JP2022534138A - Ａｌｔがんの処置 - Google Patents

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Abstract

本発明の開示は、一般的に、テロメア代替伸長(ALT)がんの処置を含む、がん及びがんの処置に関する。本開示は、FANCMの活性又は発現を阻害する工程、例えば、FANCMとRMIとの相互作用及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害して、ALT腫瘍細胞の成長及び/又は増殖を阻害するか、及び/又はATL腫瘍細胞の死を誘発する工程を含む方法を提供する。本方法は、ALT腫瘍と診断されている患者に実施することができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年5月24日に出願されたオーストラリア仮出願第2019901766号;及び2019年5月28日に出願された英国出願第1907518.3号の優先権を主張し、これらはどちらも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、PCT Sequence Listing_TREATMENT OF ALT CANCERS.txt.である。テキストファイルは約305KBであり、これは2020年5月20日に作成されたものであり、本明細書の記載の一部として電子的に提出される。
本発明の開示は、一般的に、がん、及びテロメア代替伸長(ALT)がんの処置を含むがんの処置に関する。
ゲノムの完全性は、正常細胞において部分的にテロメアによって維持される。継続的な細胞分裂を介してテロメアを連続的に短縮化することは、染色体の不安定性を誘発する。複製による不死化はしばしば、テロメアの短縮化を克服することによってがん細胞により達成される。テロメアの短縮化は、がん細胞の大多数を含む不死細胞において、老化又は死を回避するために打ち消さなければならない1。がん細胞の大半において、テロメアの長さは、テロメラーゼによって維持される。ヒトがんのおよそ90%は、逆転写酵素であるテロメラーゼを再活性化した状態であり、それにより新たに合成されたテロメア反復配列が直鎖状染色体の3'末端に付加される2、3。不死がん細胞の約10～15%はテロメラーゼ陰性であり、テロメラーゼとは独立した戦略によってテロメアを補充し、これは、テロメア代替伸長(Alternative Lengthening of Telomeres;ALT)(Bryanら、1995年及びBryanら、1997年)又はALT経路と総称される4。ヒトにおいて、ALTは、骨肉種、脂肪肉腫、膠芽腫、星細胞腫、及び膀胱癌等の間葉系又は上皮起源の腫瘍、加えてインビトロの不死化細胞株で報告されている4～8。
ALTのマーカーとみなされる分子の特徴は、i)異なる染色体末端で不均一な長さを有するテロメア、例えばテロメラーゼ陽性細胞における平均的なテロメアより一層長いテロメア等8;ii)テロメアの長い非コードRNA(IncRNA)TERRAのレベルの上昇9～13;iii)ALT関連PML体(APB)、前骨髄球性白血病タンパク質(PML)を含有する核構造、テロメア因子、例えばTRF1、TRF2及びRAP1、TERRA、並びにDNA修復因子、例えばRAD51、RAD52、複製タンパク質A(RPA)、Brcal、及びBloom(BLM)並びにウェルナーヘリカーゼへの、複数のテロメアのクラスター化11、14～19;iv)二本鎖(ds)、サークル(tサークル)、部分的に一本鎖の(ss)サークル(C及びGサークル)及び直鎖状dsDNAを含む、豊富な染色体外テロメア反復配列(ECTR)20～23;v)X連鎖アルファサラセミア/精神遅滞(ATRX)遺伝子の反復突然変異を含む12。
ALT細胞は、致死又はテロメラーゼ陽性細胞と比較して上昇したDNA傷害のレベルを特徴とし、これは、ALT細胞においてテロメアの複製ストレスが高まったことを示す。これは、テロメアの構造的な完全性における累積的な欠陥が原因である。頻繁な、又は持続的な複製フォークの失速は、DNAにおいてニック及び破断を引き起こすことから、ALTメカニズムは、失速した複製フォークから生じ、これが劣化して二本鎖破断(DSB)を形成し、次いで相同組換え修復経路の参加のための基質を提供し、破断によって誘発されたテロメア合成で終わるという仮説が立てられた。それゆえにALTテロメアは、テロメア保護と、テロメアの傷害と、修復活性との絶妙なバランスを達成し、このバランスの崩壊は、ALTメカニズムを調節不全にする可能性を有する。
ALT細胞では、複数のDNA代謝経路が協働して、テロメアを維持する。細胞周期のG2期では、破断によって誘発された複製(BIR)はALTテロメアにおいて活性であり、テロメアに係留されたDNAエンドヌクレアーゼTRF1-FokIを使用して実験的に誘発されたDSBによって刺激される24、25。ALT BIRは、DNAポリメラーゼデルタの2つの調節サブユニットであるPOLD3及びPOLD4を必要とする24、25。ヒトALT細胞では保存的な有糸分裂DNA合成(MiDAS)も証明された26。ALT MiDASは、複製ストレスによって刺激され、RAD52を必要とする2S。最終的に、APB内でのALTテロメアのクラスター化は、RAD51依存性の長期にわたる動きによって促進され、これはまた、TRF1-FokIによって誘発されたDSBによっても刺激される27。テロメアの動きは、ALT BIR及びMiDASはどちらもRAD51から独立しているにもかかわらず、効率的な相同性検索及びテロメア合成を促進することができる25、26。
全てのこの研究から得られる共通の観念は、テロメア伸長を促進するために、持続的な生理学的傷害はALTテロメアで維持されなければならないことである。これは、APBにおける複製ストレス及びDNA傷害のマーカーの存在と一致する11,14～18。この傷害の誘因は不明瞭なままであるが、候補として、RNA:DNAハイブリッド(Rループ)、G四重鎖及びオンコジーン発現が提唱されていた11、26。このシナリオは、テロメアの傷害レベルはDNA合成ベースの修復を開始させる程度に十分に高いが、細胞死を誘発するほど高すぎない特定の閾値範囲内に維持されることを必然的に伴う。一貫して、TERRAによって形成されたテロメアのRループ(telRループ)及びテロメアのDNAは、ALTテロメアで複製ストレスを活性化し、そのレベルは、エンドリボヌクレアーゼRNアーゼHIによって厳密に制御される11、28。RNアーゼHIが枯渇すると、過剰な複製ストレスは、豊富なテロメア非含有染色体末端(TFE)及びCサークルの増加を迅速に引き起こす。逆に言えば、RNアーゼHIの過剰発現は、進行性のTFE蓄積の原因となり、これは、テロメアDNAの非効率的なデノボ合成に起因する可能性がある11。また、クロマチンサブファミリーA様タンパク質1(SMARCAL1)のDNA傷害シグナル伝達キナーゼATM及びRad3関連(ATR)及びアニーリングヘリカーゼSWI/SNF関連マトリックス結合アクチン依存性調節因子も、ALTテロメアで複製ストレスを制限することが報告された29、30。
ファンコーニ貧血相補群M(FANCM)ATPアーゼ/トランスロカーゼは、ファンコーニ貧血(FA)複合体の成分であり、これは、DNA架橋等の物理的な障害によって、複製フォークが失速したとき効率的なFANCD2ユビキチン化を維持する31。FA複合体とは独立して、FANCMは、複製フォークをリモデリングし、傷害部位にDNA修復因子を補充し、減数分裂乗換えを抑制し、ATRチェックポイント活性化を容易にする32～35。更に、FANCMのATPアーゼ/トランスロカーゼ活性は、インビトロでRNA:DNAハイブリッドを解き、そのRループは、FANCM欠損細胞中にゲノム規模で蓄積する36。
FANCMは、失速した複製フォークの安定化における不可欠な因子である。FANCMは、そのN及びC末端に2つのDNA結合ドメインを含有し、その間に3つの高度に保存された領域(MM1～MM3)がある。MM1ドメインは、DNA鎖間架橋(ICL)修復に必須なマルチサブユニットのユビキチンリガーゼであるFAコア複合体を補充し、一方でMM2ドメインは、BLM-TOP3A-RMI(BTR)のRMI1-RMI2部分複合体と直接結合する。BTR複合体は、BLMヘリカーゼ活性、TOP3A脱連環活性、分枝点移動及び全体的な溶解酵素(dissolvase)活性を含み、FANCM及びBTRは協働して、失速したフォークを後退させ、したがってそれを安定化できることが示唆されている。失速した複製フォークにおけるFANCM保持は、それと機能的なBTR複合体との相互作用に依存するが、FAコア複合体との相互作用には依存しない。
ALT細胞において、FANCMは、テロメアの経路を通る複製フォークの効率的な進行を可能にし、FANCM枯渇は、テロメアの複製ストレスを誘発する17。FANCM枯渇は、ALTテロメアにおけるBLM及びBrcalの蓄積を引き起こし、FANCMとBrcal又はBLMとの同時枯渇は、致死的であることが示されている17。
多くのがん治療剤は、無差別にDNAに傷害を与えることによって作用し、ロバストなDNA修復能力がないがん細胞は、健康な組織では許容される化学療法用量から生き残ることができない。DNA損傷性の化学療法は初期は有効であるが、腫瘍DNA修復経路の再活性化は、処置の失敗や不良な患者の転帰をもたらす可能性がある。ファンコーニ貧血(FA)経路は、一般的に腫瘍形成中に活性化され、FA経路の再活性化又は上方調節は、多くのがんにおいて化学療法耐性との関連が示されてきた。FA経路の適切な実行は、FANCMタンパク質とRMI複合体との相互作用を必要とし、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる突然変異は、細胞をDNA架橋剤に対して感受性にすることができる。FANCM-RMI複合体の形成をブロックする阻害剤が、化学療法剤耐性を獲得した腫瘍を再び感受性にするための治療剤として有用な可能性があるという仮説が立てられている。Voterら、2016年において、このような阻害剤を同定するためのスクリーニングが開発された。しかしながら、これらの阻害剤のALTメカニズムへの作用は、調査されていない。
WO2017/146947において、FANCM及びBLM又はBRCA1の少なくとも一方の枯渇は、ALT細胞において複製ストレスを誘発することができ、これは主としてテロメアで起こり、ALTテロメアにおける複製効率を劇的に低減させることが見出された。しかしながら、ALT活性に対するFANCM枯渇の直接的な作用は、十分に決定されていない。
WO2017/146947 WO/2011/035375 W092/01047
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明らかに、ALTがんを含むがんのための新しい薬剤標的及び改善された処置への必要性がある。
本発明者らは、テロメア代替伸長(ALT)経路を頼る細胞におけるFANCM枯渇が細胞死を誘発することを発見した。本発明者らは、そのRMIとの相互作用によって媒介されるFANCM活性の阻害がALT活性を促進し、この阻害は、ALT細胞の成長及び/又は増殖を阻害することに適用できることを実証した。加えて、本発明者らは、FANCMのATPアーゼ活性の阻害も、ALT細胞の成長及び/又は増殖を阻害することに適用できることを実証した。これらの発見に基づき、本発明者らは、ALT細胞において、FANCMを阻害する、若しくは枯渇させる工程、FANCNのATPアーゼ活性を阻害する工程、及び/又はFANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程を含む、ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する新しい方法、及びALTがんを処置する関連方法を開発した。更に、本発明者らは、FANCMとBLMを同時に阻害することが、FANCM枯渇単独に関連するテロメア機能不全の軽減をもたらすことを見出した。したがって、本明細書に開示される本発明の態様のいずれかの特定の実施形態において、BLM及び/又はBRCA1は、阻害又は枯渇されない。
本発明の第1の態様は、それを必要とする個体におけるALTがんを処置する方法であって、個体におけるファンコーニ貧血相補群M(FANCM)の発現又は活性を低減させる工程を含む、方法を提供する。
本発明の第2の態様は、第1の態様の方法における使用のためのFANCMの発現又は活性を低減させる薬剤を提供する。
本発明の第3の態様は、第1の態様の方法における使用のための医薬の製造におけるFANCMの発現又は活性を低減させる薬剤の使用を提供する。
本発明の第4の態様は、ALTがん細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を誘発する化合物をスクリーニングする方法であって、試験化合物とFANCMとの結合を決定する工程を含む、方法を提供する。
本発明の第5の態様は、ALTがん細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を誘発する化合物をスクリーニングする方法であって、FANCMの発現又は活性に対する試験化合物の作用を決定する工程を含む、方法を提供する。
本発明の第6の態様は、個体におけるがんの、FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤に対する応答性を決定する方法であって、個体からのがん細胞のサンプル中の1つ又は複数のALTがん細胞の存在を決定する工程を含み、サンプル中の1つ又は複数のALTがん細胞の存在が、がんが前記薬剤に応答することを示す、方法を提供する。
前記薬剤に応答すると決定されたがんを有する個体は、第1の態様の方法によって処置されてもよい。
第7の態様において、本発明の開示は、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程を含む、ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する方法を提供する。本方法は、対象におけるALTがんを処置する方法であってもよい。
本明細書に開示される方法のいずれかは、FANCM-RMI相互作用の阻害剤を投与することによって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程を含んでいてもよい。
本明細書に開示される方法は、MM2ドメインにおけるFANCMとRMIとの結合を崩壊させる工程を含んでいてもよい。
本明細書に開示される方法のいずれかは、FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、FANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含んでいてもよい。
本明細書に開示される方法のいずれかは、FANCM-RMI相互作用の阻害剤を投与することによって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を投与することによって、FANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれかは、BLM及び/又はBRCA1を阻害する工程を含んでいなくてもよい。
本明細書に開示される方法は、化学療法剤の同時の、逐次的な、又は別々の投与を更に含んでいてもよい。
代替として、本明細書に開示される方法は、化学療法剤の投与を含んでいなくてもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、化学療法剤の同時の、逐次的な、又は別々の投与を含んでいなくてもよい。例えば、本明細書に開示される方法は、化学療法剤の同時の投与を含んでいなくてもよい。
第8の態様において、本発明の開示は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置について対象を選択する方法であって、対象がALTがんに罹っているかどうかを決定する工程を含み、対象がALTがんに罹っている場合、その対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置について選択される、方法を提供する。
第9の態様において、本発明の開示は、がんに罹っている対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であるかどうかを同定する方法であって、がんが、ALTがんであるかどうかを決定する工程を含み、対象がALTがんに罹っている場合、その対象は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であると同定される、方法を提供する。
第10の態様において、本発明の開示は、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法であって、
対象から採取した細胞における1つ又は複数のテロメアにおけるゲノム不安定性の存在及び/又は程度を決定する工程;及び/又は
対象から採取した細胞におけるALT活性の存在及び/又はレベルを決定する工程
を含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明の開示は、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法であって、対象における、又は対象由来のALT細胞の成長及び/又は生存能を決定する工程を含み、処置の開始後のALT細胞の成長及び/又は生存能の、処置の開始前と比較した低減は、対象が処置に正に応答していることを示す、方法を提供する。これに関して、本明細書に開示されるALT細胞を同定又は検出する方法のいずれかを使用することができる。
第11の態様において、本発明の開示は、ALTがんを処置することにおける使用のためのFANCM-RMI相互作用の阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
第12の態様において、本発明の開示は、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCM-RMI相互作用の阻害剤の使用を提供する。
医薬組成物は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤から本質的になっていてもよい。したがって、医薬は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤から本質的になっていてもよい。
FANCM-RMI相互作用の阻害剤は、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数であり得る。
一実施形態において、阻害剤は、遺伝学的阻害剤である。例えば、遺伝学的阻害剤は、siRNAであり得る。
一実施形態において、阻害剤は、小分子である。例えば、小分子は、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルであり得る。
一実施形態において、阻害剤は、ペプチドである。例えば、ペプチドは、DLFSVTFDLGFC(配列番号49)、DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)及びEDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)からなる群から選択されるペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。一例において、ペプチドは、DLFSVTFDLGFC(配列番号49)と少なくとも90%同一である。別の例において、ペプチドは、DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)と少なくとも90%同一である。別の例において、ペプチドは、EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)と少なくとも90%同一である。
一実施形態において、阻害剤は、タンパク質である。例えば、タンパク質は、不活性化されたFANCMタンパク質又は不活性化されたRMI複合体であり得る。一例において、不活性化されたFANCMタンパク質は、F1232A/F1236A二重置換を含んでいてもよい。
別の例において、タンパク質は、免疫グロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。
第13の態様において、本発明の開示は、ALTがんを処置することにおける使用のためのFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
第14の態様において、本発明の開示は、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の使用を提供する。
医薬組成物は、FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になっていてもよい。したがって、医薬は、FANCMのFANCMのATPアーゼ相互作用の阻害剤から本質的になっていてもよい。
FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤は、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数であり得る。
一実施形態において、阻害剤は、遺伝学的阻害剤である。例えば、遺伝学的阻害剤は、siRNAであり得る。
第15の態様において、本発明の開示は、ALTがんを処置することにおける使用のための、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
第16の態様において、本発明の開示は、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の使用を提供する。
医薬組成物は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になっていてもよい。したがって、医薬は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCM FANCMのATPアーゼ相互作用の阻害剤から本質的になっていてもよい。
FANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤は、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数であり得る。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下でより詳細に記載される。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の開示の特定の態様を更に実証するために含まれる。本開示は、これらの図面の1つ又は複数を、本明細書で示された具体的な実施形態の詳細な説明と合わせて参照することによってよりよく理解することができる。
テロメラーゼ陽性細胞におけるFANCM枯渇を示す図である。(a)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS、IIICF/c、GM847、Saos-2、HeLa、HeLa 1.2.11及びHCT116細胞のウェスタン免疫ブロッティング(siFANCMl又はsiFANCM2)。(b)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS及びHeLa細胞における非テロメア53BP1病巣の定量。散布図のバーは、3つの実験からのn=150個の細胞からの平均±SEMを表す、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。(c)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞における消化されていない(ND)及びHinfI/RsaIで消化した(dig.)DNAの天然及び変性TRF分析。(d)FANCM枯渇あり又はなしのIIICF/c、GM847、Saos-2、HeLa、HeLa 1.2.11及びHCT116細胞におけるCサークルの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを参照サンプル対照に正規化した。エラーバーは、n=3つの実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。FANCM枯渇あり又はなしのIIICF/c、GM847、Saos-2、HeLa、HeLa 1.2.11及びHCT116細胞における(e)APB頻度 及び(f)平均APBテロメア病巣強度のテューキーのボックスプロット。3つの実験から、n=150個の細胞を処置ごとにスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、n.s.=有意ではない、マン-ホイットニー検定。 FANCM枯渇はテロメア機能不全及びALT活性の増加をもたらすことを示す図である。(a)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞における分裂中期スプレッド(分裂中期TIF)でのテロメア(緑色)とγ-H2AX(赤色)の共局在の代表的な画像(左のパネル)。分裂中期TIFは、白色の矢印によって示される。スケールバーは、5μmである。TIFの定量(右のパネル)。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n≧81中期を処置ごとにスコア付けした。**p<0.005、マン-ホイットニー検定。(b)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞の天然及び変性TRF分析。有色の矢印は、パネルcに描写されたテロメアDNA種に対応する。(c)2次元ゲル電気泳動によって分離した示されたテロメア種の移動パターンの概略図(上のパネル)。テロメアのC鎖及びG鎖を検出するための、天然及び変性条件下でハイブリダイズした、FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞の2次元TRF分析(左及び右のパネル)。有色の矢印は、概略図に描写されたテロメアDNA種に対応する。(d)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞のCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルレベルを、スクランブル化した対照の平均に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。(e)FANCMを枯渇させたU-2 OS細胞におけるテロメア(緑色)及びPML(赤色)の共局在(APB)の代表的な画像。APBは、白色の矢印によって示される。スケールバーは、5μmである。細胞ごとの(f)APB頻度及び(g)平均APBテロメア病巣強度のテューキーのボックスプロット。3つの実験から、n≧150個の細胞を処置ごとにスコア付した。*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 FANCM枯渇は新生のテロメアDNAの生成をもたらすことを示す図である。(a)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞におけるTRF2(赤色)及びPOLD3(緑色)共局在の代表的な画像(上のパネル)。共局在は、白色の矢印によって示される。スケールバーは、5μmである。共局在の定量(下のパネル)。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=150個の細胞を処置ごとにスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 FANCM枯渇は新生のテロメアDNAの生成をもたらすことを示す図である。(b)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞におけるBrdU取込み及び免疫沈降後の新生のテロメアのC鎖(上のパネル)及びG鎖(下のパネル)DNAの代表的なドットブロット及び定量。新生のテロメア含量を、インプットされたDNAの連続希釈物に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、**p<0.005、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 FANCM枯渇は新生のテロメアDNAの生成をもたらすことを示す図である。(c)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞におけるテロメア(オレンジ色)、PML(緑色)及びEdU(紫色)の共局在(EdU-APB)の代表的な画像(上のパネル)。スケールバーは、5μmである。共局在の定量(下のパネル)。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n≧122個の非S相細胞を処置ごとにスコア付けした、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 FANCM枯渇は新生のテロメアDNAの生成をもたらすことを示す図である。(d)FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS細胞におけるBrdU取込み及び免疫沈降後のCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、スクランブル化した対照の平均に正規化した。エラーバーは、n=3つの実験からの平均±SEMを表す、**p<0.005、スチューデントのt検定。 FANCMと、POLD3、BLM、RAD51又はRAD52との同時枯渇を示す図である。(a)FANCM(siFANCM2)とPOLD3、BLM、RAD51又はRAD52のいずれかとを同時枯渇させたU-2 OS細胞の代表的なウェスタン免疫ブロッティング。 FANCMと、POLD3、BLM、RAD51又はRAD52との同時枯渇を示す図である。(b)n=3の実験からのPOLD3、BLM、RAD51及びRAD52バンドの濃度測定分析。定量を、まずローディング対照(アクチン又はビンキュリン)に正規化し、次いでスクランブル化した対照に正規化することによって実行した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 FANCMと、POLD3、BLM、RAD51又はRAD52との同時枯渇を示す図である。(c)FANCMとPOLD3、BLM、RAD51又はRAD52のいずれかとを同時枯渇させたU-2 OS細胞の天然及び変性TRF分析。 FANCM枯渇は破断によって誘発されたテロメア合成の増加をもたらすことを示す図である。(a)FANCMとPOLD3、BLM、RAD51又はRAD52のいずれかとを同時枯渇させたU-2 OS細胞におけるCサークルの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、スクランブル化した対照の平均に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。FANCMとPOLD3、BLM、RAD51又はRAD52のいずれかとを同時枯渇させたU-2 OS細胞における(b)APB頻度の定量及び(c)平均APBテロメア病巣強度の定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=150個の細胞を処置ごとにスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。(d)CldU取込み(緑色)の後にスコア付けしたテロメア伸長繊維(赤色)の例(上のパネル)。