CN111263659A - 用于蛋白纯化的超分子丝状组装体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于蛋白或肽纯化的新型免疫纤维组合物，以及使用这些组合物的简单且成本有效的方法和系统。在一些实施方案中，免疫纤维包含衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的定制的Z‑33肽，其被用于构建免疫两亲物分子，该免疫两亲物分子在水性溶液中组装成表面具有生物活性表位并且具有肽或蛋白结合能力的免疫纤维。

Description

用于蛋白纯化的超分子丝状组装体
相关申请的引用
本申请要求于2017年8月18日提交的美国临时专利申请第62/547,256号的权益，该临时专利申请在此通过引用并入用于所有目的，如同在本文中全面阐述一样。
以电子形式提交的材料的通过引用的并入
本申请包含已经以ASCII格式经由EFS-Web提交并且在此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2018年8月17日的所述ASCII副本被命名为P14755-02_ST25.txt，并且大小为2,433字节。
发明背景
可以自组装成一维(1D)纳米结构的两亲性肽或肽缀合物由于其重要的生物医学应用在过去二十年中已经被广泛地研究。为了使所得的自组装的纳米结构具有与生物接合的能力，已经将多种生物活性肽并入到分子设计中。然而，挑战仍然是对超分子表面上展示的生物活性肽的二级结构的准确控制，所述二级结构对于生物活性肽的合适功能是必需的。通常，最终的自组装形态由若干相互作用因素决定，所述相互作用因素可以包括疏水相互作用、氢键键合、静电相互作用和π-π堆叠。对于基于肽的1D纳米结构，通常使用β-折叠(β-sheet)基序为所得的组装体的各向异性生长提供分子间氢键键合。α-螺旋肽，蛋白的另一种重要组成并且也是许多重要生物分子相互作用的关键介导物，也已经被用于创建超分子纳米结构，尽管较不频繁。例如，Tirrell及同事已经设计了具有显著的α-螺旋性的圆柱形胶束和蛋白类似物胶束。此外，偶尔报道了通过调节溶剂特性、疏水性尾部或热历史，自组装肽纳米结构在如无规卷曲、α-螺旋和β-折叠的各种各样的结构间的转变。尽管存在这些重要进展，对α-螺旋肽在其超分子组装体中的固有热力学不稳定性和结构不确定性仍然存在担心。
已经表明可以通过烷基链的缀合来稳定α-螺旋二级结构。然而，很少见到通过调节烷基链的数目使一种肽从α-螺旋转变为β-折叠。
这种将生物活性肽直接放置在自组装肽基序的C-末端或N-末端已经成为创建用于特定的生物医学应用的生物活性材料的流行策略。为了调节肽组装体的免疫原性，Collier及同事将自组装肽Q11共价连接至抗原OVA肽，并且发现所得的超分子OVA-Q11纳米纤维(nanofiber)具有增强的免疫原性。迄今为止，文献中已经有许多研究充分地表明，生物活性肽可以被成功地并入到超分子肽纳米结构中，同时维持它们的生物活性。然而，在其中表位必须保持α-螺旋构象才能有生物活性的情况下，在β-折叠形成序列的使用和α-螺旋基序的呈现之间似乎存在间距不相容的问题。
高亲和力抗体结合颗粒和材料在制药工业中迅速受到越来越多的关注，这由对用于生物治疗的单克隆抗体的增加的需求所驱动。蛋白A，一种熟知的抗体结合配体，具有与来自大多数哺乳动物物种(包括人类)的IgG的Fc部分特异性结合的能力。然而，蛋白A的大的尺寸限制了其工业应用，并且因此已经设计并研究了蛋白A的许多合成的和最小化的结构域。蛋白A的Z结构域是首个且最著名的合成结构域，具有59个氨基酸残基，并且当与IgG1结合时Kd为～10nM。为了进一步使蛋白A的Z结构域最小化，设计了双螺旋衍生物Z33，结合亲和力无显著改变(Kd＝43nM)。虽然已经鉴定出高亲和力配体，但是将配体呈现在期望的基质(substrate)上的方式对于抗体纯化工艺同样重要。在制药工业中，抗体纯化主要依靠亲和色谱法，所述亲和色谱法基于具有高选择性的抗体结合配体(例如，蛋白A)的固定，但受到高的色谱介质成本和有限的捕获生产率的影响。直到最近，亲和沉淀才通过使用相对简单的工艺提供有效的纯化和潜在地消除批量生产量(batch throughput)中的瓶颈而成为传统色谱方法的有吸引力的替代方法。
亲和沉淀的典型实例是使用弹性蛋白样蛋白(ELP)融合的Z结构域以通过温度和盐触发的ELP的溶解度转变来使IgG沉淀。然而，细菌表达的ELP的高质量、每个ELP融合配体上有限的结合位点以及抗体在升高的温度的潜在变性促进了寻找呈现抗体结合配体的新的基质的兴趣。
受自组装肽两亲物的精巧的分子设计的启发，本发明人先前描述了将蛋白A模拟肽Z33并入自组装免疫两亲物(IA)中的方式，并且探索了其在自组装状态下与靶抗体的结合能力。使用等温滴定量热术(ITC)研究了自组装的免疫纤维(immunofiber；IF)与治疗性IgG之间的结合亲和力，表明包含IF的Z33维持其高的IgG结合亲和力。
本发明人研究了是否可以将肽片段化并缀合至烷基链以改变片段化的肽的构象结构，并且仍然保持自组装免疫两亲性特性，该特性可以被组合用于有效的蛋白纯化。
发明概述
许多一维(1D)纳米结构通过包含作为核心构建基序(core building motif)的短β-折叠序列的肽或肽缀合物的自组装来构建，该核心构建基序对于促进所得的组装体的定向、各向异性生长的分子间氢键键合是必需的。虽然这种分子设计策略已经导致成功地生产了大量用于与细胞接合的生物活性丝状β-折叠组装体，但联想到与淀粉样蛋白原纤维的潜在毒性相关的担忧已经促进了利用α-螺旋肽的其他超分子工艺策略。
本发明人先前已示出，具有氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:1)的蛋白A模拟肽Z33(包含两个α-螺旋的基序)与直链烃的直接缀合产生了自组装免疫两亲物(2017年3月30日提交的美国临时专利申请第62/478,795号，并且该美国临时专利申请通过引用以其整体并入，如同在本文中全面阐述一样)。结果示出，所得的两亲性肽尽管缺少必需的β-折叠区段，但在生理条件下可以有效地缔合成超分子免疫纤维(IF)，同时保持其天然的α-螺旋构象。等温滴定量热术测量证实，这些自组装免疫纤维可以在pH 7.4以高特异性与免疫球蛋白G(IgG)抗体结合，但是在pH 2.8的洗脱缓冲液中没有发生可检测到的结合。
本发明提供了通过单链或双链烷基化使α-螺旋肽的二级结构在α-螺旋和β-折叠之间转换的分子策略。从衍生自蛋白A的α-螺旋肽Z33分离的两种肽序列片段被设计成充当免疫两亲物(IA)中的亲水性区段。预期的是，这些自组装免疫纤维当在溶液中混合时可以在pH 7.4以高特异性与免疫球蛋白G(IgG)抗体结合。
因此，在一些实施方案中，将蛋白结合肽超分子工程化为自组装免疫纤维对于有效的蛋白纯化是有用的。
根据一种实施方案，本发明提供了包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的免疫两亲物。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有α-螺旋构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有α-螺旋构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有β-折叠构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列的一部分。
根据另一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的免疫纤维组合物，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物。
根据一种实施方案，本发明提供了一种用于纯化蛋白的方法，所述方法包括：使第一pH水平的包含一种或更多种感兴趣的蛋白的溶液与包含一种或更多种免疫两亲物的免疫纤维组合物接触，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物；允许一种或更多种感兴趣的蛋白结合抗体结合肽或其功能部分或片段或衍生物；将溶液的pH水平改变到使抗体结合肽和一种或更多种感兴趣的蛋白的电荷特性和构象发生改变的pH；以及从溶液中提取所释放的一种或更多种感兴趣的蛋白。
根据另外的实施方案，本发明提供了一种免疫纤维组合物，所述免疫纤维组合物包含免疫纤维结合分子，该免疫纤维结合分子包含抗体结合肽，该抗体结合肽在其N-末端处缀合至直链烃链并且缀合至第一间隔物肽，该第一间隔物肽在其C末端处缀合至抗体结合肽，该抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物，并且其中第一间隔物肽包含通用序列XXYYZZ，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，YY是两个具有带正电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且ZZ是两个具有小的中性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且所述免疫纤维组合物还包含免疫纤维间隔物分子，该免疫纤维间隔物分子在其N-末端处具有烃链，所述烃链缀合至肽序列，所述肽序列包含通用序列XXBB，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且其中BB是两个具有带负电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸。
根据另一种实施方案，本发明提供了一种用于制备免疫纤维组合物的方法，所述免疫纤维组合物包含一种或更多种免疫两亲物，该免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物。
附图简述
图1A-图1C.(1A)Z33肽与IgG的Fc部分结合的示意图。(1B)C12-Z33和2C8-Z33的序列。烷基基团和Z33分别用黄色和蓝色阴影区域指示。Z33肽中的两个α-螺旋被加下划线。(1C)R-Z33 IF的自组装和IF与IgG之间的结合的示意图。
