de pH de 6,0 a 8,0. Para agitação, uma mistura acionada por impulsor pode ser usada para tais métodos de cultura. A velocidade de rotação do impulsor pode ser de aproximadamente 50 a 200 cm/s de velocidade periférica, mas podem ser usados outros sistemas de agi-tação pneumática ou de mistura/aeração conhecidos na técnica, dependendo do tipo de célula hospedeira a ser cultivada. Aeração suficiente é fornecida para manter a concentração de oxigênio dissolvido a cerca de 20% a 80% de saturação com ar na cultura, de novo, dependendo da célula hospedeira selecionada a ser cultivada. Alternativamente, um biorreator pode ter aspersão de ar ou oxigênio diretamente para o meio de cultura. Outros métodos de fornecimento de oxigênio existem, incluindo sistemas de aeração sem bolhas empregando aera- dor de membrana de fibra oca.
Técnicas de Phage Display
[00237] Os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de phage display geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Em tais métodos os anticorpos podem ser isolados por pesquisa de uma biblioteca combina- torial de anticorpos recombinantes, de preferência uma biblioteca de phage display de scFv, preparada usando cDNAs humanos VL e VH preparados a partir de mRNA derivado de linfócitos humanos. Metodologias para preparar e pesquisar estas bibliotecas são conhecidas na técnica. Além de kits disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de phage display (p.ex., o sistema Pharmacia Recombinant Phage Antibody, catalog no. 27-9400-01; o kit Stratagene SurfZAPTM phage display, catalog no. 240612), exemplos de métodos e reagentes particularmente favoráveis para utilização na produção e rastreio de bibliotecas de apresentação de anticorpos podem ser encontrados em, por exemplo, as Patentes US Nos. 6,248,516; US 6,545,142; 6,291,158; 6,291,159; 6,291,160; 6,291,161; 6,680,192; 5,969,108; 6,172,197; 6,806,079; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,593,081; 6,582,915; 7,195,866. Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para a produção e isolamento de anticorpos monoclonais.
[00238] Em métodos de phage display, os domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que transportam as sequências de polinucleotídeos que os codificam. Em uma modalidade particular, tal fago pode ser utilizado para apresentar os domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de uma biblioteca de atividade do reportório ou combinatorial de anticorpos (p.ex., humano ou murino). O fago que expressa um domínio de ligação ao an- tígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, p.ex., utilizando o antígeno ou antígeno ligado ou capturado em uma superfície sólida ou esferas. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo domínios de ligação fd e M13 expressos do fago com Fab, Fv ou domínios de anticorpo Fv estabilizados por dissulfeto fundidos de forma recombinante com a proteína do fago gene III ou gene VIII.
[00239] Tal como descrito nas referências acima, após a seleção de fagos, as regiões codificantes do anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos, anticorpos humanizados, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, leveduras e bactérias, p.ex., como descrito em detalhe posteriormente no presente documento. Por exemplo, as técnicas para produzir de modo recombinante fragmentos Fab, Fab 'e F(ab')2 também podem ser empregues utilizando métodos conhecidos na especialida-de tais como aqueles divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
[00240] Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fvs e anticorpos de cadeia simples incluem aquelas descritas nas Patentes U.S. Nos. 4,946,778 e 5,258,498. Assim, as técnicas descritas acima e as que são bem conhecidos na especialidade podem ser utilizadas para gerar anticorpos recombinantes em que o domínio de ligação, p.ex. ScFv, foi isolado a partir de uma biblioteca de phage display.
Purificação e Isolamento de Anticorpo
[00241] Uma vez que uma molécula de anticorpo foi produzida por expressão recombinante ou de hibridoma, esta pode ser purificada por qualquer método conhecido na especialidade para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (p.ex., de troca iônica, de afinidade, particularmente por afinidade para os antígenos específicos de Proteína A ou Proteína G, e cromatografia em coluna de exclusão por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da presente invenção ou os seus fragmentos podem ser fundidos com sequências polipeptídicas heteró- logas (referidas no presente documento como "tags") para facilitar a purificação.
[00242] Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente segregado para o meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como primeiro passo, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes acidentais.
[00243] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxi- apatita, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, diálise e/ou cromatografia de afinidade, quer isoladamente ou em combinação com outras etapas de purificação. A conveniência da proteína A como um ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobu- lina que está presente no anticorpo e será entendida por um perito na técnica. A matriz à qual o ligando de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidades de fluxo mais rápi- das e tempos de processamento mais curtos do que pode ser conseguido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fracci- onamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia em SEPHAROSE em uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[00244] Após qualquer uma das etapas(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia de interação hidrofóbica a pH baixo utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5 a 4,5, e realizada a concentrações baixas de sal (p.ex., de cerca de 0 a 0,25 M de sal).
[00245] Assim, em certas modalidades são fornecidos anticorpos da invenção que são substancialmente purificados/isolados. Em uma modalidade, estes anticorpos isolados/purificados expressos de forma recombinante podem ser administrados a um paciente para mediar um efeito profilático ou terapêutico. Um profilático é uma medicação ou de um tratamento concebido e utilizado para evitar que uma doença, distúrbio ou infecção ocorra. Um agente terapêutico está relacionado especificamente com o tratamento de uma determinada doença, distúrbio ou infecção. Uma dose terapêutica é a quantidade necessária para tratar uma determinada doença, distúrbio ou infecção. Em uma outra modalidade estes anticorpos isolados/purificados podem ser utilizados para diagnosticar a infecção pelo vírus Influenza A.
Anticorpos Humanos
[00246] Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. Anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados a anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murino ou rato. A presença de tais proteínas derivadas de origem murina ou de rato pode levar à rápida eliminação dos anticorpos ou pode levar à geração de uma resposta imunitária contra o anticorpo por um paciente.
[00247] Os anticorpos humanos podem ser obtidos por métodos in vitro. Os exemplos adequados incluem, mas não estão limitados a phage display (MedImmune (anteriormente CAT), Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Prolife- ron), Affimed) ribosome display (MedImmune (formerly CAT)), yeast display, e semelhantes. A tecnologia de phage display (Ver p.ex., Patente US No. 5,969,108) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anti-corpo são clonados in-frame em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Porque a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de cadeia simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago mímica algumas das propriedades das células B. A tecnologia de phage display pode ser realizada em uma variedade de formatos, revistos em, p.ex., Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de genes V podem ser utilizadas para phage display. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram uma matriz diversificada de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combina torial aleatória de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes V de dadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma matriz diversa de antíge- nos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, também, Pat. U.S. Nos. 5,565,332 e 5,573,905.
[00248] Como discutido acima, os anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (ver Patente U.S. Nos. 5,567,610 e 5,229,275).
[00249] Genes de imunoglobulina sofrem várias modificações durante a maturação da resposta imunitária, incluindo a recombinação entre segmentos dos genes V, D e J, troca de isotipo, e hipermutação nas regiões variáveis. A recombinação e hipermutação somática são a base para a produção da diversidade de anticorpos e maturação da afinidade, mas também podem gerar compromissos na sequência que pode tornar a produção comercial de tais imunoglobulinas, como agentes terapêuticos, difícil ou aumentar o risco de imunogenicidade do anticorpo. Em geral, as mutações nas regiões CDR são passíveis de contribuir para uma afinidade e função melhorada, enquanto que mutações em regiões estruturais podem aumentar o risco de imunogeni- cidade. Este risco pode ser reduzido pela reversão de mutações estruturais da linha germinal, enquanto se assegura que a atividade do anticorpo não é influenciada de forma adversa. Os processos de diversificação também podem gerar alguns passivos estruturais ou podem existir estes passivos estruturais dentro de sequências da linha germi- nativa contribuindo para os domínios variáveis das cadeias pesada e leve. Independentemente da fonte, pode ser desejável remover potenciais passivos estruturais que podem resultar em instabilidade, agregação, heterogeneidade do produto, ou em uma imunogenicidade au- mentada. Exemplos de passivos indesejáveis incluem cisteínas de- semparelhadas (o que pode levar à codificação da ligação dissulfeto, ou a formação de aduto de sulfidrila variável), locais de glicosilação ligados a N (resultando em heterogeneidade de estrutura e atividade), bem como desamidação (p.ex., Ng, NS), isomerização (DG), oxidação (metionina exposta) e sítios de hidrólise (DP).
[00250] Deste modo, a fim de reduzir o risco de imunogenicidade e melhorar as propriedades farmacêuticas, pode ser desejável reverter uma sequência estrutural a linha germinal, reverter uma CDR a linha germinal, e/ou remover um passivo estrutural.
[00251] Assim, em uma modalidade, em que um anticorpo específico difere da sua respectiva sequência da linha germinativa no nível de aminoácidos, pode ser revertida a mutação a sequência do anticorpo para a sequência da linha germinativa. Tais mutações de correção podem ocorrer em uma, duas, três ou mais posições, ou uma combinação de qualquer uma das posições com mutação, utilizando técnicas de biologia molecular padrão.
Fragmentos de Anticorpo
[00252] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são fragmentos de anticorpo ou anticorpos compreendendo estes fragmentos. O fragmento de anticorpo compreende uma porção do anticorpo de comprimento total, o que geralmente é o antígeno de ligação ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd e Fv. Diacorpos; anticorpos lineares (Patente U.S. No. 5,641,870) e moléculas de anticorpo de cadeia simples.
[00253] Tradicionalmente, estes fragmentos eram obtidos por digestão proteolítica de anticorpos intactos utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade. No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e scFv podem ser todos expressos e segregados por E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Em uma modalidade, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos de fagos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem também ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente conjugados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de células recombinantes hospedeiras. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o perito na especialidade. Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Em certas modalidades, o anticorpo não é um fragmento Fab. Fv e scFv são as únicas espécies com locais intactos combinados que são desprovidos de regiões constantes; deste modo, são adequadas para a ligação não especifica reduzida durante a utilização in vivo. Proteínas de fusão scFv podem ser construídas de modo a se obter a fusão de uma proteína efetora quer no terminal amino ou carbóxi de um scFv.
[00254] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são anticorpos de domínio, p.ex., anticorpos que contêm as pequenas unidades de ligação funcionais de anticorpos, correspondentes às regiões variáveis das cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de anticorpos humanos. Exemplos de anticorpos de domínio incluem, mas não estão limitados a aqueles da Domantis (ver, por exemplo, WO04/058821; WO04/081026; WO04/003019; WO03/002609; Patente U.S. Nos. 6,291,158; 6,582,915; 6,696,245; e 6,593,081).
[00255] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos expostos são anticorpos lineares. Os anticorpos lineares compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Ver, Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995).
Outras Modificações das Sequências de Aminoácidos
[00256] Além dos anticorpos humanos, humanizados e/ou quiméricos descritos anteriormente neste documento, a presente invenção também engloba outras modificações e, suas variantes e seus fragmentos, dos anticorpos da invenção compreendendo substituições de um ou mais resíduos de aminoácido e/ou polipeptídeo, adições e/ou deleções no domínio leve variável (VL) e/ou domínio pesado variável (VH) e/ou modificações da região Fc e pós translacionais. Incluídos nestas modificações são conjugados de anticorpos em que um anti-corpo tenha sido covalentemente ligado a uma fração. Frações adequadas para ligação a anticorpos incluem, mas não estão limitadas a, proteínas, peptídeos, medicamentos, marcadores e citotoxinas. Estas alterações aos anticorpos podem ser feitas para alterar ou ajustar as características (bioquímicas, de ligação e/ou funcional) dos anticorpos, tal como apropriado para o tratamento e/ou diagnóstico da infecção por Influenza A. Os métodos para a formação de conjugados, fazendo alterações de aminoácidos e/ou polipeptídicas e modificações pós- translacionais são bem conhecidos na técnica, alguns dos quais são apresentados em detalhe posteriormente no presente documento.
[00257] As alterações de aminoácidos para os anticorpos resultam necessariamente em sequências que são menos do que 100% idênticas às sequências de anticorpos acima identificadas ou sequência do anticorpo genitor. Em certas modalidades, neste contexto, muitos dos anticorpos têm cerca de 25% a cerca de 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo, tal como aqui descrito. Assim, em uma modalidade, um anticorpo modificado pode ter uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos ou de similaridade com a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo, tal como aqui descrito. Em uma outra modalidade, um anticorpo alterado pode ter uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos ou de similaridade com a sequência de aminoácidos da cadeia pesada ou leve CDR1, CDR2 ou CDR3 de um anticorpo, como aqui descrito. Em uma outra modalidade, um anticorpo modificado pode ter uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos ou de similaridade com a sequência de aminoácidos da cadeia pesada ou leve FR1, FR2, FR3 ou FR4 de um anticorpo, como aqui descrito.
[00258] Em certas modalidades, os anticorpos modificados são gerados por uma ou mais alterações de aminoácidos (p.ex., substituições, deleção e/ou adições), introduzidas em uma ou mais das regiões variáveis do anticorpo. Em uma outra modalidade, as alterações de aminoácidos são introduzidas nas regiões estruturais. Uma ou mais alterações de resíduos da região estrutural pode resultar em uma melhoria na afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno. Isto pode ser especialmente verdade quando essas mudanças são realizadas em anticorpos humanizados em que a região estrutural pode ser de uma espécie diferente das regiões CDR. Os exemplos de resíduos da região estrutural a modificar incluem os que ligam diretamente o antí- geno de forma não covalente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interagem com/influenciam a conformação de uma CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); e/ou participam na interface VL-VH (Patente US Nos. 5,225,539 e 6,548,640). Em uma modalidade, entre cerca de um a cerca de cinco resíduos estruturais pode ser alterado. Por vezes, este pode ser suficiente para originar um mutante de anticorpo adequado para utilização em ensaios pré- clínicos, mesmo quando nenhum dos resíduos da região hipervariável foram alterados. Normalmente, no entanto, um anticorpo modificado compreenderá adicional alteração (ou alterações) da região hipervari- ável.
[00259] Um procedimento útil para gerar anticorpos alterados é denominado "mutagênese de varrimento de alanina" (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). Neste método, um ou mais resíduo(s) da região hipervariável é substituído por resíduo(s) de ala- nina ou de polialanina para alterar a interação dos aminoácidos com o antígeno alvo. Aquele(s) resíduo(s) da região hipervariável que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados por introdução de mutações adicionais ou outras nos, ou para os, locais de substituição. Assim, embora o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa de ser predeterminada. Os mutan- tes Ala produzidos desta forma são selecionados quanto à sua atividade biológica como aqui descrito.
[00260] Em certas modalidades, a variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo de origem (p.ex. um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a variante (ou variantes) resultante selecionada para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo genitor a partir do qual são geradas. Uma maneira conveniente para gerar estas variantes de substituição envolve a maturação de afinidade utilizando phage display (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992) and Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)). Resumidamente, vários locais de regiões hipervariáveis (p.ex., 6-7 locais) são mutados para gerar todas as substituições possíveis de aminoácidos em cada local. Os mutantes de anticorpos assim gerados são apresentados de modo monovalente nas partículas de fagos filamentosos como fusões com o produto do gene III de M13 empacotado em cada partícula. Os mutantes phage- displayed são então selecionados quanto à sua atividade biológica (p.ex., afinidade de ligação) tal como aqui divulgado.