FANCMとPOLD3、BLM、RAD51又はRAD52のいずれかとを同時枯渇させたU-2 OS細胞におけるテロメア伸長事象の数及び長さの定量(左及び右のパネル)。エラーバーは、3つの実験からのn≧350の繊維の平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。 ALT活性はFANCMの複製フォークのリモデリング性能によって減衰することを示す図である。(a)FANCMドメインの相互作用、突然変異又は欠失の概略図。明確にするために、ドメインは、機能的役割によってカラーコードで示される(下のパネル)。 ALT活性はFANCMの複製フォークのリモデリング性能によって減衰することを示す図である。(b)野生型(FANCM+)又はFANCM突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞における分裂中期TIFの定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n≧110の分裂中期を各突然変異体につきスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 ALT活性はFANCMの複製フォークのリモデリング性能によって減衰することを示す図である。(c)野生型(FANCM+)又はFANCM突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞における脆いテロメアの定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n>100の分裂中期を各突然変異体につきスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 ALT活性はFANCMの複製フォークのリモデリング性能によって減衰することを示す図である。(d)野生型(FANCM+)又はFANCMドメイン突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞におけるCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、ベクター対照の平均に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。 ALT活性はFANCMの複製フォークのリモデリング性能によって減衰することを示す図である。(e)野生型(FANCM+)又はFANCMドメイン突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞におけるテロメア伸長事象(上のパネル)及び伸長事象の長さ(下のパネル)の単一分子分析。エラーバーは、3つの実験からのn≧350の繊維の平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。 FANCM突然変異体の発現及び分析を示す図である。(a)U-2 OS細胞における安定な野生型FANCM(FANCM+)又はFANCM突然変異体過剰発現のウェスタン免疫ブロッティング。NB:CV5.1抗FANCM mAbはMM3領域で結合し、したがってこのバリアントを検出しない。 FANCM突然変異体の発現及び分析を示す図である。(b)野生型(FANCM+)又はFANCM突然変異体を過剰発現するU-2 OS細胞のTRF分析。ゲルを、天然及び変性条件下で、C鎖及びG鎖を検出するための放射標識されたテロメアプローブとハイブリダイズした。 FANCM突然変異体の発現及び分析を示す図である。(c)野生型(FANCM+)又はFANCM突然変異体を過剰発現するU-2 OS細胞におけるAPB頻度(上のパネル)及び平均APBテロメア強度(下のパネル)のテューキーのボックスプロット。3つの実験から、n=150個の細胞をバリアントごとにスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 ALT細胞はFANCM枯渇に対して過敏性であることを示す図である。ヨウ化プロピジウム(PI)で染色された(a)U-2 OS 及び(b)HeLa細胞の細胞周期プロファイル。9,800～10,000のゲーティングした事象を収集した。細胞周期分布を、ジェット-ディーン(Jett-Dean)の近似によって決定した。FANCM枯渇あり又はなしの(c)U-2 OS及び(d)HeLa細胞における分裂間期の期間の生きた細胞の定量(左のパネル)及び有糸分裂開始(右のパネル)。テューキーのボックスプロットは、トランスフェクション後の24時間から72時間モニターされたn=120個の有糸分裂前の細胞及びそれらの娘細胞の定量を表す、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。FANCM枯渇あり又はなしのU-2 OS及びHeLa細胞における(e)有糸分裂の結果 及び(f)有糸分裂期間の生細胞の定量。テューキーのボックスプロットは、3つの実験からのn=120個の有糸分裂前の細胞の定量を表す、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。^は、軸の外側の2つのデータポイントを示す。c～fにおいて、各データセットにつき、分析した細胞の数が示される。 Project Achillesからの517種のがん細胞株のパネルにわたるFANCMの遺伝子依存性スコアを示す図である。FANCMの遺伝子依存性スコア(CERES)をCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーンによって決定した。依存性スコアは、細胞株においてFANCMが必須である可能性を示し、0の依存性スコアは、細胞の生存能にとってFANCMが必須ではないことを示し、-1のスコアは、それが必須であることを示す。全ての517種のがん細胞株にわたるFANCMの依存性スコアのヒストグラム(上のパネル)。疾患型によってグループ分けしたそれぞれ個々の細胞株のFANCMの依存性スコア(下のパネル)。公知のALT細胞株を着色した。 MM2-ER融合タンパク質の特徴付けを示す図である。(a)MM2ペプチドによるFANCM-BTR複合体形成の競合阻害を示す概略図。(b)FANCM-BTR複合体(TOP3A結合)のFlag-FANCM免疫沈降は、Flag-FANCMを発現するHEK-293細胞において、MM2-WTの濃度増加に伴い(1～50μM)減少するが、MM2-FF>AA突然変異ペプチドでは減少しなかった。(c)40HTの存在又は非存在下でMM2-ER又はFF>AA-ER突然変異融合タンパク質を発現するU-2 OS細胞における姉妹染色分体交換(SCE)を示す代表的な有糸分裂スプレッド(左のパネル)。SCEの定量(右のパネル)。(d)40HTの存在又は非存在下でMM2-ER又はFF>AA-ER突然変異融合タンパク質を発現するHeLa細胞における姉妹染色分体交換(SCE)を示す代表的な有糸分裂スプレッド(左のパネル)。SCEの定量(右のパネル)。SCEは、黒色の矢印によって示される。c及びdについて、散布図のバーは、15～30個の有糸分裂スプレッドからのSCEの平均±SEMの数を表す、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。NB:MM2-ER+40HTサンプルにおける二重標識した有糸分裂の頻度は、対照における頻度のおよそ10%であったが、これは、MM2阻害剤の活性化によって導入された顕著な細胞周期遅延に起因する可能性がある。したがって、SCEレベルは、この実験において過小評価される可能性がある。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(a)FANCM-BTR複合体相互作用のMM2-タモキシフェン(40HT)誘導性ER融合タンパク質によって媒介される阻害の概略図。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(b)U-2 OS細胞における40HT活性化後のFANCMからデコイMM2-ER融合タンパク質へのTOP3A及びRMI1の移動を確認する免疫沈降。複合体成分の移動は、FF>AA突然変異MM2-ERタンパク質(FF>AA-ER)では見られない。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(c)40HTの存在又は非存在下でMM2-ER又はFF>AA-ER融合タンパク質を発現するU-2 OS細胞におけるTIFのテューキーのボックスプロット。3つの実験から、n=150個の細胞を処置ごとにスコア付けした、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(d)40HTの存在又は非存在下でMM2-ER又はFF>AA-ER融合タンパク質を発現するU-2 OS細胞におけるCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、誘発されていない対照に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、1標本t検定。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(e)40HTの存在又は非存在下でMM2-ER融合タンパク質を発現するGM847及びHCT116細胞の代表的なコロニー形成アッセイ(上のパネル)。MM2-ER又はFF>AA-ER融合タンパク質を発現するALT(U-2 OS、GM847及びSaos-2)及びテロメラーゼ陽性(HeLa及びHCT116)細胞株のコロニーの生存画分の定量(下のパネル)。コロニー数を、誘発されていない対照に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、**p<0.005、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(f)0.5μMのPIP-199又はビヒクル対照(DMSO)で72時間処置したU-2 OS、GM847、Saos-2、HeLa及びHCT116細胞からのCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを参照サンプル対照に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 FANCM-BTR複合体の阻害はALT細胞の生存能の喪失をもたらすことを示す図である。(g)PIP-199で処置したU-2 OS、GM847、Saos-2、HeLa及びHCT116細胞からのコロニーの生存画分の定量。コロニー数を、DMSO対照に正規化した。^は、可視の軸を超えるデータポイント(1.42)を意味する。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す。*p<0.05、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 PIP-199によるFANCM-BTRの用量依存性阻害を示す図である。(a)11日後のPIP-199で処置したU-2 OS、GM847、Saos-2(ALT)、HeLa及びHCT116(テロメラーゼ陽性)細胞からのコロニーの生存画分の定量。コロニー数を、DMSO対照に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、n.s.=有意ではない、スチューデントのt検定。 PIP-199によるFANCM-BTRの用量依存性阻害を示す図である。(b)72時間後にPIP-199の濃度を増加させることによってFANCM-BLM及びFANCM-RMI1の相互作用の崩壊を確認する、U-2 OS細胞におけるBLM及びRMI1の共免疫沈降反応。 FANCMによって媒介されるALT抑制の提唱されているモデルの概略図である。ALTテロメアにおいて優勢な失速した複製フォークを逆転及びリモデリングするFANCMの機能。FANCMの非存在下で、又はFANCM-BTR複合体の崩壊を介して、失速したフォークが劣化して二本鎖破断を生じ、これが、破断によって誘発されたテロメア合成事象及び併存する新生ECTRの生産のための基質を提供する。 ヨウ化プロピジウム細胞周期分析のために実行されるゲーティング戦略の例を示す図である。SSC-A、FSC-Aサブセットゲーティング、続いてPI-A、PI-Wサブセットゲーティングの擬色プロット(左のパネル)。次いでPI-A、PI-Wサブセットを、ディーン-ジェット(Dean-Jett)細胞周期分析に供した。G0/G1、S及びG2/M期のゲートは、それぞれ緑色、オレンジ色及びシアンで示される(中央のパネル)で示され、関連する統計(右のパネル)及び最良適合の曲線は紫色で示される(中央のパネル)。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(A)抗FANCM siRNA(siFa及びsiFb)又は対照siRNA(siCt)でトランスフェクトされたALT及びTel+細胞におけるFANCMタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。ALT細胞(灰色のバックグラウンド)は、U20S、Hu09、Saos2及びWI-38 VA13(VA13)であり、Tel+細胞は、HeLa、HOS、HT1080(HT10)及びSKNAS(SK)である。タンパク質を、トランスフェクションの48時間後に抽出した。ラミン(Lamin)B1(LMB1)、ゴルギン(Golgin)97及びKAP1は、ローディング対照として役立つ。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(B)ヨウ化プロピジウム(PI)で染色された示されたsiRNAでトランスフェクトされた細胞のFACSプロファイルの例。細胞数(y軸)は、PI強度(X軸)に対してプロットされる。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収した。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(C)Bの場合と同様の実験の定量化。グラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(D)示されたsiRNAでトランスフェクトされた細胞を用いたコロニー形成アッセイの例。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(E)Dの場合と同様の実験の定量化。グラフは、siCtでトランスフェクトされたサンプルに対するコロニー数を示す。バー及びエラーバーは、3つの独立した実験からの平均及びSDである。P値を、両側スチューデントのt検定を用いて計算した。*P<0.05、**p<0.005、***p<0.001。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(F)3日毎に示されたsiRNAでトランスフェクトされたU20S及びHeLa細胞の成長曲線。細胞数は、siCtでトランスフェクトされた細胞に対して表される。データポイント及びエラーバーは、3つの独立した実験からの平均及びSDである。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(G)Flagタグを有するTRF1(FL-TRF1)を発現するレトロウイルス又は空のベクター(ev)対照レトロウイルスで感染させたU20S細胞のウェスタンブロット分析。感染の5日後に、細胞を示されたsiRNAでトランスフェクトし、48時間後に回収した。pS33:セリン33でリン酸化されたRPA32、pRPA32:リン酸化されたRPA32。LMB1及びゴルギンは、ローディング対照として役立つ。 FANCMは正常な細胞周期の進行及びALT細胞の増殖を支持することを示す図である。(H)Gの場合と同様の細胞のFACSプロファイルの例。左のグラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。原始データは、Source Dataファイルとして提供される。 FANCMは、テロメアのDNA傷害を抑制し、ALT細胞においてテロメアに局在する。(A)示された細胞株に実行されたAの場合と同様の実験における核1つ当たりのTIFの数の定量化。ALT細胞は、灰色のバックグラウンド上にある。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも196個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、マン-ホイットニーU検定を用いて計算した。**P<0.005、****P<0.0001。 FANCMは、テロメアのDNA傷害を抑制し、ALT細胞においてテロメアに局在する。(B)テロメアのGリッチ反復又はAlu反復を含む放射標識したオリゴヌクレオチドを使用した示された細胞株における内因性FANCM ChIPのドットブロットハイブリダイゼーション。高コントラストの画像は、Tel+細胞の場合のテロメアのシグナルの可視化を容易にするために示される。In:インプット、Bd:ビーズのみの対照、Ip:抗FANCM免疫沈降。 FANCMは、テロメアのDNA傷害を抑制し、ALT細胞においてテロメアに局在する。(C)Cの場合と同様の実験の定量化。シグナルは、Bd関連シグナルを引いた後の対応するIpサンプルに見出されるInの画分としてグラフ化される。バー及びエラーバーは、3つの独立した実験からの平均及びSDである。 FANCMは、テロメアのDNA傷害を抑制し、ALT細胞においてテロメアに局在する。(D)示されたsiRNAでトランスフェクトされた細胞におけるDNA傷害活性化のウェスタンブロット分析。タンパク質を、トランスフェクションの48時間後に抽出した。抗体特異性を制御するために、カンプトテシン(CPT)で処置したトランスフェクトされていない細胞を含めた。pS824:セリン824でリン酸化されたKAP1、pS345:セリン345でリン酸化されたCHK1。ベータアクチン及びLMB1は、ローディング対照として役立つ。 FANCM枯渇は、分裂間期のU20S細胞におけるテロメアDNAを変更することを示す図である。(A)示した通りにRO-3306でトランスフェクトされ処置されたU20S細胞におけるFANCMタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収した。POLD3、RAD51及びPMLレベルも分析した。ベータアクチン及びLMB1は、ローディング対照として役立つ。 FANCM枯渇は、分裂間期のU20S細胞におけるテロメアDNAを変更することを示す図である。(B)PIで染色されたAの場合と同様の細胞のFACSプロファイルの定量化。グラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。R:RO-3306。 FANCM枯渇は、分裂間期のU20S細胞におけるテロメアDNAを変更することを示す図である。(C)Aの場合と同様の実験における核1つ当たりのテロメアの病巣の数の定量化。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、マン-ホイットニーU検定を用いて計算した。 FANCM枯渇は、分裂間期のU20S細胞におけるテロメアDNAを変更することを示す図である。(D)Cの場合と同様の実験におけるテロメアの病巣領域の領域分布。3D画像はsum投影図であり、個々の核のFISHシグナルの面積を、DAPI染色を使用して測定して、核を同定した(示されていない)。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。テロメアの病巣の面積(ピクセルで)は、5ピクセルの幅の25の区画に入れられ(X軸;数値はビンの中心を示す)、頻度(y軸;%)に対してプロットされる。S:小さい病巣(0～2.5ピクセル)、N:正常な病巣(2.5～57.5ピクセル)、L:大きい病巣(57.6～125.5ピクセル)。可視化を容易にするために、大きい病巣の分布は、より小さいy軸のスケールを使用して右のグラフに表示される。 FANCM枯渇は、分裂間期のU20S細胞におけるテロメアDNAを変更することを示す図である。(E)Cの場合と同様の実験における少なくとも5個の大きい(L)病巣を有する細胞の定量化。P値を、両側スチューデントのt検定を用いて計算した。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.001、****p<0.0001。 FANCM枯渇はALTの特徴を増加させることを示す図である。(A)テロメアDNA FISHと組み合わせたPML又はRAD51免疫染色の定量化実験。RAP1免疫染色と組み合わせたPOLD3免疫染色(緑色);及びテロメアDNA FISHと組み合わせたEdU検出。実験を、示されたsiRNAでトランスフェクトされたU20S細胞に実行し、トランスフェクションの48時間後に回収した。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、マン-ホイットニーU検定を用いて計算した。***p<0.001、****p<0.0001。 FANCMは、ALT細胞においてテロメアのssDNA及びECTRを制限することを示す図である。(A)示されたALT(灰色のバックグラウンド)及びTel+siRNAでトランスフェクトされた細胞のTRF分析。トランスフェクションの48時間後にゲノムDNAを調製し、制限酵素で消化し、天然条件下、ゲル中で、5つのテロメアのGリッチ又はCリッチ反復(それぞれ[TTAGGG]5及び[CCCTAA]5)を含む放射標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。シグナル獲得後、ゲルを変性させ、長い放射標識したテロメアプローブに再びハイブリダイズさせた(Telo2)。ゲルの左側にウェルの位置及び分子量マーカーのkbでのサイズを示す。 FANCMは、ALT細胞においてテロメアのssDNA及びECTRを制限することを示す図である。(B)Aの場合と同様の細胞からの消化したゲノムDNAのドットブロットハイブリダイゼーション。RNアーゼHI(siRH)に対するsiRNAでの対照トランスフェクションも含めた。天然の、又は変性したDNAをまず、放射標識したテロメアのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。シグナル獲得後、膜を変性させ、放射標識したAlu反復オリゴヌクレオチドに再びハイブリダイズさせた(ローディング)。定量化のために(以下の表)、テロメアのシグナルを対応するAluシグナルによって正規化し、siCtでトランスフェクトされたサンプルに対して表した。3つの技術的反復からの平均及びSDが示される。FANCMを枯渇させたALT細胞におけるCリッチなssDNAの蓄積に留意されたい(太い境界線)。 FANCMは、ALT細胞においてテロメアのssDNA及びECTRを制限することを示す図である。(C)トランスフェクションの48時間後に回収された、示されたsiRNAでトランスフェクトされた細胞からのゲノムDNAのCサークルアッセイ分析。生成物をドットブロットし、放射標識したTelo2プローブにハイブリダイズさせた。phi29ポリメラーゼ(Φ29)なしで対照反応を実行した。Tel+細胞は検出可能なシグナルを有していなかったことに留意されたい。下のグラフは、siCt-サンプルに対するCサークルシグナルの定量化を示す。バー及びエラーバーは、3つの独立した実験からの平均及びSDである。P値を、両側スチューデントのt検定を用いて計算した。**P<0.005、***P<0.001、****P<0.0001。 FANCMは、ALT細胞においてテロメアのssDNA及びECTRを制限することを示す図である。(D)Aの場合と同様のsiRNAでトランスフェクトされたU20S細胞からのゲノムDNAの2-Dゲル電気泳動。DNAを変性させ、放射標識したTelo2プローブにハイブリダイズさせた。矢印は、環状DNAに対応するアーチを指す。 BLM枯渇は、FANCM枯渇に関連する表現型を実質的に回避することを示す図である。(A)siFa、抗BLM siRNA(siBl)、及びsiCtでトランスフェクトされたU20S細胞におけるFANCM及びBLMのウェスタンブロット分析。siFaの2つの異なる濃度(5及び20nM)を使用した。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収した。LMB1は、ローディング対照として役立つ。星印は、抗FANCM抗体と交差反応するバンドを示す。 BLM枯渇は、FANCM枯渇に関連する表現型を実質的に回避することを示す図である。(B)PIで染色されたAの場合と同様の細胞のFACSプロファイルの定量化。グラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。 BLM枯渇は、FANCM枯渇に関連する表現型を実質的に回避することを示す図である。(C)Aの場合と同様の細胞を使用したコロニー形成アッセイの例。siFa5:5nMのsiRNA、siFa20:20nMのsiRNA。右側のグラフは、siCtでトランスフェクトされたサンプルに対するコロニー数を示す。バー及びエラーバーは、4つの独立した実験からの平均及びSDである。P値を、二元配置ANOVA、続いてテューキーのHSDを用いて計算した。 BLM枯渇は、FANCM枯渇に関連する表現型を実質的に回避することを示す図である。(D)示されたsiRNA(各20nM)でトランスフェクトされたU20S細胞の3日毎の成長曲線。細胞数は、siCtでトランスフェクトされた細胞に対して表される。データポイント及びエラーバーは、3つの独立した実験からの平均及びSDである。SiCt及びsiFa曲線は、図1Fに示されるものと同じである。 BLM枯渇は、FANCM枯渇に関連する表現型を実質的に回避することを示す図である。(E)Aの場合と同様の細胞における核1つ当たりのpS33 TIFの数の定量化。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、二元配置ANOVA、続いてテューキーのHSDを用いて計算した。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.001、****P<0.0001。 FANCMは、ALT細胞においてTERRA及びtelRループを制限することを示す図である。(A)siRNAトランスフェクションの48時間後に回収したU20S細胞からのRNAを使用したTERRAノーザンブロット。分子量マーカーのサイズは左側である。下の数値は、対応するtRNAシグナルを介して正規化したTERRAシグナルの定量化であり、siCtサンプルに対して表される。 FANCMは、ALT細胞においてTERRA及びtelRループを制限することを示す図である。(B)インビトロでどのようにtelRループを生成し巻き戻すかの概略図。右側のゲルは、telRループプラスミド(1nM)及び精製した組換えFANCM-FAAP24(2.5nM)を用いて実行されるtelRループ巻き戻しアッセイの例である。FANCMは、反応にATPが含まれる場合のみtelRループを巻き戻すことに留意されたい。 FANCMは、ALT細胞においてTERRA及びtelRループを制限することを示す図である。(C)放射標識したGリッチなテロメアのオリゴヌクレオチドを使用したAの場合と同様のU20S細胞におけるDRIPのドットブロットハイブリダイゼーション。シグナル獲得後、膜を変性させ、放射標識したAlu反復オリゴヌクレオチドに再びハイブリダイズさせた。In:インプット、Bd:ビーズのみの対照、Ip:S9.6免疫沈降。シグナルは、Bd関連シグナルを引いた後の対応するIpサンプルに見出されるInの画分として右側にグラフ化される。Aluシグナルは、定量化に含まれない。バー及びエラーバーは、4つの独立した実験からの平均及びSDである。P値を、両側スチューデントのt検定を用いて計算した。 FANCMは、ALT細胞においてTERRA及びtelRループを制限することを示す図である。(D)天然FISHについてのプロトコールの概略図。同じプロトコールが置き換えループを欠くRNA:DNAハイブリッドで結合するCリッチなDNAの検出も許容するため、置き換えられたDNA鎖は、点線で示される。 FANCMは、ALT細胞においてTERRA及びtelRループを制限することを示す図である。(E)Dの場合と同様の実験の定量化。3D画像はsum投影図であり、FISHシグナルの統合された強度を、DAPI染色(示されていない)によって同定された個々の核内で測定し、バックグラウンドを引いた。各ドットは、個々の核を表す。合計100～120個の核を各サンプルにつき分析した。1つの代表的な実験が示される。バーは、平均である。P値を、マン-ホイットニーU検定を用いて計算した。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.001、****P<0.0001。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(A)V5エピトープタグを有するFANCMバリアントを発現するレトロウイルス又は空のベクター(ev)対照レトロウイルスで感染させたU20S細胞のウェスタンブロット分析。WT:野生型、K117R:ATPアーゼ/トランスロカーゼ不活性化(dead)FANCM。感染の5日後に細胞を示されたsiRNAでトランスフェクトし、48時間後に回収した。LMB1は、ローディング対照として役立つ。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(B)PIで染色されたAの場合と同様の細胞のFACSプロファイルの定量化。グラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(C)Aの場合と同様の細胞における核1つ当たりのpS33 TIF及びAPBの数の定量化。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、二元配置ANOVA、続いてテューキーのHSDを用いて計算した。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(D)MYCエピトープタグを有するRNアーゼH1(RH1)バリアントを発現するレトロウイルス又はev対照レトロウイルスで感染させたU20S細胞のウェスタンブロット分析。D145A:エンドリボヌクレアーゼ不活性化RNアーゼH1。感染の5日後に細胞を示されたsiRNAでトランスフェクトし、48時間後に回収した。siF/B:組み合わされたsiFa及びsiBl。LMB1は、ローディング対照として役立つ。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(E)PIで染色されたDの場合と同様の細胞のFACSプロファイルの定量化。グラフは、1つの代表的な実験からのG1、S及びG2/M期における細胞のパーセンテージを示す。 脱調節されたtelRループは、ALT細胞においてFANCM枯渇のときに生じる複製ストレスに寄与することを示す図である。(F)Dの場合と同様の細胞における核1つ当たりのpS33 TIFの数の定量化。各ドットは、個々の核を表す。3つの独立した実験からの合計少なくとも300個の核を各サンプルにつき分析した。バー及びエラーバーは、平均及びSDである。P値を、二元配置ANOVA、続いてテューキーのHSDを用いて計算した。D145AとevとWTとの比較は示されない。*P<0.05、***P<0.001、****P<0.0001。 FANCMのMM2ドメイン(FF>AA)とトランスロカーゼドメイン(K117R)の両方が突然変異したALT表現型抑制における欠陥が、二重突然変異(DM)FANCMの過剰発現によって悪化することを示す図である。(a)野生型(WT)又はFANCMドメイン突然変異体(K117R、FF>AA;DM)を安定して過剰発現するU-2 OS細胞におけるCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、空のベクター対照(EV)の平均に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す。*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。(b)野生型(WT)又はFANCM突然変異体を過剰発現するU-2 OS細胞におけるAPB頻度の定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=150個の細胞を各突然変異体につきスコア付けした、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。(c)野生型(WT)又はFANCM突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞における分裂中期TIFの定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=120個の分裂中期を各突然変異体につきスコア付けした。*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。全ての統計の比較は、EV対照に対してなされる。