图2A-图2F.(2A)C12-Z33的自组装的示意图。(2B)Z33肽和Z33-C12分别在pH 7.4和pH 2.8的归一化CD光谱。C12-Z33在pH 7.4(2C、2D)和pH 2.8(2E、2F)的TEM表征。分别在PBS(pH 7.4)和IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)中以100μM的浓度制备TEM样品。将TEM样品用2wt％乙酸铀酰(uranyl acetate)负染。
图3A-图3D.将100μM C12-Z33在15℃滴定到(3A)pH 7.4的PBS缓冲液和(3B)pH2.8的IgG洗脱缓冲液中的2μM IgG1溶液中的ITC谱。将100μM(3C)Z33和(3D)C12-SZ33在15℃滴定到pH 7.4的PBS中的2μM IgG1中的ITC谱。
图4A-图4E.2C8-Z33的TEM表征：在(4A)pH 7.4的PBS中，直径为16.8±1.5nm，以及在(4B)pH 2.8的IgG洗脱缓冲液中，直径为17.3±1.9nm。TEM样品的制备与C12-Z33的制备相似。(4C)在pH 7.4的PBS中的100μM 2C8-Z33的归一化CD光谱示出了α-螺旋二级结构。将100μM 2C8-Z33滴定到(4D)pH 7.4的PBS缓冲液和(4E)pH 2.8的IgG洗脱缓冲液中的2μMIgG1溶液中的ITC谱。
图5A-图5D.(5A)通过0.6M Na2SO4溶液触发的IF-IgG复合物的沉淀的示意图。(5B)5mM C12-Z33的PBS溶液在(i)添加0.6M Na2SO4之前和(ii)添加0.6M Na2SO4之后的照片，以及具有(iii)5mM C12-Z33、(iv)0.6M Na2SO4以及(v)5mM C12-Z33和0.6M Na2SO4的20μMIgG1的PBS溶液的照片。在(ii)和(v)中观察到沉淀。(5C)C12-Z33和IgG1+C12-Z33复合物在添加0.6M Na2SO4之前和之后的吸收光谱。净IgG1的上清液源自IgG1+C12-Z33的上清液减去C12-Z33的上清液。(5D)2mM C12-SZ33和IgG1+C12-SZ33复合物在添加0.6M Na2SO4之前和之后的吸收光谱。
图6A-图6B.(6A)分别经由用C16和2C8的直接烷基化的基于螺旋1(Helix1)-和螺旋2(Helix2)-的肽两亲物的示例性实施方案的设计示意图。(6B)将IA分子自组装成一维纳米结构的示意图。
图7A-图7B.不同IA的TEM图像。(7A)螺旋1-C16和(7C)C16-螺旋2的TEM图像展示了纳米纤维形态，直径分别为9.5±1.2nm和12.4±1.7nm。(7B)螺旋1-2C8和(7D)2C8-螺旋2的TEM图像展示了纳米带(nanobelt)形态，直径分别为10nm-70nm和22.9±1.5nm。所有样品均在水中以1mM制备(pH 7.4)，并且在成像前老化过夜。将TEM样品用2wt％乙酸铀酰负染。比例尺：200nm。
图8A-图8D.报告物染料尼罗红当与(8A)螺旋1-C16、(8B)C16-螺旋2、(8C)螺旋1-2C8和(8D)2C8-螺旋2一起孵育时的发射光谱，用于确定临界胶束浓度(CMC)值。在此示出的所有光谱均通过发射最大值归一化，并且当缀合物浓度超过CMC时展示出蓝移。每种IA的CMC范围都在图例中加框。单位：μM。
图9A-图9B.pH 7.4的水中的100μM(9A)螺旋1、螺旋1-C16、螺旋1-2C8和(9B)螺旋2、C16-螺旋2、2C8-螺旋2的归一化CD光谱。
图10A-图10B.pH 7.4的水中的不同浓度的(10A)螺旋1-2C8和(10B)螺旋1-C16的归一化CD光谱。浓度的单位为μM。
图11A-图11F.不同IA的TEM图像。(11A)螺旋1-C12和(11B)C12-螺旋2的TEM图像展示了纳米纤维形态，直径分别为12.9±0.9nm和13.9±1.5nm。比例尺：200nm。报告物染料尼罗红当与(11C)螺旋1-C12和(11D)C12-螺旋2一起孵育时的发射光谱，用于确定临界胶束浓度(CMC)值。浓度的单位为μM。pH 7.4的水中的100μM(11E)螺旋1、螺旋1-C8、螺旋1-C12和(11F)螺旋2、C8-螺旋2、C16-螺旋2的归一化CD光谱。
图12.螺旋1、螺旋2和Z33的抗体结合肽序列片段的一些示例性实施方案的化学结构。
图13.螺旋1-C8、螺旋1-C12、螺旋1-C16和螺旋1-2C8的抗体结合肽序列的一些示例性片段的化学结构。
图14.C8-螺旋2、C12-螺旋2、C16-螺旋2和2C8-螺旋2的一些示例性抗体结合肽序列片段的化学结构。
图15A-图15B.报告物染料尼罗红当与(15A)螺旋1-C8和(15B)C8-螺旋2一起孵育时的发射光谱，用于确定临界胶束浓度(CMC)值。在此示出的所有光谱均通过发射最大值归一化。浓度的单位为μM。即使缀合物浓度达到100μM，也未观察到可检测到的峰位移。
图16.pH 7.4的水中的100μM的螺旋1、螺旋2和Z33的归一化CD光谱。
图17.对基于螺旋1和螺旋2的IA的CD光谱的分析。(A)基于螺旋1的分子和(B)基于螺旋2的分子中三种主要二级结构的含量。使用聚赖氨酸基光谱(polylysine basisspectra)的线性组合对从200nm至240nm的CD数据进行拟合，以确定大概的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲肽二级结构。
图18.在去离子水中，ThT染料与100μM的螺旋1和基于螺旋1的肽两亲物的荧光。
图19.(19A)可选择的实施方案的结合分子C12-VVKKGGZ33和间隔物分子C12-VVEE的化学结构。将烷基尾部(橙色)缀合至肽序列的N-末端。两个缬氨酸(VV，红色)促进一维结构的形成。两个谷氨酸(EE，蓝色)被设计作为间隔物分子中的亲水性区段，并且两个赖氨酸(KK，蓝色)被相应地设计用于KK和EE之间的静电相互作用，并且因此诱发结合分子和间隔物分子的交替堆叠。两个甘氨酸(GG，绿色)被设计以进一步分隔Z33与烷基链。(B)C12-VVKKGGZ33与C12-VVEE的共组装的示意图。通过调节结合分子与间隔物分子的摩尔比，可以容易地控制共组装的免疫纤维表面上的结合分子的密度。
图20.(20A)自组装的C12-VVEE、(20B)自组装的C12-VVKKGGZ33的代表性TEM图像。
图21.IgG结合和沉淀产率。(21A)在与摩尔比为5:1、10:1、25:1、50:1和100:1的C12-VVEE和C12-VVKKGGZ33一起孵育并且随后添加1M硫酸铵之后，20μM IgG上清液中的IgG百分比。C12-VVKKGGZ33与IgG的摩尔比：10:2。(21B)在与摩尔比为25:1和50:1的C12-VVEE和C12-VVKKGGZ33一起孵育并且随后添加1M硫酸铵之后，20μM、10μM和5μM IgG上清液中的IgG百分比。C12-VVKKGGZ33与IgG的摩尔比为10:4、10:2和10:1。
发明详述
葡萄球菌蛋白A(SPA)是一种最初发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁中的蛋白。它包含折叠成三螺旋束的五个同源结构域。蛋白A由于其与来自大多数哺乳动物物种(包括人类)的免疫球蛋白G(又称IgG)的Fc-部分特异性结合而在免疫学中发挥重要作用。已经对蛋白A进行了广泛的结构和生物化学研究。编码SPA的首个基因在1984年被克隆、测序和表达，随后是基于蛋白A的许多合成的和最小化的IgG结合结构域。其中Z-58结构域是首个且最著名的合成结构域，其广泛用于亲和色谱法和亲和沉淀。另一个最小化的结合结构域Z-33在1996年开发，分子的功能无显著改变。
根据若干实施方案，本发明提供了用于将抗体结合结构域的氨基酸序列修饰和/或衍生成充当IF的构建单元的免疫两亲物的方法。本文描述了可用于结合IgG抗体或其部分或片段的IF的设计和创建的实例。在生理pH范围的水性溶液中形成IF之后，表面上展示的暴露的生物活性表位(结合位点)能够特异性结合IgG。
根据一种实施方案，本发明提供了包含免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有α-螺旋构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽包含来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:1)或其功能部分或片段或衍生物。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有α-螺旋构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，并且其中免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有β-折叠构象。
根据一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的自组装免疫纤维，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列的一部分。
如本文使用的，术语“抗体结合肽的片段”意指金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的一部分或片段，其具有少于SEQ ID NO:1的33个氨基酸。在一些实施方案中，术语“抗体结合肽的片段”意指Z33肽的一部分，其包含在肽内具有至少一个α-螺旋区域的肽。抗体结合肽的片段还可以包含另外的氨基酸，这些另外的氨基酸可以包含或可以不包含α-螺旋区域。
根据一种实施方案，本发明提供了免疫两亲物，该免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，其中抗体结合肽的片段包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHD(SEQ IDNO:2)并且被称为螺旋1。在一些实施方案中，螺旋1包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDK(SEQID NO:3)。在另一种实施方案中，螺旋1包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDKK(SEQ ID NO:4)。