[00261] As mutações em sequências de anticorpo podem incluir substituições, deleções, incluindo deleções internas, adições, incluindo adições produzindo proteínas de fusão, ou substituições conservativas de resíduos de aminoácidos dentro e/ou adjacentes à sequência de aminoácidos, mas que resultam em uma alteração "silenciosa", em que a alteração produz um anticorpo funcionalmente equivalente. Substituições conservativas de aminoácidos podem ser feitas com base em semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leu- cina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos carregados negativamente (ácido) incluem o ácido aspártico e ácido glutâmi- co. Além disso, glicina e prolina são resíduos que podem influenciar a orientação da cadeia. As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Além disso, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos químicos de aminoácidos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição dentro da sequência do anticorpo. Os aminoácidos não clássicos incluem, mas não estão limitados a, os D-isómeros dos aminoácidos comuns, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, Y—Abu, ε-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-amino-propiônico, ornitina, nor- leucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t- butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, β-alanina, ácidos fluoro-amino, aminoácidos desenhados tais como os aminoácidos β-metil, aminoácidos Cα-metil, aminoácidos Nα-metil, e os análogos de aminoácidos, em geral.
[00262] Em uma outra modalidade, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo pode também ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulação aberrante. Por outro lado, ligação (ou ligações) de cisteína pode ser adicionada ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Regiões Fc Variantes
[00263] É conhecido que as variantes da região Fc (p.ex., substituições e/ou adições e/ou deleções de aminoácidos) aumentam ou diminuem a função efetora do anticorpo (Ver, p.ex., Patentes U.S. Nos. 5,624,821; 5,885,573; 6,538,124; 7,317,091; 5,648,260; 6,538,124; WO 03/074679; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 99/58572; Publicações U.S. No. 2006/0134105; 2004/0132101; 2006/0008883) e podem alterar as propriedades farmacocinéticas (p.ex., meia-vida) do anticorpo (ver, patentes U.S. 6,277,375 e 7,083,784). Assim, em certas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região Fc alterada (também aqui referida como "região Fc variante") em que uma ou mais alterações foram feitas na região Fc de modo a alterar as propriedades funcional e/ou farmacocinética dos anticorpos. Tais alterações podem resultar em uma diminuição ou aumento da ligação de Clq e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou de ligação de FcYR, para IgG, e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP). A presente invenção abrange os anticorpos aqui descritos com regiões Fc variantes em que foram feitas alterações para ajustar a função efetora, aumentando ou diminuindo, fornecendo uma função efetora desejada. Deste modo, os anticorpos da invenção compreendem uma região Fc variante (i.e., regiões Fc que tenham sido alteradas como discutido posteriormente no presente documento). Os anticorpos da invenção compreendendo uma região Fc variante são também referidos aqui como "anticorpos de Fc variantes." Tal como aqui utilizado, nativo refere-se à sequência genitora não modificada e o anticorpo compreendendo uma região Fc nativa é aqui referido como um "anticorpo Fc nativo". Anticorpos de Fc variantes podem ser gerados por vários métodos bem conhecidos de um perito na técnica. Os exemplos não limitantes incluem, isolar regiões codificantes do anticorpo (p.ex., a partir de hibridoma) e fazer uma ou mais substituições desejadas na região Fc da região codificante do anticorpo isolado. Alternativamente, a porção de ligação ao antígeno (p.ex., regiões variáveis) de um anticorpo pode ser sub-clonada num vector que codifica uma região Fc variante. Em uma modalidade, a região Fc variante exibe um nível semelhante de indução da função efetora em comparação com a região Fc nativa. Em uma outra modalidade, a região Fc variante exibe uma indução mais elevada da função efetora em comparação com a Fc nativa. Algumas modalidades específicas de regiões Fc variantes são especificadas infra. Os métodos para medir a função efetora são bem conhecidos na técnica.
[00264] A função de efetor de um anticorpo é modificada através de alterações na região Fc, incluindo, mas não se limitando a, substituições de aminoácidos, adições de aminoácidos, deleções de aminoáci- dos e alterações em modificações pós-translacionais para os aminoá- cidos de Fc (p.ex. glicosilação). Os métodos descritos posteriormente neste documento podem ser usados para afinar a função de efetor de um anticorpo presente, uma proporção das propriedades de ligação da região Fc para o FcR (p.ex., afinidade e especificidade), resultando em um anticorpo terapêutico com as propriedades desejadas.
[00265] Entende-se que a região Fc, tal como aqui utilizada, inclui os polipeptídeos compreendendo a região constante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio da região constante de imunoglobulina. Assim Fc refere-se aos últimos dois domínios de região constante da imunoglobulina de IgA, IgD e IgG, e os últimas três domínios de região constante da imunoglobulina de IgE e IgM, e a dobradiça flexível N- terminal para estes domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para a IgG, Fc compreende domínios de imunoglobulina Cgamma2 e Cgamma3 (CY2 e CY3) e a dobradiça entre Cgammal (CY1) e Cgamma2 (CY2). Embora os limites da região Fc podem variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida para compreender os resíduos C226 ou P230 para o seu terminal carboxilo, em que a numeração é de acordo com o índice EU como definido em Kabat. Fc pode referir-se a esta região isolada, ou a esta região no contexto de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão Fc. Os polimorfismos foram observados em uma série de diferentes posições de Fc, incluindo, mas não se limitando às posições 270, 272, 312, 315, 356, e 358 conforme numerado pelo índice EU, e assim pequenas diferenças entre a sequência apresentada e sequências anteriores na especialidade podem existir.
[00266] Em uma modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem uma afinidade de ligação alterada para um ou mais receptores Fc, incluindo, mas não se limitando ao FcRn, FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FCYRIA, FCYRIB, e FCYRIC; FCYRII (CD32 incluindo as isoformas FCYRIIA, FCYRIIB, e FCYRIIC); e FcyRIII (CD16, incluindo as isoformas FCYRIIIA e FCYRIIIB), em comparação com um anticorpo de Fc nativo.
[00267] Em uma modalidade, um anticorpo de Fc variante melhorou a ligação a um ou mais ligandos Fc em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe uma afinidade aumentada ou diminuída para um ligando de Fc que é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes menos, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 dobrar, ou pelo menos 200 vezes, ou é entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe uma afinidade para um ligando de Fc que é pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em certas modalidades, um anticorpo de Fc variante tem uma maior afinidade para um ligando de Fc. Em outras mo-dalidades, um anticorpo de Fc variante tem uma menor afinidade para um ligando de Fc.
[00268] Em uma modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação melhorada para o receptor Fc FCYRIIIA. Em uma outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação melhorada para o receptor Fc FCYRIIB. Em uma modalidade ainda mais específica, um anticorpo de Fc variante tem uma ligação melhorada para ambos os receptores Fc, FCYRIIIA e FCYRIIB. Em certas modalidades, os anticorpos de Fc variante que têm ligação melhorada para FcyRIIIA não têm um concomitante aumento na ligação do receptor de FCYRIIB em comparação com um anticorpo de Fc nativo. Em uma modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação reduzida para o receptor Fc FCYRIIIA. Em uma modalidade ainda mais específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação reduzida para o receptor Fc FCYRIIB. Em ainda outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante que exibe afinidade alterada para FCYRIIIA e/ou FCYRIIB tem ligação melhorada para o receptor Fc FcRn. Em ainda outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante que exibe afinidade alterada para FcyRIIIA e/ou FcyRIIB tem ligação alterada a C1q em relação a um anticorpo de Fc nativo.
[00269] Em uma modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem afinidades para o receptor FcyRIIIA que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes menos, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 dobrar, ou pelo menos 200 vezes, ou são entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe uma afinidade para FcyRIIIA que é pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo.
[00270] Em uma modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem afinidades para o receptor FcyRIIB que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes menos, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 dobrar, ou pelo menos 200 vezes, ou são entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe uma afinidade para FCYRIIB que é pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo.
[00271] Em uma modalidade, anticorpos de Fc variantes exibem afinidades aumentada ou diminuída para C1q em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem afinidades para o receptor C1q que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 10 vezes menos, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 40 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 60 vezes, ou pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 80 vezes, ou pelo menos 90 vezes, ou pelo menos 100 dobrar, ou pelo menos 200 vezes, ou são entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe uma afinidade para C1q que é pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 10%, ou pelo menos 5% maior ou menor do que um anticorpo de Fc nativo. Em ainda outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante que exibe afinidade alterada para Ciq tem ligação melhorada para o receptor Fc FcRn. Em ainda outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante que exibe afinidade alterada para C1q tem ligação alterada a FCYRIIIA e/ u FCYRIIB em relação a um anticorpo de Fc nativo.
[00272] É bem conhecido na técnica que os anticorpos são capazes de dirigir o ataque e destruição por meio de vários processos coletivamente conhecidos na técnica como as funções efetoras do anticorpo. Um desses processos, conhecido como "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que a Ig segregada se liga a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a células contendo an- tígenos e subsequentemente matem as células com citotoxinas. Os anticorpos IgG específicos de alta afinidade dirigidos para a superfície de células "armam" as células citotóxicas e são necessários para tal morte. A lise da célula é extracelular, requer o contato direto célula a célula, e não envolve o complemento.
[00273] Outro processo englobado pelo termo função efetora é a citotoxicidade dependente do complemento (daqui em diante referida como "CDC"), que se refere a um evento bioquímico de destruição das células pelo sistema do complemento. O sistema de complemento é um sistema complexo de proteínas encontradas no plasma sanguíneo normal que combina com anticorpos para destruir bactérias patogênicas e outras células estranhas.
[00274] Ainda um outro processo englobado pelo termo função efe- tora é a fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) que se refere a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam um ou mais ligandos efetores reconhecem o anticorpo ligado em uma célula e subsequentemente causam a fagocitose da célula.
[00275] É contemplado que os anticorpos de Fc variantes são ca- racterizados por ensaios funcionais in vitro para determinar uma ou mais funções das células efetoras mediadas por FcyR. Em certas modalidades, os anticorpos de Fc variante têm propriedades semelhantes de ligação e funções efetoras de células em modelos in vivo (tal como os descritos e divulgados aqui), como aquelas com base em ensaios in vitro. No entanto, a presente invenção não exclui anticorpos de Fc va-riante que não apresentam o fenótipo desejado em ensaios com base em in vitro, mas que exibem o fenótipo desejado in vivo.
[00276] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma variante de Fc tem a citotoxicidade ou a atividade de fagocitose melhorada (por exemplo, ADCC, CDC e ADCP) em relação a um anticorpo que compreende uma região Fc nativa. Em uma modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem a citotoxicidade ou a atividade de fagocitose que é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos de 200 vezes, ou é entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, maior do que a de um anticorpo de Fc nativo. Alternativamente, um anticorpo de Fc variante tem citotoxicidade ou atividade de fagocitose reduzida em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em uma modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem a citotoxicidade ou a atividade de fagocitose que é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos de 200 vezes, ou é entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, menor do que a de um anticorpo de Fc nativo.
[00277] Em certas modalidades, os anticorpos de Fc variantes exibem atividades ADCC diminuídas em comparação com um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe atividades ADCC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos de 200 vezes, ou é entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes, menos do que as de um anticorpo de Fc nativo. Em ainda uma outra modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem atividades ADCC que estão reduzidas em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou de pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo me-nos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500%, em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em certas modalidades, os anticorpos de Fc variante não têm atividade ADCC detectável. Em modalidades específicas, a redução e/ou moderação da atividade de ADCC pode ser atribuída à reduzida afinidade que anticorpos de Fc variantes exibem para ligandos e/ou receptores de Fc.
[00278] Em uma modalidade alternativa, os anticorpos de Fc variantes exibem atividades ADCC aumentadas em comparação com um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, os anticorpos de FC variantes apresentam atividades de ADCC que são pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes maiores do que as de um anticorpo de Fc nativo. Em ainda uma outra modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem atividades de ADCC que estão aumentadas em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou de pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500%, em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em modalidades específicas, o aumento da atividade ADCC pode ser atribuída à afinidade aumentada que anticorpos de Fc variantes exibem para ligados e/ou receptores de Fc.
[00279] Em uma modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação melhorada para o receptor Fc FCYRIIIA e atividade de ADCC melhorada em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em outras modalidades, o anticorpo de Fc variante tem ambas a atividade de ADCC melhorada e meia-vida no soro melhorada em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade específica, um anticorpo de Fc variante tem ligação reduzida para o receptor Fc FcyRIIIA e atividade de ADCC reduzida em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em outras modalidades, o anticorpo de Fc variante tem ambas a atividade de ADCC reduzida e meia-vida no soro melhorada em relação a um anticorpo de Fc nativo.
[00280] Em certas modalidades, a citotoxicidade é mediada por CDC, em que o anticorpo de Fc variante tem a atividade CDC aumentada ou diminuída em relação a um anticorpo de Fc nativo. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a uma molécula, um anticorpo, por exemplo, complexado com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, p.ex. tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163, pode ser realizado.
[00281] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção exibem um aumento da atividade CDC em comparação com um anticorpo de Fc nativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo de Fc variante exibe atividade de CDC que é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos de 200 vezes, ou é entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 50 vezes, ou entre 25 vezes e 100 vezes, ou entre 75 vezes e 200 vezes, ou entre 100 e 200 vezes mais do que as de um anticorpo de Fc nativo. Em ainda uma outra modalidade, os anticorpos de Fc variantes exibem atividade de CDC que está aumentada em pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou de pelo menos 30%, ou em pelo menos 40%, ou em pelo menos 50%, ou em pelo menos 60%, ou em pelo menos 70%, ou em pelo menos 80%, ou em pelo menos 90%, ou em pelo menos 100%, ou em pelo menos 200%, ou em pelo menos 300%, ou em pelo menos 400%, ou em pelo menos 500%, em relação a um anticorpo de Fc nativo. Em modalidades específicas, o aumento da atividade CDC pode ser atribuída ao aumento da afinidade que anticorpos de Fc variantes exibem para C1q.
[00282] Os anticorpos da invenção podem apresentar atividade de CDC aumentada em comparação com um anticorpo de Fc nativo em virtude da Tecnologia COMPLEGENT® (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.), o que melhora um dos principais mecanismos de ação de um anticorpo, CDC. Com uma abordagem chamada quimerismo isotípico, em que porções de IgG3, um isotipo de anticorpo, são introduzidas em regiões de IgG1 correspondente, o isotipo padrão para anticorpos terapêuticos, tecnologia COMPLEGENT® melhora significativamente a atividade de CDC além do que a de qualquer IgG1 ou IgG3, mantendo a características desejáveis de IgG1, tais como ADCC, perfil PK e Proteína A de ligação. Além disso, pode ser utilizado em conjunto com a Tecnologia POTELLIGENT®, criando um Mab (ACCRETAMAB®) terapêutico mesmo superior com atividades de ADCC e CDC melhoradas.
[00283] O anticorpo de Fc variante da invenção pode ter a atividade de ADCC aumentada e uma meia-vida no soro melhorada em relação a um anticorpo de Fc nativo.
[00284] O anticorpo de Fc variante da invenção pode ter atividade CDC e meia-vida no soro melhorada em relação a um anticorpo de Fc nativo.
[00285] O anticorpo de Fc variante da invenção pode ter a atividade de ADCC melhorada, atividade de CDC melhorada e meia-vida no soro melhorada em relação de um anticorpo de Fc nativo.