配列表の記号表
配列番号1 参照ヒトテロメラーゼタンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号O14746)。
配列番号2 参照ヒトFANCMタンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号Q8IYD8)。
配列番号3 参照ヒトRMI1タンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号Q9H9A7)。
配列番号4 参照ヒトRMI2タンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号Q96E14)。
配列番号5 参照ヒトMM2タンパク質ドメインのアミノ酸配列。
配列番号6 参照ヒトBLMタンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号P54132)。
配列番号7 参照ヒトTOP3Aタンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号Q13472)。
配列番号8 参照ヒトBRCA1タンパク質のアミノ酸配列(Uniprot受託番号P38398)。
配列番号9 参照ヒトFANCM配列のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NM_020937.1)。
配列番号10 参照ヒトRMI1配列のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NM_001358291.1)。
配列番号11 参照ヒトRMI2配列のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NM_152308.3)。
配列番号12 FANCM1 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号13 FANCM2 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号14 POLD3 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号15 BLM siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号16 RAD51 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号17 RAD52 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号18 RMI1 siRNAのヌクレオチド配列。
配列番号19 突然変異ヒトFANCMタンパク質(PIP)のアミノ酸配列。
配列番号20 突然変異ヒトFANCMタンパク質(K117R)のアミノ酸配列。
配列番号21 突然変異ヒトFANCMタンパク質(MID)のアミノ酸配列。
配列番号22 突然変異ヒトFANCMタンパク質(S1045A)のアミノ酸配列。
配列番号23 突然変異ヒトFANCMタンパク質(ΔMM1)のアミノ酸配列。
配列番号24 突然変異ヒトFANCMタンパク質(ΔMM2)のアミノ酸配列。
配列番号25 突然変異ヒトFANCMタンパク質(FF>AA)のアミノ酸配列。
配列番号26 突然変異ヒトFANCMタンパク質(ΔMM3)のアミノ酸配列。
配列番号27 突然変異ヒトFANCMタンパク質(ΔERCC4)のアミノ酸配列。
配列番号28 突然変異ヒトFANCMタンパク質(ΔHhH)のアミノ酸配列。
配列番号29 野生型ヒトFANCM MM2ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号30 突然変異ヒトFANCM MM2ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号31 参照ヒトFANCMタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号32 参照ヒトFANCMコード配列のヌクレオチド配列。
配列番号33 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siFa)のヌクレオチド配列。
配列番号34 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siFb)のヌクレオチド配列。
配列番号35 二重突然変異ヒトFANCMタンパク質(K117R及びFF>AA)のアミノ酸配列。
配列番号36 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siBl)のヌクレオチド配列。
配列番号37 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siATRXa)のヌクレオチド配列。
配列番号38 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siATRXb)のヌクレオチド配列。
配列番号39 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siTRF1)のヌクレオチド配列。
配列番号40 ヒトFANCMの抑制に関するsiRNA分子(siRNアーゼH1)のヌクレオチド配列。
一般的な技術及び定義
別段の具体的な規定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、当分野(例えばゲノミクス、免疫学、分子生物学、免疫組織化学、生化学、腫瘍学、及び薬理学)における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
本発明の開示は、別段の指定がない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の従来の技術を使用して実行される。このような手順は、例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、New York、第4版(2012)、第I巻、第II巻、及び第III巻の全体; DNA Cloning: A Practical Approach、第I巻及び第II巻(D. N. Glover、第2版、1995)、IRL Press、Oxford、テキスト全体; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait編、1984) IRL Press、Oxford、テキスト全体、及び特にそこに記載されたGaitによる論文、1～22頁; Atkinsonら、35～81頁; Sproatら、83～115頁;及びWuら、135～151頁; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins編、1985) IRL Press、Oxford、テキスト全体; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press、Oxford、テキスト全体; Perbal, B.、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)及びMethods In Enzymology (S. Colowick及びN. Kaplan編、Academic Press, Inc.)、シリーズ全体に記載される。
当業者は、本発明の開示は、特に記載されたもの以外のバリエーション及び改変も許容できることを理解しているであろう。本開示は全てのこのようなバリエーション及び改変を含むことが理解されるであろう。本開示はまた、本明細書で個々に、又は集合的に言及されるか又は示された工程、特徴、組成物及び化合物の全て、並びに前記工程又は特徴のいずれか2つ以上のいずれか及び全ての組合せも含む。
本発明の開示は、本明細書に記載される具体的な実施形態による範囲に限定されず、これらは、単に例証の目的のために意図される。機能的に同等な生成物、組成物及び方法は明らかに、本明細書に記載される通り、本開示の範囲内である。
本発明の開示のあらゆる特定の態様又は実施形態の各特徴は、必要な変更を加えて本発明の開示の他のあらゆる態様又は実施形態に適用することができる。
本明細書にわたり、特に別段の規定がない限り、又は文脈上そうではないことが求められない限り、単一の工程、物質の組成物、工程のグループ又は物質の組成物のグループへの言及は、それらの工程、物質の組成物、工程のグループ又は物質の組成物のグループの1つ及び複数(すなわち1つ又は複数)を包含すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「and」及び「the」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、これらの語の複数形を含む。
用語「及び/又は」、例えば、「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味の明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
用語「及び/又は」は、本明細書において使用される場合、2つの特定された特徴又は成分のそれぞれが、他方を伴うか又は伴わないかの具体的な開示として解釈されるものとする。例えば「A及び/又はB」は、それぞれが本明細書において個々に記載されたかのように、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。
本明細書にわたり、言葉「含む(comprise)」又は「含む(comprises)」又は「含むこと」等の変化形は、述べられた要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程のグループの包含を必然的に伴うが、他のあらゆる要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程のグループは排除しないことが理解されるであろう。
ALT細胞及びALTがん
本発明の開示は、ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する方法を提供する。これに関して、本発明者らは、驚くべきことに、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程が、ALT細胞に対して選択的に毒性であることを示した。この開示はまた、ALTがん細胞におけるFANCMの発現又は活性の低減又は排除が、G2/Mの停止及び細胞死を誘発するという発見にも関する。したがって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる方法、及びFANCMの発現又は活性を低減させるか又は阻害する方法は、例えばALTがんの処置において使用することができる。
がん細胞は、無制限の増殖を達成するために、そのテロメアを維持しなければならない。がんの大部分(85～90%)が、テロメラーゼを再活性化することによってこれを達成する(テロメラーゼ陽性細胞)。テロメラーゼは、RNAテンプレートからテロメアDNAを合成することに関与する逆転写酵素である。テロメラーゼの配列は、公共的に利用可能である。例示的な配列は、配列番号1に記載される。腫瘍細胞の残りの10～15%は、成長の中断を回避するために、代替メカニズムによってその染色体末端を安定化させなければならない。これらのテロメラーゼとは独立した戦略は、総称してテロメア代替伸長(ALT)として公知である。したがって、本明細書において定義されるようなALT細胞は、活性なALTメカニズムを呈示する細胞であり得る。ALTメカニズムは、テロメラーゼを頼らないテロメア安定化のあらゆるメカニズムであり得る。ALTメカニズムは必ずしも、テロメアを維持するためにALTが細胞で作動する可能性があるいずれか1つの具体的なメカニズムに限定されない。したがって、「ALTメカニズム」は、必ずしもALTメカニズムが作動する1つの具体的な生化学的なメカニズム又は経路のみを指すとは限らない。ALTが作動する1つより多くの具体的な経路が存在し得る。
したがって、ALT細胞は、そのテロメアの長さを維持するためにテロメラーゼ活性を頼らないあらゆる細胞であり得る。代替として、又は加えて、ALT細胞は、そのテロメアの安定性を維持するためにテロメラーゼ活性を頼らないあらゆる細胞とみなされる場合がある。したがって、ALT細胞は、テロメラーゼ陽性ではない細胞;又はテロメラーゼ陰性細胞とみなされる場合がある。
代替として、又は加えて、ALT細胞は、テロメラーゼの発現及び/又は活性がテロメラーゼ陽性細胞と比較して低減されている細胞とみなされる場合がある。テロメラーゼの発現及び/又は活性は、当技術分野において公知のあらゆる手段によって決定することができる。例えば、テロメラーゼの発現レベルは、あらゆる好適なmRNA検出方法(例えば、これらに限定されないが、定量PCR、リアルタイムqPCR;次世代シーケンシング(NGS)方法;ナノ細孔シーケンシング方法;ノーザンブロッティング等)によって、テロメラーゼmRNAの生産のレベルを定量化することによって決定することができる。代替として、又は加えて、テロメラーゼの発現レベルは、あらゆる好適なタンパク質検出方法によってテロメラーゼタンパク質の生産のレベルを定量化することによって決定してもよい。テロメラーゼタンパク質レベルは、例えば、これらに限定されないが、ウェスタンブロッティング;抗体検出方法(例えば、ELISA;又はテロメラーゼに特異的に結合することが可能な抗体にコンジュゲートした蛍光標識等の標識の検出);及び他の方法によって検出することができる。代替として、又は加えて、テロメラーゼの発現及び/又は活性レベルは、テロメラーゼ機能アッセイの実行を介して決定してもよく、この場合、テロメラーゼ活性のレベルは、細胞におけるテロメラーゼの発現及び/又は活性のレベルの指標である。テロメラーゼ活性は、テロメラーゼ反復増幅プロトコール(TRAP)、定量TRAP(qTRAP)によって検出してもよいし、又は直接のテロメラーゼ活性アッセイ、例えばCohen及びReddel、2008に記載されるものによって検出してもよい。ALT細胞を同定するか若しくはALTがんを同定する方法、又は対象が本明細書に開示されるALTがんに罹っているかどうかを決定する方法のいずれかは、本明細書に開示される方法のいずれかによって、細胞がテロメラーゼ陽性細胞であるかどうかを決定することを含んでいてもよく、細胞がテロメラーゼ陽性細胞であると決定される場合、その細胞は、ALT細胞ではないと同定されることが理解されるであろう。
ALT細胞は、死んだ又はテロメラーゼ陽性細胞と比較して、DNA傷害レベルの上昇によって特徴付けることができ、これは、ALT細胞において高められたテロメアの複製ストレスを示す。この高められたテロメアの複製ストレスは、テロメアの構造的な完全性が累積的に不十分になることが原因である。頻繁な、又は持続的な複製フォーク失速は、DNAにおいてニック及び破断を引き起こすことから、ALTメカニズムは、失速した複製フォークから生じ、これが劣化して二本鎖破断(DSB)を形成し、次いで相同組換え修復経路の参加のための基質を提供し、破断によって誘発されたテロメア合成で終わるという仮説が立てられた。それゆえにALT細胞は、テロメア保護と修復活性とテロメア傷害との絶妙なバランスを達成し、このバランスの崩壊は、ALTメカニズムを制御できなくする手段として適用される可能性がある。
本明細書において定義されるALT細胞は、非ALT細胞に典型的なレベルを超える複製フォーク失速(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞に典型的なレベルを超える);非ALT細胞に典型的なレベルを超えるDSB出現(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞に典型的なレベルを超える)等のいずれか1つ又は複数を含む、ALTテロメア修復又はALTテロメアの複製ストレスの1つ又は複数の表現型の特色の検出によって同定してもよい。ALT細胞に典型的なテロメアの複製フォーク失速及び/又はDSBのレベルは、ALT細胞のサンプル及び非ALT細胞(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞)のサンプルにおけるこれらの特色の同定及び/又は測定を介して確立できることが理解されるであろう。次いで好適な閾値レベルは、これらの特色を同定及び/又は測定するのに使用される特定の手法に従って決定することができ、次いでそのようにして、所与の細胞が、同じ又は類似の手法を使用してALT細胞又は非ALT細胞として同定することができる。正確な閾値は、その閾値レベルを確立するために使用されるサンプルに応じて、更に各例において使用される特定の分析手法に従って、様々であると予想されることが理解されるであろう。
ALTは、組換え依存性DNA複製(Dunhamら、2000)を含み、ALTは、テロメアの長さにおける突然の大幅な増加をもたらすことができ(Murnaneら、1994)、これは、長い直鎖状のテロメアテンプレート又はローリングメカニズム、例えばローリングサークル増幅(RCA)のいずれかと一致する。ALT活性を有する細胞もまた、個々のテロメアの長さにおける急速な減少を経験し(Jiangら、2005及びPerremら、2001)、高度に不均一なテロメア長さの分布をもたらす。ALT細胞はしばしば、前骨髄球性白血病(PML)の核小体(ALT関連前骨髄球性白血病の核小体;APB)内にテロメアクロマチンを含有する(Yeagerら、1999)。したがって、本明細書において定義されるALT細胞は、これらの表現型の特色のいずれか1つ又は複数を含んでいてもよい。例えば、ALT細胞は、組換え依存性DNA複製を呈示する可能性があり、及び/又はテロメアの長さにおける突然の大幅な増加を呈示する可能性があり(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞等の非ALT細胞と比較して)、及び/又は不均一なテロメア長さの分布を呈示する可能性があり(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞等の非ALT細胞と比較して)、及び/又はAPB(例えば、テロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞等の非ALT細胞においてより大きいAPBのレベル)を含む可能性がある。代替として、ALT細胞は、テロメラーゼ活性及び/又は発現の非存在下での、1回又は複数の細胞分裂にわたるテロメアの長さの維持によって同定してもよい。テロメアは、直鎖状染色体の末端又はその近傍に存在する繰り返しのDNA配列であることが理解されるであろう。ヒトにおけるテロメアは、典型的には、ヌクレオチド配列5'-TTAGGG-3'の複数の反復を含む。したがって、テロメアの長さの同定は、このヌクレオチド配列の反復の数を決定することを含んでいてもよい。
本明細書に開示されるALT細胞は、がん細胞であり得る。したがって、本明細書に開示されるALT細胞は、異常な細胞増殖に関連する疾患又は状態に罹っている対象、それに罹っている疑いのある対象、又はそれに罹りやすい対象由来であり得る。がんは、あらゆる生理学的な起源のものであり得る。ALTは、多種多様のがん、例えば、これらに限定されないが、膀胱、子宮頸、子宮内膜、食道、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、脳、骨及び結合組織由来の組織等の組織から生じる癌腫で同定されている。ALTはまた、髄芽細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、シュワン鞘腫及び小児における多形性膠芽腫でも見出されている。一例において、がんは、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、脳がん、骨がん、又は結合組織がんのいずれか1つであり得る。ALTがん又は細胞は、例えば、肉腫、芽細胞腫、癌腫、中皮腫又は星細胞腫であり得る。肉腫は、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、滑膜肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫又は平滑筋肉腫であり得る。芽細胞腫は、神経芽細胞腫であり得る。癌腫は、非小細胞肺癌、例えば肺腺癌又は乳癌であり得る。中皮腫は、腹膜中皮腫であり得る。星細胞腫は、低悪性度星細胞腫、退形成性星細胞腫、又は多形性膠芽腫であり得る。ALTがん又は細胞は、髄芽細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、シュワン鞘腫及び/又は小児における多形性膠芽腫であり得る。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。がんは、原発性がん又は転移がんであり得る。転移がんは、起源がわかっていてもよいし、又は未知でもよい。本明細書に開示される方法は、これらの又は他のALTがんのいずれかを処置するのに使用することができる。
ALT細胞は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物由来であってもよく、特に、ヒト由来であってもよい。
本明細書において示した通りに、細胞がALT細胞であるかどうか、又はがんがALTがんであるかどうかを決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Cサークルバイオマーカーは、Cサークルアッセイ(Hensonら、2009及びWO/2011/035375)を使用して検出できるALT特異的な分子である。WO/2011/035375の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。簡単に言えば、Cサークルアッセイは、試料からDNAを抽出すること、その後それを定量化することを含む。例えば、Cサークルは、ローリングサークル増幅によって増幅させることができ、生成物は、検出することができる。
Hensonら、2009及び/又はWO/2011/035375で開示された方法のいずれも、本発明の開示と併用して細胞をALT細胞として同定するのに使用することができる。したがって、例えば、本明細書に開示される方法は、細胞中の部分的に二本鎖のテロメアDNAサークルの存在及び/又は量を決定することによって細胞をALT細胞として同定することを含んでいてもよく、この場合、部分的に二本鎖のテロメアDNAサークルの存在及び/又は量は、その細胞をALT細胞として同定する。部分的に二本鎖のテロメアDNAサークルは、閉環鎖及び直鎖状の鎖を含んでいてもよい。環状の鎖は、Cリッチ又はGリッチなテロメア配列を含んでいてもよい。直鎖状の鎖は、Gリッチ又はCリッチなテロメアDNA配列を含んでいてもよい。部分的に二本鎖のテロメアサークルは、環状の鎖に配列(CCCTAA)nの反復、及び/又は直鎖状の鎖に配列(TTAGGG)nの反復を含んでいてもよい(式中、nは、1より大きいあらゆる整数である)。部分的に二本鎖のテロメアサークルは、環状の鎖に配列(TTAGGG)nの反復、及び/又は直鎖状の鎖に配列(CCCTAA)nの反復を含んでいてもよい(式中、nは、1より大きいあらゆる整数である)。一例において、細胞中の部分的に二本鎖のテロメアDNAサークルの存在及び/又は量は、ローリングサークル増幅を使用して検出することができる。
環状及び/又は直鎖状の鎖は、バリアントテロメア反復配列、突然変異テロメア反復配列及び/又は非テロメア配列を含んでいてもよい。
部分的に二本鎖のテロメアサークルは、直接的又は間接的に検出してもよい。例えば、検出は、ローリングサークル増幅に従って間接的であってもよい。ローリングサークル増幅は、テンプレートとして部分的に二本鎖のサークルの環状の鎖を使用することができる。一例において、検出は、
(a)任意選択で細胞からDNAを単離する工程;
(b)不完全な(直鎖状)鎖からのポリメラーゼによって媒介される伸長が一本鎖テロメアDNAのコンカテマーを生成するような好適な条件下で、DNAポリメラーゼ及び1種又は複数のdNTPの存在下でDNAをインキュベートする工程;及び
(c)コンカテマーを検出する工程
を含む。
コンカテマーは、例えば、ハイブリダイゼーション、シーケンシング、PCR、分子ビーコン、核酸酵素、例えばDNAパートザイム(partzyme)等のあらゆる好適な手段によって検出してもよいし、又はインキュベーション工程(b)で好適に標識されたdNTPを取り込むことによって検出してもよい。一例において、コンカテマーは、標識されたヌクレオチドプローブを使用して検出してもよい。標識プローブは、ヌクレオチド配列(CCCTAA)nを含んでいてもよく、式中、nは、1又は1より大きいあらゆる整数である。標識は、あらゆる検出可能な標識であり得る。例えば、標識は、蛍光標識であり得る。
DNAポリメラーゼは、例えば、φ29DNAポリメラーゼであり得る。典型的には、部分的に二本鎖のテロメアサークルが環状の鎖に配列(CCCTAA)nの反復を含む場合、dNTPは、dATP、dGTP及びdTTP、並びに任意選択でdCTPからなる。
部分的に二本鎖のテロメアサークルの検出は、細胞内に存在する前記サークルの検出であってもよいし、又は代替として、生物学的サンプルにおける、例えば対象由来のサンプルにおける前記サークルの検出を含んでいてもよい。生物学的サンプルは、例えば、血液、尿、痰、胸膜液、腹腔液、気管支及び気管支肺胞洗浄液、又は組織切片を含んでいてもよい。サンプルは、例えば、細針吸引生検によって得てもよい。血液は、全血、血清又は血漿であり得る。
ローリングサークル増幅は、外因性プライマーの提供と共に実行してもよいし、又はそれなしで実行してもよい。有利には、ローリングサークル増幅は、外因性プライマーなしで実行してもよい。したがって、本明細書に開示されるCサークルアッセイを実行することによってALT細胞を同定する方法は、外因性プライマーの使用を含んでいなくてもよい。
ALT活性を決定するための他の好適な方法としては、これらに限定されないが、テロメアDNA及びCサークルのテロメラーゼ定量PCR(Lauら、2012);テロメラーゼ活性の非存在;非常に長く不均一なテロメアの存在;テロメアDNA及びテロメア結合タンパク質を含有するALT関連前骨髄球性白血病(PML)体(APB)の存在(Yeagerら、1999);増加したテロメア姉妹染色分体交換(T-SCE)事象及び染色体外テロメア反復(ECTR)DNAの存在が挙げられる。腫瘍サンプルはまた、テロメア特異的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーションと、PMLタンパク質の免疫蛍光標識との組合せによって評価することもできる(Heaphyら、2011)。
ALT細胞は、PMLタンパク質が、テロメアDNA並びにテロメア結合タンパク質hTRF1及びhTRF2と共に共局在化する、前骨髄球性白血病(PML)体(ALT関連PML体、APB)の新規の形態を含有する。APBは、死んだ細胞、テロメラーゼ陽性の細胞株又は腫瘍に見出されない(Yeagerら、1999)。APBを検出するのに使用される当技術分野において公知のあらゆる方法が、本発明の開示と共に使用することができる。例えば、APBは、視覚的に検出してもよい。例えば、APBは、免疫組織化学的方法によって(例えば、抗hTRF1及び/又は抗PML抗体を使用して)可視化してもよい。
テロメアバリアント反復含量における有意差は、ALTメカニズムを使用する腫瘍と使用しない腫瘍で見出されている(Leeら、2018)。したがって、テロメアバリアント反復含量を決定するための当技術分野において公知のあらゆる方法が、本発明の開示と共に使用することができる。例えば、全ゲノムシーケンシングを使用して、テロメアバリアント反復含量を決定することができる。
FANCM
ファンコーニ貧血群Mタンパク質(FANCM)は、相同組換え、減数分裂及びDNA修復に関与するATP依存性DNAヘリカーゼ/トランスロカーゼ(EC3.6.4.13)である。FANCMは、ヒトFANCMであり得る。FANCMポリペプチドをコードするヒト遺伝子(遺伝子番号57697)は、25個のエクソンを有し、14q21.2に配置されている。参照ヒトFANCMのアミノ酸配列は、配列番号31に示される。他の参照ヒトFANCMのアミノ酸配列は、データベース受託番号NP_001295062.1、NP_1295063.1、及びNP_065988.1を有する。本明細書に記載されるFANCMポリペプチドは、参照アミノ酸配列、例えば配列番号31、又は参照アミノ酸配列、例えば配列番号31と、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の同一性、若しくは少なくとも98%の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
参照ヒトFANCMをコードするヌクレオチド配列は、配列番号32に示される。他の参照ヒトFANCMコード配列は、データベース受託番号NM_001308133.1、NM_001308134.1及びNM_020937.4を有する。本明細書に記載されるFANCMヌクレオチド配列は、参照ヒトFANCMコード配列、例えば配列番号32のヌクレオチド配列、又は参照ヒトFANCMコード配列、例えば配列番号32と、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の同一性、若しくは少なくとも98%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムGAPを参照して定義される(Wisconsin GCG package、Accelerys Inc、San Diego USA)。GAPは、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する2つの完全配列をアライメントするためのニードルマン及びブンシュのアルゴリズムを使用する。一般的に、デフォルトパラメーターが使用され、ギャップクリエーションペナルティー=12であり、GAP伸長ペナルティー=4である。GAPの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズムも使用でき、例えばBLAST(これは、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol.215:405～410頁の方法を使用する)、FASTA(これは、Pearson及びLipman(1988) PNAS USA 85: 2444～2448頁の方法を使用する)、SSEARCH(Smith及びWaterman(1981) J. Mol Biol. 147: 195～197頁)、HMMER3(Johnson LSら、BMC Bioinformatics. 2010年8月18日;11( ):431頁)又は一般的にデフォルトパラメーターを採用する上記のAltschulら(1990)のTBLASTNプログラム(例えばPearson Curr Prot Bioinformatics(2013)第3章、Uniy 3.1 doi: 10.1002/0471250953.bi0301s42を参照)。特に、psi-Blastアルゴリズムを使用することができる(Altschulら、Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389～3402頁)。また配列同一性及び類似性も、Genomequest(商標)ソフトウェア(Gene-IT、Worcester MA USA)を使用して決定することができる。配列比較は、好ましくは、本明細書に記載される関連配列の全長にわたりなされる。