根据一种实施方案，本发明提供了免疫两亲物，该免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽的片段，其中抗体结合肽的片段包含氨基酸序列PNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQID NO:5)并且被称为螺旋2。在一些实施方案中，螺旋2包含氨基酸序列FPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:6)。
如本文使用的，术语“免疫两亲物”意指可以自发地缔合成被称为“免疫纤维”(IF)的离散的、稳定的超分子纳米结构的分子。通常，本发明的IF可以在约2.8至约7.5之间的pH范围内组装。然而，结合特性也是pH依赖性的。那些带较多正电荷的IF在较高pH溶液的条件下更容易缔合，并且相反地，带负电荷的IF在较低pH的溶液中将更容易缔合。
在一些实施方案中，本发明的免疫两亲物包含缀合至烃链的亲水性肽，所述烃链具有8和22个之间的碳并且该链可以是直链或支链的。考虑到在水性溶液中的溶解度，碳的数目存在上限。亲水性肽增加了纳米结构的水溶性，并且可以通过优选的二级结构形成(例如β折叠、α螺旋、聚脯氨酸II型螺旋、β转角)来促进良好定义的纳米结构架构(architecture)的形成，该良好定义的纳米结构架构包括但不限于圆柱形或球形胶束、中空纳米管、环形体(toroid)、盘和囊泡。
如本文使用的，术语“烃链”与术语“脂肪族链”同义，其是本领域公认的术语并且包括直链、支链和环状的烷烃、烯烃或炔烃。在某些实施方案中，本发明中的脂肪族基团是直链或支链的，并且具有8个-约22个碳原子。
术语“烷基”是本领域公认的，并且其在本文中的使用包括饱和脂肪族基团，包括直链烷基基团和支链烷基基团。
如本文使用的，术语“抗体结合肽”意指具有以高特异性(诸如具有在约10-6M至约10-10M之间的Kd)结合抗体或抗体分子的特定部分(例如Fc部分)的能力的肽。
在一些实施方案中，抗体结合肽是金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的Z33双螺旋衍生肽的亲水性氨基酸序列、或其功能部分或片段或衍生物。
如本文使用的，蛋白A的Z33肽具有氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，抗体结合肽是缀合至直链烃链的蛋白A的Z33肽的片段，其中抗体结合肽的片段包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHD(SEQ ID NO:2)并且被称为螺旋1。在一些实施方案中，螺旋1包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDK(SEQ ID NO:3)。在另一种实施方案中，螺旋1包含氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDKK(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，抗体结合肽是缀合至直链烃链的蛋白A的Z33肽的片段，其中抗体结合肽包含氨基酸序列PNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:5)并且被称为螺旋2。在一些实施方案中，螺旋2包含氨基酸序列FPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:6)。
根据另一种实施方案，本发明提供了包含一种或更多种免疫两亲物的免疫纤维组合物，所述免疫两亲物包含缀合至直链烃链的抗体结合肽，其中抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列、或其功能部分或片段或衍生物。在一些实施方案中，功能部分或片段或衍生物选自由SEQ ID NO:1-6组成的组。
本领域普通技术人员将理解，其他结合肽可以替代Z33肽以结合其他蛋白。例如，可以将链霉亲和素或其功能部分或片段并入免疫两亲物中，并且所得的IF可以被用于结合生物素化的化合物。
术语“氨基酸”包括呈D型或L型的天然α-氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)、以及β-氨基酸、合成的氨基酸和非天然氨基酸的残基。许多类型的氨基酸残基可用于多肽，并且本发明不限于天然的、基因编码的氨基酸。可以用于本文描述的肽的氨基酸的实例可见于例如，Fasman,1989,CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,CRCPress,Inc.和其中引用的参考文献。RSP Amino Acids LLC的网站提供了大量氨基酸残基的另一来源。
本文提及的“衍生物”包括本发明的创造性抗体结合肽的部分(parts)、片段和部分(portions)。衍生物还包含单个或多于一个氨基酸取代、缺失和/或添加。同源物包括来自同一物种的蛇或来自同属或同科的蛇的毒液的在功能上、结构上或立体化学上相似的肽。本发明设想了所有这样的同源物。
类似物和模拟物包括这样的分子，该分子包括包含非天然存在的氨基酸的分子或不包含氨基酸但仍在功能上与肽表现相同的分子。天然产物筛选是用于鉴定类似物和模拟物的一种有用策略。
在肽合成期间并入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体的使用。在表1中示出了本文设想的已知的非天然氨基酸的部分列表。
表1：非天然氨基酸
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本文设想的主题肽的类似物包括对侧链的修饰、在肽合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对肽分子或其类似物施加构象限制的其他方法。
本发明设想的侧链修饰的实例包括氨基基团的修饰，诸如通过与醛反应、随后用NaBH4还原的还原烷基化；用乙酰亚胺酸甲酯(methylacetimidate)的脒化；用乙酸酐的酰化；用氰酸酯的氨基基团的氨甲酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的氨基基团的三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的氨基基团的酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸、随后用NaBH4还原的赖氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)。
精氨酸残基的胍基团可以通过与试剂诸如2,3-丁二酮、苯乙二醛(phenylglyoxal)和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。
羧基基团可以通过经由O-酰基异脲形成进行碳二亚胺活化，随后通过后续衍生化成例如相应的酰胺来修饰。
巯基基团可以通过诸如以下的方法来修饰：用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他被取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯/盐、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其他汞类形成汞衍生物；在碱性pH用氰酸酯进行氨甲酰化。
色氨酸残基可以通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺进行的氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或次磺酰卤进行的吲哚环的烷基化来修饰。另一方面，酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷进行硝化来改变以形成3-硝基酪氨酸衍生物。
组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行的烷基化或用焦碳酸二乙酯进行的N-乙酯基化来实现。
使用同-双官能交联剂诸如具有(CH2)n间隔物基团(其中n＝1至n＝6)的双官能亚胺酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和异-双官能试剂，交联剂可以被用于例如稳定3D构象，所述异-双官能试剂通常包含氨基反应性部分诸如N-羟基琥珀酰亚胺和另一基团特异性反应性部分诸如马来酰亚胺基或二硫代部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。另外，肽可以通过例如并入Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸、在氨基酸的Cα和Cβ原子之间引入双键以及通过引入共价键诸如在N末端和C末端之间、在两个侧链之间或在侧链和N末端或C末端之间形成酰胺键来形成环肽或类似物，在构象上被限制。
如本文使用的，术语“肽”包括长度为从4至100个氨基酸残基、优选地长度为约10至80个残基、更优选地长度为15至65个残基的序列，并且其中一个氨基酸的α-羧基基团通过酰胺键连接至相邻氨基酸的主链(α-或β-)氨基基团。
根据一些实施方案，通常，本发明提供了用于纯化感兴趣的蛋白或肽的方法，所述方法用本发明的免疫纤维，使用免疫沉淀方法来进行，其中蛋白或肽能够被免疫纤维的抗体结合肽部分结合。