[00286] A meia-vida no soro de proteínas compreendendo as regiões Fc pode ser aumentada através do aumento da afinidade de ligação da região Fc para FcRn. O termo "meia-vida do anticorpo" tal como aqui utilizado significa uma propriedade farmacocinética de um anticorpo que é uma medida do tempo médio de sobrevivência de moléculas de anticorpo após a sua administração. A meia-vida do anticorpo pode ser expressa como o tempo necessário para eliminar 50 por cento de uma quantidade conhecida de imunoglobulina do corpo do paciente (ou outro mamífero) ou de um compartimento específica do mesmo, por exemplo, como medido no soro, i.e., meia-vida em circulação, ou em outros tecidos. Meia-vida pode variar de uma imunoglobulina, ou classe de imunoglobulina para outra. Em geral, um aumento da meia-vida do anticorpo resultada em um aumento no tempo médio de residência (MRT) em circulação para o anticorpo administrado.
[00287] O aumento da meia-vida permite a redução da quantidade de medicamento administrado a um paciente, bem como a redução da frequência de administração. Para aumentar a meia-vida do anticorpo no soro, pode-se incorporar um epítopo de ligação ao receptor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na Patente U.S. No. 5,739,277, por exemplo. Tal como aqui utilizado, o termo "epítopo de ligação ao receptor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (p.ex., IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento in vivo da meia-vida no soro da molécula de IgG.
[00288] Alternativamente, os anticorpos da invenção com o aumento de meia-vida podem ser gerados por modificação de resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o Fc e o receptor FcRn (ver, para exemplos, Patentes US Nos. 6,821,505 e 7,083,784; e WO 09/058492). Além disso, a meia-vida dos anticorpos da invenção pode ser aumentada por conjugação com PEG ou Albumina através de técnicas amplamente utilizadas na especialidade. Em algumas modalidades, anticorpos compreendendo regiões Fc variantes da invenção apresentam um aumento da meia-vida de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100%, cerca de 125%, cerca de 150% ou mais em comparação com um anticorpo compreendendo uma região Fc nativa. Em algumas modalidades, anticorpos compreendendo regiões Fc variantes têm um aumento da meia-vida de cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 50 vezes ou mais, ou está entre 2 vezes e 10 vezes, ou entre 5 vezes e 25 vezes, ou entre 15 vezes e 50 vezes, em comparação com um anticorpo compreendendo uma região Fc nativa.
[00289] Em uma modalidade, a presente invenção fornece variantes de Fc, em que a região Fc compreende uma modificação (p.ex., substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de ami- noácidos) em uma ou mais posições selecionadas do grupo que con-siste em 221, 225, 228, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 250, 251, 252, 254, 255, 256, 257, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 308, 313, 316, 318, 320, 322, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 428, 433, 434, 435, 436, 440, e 443 conforme numerado pelo índice EU tal como previsto em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode compreender uma modificação em posições adicionais e/ou alternativas conhecidas de um perito na especialidade (ver, p.ex., as Patentes U.S. 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 7,083,784; 7,317,091; 7,217,797; 7,276,585; 7,355,008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; WO 94/29351; e WO 99/58572). Além disso, posições de aminoácidos úteis e substituições específicas são exemplificadas nas Tabelas 2 e 6-10 da US 6,737,056; as tabelas apresentadas na Figura 41 da US 2006/024298; as tabelas apresentadas nas Figuras 5, 12 e 15 de US 2006/235208; as tabelas apresentadas nas Figuras 8, 9 e 10 da US 2006/0173170 e as tabelas apresentadas nas Figuras 8-10, 13 e 14 de WO 09/058492.
[00290] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece uma variante de Fc, em que a região Fc compreende pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em 221K, 221Y, 225E, 225K, 225W, 228P, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235E, 235F, 236E, 237L, 237M, 237P, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 250E, 250Q, 251F, 252L, 252Y, 254S, 254T, 255L, 256E, 256F, 256M, 257C, 257M, 257N, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265A, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 296G, 297S, 297D, 297E, 298A, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 308F, 313F, 316D, 318A, 318S, 320A, 320S, 322A, 322S, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 326A, 326D, 326E, 326G, 326M, 326V, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 333A, 333D, 333G, 333Q, 333S, 333V, 334A, 334E, 334H, 334L, 334M, 334Q, 334V, 334Y, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 428L, 428F, 433K, 433L, 434A, 424F, 434W, 434Y, 436H, 440Y e 443W tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Opcionalmente, a região Fc pode incluir as substituições de aminoácidos adicionais e/ou alternativas conhecidas de um perito na técnica, incluindo mas não se limitando às exemplificadas nas Tabelas 2 e 6-10 de US 6,737,056; as tabelas apresentadas na Figura 41 da US 2006/024298; as tabelas apresentadas nas Figuras 5, 12 e 15 de US 2006/235208; as tabelas apresentadas nas Figuras 8, 9 e 10 da US 2006/0173170 e as tabelas apresentadas nas Figuras 8, 9 e 10 de WO 09/058492.
[00291] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um anticorpo de Fc variante, em que a região Fc compreende pelo menos uma modificação (p.ex., substituições de aminoácidos, inserções de aminoácidos, deleções de aminoácidos) em uma ou mais posições selecionadas entre o grupo que consiste em 228, 234, 235 e 331 tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Em uma modalidade, a modificação é pelo menos uma substituição selecionada do grupo que consiste em 228P, 234F, 235E, 235F, 235Y, e 331S tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat.
[00292] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção fornece um anticorpo de Fc variante, em que a região Fc é uma região Fc de IgG4 e compreende pelo menos, uma alteração em uma ou mais posições selecionadas entre o grupo que consiste em 228 e 235 tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Em ainda outra modalidade específica, a região Fc é uma região Fc de IgG4 e os aminoácidos de ocorrência não natural são selecionados do grupo que consiste em 228P, 235E e 235Y tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat.
[00293] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção fornece uma variante de Fc, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas entre o grupo que consiste em 239, 330 e 332 tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Em uma modalidade, a modificação é pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em 239D, 330L, 330Y, e 332E tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat.
[00294] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um anticorpo de Fc variante, em que a região Fc compreende pelo menos um aminoácido de ocorrência não natural em uma ou mais posições selecionadas entre o grupo que consiste em 252, 254 e 256 tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Em uma modalidade, a modificação é pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em 252Y, 254T e 256E tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat. Em anticorpos particularmente preferidos da invenção, a modificação é três substituições 252Y, 254T e 256E tal como numerado pelo índice EU como definido em Kabat (conhecido como "YTE"), ver U.S. 7,083,784.
[00295] Em certas modalidades, as funções efetoras provocadas por anticorpos IgG dependem fortemente da porção hidrato de carbo- no ligado à região Fc da proteína (Claudia Ferrara et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 93:851-861). Assim, a glicosilação da região Fc pode ser modificado para aumentar ou diminuir a função efe- tora (ver para exemplos, Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17:176180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; U.S. Pat. Nos. 6,602,684; 6,946,292; 7,064,191; 7,214,775;7,393,683; 7,425,446; 7,504,256; Publicação U.S. Nos. 2003/0157108; 2003/0003097; 2009/0010921; tecnologia Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnologia de engenharia de glicosilação GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suíça)). Deste modo, em uma modalidade as regiões Fc de anticorpos da invenção compreendem a glicosilação alterada de resíduos de aminoácidos. Em uma outra modalidade, a glicosilação alterada dos resíduos de amino- ácidos resulta em função efetora reduzida. Em uma outra modalidade, a glicosilação alterada dos resíduos de aminoácidos resulta em função efetora aumentada. Em uma modalidade específica, a região Fc reduziu a fucosilação. Em uma outra modalidade, a região Fc está afucosi- lada (ver para exemplos, Publicação de Pedido de Patente U.S. No.2005/0226867). Em um aspecto, estes anticorpos com aumento da função efetora, especificamente ADCC, como gerados em células hospedeiras (p.ex., células CHO, Lemna minor) modificadas para produzir anticorpos altamente defucosilados com ADCC mais de 100 vezes mais elevada em comparação com o anticorpo produzido pelas células genitoras (Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88:901-908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24:1591-7).
[00296] A adição de ácido siálico aos oligossacarídeos em moléculas de IgG pode melhorar a sua atividade anti-inflamatória e altera a sua citotoxicidade (Keneko et al., Science, 2006, 313:670-673; Scallon et al., Mol. Immuno. 2007 março;44(7):1524-34). Os estudos referidos anteriormente no presente documento demonstram que as moléculas de IgG com o aumento da sialilação têm propriedades anti- inflamatórias enquanto que as moléculas de IgG com sialilação reduzida aumentaram as propriedades imunoestimuladoras (p.ex., atividade de ADCC aumentada). Portanto, um anticorpo pode ser modificado com um perfil de sialilação apropriado para uma aplicação terapêutica particular (Publicação US No. 2009/0004179 e Publicação Internacional No. WO 2007/005786).
[00297] Em uma modalidade, as regiões Fc de anticorpos da invenção compreendem um perfil de sialilação alterado em comparação com a região Fc nativa. Em uma modalidade, as regiões Fc de anticorpos da invenção compreendem um perfil de sialilação aumentado em comparação com a região Fc nativa. Em uma outra modalidade, as regiões Fc de anticorpos da invenção compreendem um perfil de siali- lação diminuído em comparação com a região Fc nativa.
[00298] Em uma modalidade, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes de Fc conhecidas, tais como as divulgadas em Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:63740; Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idu- sogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); Patentes U.S. Nos. 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 7,122,637; 7,183,387; 7,332,581; 7,335,742; 7,371,826; 6,821,505; 6,180,377; 7,317,091; 7,355,008; 2004/0002587; e WO 99/58572. Outras modificações e/ou substituições e/ou adições e/ou deleções do domínio Fc serão prontamente evidentes para um perito na especialidade.
Glicosilação
[00299] Além da capacidade da glicosilação para alterar a função efetora de anticorpos, glicosilação modificada na região variável podem alterar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Em uma modalidade, o padrão de glicosilação da região variável dos anticorpos da presente invenção é modificado. Por exemplo, pode ser feito um anticorpo aglicosilado (i.e., o anticorpo carece de glicosilação). A glicosila- ção pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tais modificações de hidratos de carbono podem ser conseguidas através, por exemplo, da alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação da região estrutural variável para eliminar assim a glicosilação nesse local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Esta abordagem é descrita em maior detalhe nas Patentes U.S. Nos. 5,714,350 e 6,350,861. Uma ou mais substituições de ami- noácidos também podem ser feitas que resultam na eliminação de um local de glicosilação presente na região Fc (p.ex., Asparagina 297 de IgG). Além disso, os anticorpos aglicosilados podem ser produzidos em células bacterianas que não possuem a maquinaria de glicosilação necessária.
Anticorpos Conjugados
[00300] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são conjugados ou covalentemente ligados a uma substância utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a substância ligada é um agente terapêutico, um marcador detectável (também aqui referido como uma molécula repórter) ou um suporte sólido. As substâncias adequadas para ligação a anticorpos incluem, mas não estão limitadas a, um aminoácido, um peptídeo, uma proteína, um polissacárido, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um oligonucle- otídeo, um ácido nucleico, um hapteno, uma droga, uma hormona, uma lipídeo, um conjunto de lipídeo, um polímero sintético, uma mi- cropartícula polimérica, uma célula biológica, um vírus, um fluoróforo, um cromóforo, um corante, uma toxina, um hapteno, uma enzima, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um radioisótopo, matrizes sólidas, matrizes semissólidos e suas combinações. Os métodos para a conjugação ou ligação covalente de outra substância a um anticorpo são bem conhecidos na técnica.
[00301] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são conjugados a um suporte sólido. Os anticorpos podem ser conjugados a um suporte sólido, como parte da pesquisa e/ou purificação e/ou processo de produção. Em alternativa os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados a um suporte sólido como parte de um método ou composição de diagnóstico. Um suporte sólido adequado para utilização na presente invenção é tipicamente substancialmente insolúvel em fases líquidas. Um grande número de suportes está disponível e é conhecido de um vulgar perito na especialidade. Assim, os suportes sólidos incluem matrizes sólidas e semissólidas, tais como aerogéis e hidrogéis, resinas, grânulos, biochips (incluindo biochips revestidos de película fina), chip de microfluidos, um chip de silício, placas multipoços (também referidos como placas de microtitu- lação ou microplacas), membranas, metais condutores e não conduto- res, vidro (incluindo lâminas de microscópio) e suportes magnéticos. Exemplos mais específicos de suportes sólidos incluem géis de sílica, membranas poliméricas, partículas, filmes plásticos derivatizados, esferas de vidro, algodão, esferas de plástico, géis de alumina, polissa- carídeos tais como Sepharose, poli(acrilato), poliestireno, po- li(acrilamida), poliol, agarose, agar, celulose, dextrano, amido, Ficoll, heparina, glicogênio, amilopectina, manana, inulina, nitrocelulose, diazo-celulose, cloreto de polivinilo, polipropileno, polietileno (incluindo poli(etilenoglicol)), náilon, esferas de látex, esferas magnéticas, esferas paramagnéticas, esferas superparamagnéticas e semelhantes.
[00302] Em algumas modalidades, o suporte sólido pode incluir um grupo reativo funcional, incluindo, mas não se limitando a, hidroxilo, carboxilo, amino, tiol, aldeído, halogêneo, nitro, ciano, amido, ureia, carbonato, carbamato, isocianato, sulfona, sulfonato, sulfonamida, sul- fóxido, etc., para ligar os anticorpos da invenção.
[00303] Um suporte de fase sólida adequado pode ser selecionado com base na utilização final desejada e conveniência para vários protocolos sintéticos. Por exemplo, onde a formação da ligação amida é desejável para fixar os anticorpos da invenção ao suporte sólido, resinas geralmente úteis na síntese de peptídeos podem ser empregues, tais como poliestireno (p.ex., resina PAM obtida de Bachem Inc., Península Laboratories, etc.), resina POLYHIPE™ (obtido a partir de Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtida de Península Laboratories), resina de poliestireno enxertada com polietilenoglicol (Tenta- Gel™, Rapp Polymere, Tubingen, Alemanha), a resina de polidimetila- crilamida (disponível de Milligen/Biosearch, Califórnia), ou esferas PEGA (obtidas de Polymer Laboratories).
[00304] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são conjugados com marcadores para fins de diagnóstico e outros ensaios em que o anticorpo e/ou o seu ligando associado podem ser detectados. Um marcador conjugado a um anticorpo e utilizado nos presentes métodos e composições aqui descritos é qualquer fração química, orgânica ou inorgânica, que apresenta um máximo de absorção a comprimentos de onda superiores a 280 nm, e conserva as suas propriedades espectrais quando ligado de forma covalente a um anticorpo. Os marcadores incluem, sem limitação, um cromóforo, um fluo- róforo, uma proteína fluorescente, um corante fosforescente, um corante em tandem, uma partícula, um hapteno, uma enzima e um ra- dioisótopo.