他の実施形態において、例えば処置しようとする個体が非ヒト哺乳動物である場合、FANCMは、非ヒト哺乳類FANCMであり得る。
テロメア(ALT細胞)を維持するためにテロメア代替伸長(ALT)経路を利用する細胞において、FANCMの発現又は活性における低減は、本明細書において、生存能を低減させ、細胞周期の停止及び死亡を増加させることであると示される。対照的に、FANCMの発現又は活性における低減は、テロメラーゼ陽性細胞(これは、ALT経路を介してテロメアを維持しない)又は初代細胞への作用を有さない。それゆえに、FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤は、例えばALTがんの処置において、ALTがん細胞(すなわちテロメアを維持するためにALT経路を頼るがん)において細胞死を誘発するのに使用することができる。
FANCM活性は、FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤、例えばFANCMアンタゴニストを投与することによって、個体において低減することができる。FANCMアンタゴニストは、FANCM活性を阻害することができ、例えばFANCM阻害剤であり、又はFANCMの発現を低減させる又は抑制することができ、例えばサプレッサー核酸又は標的化されたヌクレアーゼである。
FANCM-RMI複合体
FANCMは、失速した複製フォークの安定化において不可欠な因子である。これは、そのN及びC末端に2つのDNA結合ドメインを含有し、その間に3つの高度に保存された領域がある(MM1～MM3)。FANCMの配列は、公共的に利用可能である。例示的な配列は、配列番号2に記載される。MM1ドメインは、DNA鎖間架橋(ICL)修復に必須のマルチサブユニットのユビキチンリガーゼであるFAコア複合体を補充し、一方でMM2ドメインは、34アミノ酸のモチーフとして記載されており、これは、BLM-TOP3A-RMI(BTR)のRMI(RecQによって媒介されるゲノム不安定性)部分複合体(RMI1及びRMI2)部分複合体と直接結合する。MM2ドメインはまた、(Deansら、2009)にも記載されている。RMI1及びRMI2の配列は、公共的に利用可能であり、例示的な配列は、配列番号3及び4に記載される。MM2ドメインを含む例示的な配列は、配列番号5に記載される。したがって、MM2ドメインは、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含んでいてもよい。代替として、本明細書に記載されるMM2ドメインは、アミノ酸配列DLFSVTFDLGFC(配列番号49)と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含んでいてもよい。MM2ドメインは、アミノ酸配列DLFSVTFDLGFC(配列番号49)と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一なアミノ酸配列を含んでいてもよい。この配列は、MM2ドメイン内のコア配列として同定されている(Hoadleyら、2012)。
BTR複合体は、BLMヘリカーゼ活性、TOP3A脱連環活性、分枝点移動及び全体的な溶解酵素活性を包含し、FANCMとBTRが協働して、失速したフォークを後退させることができ、したがってそれを安定化できることが示唆されている。BLM及びTOP3Aの配列は、公共的に利用可能であり、例示的な配列は、配列番号6及び7に記載される。
失速した複製フォークにおけるFANCMの保持は、それと機能的なBTR複合体との相互作用に依存するが、FAコア複合体との相互作用には依存しない。
阻害剤
特定の実施形態において、FANCM阻害剤及びRMI阻害剤は、細胞において、例えばALTがん細胞において、それぞれFANCM又はRMIの発現を阻害又は低減する。特定の実施形態において、FANCM阻害剤及びRMI阻害剤は、細胞において、例えばALTがん細胞において、それぞれFANCM又はRMIの1つ又は複数の生物学的活性を阻害又は低減する。特定の実施形態において、FANCM阻害剤及びRMI阻害剤は、細胞において、例えばALTがん細胞において、それぞれFANCM又はRMIと別のタンパク質との結合を阻害又は低減する。特定の実施形態において、FANCM阻害剤は、細胞において、例えばALTがん細胞において、FANCMのATPアーゼ活性を阻害又は低減する。
FANCM阻害剤又はRMI阻害剤は、それぞれFANCM又はRMIの直接的な阻害剤又は間接的な阻害剤であってもよく、すなわちそれらは、それぞれFANCM又はRMI、又はそれぞれFANCM又はRMIをコードする核酸配列に直接的に結合することによって、その阻害作用を発揮することができ、又はそれらは、例えば、FANCM又はRMIの発現又は活性のいずれかに必要な別のタンパク質を阻害することによって、その阻害作用を間接的に発揮することができることが当業者には理解されるであろう。特定の実施形態において、本明細書に開示されるもの等の阻害剤は、FANCMの1つ又は複数の内因性活性が阻害されるように、FANCMを阻害することが可能であり得る。特定の実施形態において、本明細書に開示されるもの等の阻害剤は、RMIの1つ又は複数の内因性活性が阻害されるように、RMIを阻害することが可能であり得る。特定の実施形態において、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、DNAトランスロカーゼ活性又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害又は低減する。特定の実施形態において、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞、例えばALTがん細胞のALT活性を阻害又は低減する。特定の実施形態において、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性又はATPアーゼ活性は、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させていないALT細胞に存在する活性と比較して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%低減されるか、又は完全に低減される。特定の実施形態において、ALT活性は、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させていないALT細胞に存在する活性と比較して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%低減されるか、又は完全に低減される。
特定の実施形態において、FANCM-RMI相互作用は、FANCM又はRMIの上流又は下流のエフェクターによって崩壊させることができる。阻害剤は、FANCM-RMI相互作用の直接の阻害剤であってもよいし、又はFANCM-RMI相互作用の間接的な阻害剤であってもよい。例えば、阻害剤は、FANCMに結合して、それがRMIに結合することができなくなるように、そのコンフォメーションを変化させることによって、又はその結合部位に影響を与えることによって、その機能を阻害することができる。別の例において、阻害剤は、RMIに結合して、それがFANCMに結合することができなくなるように、そのコンフォメーションを変化させることによって、又はその結合部位に影響を与えることによって、その機能を阻害することができる。例えば、阻害剤は、RMI1-RMI2部分複合体がFANCMに結合することができなくなるように、RMI1-RMI2部分複合体を崩壊させることができる。一例において、FANCMとRMIとの結合は、MM2ドメインにおいて崩壊する。本明細書に開示されるもの等のいずれかの阻害剤は、FANCM-RMI複合体の内因性機能が阻害されるように、FANCM-RMI相互作用を崩壊させることが可能であってもよい。
FANCM活性は、Cサークルアッセイを介して、又は当技術分野において公知のあらゆる好適な手段、若しくは本明細書に開示される方法のいずれかを介して測定することができる。
FANCM阻害剤及びRMI阻害剤(及び他の阻害剤)は、阻害活性を有するあらゆる型の分子であってもよく、例えば、低分子の化学分子、ポリペプチド(この例としては、ペプチド及びタンパク質が挙げられる)、核酸、又はこれらのクラスの分子のいずれかの組合せを含む分子であってもよい。用語「FANCM阻害剤」及び「RMI阻害剤」は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるあらゆる生物学的分子又は化合物の医薬的に許容される塩及び溶媒和物を網羅する。
特定の実施形態において、阻害剤は、標的タンパク質、例えばFANCMの発現における低減、又は標的タンパク質、例えばFANCMの1つ又は複数の生物学的活性における低減をもたらすことができ、低減は、それぞれのケースにおいて、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は約100%の低減である。活性なFANCMタンパク質の量を、対照細胞における量の20%又はそれより低く低減させることは、細胞死を誘発するのに十分であることが示される。例えば、細胞は、対照細胞によって発現される活性なFANCMポリペプチドの、最大5%、最大10%、最大15%又は最大20%を発現することができる。特定の実施形態において、FANCMのATPアーゼ活性は、阻害剤で処置されていない対照細胞と比較して、例えば、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は約100%低減される。
FANCM阻害剤としては、例えば、FANCMに特異的に結合する生物学的分子を挙げることができる。FANCMのATPアーゼ活性は、トランスロカーゼ及び分枝点移動活性に関与するアミノ末端のDEAHヘリカーゼ様ドメイン内に配置される。このATPアーゼ活性は、一般的に、コア複合体の標的化及びFANCD2ユビキチン化にとって重要ではないことが見出されているが、複製フォークの安定性及び効率的なチェックポイント応答に必要である。一部の実施形態において、生物学的分子は、ATPアーゼ活性に関連するFANCMの領域に特異的に結合することができる。一部の実施形態において、生物学的分子は、配列番号31の残基83～591に対応するDEAHヘリカーゼ様ドメインに特異的に結合することができる。一部の実施形態において、生物学的分子は、配列番号5に対応するFANCMのMM2ドメインに特異的に結合することができる。
FANCMアンタゴニスト及びFANCM阻害剤としては、例えば、低分子の化学分子、例えば900ダルトン以下の分子量を有する非ポリマー性の有機化合物を挙げることができる。好適な小分子FANCM阻害剤は、例えば、ATPとFANCMのATPアーゼドメインとの結合;DNAとFANCMのトランスロカーゼドメインとの結合、及び/又はFANCMと、結合パートナー、例えばMHF、FAAP24、BLM、RMI、Topo IIIαとの結合を阻害することができる。FANCMの構造的な分析を介した小分子阻害剤の合理的設計のための好適な技術は、当技術分野において周知である。
一例において、FANCM阻害剤は、小分子である。FANCM阻害剤が小分子である一例によれば、小分子は、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルである。したがって、小分子阻害剤は、以下の式Iで定義される阻害剤であり得る:
式I:
Figure 2022534138000001
特定の実施形態において、阻害剤は、生物学的分子、例えばポリペプチド、例えば、ペプチド又はタンパク質である。ペプチドは、5～40アミノ酸、例えば、6～10アミノ酸を含んでいてもよいし、又はそれらからなっていてもよく、本明細書に記載されるFANCM又はその結合パートナー由来であってもよい。ポリペプチド分子としてはまた、抗体、抗体断片及び抗体誘導体、並びに非免疫グロブリン結合分子、例えばアプタマー、トリネクチン(trinectin)、アンチカリン(anticalin)、クニッツドメイン、トランスフェリン、テンジクザメ抗原受容体、及びウミヤツメロイシンリッチ反復タンパク質も挙げることができる。FANCMに特異的に結合する生物学的分子を生成するための好適な技術は当技術分野において周知である。
一部の実施形態において、FANCM阻害剤は、ペプチドである。ペプチドは、FANCMのMM2ドメインの全部又は一部を模擬するあらゆるペプチドであり得る。例えば、ペプチドは、アミノ酸配列DLFSVTFDLGFC(配列番号49)と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む又はそれらからなるペプチドであり得る。ペプチドは、アミノ酸配列DLFSVTFDLGFC(配列番号49)と、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であり得る。例えば、ペプチドは、アミノ酸配列DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む又はそれらからなるペプチドであり得る。ペプチドは、アミノ酸配列DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)と、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であり得る。
一部の実施形態において、ペプチドは、EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)と少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む又はそれらからなるペプチドであり得る。ペプチドは、アミノ酸配列EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)と、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であり得る。
一部の実施形態において、ペプチド又はタンパク質であるFANCM阻害剤は、FANCMに結合することが可能な、更に、MM2結合ドメインを遮蔽することが可能なあらゆるペプチドであり得る。遮蔽は、FANCMとその内因性結合パートナーとの正常な(内因性)結合相互作用が崩壊するようなものであり得る。ペプチド又はタンパク質は、直接的又は間接的にMM2結合ドメインに結合することが可能であり得る。代替として、ペプチド又はタンパク質は、FANCMに結合することが可能なRMI複合体のあらゆるペプチドであり得る。
一部の実施形態において、FANCM阻害剤は、RMIタンパク質への結合能力が低減した突然変異FANCMタンパク質、又はFANCMタンパク質への結合能力が低減した突然変異RMIタンパク質であり得る。理論に制限されることは望まないが、このようなタンパク質は、内因性タンパク質上の利用可能な結合部位を飽和させ、それによってそれらの機能を阻害する内因性FANCM又はRMIタンパク質に対するデコイとして作用し得る。一例において、突然変異FANCMは、F1232A/F1236A二重置換を含む不活性化されたFANCMタンパク質であり得る。このタンパク質は、免疫グロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。
一部の実施形態において、阻害剤は、FANCM又はRMIの遺伝学的な阻害剤であり得る。好適な遺伝学的阻害剤を設計する方法は、当技術分野において公知である。遺伝学的阻害剤の好適な例としては、これらに限定されないが、DNA(gDNA、cDNA)、RNA(センスRNA、アンチセンスRNA、mRNA、tRNA、rRNA、短鎖干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(ShRNA)、マイクロRNA(miRNA)、核小体低分子RNA(SnoRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、リボザイム、アプタマー、DNAザイム、アンチセンスオリオゴヌクレオチド(oliogonucleotide)、ベクター、プラスミド、他のリボヌクレアーゼ型の複合体、及びそれらの混合物が挙げられる。FANCM並びにRMI1及びRMI2の遺伝子配列は公共的に利用可能であり、当技術分野において公知の方法によって好適な遺伝学的阻害剤を設計するのに使用することができる。FANCM、RMI1及びRMI2の参照ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号9、10及び11に提供される。
好適な遺伝学的阻害剤の例は、本明細書の実験の例で記載される。したがって、遺伝学的阻害剤は、配列番号12又は配列番号13に開示されたヌクレオチド配列を含む又はそれらからなるsiRNA阻害剤を含んでいてもよい。
特定の実施形態において、FANCMの発現を低減又は抑制するための阻害剤としては、サプレッサー核酸、標的化可能なヌクレアーゼ、及びこのような薬剤をコードする核酸が挙げられる。サプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸は、ベクターに含有されていてもよい。好適な発現ベクターは、当技術分野において周知であり、その例としては、ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニア又はヘルペスベクターが挙げられる。
活性なFANCMタンパク質の発現は、サプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼによって、対照細胞と比較して低減させてもよいし、又はなくしてもよく、すなわち、サプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼで処置した細胞が活性なFANCMタンパク質を欠如するように、又は対照細胞と比較して活性なFANCMタンパク質の量を低減させているように、FANCM遺伝子の転写及び/又はFANCMのmRNAの翻訳は、低減させるか又はなくすことができる。活性なFANCMタンパク質の量を、対照細胞における量の20%又はそれより低く低減させることは、細胞死を誘発するのに十分であることが示される。例えば、細胞は、対照細胞によって発現される活性なFANCMポリペプチドの、最大5%、最大10%、最大15%又は最大20%を発現することができる。
一部の実施形態において、核酸抑制は、活性なFANCMポリペプチドの発現を低減させるのに使用することができる。標的遺伝子の発現を下方調節するためのアンチセンス及びRNAi抑制等の核酸抑制技術の使用は、当技術分野において十分に確立されている。
細胞は、サプレッサー核酸(すなわちFANCMの発現を抑制する核酸分子)、例えばサプレッサー核酸をコードするsiRNA若しくはshRNA、又は異種核酸でトランスフェクトすることができる。サプレッサー核酸は、転写及び/又は翻訳を妨害することによって活性なFANCMポリペプチドの発現を低減させ、それによって細胞におけるFANCM活性を低減させる。
RNAiは、FANCMコード配列と同一な、又はそれと高度に類似した配列を含むRNA分子の発現又はその細胞への導入を含む。RNA分子は、FANCM遺伝子から転写されたmRNAと相互作用し、その結果として、mRNAの配列特異的な分解又は特異的な転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)が起こる。これは、活性なFANCMポリペプチドの発現を低減又は抑制する(Angell及びBaulcombe (1997) The EMBO Journal 16、12:3675～3684頁; Voinnet及びBaulcombe (1997) Nature 389: 553頁)。
RNA分子は、好ましくは二本鎖RNA(dsRNA)(Fire A.ら、Nature 391, (1998))である。合成siRNA二重鎖は、多様な哺乳類細胞株において内因性及び異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている(Elbashir SM.ら、Nature、411、494～498頁、(2001))。
RNAi抑制における使用のための好適なRNA分子としては、短鎖干渉RNA(siRNA)が挙げられる。siRNAは、長さが15～40ヌクレオチドの、好ましくは、長さが15～28ヌクレオチド又は19～25ヌクレオチドの、例えば、長さが19、20、21、22、23、24又は25ヌクレオチドの二本鎖RNA分子である。例えば、2つの改変されていない21merのオリゴヌクレオチドが一緒にアニールして、siRNAを形成することができる。siRNA分子は、各鎖に約0、1、2、3、4、又は5ヌクレオチドの長さを有する3'及び/又は5'オーバーハングを含有していてもよい。鎖のオーバーハングの長さは独立しており、すなわち、1つの鎖におけるオーバーハングの長さは、第2の鎖におけるオーバーハングの長さに依存しない。
RNAiにおける使用のための他の好適なRNA分子としては、小ヘアピンRNA(shRNA)が挙げられる。shRNAは、短い(例えば19～25ヌクレオチド)アンチセンスヌクレオチド配列、それに続いて5～9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、及び相補的センスヌクレオチド配列(例えば19～25ヌクレオチド)を含むか又はそれらからなる単鎖RNA分子である。
代替として、センス配列が、ヌクレオチドループ構造の前に存在していてもよく、アンチセンス配列がその後に存在していてもよい。ヌクレオチドループはヘアピンターンを形成し、それにより相補的センス配列とアンチセンス配列との塩基対合が可能になり、shRNAが形成される。
サプレッサー核酸、例えばsiRNA又はshRNAは、参照FANCMヌクレオチドのコード配列、例えば配列番号32の全部又は一部(例えば、15～40ヌクレオチド)と同一又は実質的に同一な(すなわち少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%同一な)配列、又はその相補物を含んでいてもよいし、又はそれらからなっていてもよい。サプレッサー核酸の設計に使用することができるFANCMをコードする好適な参照配列は、公共的に利用可能でありその例としては、配列番号32が挙げられる。FANCM活性は、がん細胞において、サプレッサー核酸による活性なFANCMポリペプチドの生産の下方調節によって抑制される。例えば、ヒトFANCMの発現を抑制するためのsiRNAは、配列番号32からの18～22個の連続するヌクレオチドを含んでいてもよい。
ヒトFANCMの抑制のための好ましいsiRNA分子の例としては、配列番号33(siFa)及び配列番号34(siFb)が挙げられる。
FANCMの発現を低減させるためのサプレッサー核酸、例えばsiRNA及びshRNAは、当技術分野において広く利用可能な参照FANCMコード配列及びソフトウェアツールを使用して容易に設計することができ、慣例的な技術を使用して生産することができる。例えば、サプレッサー核酸は、化学的に合成してもよいし、インビトロ又は細胞で組換え生産してもよく(Elbashir, S. M.ら、Nature 411:494～498頁(2001);Elbashir, S. M.ら、Genes & Development 15:188～200頁(2001))、又は商業的な供給源(例えばCruachem (Glasgow、UK)、Dharmacon Research (Lafayette、Colo.、USA))から得てもよい。
一部の実施形態において、2つ以上のサプレッサー核酸を使用して、FANCMの発現を抑制することができる。例えばsiRNAのプールを採用することができる。好適なsiRNA及びsiRNAプールは、標準的な技術を使用して生産することができる。
核酸抑制はまた、アンチセンス技術を使用して行うこともできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸、pre-mRNA又は成熟mRNAの相補配列にハイブリダイズし、その発現が低減されるか又は完全に又は実質的に完全に防止されるように、塩基除去修復経路成分の生産に干渉するように設計することができる。コード配列を標的化することに加えて、アンチセンス技術を使用して、遺伝子の制御配列、例えば5'の隣接配列における制御配列を標的化することができ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現制御配列に干渉することができる。アンチセンス配列の構築及びその使用は当技術分野において周知である(Peyman及びUlman、Chemical Reviews、90:543～584頁、(1990); Crooke、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:329～376頁、(1992))。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与のために、インビトロ又はエクスビボで生成してもよいし、又はアンチセンスRNAは、FANCMの下方調節が望ましいがん細胞内で、インビボで生成してもよい。したがって、二本鎖DNAは、DNAのアンチセンス鎖の転写によって標的遺伝子のセンス鎖から転写された正常なmRNAに相補的なRNAが生じるように「逆方向」でプロモーターの制御下に配置されていてもよい。次いで相補的アンチセンスRNA配列は、mRNAと結合して二重鎖を形成し、標的遺伝子からタンパク質への内因性mRNAの翻訳を阻害すると考えられる。
逆方向のFANCMコード配列に対応する完全配列を必ずしも使用しなくてもよい。例えば、十分な長さの断片を使用してもよい。様々なサイズを有し、アンチセンス阻害のレベルを最適化しようとする遺伝子のコード又は隣接配列の様々な部分に由来する断片をスクリーニングすることは、当業者にとって慣例的な事である。開始のメチオニンATGコドンを含むこと、場合によっては開始コドン上流の1つ又は複数のヌクレオチドも含むことが有利な可能性がある。好適な断片は、約14～23ヌクレオチド、例えば約15、16又は17ヌクレオチドを有していてもよい。
他の実施形態において、標的化変異誘発を使用して、活性なFANCMポリペプチドの発現を低減させることができる。標的遺伝子の発現をノックアウト又は排除するための遺伝子編集等の標的化変異誘発技術の使用は、当技術分野において十分確立されている(例えばGajら、(2013) Trends Biotechnol.31(7) 397～405頁を参照)。
1つ又は複数の突然変異、例えば挿入、置換又は欠失は、がん細胞におけるFANCM遺伝子に導入されてもよい。好適な突然変異としては、FANCM遺伝子の全部又は一部の欠失、例えば、1つ、2つ又はそれより多くのエクソン、フレームシフト変異、又は未成熟停止コドンを導入するナンセンス突然変異が挙げられる。一部の好ましい実施形態において、1つ又は複数の未成熟停止コドンが、FANCMコード配列に導入されてもよい。好ましくは、FANCMのATPアーゼドメインを除外するために、突然変異、例えば未成熟停止コドンが、コード配列の最初の400コドンに導入される。突然変異は、例えばFANCM遺伝子の転写又は翻訳を減少させるか、又は不活性なポリペプチドを発現させることによって、活性なFANCMポリペプチドの発現を防止することができる。
1つ又は複数の突然変異を導入するための標的化変異誘発は、あらゆる便利な方法によって実行することができる。例えば、がん細胞は、標的化可能なヌクレアーゼをコードする異種核酸でトランスフェクトすることができる。標的化可能なヌクレアーゼは、例えば、活性なFANCMポリペプチドの発現を防止する1つ又は複数の突然変異を導入することによって、個体の1つ又は複数の細胞においてFANCMをコードするFANCM遺伝子を不活性化することができる。
標的化可能なヌクレアーゼは、個体のがん細胞において選択的にFANCMをコードするFANCM遺伝子を不活性化することができる。標的化可能なヌクレアーゼは、従来の技術によってがん細胞に特異的に標的化することができ、このような技術としては、細胞を標的化した運搬手段、例えば特異的な細胞型のリガンドを発現するウイルスベクター;腫瘍への標的化可能なヌクレアーゼの直接投与、例えば注射による直接投与;又はがん細胞において選択的に異種核酸から標的化可能なヌクレアーゼを発現させること、例えば組織特異的プロモーターを使用する発現が挙げられる。
標的化可能なヌクレアーゼは、部位特異的であってもよいし(例えばZFN又はTALEN)、又はヌクレアーゼをFANCM遺伝子に標的化する1つ又は複数の標的配列(例えばCRISPR/Cas)と共に発現されてもよい。
標的化可能なヌクレアーゼをコードする異種核酸は、特異的な細胞型、例えば腫瘍細胞内で、標的化可能なヌクレアーゼ及び任意選択の標的配列の発現を促進する誘導性プロモーターを含んでいてもよい。例えば、誘導性プロモーターは、他の型の宿主細胞よりも腫瘍細胞内において標的化可能なヌクレアーゼ及び任意選択の標的配列の発現が選択的に支持されるプロモーター-エンハンサーカセットであり得る。
好適な標的化されるヌクレアーゼとしては、例えば、部位特異的なヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びメガヌクレアーゼ又はRNAガイドヌクレアーゼ、例えばクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat;CRISPR)ヌクレアーゼが挙げられる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、1つ又は複数のCys2-His2ジンクフィンガーDNA結合ドメイン及び切断ドメイン(すなわち、ヌクレアーゼ)を含む。DNA結合ドメインは、従来の技術を使用して、いずれかの核酸配列を認識し、それに結合するように操作されてもよい(例えばQuら、(2013) Nucl Ac Res 41(16): 7771～7782頁を参照)。標的遺伝子に突然変異を導入するためのZFNの使用は、当技術分野において周知であり(例えば、Beerliら、Nat. Biotechnol.2002; 20:135～141頁; Maederら、Mol. Cell.2008; 31:294～301頁; Guptaら、Nat. Methods.2012; 9:588～590頁を参照)、操作されたZFNは、商業的に入手可能である(Sigma-Aldrich社(St. Louis、MO)。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、連続するヌクレオチド配列を認識するための、一緒に連結された一連のモジュラーTALE反復を含むDNA結合ドメインに融合した非特異的なDNA切断ヌクレアーゼを含む。TALEN標的化ヌクレアーゼの使用は当技術分野において周知である(例えばJoung及びSander (2013) Nat Rev Mol Cell Bio 14:49～55頁; Kimら、Nat Biotechnol. (2013); 31:251～258頁. Miller JCら、Nat. Biotechnol. (2011) 29:143～148. Reyon Dら、Nat. Biotechnol. (2012); 30:460～465頁)。