根据一种实施方案，本发明提供了用于纯化具有免疫球蛋白分子的Fc部分或其功能部分或片段的肽或蛋白的方法，所述方法包括：使第一pH水平的包含一种或更多种感兴趣的肽或蛋白的溶液与包含一种或更多种免疫两亲物的免疫纤维组合物接触，其中一种或更多种免疫两亲物包含缀合至烃链的Fc结合肽，并且其中Fc结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物；允许一种或更多种感兴趣的蛋白结合Fc结合肽或其功能部分或片段或衍生物；将溶液的pH水平改变到使Fc结合肽的构象改变为不再结合一种或更多种感兴趣的蛋白的构象的pH；以及从溶液中提取所释放的一种或更多种感兴趣的蛋白。
通常，包含Fc的蛋白可以是免疫球蛋白或抗体(例如，IgG型)或包含Fc部分的融合肽或蛋白，其通过以下来纯化：将样品中的蛋白与本发明的免疫纤维在生理pH的水性溶液中混合，以及允许免疫纤维结合感兴趣的蛋白分子的Fc部分。在一些实施方案中，免疫纤维包含蛋白A的Z33部分，并且对IgG分子的Fc部分或包含Fc部分的融合肽或蛋白是特异性的。
根据一些其他实施方案，然后使用多种过滤方法，诸如例如渗滤(diafiltration)、微滤或超滤，将免疫纤维与结合的蛋白分离。
在实施方案中，本发明的免疫纤维组合物包含缀合至直链烃的蛋白A的Z33肽的两个或更多个片段。在实施方案中，用于纯化或结合抗体的方法的免疫纤维可以包含螺旋1肽和螺旋2肽的混合物。例如，该方法可以包括添加一种或更多种具有SEQ ID NO:2-4的肽序列的螺旋1肽及其组合，以及添加一种或更多种具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的肽序列的螺旋2肽及其组合。
在允许免疫纤维结合的时间段后，免疫纤维在溶液中形成免疫纤维-蛋白复合物。然后，可以通过许多已知的分离手段，包括例如盐诱发的沉淀和离心，将所形成的复合物与样品中未结合的纤维和蛋白以及其他组分分离。然后可以将所分离的复合物引入另一种酸性pH的溶液中，在该溶液中免疫纤维失去它们对蛋白的结合亲和力。然后可以通过过滤，诸如渗滤或其他手段将蛋白与解离的免疫纤维分离，并且解离的单体也可以被去除。
设想的是，本发明的免疫纤维可以与其他蛋白纯化方法一起使用，诸如将本发明的免疫纤维共价固定到多孔树脂(诸如珠状琼脂糖)或磁珠上，或固定化基质和免疫沉淀方法的组合。
如本文使用的，术语“样品”意指包含可以使用本发明的免疫纤维结合的感兴趣的抗体的任何样品或溶液或流体。在一些实施方案中，样品可以是生物样品。
根据本发明的一种或更多种实施方案，将理解的是，术语“生物样品”或“生物流体”包括但不限于来自活的或以前活的患者或哺乳动物的任何量的物质。这样的物质包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织、软骨细胞、滑膜巨噬细胞、内皮细胞和皮肤。
在表1中总结了本研究中的IA的所有序列、CMC和二级结构。长的单链和双链烷基化两者都可以导致一维丝(filament)的形成，但是在形态、CMC和二级结构方面不同。已经证明烷基链的长度和数目影响肽缀合物的自组装行为。例如，Jan van Hest及同事发现，与C12或更短的烷基链缀合的GANPNAAG(SEQ ID NO:8)肽未显示出聚集体。然而，在C14缀合物和C16或更长的缀合物中分别发现了纤维状聚集体和管状结构。类似地，如其他研究人员先前报道的，单链烷基化的两亲物的CMC随着烷基链长度的增加而降低，这是由于增强的疏水性促进了IA的聚集。先前已证明烷基链缀合增强了α-螺旋二级结构的稳定性并且增加了缀合形式的含量。报道了在一些形成肽的α-螺旋中生物活性增强。例如，Mayo和Tirell发现SC4肽-两亲物的杀菌活性增加。我们的结果似乎与Forns及同事研究的系统相冲突，在该系统中，16个残基的肽的螺旋度随着烷基链延长而增加。然而，这种差异可能是由未缀合的16个残基的肽中预先存在的α-螺旋结构引起的。Mihara及同事发现，较长的N-末端烷基化的2α-螺旋肽经历了较高的α-至-β转变率，表明由长烷基链促进的β-折叠的形成。
总之，成功设计并合成了两个系列的免疫两亲物。通过IA的不同的分子设计，发现不同的烷基化方式导致了IA分子的若干自组装特性(诸如CMC值、形态和二级结构的组成)的不同。我们的结果清楚地表明，单链和双链烷基化两者都可以导致一维丝的形成。较长的单烷基链能够促进IA分子的聚集，并且增加β-折叠的形成。双链烷基化可以有助于自组装的丝中α-螺旋的形成。然而，不同肽分子之间烷基化的影响存在差异。调节烷基链的长度和数目的这一策略可以被进一步开发并且应用于需要特定二级结构来发挥期望生物活性的其他自组装的功能肽系统。
根据一些实施方案，用于使肽及其片段烷基化的烷基链可以具有长度为2至24个碳的碳长度，包括长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个和24个碳的中间长度。另外，肽或其片段可以具有使肽或其片段烷基化的1至4个烷基链。
本发明的免疫纤维组合物的可选择的实施方案。
本发明人先前的工作示出了自组装C12-Z33免疫纤维的高IgG结合亲和力和潜在的IgG沉淀能力。考虑到免疫纤维中C12-Z33的紧密堆叠，以上描述的第一种免疫纤维设计的一个缺点是，对于具有10nm直径的IgG分子，Z33配体的配体可及性可能是有限的。尽管在免疫纤维表面存在高密度的Z33配体，但认为空间位阻可能会妨碍IgG结合效率和形成用于沉淀的大的组装体的免疫纤维的交联。因此，提供了本发明的免疫纤维组合物的可选择的实施方案。
根据一种或更多种实施方案，通过将结合分子(烷基-XXYYZZ-抗体结合肽)与间隔物分子(烷基-XXBB)组合在共组装的免疫纤维系统中，提供了改进的免疫纤维结合系统，其中第一间隔物肽包含通用序列XXYYZZ，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，YY是两个具有带正电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且ZZ是两个具有小的中性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且所述免疫纤维结合系统还包含免疫纤维间隔物分子，该免疫纤维间隔物分子在其N-末端处具有直链烃链，所述直链烃链缀合至肽序列，该肽序列包含通用序列XXBB，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且其中BB是两个具有带负电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸。
与以上提供的C12-Z33免疫纤维相比，在示例性实施方案中，免疫纤维结合分子包含在碳链和抗体结合肽Z33之间的4-8个之间的氨基酸，并且在一些实施方案中，免疫纤维结合分子包含在碳链和抗体结合肽Z33之间的6个氨基酸残基，所述6个氨基酸残基包含VVKKGG(SEQ ID NO:9)。两个疏水性氨基酸诸如缬氨酸(VV，红色)促进一维结构的形成。两个带正电荷的氨基酸诸如谷氨酸(EE，蓝色)被设计作为间隔物分子中的亲水性区段，并且两个带负电荷的氨基酸诸如赖氨酸(KK，蓝色)被相应地设计用于带正电荷的氨基酸和带负电荷的氨基酸之间的静电相互作用，并且因此诱发结合分子和间隔物免疫纤维分子C12-VVKKGGZ33的交替堆叠。两个中性氨基酸诸如甘氨酸(GG，绿色)被设计以进一步分隔抗体结合肽诸如Z33与烷基链。当将结合分子和间隔物分子溶解在水性溶液中时，预期这两种分子可以均匀地共组装成一维免疫纤维，其中结合配体Z33突出在表面上(图19)。
根据另外的实施方案，本发明提供了免疫纤维组合物，所述免疫纤维组合物包含免疫纤维结合分子，该免疫纤维结合分子包含抗体结合肽，该抗体结合肽在其N-末端处缀合至直链烃链并且缀合至第一间隔物肽，该第一间隔物肽在其C末端处缀合至抗体结合肽，所述抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物，并且其中第一间隔物肽包含通用序列XXYYZZ，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，YY是两个具有带正电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且ZZ是两个具有小的中性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且所述免疫纤维组合物还包含免疫纤维间隔物分子，该免疫纤维间隔物分子在其N-末端处具有直链烃链，所述直链烃链缀合至肽序列，该肽序列包含通用序列XXBB，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且其中BB是两个具有带负电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸。例如，氨基酸序列VVEE(SEQ ID NO:10)可以被用于制备C12-VVEE，作为免疫纤维间隔物肽。
本领域普通技术人员将理解，术语“具有疏水性侧链的氨基酸”意指诸如Ala、Val、Ile、Leu的氨基酸。术语“具有带正电荷的侧链的氨基酸”意指Arg、His和Lys。术语“具有小的中性侧链的氨基酸”意指诸如Gly或Pro的氨基酸。术语“具有带负电荷的侧链的氨基酸”意指诸如Asp或Glu的氨基酸。
本发明的免疫纤维组合物和包含免疫纤维结合分子(烷基-XXYYZZ-抗体结合肽)和间隔物分子(烷基-XXBB)的可选择的免疫纤维结合系统可用于纯化抗体和包含抗体的Fc部分的其他分子或其部分或片段。在一些实施方案中，本发明的免疫纤维组合物可以被用于分离或纯化包含抗体分子的Fc的至少一部分的任何肽或融合蛋白。
从纯化的蛋白中去除最后痕量的杂质通常被称为精制(polishing)。这是下游加工中的一个重要步骤，因为当制品旨在用于研究、诊断以及更重要的治疗应用时，蛋白杂质可能产生不期望的副作用。通常通过使用与先前步骤正交的分离方法来实现精制，最常见的是凝胶渗透色谱法。尽管该技术具有精制有效性，但由于速度低，该技术受分离能力差和生产率不高的影响。可针对给定工艺优化的例如基于阴离子交换或疏水性色谱法的其他方法不能用作通用方法。在一些实施方案中，另外的精制步骤将被用于纯化感兴趣的蛋白。