[00305] Em certas modalidades, os anticorpos são conjugados com um fluoróforo. Como tal, fluoróforos usados para marcar anticorpos da invenção incluem, sem limitação; um pireno (incluindo qualquer um dos compostos derivados correspondentes divulgados na Patente US 5,132,432), um antraceno, um naftaleno, uma acridina, um estilbeno, um indole ou benzindole, um oxazole ou benzoxazole, um tiazol ou benzotiazol, um 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD), uma cia- nina (incluindo quaisquer compostos correspondentes nas Patente US Nos, 6,977,305 e 6,974,873), uma carbocianina (incluindo quaisquer compostos correspondentes na Série US Nos. 09/557,275; Patentes U.S. Nos. 4,981,977; 5,268,486; 5,569,587; 5,569,766; 5,486,616; 5,627,027; 5,808,044; 5,877,310; 6,002,003; 6,004,536; 6,008,373; 6,043,025; 6,127,134; 6,130,094; 6,133,445; e publicações WO 02/26891, WO 97/40104, WO 99/51702, WO 01/21624; EP 1 065 250 A1), um carboestiril, uma porfirina, um salicilato, um antranilato, um azuleno, um perileno, uma piridina, uma quinolina, um borapoliazain- daceno (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados nas Patentes US Nos. 4,774,339; 5,187,288; 5,248,782; 5,274,113; e 5,433,896), um xanteno (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados na Patente U.S. No. 6,162,931; 6,130,101; 6,229,055; 6,339,392; 5,451,343; 5,227,487; 5,442,045; 5,798,276; 5,846,737; 4,945,171; Série US Nos. 09/129,015 e 09/922,333), uma oxazina (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados na Patente US No. 4,714,763) ou uma benzoxazina, uma carbazina (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados na Patente US No. 4,810,636), uma fenalenona, uma cumarina (incluindo uns compostos correspondentes divulgados nas Patentes US nos. 5,696,157; 5,459,276; 5,501,980 e 5,830,912), um benzofurano (incluindo uns compostos correspondentes divulgados na Patente US Nos. 4,603,209 e 4,849,362) e benzfenalenona (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados na Patente US No. 4,812,409) e derivados dos mesmos. Tal como aqui utilizado, oxazinas incluem re- sorufinas (incluindo quaisquer compostos correspondentes divulgados em 5,242,805), amino-oxazinonas, diamino-oxazinas, e os seus análogos benzo-substituídos.
[00306] Em uma modalidade específica, os fluoróforos conjugados com os anticorpos aqui descritos incluem xanteno (rodol, rodamina, fluoresceína e seus derivados), cumarina, cianina, pireno, oxazina e borapoliazaindaceno. Em outras modalidades, tais fluoróforos são xan- tenos sulfonados, xantenos fluorados, cumarinas sulfonadas, cumari- nas fluoradas e cianinas sulfonadas. Também estão incluídos os corantes vendidos sob os nomes comerciais, e, geralmente, conhecidos como, ALEXA FLUOR®, DyLight, CY® Dyes, BODIPY®, OREGON GREEN®, PACIFIC BLUE™, IRDYE®, FAM, FITC, e ROX™.
[00307] A escolha do fluoróforo ligado ao anticorpo irá determinar as propriedades de absorção e de emissão de fluorescência do anticorpo conjugado. Propriedades físicas de um marcador fluoróforo que podem ser utilizadas para o anticorpo e ligandos ligados ao anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, características espectrais (absorção, emissão e de desvio de Stokes), a intensidade de fluorescência, tempo de vida, polarização e índice de fotobranqueamento, ou uma combinação das mesmas. Todas estas propriedades físicas podem ser utilizados para distinguir um fluoróforo de outro, e assim permitir a análise multiplexa. Em certas modalidades, o fluoróforo tem um máximo de absorção a comprimentos de onda superiores a 480 nm. Em outras modalidades, o fluoróforo absorve a, ou próximo de, 488 nm a 514 nm (particularmente apropriado para excitação pelo output da fonte de excitação do laser de ião árgon) ou próximo de 546 nm (particularmente adequado para a excitação por uma lâmpada de vapor de mercúrio). Em outra modalidade, um fluoróforo pode emitir em NIR (perto da região infravermelha) para aplicações de tecido ou de organismo inteiro. Outras propriedades desejáveis do marcador fluorescente podem incluir a permeabilidade celular e baixa toxicidade, por exemplo, se a marcação do anticorpo é para ser realizada em uma célula ou um organismo (p.ex., um animal vivo).
[00308] Em certas modalidades, uma enzima é um marcador e é conjugada a um anticorpo aqui descrito. As enzimas são marcadores desejáveis porque a amplificação do sinal detectável pode ser obtida resultando em um aumento da sensibilidade do ensaio. A própria enzima não produz uma resposta detectável, mas funciona para quebrar um substrato quando este é contactado por um substrato apropriado, tal que o substrato convertido produz um sinal fluorescente, colorimé- trico ou luminescente. As enzimas amplificam o sinal detectável porque uma enzima em um reagente de marcação pode resultar em vários substratos sendo convertidos para um sinal detectável. O substrato da enzima é selecionado para produzir o produto mensurável preferido, por exemplo, colorimétrico, fluorescente ou quimioluminescência. Tais substratos são amplamente utilizados na técnica e são bem conhecidos por um perito na especialidade.
[00309] Em uma modalidade, o substrato colorimétrico ou fluorogê- nico e a combinação de enzima utiliza oxidorredutases, tais como pe- roxidase de rábano e um substrato, tal como 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), que produzem uma cor distintiva (castanhos e vermelho, respectivamente). Outros substratos colo- rimétricos oxidoredutase que produzem produtos detectáveis incluem, mas não estão limitados a: 2,2-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPD), 3,3 ', 5,5'- tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, 5-aminossalicílico ácido 4- cloro-1-naftol. Substratos fluorogênicos incluem, mas não estão limitados a, ácido homovanílico ou ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fe- noxazinas reduzidas e benzotiazinas reduzidas, incluindo reagente Amplex® Red e as suas variantes (Patente U.S. No. 4,384,042) e di- hidroxantenos reduzidos, incluindo di-hidrofluoresceinas (Patente U.S. No. 6,162,931) e dihidrorodaminas incluindo dihidrorodamina 123. Os substratos de peroxidase que são tiramidas (Patente U.S. Nos. 5,196,306; 5,583,001 e 5,731,158) representam uma classe única de substratos de peroxidase em que eles podem ser intrinsecamente de- tectável antes da ação da enzima, mas são "fixos no local" pela ação de uma peroxidase no processo descrito como amplificação de sinal tiramida (TSA). Estes substratos são extensivamente utilizados para marcar o antígeno em amostras que são células, tecidos ou matrizes para a sua subsequente detecção por microscopia, citometria de fluxo, exploração óptica e fluorometria.
[00310] Em uma outra modalidade, uma combinação de substrato colorimétrico (e em alguns casos fluorogênico) e de enzima utiliza uma enzima fosfatase, tal como uma fosfatase ácida, uma fosfatase alcalina ou uma versão recombinante de uma tal fosfatase em combinação com um substrato colorimétrico tal como 5-bromo-6-cloro-3-indolilo fosfato (BCIP), 6-cloro-3-indolilo fosfato, 5-bromo-6-cloro-3-indolilo fosfato, p-nitrofenil fosfato, ou o-nitrofenil fosfato ou com um substrato flu- orogênico tal como 4-metilumbeliferil fosfato, 6,8-difluoro-7-hidroxi-4- metilcoumarinil fosfato (DiFMUP, Patente No. 5,830,912) difosfato de fluoresceína, 3-O-metilfluoresceína fosfato, resorufina fosfato, 9H-(1,3- dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona-7-ila) fosfato (fosfato DDAO), ou ELF 97, ELF 39 ou fosfatos relacionados (Patente U.S. Nos. 5,316,906 e 5,443,986).
[00311] As glicosidases, em particular beta-galactosidase, betaglucuronidase e beta-glucosidase, são enzimas adequadas adicionais. Substratos colorimétricos adequados incluem, mas não estão limitados a, 5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactopiranosídeo (X-gal) e semelhantes galactosídeos indol, glucósidos, e glucuronidos, O-nitrofenil- beta-D-galactopiranósido (ONPG) e p-nitrofenil-beta-D- galactopiranósido. Em uma modalidade, os substratos fluorogênicos incluem resorufina beta-D-galactopiranósido, digalactosídeo fluoresce- ína (FDG), diglucuronido fluoresceína e seus variantes estruturais (Patente U.S. Nos. 5,208,148; 5,242,805; 5,362,628; 5,576,424 e 5,773,236), 4-metilumbeliferil-beta-D-galactopiranosídeo, metilumbeli- feril-beta-D-galactopiranosídeo e cumarina fluorado beta-D- galactopiranosídeo (Patente U.S. No. 5,830,912).
[00312] Enzimas adicionais incluem, mas não estão limitadas a, hi- drolases, tais como colinesterases e peptidases, oxidases, tais como glucose oxidase e citocromo oxidases e redutases, para os quais são conhecidos substratos adequados.
[00313] As enzimas e os seus substratos apropriados que produzem quimioluminescência são preferidos para alguns ensaios. Estes incluem, mas não estão limitados a, formas naturais e recombinantes de luciferases e aequorinas. Substratos produtores de quimilumines- cência para fosfatases, glicosidases e oxidases tais como aqueles contendo dioxetanos estáveis, luminol, isoluminol e ésteres de acridi- nio são adicionalmente úteis.
[00314] Em uma outra modalidade, haptenos tais como biotina, também são utilizados como marcadores. A biotina é útil porque pode funcionar em um sistema de enzimas para amplificar adicionalmente o sinal detectável, e pode funcionar como um tag a ser utilizada em cro- matografia de afinidade para fins de isolamento. Para fins de detecção, um conjugado de enzima que tem afinidade para a biotina é utilizada, tal como avidina-HRP. Posteriormente, um substrato de peroxidase é adicionado para produzir um sinal detectável.
[00315] Os haptenos incluem hormonas, de ocorrência natural e sintéticas, fármacos poluentes, alérgenos, moléculas afetoras, factores de crescimento, quimiocinas, citocinas, linfocinas, aminoácidos, peptí- deos, nucleotídeos, intermediários químicos e semelhantes.
[00316] Em certas modalidades, as proteínas fluorescentes podem ser conjugadas com anticorpos como uma marcação. Exemplos de proteínas fluorescentes incluem a proteína verde fluorescente (GFP) e as ficobiliproteínas e os seus derivados. As proteínas fluorescentes, especialmente ficobiliproteínas, são particularmente úteis para a criação de reagentes de marcação corantes marcados em tandem. Estes corantes em tandem compreender uma proteína fluorescente e um flu- oróforo para os fins de obtenção de um desvio de Stokes maior em que o espectro de emissão é mais desviado do comprimento de onda dos espectros de absorção da proteína fluorescente. Isto é particularmente vantajoso para a detecção de uma baixa quantidade de antíge- no em uma amostra, em que a luz fluorescente emitida é maximamente otimizada, em outras palavras, pouca ou nenhuma da luz emitida é reabsorvida pela proteína fluorescente. Para que isto funcione, a proteína fluorescente e o fluoróforo funcionam como um par de transferência de energia em que a proteína fluorescente emite no comprimento de onda que o fluoróforo absorve e o fluoróforo então emite a um comprimento de onda mais distante das proteínas fluorescentes do que poderia ter sido obtido com apenas a proteína fluorescente. Uma combinação particularmente útil são as ficobiliproteínas divulgadas na Patente US Nos. 4,520,110; 4,859,582; 5,055,556 e os fluoróforos sul- forodamina divulgados na Patente US No. 5,798,276, ou os fluoróforos de cianina sulfonados divulgados na Patente US Nos. 6,977,305 e 6,974,873; ou os derivados de xanteno sulfonados divulgados na Patente US No. 6,130,101 e estas combinações divulgadas na Patente US No. 4,542,104. Alternativamente, o fluoróforo funciona como o dador de energia e a proteína fluorescente é o aceitador de energia.
[00317] Em certas modalidades, o marcador é um isótopo radioativo. Os exemplos de materiais radioativos adequados incluem, mas não estão limitados a, iodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnécio (99Tc, 99mTc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xénon (135Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, e 97Ru.
Tratamentos Médicos e Utilizações
[00318] Os anticorpos e os seus fragmentos de ligação da invenção e as suas variantes podem ser utilizados para o tratamento de infecção pelo vírus influenza A, para a prevenção da infecção pelo vírus influenza A e/ou para a detecção, diagnóstico e/ou prognóstico da infecção pelo vírus influenza A.
[00319] Métodos de diagnóstico podem incluir o contato de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo com uma amostra. Tais amostras podem ser amostras de tecido retiradas de, por exemplo, passagens nasais, cavidades dos seios nasais, glândulas salivares, pulmão, fígado, pâncreas, rim, ouvido, olho, placenta, trato digestivo, coração, ovários, pituitária, suprarrenais, tireoide, cérebro ou pele. Os métodos de detecção, diagnóstico e/ou prognóstico podem também incluir a detecção de um complexo antígeno/anticorpo.
[00320] Em uma modalidade, a invenção fornece um método de tratamento de um sujeito por administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, de acordo com a invenção, ou uma composição farmacêutica que inclui o anticorpo ou seu fragmento de ligação. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação é substancialmente purificado (i.e., substancialmente isento de substâncias que limitam o seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejáveis). Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado após a exposição, ou após o sujeito ter sido exposto ao vírus influenza A, ou estar infectado com o vírus influenza A. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado antes da exposição, ou a um sujeito que ainda não tenha sido exposto ao vírus influenza A ou que ainda não está infectado com o vírus influenza A. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado a um sujeito que é seronegativo para um ou mais subtipos de Influenza A. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado a um sujeito que é seropositivo para um ou mais subtipos de Influenza A. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado a um sujeito dentro de 1, 2, 3, 4, 5 dias de infecção ou o início dos sintomas. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção pode ser administrado a um sujeito, após 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias, e no prazo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias após a infecção ou início dos sintomas.
[00321] Em uma modalidade, o método reduz a infecção por vírus Influenza A no sujeito. Em uma outra modalidade, o método previne, reduz o risco ou atrasa a infecção por vírus influenza A no sujeito. Em uma modalidade, o sujeito é um mamífero. Em uma modalidade mais particular, o sujeito é humano. Em uma modalidade, o sujeito inclui, mas não está limitado a, um que está particularmente em risco de, ou seja, susceptível a infecção pelo vírus influenza A, incluindo, por exemplo, um sujeito imunocomprometido.
[00322] O tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla e o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção pode ser usado na imunização passiva.
[00323] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado a um sujeito em combinação com um ou mais medicamentos antivirais. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção é administrado a um sujeito em combinação com um ou mais medicamentos antivirais de moléculas pequenas. Medicamentos antivirais de moléculas pequenas incluem inibidores da neuraminidase, como o oseltamivir (TAMIFLU®), o zan- amivir (RELENZA®) e adamantanas tais como a amantadina e riman- tadina.
[00324] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma composição para utilização como um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção pelo vírus influenza A. Em uma outra modalidade, a invenção fornece a utilização de um anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção e/ou uma proteína compreendendo um epítopo ao qual um anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção se liga na produção de um medicamento para tratamento de um sujeito e/ou diagnóstico em um sujeito.
[00325] Os anticorpos e seus fragmentos tal como descritos na presente invenção também podem ser utilizados em um kit para o diagnóstico da infecção pelo vírus influenza A. Além disso, os epítopos capazes de se ligar a um anticorpo da presente invenção podem ser utilizados num kit para monitorizar a eficácia dos procedimentos de vacinação através da detecção da presença de anticorpos de proteção contra o vírus influenza A. Os anticorpos, ou fragmento de anticorpo, variantes e derivados dos mesmos, conforme descrito na presente in- venção podem também ser utilizado em um kit para monitorizar a produção da vacina com a imunogenicidade desejada.
[00326] A invenção também fornece um método de preparação de uma composição farmacêutica, que inclui a etapa de mistura de um anticorpo monoclonal com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção aqui descrita.