メガヌクレアーゼは、大きい認識部位(12～40塩基対の二本鎖DNA配列)を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、結果としてこの部位は、一般的に、いずれの所与のゲノムにおいても1回のみ存在する(例えばSilvaら、(2011) Curr Gene Ther 11(1): 11～27頁を参照)。
CRISPR標的化ヌクレアーゼ(例えばCas9)は、ガイドRNA(gRNA)と複合体化して、配列特異的な方式でゲノムDNAを切断する。ガイドRNAのcrRNA及びtracrRNAは、FANCM遺伝子又はその調節エレメント内での部位特異的な哺乳類ゲノム切断が可能になるように、別々に使用してもよいし、又は単一のRNAに組み合わせてもよい。転写を減少させる方法として遺伝子に挿入又は欠失を導入するためのCRISPR/Cas9システムの使用は当技術分野において周知である(例えばCaderら、Nat Immunol 2016 17 (9) 1046～1056頁、Hwangら、(2013) Nat. Biotechnol 31:227～229頁; Xiaoら、(2013) Nucl Acids Res 1～11頁; Horvathら、Science (2010) 327:167～170頁; Jinek M ら、Science (2012) 337:816～821頁; Cong L ら、Science (2013) 339:819～823頁; Jinek M ら、(2013) eLife 2:e00471; Mali P ら、(2013) Science 339:823～826頁; Qi LSら、(2013) Cell 152:1173～1183頁; Gilbert LAら、(2013) Cell 154:442～451頁; Yang Hら、(2013) Cell 154:1370～1379頁;及びWang Hら、(2013) Cell 153:910～918頁を参照)。
一部の好ましい実施形態において、標的化可能なヌクレアーゼは、Casエンドヌクレアーゼ、好ましくはCas9であり、これは、FANCM遺伝子内でゲノムDNAを切断し、活性なFANCMポリペプチドの発現を防止する挿入又は欠失を生成するためにCasエンドヌクレアーゼを標的化するガイドRNA標的配列と組み合わされて、がん細胞で発現される。
サプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸配列、及び任意選択でガイドRNAは、発現ベクター内に含まれていてもよい。好適なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列等の適切な調節配列を含有するものを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、宿主細胞においてコード核酸の発現を促進するのに適切な調節配列を含有する。様々な発現系で異種核酸コード配列の発現を促進するのに好適な調節配列は、当技術分野において周知であり、その例としては、構成的プロモーター、例えばウイルスプロモーター、例えばCMV又はSV40が挙げられる。一部の好ましい実施形態において、組織特異的又は誘導性プロモーター、例えば光誘導性プロモーターは、がん細胞においてサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼ、及び任意選択でガイドRNAを選択的に発現させるために採用することができる。ベクターはまた、細菌宿主、例えば大腸菌(E. coll)において、及び/又は真核細胞、例えば酵母、昆虫若しくは哺乳類細胞において、その選択及び複製及び発現を可能にする複製起点及び選択可能マーカー等の配列を含んでいてもよい。哺乳類細胞におけるサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼの発現における使用に好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルスベクター、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。哺乳類細胞においてサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼを発現させるための好適な技術は当技術分野において周知である(例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual:第3版、Russellら、2001、Cold Spring Harbor Laboratory Press or Protocols In Molecular Biology、第2版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992; Recombinant Gene Expression Protocols Ed RS Tuan (1997年3月) Humana Press Incを参照)。
FANCM阻害剤の同定
本発明の他の態様は、細胞死を増加させるか又はALT細胞の生存能を低減させ、ALTがんの処置において有用な可能性がある化合物をスクリーニングするためのFANCMの使用に関する。
スクリーニング方法を使用して、単離されたFANCMタンパク質に結合する試験化合物を同定することができる。ALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させる化合物をスクリーニングする方法は、試験化合物とFANCMとの結合を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、試験化合物をFANCMと接触させ、試験化合物とFANCMとの結合を決定してもよい。試験化合物とFANCMとの結合は、試験化合物がALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させることを示す可能性がある。
試験化合物とFANCMとの結合は、表面プラズモン共鳴(SPR)等の標準的な技術によって決定してもよい。
一部の実施形態において、FANCMと結合パートナーとの相互作用を阻害する試験化合物の能力が決定され得る。ALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させる化合物をスクリーニングする方法は、FANCMと結合パートナーとの結合に対する試験化合物の作用を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、FANCMは、試験化合物の存在及び非存在下において結合パートナーと接触させてもよい。試験化合物の非存在下と比べて試験化合物の存在下におけるFANCMと結合パートナーとの結合における低減は、その試験化合物がALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させることを示す可能性がある。
結合パートナーは、例えば相同組換え、減数分裂及びDNA修復中に、天然に細胞内のFANCMに結合するタンパク質である。FANCM結合パートナーとしては、MHF、FAAP24、HCLK2、BLM、RMI、Topo IIIαが挙げられる。
スクリーニング方法を使用して、FANCM活性を阻害する試験化合物を同定することができる。ALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させる化合物をスクリーニングする方法は、FANCM活性に対する試験化合物の作用を決定する工程を含んでいてもよい。例えば、FANCM活性は、試験化合物の存在及び非存在下で決定することができる。試験化合物の非存在下と比べて試験化合物の存在下におけるFANCM活性における減少は、その化合物が、ALT細胞において生存能を低減させるか又は細胞死を増加させることを示している。
FANCMのATP依存性DNAヘリカーゼ/トランスロカーゼ活性は、試験化合物の非存在下と比べて、試験化合物の存在下で決定することができる。試験化合物の存在下におけるATP依存性DNAヘリカーゼ/トランスロカーゼ活性における減少又は低減は、試験化合物がFANCMタンパク質の活性を阻害することを示す可能性がある。例えば、試験化合物は、FANCM阻害剤であり得る。ATPアーゼ及びトランスロカーゼアッセイ等の活性を決定する好適な方法は当技術分野において周知である。
本発明のスクリーニング又はアッセイ方法のいずれかの正確な様式は、慣例的な技術及び知識を使用して当業者によって変更が可能である。当業者は、適切な対照実験を採用する必要性についてよく知っている。
スクリーニング方法における使用のためのFANCMは、全長FANCM配列、例えばFANCM参照配列、例えば本明細書に記載の配列番号1、又はそれらの断片を含む単離されたポリペプチドであり得る。好適な断片は、FANCM参照配列からの、少なくとも50個、少なくとも100個又は少なくとも150個の連続するアミノ酸を含み得る。一部の実施形態において、ATPアーゼ又はトランスロカーゼ活性を含むFANCM断片は、例えば配列番号1の残基83～591に対応するN末端DEAHヘリカーゼ様ドメインを含む又はそれらからなる断片を採用することができる。単離されたFANCMポリペプチドは、標準的な組換え技術を使用して生産することができる。
試験化合物は、単離された分子であってもよいし、又はサンプル、混合物又は抽出物、例えば生物学的サンプル中に含まれていてもよい。本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングされ得る化合物は、薬物スクリーニングプログラムで使用される天然又は合成化学物質であってもよく、その例として、有機小分子、ポリペプチド及び核酸、例えばアプタマーを挙げることができる。数種の特徴付けられた又は特徴付けられていない成分を含有する植物、微生物又は他の生物の抽出物も使用することができる。
スクリーニングのための好適な試験化合物としては、FANCMのATP依存性DNAヘリカーゼ/トランスロカーゼ活性と類似の活性を阻害する化合物が挙げられる。例えば、好適な試験化合物は、ATPアナログであり得る。好適な試験化合物は、FANCM活性をモジュレートするのに好適な特定の分子の形状、サイズ及び電荷特徴を有する試験候補化合物を提供するような合理的な薬物設計を使用して生産することができる。
コンビナトリアルライブラリー技術は、FANCM活性をモジュレートする能力に関して膨大な数の可能性がある異なる化合物を試験する効率的な方法を提供する。このようなライブラリー及びその使用は、当技術分野において、あらゆる種類の天然産物、なかでも小分子及びペプチドに関して公知である。ペプチドライブラリーの使用は、特定の環境において好ましい可能性がある。一部の実施形態において、生物学的分子、例えばアプタマー又は抗体分子のライブラリー。
本発明のアッセイに添加することができる試験化合物の量は、一般的に、使用される化合物の型に応じて試行錯誤によって決定されると予想される。典型的には、約0.001nM～1mM又はそれより高い濃度の推定上の阻害剤化合物を使用することができ、例えば0.01nM～100μM、例えば0.1～50μM、例えば約10μMの阻害剤化合物を使用することができる。弱い作用しかない化合物でも、更なる調査及び開発のための有用なリード化合物である可能性がある。
試験化合物としては、上述した通りのFANCM又はその結合パートナー由来のペプチドを挙げることができる。5～40アミノ酸、例えば、6～10アミノ酸の膜透過性のペプチド断片は、FANCMに結合する又はその活性を阻害するその能力について試験することができる。上記ペプチドの調節特性は、以下のグループ:クロロメチルケトン、アルデヒド及びボロン酸のうちの1つのC末端への付加によって増加させることができる。これらのグループは、セリン、システイン及びスレオニンプロテアーゼの遷移状態アナログである。ペプチド断片のN末端をカルボベンジルでブロックして、アミノペプチダーゼを阻害し、安定性を改善することができる(Proteolytic Enzymes、第二版、R. Beynon及びJ. Bond編、Oxford University Press、2001)。
試験化合物としては、抗体、抗体断片及び抗体誘導体、並びに非免疫グロブリン結合分子、例えばアプタマー、トリネクチン、アンチカリン、クニッツドメイン、トランスフェリン、テンジクザメ抗原受容体、及びウミヤツメロイシンリッチ反復タンパク質を挙げることができる。好適な分子は、配列番号1の残基83～591に対応するDEAHヘリカーゼ様ドメイン、又はFANCMタンパク質の別の一部に対して向けられたものでもよい。候補調節抗体分子を特徴付け、その結合領域を、活性の阻害又は結合パートナーとの相互作用のブロックに関与する単鎖抗体及びその断片を提供して決定することができる。好適な抗体は、当技術分野において標準的な技術を使用して、例えば、好適なペプチド、例えば炎症促進性ポリペプチドの断片で哺乳動物を免疫化すること、又は発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え生産されたライブラリーから特異的な抗体を単離すること、例えば、その表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して得てもよい;例えばW092/01047を参照。
FANCMに対して向けられたアプタマーはまた、FANCMをモジュレートするための推定上の薬剤でもある。アプタマーは、標的分子に特異的に結合する核酸である。典型的には、アプタマーは、既定の二次及び三次構造、例えばステム-ループ又はGカルテットにフォールディングする長さが15～50塩基の範囲の小さい核酸である。アプタマーは、標的分子に対して10-12M未満のkdで非常にかたく結合することができる。アプタマーは、FANCMと非常に高い程度の特異性で結合することができる。例えば、標的分子と、分子上の単一の位置でのみ異なる別の分子との結合親和性の差が10000倍より大きいアプタマーが単離されている。アプタマーは、対照ポリペプチドとのkdの、少なくとも10、100、1000、10,000、又は100,000分の1のFANCMとのkdを有していてもよい。アプタマーの生産及び使用は当技術分野において周知である(例えばBunkaら、Curr Opin Pharmacol 2010 10 (5) 557～562頁を参照)。
FANCM活性を阻害するとして同定された試験化合物は、1つ又は複数の二次スクリーニングを使用して更に調査してもよい。二次スクリーニングは、インビトロ及び/又はインビボでの、例えば動物モデルにおける生物学的機能又は活性に関して試験することを含んでいてもよい。例えば、ALT細胞の生存能を低減させるか又は細胞死を増加させる試験化合物の能力が決定され得る。一部の実施形態において、二次スクリーニングは、単離された酵素のパネルに対してスクリーニングすることによって、FANCMに対する化合物の選択性を決定することを含んでいてもよい。
FANCM阻害剤として同定された試験化合物の作用は、インビトロで哺乳類細胞において決定することができる。例えば、ALT細胞株への試験化合物の作用を決定することができる。化合物の非存在下と比べて化合物の存在下における増加したALT細胞死は、その化合物がALTがんの処置において有用な活性を表すことを示す可能性がある。
本明細書に記載されるようにALTがんの処置において有用な可能性があるFANCM阻害剤が同定された後、方法は、化合物をその医薬特性が最適化されるように改変することを更に含んでいてもよい。例えば構造的なモデリングによる好適な最適化方法が当技術分野において周知である。次いで、インビボの試験又は臨床試験の間に1つ又は複数の最終的な化合物に到達するように更なる最適化又は改変を行ってもよい。
FANCM阻害剤として同定された試験化合物は、単離及び/又は精製してもよいし、又は代替として、組換え発現又は化学合成の従来の技術を使用して合成してもよい。更に、このような試験化合物は、医薬、医薬組成物又は薬物等の組成物の調製、すなわち製造又は製剤化に製造、及び/又は使用することができる。したがって本明細書に記載される方法は、試験化合物を、治療用途のための医薬的に許容される賦形剤、ビヒクル又は担体を用いて医薬組成物に製剤化することを含んでいてもよい。
医薬組成物
本明細書に記載される治療剤、例えばFANCMアンタゴニスト、阻害剤、サプレッサー核酸、標的化可能なヌクレアーゼ、サプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸は単独で投与してもよいが、治療剤は通常、医薬組成物の形態で投与されると予想され、医薬組成物は、活性薬剤に加えて少なくとも1つの成分を含んでいてもよい。治療剤は、がん免疫療法における使用のための医薬組成物を生産するために、他の試薬、例えば緩衝液、担体、希釈剤、保存剤及び/又は医薬的に許容される賦形剤と混合されていてもよい。好適な試薬は、以下でより詳細に記載される。
本発明の態様は、(i)(a)FANCM阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸から選択される治療剤、及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物;並びに(ii)がん免疫療法における使用のための医薬組成物を生産する方法であって、上述した治療剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、方法を提供する。
本発明の態様は、(i)(a)RMI阻害剤、(b)RMIサプレッサー核酸、(c)RMI標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)RMIサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸から選択される治療剤、及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物;及び(ii)がん免疫療法における使用のための医薬組成物を生産する方法であって、上述した治療剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、方法を提供する。
本発明の態様は、(i)(a)小分子阻害剤、(b)ポリペプチド阻害剤、又は(c)核酸阻害剤から選択される、FANCMとRMIとの結合を阻害する治療剤、及び医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物、及び(ii)がん免疫療法における使用のための医薬組成物を生産する方法であって、上述した治療剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、方法を提供する。
本発明の態様は、FANCMとRMIとの結合を阻害する治療剤、及びFANCMのATPアーゼ活性を阻害する治療剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、治療剤は、(a)小分子阻害剤、(b)ポリペプチド阻害剤、又は(c)核酸阻害剤、及び医薬的に許容される賦形剤から選択される。特定の実施形態において、本開示は、がん免疫療法における使用のための医薬組成物を生産する方法であって、上述した治療剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、方法を提供する。
用語「組成物」は、本明細書で使用される場合、特定された成分を特定された量で含む生成物、加えて、特定された量で特定された成分の組合せから直接的又は間接的に生じるあらゆる生成物を包含することが意図される。
用語「医薬的に許容される」は、本明細書で使用される場合、信頼できる医学的判断の範囲内であり、過剰な毒性、炎症、アレルギー性応答、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく対象(例えば、ヒト)の組織と接触する使用に好適な、適度なベネフィット/リスク比に見合った、化合物、材料、組成物、及び/又は剤形に関する。各担体、賦形剤等も、配合物の他の成分に適合するという意味で「許容される」ものでなければならない。
本発明の開示はまた、ALTがんを処置することにおける使用のためのFANCM-RMI相互作用の阻害剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の開示はまた、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCM-RMI相互作用の阻害剤の使用も提供する。一例において、医薬組成物又は医薬は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤から本質的になる。本発明の開示はまた、ALTがんを処置することにおける使用のためのFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の開示はまた、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の使用も提供する。本発明の開示はまた、ALTがんを処置することにおける使用のための、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の開示はまた、ALTがんの処置のための医薬の製造におけるFANCM-RMI相互作用の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の使用も提供する。一例において、医薬組成物又は医薬は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤から本質的になる。一例において、医薬組成物又は医薬は、FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になる。一例において、医薬組成物又は医薬は、FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤及びFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になる。しかしながら、医薬又は組成物はまた、本明細書に記載される阻害剤又はその使用にとって生理学的に適合し、有害ではない、賦形剤、又は例えば溶媒、希釈剤、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等の薬剤を含んでいてもよい。医薬活性物質の組成物を調製するためのこのような担体及び薬剤の使用は当技術分野において周知である(例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia、PA、2005を参照)。
投与(例えば輸注による)に好適な医薬組成物としては、水性及び非水性の等張なパイロジェンフリーの滅菌注射液が挙げられ、このような注射液は、抗酸化剤、緩衝液、保存剤、安定剤、静菌薬、及び配合物を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有していてもよく;、水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられ、このような滅菌懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含んでいてもよい。このような配合物における使用に好適な等張なビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルは、標準的な製薬学の教本、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton, Pa.、1990に見出すことができる。
医薬組成物は、使用前に希釈してもよい。好適な希釈剤は、例えば、リンゲル液、ハルトマン液、デキストロース溶液、生理的食塩水及び滅菌注射用水から選択してもよい。
医薬組成物としては、経口、直腸、鼻、局所(頬側及び舌下を含む)、非経口投与(筋肉内、腹膜内、皮下及び静脈内を含む)のための医薬組成物、又は吸入若しくは通気による投与に好適な形態での医薬組成物が挙げられる。FANCM-RMI相互作用の阻害剤は、従来のアジュバント、担体又は希釈剤と共に、医薬組成物及びその単位投薬の形態に入れてもよく、このような形態において、全て経口での使用のための、固体として、例えば錠剤又は充填されたカプセルとして、又は液剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤のような液体若しくはそれらが充填されたカプセルとして採用してもよいし、又は非経口(例えば皮下)での使用のための滅菌注射用溶液の形態で採用してもよい。
この開示のアンタゴニスト又は阻害剤の投与のための医薬組成物は、都合のよい形態としては、投薬量単位形態で供給してもよく、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製することができる。
本明細書に開示される医薬組成物及び方法は、通常、開示された障害又は状態の処置に適用される他の治療活性を有する化合物を更に含んでいてもよい。併用療法における使用のための適切な薬剤の選択は、従来の製薬上の原理に従って当業者によって作製され得る。治療剤の組合せは、本明細書に開示される様々な障害又は状態の処置又は防止がなされるように相乗的に作用し得る。このアプローチを使用して、各薬剤の投薬量をより低くして治療効能を達成でき、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
他の治療剤が本明細書に開示されるものと組み合わせて採用される場合、それらは、例えば、医師用卓上参考書(Physician Desk Reference;PDR)で述べられているような量で、又はそれ以外の方法で当業者によって決定した通りに使用してもよい。
方法
特定の実施形態において、本開示は、例えば、ALT細胞、例えばALTがん又は腫瘍細胞において、FANCMを阻害するための方法、RMIを阻害するための方法、FANCM-RMI相互作用を阻害するか又は崩壊させるための方法、及びFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性を阻害するための方法を提供する。あらゆるこのような方法の特定の実施形態において、本方法は、ALT細胞の生存能及び/又は成長、例えば、ALTがん又は腫瘍細胞の生存能又は成長を阻害する。特定の実施形態において、本方法は、ALT細胞、例えばALTがん又は腫瘍細胞の死を増加させるか又はそれを誘発する。本方法は、例えば、ALTがん又は腫瘍を有する対象を処置するために、インビトロ又はインビボで実施することができる。特定の実施形態において、対象は、哺乳動物であり、例えばALTがんと診断されているヒトである。
FANCM活性を「阻害すること」、例えばRMIに結合すること、DNAトランスロカーゼ活性、ATPアーゼ活性及び/又はトランスロカーゼ活性に関して、阻害剤は、部分的であってもよいし、又は完全であってもよい。特定の実施形態において、阻害は、例えば、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させていない同等な細胞における量と比較して、又は予め決定された値と比較して少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は約100%の低減である。
したがって、一実施形態において、本開示は、ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する方法であって、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞におけるFANCMの発現を阻害する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞における1つ又は複数のFANCMの生物学的活性を阻害する。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMとBLM-TOP3-RMI(BTR)複合体との結合によって媒介される。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのATP依存性トランスロカーゼ活性(DEAHドメイン)によって媒介される。特定の実施形態において、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性)の両方を阻害する。特定の実施形態において、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCM-RMI相互作用を崩壊させ、FANCMのATPアーゼ/トランスロカーゼ活性を阻害する。FANCM-RMI相互作用を崩壊させる阻害剤とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性を阻害する阻害剤とは、同じ阻害剤又は異なる阻害剤であってもよい。
本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する」は、FANCM-RMI相互作用が無傷であるALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。同様に、本明細書で使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する」は、FANCMが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する」は、RMIが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する」は、FANCM-RMI相互作用が崩壊していないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。
細胞の生存能及び/又は成長は、あらゆる測定可能な量で阻害されてもよい。細胞の生存能の阻害は、完全であってもよいし、又は部分的であってもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、ALT細胞の生存能及び/又は成長の少なくとも部分的な阻害を含んでいてもよい。例えば、細胞の生存能及び/又は成長は、FANCM-RMI相互作用の崩壊の後、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は100%低減させることができる。
したがって、一実施形態において、本開示は、ALT細胞死を誘発する方法であって、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、FANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞におけるFANCMの発現を阻害する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞における1つ又は複数のFANCMの生物学的活性を阻害する。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMとBLM-TOP3-RMI(BTR)複合体との結合によって媒介される。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのATP依存性トランスロカーゼ活性(DEAHドメイン)によって媒介される。特定の実施形態において、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性の両方を阻害する。特定の実施形態において、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCM-RMI相互作用を崩壊させ、FANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性を阻害する。FANCM-RMI相互作用を崩壊させる阻害剤とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性を阻害する阻害剤とは、同じ阻害剤又は異なる阻害剤であってもよい。