因此，鉴于上述情况，本发明提供了用于纯化抗体或包含Fc的肽或蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)将包含以上描述的任何免疫纤维组合物的样品溶解在生理pH的水性溶液中并且老化过夜，以使其自组装成IF；b)将包含抗体的样品与IF溶液混合，并且允许IF结合免疫球蛋白分子或包含Fc的肽或蛋白的Fc部分，并且在溶液中形成免疫纤维-Fc免疫球蛋白或免疫纤维-包含Fc的肽或蛋白复合物；c)通过添加盐并且进行离心从溶液中分离免疫纤维-Fc免疫球蛋白或免疫纤维-包含Fc的肽或蛋白复合物；d)使IF与免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白解离，并且收集未结合的免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白。
以下实施例被包括以向本领域普通技术人员提供用于实践本公开主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平，技术人员可以理解，以下实施例意图仅是示例性的，并且可以采用许多变化、修改和改变而不偏离本公开主题的范围。接下来的合成的描述和具体实施例仅意图用于说明的目的，并且不应被解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开内容的化合物。
实施例
材料。所有Fmoc氨基酸和树脂均购自Advanced Automated Peptide ProteinTechnologies(AAPPTEC,Louisville,KY,UXSA)，并且Fmoc-Lys(Fmoc)从Novabiochem(SanDiego,CA,USA)获得。治疗性人类IgG1(IgG1)从Bristol-Myers Squibb(Boston,MA,USA)获得，并且IgG洗脱缓冲液来源于Thermo Fisher Scientific(Rockford,IL,USA)。所有其他试剂均从VWR(Radnor,PA,USA)获得，并且按原样使用而不经进一步纯化。
分子合成。使用类似方法合成了C12-Z33和2C8-Z33免疫两亲物。简而言之，首先使用标准的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相合成方案在Focus XC自动肽合成仪(AAPPTEC,Louisville,KY)上合成Z33肽。然后用相对于Z33肽为4(或8):4:6比例的月桂酸(或辛酸)/HBTU/DIEA将C12(或2C8)烷基链手动地偶联在Z33肽的N-末端(在Fmoc去除之后)，在室温振荡过夜。将其他烷基链手动地偶联在肽的N-末端或赖氨酸(K)的侧链以产生不同的IA，并且在室温振荡过夜。使用在DMF溶液中的20％4-甲基哌啶持续10分钟进行Fmoc去保护，重复一次。在所有情况下，通过茚三酮测试(Anaspec Inc.,Fremont,CA)监测反应的游离胺。使用92.5:5:2.5比例的TFA/TIS/H2O的混合物持续2.5小时从固体支持物上裂解完整的肽。通过旋转蒸发去除过量的TFA，并且添加冷乙醚(diethyl ether)来使粗肽沉淀。通过离心方法，以6000rpm持续3分钟分离沉淀的肽与乙醚。用乙醚另外洗涤肽2次，并且通过离心去除溶液。
具有抗体结合肽的片段的IA的分子合成。使用类似方法合成了肽两亲物。以下我们以螺旋1-C16、螺旋1-2C8、C16-螺旋2和2C8-螺旋2作为实例来示出合成过程。简而言之，首先使用标准的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相合成方案在Focus XC自动肽合成仪(AAPPTEC,Louisville,KY)上合成FNMQQQRRFYEALHDK(螺旋1+Kmtt)(SEQ ID NO:3)和FNMQQQRRFYEALHDKK(螺旋1+Kmtt+Kmtt)(SEQ ID NO:4)肽序列。将K-甲硫基四唑(Kmtt)添加在螺旋1序列的C-末端处用于进一步反应。然后将棕榈酸(C16)或辛酸(2C8)烷基尾部分别手动地偶联在螺旋1+Kmtt和螺旋1+Kmtt+Kmtt中的Kmtt侧链处，以产生螺旋1-C16和螺旋1-2C8，并且在室温振荡过夜。类似地，对于C16-螺旋2和2C8-螺旋2，首先在Focus XC自动肽合成仪上合成PNLNEEQRNAKIKSIRDD(螺旋2)(SEQ ID NO:5)和FPNLNEEQRNAKIKSIRDD(K-Fmoc-螺旋2)(SEQ ID NO:6)肽序列。将K-Fmoc添加在螺旋2序列的N-末端处用于进一步反应。然后将棕榈酸(C16)或辛酸(2C8)烷基尾部分别手动地偶联在螺旋2的N-末端处或K-Fmoc-螺旋2的N-末端和侧链处，以产生螺旋1-C16和螺旋1-2C8，在室温振荡过夜。使用在DMF溶液中的20％4-甲基哌啶持续10分钟进行Fmoc去保护，重复一次。在所有情况下，使用茚三酮测试(Anaspec Inc.,Fremont,CA)测试反应的游离胺。使用92.5:5:2.5比例的TFA/TIS/H2O的混合物持续2.5小时从固体支持物上裂解完整的肽。通过旋转蒸发去除过量的TFA，并且添加冷乙醚来使粗肽沉淀。通过离心方法，以6000rpm持续3分钟来分离沉淀的肽与乙醚。用乙醚再洗涤肽2次，并且通过离心去除溶液。
在配备有级分收集器的Varian ProStar 325型制备型HPLC(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)上，在25℃使用Varian聚合柱(PLRP-S，
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10μm，150×25mm)通过制备型RP-HPLC纯化IA。含有0.1％v/v TFA的水/乙腈梯度被用作洗脱液，流速为20mL/min。监测Z33肽区段在220nm处的吸收峰。将粗材料溶解在20ml的0.1％水性TFA中，并且每次纯化运行用10ml注射来进行。用MALDI-ToF(BrukerAutoflex III MALDI-ToF仪器，Billerica,MA)分析收集的级分，并且将含有期望产物的级分冻干(FreeZone-105℃4.5L冷冻干燥器，Labconco,Kansas City,MO)，并储存在-30℃。
免疫两亲物的自组装和TEM成像。用HFIP预处理具有1mM浓度的免疫两亲物，并且然后溶解在1×PBS或去离子水中，并且在室温老化过夜；将10μL的10倍稀释的样品点在具有400平方目的碳膜铜网格(grid)(来自EMS:Electron Microscopy Sciences)上，并且用滤纸去除过量部分以在网格上留下样品的薄膜。在使样品干燥5分钟后，将10μL的2％乙酸铀酰添加至样品网格，并且在30秒后去除过量部分。使所有样品干燥至少3小时，之后进行TEM成像。
圆二色谱(CD)。在25℃，在Jasco J-710分光偏振计(JASCO,Easton,MD,USA)上使用1mm路径长度的石英UV-Vis吸收池(ThermoFisher Scientific,Pittsburgh,PA,USA)进行自组装的IA样品的CD实验。在实验之前，将样品立即从1mM储备溶液稀释至1×PBS中的100μM。在190nm-280nm的波长范围内收集光谱，作为三次扫描的平均值。获取溶剂的背景光谱，并且将其从样品光谱中减去。将收集的数据相对于样品浓度归一化。
ITC实验。使用高精度VP-ITC滴定量热系统(Microcal Inc.)对C12 IA和2C8 IA进行等温滴定量热术实验。在15℃用在1×PBS中的免疫两亲物滴定IgG1溶液(pH 7.4或2.8)。对于0.1％(1mg/ml)IgG溶液，使用在280nm的1.4的质量消光系数(mass extinctioncoefficient)来计算IgG1浓度。免疫两亲物的浓度通过总氮测定来确定(Anal.Biochem.,61.2(1974):623-627)。每次注射后释放的热通过量热信号的积分获得。与免疫两亲物结合IgG1相关的热通过减去稀释的热来获得。使用MicroCal OriginTM包进行数据分析。
CMC测量。具有片段化的抗体结合肽的Z33片段IA的CMC通过将不同浓度的这些分子与一定量的尼罗红一起孵育来确定。首先通过将染料以50μM溶解在丙酮中制备尼罗红的储备溶液。将10μL储备溶液加载到若干离心管中，在离心管中使溶剂在室温下蒸发，以产生干质量的尼罗红。在去离子水中制备不同浓度的肽溶液，并且然后将相同的体积添加到包含干尼罗红的离心管中并且老化过夜。然后通过Fluorolog荧光仪(Jobin Yvon,Edison,NJ)监测尼罗红的荧光光谱，固定激发波长为560nm；监测580nm-720nm的发射光谱。IA的CMC通过发射最大值的蓝移来确定，而这种转变在孵育的肽超过其CMC值时发生。
硫黄素T(ThT)光谱测定。在去离子水中以50μM制备ThT储备溶液。将100μM具有片段化的抗体结合肽的Z33 IA涡旋，并且与相同体积的ThT储备溶液一起孵育1h。然后通过Fluorolog荧光仪(Jobin Yvon,Edison,NJ)测量荧光强度，激发为440nm(狭缝宽度5nm)，而发射为482nm(狭缝宽度10nm)。
全长Z33免疫两亲物的分子设计。这类两亲性肽缀合物(诸如肽两亲物、肽-聚合物缀合物、肽-药物缀合物等)的构建已经被广泛用于创建多种超分子纳米结构。由亲水性Z33肽序列(FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD)(SEQ ID NO:1)和疏水性烷基链组成的IgG结合免疫两亲物被设计为充当免疫纤维(IF)的构建基序。Z33肽是来自蛋白A的双螺旋衍生物(图1A)，其以高结合亲和力(Kd＝43nM)特异性结合IgG的Fc部分。
经由将月桂酸部分(C12)或两个辛酸部分(2C8)直接缀合至Z33肽的N-末端合成了两种IA，C12-Z33和2C8-Z33(图1B)。如图1C中示出的，预期IA自组装成IF并且特异性结合来自抗体混合物溶液的IgG。还合成了纯的Z33肽，以将Z33分子与包含Z33的IF之间的生物活性进行比较。另一对照分子C12-SZ33是通过将C12缀合至具有加扰序列(scrambledsequence)的Z33的N-末端设计的。所有分子使用自动固相肽合成(SPPS)方法和RP-HPLC来合成和纯化。使用分析型HPLC和质谱法证实了合成的化合物的纯度和预期的分子质量。
实施例2