[00327] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser utilizados para administrar o anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção, incluindo, mas não se limitando a, encapsulação em li- possomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressarem o anticorpo ou fragmento de anticorpo, endoci- tose mediada por recepto, construção de um ácido nucleico como parte de um vector retroviral ou outro, distribuição de ácidos de nucleotí- deos nus por tecnologia de distribuição por eletroporação (como descrito em Muthumani et al., PLoS One. 2013 dezembro 31;8(12):e84234. doi: 10.1371/journal.pone.0084234. eCollection 2013) etc. Os métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a via intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bólus, absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocu- tâneas (p.ex., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos, incluindo, mas não se limitando a composições antivirais de moléculas pequenas. A administração pode ser sistêmica ou local. A administração pulmonar também pode ser empregue, p.ex., pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de formação de aerossóis. Em ainda outra modalidade, a composição pode ser ministrada em um sistema de libertação controlada.
[00328] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas. Tais composições incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" tal como utilizado no presente documento, significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou de um governo estadual ou listada na Farmacopeia dos EUA ou noutra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, e mais particularmente em seres humanos. O termo "transportador" refere-se a um di- luente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a terapêutica é administrada. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é o veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos padrão tais como compostos de qualidade farmacêutica como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina só- dica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Em uma modalidade, a composição farmacêutica contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação, de preferência na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer a forma apropriada de administração ao paciente. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[00329] Tipicamente, para a terapêutica de anticorpos, a dosagem administrada a um paciente situa-se entre cerca de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do paciente.
Lista de Figuras
[00330] A Figura 1A mostra a ligação do Anticorpo 3 e Anticorpo 12 à proteína HA expressa na superfície dos subtipos H11, H12, H13, H16, H17, H4, H10, H14 e H15. Os histogramas representam o número de células versus a intensidade de fluorescência da ligação do anticorpo às células transfectadas com HA, em branco, ou células não transfectadas (mock), em cinzento. A Figura 1B mostra a percentagem de inibição da fusão induzida a pH baixo de eritrócito de galinha e A/Puerto Rico/ 8/34 na presença de Anticorpo 3, Anticorpo 12, ou MPE8v3 (anticorpo de proteína de fusão viral não relevante) (Corti D et al., 2013, Nature 501). Figura 1C e 1D mostram imunoblots de não clivado (HA0), H1 HA recombinante após a digestão com tripsina durante 5, 10 ou 20 minutos. As reações de digestão continham ou HA apenas (input), ou HA pré-tratado com FI6v4 (descrito em WO2013/011347A1), Anticorpo 3, FE17.23 (mAb de cabeça globular específico) (Corti D et al., 2010, J Clin Invest 120) ou anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) em 1C, e HA apenas (input), ou HA pré- tratado com o Anticorpo 3, Anticorpo 12, 14 do anticorpo, ou anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) em 1D.
[00331] A Figura 2 mostra a percentagem de morte mediada por células NK de células MDCK infectadas com A/HK/8/68 na presença de uma quantidade crescente de Anticorpo 3, Anticorpo 11, Anticorpo 12 e Anticorpo 14.
[00332] A Figura 3 mostra a percentagem de macrófagos que fago- citaram as células alvo MDCK expressando A/HK/8/68HA, na presença de uma quantidade crescente de Anticorpo 3, Anticorpo 11, Anticorpo 12 e Anticorpo 14, ou controle de isotipo não relevante (Ctrl. IgG).
[00333] A Figura 4 mostra a percentagem de morte dependente do complemento em células MDCK infectadas com A/PR/8/34, na presença de uma quantidade crescente de Anticorpo 3, Anticorpo 11, Anticorpo 12 e Anticorpo 14.
[00334] A Figura 5 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de estudo quando diferentes concentrações de Anticorpo 3 ou de um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) foram administrados a ratinhos 4 horas antes da infecção com uma dose letal de vírus influenza H1N1.
[00335] A Figura 6 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de estudo em que diferentes concentrações de Anticorpo 3 ou de um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) foram administrados a ratinhos 4 horas antes da infecção com uma dose letal de vírus influenza H3.
[00336] A Figura 7 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo quando os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H1N1 e tratados em diferentes pontos de tempo (1 e 2 dias após a infecção) com 30 mg/kg de Anticorpo 3 ou um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG).
[00337] A Figura 8 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo em que os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H3 e tratados em diferentes pontos de tempo (3, 4 e 5 dias após a infecção) com 30 mg/kg de Anti- corpo 3 ou um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG).
[00338] A Figura 9 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo no qual os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H1N1 e tratados 1 dia após a infecção com 2 mg/kg de Anticorpo 3, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 14 ou um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG).
[00339] A Figura 10 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo no qual os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H3 e tratados 2 dias após a infecção com 3 mg/kg de Anticorpo 3, Anticorpo 11, Anticorpo 12, Anticorpo 14 ou um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG).
[00340] A Figura 11 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo no qual os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H1N1 e o tratamento com 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias, 10 mg/kg de Anticorpo 12, ou 10 mg/kg do anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) foi iniciado em diferentes pontos de tempo (4 hr antes, 1 dia após, ou 2 dias após a infecção).
[00341] A Figura 12 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo no qual os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H3 e o tratamento com 25 mg/kg oseltamivir oral duas vezes por dia (BID) durante 5 dias, ou dose única de 10 mg/kg de Anticorpo 12, ou 10 mg/kg de um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) que foi iniciado em diferentes pontos de tempo (1, 2, 3 ou 4 dias após a infecção).
[00342] A Figura 13 mostra a percentagem de animais que sobreviveram em cada grupo de um estudo que os ratinhos foram infectados com uma dose letal de vírus influenza H3 e tratados com o Anticorpo 12 em uma dose única de 2,5 mg/kg ou 0,3 mg/kg, oseltamivir BID a 25 mg/kg durante 5 dias, ou uma combinação de Anticorpo 12 a 2,5 mg/kg ou 0,3 mg/kg e oseltamivir BID 25 mg/kg durante 5 dias a 2 dias após a infecção.
[00343] A Figura 14 mostra a percentagem de furões sobreviventes em cada grupo de estudo após a infecção com uma dose letal de vírus influenza H5N1 e o tratamento com 25 mg/kg de dose única de Anticorpo 12, 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias, ou um anticorpo controle não relevante (Ctrl. IgG) em 1, 2, ou 3 dias após a infecção.
[00344] A Figura 15 mostra um alinhamento da Proteína HA2 das Estirpes de Influenza A Utilizadas na seleção de MARM.
Exemplos Exemplo 1. Construção e otimização de anticorpos monoclonais humanos isolados de células B de memória
[00345] As células CD22 + IgG + B foram classificadas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) criopreservadas de um dador selecionado para títulos elevados de anticorpos heteros- subtípicos e imortalizadas em 3 células/poço usando o Vírus de Epstein Barr (EBV) e oligodesoxinucleotídeos CpG 2006 e células alimen- tadoras. Os sobrenadantes da cultura contendo os anticorpos foram colhidos após 14 dias e analisados por ensaio de ligação ELISA para determinar a atividade de ligação contra hemaglutinina (HA) de H5 (A/Vietnam/1203/04) e H7 (A/NLD/03), respectivamente. Quatro clones de células B (Anticorpo 1, Anticorpo 4, Anticorpo 7 e Anticorpo 9) mostraram que se ligam especificamente a ambas HA e foram por isso recolhidos. Os genes VH e VL destes clones foram sequenciados e se verificou serem relacionados clonalmente de acordo com a análise de homologia realizada nos fragmentos V, D e J de VH e VL, usando a base de dados Kabat. De salientar, o VH do Anticorpo 4 foi identificado ter um local de nucleotídeos degenerado na HCDR3 codificando seja valina (codificada no Anticorpo 5) ou glutamato (codificado no Anticorpo 6). Os genes VH e VL dos quatro anticorpos foram clonados em vectores de expressão de IgG1 (modificações menores na sequência para facilitar a clonagem e ou otimização de codões resultou em cinco anticorpos; Anticorpo 3, Anticorpo 5, Anticorpo 6, Anticorpo 8 e Anticorpo 10; utilizados nos Exemplos seguintes) e anticorpos recombi- nantes foram produzidas por transfecção transiente de linhas celulares de mamífero derivadas de células HEK ou CHO. Os sobrenadantes das células transfectadas foram recolhidos após 7 a 10 dias de cultura e as IgGs foram purificados por afinidade por cromatografia em Proteína A e submetidos a diálise em PBS. O Anticorpo 3 foi ainda otimizado para criar variantes em que mutações somáticas não codificadas na linha germinal localizadas nas regiões estruturais foram alteradas para o aminoácido codificado na linha germinal, e as regiões CDR foram sujeitas a mutagênese parcimoniosa. Os vectores de expressão com-pletos de IgG contendo diferentes mutações foram expressos como descrito acima e os sobrenadantes brutos foram analisados por ELISA para selecionar clones que tinham a atividade de ligação aumentada em relação a proteínas H3 e H1 HA. ELISA foi executado utilizando uma concentração de revestimento de 0,15 μg/mL de IgG anti-humana de coelho, a fim de capturar e normalizar a IgG dos sobrenadantes, e depois 0,5 μg/mL de HA biotinilada do subtipo H1 (A/California/7/04 (H1N1)) ou subtipo H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)) foi adicionada e incubada durante uma hora. A ligação foi detectada por meio da adição de estreptavidina-HRP (1:5000), e a evolução da absorvância foi lida a 450 nm. As únicas mutações benéficas que conferem melhor ligação foram combinadas e clonadas em uma biblioteca combinatória, que foi expressa e analisada por ELISA como descrito acima. Esta abordagem de biblioteca resultou na criação de 5 variantes adicionais de Anticorpo 3 que foram adicionalmente caracterizadas (Anticorpos 11-15).
Exemplo 2. Anticorpo de neutralização anti-HA (nAB) liga HA de diferentes subtipos
[00346] Para testar se o epítopo dos anticorpos anti-HA é conservado entre HAs de diferentes subtipos, um ensaio de ligação ELISA de reatividade cruzada a HA foi realizado. Uma placa de 384 poços de ELISA Maxisorb (Nunc) foi revestida durante a noite a 4 °C com 0,5 μg/mL de HA recombinante (rHA), subtipo H1 (A/California/7/09 (H1N1)), subtipo H2 (A/Swine/PB/06 (H2N3)), subtipo H3 subtipo (A/Perth/16/09 (H3N2)), subtipo H5 (A/Vietnam/1203/04 (H5N1)), sub- tipo H6 (A/teal/HK/W312/97 (H6N1)), subtipo H7 (A/Netherlands/219/03 (H7N7)) e subtipo H9 (A/chicken/HK/G9/97 (H9N2)) em PBS. A placa foi lavada com PBS contendo 0,1% v/v de Tween-20 para remover proteína não revestida e subsequentemente solução de bloqueio contendo 1% (p/v) de caseína (Thermo Scientific) foi adicionada e incuba durante 1 h à temperatura ambiente. A solução de bloqueio foi descartada e foram adicionados anticorpos anti-HA 3 vezes diluídos em série em solução de bloqueio (Caseína-PBS (Thermo Scientific)) e incubados durante 1 h à temperatura ambiente. A placa foi lavada três vezes e os anticorpos ligados foram detectados utilizando um anticorpo anti-IgG humana de rato conjugado com peroxidase (Jackson). A atividade de ligação de anticorpo foi calculada quer pela medição do sinal quimioluminescente após adição do substrato Supersignal Pico (Thermo Scientific) ou pela medição da alteração de cor a 450 nm após a incubação com Tetrametilbenzidina (TMB), um substrato componente (KPL), seguido pela adição de ácido sulfúrico 2N para parar a reação. Tabela 1
[00347] A Tabela 1 mostra que todos os anti-HA IgG testados se ligam a HA recombinante dos subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H9 e H7. A HA recombinante do subtipo H9 foi reconhecida pelo Anticorpo 3 e Anticorpo 10, mas não pelo Anticorpo 5, Anticorpo 6 e Anticorpo 8 na concentração mais elevada de anticorpo testada (6 μg/mL). Isto indica que os epitopos da maioria destes anti-HA IgG são conservados entre moléculas HA de diferentes subtipos. Tabela 2
[00348] A Tabela 2 mostra que todos os anti-HA IgG variantes testados se ligam a HA recombinante dos subtipos H1, H2, H5, H6 e H9 do grupo 1 com valores de EC50 semelhantes. Todas as variantes se ligam às proteínas HA do grupo 2 (H3 e H7), contudo, o Anticorpo 11 e Anticorpo 3 mostraram atividade diminuída com o aumento dos valores de EC50 em comparação com os Anticorpos 12-15.
[00349] Para estender estes resultados de ligação de modo a incluir mais subtipos de HA diversificados, foram realizados estudos de ligação adicionais utilizando citometria de fluxo baseada na ligação às células HA transfectadas. Neste ensaio, as células HEK foram transfec- tadas de modo transiente com o plasmídeo de expressão de HA do tipo selvagem de comprimento total do subtipo H4 (A/duck/Czechoslovakia/56 (H4N6)), subtipo H10 (A/chicken/Germany/N49 (H10N7)), subtipo H11 (A/duck/Memphis/546/74 (H11N9)), subtipo H12 (A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)), subtipo H13 (A/gull/Maryland/704/77 (H13N6)), subtipo H14 (A/mallard/Astrakhan/263/82 (H14N5)), H15 subtipo (A/shearwater/West Australia/2576/79 (H15N9)), H16 subtipo (A/black- headed gull/Sweden/2/99 (H16N3)) e subtipo H17 (A/little yellowshouldered bat/Guatemala/164/2009 (H17N10)). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram descoladas com tripsina e incubadas com 5 μg/mL de Anticorpo 3 ou Anticorpo 12 em gelo durante 1 hora. Após a hora de incubação, o anticorpo ligado à superfície celular expressa proteína HA, sendo em seguida coradas com um anticorpo anti-IgG humana de cabra Daylight 649 (Jackson ImmunoResearch), e que foi detectado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra a alteração na intensidade de fluorescência quando o anticorpo se liga às células que expressam HA (branco) versus células não transfectadas (mock) (cinzento) para cada um dos subtipos. O Anticorpo 3 se ligou a todas HAs testadas com a excepção de H12, enquanto que o Anticorpo 12 se ligou a todas as HAs testadas de ambos os grupos (H11, H12, H13, H16 e H17 do grupo 1 e H4, H10, H14 e H15 do grupo 2)
Exemplo 3 Caracterização cinética da ligação de HA à IgG1 do Anticorpo 3 e Anticorpo 5 usando Octeto
[00350] Medições de afinidade foram realizadas utilizando um ForteBio Octeto QK 384 Kinetic Analyzer (Menlo Park, CA) em placas inclinadas de 384 poços. Todos os reagentes foram diluídos em tampão Octet Kinetics (ForteBio). HA marcada com His de diferentes subtipos: subtipo H1 (A/California/7/04 (H1N1)) e subtipo H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)) foram imobilizadas em sensores anti-His a 10 μg/mL. A asso ciação/dissociação do mAb anti-HA foi então monitorizada em diluições de 2 vezes a partir de 100 nM, mais um controle mAb a zero.