本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞死を誘発する」は、FANCM-RMI相互作用が無傷であるALT細胞と比べて、ALT細胞死を誘発する、増加させる、引き起こす、又は促進することを意味すると解釈されるものとする。同様に、本明細書で使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞死を誘発する」は、FANCMが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞死を誘発する、増加させる、引き起こす、又は促進することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞死を誘発する」は、RMIが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞死を誘発する、増加させる、引き起こす、又は促進することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALT細胞死を誘発する」は、FANCM-RMI相互作用が崩壊していないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を誘発する、増加させる、引き起こす、又は促進することを意味すると解釈されるものとする。
細胞死は、あらゆる測定可能な量で増加させることができる。細胞死を増加させることは、完全であってもよいし、又は部分的であってもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、ALT細胞死の少なくとも部分的な誘発を含んでいてもよい。例えば、ALT細胞死は、FANCM-RMI相互作用の崩壊の後、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は100%増加させることができる。細胞死は、例えば、本明細書に開示されるアンタゴニスト又は阻害剤との接触後の生存不能な細胞又は死細胞のパーセンテージとして、複数の細胞で決定することができる。特定の実施形態において、複数の細胞は、ALT腫瘍細胞である。
したがって、一実施形態において、本開示は、対象におけるALTがんを阻害する方法であって、対象をFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞におけるFANCMの発現を阻害する。特定の実施形態において、アンタゴニスト又は阻害剤は、ALT細胞における1つ又は複数のFANCMの生物学的活性を阻害する。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FNCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性である。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMとBLM-TOP3-RMI(BTR)複合体との結合によって媒介される。特定の実施形態において、生物学的活性は、FANCMのATP依存性トランスロカーゼ活性(DEAHドメイン)によって媒介される。特定の実施形態において、対象を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性の両方を阻害する。特定の実施形態において、ALT細胞(例えば、ALTがん細胞)を、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤と接触させることを含む方法であって、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCM-RMI相互作用を崩壊させ、FANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性を阻害する。FANCM-RMI相互作用を崩壊させる阻害剤とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼを阻害する阻害剤とは、同じ阻害剤又は異なる阻害剤であってもよい。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。
本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALTがんを阻害する」は、FANCM-RMI相互作用が無傷であるALT細胞と比べて、ALTがん又は腫瘍の成長又は転移を阻害する、ALTがん又は腫瘍のサイズを低減する、ALTがん又は腫瘍の成長速度を低減することを意味すると解釈されるものとする。同様に、本明細書で使用される特定の文脈において、用語「ALTがんを阻害する」は、FANCMが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALTがんを阻害する」は、RMIが阻害されていないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。本明細書において使用される特定の文脈において、用語「ALTがんを阻害する」は、FANCM-RMI相互作用が崩壊していないALT細胞と比べて、ALT細胞の生存能及び/又は成長を妨害する、低減する、制限する、又は防止することを意味すると解釈されるものとする。
ALTがんの阻害は、あらゆる測定可能な量で生じ得る。ALTがんの阻害は、完全であってもよいし、又は部分的であってもよい。したがって、本明細書に開示される方法は、ALTがん又は腫瘍の成長又は転移の少なくとも部分的な阻害、ALTがん又は腫瘍のサイズにおける少なくとも部分的な低減、又はALTがん又は腫瘍の成長速度における少なくとも部分的な低減を含んでいてもよい。
FANCM又はRMIの阻害は、本明細書に開示されるFANCM及びRMI阻害剤のいずれかの使用を含む当技術分野におけるあらゆる好適な手段によって達成することができる。FANCMとRMIとの相互作用は、本明細書に開示されるFANCM-RMIの阻害剤又はそれを崩壊させる物質のいずれかの使用を含む当技術分野において公知のあらゆる好適な手段によって崩壊させることができる。FANCM、RMIの阻害又はFANCM-RMI相互作用の崩壊は、部分的であってもよいし、又は完全であってもよい。FANCM活性は、Cサークルアッセイを介して、又は当技術分野において公知のあらゆる好適な手段、若しくは本明細書に開示される方法のいずれかを介して測定することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法はまた、BLM及び/又は乳がん1型感受性タンパク質(BRCA1)の1つを阻害することを含んでいなくてもよい。本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法はまた、BLMを阻害することを含んでいなくてもよい。本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法はまた、BRCA1を阻害することを含んでいなくてもよい。BRCA1の配列は、公共的に利用可能である。例示的な配列は、配列番号8に記載される。
FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤は、ALTがん細胞においてG2/Mの停止及び細胞死を誘発することが本明細書において示され、それゆえにALTがんの処置において有用であり得る。
用語「処置すること」、「処置する」又は「処置」及びそれらの変化形は、本明細書で使用される場合、臨床病理の経過中に処置されている個体又は細胞の天然の経過を変更するように設計される臨床的介入を指す。用語「処置」は、本明細書において状態を処置する状況で使用される場合、一般的に、いくつかの望ましい治療作用、例えば状態の進行の阻害が達成される処置及び療法に関し、進行速度の低減、進行速度の停止、並びに状態の緩和、及び状態の治癒を含む。処置の望ましい作用としては、疾患進行の速度を減少させること、がんのサイズを低減させること、腫瘍成長を阻害すること、がんの進行又は転移を阻害すること、疾患の状態を緩和又は軽減すること、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。
処置は、ヒト又は動物(例えば獣医学的な用途における)のどちらの処置及び療法であるかにかかわらず、一部の望ましい治療作用、例えば状態の進行の阻害又は遅延が達成されるあらゆる処置及び療法であってもよく、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の緩和、状態の治癒若しくは寛解(部分的でも完全でもよい)、状態の1つ又は複数の症状及び/若しくは兆候を防止する、遅延させる、和らげる、若しくは停止すること、又は対象又は患者の生存期間を処置の非存在下で期待される生存期間より長くすることを含む。
予防手段としての処置(すなわち予防)も含まれる。例えば、がんの発生又は再発を起こしやすい又はそのリスクがある個体が、本明細書に記載される通りに処置することができる。このような処置は、個体におけるがんの発生又は再発を防止するか又は遅延させることができる。
特に、処置は、がんの完全寛解を含むがんの成長の阻害、及び/又はがん転移の阻害を含み得る。がんの成長は、一般的に、がん内のより発達した形態への変化を示す様々な指標のいずれか1つを指す。したがって、がん成長の阻害を測定するための指標としては、がん細胞生存の減少、腫瘍体積又は形態の減少(例えば、コンピューター断層撮影(CT)、超音波検査法、又は他の画像化方法を使用して決定される場合)、腫瘍成長の遅延、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型過敏性皮膚試験における性能の改善、細胞溶解性がん細胞の活性の増加、及び腫瘍特異的な抗原のレベルの減少が挙げられる。
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、あらゆる動物、例えば、哺乳動物を指し、例えば、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、家畜(例えばヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ロバ)、コンパニオンアニマル(例えばペット、例えばイヌ及びネコ)、実験室試験動物(例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット)、働く動物(performance animals)(例えば競走馬、ラクダ、グレーハウンド)又は捕獲野生動物等を指す。一実施形態において、「対象」は、ヒトである。特定の実施形態において、治療剤、例えば(a)FANCMアンタゴニスト又は阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸での処置に好適な対象又は個体は、本明細書に記載される通り、哺乳動物、例えばげっ歯類(例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス)、ネズミ科動物(例えばマウス)、イヌ科動物(例えばイヌ)、ネコ科動物(例えばネコ)、ウマ科動物(例えばウマ)、霊長類、類人猿(例えばサル又はエイプ)、サル(例えばマーモセット、ヒヒ)、エイプ(例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル)、又はヒトであり得る。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、特にヒト対象への言及において、同義的に使用される。対象は、同時の、逐次的な、又は別々の化学療法剤の投与を受けていてもよい。対象は、がんに罹っている対象、それに罹っている疑いのある対象、又はそれに罹りやすい対象であり得る。がんは、本明細書に開示されるあらゆるがんであり得る。
本発明者らは、驚くべきことに、FANCM-RMI複合体の崩壊が、ALTがん細胞に対して選択的に毒性であることを初めて示した。この発見に基づいて、本発明者らは、本明細書において、(i)ALT細胞の生存能及び/又は成長を阻害する方法、(ii)ALTがんを処置する方法、(iii)処置について対象を選択する方法、又はがんに罹っている対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であるかどうかを同定する方法、及び(iv)対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法を開発し、それらを提供する。
特定の実施形態において、本発明の開示は、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程を含む、対象におけるALTがんを処置する方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、ALTがんを有する対象に、有効量のFANCM-RMI相互作用を崩壊させる阻害剤を提供することを含む。特定の実施形態において、ALTがんは、本明細書に開示されるもののいずれかである。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。特定の実施形態において、本方法は、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤を対象に提供することを含み、1つ又は複数のFANCMアンタゴニスト又は阻害剤は、集合的に、FANCMのDNAトランスロカーゼ活性とFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性の両方を阻害する。
特定の実施形態において、本発明の開示は、対象におけるALTがんを処置する方法であって、FANCMのATPアーゼ活性を阻害することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、有効量のFANCMのATPアーゼ阻害剤をALTがんを有する対象に提供することを含む。特定の実施形態において、ALTがんは、本明細書に開示されるもののいずれかである。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。
一例において、本発明の開示は、ALTがんを処置する方法であって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含み、対象は、化学療法剤の同時の投与を受けている、方法を提供する。別の例において、本発明の開示は、ALTがんを処置する方法であって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程を含み、対象は、化学療法剤の逐次的な投与を受けている、方法を提供する。別の例において、本発明の開示は、ALTがんを処置する方法であって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含み、対象は、化学療法剤の別々の投与を受けている、方法を提供する。特定の実施形態において、ALTがんは、本明細書に開示されるもののいずれかである。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。
一例において、本発明の開示は、ALTがんを処置する方法であって、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含み、対象は、同時の、逐次的な、又は別々の化学療法剤の投与を受けていない、方法を提供する。したがって、本明細書に開示される方法は、単独の治療様式、又は単独の抗がん治療様式として、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含んでいてもよい。特定の実施形態において、ALTがんは、本明細書に開示されるもののいずれかである。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。
がんの処置のために承認されたあらゆる化学療法剤が、本明細書に開示される阻害剤のいずれかと組み合わせた、又は本明細書に開示される、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程と組み合わせた任意選択の使用に好適である。好適な化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、パクリタキセル、ドキソルビシン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、エリブリン、イキサベピロン、メトトレキセート、ムタマイシン、ミトキサントロン、ビロレルビン(virorelbine)、ドセタキセル、チオテパ、ビンクリスチン及びカペシタビンが挙げられる。
本明細書に開示される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、ALTがんを有する対象を処置することを含む。本明細書に記載される方法のいずれかはまた、個体におけるがんをALTがんとして同定又は診断することを含んでいてもよい。これは、例えば、医師、病院、又は診断研究所からこのような診断を得ることによって達成することができる。これはまた、対象から得られた生物学的サンプル、例えば腫瘍サンプルにアッセイを実行することによって達成してもよいし、本明細書に開示される様々なアッセイのいずれかを含んでいてもよい。例えば、個体からのがん細胞におけるCサークル又はALT関連PML体の存在を決定することができる。ALTがんの同定のための好適な方法は当技術分野において周知である75。
本明細書で論じられるように、対象がALTがんに罹っているかどうかを決定するための方法は、当技術分野において公知である。好適なアッセイとしては、これらに限定されないが、Cサークルの測定(例えば、Hensonら、2009及びWO2011035375で開示された通り)、テロメアDNA及びCサークルの定量PCR(Lauら、2012)、テロメラーゼ活性の非存在、極めて長く不均一なテロメアの存在、ALT関連PML体(APB)の存在、上昇したテロメア姉妹染色分体交換(T-SCE)(例えば、非ALT細胞、例えばテロメラーゼ陽性細胞又は死んだ細胞に関連して上昇するもの)、及び染色体外テロメア反復(ECTR)DNAの存在が挙げられる。ALT細胞を同定するための本明細書に開示される方法のいずれかは、対象がALTがんに罹っているかどうかを決定するのに使用することができる。これらの方法は、対象又は対象から採取したサンプルに実行することができる。
一例において、本発明の開示は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置について対象を選択する方法であって、対象がALTがんに罹っているかどうかを決定する工程を含み、対象がALTがんに罹っている場合、その対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置について選択される、方法を提供する。
一例において、本発明の開示は、がんに罹っている対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であるかどうかを同定する方法であって、がんが、ALTがんであるかどうかを決定する工程を含み、対象がALTがんに罹っている場合、その対象は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であると同定される、方法を提供する。
一例において、本発明の開示は、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法であって、対象から採取した細胞における1つ又は複数のテロメアにおけるゲノム不安定性の存在及び/又は程度を決定する工程を含む、方法を提供する。代替として、本発明の開示は、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法であって、対象から採取した細胞又は組織サンプルにおけるALT活性の存在及び/又はレベルを決定する工程を含む、方法を提供する。ALT活性の存在及び/又はレベルは、当技術分野において公知のあらゆる好適な方法を使用して、又はALT細胞を同定するための本明細書に開示される方法のいずれかを使用して決定することができる。特定の実施形態において、例えば、処置の前に対象から採取した細胞又は組織サンプルで事前に検出された量と比較して、又は予め決定された値と比較して、細胞又は組織サンプルにおいてALT活性が低減されている場合、対象は応答している。
加えて、本明細書に開示される方法は、1つ又は複数のテロメアにおけるゲノム不安定性の存在及び/若しくは程度、並びに/又は対象から採取した細胞におけるALT活性の存在及び/若しくはレベルを決定するために、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の前に対象から得ることができるサンプルをアッセイすることを含んでいてもよい。これは、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の後に対象から採取したサンプルと比較することができる。したがって、FANCM相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の前のゲノム不安定性又はALT活性のレベルの量/存在と比べた、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の後のゲノム不安定性又はALT活性のレベルの増加は、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置に応答していることを示す。逆に言えば、FANCM相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の前のゲノム不安定性又はALT活性のレベルの量/存在と比べた、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置の後のゲノム不安定性又はALT活性のレベルの増加又は減少がないことは、対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤での処置に応答していないことを示す。
細胞がALT細胞であるかどうか、又はがんがALTがんであるかどうかを決定するのに使用されるアッセイはまた、対象がFANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定することにも使用できることが当業者には理解されるであろう。
例えば、Hensonら、2009及び/又はWO/2011/035375で開示された方法のいずれかを使用して、対象が本発明の開示の処置方法に応答しているかどうかを決定することができる。したがって、例えば、本明細書に開示される方法は、FANCM-RMI相互作用の阻害剤で処置した対象から得られたサンプルを、部分的に二本鎖のテロメアサークルの存在及び/又は量についてアッセイすることを含んでいてもよく、この場合、部分的に二本鎖のテロメアサークルは、テンプレートとして部分的に二本鎖の環状テロメアDNAを使用するローリングサークル増幅に従って検出され、この場合、前記サークルの存在及び/又は量が、対象が処置に応答しているかどうかを示す。本方法は、外因性プライマーと共に実行してもよいし、又はそれなしで実行してもよい。例えば、本方法は、外因性プライマーなしで実行してもよい。サンプルは、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置を始める前に、及びFANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置の後に対象から得ることができる。サンプル中のCサークルの存在及び/又は量を比較して、対象が処置に応答しているかどうかを決定することができる。例えば、対象のサンプル中のCサークルの存在及び/又は量における増加は、対象がFANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答していることを示す。
特定の実施形態において、本発明の開示は、それを必要とする対象におけるALTがんを処置するための方法であって、有効量の治療剤、例えば(a)FANCM阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸を対象に提供することを含み、これらのそれぞれが、本明細書に記載されるように療法において有用であり得る、方法を提供する。例えば、FANCMの発現又は活性を低減させる治療剤は、ALTがんの処置のために個体に投与されてもよい。特定の実施形態において、ALTがんは、本明細書に開示されるもののいずれかである。特定の実施形態において、ALTがんは、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である。
FANCMの発現又は活性の低減は、本明細書において、ALTがん細胞に対して強く特異的な作用を有することが示される。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載される治療剤、例えば(a)FANCM阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸は、それゆえに、他の併存するがん療法、例えば細胞傷害性の化学療法又は放射線療法なしで個体に投与されてもよく、すなわち治療剤は、単独で投与されてもよい。
本明細書に開示される方法のいずれかの他の実施形態において、本明細書に記載される治療剤、例えば(a)FANCM阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸は、1つ又は複数の他の療法、例えば細胞傷害性の化学療法又は放射線療法と組み合わせて投与されてもよい。これは、例えば、ALT/テロメラーゼのステータスが決定されていないALTがん細胞及びテロメラーゼ陽性がん細胞又はがんの両方を含むがんを処置することにおいて有用であり得る。一部の実施形態において、ATMアンタゴニストと組み合わせて使用するのに好適な細胞傷害性の化学療法は、DNA傷害剤でなくてもよい。
阻害剤又は治療剤が追加の治療剤と組み合わせて使用される場合、化合物は、あらゆる便利な経路によって逐次的又は同時のいずれかで投与することができる。治療剤が、同じ疾患に対して活性な追加の治療剤と組み合わせて使用される場合、組合せにおける各薬剤の用量は、治療剤が単独で使用される場合の用量と異なっていてもよい。適切な用量は、当業者によって容易に認識されると予想される。
本明細書に記載のデータは、FANCM枯渇が単独でALT細胞死を増加させ、ALT細胞の生存能を低減させ、それに対してBLM及びFANCM両方の同時枯渇はこの作用を有さないことを示す。一部の好ましい実施形態において、FANCMアンタゴニスト、例えばFANCM阻害剤、FANCMサプレッサー核酸、FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸、又はFANCM-RMI相互作用を崩壊させる薬剤及び/若しくはFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤は、BLM及び/又はBRCA1の発現又は活性を低減させることなく投与することができる。例えば、FANCMアンタゴニスト及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤は、個体にBRCA1アンタゴニスト及び/又はBLMアンタゴニストを併存して投与せずに、個体に投与されてもよい。したがって、本明細書に開示される方法のいずれかの実施形態は、BRCA1アンタゴニスト又はBLMアンタゴニストを対象に提供又は投与することも含まない。
本明細書に記載される阻害剤又は治療剤、例えば(a)FANCM阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、(d)FANCMサプレッサー核酸又は標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸、(e)FANCM-RMI相互作用を崩壊させる薬剤、又は(f)FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の投与は、処置経過にわたり連続的又は間欠的に(例えば、適切なインターバルで数回に分けた用量で)、1用量で実行することができる。最も有効な投与の手段及び投薬量を決定する方法は当業者に周知であり、療法に使用される配合物、療法の目的、処置されている標的細胞、及び処置されている対象に応じて様々であると予想される。単回又は複数回投与を行ってもよく、用量レベル及びパターンは処置する医師によって選択される。
一部の好ましい実施形態において、対象又は個体は、ヒトである。他の好ましい実施形態において、非ヒト哺乳動物、特に、慣習的にヒトにおける治療効能を実証するためにモデルとして使用される哺乳動物(例えばマウス、霊長類、ブタ、イヌ、又はウサギ動物)を採用することができる。
一部の実施形態において、個体は、最初のがん処置の後に、微小残存病変(MRD)を有する場合がある。
ALTがんを有する個体は、当技術分野において公知の臨床基準に従ってALTがんの診断をなすのに十分な、少なくとも1つの同定可能な兆候、症状、又は検査上の発見を表する可能性がある。このような臨床基準の例は、医学の教本、例えばHarrison's Principles of Internal Medicine、第15版、Fauci ASら編、McGraw-Hill、New York、2001で見出すことができる。一部の場合において、個体におけるALTがんの診断は、個体から得られた体液又は組織のサンプルにおける特定の細胞型(例えばALTがん細胞)の同定を含み得る。本明細書に開示される方法は、ALTがんの診断に使用することができる。
本発明の他の態様は、本明細書に記載されるFANCMアンタゴニスト、例えば(a)FANCMアンタゴニスト又は阻害剤、(b)FANCMサプレッサー核酸、(c)FANCM標的化可能なヌクレアーゼ、又は(d)FANCMサプレッサー核酸若しくは標的化可能なヌクレアーゼをコードする核酸での処置に好適ながんを有する個体の同定に関する。例えば、がんを有する個体を、本明細書に記載される方法を使用して評価して、FANCMアンタゴニストでの処置が、個体にとって有益である可能性が高いかどうか、すなわち個体が本発明の第1の態様の方法による処置に好適であるかどうかを決定することができる。個体におけるがんの、FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤に対する応答性を予測する、決定する、又は評価する方法は、個体からのがん細胞のサンプル中の1つ又は複数のALTがん細胞の存在を決定する工程を含んでいてもよく、サンプル中の1つ又は複数のALTがん細胞の存在が、がんが前記薬剤に応答することを示す。
がん細胞のサンプルは、従来の技術を使用して個体から得ることができる。サンプル中のALTがん細胞の存在は、ALTがん細胞の1つ又は複数の特徴的な特色、例えば上記で詳述された(i)～(v)の特色のうちの1つ又は複数を有するがん細胞の存在を決定することによって決定してもよい。Cサークル又はALT関連PML体の存在等のALTがん細胞の特徴的な特色の存在を同定するための好適な方法は、標準的な技術を使用して決定することができる。