全长Z33免疫两亲物的分子自组装和表征。可以通过两步操作容易地实现两种IA的自组装。首先，分别将IA在六氟异丙醇(HFIP)中预处理，以消除任何可能影响其溶解度和自组装形态的均一性的预先存在的纳米结构。其次，经由蒸发去除HFIP，随后后续添加去离子水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以达到1mM的终浓度。形成IF，其中烷基区段通过疏水相互作用被捕获在IF的核心中且生物活性Z33序列展示在面向溶剂的壳中(图2A)。在室温老化过夜后，利用透射电子显微镜(TEM)和圆二色谱(CD)来表征所组装的纳米结构的形态。
鉴于pH条件在当前IgG纯化方法中的重要作用，对C12-Z33响应于pH变化的自组装行为进行了评估。中性pH通常被用作结合条件，而酸性pH被用于从蛋白A亲和柱洗脱抗体。为了研究在中性pH和低pH的自组装行为，利用PBS(pH 7.4)和IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)作为C12-Z33自组装的水性环境。通过TEM(图2C至图2F)和CD(图2B)研究了C12-Z33 IF在不同pH的形态。发现在以上提及的两种pH条件下，C12-Z33分子能够良好地溶解并且自组装成纳米纤维。来自100μM C12-Z33溶液的代表性TEM图像揭示，C12-Z33在生理条件和酸性条件两种条件下都自组装成纳米纤维结构，直径为16.0±1.7nm，该值小于完全延伸的肽分子的长度(在β-折叠构象的情况下为约22.5nm)。纳米纤维的长度被示出处于微米级，并且无法被良好控制。
为了进一步了解自组装的结构内的分子堆叠，使用圆二色谱(CD)研究肽二级结构。在C12-Z33中观察到在约222nm(n-π*)和208nm(π-π*)的强烈负信号，表明Z33区段在自组装状态下形成了α-螺旋二级结构，如纯的Z33肽中显示出的。基于IF的CD光谱和测量的直径，合理地推断出肽在堆叠成IF时维持其α-螺旋二级结构。值得注意的是，尽管在PBS溶液或IgG洗脱缓冲液中的C12-Z33的CD光谱仅维持部分α-螺旋信号，但与相同缓冲液中的Z33肽相比，在约222nm和208nm处的两个负峰的椭圆率改变。CD光谱的位移可能是由IF的形成引起的，所述IF的形成可以使Z33区段的分子堆叠从其游离状态改变，并且随后由于结合位点所需的特定构象可能影响Z33区段对IgG的结合亲和力。
实施例3
用于测量IF的结合亲和力的ITC实验。鉴于Z33肽在并入IF后二级结构的构象变化，对了解C12-Z33 IF的形成是否会影响原始Z33肽中存在的IgG结合能力有极大兴趣。为了研究自组装的C12-Z33 IF的结合亲和力，通过等温滴定量热术(ITC)研究了与IgG1结合的热力学特性。ITC已经被广泛用于监测大量蛋白与配体之间的结合事件，其是探索C12-Z33 IF与IgG1之间是否可以发生结合的优异方法。记录在逐步注射期间与结合反应相关的热，并且可以直接获得热力学参数，包括热力学解离常数(Kd)、摩尔焓变(ΔH°)和化学计量(N)。
表2.在15℃，在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中，基于Z33的配体与IgG1的结合的热力学参数。按照配体报告数据。
Figure BDA0002458859870000271
表2.在15℃，在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中，基于Z33的配体与IgG1的结合的热力学参数。按照IgG1报告数据。
Figure BDA0002458859870000272
在典型的ITC实验中，将在PBS缓冲液中的100μM C12-Z33的溶液老化过夜，并且然后在15℃将其注射到pH 7.4的相同缓冲液中的2μM IgG1的溶液中。在图3A中示出了典型的热谱图和结合等温线，并且在表2中总结了按照配体报告的热力学参数。C12-Z33 IF与IgG1结合的ITC结果揭示了特征为650的Kd的焓驱动结合事件。为了进一步比较C12-Z33 IF的结合效率，我们合成了被证明与IgG1紧密结合的Z33肽，其中通过表面等离子体共振测量的Kd为43nM。在15℃，在pH 7.4的PBS中通过ITC测量了Z33肽与IgG1的结合特性，并且在图3C中示出了典型的热谱图和结合等温线。除了提高100倍的亲和力之外，Z33的化学计量为2.3，而C12-Z33的表观化学计量为3.1，这指示在IF中并非所有的C12-Z33都可用于与IgG1分子结合。可以通过将Z33的化学计量除以C12-Z33的化学计量，估计能够与IgG1结合的C12-Z33分子效率为74.2％。
虽然按照配体归一化允许确定结合的表观化学计量，但热力学参数的比较应当在按照每摩尔IgG归一化之后进行，如表2中示出的。Z33与IgG结合的特征为与大的不利熵变相对的大的有利焓变。尽管焓变和熵变的幅度较小，但C12-Z33的结合的热力学特征是相似的。尽管与Z33相比，C12-Z33以较小的不利熵结合，但有利焓的损失甚至更大，这导致结合亲和力总体较低。有利结合焓的总体损失可能是由与IF的破坏(disruption)相关的不利焓引起的。由于IF中的限制，存在与IgG1的有利相互作用受到限制的可能性。还在15℃在IgG洗脱缓冲液(pH 2.8)中进行用C12-Z33滴定IgG1(图3B)，以证明在适合于从IF中洗脱的该低pH，结合亲和力显著较低。
为了排除IF与IgG1之间的非特异性结合，具有加扰Z33肽序列的C12-SZ33被用作阴性对照。这种C12-SZ33 IA示出通过TEM和CD表征的类似的自组装特性和二级结构(数据未示出)。通过在15℃将100μM C12-SZ33 IA注射到pH 7.4的PBS中的2μM IgG1溶液中进行ITC实验，以测量它们的结合能力。图3D中的热谱图和结合等温线表明了IgG1与Z33肽之间的特异性相互作用。
实施例4
为了进一步证明IF功能的普遍性，还研究了双链烷基化IA 2C8-Z33的从自组装特性到与IgG1的结合亲和力(图4A-图4E)。在TEM图像中观察到具有均一直径的纳米级IF，并且通过CD证实了α-螺旋二级结构。根据ITC结果，在15℃，在pH 7.4的PBS中发生了2C8-Z33与IgG1之间的结合，而在pH 2.8的洗脱缓冲液中未发生可检测到的结合。2C8-Z33的结合的表观化学计量为9.1，指示结合效率甚至更低。尽管与C12-Z33相比，2C8-Z33以较不有利的结合焓结合，但熵的贡献是较少的不利的，这导致结合亲和力稍好(表2)。根据以上讨论的结果，我们证明了在表面上展示出的高密度结合位点的情况下，自组装的IF能够维持与IgG1的有利结合能力，如在原始Z33肽中示出的。然而，观察到IF的总体结合亲和力的损失，这起源于焓。有利焓的损失可以通过由于IF中的限制导致的相互作用的损失和与粒子的破坏相关的不利焓的贡献来解释。IF内的分子水平堆叠决定了它们的形态以及功能特性，这可极大地影响它们的生物活性性能。
实施例5
用于免疫球蛋白和其他具有Fc部分的分子的纯化的潜在应用。
组成氨基酸的多样性为自组装肽纳米纤维之间的非共价相互作用(包括氢键键合、π-π堆叠、疏水性折拢(hydrophobic collapse)和静电相互作用)提供了广泛基础。例如，酸性氨基酸和碱性氨基酸的溶解度由离子化程度决定，所述离子化程度是一种依赖于pH和离子强度的特性。因此，可以通过调节pH或添加盐来减少静电排斥、促进聚集以及甚至沉淀来促进带电荷的肽的自组装过程。考虑到Z33肽中展示出的许多带电荷的氨基酸残基，我们的免疫纤维系统的吸引人的优势在于容易地可调节的溶解度。IgG与IF结合之后，通过添加具有高离子强度的盐，IgG-IF复合物具有被沉淀出来的高潜力(图5A)。
因为C12-Z33 IF与IgG1的相对高的结合亲和力，选择C12-Z33 IF来研究使IgG1沉淀的可能性。如图5B(i-ii)中示出的，5mM C12-Z33可以充分溶解在PBS溶液中，但在0.6MNa2SO4的PBS溶液中沉淀。C12-Z33在PBS溶液中的δ电位为-7.61mV，而添加Na2SO4可以屏蔽IF表面上的电荷，并且因此诱发沉淀。对于IgG1，它充分溶解在5mM C12-Z33以及0.6MNa2SO4中。然而，在将20μM IgG1和5mM C12-Z33混合5分钟，随后添加0.6M Na2SO4后，观察到沉淀。为了确定沉淀物的组成，进行了两组平行实验。离心0.6M Na2SO4中的5mM C12-Z33，并且使用紫外-可见(UV-Vis)光谱监测添加Na2SO4之前和之后的上清液在280nm处的吸光度变化。对在0.6M Na2SO4中的5mM C12-Z33与20μM IgG1的混合物进行相同的程序。如图5C中示出的，大多数C12-Z33 IF能够被0.6M Na2SO4沉淀出来。对于IgG1-IF复合物系统，280nm处的吸光度减少至低于IgG1的初始吸光度的水平，指示从溶液中去除了IgG1。更清楚的是，经由从蓝线中减去绿线的值来绘制净IgG1的上清液的吸光度，表明多于60％的IgG1从上清液中去除。目前为止，初步证明了我们的IF充当新的亲和沉淀剂的可能性。
实施例6
具有片段化的抗体结合肽的IA的分子设计。将包含两个α-螺旋的Z33的肽序列(FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD)(SEQ ID NO:1)在D和P之间分离并且烷基化成两个系列的免疫两亲物：1)基于螺旋1(FNMQQQRRFYEALHD)(SEQ ID NO:2)的免疫两亲物；2)基于螺旋2(PNLNEEQRNAKIKSIRDD)(SEQ ID NO:5)的免疫两亲物。我们对分离、烷基化和自组装之后的肽结构中可能的构象变化感兴趣。将C16和2C8烷基链缀合至螺旋1的C-末端和螺旋2的N-末端(图6A)。我们将烷基尾部缀合在螺旋1和螺旋2肽的不同末端的原因是为了维持如Z33肽中显示出的螺旋与其他区段之间的相对位置。IA应在某些条件下缔合，其中烷基区段被捕获在疏水性核心中且肽序列面向水性环境(图6B)。所有分子均使用自动固相肽合成(SPPS)方法和RP-HPLC来合成和纯化。使用分析型HPLC和质谱法证实了合成的化合物的纯度和预期的分子质量。
实施例7