[00351] Os dados em bruto da associação e dissociação foram corrigidos para qualquer desvio com os controles mAb a zero e em seguida exportados para o GraphPad Prism (São Diego, CA) para o ajustamento da curva de afinidade. Os dados foram ajustados utilizando o ajuste global associação/dissociação com um limite imposto > 5 x10-6 s-1. Como apresentado na Tabela 3, ambos os anticorpos têm uma afinidade de ligação muito alta ao H1 a um nível de pM com uma taxa de dissociação lenta sob o limite de detecção. De modo semelhante, Kon, Koff e Kd de ambos os anticorpos foram observados com H3 trímero a um nível sub-nM. Tabela 3
Exemplo 4 Atividade In vitro de neutralização da reação cruzada de IgG1s anti-HA contra vírus de diferentes subtipos
[00352] O ensaio de microneutralização (MNA) foi modificado a partir de um ensaio anteriormente descrito de inibição viral acelerada utilizando a atividade da neuraminidase (NA) na forma de uma visualização (Hassantoufighi, A. et al. 2010, Vaccine 28:790). Resumidamente, o MNA foi realizado em células MDCK que foram cultivadas em meio MEM (Invitrogen) suplementado com antibióticos, glutamina (meio MEM completo) e 10% (v/v) de soro fetal de bovino. Sessenta TCID50 (dose infecciosa para 50% da cultura de tecidos) de vírus foram adicionadas a diluições de três vezes de anticorpo em uma placa de 384 poços em meio MEM completo contendo 0,75 μg/mL de tripsina (Worthington) em poços em duplicado, após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, 2x104 células/poço foram adicionadas à placa. Após incubação a 33 °C em incubadora a 5% de CO2 por aproximadamente 40 horas, a atividade da NA foi medida adicionando um substrato fluorescente marcado, ácido neuramínico metilumbeliferil-N- acetil (MU-NANA) (Sigma) a cada poço e incubado a 37 °C durante 1 h. A replicação do vírus representada pela atividade de NA foi quantificada através da leitura da fluorescência em Fluorómetro Envison (Perkin Elmer) utilizando os seguintes ajustes: excitação a 355 nm, emissão a 460 nm; 10 flashes por poço. O título de neutralização (concentração inibitória 50% [IC50]) é expresso como a concentração final de anticorpo que reduziu o sinal de fluorescência por 50% em comparação com os poços de células controle. As Tabela 4 e 5 mostram a neutralização por anticorpos anti-HA do vírus influenza A de diferentes subtipos testados abaixo: H1-PR34 (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)); H1- PR34-OR (A/Puerto Rico/8/34 contendo a mutação NA 274Y (numeração N2) conferindo resistência ao oseltamivir (H1N1)); H1-FM47 (A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)); H1-NJ76 (A/New Jersey/8/76 (H1N1)); H1-Kaw86 (A/Kawasaki/9/86 (H1N1)); H1-TX91 (caA/Texas/36/91 (H1N1)): H1-BJ95 (ca A/Beijing/262/95 (H1N1)); H1- Ncal99 (ca A/New Caledonia/20/99 (H1N1)); H1-SD07 (ca A/South Dakota/6/07 (H1N1)); H1-CA09 (ca A/California/7/09 (H1N1)); H1- CA09-OR (ca A/California/7/09 contendo a mutação NA 274Y (numeração N2) conferindo resistência ao oseltamivir (H1N1)); H5-VN04 (ca A/Vietnam/1203/04 (H5N1)); H5-HK03 (ca A/Hong Kong/213/03 (H5N1)); H9-HK97 (ca A/chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2); H2-JP57 (ca A/Japan/57 (H2N2)); H2-MO06 (ca A/swine/Missouri/06 (H2N3)); H6-HK97 (ca A/teal/Hong Kong/W312/97 (H6N1)); H6-AB85 (ca A/mallard/Alberta/89/85 (H6N2)); H3-HK68 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); H3-Vic75 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); H3-LA87 (A/Los Ange- les/7/09 (H3N2)); H3-SD93 (A/Shan dong/9/93 (H3N2)); H3-WH95 (ca A/Wuhan/359/95 (H3N2)); H3-Syd97 (ca A/Sydney/5/97 (H3N2)); H3- WH95-OR (ca A/Wuhan/359/95 contendo a mutação NA 274Y (numeração N2) conferindo resistência ao oseltamivir (H3N2)); H3-Pa99 (ca A/Panama/2007/99 (H3N2)); H3-Wy03 (A/Wyoming/03/03 (H3N2)); H3-WI05 (A/Wisconsin/67/05 (H3N2)); H3-Perth09 (ca A/Perth/16/09 (H3N2)), H3-VC11 (A/Victoria/361/11 (H3N2)); H7-NLD03 (ca A/Netherlands/219/03 (H7N7)); H7-BC04 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP); H7-ANU13 (ca A/Anhui/1/13 (H7N9). Tabela 4
[00353] A Tabela 4 mostra que os anticorpos anti-HA neutralizam todos os vírus influenza A do grupo 1 testados. Todos os anticorpos anti-HA, com excepção do Anticorpo 8, demonstraram atividade de neutralização contra H3 de todos os vírus influenza A testados e todos os anticorpos anti-HA, excepto o Anticorpo 6, exibiram uma atividade neutralizadora contra H7-NLD03 (ca A/Netherlands/219/03 (H7N7)); H7-BC04 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP). Tabela 5
[00354] A Tabela 5 mostra que as variantes de Anticorpos (Anticor- pos 11-15) são mais eficazes do que o Anticorpo 3 de origem na neu-tralização de todos os vírus influenza A do grupo 1 e grupo 2 testados com valores de IC50 diminuídos. Além disso, os anticorpos também neutralizaram 3 vírus que têm uma mutação manipulada na proteína NA que confere resistência ao oseltamivir (OR).
Exemplo 5. Atividade de neutralização de IgGs anti-HA contra o vírus H3N2 de origem suína.
[00355] A atividade de neutralização do Anticorpo 3 anti-HA e variantes (Anticorpos 11-15) contra o vírus H3N2 de origem suína que emergiu recentemente A/Minnesota/11/2010 and A/Indiana/10/2011) foi medida em um ensaio de microneutralização como descrito no Exemplo 4. O Anticorpo FI6v4 (descrito em WO2013/011347A1) foi utilizado como um anticorpo controle. Como apresentado na Tabela 6 a partir de duas experiências independentes, o Anticorpo 3 e as variantes do anticorpo (Anticorpos 11-15) foram mais eficazes do que FI6v4 na neutralização do vírus H3N2 de origem suína A/Indiana/10/2011. O Anticorpo 3 e a variantes do anticorpo neutralizaram de forma potente o vírus H3N2 de origem suína A/Indiana/10/2011 enquanto o FI6v4 não conseguiu neutralizar na concentração mais elevada (50 μg/mL) de anticorpo testado. Tabela 6
Exemplo 6. Anticorpo de neutralização anti-HA inibe a fusão do influ- enza e clivagem de HA0 mediada por protease.
[00356] Para testar para a inibição da fusão mediada por anticorpos, um ensaio de fusão de eritrócitos induzida a pH baixo foi realizado através de um protocolo modificado descrito anteriormente (Wang T.T. et al., 2010 PLoS Pathog. 6). Em resumo, o vírus A/Puerto Ri- co/8/34 (10 x 106 TCID50) foi incubado com os eritrócitos humanos (concentração de eritrócitos final de 2%) em gelo durante 10 minutos. As diluições do Anticorpo 3, Anticorpo 12, e um anticorpo não relevante MPE8v3 foram incubadas com o vírus durante 30 minutos à TA. Os eritrócitos foram então adicionados à mistura de anticorpo-vírus durante 30 minutos a 37 °C e finalmente foi adicionado tampão de acetato de sódio (0,5 M, pH 5,0) durante 45 minutos adicionais a 37 °C. As amostras foram centrifugadas durante 6 minutos a 400xg e incubadas durante mais 45 minutos à TA e em seguida centrifugadas novamente durante 6 minutos a 400xg para sedimentar os eritrócitos. Os sobrena- dantes foram então transferidos para uma placa de ELISA para determinar a quantidade de NADPH libertado, medindo a absorvância a 540 nm (Figura 1B). O resultado mostrou que o Anticorpo 3 e o Anticorpo 12 inibiram potencialmente a fusão viral enquanto que o MPE8v3, um anticorpo monoclonal humano contra a proteína de fusão de um para- mixovírus (Corti et al., 2013 Nature 501), não foi capaz de inibir fusão induzida a pH baixo.
[00357] Para testar para o bloqueio mediado por anticorpos da maturação de HA, HA recombinante de A/New Caledonia/20/99 (H1N1) foi incubada durante 40 minutos com Anticorpo 3, FI6v4, FE17.23 ou um anticorpo isotipo controle na razão molar de 15:1 (mAb:HA). A mistura de anticorpo-HA foi em seguida exposta a 2,5 μg/mL de tripsina tratada com TPCK e incubada durante 5, 10 e 20 minutos a 37 °C. As amostras foram separadas num gel de poliacrilamida e em seguida transferidas para membrana de nitrocelulose para análises de Western blot utilizando um mAb biotinilado humano (FO32) (Humabs) que reconhece a HA2 e HA0 de estirpes de influenza A (Figura 1C). O resultado mostrou que o Anticorpo 3 foi mais potente do que o FI6v4 no bloqueio da clivagem de HA0 mediada por protease. Em contraste, FE17.23, um anticorpo monoclonal humano que reconhece a cabeça globular de HA, e o anticorpo controle não foram capazes de inibir a clivagem de HA0 mediada por protease. Em uma experiência separada foram comparadas a inibição da protease de clivagem do Anticorpo 12 e Anticorpo 14 em comparação com o Anticorpo 3 usando as mesmas condições descritas acima (Figura 1D). Os resultados mostraram que o Anticorpo 12, Anticorpo 13, tinha uma capacidade semelhante para bloquear a clivagem da protease como o Anticorpo 3.
Exemplo 7. Anticorpos anti-HA exibem função efetora Fc
[00358] Os anticorpos têm o potencial de eliminar células infectadas por vírus através da função efetora Fc, tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), e morte celular dependente de complemento (CDC). Para confirmar que os anticorpos anti-HA exibem a atividade de ADCC foi testada a sua capacidade para matar as células infectadas com o vírus na presença de células assassinas naturais (NK) humanas. O ensaio de ADCC foi realizada em células MDCK infectadas com A/Hong Kong/8/68 a uma MOI de 20. As células infectadas foram incubadas com uma série de diluição de anticorpo, e em seguida incubadas com células NK purificadas que foram selecionadas negativamente de PBMC humanos (Miltenyi), em uma razão de efector para alvo de 6:1. A mistura de células infectadas, anticorpo e células NK foi incubada durante 4 horas, e a morte celular foi medida pela libertação de LDH (Roche). A Figura 2 mostra que todos os quatro anticorpos contra a haste HA exibiram morte dependente da dose de células MDCK infectadas.
[00359] Para medir a capacidade dos anticorpos anti-HA de mediar a fagocitose, os requerentes utilizaram células MDCK transfectadas estavelmente com HA derivada de A/Hong Kong/8/68 como células alvo. Os monócitos humanos foram isolados de PBMC e cultivados durante 7 dias na presença de M-CSF para se diferenciarem em ma- crófagos. Os macrófagos humanos e células alvo expressando HA foram marcados por fluorescência violeta e verde, respectivamente (CellTrace Violet ou CSFE, Invitrogen). Células efetoras e alvo marcadas foram incubadas a uma razão de 6:1 na presença de uma série de diluição de anticorpo durante 2 horas, e depois analisadas por citome- tria de fluxo. A percentagem de fagocitose foi medida como a percentagem de macrófagos corados violeta que também foram positivos para as células alvo verde (duplo positivo). A Figura 3 mostra que todos os anticorpos anti-HA apresentaram níveis semelhantes de ADCP, como esperado o anticorpo de controle não específico não apresentou fagocitose.
[00360] Para medir a capacidade dos anticorpos anti-HA para trabalhar com o complemento para mediar a morte de células infectadas, foi realizado ensaio de CDC. Neste este ensaio, as células MDCK foram infectadas com o A/Puerto Rico/8/34 a uma MOI de 2, incubadas com uma série de diluição de anticorpo, e derivado de complemento de coelho (Cedarlane) a uma razão efector para alvo de 1:18. A morte celular foi medida pela libertação de LDH (Roche). A Figura 4 mostra que todos os anticorpos anti-HA demonstraram a capacidade para mediar a morte celular na presença de complemento.
Exemplo 8. Efeito profiláctico e terapêutico de anticorpos anti-HA
[00361] A eficácia protetora do anticorpo neutralizante humano (nAbs) contra a infecção pelo vírus da gripe foi avaliada em modelo de ratinho BALB/c (Harlan Laboratories) com seis a oito semanas de idade. Os ratinhos foram tratados com diferentes doses de nAb, antes ou após o desafio viral letal.
[00362] Atividade profiláctica (Figura 5 e 6) Ratinhos em grupos de 8 foram administrados com o Anticorpo 3 como uma única injeção intraperitoneal (IP) em doses de 0,1, 0,3, 1, 3 e 10 mg/kg, ou com um isotipo humano não relevante IgG controle a 10 mg/kg em volumes de 100 μL. Quatro horas após a administração, os ratinhos foram inoculados por via intranasal com 7 vezes cinquenta por cento da dose letal em ratinhos (7 MLD50) de A/California/7/09 (H1N1) (H1-CA09) ou 7:1 A/PR/8:A/HK/8/68 HA (H3N1) (H3-HK68) recombinante em um volume de 50 μL. Os ratinhos foram pesadosno dia ou um dia antes do desafio viral e monitorizadas diariamente durante 14 dias para perda de peso e sobrevivência (ratinhos com perda de peso corporal > 25% foram sacrificados). O Anticorpo 3 conferiu proteção de uma forma dependente da dose. A injeção IP de 1 mg/kg ou mais do Anticorpo 3 forneceu uma proteção completa em animais desafiados com H1-CA09 (Figura 5) e H3-HK68 (Figura 6). Uma dose de anticorpo mais baixa (0,3 mg/kg) também foi altamente protetora com proteção de 90%. Como esperado, nenhum dos ratinhos que recebeu o mAb do isotipo controle a 10 mg/kg sobreviveu ao desafio letal da infecção.
[00363] Atividade terapêutica (Figura 7 e 8) Os ratinhos foram inoculados com 3 MLD50 de H1-CA09 e injetados com o Anticorpo 3 às 24 e 48 horas após a infecção (h.p.i.) (Figura 7) ou com 5 MLD50 de H3- HK68 às 72, 96 e 120 h.p.i. (Figura 8). O tratamento IP com 30 mg/kg de Anticorpo 3 às 24 e 48 h.p.i protegeu 75 a 100% dos ratinhos desafiados com H1-CA09, e às 72 e 96 h.p.i protegeu 87,5 a 100% dos ratinhos desafiados com H3-HK68. O tratamento com mesma dose de anticorpo controle de isotipo não relevante às 0 ou 24 h.p.i em modelos de H1 e H3 não conseguiu proteger os ratinhos contra o desafio letal com uma taxa de sobrevivência igual a 0 ou 12,5%, respectivamente.