FANCMアンタゴニストに応答するとして同定されたがんを有する個体は、本明細書に記載される通りに、例えば本発明の第1の態様の方法を使用して処置することができる。
本明細書に記載される治療剤又は治療剤を含む医薬組成物は、全身/末梢か、又は望ましい作用部位かどうかにかかわらず、あらゆる便利な投与経路によって、対象に投与することができ、例えば、これらに限定されないが、非経口で、例えば、静脈内輸注、特に静脈内ボーラス輸注等の輸注によって投与することができる。好適な輸注技術は、当技術分野において公知であり、療法において一般的に使用される(例えば、Rosenbergら、New Eng. J. of Med.、319:1676、1988を参照)。
治療剤及び治療剤を含む組成物の適切な投薬量は、患者ごとに変更が可能であることが理解されるであろう。最適な投薬量を決定することは、一般的に、本発明の処置のあらゆるリスク又は有害な副作用に対する治療的有用性のレベルのバランスをとることを含むと予想される。選択された投薬レベルは、これらに限定されないが、特定の細胞の活性、投与経路、投与の時間、細胞の喪失又は不活性化の速度、処置期間、組合せで使用される他の薬物、化合物、及び/又は材料、並びに患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、及び以前の病歴等の様々な要因に依存すると予想される。したがって、特定の実施形態において、いずれか特定の対象に対する具体的な用量レベル及び投薬の頻度は、様々であってもよく、採用される具体的な化合物の活性、その化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄の頻度、薬物の組合せ、特定の状態の重症度、並びに療法を受けている宿主等の様々な要因に依存すると予想される。細胞の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量によると予想されるが、一般的に、投薬量は、実質的な有毒又は有害な副作用を引き起こさずに望ましい作用を達成する作用部位における局所濃度を達成すると予想される量である。
一部の実施形態において、小分子阻害剤の典型的な経口投薬量は、約0.05～約1000mg、好ましくは約0.1～約500mg、より好ましくは約1.0mg～約200mgの範囲内であり、1回又は複数の投薬で、例えば1～3回の投薬で投与される。正確な投薬量は、投与の頻度及び様式、処置される対象の性別、年齢、体重及び全身状態、処置される状態の性質及び重症度、並びに処置しようとするあらゆる併存する疾患、並びに当業者に明白な他の要因に依存すると予想される。非経口経路、例えば静脈内、髄腔内、筋肉内及び類似の投与の場合、典型的には、用量は、経口投与で採用される用量の約半分の程度である。
本発明の他の態様及び実施形態は、用語「含む」を用語「からなる」で置き換えた本明細書に記載される態様及び実施形態、及び用語「含む」を用語「から本質的になる」で置き換えた上記に記載される態様及び実施形態を提供する。
本出願は、文脈上他の意味が要求されない限り、互いに上記で記載された上記の態様及び実施形態のいずれかの全ての組合せを開示することが理解されるであろう。同様に、本出願は、文脈上他の意味が要求されない限り、好ましい及び/又は任意選択の特色の全ての組合せを単独又は他の態様のいずれかと共にのいずれかで開示する。
上記の実施形態の改変、更なる実施形態及びそれらの改変は、この開示を読めば当業者には明らかと予想され、そのようなものとしてこれらは本発明の範囲内である。
本明細書で述べられた全ての文書及び配列データベースの登録は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
(実施例1)
細胞培養及び細胞株
細胞株U-2 OS(ALT)、IIICF/c(ALT)、HeLa(テロメラーゼ陽性)、HeLa 1.2.11(テロメラーゼ陽性)、HCT116(テロメラーゼ陽性)、GM847(ALT)、Saos-2(ALT)及びHEK-293(テロメラーゼ陽性)を、加湿したインキュベーター中で、37℃、10%CO2で、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)が補足されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。細胞株を16遺伝子座のショートタンデムリピートプロファイリングによって認証し、CellBank Australia(Children's Medical Research Institute)によってマイコプラズマ汚染に関して試験した。
(実施例2)
RNA干渉
以下のSilencer Select siRNAを設計し、Life Technologies社:FANCM1(s33619)(配列番号12)及びFANCM2(s33621)(配列番号13)、POLD3(s21045)(配列番号14)、BLM(sl998)(配列番号15)、RAD51(sll735)(配列番号16)、RAD52(sll747)(配列番号17)及びSilencer Select RNAiのsiRNA陰性対照#2(#4390847)によって合成した。細胞懸濁液を、20～50%の密集度で、Lipofectamine RNAiMAX(Life Technologies社)で、30nMのsiRNAの最終濃度でトランスフェクトした。48時間後に培養培地を交換し、トランスフェクションの72時間後に分析のために細胞を回収した。ノックダウン効率をウェスタンブロット分析によって検証した。
(実施例3)
ベクター
空のベクター及び野生型FANCM(pCMV6-Myc-DDK)構築物をOrigene Technologies社から得た。野生型FANCM(配列番号2)及びFANCM突然変異体(配列番号19～28)を、Integrated DNA Technologies(IDT)によって合成された遺伝子ブロックの制限酵素サブクローニングによって、pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Neo主鎖(Origene Technologies社)にクローニングした。レンチウイルスを、ベクター及びGenome Engineering Facility(Children's Medical Research Institute)によって生産した。安定な過剰発現のために、細胞をレンチウイルスで形質導入し、24時間にわたり回収できるようにし、G418選択に供した。細胞をG418で維持して、持続的な過剰発現を確実にした。
(実施例4)
ゲノムDNAの抽出及び精製
細胞をトリプシン処理によって回収し、PBS中で洗浄し、DNA抽出緩衝液(100mMのトリス-HCl pH7.6、100mMのNaCl、10mMのEDTA、1%(w/v)N-ラウロイルサルコシン)中に溶解させた。溶解産物を50μg/mlのRNアーゼAで室温で20分間消化し、続いて100μg/mlのプロテイナーゼKで55℃で一晩消化した。DNAを、MaXtract High Densityチューブ(Qiagen社)中で3回のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)溶液(Sigma Aldrich社)を使用して抽出した。水性相からのDNAを、0.1体積の3M酢酸ナトリウムpH5.2及び2.5体積の冷たい100%エタノールを用いて沈殿させた。DNAを70%エタノールで洗浄し、乾燥させ、10mMのトリス-HCl pH8.0、1mMのEDTA中に溶解させた。
(実施例5)
Cサークルアッセイ
Cサークルを、Phi29ポリメラーゼで、dATP、dTTP及びdGTPを使用して一晩増幅した。生成物を、バイオダインB膜(Pall社)上にドットブロットし、PerfectHyb Plus(Sigma社)中で少なくとも30分間事前にハイブリダイズさせた。次いで、放射標識したテロメアC-プローブを添加し、ブロットを37℃で一晩ハイブリダイズさせた(Hensonら、2009)。ブロットを、0.5×SSC、0.1%SDSで3回、それぞれ5分間洗浄し、次いで蛍光体スクリーンに曝露した。750VのPMTを用いたTyphoon FLA 7000システム(GE Healthcare社)で画像化を実行した。
(実施例6)
末端制限断片(TRF)分析
ゲノムDNAを4U/μgのHinfI及びRsaIで37℃で一晩消化した。消化したDNAを、0.1体積の3M酢酸ナトリウムpH5.2及び2.5体積の100%エタノールを用いて沈殿させた。DNAを、70%エタノールで洗浄し、乾燥させ、10mMのトリス-HCl pH7.6、1mMのEDTA中に溶解させた。一次元ゲル電気泳動のために、消化したDNA(2μg)を、1%(w/v)のパルスフィールド認定済みアガロース(Bio-Rad社)ゲルにローディングし、6V/cmで12時間、1秒の最初のスイッチ時間及び6秒の最後のスイッチ時間を用いて分離した。2次元ゲル電気泳動のために、消化したDNA(20μg)を、標準的なゲル電気泳動によって、0.5×TBE中の0.6%(w/v)アガロースゲル中で、第1の方向で、1V/cmで13.5時間分離した。レーンを切り出し、300ng/mlエチジウムブロマイドを含有する1.1%(w/v)アガロースゲル中で、第2の方向で、6V/cmで4時間泳動した。ゲルを50℃で150分間乾燥させ、2×SSC中で30分間、再び水和した。ゲルを、チャーチ(Church)緩衝液(250mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、7%(w/v)SDS、1%(w/v)BSA画分Vグレード(Roche社)、1mMのEDTA)中で50℃で2時間事前にハイブリダイズした。天然のゲルを、γ-[32P]-ATP標識(GGGTTA)4又は(CCCTAA)4オリゴヌクレオチドプローブと一晩ハイブリダイズさせた。ゲルを、室温で15分間、0.2×SSC中で3回洗浄し、PhosphorImagerスクリーンに3日間曝露した。次いでゲルを0.5MのNaOH、1.5MのNaCl中で65℃で40分間変性させ、続いて2×SSC中で2回洗浄した。ゲルを事前に1時間ハイブリダイズし、次いでチャーチ緩衝液中、50℃で、γ-[32P]-ATP標識(GGGTTA)4又は(CCCTAA)4オリゴヌクレオチドプローブと一晩ハイブリダイズさせた。変性したゲルを洗浄し、PhosphorImagerスクリーンに一晩曝露した。750VのPMTを用いたTyphoon FLA7000システム(GE Healthcare社)で画像化を実行した。
(実施例7)
免疫ブロッティング
細胞を収集し、完全ミニEDTA非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)が補足されたRIPA緩衝液(50mMのトリス-HCl pH7.6、150mMのNaCl、1% Nonidet P-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、4mMのEDTA)中に溶解させた。タンパク質を、3～8%酢酸トリス又は4～12%ビストリスゲル(Life Technologies社)のいずれかで分離した。タンパク質をイモビロンP PVDF膜(Merck社)に移した。膜を任意選択でポンソーS(Sigma Aldrich社)で染色し、次いでPBSTで脱色した。次いで膜を、PBST中の5%スキムミルク又はウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかでブロックした。ブロットを、一次抗体(抗体のリストについて、Table 1(表1)を参照)と共に4℃で一晩又は室温で2時間のいずれかでインキュベートした。次いで膜を、対応するHRP結合二次抗体(Dako社)と共に室温で1時間インキュベートし、PICO、PICO PLUS又はFEMTO強化した化学発光試薬(Thermo Scientific社)を使用して、バンドを可視化した。
Figure 2022534138000002
(実施例8)
共免疫沈降反応(co-IP)
ER誘導性システムを含む共IP実験のために、細胞を、MM2ペプチドバリアント(ミモトープ)を含む又は含まない1×哺乳類プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Aldrich社)及び50U/mlベンゾナーゼ(Novagen社)が補足されたIP緩衝液(20mMのトリス-HCl pH7.5、100mMのNaCl、10%(v/v)グリセロール、0.5mMのEDTA、1mMのDTT)中で4℃で2時間溶解させた。溶解の後、NaCl濃度を250mMに高め、次いで溶解産物を16,000×gで15分間清澄化した。次いで上清を、1μgのα-FANCM(Abcam社)又はα-ER(Santa Cruz Biotechnology社)及び20μlのプロテインGセファロース(GE Healthcare社)と共に、又はα-Flag M2アガロース(Sigma Aldrich社)を使用して混合した。4℃で3時間の混合後、ビーズをIP緩衝液で4回、50mMのNH4(CO3)2、0.5mMのEDTAで1回洗浄し、次いで500mMのNH4OH(pH11.0)、0.5mMのEDTAで溶出した。次いでサンプルを凍結乾燥し、免疫ブロッティングの前に1×LDSローディング緩衝液(Life Technologies社)に再懸濁した。
PIP-199を含む共IP実験のために、PIP-199又はDMSOで72時間処置したHeLa細胞を、1mMのPMSF、1mMのDTT及び1×完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社)が補足された20mMのHEPES-KOH pH7.9、200mMのNaCl、2mMのMgCl2、10%グリセロール、0.1% Triton X-100中に4℃で1時間溶解させた。溶解産物を13,000rpm、4℃で40分間清澄化した。次いで上清を、4℃で一晩、30μlのプロテインGダイナビーズ、及び2.5μgの抗BLM(Bethyl社:#A300～110A)、0.5μgの抗RMI1(Proteintech社:14630-1-AP)又は2.5μgの正常ウサギIgG対照(Cell Signalling社:2729S)と共に4℃でインキュベートした。タンパク質を、免疫ブロッティングによる分析の前に、30μlのLDS緩衝液(Life Technologies社)中に70℃で溶出させた。
(実施例9)
免疫蛍光法(IF)及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)
間接IF及びテロメアFISHを、間期核及び分裂中期スプレッドの両方に実行した。分裂間期IF実験のために、細胞をカバーガラス又はLabTekチャンバースライド(Thermo Scientific社)上で成長させた。スライドをSobinoffら、2017に記載されたように調製した。カバーガラス上の細胞をPBSで2回洗浄し、KCM緩衝液(120mMのKCl、20mMのNaCl、10mMのトリスpH7.5、0.1%Triton)で透過化し、PBST及びPBSで再度洗浄し、次いで氷冷した4%ホルムアルデヒドPBS溶液で、室温で10分間固定した。カバーガラスを、抗体希釈緩衝液(20mMのトリス-HCl、pH7.5、2%(w/v)BSA、0.2%(v/v)魚ゼラチン、150mMのNaCl、0.1%(v/v)Triton X-100及び0.1%(w/v)アジ化ナトリウム)及び0.1mg/mlのRNアーゼAで37℃で30分間ブロックした。細胞を、一次抗体(補足のTable 1(表1))と共に、37℃で1時間又は室温で2時間インキュベートし、次いで適切なAlexa Fluor結合二次抗体(Thermo Scientific社)の1:1,000希釈液と共にインキュベートした。カバーガラスをPBSで濯ぎ、次いでテロメアFISHの前に4%(v/v)ホルムアルデヒドを用いて室温で固定した。カバーガラスを、段階的な一連のエタノール(75%で2分間、85%で2分間、及び100%で2分間)に供し、そのまま空気乾燥した。脱水したカバーガラスを、PNAハイブリダイゼーション溶液(70%脱イオンホルムアミド、0.25%(v/v)NENブロッキング試薬(PerkinElmer社)、10mMのトリス-HCl、pH7.5、4mMのNa2HP04、0.5mMのクエン酸、及び1.25mMのMgCl2)中の0.3μg/mlのFAM-OO-(CCCTAA)3テロメアPNAプローブ(Panagene社)と共に重ね、80℃で5分間変性させ、室温で一晩ハイブリダイズした。カバーガラスをPNA洗浄液A(70%ホルムアミド、10mMのTrish pH7.5)、次いでPNA洗浄液B(50mMのトリスpH7.5、150mMのNaCl、0.8% Tween-20)で2回、各5分間洗浄した。2回目のPNA洗浄液BにDAPIを50ng/mlで添加した。最終的に、カバーガラスを、脱イオン水中で、短時間で濯ぎ、空気乾燥させ、DABCO(2.3% 1,4ジアザビシクロ(2.2.2)オクタン、90%グリセロール、50mMのトリスpH8.0)中で固定した。ZeissのAxioイメージャー顕微鏡で適切なフィルターセットを用いて顕微鏡画像を取得した。
(実施例10)
EdU検出
細胞を10μMのEdUで2時間パルスした。細胞を透過化し、次いで4%ホルムアルデヒドPBS溶液で固定した。次いで、抗体希釈緩衝液及びRNアーゼAでブロックする前に、Click-iT(登録商標)Alexa Fluor 647アジ化物反応を、製造元の説明書に従って実行した。テロメアを、TAMRA-OO-(CCCTAA)3テロメアPNAプローブ(Panagene社)を使用したFISHによって可視化し、PMLをIFによって可視化した。
(実施例11)
テロメアDNAの単一分子分析(SMAT)
細胞を100μMのCldUで5時間標識し、その後、トリプシン処理によって回収した。細胞を低融点のアガロースプラグに埋め込み、次いでプロテイナーゼK消化に一晩供した。プラグを、製造元の説明書に従ってアガラーゼ(Thermo Scientific社)を用いて溶解させた。分子コーミングは、製造元の説明書に従って、分子コーミングシステム(Genomic Vision S.A.社)を2kb/μmの一定の伸長係数と共に使用して、ビニルシランカバーガラス(20×20mm;Genomic Vision S.A.社)を使用して実行された。
コーミングの後、カバーガラスを60℃で4時間乾燥させた。コーミングされたDNA繊維の品質及び完全性を、YoYo-1対比染色(Molecular Probes社)を使用してチェックした。カバーガラスを、アルカリ変性緩衝液(70%エタノール中の0.2MのNaOH、0.1% b-メルカプトエタノール)中で25分間変性させ、0.5%グルタルアルデヒドを5分間添加することによって固定した。TAMRA-OO-KKK(TTAGGG)3PNAプローブ(Panagene社)を用いたハイブリダイゼーションによって、テロメアDNAを可視化した。ハロゲン化ヌクレオチドを、ラット抗CldUモノクローナル抗体(Accurate社)及びAlexa Fluor 488結合ヤギ抗ラット抗体(Molecular Probes社)で検出した。ApoTomeモジュールを備えたZeiss社のAxio Imager顕微鏡でテロメア繊維を検出し、Zenソフトウェア(Zeiss社)を用いて分析した。
(実施例12)
新生のテロメア分析
BrdUプルダウンを、Vermaら、2018に記載された通りに、部分的に改変して実行した。100μMのBrdU(Sigma社)で5時間のパルス化の後に細胞を回収した。ゲノムDNA(gDNA)を抽出し、100μlのEB緩衝液(Qiagen社)に再懸濁した。Covaris M220超音波発生装置を使用してgDNAを100～1,000bpの断片にせん断した。4μgのせん断したgDNAを95℃で10分間変性させ、次いですぐに冷却した。変性したgDNAを、250μlの免疫沈降緩衝液(PBS中の0.0625%(v/v)Triton X-100)中の2μgの対照マウスIgG(Millipore社)又は抗BrdU抗体(BD Biosciences社)と共にインキュベートし、4℃で一晩回転させた。次いでサンプルを、60μlのBSAでブロックした(ヌクレアーゼ非含有)プロテインGアガロースビーズ(Roche社)と共に4℃で一晩インキュベートした。次の日、ビーズを13,000rpmで60秒の遠心分離により収集し、1mlの緩衝液A(20mMのHEPES-KOH、pH8.0、2mMのMgCl2、300mMのKCl、1mMのEDTA、10%(v/v)グリセロール、及び48 0.1%(v/v)Triton X-100)、次いで、1mlのTE(10mMのトリス-HCl、1mMのEDTA、pH8.0)で2回洗浄した。免疫沈降したDNAを、プロテインGアガロースビーズから100μlの溶出緩衝液(50mMのNaHCO3、及び1%(v/v)SDS)中に溶出させ、次いでQIAquick PCR精製キット(Qiagen社)で精製し、140μlのTE中に溶出させた。サンプル及びインプットを200μlの0.46MのNaOHで希釈し、95℃で5分間変性させ、氷上で冷却し、次いでHybond XL(GE Healthcare Life Sciences社)上にドットブロットした。膜を、Stratalinker(Stratagene社)中で、254nmで、2×240mJで架橋し、PerfectHyb Plusハイブリダイゼーション緩衝液(Sigma社)中で、37℃で54分間、事前にハイブリダイズし、γ-[32P]-ATP標識(TTAGGG)4テロメアプローブで一晩ハイブリダイズして、C鎖を検出した。G鎖を検出するために、ほぼ沸騰した0.1% SDSで5回、20分間洗浄することでブロットをストリッピングし、γ-[32P]-ATP標識(CCCTAA)4テロメアプローブで再びプローブ付けした。膜を2×SSC中で3回、室温で15分間洗浄し、次いでPhosphorImagerスクリーンに曝露した。ImageQuantソフトウェア(GE Healthcare Life Sciences社)を使用したアレイ分析機能で画像化を実行した。
代替として、gDNAを抽出し、BrdU免疫沈降の前にHinfI及びRsaIで消化した。次いで免疫沈降したDNAを、プロテインGアガロースビーズから100μlの溶出緩衝液(50mMのNaHCO3、及び1% 61(v/v)SDS)中に溶出させ、QIAquick PCR精製キット(Qiagen社)で精製し、25μLのTE中に溶出させた。Cサークルの増幅及び検出を、Hensonら、2009に記載された通りに行った。
(実施例13)
自動画像分析
ZEN顕微鏡画像(.czi)を、ZEN desk 2011ソフトウェア(Zeiss社)を使用してzスタックの拡大投影図に加工し、分析のためにCellprofiler v2.1.1(Carpenterら、2006)にインポートした。DAPIチャネルを使用して、主要なオブジェクトとして個々の核をマスクした。それぞれのセグメント化された核内の病巣を、強度閾値ベースのマスクを使用して同定した。第1のオブジェクトの領域の少なくとも20%が第2のオブジェクトの領域内に入っている場合、いずれかの所与のオブジェクトは、別のオブジェクトとオーバーラップするとみなされた。
(実施例14)
姉妹染色分体交換(SCE)アッセイ
SCEアッセイをBayani、2005に記載された通りに実行し、細胞を、2つの細胞周期にわたり100μMのBrdU(Sigma Aldrich社)中で、200nMの4-ヒドロキシタモキシフェン(Sigma Aldrich社)含有又は非含有で培養し、続いて0.2μg/mlのコルセミド(Life Technologies社)中で1時間培養した。Zeiss社のAxioplan 2顕微鏡を使用して有糸分裂スプレッドの画像を捕獲し、SCEを手動でスコア付けし、盲検で検証した。明らかに中心体における「フリッピング」に起因する交換は、定量から省いた。有糸分裂異常を、Caldonら、2013及びBayani、2005に記載された通りにスコア付けした。
(実施例15)
クローン形成アッセイ
クローン形成アッセイを、Frankenら、2006に記載された通りに実行し、200nMの4-ヒドロキシタモキシフェン(Sigma Aldrich社)含有又は非含有で細胞1,000個/10cmの培養皿に細胞をプレーティングし、4-ヒドロキシタモキシフェンを4日目及び7日目に補給した。PIP-199で処置した細胞(Aobious社 #AOB33732、CAS番号622795-76-0)の場合、細胞300個/ウェルで6ウェルプレートに細胞をプレーティングし、ジメチルスルホキシド(DMSO)中の0～10μMの薬物で処置した。細胞をそのまま11日間成長させた。プレートを1×PBSで洗浄し、次いで固定し、1部の酢酸、7部のメタノール中の0.5%(w/v)クリスタルバイオレットで室温で2時間染色した。次いでプレートを水道水で洗浄し、そのまま空気乾燥した。各プレート上のコロニーを計数し、プレート効率及び生存画分を計算した。
(実施例16)
生細胞の画像化
画像化の24時間前に、細胞を、アルシアンブルーでコーティングされた12ウェルの1.5mmガラス底ウェル(MatTek社)中に植え付けた。120個の細胞及び後続の娘細胞を6分のインターバルで48時間モニターした。核の数、分裂間期の期間、有糸分裂の期間(最初の細胞の集合から細胞質分裂の完了までの期間によって定義される)、及び有糸分裂の結果(正常、有糸分裂中の致死、途中で止まった、多極分裂、及び多核の細胞を生じる細胞融合)を記録した。
(実施例17)
フローサイトメトリー
エタノール固定した単一細胞懸濁液(およそ細胞1×106個)を、DNA分析のために、0.25mlのPBS中の2mg/mlのRNアーゼA及び0.1mg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。細胞を37℃で30分間インキュベートし、暗所、室温で少なくとも10分間平衡化した。PIを励起させるために空冷した488nmアルゴンレーザーを使用したBD FACSCantoフローサイトメトリー(BD Biosciences社)によって、細胞を分析した。およそ200事象/秒の流速で合計9,800～10,000のストッピングゲート事象が収集された。各細胞の前方散乱(FSC、サイズ)及び側方散乱(SSC、内部の粒状性)を記録した。死細胞片及びダブレットを識別及び除外するために、パルス幅(PI-W)に対してパルス面積(PI-A)をプロットした。4NのDNA含量とパルス幅の増加を有する細胞として同定されたダブレットを除外した。細胞周期集団分析をFlowJo v5ソフトウェア(FlowJo)を用いて実行した。細胞分裂相(G0/G1及びG2/M)のゲーティングを、ディーン-ジェットアルゴリズムを使用して実行した。S期の細胞のパーセンテージを、G0/G1及びG2/Mゲーティング後の残りのパーセンテージとして計算した。
(実施例18)
統計的分析
定量及び統計的分析に関する詳細は図の凡例に提供される。正常に分配されたと仮定されるデータに、両側スチューデントのt検定を実行し、一方で正常に分配されなかったと仮定されるデータに、両側マン-ホイットニー検定を実行した。処置間の事象における実質的な差のために、テロメア伸長の長さには統計的分析を実行しなかった。データ分析は、Microsoft Excel及びGraphPadプリズムを使用して実行された。
(実施例19)
FANCM枯渇はテロメア機能不全及びALTマーカーを誘発する
ALTテロメアは、致死及びテロメラーゼ陽性細胞と比較して上昇したDNA傷害応答(DDR)を特徴とする(Cesareら、2009)。このような傷害は、DNA傷害マーカーγ-H2AXとテロメアDNAの共局在を特徴とするテロメア機能不全によって誘発された病巣(TIF)として観察される。siFANCM1及びsiFANCM2を使用したFANCMのノックダウン(図1a)は、U-2 OS ALT細胞においてスクランブル化した対照と比較して分裂中期TIF(meta-TIF)における顕著な増加をもたらした(図2a)。テロメア機能不全のALT特異的な誘発とは対照的に、FANCM枯渇は、U-2 OS(ALT)及びHeLa(テロメラーゼ陽性)細胞株の両方において全体的なDDRシグナル伝達の同等なレベルを誘発した(図1b)。
ALT細胞は、特徴的に長く不均一なテロメアの長さ、並びにtサークル及びCサークルを含む豊富な染色体外のテロメア反復(ECTR)DNAを有する(Hensonら、2009)。単離された末端制限断片(TRF)の一次元ゲル電気泳動、それに続く天然条件下でのハイブリダイゼーションにより、FANCM枯渇を伴うGリッチなオーバーハングの減少と低分子量の一本鎖(ss)のCリッチなテロメアDNAにおける著しい増加の両方(図2b;それぞれ黒色の矢印及び赤色の矢印)が解明された。このDNAの低分子量種は未消化のゲノムDNAの分離後も検出されたことから(図1c)、本来それは染色体外であることが示される。これらの観察にもかかわらず、平均テロメア長さの変化は観察されなかった(図2b)。これらの作用は、両方のsiRNAを使用してFANCM枯渇後に観察され、最も著しい作用はsiFANCM2で見られた。結果として、siFANCM2を後続の実験で使用した。2次元ゲル電気泳動によるTRFの分離から、染色体外tサークルにおける増加が同定されたが、これは、FANCM枯渇の後、直鎖状テロメアDNAの弧の上の弧であることを特徴的に解明する(図2c;青色の矢印)。低分子量ss CリッチテロメアDNAは、FANCM枯渇細胞において、tサークルと直鎖状テロメアDNAの弧の両方の下の別個の分かれた弧として泳動した(図2c;赤色の矢印)。
FANCM枯渇は、ローリングサークル増幅によって検出されたCサークルにおける著しい増加をもたらした(図1d、図2d)。この増幅したCサークルにおける増加は、1次元及び2次元ゲル電気泳動によって同定された低分子量ss ECTR CリッチテロメアDNA(図2b及び図2c)に一致しており、この種のDNAがCサークルであることと一致する。これは、ゲル電気泳動によって初めて報告されたCサークルの可視化であり、tサークル及びCサークルが別個のDNA種であることを解明することを実証する。テロメアDNA及びテロメア関連タンパク質がPMLタンパク質と共局在化するALT関連PML体(APB)の定量は、U-2 OS及びIIICF/c細胞では、FANCM枯渇後にAPB数が顕著に増加したが、GM847及びSaos-2細胞では変化がなかったことを解明した(図1e、図2e及び図2f)。
興味深いことに、APB内のテロメアのシグナルの強度における顕著な増加も、分析された全てのALT細胞株で観察された(図1f、図2e及び図2g)。これは、FANCM枯渇に応答したAPBにおける増加したテロメアDNA蓄積又はテロメアのクラスター化を示す。まとめると、これらのデータは、FANCMの一時的な喪失後に、ALT表現型が著しく誘発されるが、全体的なテロメア伸長はみられないことを実証する。これらの観察はALT細胞株(U-2 OS、IIICF/c、GM847及びSaos-2)に特異的であり、p53のステータスとは無関係であるが、一方でALTの特徴の誘発は、テロメラーゼ陽性細胞株(HeLa、HeLa 1.2.11及びHCT116)では、FANCM枯渇に応答して観察されなかった(図1)。これは、ALT表現型の誘発が、ALT特異的なテロメア機能不全に起因する可能性があることを示す。
(実施例20)
FANCM枯渇が破断によって誘発されたテロメア合成を促進する
ALTは、酵母において破断によって誘発された複製(BIR)に類似した保存的な破断によって誘発されたテロメア合成のメカニズムを含み、PolδのPOLD3サブユニットに依存する。FANCM枯渇後におけるテロメアへのPOLD3補充の顕著な増加(図3a)が同定された。これは、合計の新生のテロメア反復の生成における増加と一致した(図3b)。新生のテロメアDNAは、APBと共に局在しており(図3c)、FANCM枯渇に応答して生成したCサークルの劇的な誘発に寄与した(図3d)。