具有片段化的抗体结合肽的IA的分子组装。IA的自组装通过两步操作实现。首先将IA用HFIP预处理，以消除合成和纯化过程期间形成的任何预先存在的纳米结构。然后经由蒸发去除HFIP，随后后续添加去离子水，以获得在pH 7.4的1mM的终浓度，并且老化过夜。为了研究烷基化如何能够影响自组装的IA的形态，对所有IA使用TEM以使组装的形态可视化，并且在图7中示出了100μM IA溶液的代表性TEM图像。图7A和图7C揭示了螺旋1-C16和C16-螺旋2两者都自组装成长纳米纤维结构，直径分别为9.6±1.3nm和12.4±1.7nm。还观察到由于电荷屏蔽，两条或更多条纳米纤维合并在一起形成纳米带。纳米纤维的长度被示出处于微米级，并且无法被良好控制。对于用辛酸(C8)进行的双链烷基化，在相同的条件下，还发现螺旋1-2C8和2C8-螺旋2两者的丝状组装体(图7B和图7D)。然而，这些丝相对较短，在长度上也呈现出较大程度的多分散。另外，观察到直径的变化，其中螺旋1-2C8丝的最小丝具有11.0±1.4nm的直径，而螺旋2-2C8丝的最小丝具有9.3±1.3nm的直径。我们假设大的双链的位阻效应可能在组装体的形态中发挥重要作用。然而，位阻效应对不同的肽两亲物系统的影响不同。Stupp及同事发现，增加烷基链的末端基团的位阻效应倾向于减少超螺旋的螺距(superhelical pitch)。在基于Tat肽的纳米纤维系统中，仅四-C8缀合物能够自组装成丝状纳米结构，并且对于二-C8或单-C8缀合物，则未观察到纳米结构。
实施例8
为了深入了解单链和双链烷基化的具有片段化的抗体结合肽的IA之间的差异，对CMC和二级结构进行了进一步研究。使用尼罗红(一种取决于溶剂极性发出荧光的亲脂性染料)测量不同IA的临界胶束浓度(CMC)值。暴露于疏水环境后的强烈荧光在水性介质中可以被强烈猝灭和红移。当在水性溶液中与不同浓度的IA一起孵育时，尼罗红优先分配到由自组装的纳米结构提供的疏水性核心中，并且当发射最大值发生蓝移时，确定IA的CMC。图8A示出了螺旋1-C16的浓度与尼罗红荧光强度的图。发射最大波长直至0.5μM都主要在660nm处；然后在1μM的浓度，首次出现从660nm至635nm的蓝移，表明CMC值介于两者之间。类似地，C16-螺旋2、螺旋1-2C8和2C8-螺旋2的CMC值可从图8B-图8D获得。与单链烷基化相比，双链烷基化显示出更高的CMC值。2C8-螺旋2示出了比螺旋1-2C8更强的聚集趋势，因为前者具有更低的CMC值范围。
实施例9
烷基化的具有片段化的抗体结合肽的IA的二级结构研究。
为了了解自组装的结构内的分子堆叠，使用圆二色谱(CD)研究肽二级结构。如图9中示出的，螺旋1和螺旋2两者在从Z33中分离之后都失去了α-螺旋结构，并且展示出无规卷曲CD光谱(图16)，这可能是由稳定性的相互依赖性的破坏引起的。螺旋1-C16和C16-螺旋2组装体在约218nm(n-π*跃迁)处显示出强烈的负信号，表明在两种IA中形成了β-折叠二级结构。先前已经证明β-折叠构象在促进良好定义的一维纳米结构的形成中发挥重要作用。有趣的是，在螺旋1-2C8和2C8-螺旋2中观察到在约225nm(n-π*跃迁)和208nm(π-π*跃迁)处的负信号，指示α-螺旋二级结构的存在。使用聚赖氨酸基光谱的线性组合对所得的CD光谱进行拟合，以评估每种二级结构的含量(图17)。β-折叠是螺旋1-C16和C16-螺旋2IA的主要组成部分，而双链烷基化的IA存在α-螺旋为主的二级结构。
实施例10
为了进一步证实自组装的IA中二级结构的组成，使用荧光染料硫黄素-T(ThT)来检查基于螺旋1的IA中β-折叠二级结构的存在，所述硫黄素-T(ThT)在结合至β-折叠表面后其荧光发射大幅增强。如图18中示出的，预孵育的螺旋1和螺旋1-2C8在482nm处的ThT发射与纯ThT溶液的ThT发射相比维持相似或略微增加的水平，意味着在这些IA中不存在显著的β-折叠。相反，在预孵育的螺旋1-C16二者中观察到荧光的显著增加，这对应于通过CD检查的主要的β-折叠二级结构。
人们可能争论，CD信号可能来自游离单体，而不是自组装的丝。为了排除这种可能性，获取了α-螺旋IA(由螺旋1-2C8代表)和β-折叠IA(由螺旋1-C16代表)的稀释溶液的CD光谱。图10A和图10B示出，仅当IA浓度超过相应的CMC值时，CD信号才变得显著和稳定，揭示丝状结构中IA的堆叠是CD信号的主要贡献者。
如从α-螺旋和β-折叠的几何形状已知的，螺旋间轴距离为约
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而β-链的间距为
Figure BDA0002458859870000321
指示与α-螺旋相比，β-折叠的形成需要更紧密的堆叠。已经证明，较长的烷基链倾向于在自组装的纳米结构中更紧密地堆叠并且甚至结晶化，这可以使肽区段更密切接近。对于2C8缀合，应当注意的是，两个C8链以非对称方式缀合至螺旋1和螺旋2。两个C8缀合在螺旋1的C-末端处的两个相邻的赖氨酸上，而对于螺旋2，一个C8缀合在N-末端胺上并且另一个C8缀合在赖氨酸的侧链上。具有非对称结构的烷基链数目的增加可以大幅增加空间位阻并减弱聚集，导致相对大的CMC、松散堆叠和更宽的直径的丝。
实施例11
单烷基链长度的作用。
由于双链烷基化的IA的较松散的堆叠促进α-螺旋组装体的形成和稳定，我们假设缩短单烷基化的链的长度可能具有相同的作用。为了证实这一假设，将两种较短的烷基链(月桂酸，C12；辛酸，C8)分别缀合至螺旋1和螺旋2，并且用TEM和CD对组装体进行表征。对于100μM的最高测试浓度的螺旋1-C8和C8-螺旋2，未观察到良好定义的纳米结构和发射最大跃迁，指示这两种IA在低于该浓度时不能够自组装。螺旋1-C12和C12-螺旋2(图11A和图11B)缔合成长纳米纤维，直径分别为12.2±1.4nm和9.1±1.6nm。应当注意的是，纳米纤维的直径不仅与化学结构的长度有关，而且还与堆叠状态有关。因此，并不令人惊讶的是，我们观察到与C12缀合物相比，C16缀合的IA由于更强的疏水相互作用直径更小，CMC值更低(图11C和图11D)并且堆叠更紧密。在CD光谱中(图11E和图11F)，由于螺旋1-C8和C8-螺旋2两者的聚集能力低，它们示出的CD结果与未缀合的肽示出的CD结果相似。感兴趣的是，β-折叠信号出现在螺旋1-C12的CD光谱中，而在C12-螺旋2中则观察到α-螺旋二级结构，这证实了我们先前的假设。对于单链烷基化，具有较长烷基链的自组装的IA可以诱发相邻IA分子之间的紧密堆叠，并且促进β-折叠的形成，而较短链烷基化的IA中的较松散的堆叠可以为α-螺旋结构提供更多空间。
表3：具有片段化的抗体结合肽的IA的总结
Figure BDA0002458859870000331
实施例12
制备包含免疫纤维结合组合物和免疫纤维间隔组合物的可选择的免疫纤维组合物。
如以上描述的，通过将结合免疫纤维分子(C12-VVKKGGZ33)和间隔物分子(C12-VVEE)组合在共组装的免疫纤维系统中，设计了改进的基于免疫纤维的结合系统(图19A)。与原始设计C12-Z33相比，结合分子在碳链和结合肽Z33之间包含6个另外的氨基酸残基VVKKGG。两个缬氨酸(VV，红色)促进一维结构的形成。两个谷氨酸(EE，蓝色)被设计作为间隔物分子中的亲水性区段，并且两个赖氨酸(KK，蓝色)被相应地设计用于KK和EE之间的静电相互作用，并且因此诱发结合分子和间隔物分子的交替堆叠。两个甘氨酸(GG，绿色)被设计以进一步分隔抗体结合肽(Z33)与烷基链。当将结合分子和间隔物分子溶解在水性溶液中时，这两种分子可以均匀地共组装成一维免疫纤维，结合配体Z33突出在表面上(图19B)。两个Z33配体的距离可以通过调节共组装体的结合分子和间隔物分子的摩尔比来控制。在pH 7.4的PBS中的自组装的C12-VVEE(图20A)和C12-VVEE(图20B)的代表性TEM图像示出了圆柱形纳米纤维结构。图20C示出了10:1摩尔比的C12-VVEE和C12-VVKKGGZ33的共组装的纳米纤维。
实施例13
为了研究新的免疫纤维结合系统的IgG结合和沉淀能力，将100μl期望的免疫纤维溶液与IgG一起孵育(10:1摩尔比的C12-VVKKGGZ33和IgG)半小时，随后添加硫酸铵至1M的终浓度，以触发免疫纤维和IgG的沉淀。当将自组装的C12-VVKKGGZ33与IgG混合时，在添加硫酸铵后未观察到沉淀。有趣的是，包含IgG和10:1摩尔比的共组装的C12-VVEE和C12-VVKKGGZ33的溶液在添加盐后变得浑浊。在将沉淀物离心下来并且分析上清液中的IgG浓度后，约30％IgG从溶液中沉淀出。用在280nm处监测的ProA柱(
Figure BDA0002458859870000341
Protein A-5PW，20μm，35×4.6mm)定量IgG浓度。这一初步结果示出，在溶液中结合分子与IgG的量相同的情况下，间隔物分子的添加在IgG捕获和沉淀中发挥重要作用。使结合分子间隔并且使结合配体Z33突出在免疫纤维的表面提供了较大的配体灵活性和IgG可及性。
实施例14
为了提高共组装的免疫纤维结合系统的IgG结合效率和最佳沉淀条件，将继续优化若干因素，包括结合分子与间隔物分子的比率、结合分子与IgG的比率、盐浓度、结合时间和盐析时间等。首先研究了C12-VVEE与C12-VVKKGGZ33的摩尔比以及C12-VVKKGGZ33的摩尔比，并且在图21中示出了初步结果。在10:2摩尔比的C12VVKKGGZ33与IgG和1M硫酸铵的情况下，测试了5种摩尔比的C12-VVEE与C12-VVKKGGZ33(5:1、10:1、25:1、50:1、100:1)。图21A示出了在盐析和离心后上清液中的IgG百分比。随着C12-VVEE含量的增加，更多IgG从溶液中沉淀出，并且在50:1时达到约75％的最高产率。应当注意，在100:1时沉淀产率的降低可能是由于高浓度导致免疫纤维的溶解度较低所引起的。然后使用在图3B中显示出较好性能的25:1和50:1的免疫纤维系统，将C12-VVKKGGZ33与IgG的摩尔比调节为从10:4、10:2至10:1。如图3B中示出的，这两种免疫纤维系统遵循相同的趋势，即随着C12-VVKKGGZ33与IgG的比率增加，IgG沉淀的产率增加。在最佳条件下，在10:1比率的C12-VVKKGGZ33与IgG的50:1免疫纤维系统中，可以达到99％IgG沉淀产率。这一令人兴奋的结果证实了共组装的免疫纤维具有高的IgG结合和沉淀能力。将对IgG沉淀和回收条件的优化进行更系统性的研究。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用并入，其程度如同每个参考文献被单独和具体地指出通过引用并入并且以其整体在本文中列出一样。