[00364] Atividade terapêutica das variantes do Anticorpo 3 (Figura 9 e 10) Os ratinhos foram inoculados com 3 MLD50 de H1-CA09 e injetados com os anticorpos 24 h.p.i. (Figura 9) ou inoculados com 7 MLD50 de H3-HK68 e injetados com anticorpos 48 h.p.i. (Figura 10). O tratamento IP com 2 mg/kg de Anticorpo 3 e variantes mAbs (Anticorpo 11, Anticorpo 12 e Anticorpo 14) protegeu 87,5 a 100% dos ratinhos desafiados com H1-CA09, e a dose de 3 mg/kg dos diferentes mAbs protegeu 50 a 87,5% dos ratinhos desafiados com H3-HK68. Como esperado, o tratamento com mesma dose de anticorpo controle de isotipo não relevante às 24 ou 48 h.p.i. em modelos de H1 e H3 não conseguiu proteger os ratinhos com uma taxa de sobrevivência de 0 ou 12,5%, respectivamente.
Exemplo 9. Efeito terapêutico de anticorpos anti-HA e inibidor de molécula pequena oseltamivir
[00365] Para comparar diretamente a eficácia protetora de nAbs anti-HA com o inibidor de molécula pequena de neuraminidase (NA), oseltamivir, e o efeito da terapia de combinação, foi utilizado o modelo de murino de infecção por influenza descrito no Exemplo 8.
[00366] Comparação terapêutica de nAbs anti-HA e oseltamivir (Figura 11 e 12) Os ratinhos foram inoculados com 3 MLD50 de H1-CA09 e tratados com 10 mg/kg de Anticorpo 12 ou 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias iniciado quer às 4 horas antes, 1 dia ou 2 dias após a infecção (Figura 11). O tratamento com o Anticorpo 12 antes e 1 dia após a infecção protegeu 100% dos ratinhos desafiados com H1- CA09, enquanto que todos os animais tratados com oseltamivir sucumbiram à infecção. Todos os animais tratados com a mesma dose de isotipo não relevante controle 4 horas antes da infecção morreram com uma taxa de sobrevivência de 0%. Além disso, os ratinhos foram inoculados com 7 MLD50 de H3-HK68, em seguida tratado com 10 mg/kg de Anticorpo 12 ou 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias iniciado quer 1, 2, 3, ou 4 dias após a infecção (Figura 12). Os animais tratados com o Anticorpo 12 em 1, 2, ou 3 dias após a infecção apre-sentaram uma taxa de sobrevivência de 100%, enquanto que o tratamento com o oseltamivir nesses mesmos pontos de tempo mostrou apenas uma taxa de sobrevivência de 60% a 20%. Como esperado, os ratinhos tratados com a mesma dose de anticorpo controle de isotipo não relevante 1 dia após infecção sucumbiram à infecção com uma taxa de sobrevivência de 10%.
[00367] Combinação terapêutica de nAbs anti-HA e oseltamivir (Figura 13) Para avaliar o efeito aditivo da combinação de mAb anti-HA com oseltamivir, os ratinhos foram inoculados com 7 MLD50 de H3- HK68 e tratados com uma concentração subótima de Anticorpo 12 (2,5 ou 0,3 mg/kg), 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias, ou uma combinação de Anticorpo 12 (2,5 ou 0,3 mg/kg) e 25 mg/kg de oselta- mivir BID durante 5 dias, no dia 3 após a infecção (Figura 13). O tratamento com Anticorpo 12 sozinho ou oseltamivir sozinho protegeu apenas 10 a 20% dos animais enquanto que o tratamento com 2,5 mg/kg de Anticorpo 12 em combinação com oseltamivir protegeu 80%, e 0,3 mg/kg de Anticorpo 12 em combinação com oseltamivir protegeu 50% dos animais.
Exemplo 10. Efeito terapêutico de anticorpos anti-HA e pequena molécula inibidora contra a infecção de influenza H5N1 em furões
[00368] A eficácia protetora de nAbs anti-HA e oseltamivir contra uma infecção por um vírus influenza de alta patogenicidade foi avaliada em furões com cinco a seis meses de idade seronegativos para influenza (Triplo F Farms). Todos os furões foram infectados por via intranasal com uma LD90 do vírus da gripe aviária altamente patogênico A/VN/1203/04 (H5N1) em 1,0 mL (aproximadamente 0,5 mL/narina), e em seguida tratados com uma única dose de Anticorpo 12 a 25 mg/ g ou 25 mg/kg de oseltamivir BID durante 5 dias iniciado 1, 2, ou 3 dias após a infecção. A percentagem de sobrevivência foi calculada para cada grupo (n = 7) (Figura 14). Os furões tratados com Anticorpo 12 iniciado 1, 2, e 3 dias após a infecção, bem como aqueles tratados com oseltamivir um dia após a infecção foram protegidos, tendo uma taxa de sobrevivência de 100%. No entanto, quando o tratamento foi iniciado oseltamivir em 2 e 3 dias após a infecção, os furões apenas tiveram 71% de sobrevivência (média do dia morte 12) e 29% de sobrevivência (média dia da morte 9), respectivamente. Como esperado os animais tratados com 25 mg/kg de um anticorpo controle de isotipo não relevante um dia após a infecção não conseguiram sobreviver com uma taxa de sobrevivência de 0%.
Exemplo 11. Identificação do epitopo por seleção de mutantes resistentes ao anticorpo monoclonal (MARMs).
[00369] Mutantes resistentes aos anticorpos foram isolados através de dois métodos diferentes a partir de três vírus H3N2. A/Aichi/2/68 (Aichi/68) H3N2 foi incubado com concentrações elevadas de Anticorpo 12 (125xIC50) durante 1 hora antes da mistura de vírus e anticorpo ser adsorvida nas células MDCK a 30.000 TCID50 por poço em 10 x placas 96 poços e cultivadas na presença do Anticorpo 12 (10XIC50). Três MARMs HK2/68 putativos de Anticorpo 12 que exibem o efeito citopático (CPE) em células infectadas até 3 dias após a infecção foram isolados. O gene HA foi amplificado por RT-PCR e subsequentemente sequenciado. A análise da sequência revelou 2 substituições não-sinônimas em comparação com a sequência de origem (Tabela 7). Estas duas alterações de nucleotídeos respectivamente codificam para substituições de um único aminoácido de isoleucina (I) para a ar- ginina (R); e de ácido aspártico (D) para tirosina (Y) na posição de aminoácido 18 e 19 na região altamente conservada da haste HA2. Em alternativa, passagem em série do vírus influenza H3N2, A/Wisconsin/67/2005 (WI05), e ca A/Panama/2007/1999 (Pa99) foram propagados na presença de concentrações crescentes de Anticorpo 12 de 2-5XIC50 até 100XIC50. Os potenciais mutantes de escape foram subclonados por diluição limitada e os seus genes HA cognatos foram submetidos a análise de sequência. As mudanças individuais de ami- noácidos de D a Y na posição 19 e de Glutamina (Q) para R na posição 42 em HA2 foram identificadas. Além disso, as mutações duplas foram observadas com substituição de aminoácidos de Histina (H) para Q na posição 156 em HA1 em combinação com D19Y, ou de D a asparagina (N) na posição 19 em combinação com a mudança de aminoácido de I para N no resíduo 45 em HA2; ou de alanina (A) para treonina (T) na posição 196 em HA1 em combinação com Q42R (Tabela 7). Da mesma forma, quando Pa99 foi passada em série na presença do Anticorpo 12 concentrações até 100 x IC50, substituição única de aminoácidos foi selecionada em HA2 no resíduo 42 (Q42R) e 45 (I45T) (Tabela 7). As variantes MARM representativos apresentadas na Tabela 7 foram usados num ensaio de microneutralização para melhor avaliar a susceptibilidade fenotípica destes MARMs à neutralização pelo Anticorpo 12. Os resultados mostraram que as MARMs WI05 selecionadas in vitro contendo mutações D19Y, H156Q/D19Y, D19N/I45N, Q42R ou A196T/Q42R; MARMs Pa99 contendo Q42R ou I45T e MARMs Aichi/68 contendo mutações D19Y ou I18R eram menos suscetíveis à neutralização de anticorpos, com aumentos nos valores de IC50 calculados variando de > 8 vezes para clones resistentes PA99 a > 180 vezes para variantes WI05 resistentes quando em comparação com as estirpes genitoras de tipo selvagem, respectivamente (Tabela 8). Para avaliar o efeito destas substituições de aminoácidos na susceptibilidade à neutralização pelo Anticorpo 12, variantes H3 recombinante A/Hong Kong/1-5/68 (rHK68) que codificam mutações individuais foram geradas e avaliadas utilizando um ensaio de micro- neutralização. Como mostrado na Tabela 9, as variantes H3 rHK68_I18R e rHK68_D19Y exibiram resistência ao Anticorpo 12 na concentração mais elevada testada (~ 200 μg/mL) e conferiram uma redução > 130 vezes na suscetibilidade à neutralização pelo Anticorpo 12 em comparação com o vírus rHK68 de tipo selvagem. A alteração de um único aminoácido Q42R em rHK68 resultou em uma redução modesta de cerca de 8 vezes em suscetibilidade à neutralização pelo Anticorpo 12. No entanto, as substituições de aminoácidos (K156Q, A196T, I45N ou I45T) identificadas nas proteínas HA de MARMs selecionadas não alterou a suscetibilidade dos vírus recombinantes HK68 que codificam tais substituições para o Anticorpo 12 em ensaio de mi- croneutralização. Estes resultados sugerem que o Anticorpo 12 reconhece epitopos conformacionais em uma região altamente conservada da haste HA2 e aminoácidos nas posições 18, 19, 42 ou 45 são resíduos chave de contato. Tabela 7. Substituições de aminoácidos identificadas em H3 HA dos mutantes resistentes do Anticorpo 12 Tabela 8. Susceptibilidade das variantes resistentes H3 à neutralização pelo Anticorpo 12 (Neut) Tabela 9. Susceptibilidade das variantes rHK6$ 3 H3 à Neutralização pelo Anticorpo 12 (Neut) Referências sobre Influenza A: Corti, D., et al. 2010. Heterosubtypic neutralizing antibodies are produced by individuals immunized with a seasonal influenza vaccine. J Clin Invest 120:1663-1673. Corti, D., et al. 2011. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemaggluti-nins. Science 333:850-856. Corti, D., et al. 2013. Cross-neutralization of four paramyxo-viruses by a human monoclonal antibody. Nature 501(7467):439-43. Ekiert, D. C. et al., 2009. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science 324: 246-251. Ekiert, D. C. et al. 2011. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science 333:843-850. Ekiert, D.C., et al. 2012. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature 489: 526-532. Krause, J. C., et al. 2011. A broadly Neutralizing human monoclonal antibody that recognizes a conserved, novel epitope on the globular head of the influenza H1N1 virus hemagglutinin. J. Virol. 85:10905-10908. Lee, P.S., et al. 2012. Heterosubtypic antibody recognition of the influenza virus hemagglutinin receptor binding site enhanced by avidity. Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 17040-17045 Li G.M. et al. 2012. Pandemic H1N1 influenza vaccine in-duces a recall response in humans that favors broadly cross-reactive memory B cells. Proc Natl Acad Sci U S A.109:9047-9052. Nakamura G. et al. 2013. An in vivo human-plasmablast en-richment technique allows rapid identification of therapeutic influenza a antibodies. Cell host microbe 14:93-103 Sui, J., et al. 2009. Structure and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273. Throsby, M., et al. 2008. Heterosubtypic neutralizing mono-clonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PLoS One 3: e3492 Wang T.T., et al., 2010. Broadly protective monoclonal anti-bodies against H3 influenza viruses following sequential immunization with different hemagglutinins. PLoS Pathog. 6(2):e1000796. Whittle, J. R. R., et al. 2011. Broadly neutralizing human an-tibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:14216-14221. Wrammert, J., et al. 2011. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 in-fluenza virus infection. J Exp Med. 208:181-193. INFORMAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS Anticorpo 1 (cDNA original) SEQ ID NO: 1 cagatacagctgcaggagtcgggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacaatgctgtttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tatgcagaatctgtgaaaagtcgaataaccgtcaatccagacacatccaagaaccagtt- ctccctgcacctgaagtctgtgactcccgaggacacggctgtgttttactgtg- tacgatctggccacattacggtttttggagtgaatgttgacgcttttgatatgtggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 2 QIQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 3 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 4 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 5 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 6 gacatccagatcacccagtcgccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtaaccat- cacttgccggacaagtcagagccttagtagctatttacattggtatcagcagaaaccaggga- aagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggtt- cagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagtagtctgcaacctgaaga- ttttgcaacttactactgtcaacagagtcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa SEQ ID NO: 7 DIQITQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 8 LCDR1 RTSQSLSSYLH SEQ ID NO: 9 LCDR2 AASSLQS SEQ ID NO: 10 LCDR3 QQSRT Anticorpo 2 (forma expressa do Anticorpo 1) SEQ ID NO: 11 caggtacagctgcaggagtcgggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacaatgctgtttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tatgcagaatctgtgaaaagtcgaataaccgtcaatccagacacatccaagaaccagtt- ctccctgcacctgaagtctgtgactcccgaggacacggctgtgttttactgtg- tacgatctggccacattacggtttttggagtgaatgttgacgcttttgatatgtggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 12 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 13 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 14 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 15 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 16 gacatccagatgacccagtcgccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtaaccat- cacttgccggacaagtcagagccttagtagctatttacattggtatcagcagaaaccaggga- aagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggtt- cagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagtagtctgcaacctgaaga- ttttgcaacttactactgtcaacagagtcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa SEQ ID NO: 17 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 18 LCDR1 RTSQSLSSYLH SEQ ID NO: 19 LCDR2 AASSLQS SEQ ID NO: 20 LCDR3 QQSRT Anticorpo 3 (codões otimizados Anticorpo 2) SEQ ID NO: 21 caggtccagctgcaggagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctccaacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccaagtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactgtcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcacctgaaaagtgtgacccctgaggacacagccgtgttctactgcgtcagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggactatggtcaccgtgtcaagc SEQ ID NO: 22 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITVNPDTSKNQFSLHLKSVTPEDTAVFYCVRSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 23 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 24 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 25 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 26 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacctgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtctgcagtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 28 LCDR1 RTSQSLSSYLH SEQ ID NO: 29 LCDR2 AASSLQS SEQ ID NO: 30 LCDR3 QQSRT Anticorpo 4 (cDNA original) de nucleotídeo degenerado em HCDR3, t ou a SEQ ID NO: 31 caggtccagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagagtctctagcaacagtgctgtttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggcctcgagtggctgggaaggacatattacaggtccaaatggtattatgat- tatgcagaatctgtgaaaagtcgaatagttatcgacccagacacatccaagaaccagg- tctccctgcagttgaattctgtgactcccgaggactcggctatatattactgtgcaagagg- tggccacattacggtgtttgggctgaatattgacgcttatgatatttggggccaaggggcaaaggtcaccgtgtcttcag SEQ ID NO: 32 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDRVSSNSAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYYDYAESVKSRIVIDPDTSKNQVSLQLNSVTPEDSAIYYCARGGHITVFGLNI- DAYDIWGQGAKVTVSS SEQ ID NO: 33 HCDR1 SNSAVWN SEQ ID NO: 34 HCDR2 RTYYRSKWYYDYAESVKS SEQ ID NO: 35 HCDR3 GGHITVFGLNIDAYDI SEQ ID NO: 36 gacatccaggtgacccagtctccgtcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac- catctcttgccgggcacagagccttagcagctacttacattggtatcagcagaaaccaggg- caaccccctaaactcctgatctatgctgcaaccactttgcaaagtggggtcccatcacggtt- cagtggtagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagtactttccaagctgaagatg- ttgccacttactattgtcaacagagtcggacgttcggccaagggaccaaggttgaaatcaaac SEQ ID NO: 37 DIQVTQSPSSLSASVGDRVTISCRAQSLSSYLHWYQQKPGQPPKLLIYAATTLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISTFQAEDVATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 38 LCDR1 RAQSLSSYLH SEQ ID NO: 39 LCDR2 AATTLQS SEQ ID NO: 40 LCDR3 QQSRT Anticorpo 5 (forma expressa do Anticorpo 4 HCDR3 V) SEQ ID NO: 41 caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagagtctctagcaacagtgctgtttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggcctcgagtggctgggaaggacatattacaggtccaaatggtattatgat- tatgcagaatctgtgaaaagtcgaatagttatcgacccagacacatccaagaaccagg- tctccctgcagttgaattctgtgactcccgaggactcggctatatattactgtgcaagagg- tggccacattacggtgtttgggctgaatattgacgcttatgatatttggggccaaggggcaatggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 42 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDRVSSNSAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYYDYAESVKSRIVIDPDTSKNQVSLQLNSVTPEDSAIYYCARGGHITVFGLNI- DAYDIWGQGAMVTVSS SEQ ID NO: 43 HCDR1 SNSAVWN SEQ ID NO: 44 HCDR2 RTYYRSKWYYDYAESVKS SEQ ID NO: 45 HCDR3 GGHITVFGLNIDAYDI SEQ ID NO: 46 gacatccagatgacccagtctccgtcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac- catctcttgccgggcacagagccttagcagctacttacattggtatcagcagaaaccaggg- caaccccctaaactcctgatctatgctgcaaccactttgcaaagtggggtcccatcacggtt- cagtggtagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagtactttccaagctgaagatg- ttgccacttactattgtcaacagagtcggacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaac SEQ ID NO: 47 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRAQSLSSYLHWYQQKPGQPPKLLIYAATTLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISTFQAEDVATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 48 LCDR1 RAQSLSSYLH SEQ ID NO: 49 LCDR2 AATTLQS SEQ ID NO: 50 LCDR3 QQSRT Anticorpo 6 (forma expressa do Anticorpo 4 HCDR3 E) SEQ ID NO: 51 caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagagtctctagcaacagtgctgtttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggcctcgagtggctgggaaggacatattacaggtccaaatggtattatgat- tatgcagaatctgtgaaaagtcgaatagttatcgacccagacacatccaagaaccagg- tctccctgcagttgaattctgtgactcccgaggactcggctatatattactgtgcaagagg- tggccacattacggagtttgggctgaatattgacgcttatgatatttggggccaaggggcaatggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 52 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDRVSSNSAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYYDYAESVKSRIVIDPDTSKNQVSLQLNSVTPEDSAIYYCARGGHITEFGLNI- DAYDIWGQGAMVTVSS SEQ ID NO: 53 HCDR1 SNSAVWN SEQ ID NO: 54 HCDR2 RTYYRSKWYYDYAESVKS SEQ ID NO: 55 HCDR3 GGHITEFGLNIDAYDI SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 56 gacatccagatgacccagtctccgtcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac- catctcttgccgggcacagagccttagcagctacttacattggtatcagcagaaaccaggg- caaccccctaaactcctgatctatgctgcaaccactttgcaaagtggggtcccatcacggtt- cagtggtagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagtactttccaagctgaagatg- ttgccacttactattgtcaacagagtcggacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaac SEQ ID NO: 57 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRAQSLSSYLHWYQQKPGQPPKLLIYAATTLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISTFQAEDVATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 58 LCDR1 RAQSLSSYLH SEQ ID NO: 59 LCDR2 AATTLQS SEQ ID NO: 60 LCDR3 QQSRT Anticorpo 7 (cDNA original) SEQ ID NO: 61 caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctccctcac- ctgtgtcatctccggagacactgtctctagcaacagagctacttggaattggatgaggcag- tccccattgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tacgcagtttctgtgaaaagtcgagtagtcatcaacccagacacatccaagaaccaag- tctccctgcagttgaacactgtgactcccgatgactcgggtgtatacttttgtgcaagagg- tggccacatcacggtctttggagtgaatattgacgcttttgacatctggggcctcgggacaaaggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 62 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCVISGDTVSSNRATWNWMRQSPLRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAVSVKSRVVINPDTSKNQVSLQLNTVTPDDSGVYFCARGGHITVFGVNI- DAFDIWGLGTKVTVSS SEQ ID NO: 63 HCDR1 SNRATWN SEQ ID NO: 64 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAVSVKS SEQ ID NO: 65 HCDR3 GGHITVFGVNIDAFDI SEQ ID NO: 66 Anticorpo 8 (forma expressa do Anticorpo 7) SEQ ID NO: 71 caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctccctcac- ctgtgtcatctccggagacactgtctctagcaacagagctacttggaattggatgaggcag- tccccattgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tacgcagtttctgtgaaaagtcgagtagtcatcaacccagacacatccaagaaccaag- tctccctgcagttgaacactgtgactcccgatgactcgggtgtatacttttgtgcaagagg- tggccacatcacggtctttggagtgaatattgacgcttttgacatctggggcctcgggacaaaggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 72 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCVISGDTVSSNRATWNWMRQSPLRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAVSVKSRVVINPDTSKNQVSLQLNTVTPDDSGVYFCARGGHITVFGVNI- DAFDIWGLGTKVTVSS SEQ ID NO: 73 HCDR1 SNRATWN SEQ ID NO: 74 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAVSVKS SEQ ID NO: 75 HCDR3 GGHITVFGVNIDAFDI SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 76 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagttac- catctcttgccgggcaagtcagagacttaatagttatctacattggtatcagcagacacca- gggcaagccccgaagctgctgatctatgcaacgtccactttgcaaagtggggtctcaccaa- gattcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctccaacctgaa- gatgttgcaacttactactgtcaattgagtcggacgttcggccacgggaccaaggtggaaatcaaac SEQ ID NO: 77 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQRLNSYLHWYQQTPGQAPKLLIYAT- STLQSGVSPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQLSRTFGHGTKVEIK SEQ ID NO: 78 LCDR1 RASQRLNSYLH SEQ ID NO: 79 LCDR2 ATSTLQS SEQ ID NO: 80 LCDR3 QLSRT Anticorpo 9 (cDNA original) SEQ ID NO: 81 caagtagagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tatgcagattttctgaaaaggcgaataaccatcaatccagacacatccaacaacgagg- tctccctgcggctgacctctgtgactcccgacgacacggctttgtattactgtgcaagagg- tggccacattacggtgtttggagtgaatattgacgcctttgacgtctggggccaagggacaatggccaccgtctcttcag SEQ ID NO: 82 QVELQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYADFLKRRITINPDTSNNEVSLRLTSVTPDDTALYYCARGGHITVFGVNI- DAFDVWGQGTMATVSS SNSATWN RTYYRSKWYNDYADFLKR GGHITVFGVNIDAFDV SEQ ID NO: 86 gacatccaggtgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagaatcac- catctcttgccggacaagtcagagccttaggagctatttacattggtatcagcaaaaaccagg- gaaagcccctaagctcctgatctatgcttcatccactttacaaagtggggtcccatcaaggtt- cagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatctccaacctgaaga- ttttgcaacttactactgtcaactgagtcggacgttcggccaagggaccaaggttgaaatcaaac SEQ ID NO: 87 DIQVTQSPSSLSASVGDRITISCRTSQSLRSYLHWYQQKPGKAPKLLIYASSTLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQLSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 88 LCDR1 RTSQSLRSYLH SEQ ID NO: 89 LCDR2 ASSTLQS SEQ ID NO: 90 LCDR3 QLSRT Anticorpo 10 (forma expressa do Anticorpo 9) SEQ ID NO: 91 caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcac- ctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcag- tccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataatgat- tatgcagattttctgaaaaggcgaataaccatcaatccagacacatccaacaacgagg- tctccctgcggctgacctctgtgactcccgacgacacggctttgtattactgtgcaagagg- tggccacattacggtgtttggagtgaatattgacgcctttgacgtctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcag SEQ ID NO: 92 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYADFLKRRITINPDTSNNEVSLRLTSVTPDDTALYYCARGGHITVFGVNI- DAFDVWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 93 HCDR1 SNSATWN SEQ ID NO: 94 HCDR2 RTYYRSKWYNDYADFLKR SEQ ID NO: 95 HCDR3 SEQ ID NO: 96 GGHITVFGVNIDAFDV gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagaatcac- catctcttgccggacaagtcagagccttaggagctatttacattggtatcagcaaaaaccagg- gaaagcccctaagctcctgatctatgcttcatccactttacaaagtggggtcccatcaaggtt- cagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatctccaacctgaaga- ttttgcaacttactactgtcaactgagtcggacgttcggccaagggaccaaggtggagatcaaac SEQ ID NO: 97 DIQMTQSPSSLSASVGDRITISCRTSQSLRSYLHWYQQKPGKAPKLLIYASSTLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQLSRTFGQGTKVEIK Anticorpo 11 SEQ ID NO: 101 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctcctacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccgggtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggactatggtcaccgtgtcaagc SEQ ID NO: 102 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 103 HCDR1 SYNAVWN SEQ ID NO: 104 HCDR2 RTYYRSGWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 105 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 106 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacacgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtcggctgtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 107 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRLSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 108 LCDR1 RTSQSLSSYTH SEQ ID NO: 109 LCDR2 AASSRLS SEQ ID NO: 110 LCDR3 QQSRT Anticorpo 12 SEQ ID NO: 111 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctcctacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccgggtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggactatggtcaccgtgtcaagc SEQ ID NO: 112 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 113 HCDR1 SYNAVWN SEQ ID NO: 114 HCDR2 RTYYRSGWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 115 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 116 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacacgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtcgggggtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 117 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 118 LCDR1 RTSQSLSSYTH SEQ ID NO: 119 LCDR2 AASSRGS SEQ ID NO: 120 LCDR3 QQSRT Anticorpo 13 SEQ ID NO: 121 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctcctacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccgggtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggactatggtcaccgtgtcaagc SEQ ID NO: 122 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSYNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSGWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTMVTVSS SEQ ID NO: 123 HCDR1 SYNAVWN SEQ ID NO: 124 HCDR2 RTYYRSGWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 125 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 126 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacgaccactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtcggctgtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYDHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRLSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 128 LCDR1 RTSQSLSSYDH SEQ ID NO: 129 LCDR2 AASSRLS SEQ ID NO: 130 LCDR3 QQSRT Anticorpo 14 SEQ ID NO: 131 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctccaacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccaagtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggaccacagtcaccgtctcctca SEQ ID NO: 132 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 133 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 134 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 135 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 136 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacacgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtcggctgtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 137 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRLSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 138 LCDR1 RTSQSLSSYTH SEQ ID NO: 139 LCDR2 AASSRLS SEQ ID NO: 140 LCDR3 QQSRT Anticorpo 15 SEQ ID NO: 141 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctccaacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccaagtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggaccacagtcaccgtctcctca SEQ ID NO: 142 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 143 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 144 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 145 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 146 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagytcctacacgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtcgggggtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 147 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYTHWYQQKPGKAPKLLIYAASSRGSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 148 LCDR1 RTSQSLSSYTH SEQ ID NO: 149 LCDR2 AASSRGS SEQ ID NO: 150 LCDR3 QQSRT Anticorpo 3-GL SEQ ID NO: 151 caggtccagctgcagcagagcggccccggactggtcaagccttcacagacactgagcctga- catgcgccattagcggagatagcgtgagctccaacaatgccgtgtggaactggatcaggcag- tctccaagtcgaggactggagtggctgggacgaacatactatagatccaagtggtacaatgac- tatgctgaatcagtgaaaagccgaattactatcaaccccgatacctccaagaatcagtt- ctctctgcagctgaacagtgtgacccctgaggacacagccgtgtactactgcgccagaag- cggccatatcaccgtctttggcgtcaatgtggatgctttcgatatgtgggggcaggggaccacagtcaccgtctcctca SEQ ID NO: 152 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNNAVWNWIRQSPSRGLEWL- GRTYYRSKWYNDYAESVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSGHITVFGVNV- DAFDMWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 153 HCDR1 SNNAVWN SEQ ID NO: 154 HCDR2 RTYYRSKWYNDYAESVKS SEQ ID NO: 155 HCDR3 SGHITVFGVNVDAFDM SEQ ID NO: 156 gatattcagatgacccagagcccttccagcctgtccgcttcagtgggggatcgagtgaccat- tacctgccgaaccagccagagcctgagctcctacctgcactggtatcagcagaagcccgg- caaagcccctaagctgctgatctacgccgcttctagtctgcagtccggagtgccaagccgg- ttctccggatctgggagtggaaccgactttaccctgacaatttcaagcctgcagcccgagga- tttcgctacatactactgtcagcagagcagaactttcgggcagggcactaaggtggagatcaaa SEQ ID NO: 157 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSLSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPS- RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 158 LCDR1 RTSQSLSSYLH SEQ ID NO: 159 LCDR2 AASSLQS SEQ ID NO: 160 LCDR3 QQSRT

Claims (15)

1. Anticorpo isolado ou um seu fragmento de ligação capaz de se ligar à hemaglutinina do vírus influenza A e neutralizar pelo menos um subtipo do grupo 1 e pelo menos 1 subtipo do grupo 2 do vírus influenza A, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação compreende uma HCDR1 de SEQ ID NO: 113, HCDR2 de SEQ ID NO: 114, HCDR3 de SEQ ID NO: 115, LCDR1 ou SEQ ID NO: 118, LCDR2 de SEQ ID NO: 119 e LCDR3 da SEQ ID NO: 120.
2. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma VH de SEQ ID NO: 112 e uma VL de SEQ ID NO: 117.
3. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo com enxerto CDR, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um Fv ligado por dissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo de especificidade dupla, e um anticorpo biespecífico.
4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a VH compreende uma estrutura de linha germinal humana VH6-1, a VL compreende uma estrutura de linha germinal humana VK1-39, e combinações das mesmas.
5. Anticorpo ou um seu fragmento de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação compreende uma região Fc.
6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação de acordo com qualquer umas das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação é uma IgG1, IgG2 ou IgG4 ou seus fragmentos.
7. Anticorpo para o vírus influenza A ou um seu fragmento de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação liga um epitopo que é conservado entre um ou mais subtipos do grupo 1 do vírus influenza A selecionado de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 e H16 e um ou mais subtipos do grupo 2 selecionado de H3, H4, H7, H10, H14 e H15.
8. Anticorpo para o vírus influenza A ou um seu fragmento de ligação, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação se liga a um epitopo que está localizado em uma região conservada da haste HA2.
9. Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo ou seu fragmento de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico isolado compreende a SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 116.
10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico isolado como definido na reivindicação 9.
11. Método para a produção de um anticorpo ou seu fragmento de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedeira transgênica de um mamífero compreendendo um ácido nucleico como definido na reivindicação 9 sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou seu fragmento.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o isolamento do anticorpo ou seu fragmento de ligação a partir da cultura de células hos- pedeiras.
13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação como definido qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e compreende ainda His a 25 mM e NaCl a 0,15 M a pH 6,0.
15. Uso de um anticorpo ou seu fragmento de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para a produção de um medicamento para a profilaxia ou tratamento de infecção por influenza A em um sujeito.
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