除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求书的上下文中)使用的术语“一(a)”和“一(an)”以及“该/所述(the)”和相似的指示物应被解释为覆盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包含/包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括/包含(including)”和“包含/含有(containing)”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另有指示，否则本文中对值的范围的列举仅旨在作为单独提及落在该范围内的各个单独的值的简写方法，并且每个单独的值都被并入本说明书中，如同所述每个单独的值在本文中被单独地列举一样。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有指示或以其他方式与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释为表示任何未被要求保护的要素对于本发明的实践是必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述之后，这些优选实施方案的变化形式对于本领域普通技术人员来说可变得明显。本发明人预期技术人员视情况使用此类变化形式，并且本发明人预期了本发明以不同于本文具体描述的方式来实践。因此，本发明包括被适用法律许可的在此所附权利要求书中描述的主题的所有修改形式和等同物。此外，除非本文另有指示或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖以上描述的要素的所有可能变化形式的任何组合。
序列表
<110> 约翰霍普金斯科技创投
<120> 用于蛋白纯化的超分子丝状组装体内的α-螺旋肽的保留
<130> P14755-02
<150> 62/547,256
<151> 2017-08-18
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 1
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Pro
1 5 10 15
Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile Arg Asp
20 25 30
Asp
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 2
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 3
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 4
Phe Asn Met Gln Gln Gln Arg Arg Phe Tyr Glu Ala Leu His Asp Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 5
Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile Arg
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 6
Phe Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 7
Lys Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Lys Ile Lys Ser Ile
1 5 10 15
Arg Asp Asp
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 8
Gly Ala Asn Pro Asn Ala Ala Gly
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 9
Val Val Lys Lys Gly Gly
1 5
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成的序列(synthetic sequence)
<400> 10
Val Val Glu Glu
1

Claims (21)

1.一种免疫纤维组合物，所述免疫纤维组合物包含一种或更多种免疫两亲物，其中所述免疫两亲物包含缀合至烃链的抗体结合肽。
2.如权利要求1所述的免疫纤维组合物，其中所述免疫两亲物当在生理pH的水性溶液中时具有α-螺旋构象。
3.如权利要求1所述的免疫纤维组合物，其中所述抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物。
4.如权利要求1所述的免疫纤维组合物，其中所述抗体结合肽具有氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:1)或其功能部分或片段或衍生物。
5.如权利要求3所述的免疫纤维组合物，其中所述抗体结合肽具有选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的亲水性氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的免疫纤维组合物，其中所述烃链的长度为在8和22个碳之间，并且是直链或支链的。
7.如权利要求6所述的免疫纤维组合物，其中所述烃链是直链的。
8.如权利要求7所述的免疫纤维组合物，其中所述烃链的长度在8和12个碳之间。
9.一种免疫纤维组合物，所述免疫纤维组合物包含免疫纤维结合分子，其中所述结合分子包含抗体结合肽，所述抗体结合肽在其N-末端处缀合至烃链并且所述结合肽缀合至第一间隔物肽，所述第一间隔物肽在其C末端处缀合至抗体结合肽，所述抗体结合肽具有金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z33肽的亲水性氨基酸序列或其功能部分或片段或衍生物，并且其中所述第一间隔物肽包含通用氨基酸序列XXYYZZ，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，YY是两个具有带正电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且ZZ是两个具有小的中性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸。
10.如权利要求9所述的免疫纤维组合物，其中所述抗体结合肽具有氨基酸序列FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIRDD(SEQ ID NO:1)或其功能部分或片段或衍生物。
11.如权利要求9所述的免疫纤维组合物，其中所述抗体结合肽具有选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的亲水性氨基酸序列。
12.如权利要求9所述的免疫纤维组合物，其中所述烃链的长度为8个碳。
13.如权利要求9至12中任一项所述的免疫纤维组合物，其中所述具有小的疏水性侧链的氨基酸选自由以下组成的组：Ala、Val、Ile和Leu。
14.如权利要求9至12中任一项所述的免疫纤维组合物，其中所述具有带正电荷的侧链的氨基酸选自由以下组成的组：Arg、His和Lys。
15.如权利要求9至12中任一项所述的免疫纤维组合物，其中所述具有小的中性侧链的氨基酸选自由以下组成的组：Gly和Pro。
16.一种免疫纤维组合物，所述免疫纤维组合物包含间隔物分子，所述间隔物分子在其N-末端处具有烃链，所述烃链缀合至肽序列，所述肽序列包含通用氨基酸序列XXBB，其中XX是两个具有小的疏水性侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸，并且其中BB是两个具有带负电荷的侧链的氨基酸并且可以是相同或不同的氨基酸。
17.如权利要求16所述的免疫纤维组合物，其中所述具有小的疏水性侧链的氨基酸选自由以下组成的组：Ala、Val、Ile和Leu。
18.如权利要求16所述的免疫纤维组合物，其中所述具有带负电荷的侧链的氨基酸选自由以下组成的组：Glu和Asp。
19.一种用于纯化抗体或包含Fc的肽或蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将包含如权利要求1至18中任一项的样品溶解在生理pH的水性溶液中并且老化过夜，以使其自组装成IF；
b)将包含抗体的样品与IF溶液混合，并且允许所述IF结合免疫球蛋白分子或包含Fc的肽或蛋白的Fc部分，并且在溶液中形成免疫纤维-Fc免疫球蛋白或免疫纤维-包含Fc的肽或蛋白复合物；
c)通过添加盐并且进行离心从所述溶液中分离所述免疫纤维-Fc免疫球蛋白或免疫纤维-包含Fc的肽或蛋白复合物；
d)使所述IF与所述免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白解离，并且收集未结合的免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白。
20.如权利要求19所述的方法，其中通过将pH降低至洗脱条件并进行过滤、微滤或超滤来将所述IF与所述免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白分离。
21.如权利要求19或20中任一项所述的方法，其中使用精制步骤进一步纯化所述免疫球蛋白或包含Fc的肽或蛋白。
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