これまでに、破断によって誘発されたテロメア合成がBLMに依存すること、及びテロメア伸長のRAD51依存性及び非依存性経路の両方が存在し得ることが示されている(Sobinoffら、2017、Dilleyら、2016、Choら、2014及びVermaら、2016)。これらの経路は、Rad52及びBLMホモログSgs1を必要とする、I型(Rad51依存性)及びII型(Rad51非依存性)テロメラーゼが存在しないサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)の生き残りを連想させる。FANCMノックダウンの状況におけるこれらのタンパク質の関与を特徴付けるために、本発明者らは、FANCMと、POLD3、BLM、RAD51及びRAD52のいずれかとを同時枯渇させた(補足の図4a)。興味深いことに、FANCM枯渇は、POLD3、BLM、及びRAD51のタンパク質レベルの同時発生的な減少をもたらし(図4a及び図4b)、RAD51で顕著であったことから、FANCMがこれらのタンパク質を共に調節することを示唆する。POLD3、BLM又はRAD51の独立した枯渇が、FANCM枯渇で見られるものと比較して、ALT活性に対してわずかな作用又はアンタゴニスト作用を引き起こすため、この共調節は、観察された悪化するALT表現型に寄与する可能性は低い。同時枯渇実験は、FANCM枯渇後のCサークルアッセイとTRF分析の両方によって検出されたCサークルの上昇したレベルは、POLD3及びBLMに依存し、RAD51及びRAD52に部分的に依存することを示した(図4c及び図5a)。同様に、FANCM枯渇に応答して増加したAPBの数及び強度は、POLD3及びBLMに依存し、RAD51及びRAD52に部分的に依存していた(図5b及び図5c)。
テロメア合成事象の頻度及び長さを直接測定するために、CldUを取り込んだDNA繊維におけるテロメア(SMAT)の単一分子分析を使用した。FANCM枯渇は、テロメア伸長事象の数における顕著な増加をもたらしたが、伸長生成物の長さは不変のままであった(図5d)。この増加は、POLD3、BLM及びRAD52に優勢に依存する(図5d)。全体として、これらのデータは、FANCM枯渇が、ALTテロメアにおいてPOLD3及びBLMによって媒介される破断によって誘発されたテロメア合成の増加をもたらすことを実証し、これは、ss及びCリッチに優勢な新生ECTRの急速な誘発と一致する。これらのデータは、RAD51よりRAD52に対するより強い依存を示すが、破断によって誘発されたテロメア合成における両方のタンパク質の役割を裏付ける。
(実施例21)
FANCMのMM2ドメインはALT活性を弱めるのに必要である
FANCMの複数の機能性ドメインは、よく特徴付けられている。特に、PIPドメインは、保存されたPIP-ボックス配列を介して増殖性細胞核抗原(PCNA)と相互作用する(Rohlederら、2016)。保存されたDEAHドメインは、ATP依存性DNAリモデリングトランスロカーゼ活性を有し、複製フォーク及びDNA修復中間体に結合して、新生及び親DNA鎖の置き換え及びアニーリングを促進する(Xueら、2008及びGariら、2008)。主要なヒストンフォールド1及び2(MHF1/2)ヘテロ四量体は、MHF1/2と相互作用するドメイン(MID)に結合し、FANCMをDNA分岐点に標的化して複製フォークのトラバースを容易にする必須の補因子である(Yanら、2010、Huangら、2013、Foxら、2014及びZhaoら、2014)。MM1ドメインは、FAコア複合体をICL部位に補充し;MM2ドメインは、BTR複合体と相互作用して複製フォークの安定化を調整し;MM3ドメインは、わかっている機能がない(Singhら、2013)。S1045における主要な部位は、遺伝毒性ストレスを受けてリン酸化され、これは、効率的なATR-CHK1チェックポイント活性化に必要である。ERCC4エンドヌクレアーゼドメイン及びヘリックス-ヘアピン-ヘリックス(HhH)モチーフは、ICL部位に存在するDNAにおけるss DNAギャップ及び病変を認識し、別の必須のFANCM補因子であるFAAP24とのヘテロ二量体化を容易にする(Xueら、2008、Blackfordら、2012、Kimら、2008及びHuangら、2010)。
FANCMはテロメアDNAと直接会合することが他所で示されている(Panら、2017及びPentzら、2019)。
ALT表現型を抑制するのに必要な特定の機能的なFANCMの活性を決定するために、それぞれ同定されたドメインを崩壊させた10種の突然変異レンチウイルス構築物(配列番号19～28)のパネル(図6a)を確立した。PIP突然変異体(配列番号19)は、L8R及びW12Sで置換されている。K117R突然変異体(配列番号20)は、K117Rで置換されている。MIDドメイン突然変異体(配列番号21)は、MHF1/2ヘテロ四量体の境界との相互作用を崩壊させるために、V749G/H751Gで置換されている。S1045A突然変異体(配列番号22)は、S1045Aで置換されている。MM1ドメイン突然変異体(配列番号23)は、アミノ酸残基943～1004に欠失を有する。MM2ドメイン突然変異体(配列番号24)は、アミノ酸残基1219～1251に欠失を有する。FF>AA突然変異体(配列番号25)は、MM2ドメイン内にフェニルアラニンのアラニンでの二重置換(FANCMF1232A/F1236A)を有し、これまでにBTR結合を実質的に崩壊させることが特徴付けられている(Deansら、2009)。MM3ドメイン突然変異体(配列番号26)は、アミノ酸残基1337～1707に欠失を有する。ERCC4ドメイン突然変異体(配列番号27)は、アミノ酸残基1815～1922に欠失を有する。HhHドメイン突然変異体(配列番号28)は、アミノ酸残基1971～2048に欠失を有する。これらの構築物は、野生型FANCMを含めて、U-2 OS細胞に安定して形質導入され、FANCM突然変異体の外因性発現がウェスタンブロット分析によって確認された(図7a)。FANCMの安定な過剰発現は、テロメア機能不全(図6b)と脆いテロメアの数(図6c)の両方における顕著な減少をもたらした。突然変異体のほとんども、テロメアDDR及びテロメアの脆さを抑制した(図6b及び図6c)。例外は、テロメア機能不全とテロメアの脆さの両方が著しく増加したMM2(配列番号24)、FF>AA及びMIDドメイン突然変異体と、表現型を抑制できなかったDEAHドメインが崩壊しているK117R突然変異体(配列番号20)(図6b及び図6c)であった。ECTR生成及びALT活性に対するFANCM突然変異体過剰発現の作用を検査した。野生型FANCMの安定な過剰発現と一致して、ほとんどのFANCM突然変異体の過剰発現は、Cサークル生成における顕著な減少をもたらした(図6d)。例外は、Cサークルレベルにおける変化を引き起こさなかったK117R(配列番号20)、ERCC4(配列番号27)及びHhHドメイン(配列番号28)突然変異体、並びにベクター対照と比較しておよそ2倍のCサークル増加を引き起こしたMM2(配列番号24)及びFF>AA(配列番号25)ドメイン突然変異体(図6d)であった。野生型又は突然変異FANCMの過剰発現後、平均テロメア長さの変化は観察されなかったが、これまでに同定された低分子量ss CリッチテロメアDNAのスメアは、K117R、MM2及びFF>AAドメイン突然変異体を過剰発現する細胞で観察された(図7b)。これらの変化は、K117R、MM2及びFF>AA突然変異体の過剰発現後の、APBの数とAPB内のテロメアのシグナルの強度の両方における顕著な増加と一致した(図7c)。他の突然変異体の一部の過剰発現の後、APBの数及び強度における比較的わずかな差が観察されたことから、APBの形成及び機能の基礎となる複雑さが示される。
FANCM突然変異体の過剰発現がテロメア合成に直接の影響を有するかどうかを決定するためのテロメア伸長事象の数及び長さを測定した。伸長事象の数における顕著な増加が、MM2及びFF>AAドメイン突然変異体の過剰発現に応答して観察されたが(図6e)、伸長事象の長さは、野生型FANCM及び他の突然変異体の過剰発現の後、比較的安定なままであった。これらのデータは、野生型FANCMはテロメア複製ストレスを抑制するが、テロメア伸長事象の長さに直接影響を与えないことを示す。全体として、ALT活性を調節することにおける、そのATP依存性トランスロカーゼ活性(DEAHドメイン)及びそのBTR結合能力(MM2ドメイン)によって提供される、複製フォークのリモデリング及びFANCMの再開活性の機能的な有意性が実証された。このデータはまた、MM2ドメイン突然変異体の過剰発現の後におけるドミナントネガティブ作用も示す。
更なる研究を、K117R置換及びFF>AA二重置換の両方を含む二重突然変異(DM)レンチウイルス構築物(配列番号35)を使用して実行した。K117R突然変異体及びFF>AA突然変異体と比較した、テロメア機能不全、APB頻度及びCサークルレベルへのDMの作用を検査した。図23A～図23Cで示されるように、DMは、K117R突然変異体又はFF>AA突然変異体のいずれかと比較して、より著しく大きいCサークルの増加を引き起こした。DM突然変異体はまた、空のベクター又は野生型のいずれかと比較して強化されたテロメア機能不全も示した。これらの変化は、K117R突然変異体又はFF>AA突然変異体のいずれかと比較してより大きいAPB数の増加を伴っていた。したがって、本発明者らは、FANCMに対する同定された2つの独立した標的(MM2相互作用ドメイン及びATPアーゼドメイン)を有する。FANCMのATPアーゼドメインが、テロメアにおける複製ストレスの主要なきっかけであるテロメアのRループを改造するのに必要であることを示すデータを考慮すると、これらの研究は、FANCMのATPアーゼ活性及びRMI相互作用が、ALT細胞におけるテロメアの安定性を独立して支持することを示唆する。これらの研究は、ALTがんも、FANCM-RMI相互作用の阻害剤を、単独で、又はFANCMのATPアーゼ及び/又はトランスロカーゼ活性の阻害剤と組み合わせて使用して処置され得ることを示唆する。
ALT表現型抑制の欠陥は、FANCMのMM2ドメイン(FF>AA)とトランスロカーゼドメイン(K117R)の両方が突然変異した二重突然変異(DM)FANCMの過剰発現によって悪化する。
(a)野生型(WT)又はFANCMドメイン突然変異体(K117R、FF>AA、DM)を安定して過剰発現するU-2 OS細胞におけるCサークルアッセイの代表的なドットブロット及び定量。Cサークルを、空のベクター対照(EV)の平均に正規化した。エラーバーは、n=3の実験からの平均±SEMを表す、*p<0.05、**p<0.005、スチューデントのt検定。(b)野生型(WT)又はFANCM突然変異体を過剰発現するU-2 OS細胞におけるAPB頻度の定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=150個の細胞を各突然変異体につきスコア付けした、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。(c)野生型(WT)又はFANCM突然変異体を安定して過剰発現するU-2 OS細胞における分裂中期TIFの定量。散布図のバーは、平均±SEMを表す。3つの実験から、n=120の分裂中期を各突然変異体につきスコア付けした、*p<0.05、**p<0.005、マン-ホイットニー検定。全ての統計の比較は、EV対照に対してなされる。
(実施例22)
FANCM-BTR複合体の崩壊はALT細胞の生存能を阻害する
これまでに、FANCM枯渇が、ALTテロメアにおいて複製ストレスを誘発したが、細胞の生存能に影響を与えなかったことが示されている(Panら、2017)。対照的に、この研究の経過にわたり、FANCM枯渇後の有糸分裂細胞の不足が一貫して観察された。細胞周期進行へのFANCM枯渇の作用を決定するために、細胞周期分析及び生細胞の画像化を使用した。FANCM枯渇HeLa細胞と比較して、FANCM枯渇U-2 OS細胞においてG2/Mにおける細胞の蓄積が観察された(図8a及び図8b)。U-2 OS及びHeLa細胞の両方が、分裂間期の期間の増加によって明らかなように、FANCM枯渇後のサイクリング速度の遅延を示した(図8c及び図8d)。FANCMを枯渇させたU-2 OS細胞は、48時間の観察の時間枠にわたり有糸分裂に入れなかった細胞の3分の1未満で細胞周期の減衰を呈示し、一方でHeLa細胞における有糸分裂開始へのFANCM枯渇の作用は、著しく少なかった(図8c及び図8d)。FANCM枯渇の後、有糸分裂の結果における変化(異常な有糸分裂又は有糸分裂の死)は明らかではなく、これは、有糸分裂の前に停止している細胞と一致する(図8e及び図8f)。有糸分裂まで進行可能な細胞は、危険なレベルのFANCMノックダウンを回避した可能性がある。これらのデータは、ALT細胞が、FANCM枯渇によって引き起こされる複製ストレスに対して過敏性であることを実証する。
細胞生存へのFANCM攪乱の作用を更に評価するために、がん細胞株にわたり遺伝子を同定しその要件を列挙する第一歩であるProject Achillesを利用した(Meyersら、2017)。CRISPR-Cas9によって媒介されるノックアウト後のFANCMに関する遺伝子依存性スコアを比較した。遺伝子依存性スコアを、CERES43を使用して計算したところ、FANCMがその細胞株において必須である可能性が示される。より低い遺伝子依存性スコアは、遺伝子が必須であるより高い可能性を示し、-1は全ての汎がん必須遺伝子に関する中央値スコアを表す。全体として、細胞株のパネルにわたり、FANCMは、細胞の生存能に必須ではないようであった(図9)。しかしながら、同定されたALT細胞株のサブセットに関し、大部分(4/5)が-1の遺伝子依存性スコアの周辺でクラスター化した(図9)。これらのデータは、ALTがん細胞の生存能におけるFANCMに関する必須の役割を裏付ける。
FANCMを介してALT細胞の生存能を特異的に標的化する可能性を調査するために、FANCM-BTR複合体を崩壊させる2つのアプローチを採用した。第1に、全長FANCMと類似のBTR複合体への結合親和性を有することが示された、MM2ドメインの高度に保存された28アミノ酸に対応する化学的に合成されたペプチド(配列番号29)を使用した(Deansら、2009)。細胞溶解産物へのMM2ペプチドの添加は、FANCM-BTR複合体形成の用量依存性阻害をもたらしたが、BTRに結合しないFF>AA突然変異体を含有するMM2ペプチド(配列番号30)の添加は、複合体形成を阻害することができなかった(図10a及び図10b)。ALT細胞におけるFANCM-BTR複合体崩壊の作用を調査するために、MM2ペプチドを、エストロゲン受容体のC末端への融合によってタモキシフェンに対して機能的に依存性にした(MM2-ER)(図11a)。FANCM-BTR複合体形成を阻害するMM2-ER融合タンパク質の能力を、FANCM又はERのいずれかとの免疫沈降によって試験した。タモキシフェンの非存在下で、BTR複合体のTOP3A及びRMI1成分は、FANCMによって免疫沈降したが、ERによっては免疫沈降しなかった(図11b)。タモキシフェンの添加は、MM2-ER融合タンパク質の活性化をもたらし、これは、FANCMとではなくERとのTOP3A及びRMI1の免疫沈降によって検出された。対照FF>AA突然変異MM2-ER融合タンパク質の活性化は、BTR複合体をFANCMから隔離することができなかった(図11b)。
FANCM-BTR複合体崩壊のゲノムの効能を確認するために、これまでFANCM枯渇が増加したSCE形成をもたらすことが示された通りに、姉妹染色分体交換(SCE)が定量化された(Deansら、2009)。MM2-ER融合タンパク質の活性化に応答するSCEの頻度の増加が同定されたが、FF>AA突然変異体(図10c及び図10d)では同定されなかったことから、これは、ALTとテロメラーゼ陽性細胞株の両方におけるFANCM-BTR複合体の有効な崩壊と一致する。MM2-ER融合タンパク質の活性化は、U-2 OS細胞におけるTIFの顕著な増加をもたらしたが、FF>AA突然変異融合タンパク質の活性化の後、TIFの小さいが有意な減少が観察された(図11c)。FF>AA突然変異体ではなくMM2-ER融合タンパク質の活性化もCサークルを誘発したことから(図11d)、ALTテロメアにおける複製ストレスの強化がALT活性の増加をもたらすことが示される。クローン産生性の生存アッセイから、MM2-ER融合タンパク質の活性化後の、U-2 OS、GM847及びSaos-2 ALT細胞の生存における10～20倍の減少が解明されたが、FF>AA突然変異MM2-ER融合タンパク質の活性化は細胞生存に影響を与えなかった(図11e)。テロメラーゼ陽性細胞株HeLa及びHCT116において、野生型MM2-ER又はFF>AA突然変異MM2-ER融合タンパク質のいずれかの活性化では、細胞生存への影響は観察されなかった(図11e)。
第2のアプローチは、FANCM-BTR内のMM2-RMI相互作用の小分子阻害剤であるPIP-199の濃度を増加させることで細胞を処置することを含んでいた。U-2 OS、GM847及びSaos-2 ALT細胞株におけるCサークルの増加(図11f)が観察された。これは、PIP-199によって媒介されるFANCM-BTR複合体の崩壊と一致する。クローン形成アッセイは、テロメラーゼ陽性細胞と比較したPIP-199に対するALT細胞の過敏性を同定した(図11g及び図12a)。U-2 OS細胞におけるBLM及びRMI1の共免疫沈降反応実験は、72時間後にPIP-199の濃度を増加させることによる、FANCM-BLM及びFANCM-RMI1相互作用の崩壊を確認した(図12b)。
これらの実験は、FANCMとBTR複合体との重要な結合相互作用を崩壊させるための2つの独立したアプローチを採用し、FANCM-BTR複合体の阻害が複製ストレスと上昇したCサークルをもたらすことを実証する。
まとめると、本発明者らの研究は、FANCMがALT活性を調節するメカニズムを定義した。具体的に言えば、FANCMは、BTR依存性の、FA-コア複合体とは独立した方式で機能して、テロメア内で自発的に生じる複製ストレスを解消する。ALTテロメアは、それらを複製欠陥にさせる固有の構造的な異常を有することから、FANCM枯渇に対して過敏性である。FANCMの非存在下で、又はFANCM-BTR複合体の合成阻害を介して、失速したフォークは劣化して、DSBを形成する。これは、機能不全性のテロメアを修復するための破断によって誘発されたテロメア合成事象の誘発をもたらし、新生のECTR DNA種の生産と一致する。ECTR蓄積は、細胞のRPA予備の消耗によって更にDDRを悪化させる可能性がある。DSB形成及び続くDDRの結果は、G2/M失速を介した過剰なALT活性及び細胞の生存能の喪失を含む。重要なことに、本発明者らは、FANCM-BTR複合体阻害を使用して、ALTがん細胞の成長及び生存能を選択的に抑制できること、及びFANCM-RMI相互作用を標的化することは、ALTがん細胞致死のための有力な戦略であることを見出した。
(実施例23)
FANCMはALT細胞においてBMLを調節する
方法
細胞株及び培養条件
HeLa子宮頸がん、HT1080線維肉腫、及びHEK293胎児腎臓細胞を、ATCCから購入した。U20S骨肉腫細胞は、M.Lopes氏(IMCR、Zurich、Switzerland)からの親切な贈与であった。Hu09、Saos2及びHOS骨肉腫細胞は、B.Fuchs氏(Balgrist University Hospital、Zurich、Switzerland)からの親切な贈与であった。WI-38 VA13インビトロSV40形質転換肺線維芽細胞は、A.Londono-Vallejo氏(CNRS、Paris、France)からの親切な贈与であった。SKNAS神経芽細胞腫細胞は、0.Shakhova氏(University Hospital Zurich、Switzerland)からの親切な贈与であった。HeLa、HT1080、HEK293、U20S、及びWI-38 VA13細胞を、10%テトラサイクリン非含有ウシ胎児血清(Pan BioTech社)及び100U/mlペニシリン-ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific社)が補足された高グルコースDMEM、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社)中で培養した。Hu09、Saos2、HOS及びSKNAS細胞を、10%テトラサイクリン非含有ウシ胎児血清(Pan BioTech社)、100U/mlペニシリン-ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific社)及び非必須アミノ酸(Thermo Fisher Scientific社)が補足された高グルコースDMEM/F12、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific社)中で培養した。マイコプラズマ汚染を、VenorGeMマイコプラズマPCR検出キット(Minerva Biolabs社)を製造元の説明書に従って使用して試験した。示された場合、細胞を、1μMのカンプトテシン(Sigma-Aldrich社)と3時間、0.2mMのヒドロキシ尿素(Sigma-Aldrich社)と16時間、20μMのBIBR1532(Merck Millipore社)と7日間、及び10μMのRO-3306(Selleckchem社)と18時間インキュベートした。
タンパク質の異所発現
FANCM相補性実験のために、N末端にV5タグを有するFANCMバリアントをコードするsiFa及びsiFb耐性cDNAをGenScriptで合成し、レンチウイルスベクターpLVX-TetOne-Puro(Clontech社)にクローニングした。得られたプラスミド、pLVX-V5FANCM及びpLVX-V5FANCMK117Rを使用して、レンチウイルスを生産し、U20S細胞に感染させ、続いて1μg/mlのピューロマイシン(Merck Millipore社)を含有する培地中で選択した。1μg/mlのドキシサイクリン(Sigma-Aldrich社)を含有する培地中で実験を実行した。RNアーゼH1過剰発現のために、U20S細胞を、pLHCX-MYC-RHIWT及びpLHCX-MYC-RHID145Aプラスミド11を使用して生産されたレトロウイルスに感染させ、続いて200μg/mlのハイグロマイシンB(VWR)を含有する培地中で選択した。TRF1過剰発現のために、U20S細胞を、pLPC-NFLAG-TRF1(T.de Lange氏からの親切な贈与、Addgeneプラスミド#16058)を使用して生産されたレトロウイルスに感染させ、続いてピューロマイシンで選択した。導入遺伝子発現をウェスタンブロッティングによって検証した。テロメラーゼ過剰発現のために、U20S及びHeLa細胞を、pBABEpuroUThTERT+U3-hTR-500プラスミド(Addgeneプラスミド#27665)を使用して生産されたレトロウイルスに感染させ、続いてピューロマイシンで選択した。標準的手順に従ってウイルスをHEK293細胞で生産した。FANCM、RNアーゼH1及びTRF1異所発現を、ウェスタンブロッティングによって検証した(以下を参照)。hTERT及びhTR発現を、以下のオリゴヌクレオチドを使用した全RNAへの定量RT-PCRによって検証した:hTERTフォワード、5'-agagtgtctggagcaagttgc-3'(配列番号41);hTERTリバース、5'-cgtagtccatgttcacaatcg-3'(配列番号42);hTRフォワード、5'-gtggtggccattttttgtctaac-3'(配列番号43);hTRリバース、5'-tgctctagaatgaacggtggaa-3'(配列番号44);アクチンB1フォワード、5'-tccctggagaagagctacga-3'(配列番号45);アクチンB1リバース、5'-agcactgtgttggcgtacag-3'(配列番号46)。アクチンB1を、標準として使用した。
siRNAによって媒介されるタンパク質枯渇
DsiRNA(Integrated DNA Technologies社)を、Lipofectamine RNAiMAX試薬(Invitrogen社)を製造元の説明書に従って使用してトランスフェクトした。DsiRNAを、別段の指定がない限り20nMの最終濃度で使用した。トランスフェクションの5時間後に培地を交換し、別段の指定がない限りトランスフェクションの48時間後にサンプルを収集した。以下のmRNA標的配列を使用した:
siFa:5'-GGATGTTTAGGAGAACAAAGAGCTA-3'(配列番号33);
siFb:5'-CCCATCAAATGAAGATATGCAGAAT-3'(配列番号34);
siBl:5'-GCTAGGAGTCTGCGTGCGAGGATTA-3'(配列番号36);
siATRXa:5'-GAGGAAACCUUCAAUUGUAACAAAGUA-3'(配列番号37);
siATRXb:5'-UGCAAGCUCUAUCAGUACUACUUAGAU-3'(配列番号38);
siTRFl:5'-CUUUCUUUCUUAUUAAGGUCUUGUUGC-3'(配列番号39);
siRNアーゼH1:5'-UUGUCUAAUGCCUACAUUUAAAGGAUG-3'(配列番号40)。
NC1陰性対照(51-01-14-03)を、siCtとして使用した。
細胞の増殖及び生存能アッセイ
コロニー形成アッセイのために、細胞をsiRNAでトランスフェクトし、24時間後、300～500個の細胞を3cmの培養皿にプレーティングし、目に見えるコロニーが形成されるまで成長させた。細胞を1%クリスタルバイオレット、1%ホルムアルデヒド、1%MeOH(Sigma-Aldrich社)で室温で20分染色させ、続いて水道水で洗浄した。プレートを風乾させ、FluorChem HD2イメージング装置(Alpha Innotech社)で撮影した。
コロニーをImageJソフトウェアを使用して計数した。成長曲線のために、細胞をsiRNAでトランスフェクトし、24時間後、1×105個の細胞を6cmの培養皿に植え付け、10日で継代した。細胞をsiRNAで再びトランスフェクトし、3日毎に計数した。蛍光活性化セルソーティングのために、細胞をトリプシン処理し、500gで、4℃で5分間、遠心分離によってペレット化した。細胞ペレットを、生存能アッセイのために未処置のままにするか、又は70%のエタノール中、-20℃で30分間固定し、1×PBS中の25μg/mlのRNアーゼA(Sigma-Aldrich社)中、37℃で20分間処置するかのいずれかとした。次いで細胞を1×PBS中で洗浄し、1×PBS中の20μg/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma-Aldrich社)で4℃で10分間染色した。フローサイトメトリーを、BD FACSCalibur又はBD Accuri C6(BD Biosciences社)で実行した。データをFlowJoソフトウェアを使用して分析した。
ウェスタンブロッティング
細胞をトリプシン処理し、500gで、4℃で5分間、遠心分離によってペレット化した。ペレットを、2×溶解緩衝液(4%のSDS、20%のグリセロール、120mMのトリス-HCl pH6.8)中に再懸濁し、95℃で5分間沸騰させ、1600gで、4℃で10分間、遠心分離した。上清を回収し、タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン(BSA;Sigma-Aldrich社)を使用したローリーアッセイによって決定した。20～40μgのタンパク質に、0.004%ブロモフェノールブルー及び1%β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich社)を補足し、95℃で5分間インキュベートし、6又は10%ポリアクリルアミドゲルで分離し、トランスブロットSDセミドライ細胞移動装置(Bio-Rad社)を使用してニトロセルロース膜(Maine Manufacturing社、LLC)に移した。以下の一次抗体も使用した:マウスモノクローナル抗FANCM(CV5.172、1:1000希釈);マウスモノクローナル抗ゴルギン97(Molecular Probes社、A-21270、1:5000希釈);ウサギポリクローナル抗KAPl(Bethyl Laboratories社、A300～274A、1:2000希釈);ウサギポリクローナル抗pKAPl(Ser824)(Bethyl Laboratories社、A300～767A、1:2000希釈);マウスモノクローナル抗CHK1(Santa Cruz Biotechnology社、sc-8408、1:1000希釈);ウサギモノクローナル抗pCHK1 Ser345(Cell Signaling社、2348、1:500希釈);ウサギポリクローナル抗RPA32(Bethyl Laboratories社、A300～244A、1:3000希釈);ウサギポリクローナル抗pRPA32 Ser33(Bethyl Laboratories社、A300～246A、1:1000希釈);ウサギポリクローナル抗Lamin B1(GeneTex社、GTX103292、1:1000希釈);ウサギポリクローナル抗RNアーゼH1(GeneTex社、GTX117624、1:500希釈);マウスモノクローナル抗ベータアクチン(Abcam社、ab8224、1:5000希釈);ウサギポリクローナル抗BLM(Bethyl Laboratories社、A300～110A、1:3000希釈);ウサギポリクローナル抗PML(1:1000希釈);ウサギポリクローナル抗PARPl(Cell Signaling社、9542、1:1000希釈);マウスモノクローナル抗POLD3(Novus Biologicals社、H00010714-M01、1:500希釈);ウサギポリクローナル抗ATRX(Bethyl Laboratories社、A301～045A-T、1:1000希釈);ヒツジポリクローナル抗TRFl(R&D Systems社、AF5300、1:1000希釈)。二次抗体は、HRP結合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギIgG(Bethyl Laboratories社、A90～116P及びA120～101P、1:2000希釈)並びにHRP結合ロバ抗ヒツジIgG(Novus Bio社、NBP1～75437、1:3000希釈)であった。シグナル検出を、ECL検出試薬(GE Healthcare社)及びFluorChem HD2イメージング装置(Alpha Innotech社)を使用して実行した。
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)
分裂中期スプレッドを、細胞を200ng/mlのコルヒチン(Sigma-Aldrich社)と共に2～6時間インキュベートすることによって調製し、有糸分裂細胞を振り落とすことによって回収し、0.075MのKCl中で37℃で10分間インキュベートした。染色体を氷冷したメタノール/酢酸(3:1)中で固定し、スライドガラス上に塗り広げた。スライドを、1×PBS中の20μg/mlのRNアーゼA(Sigma-Aldrich社)で37℃で1時間処置し、1×PBS中の4%ホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)中で2分間固定し、次いで2mMのグリシン、pH2(Sigma-Aldrich社)中の70μg/mlのペプシン(Sigma-Aldrich社)で37℃で5分間処置した。スライドを、1×PBS中の4%ホルムアルデヒドで2分間、再び固定し、その後、70%、90%及び100%のエタノール中でそれぞれ5分間インキュベートし、風乾させた。
ハイブリダイゼーション溶液(10mMのトリス-HCl pH7.2、70%ホルムアミド、0.5%ブロッキング溶液(Roche社)で希釈したCy3結合CリッチテロメアPNAプローブ(TelC-Cy3;5'-Cy3-OO-CCCTAACCCTAACCCTAA-3'[配列番号47];Panagene社)を、スライド上に適用し、続いて、80℃、5分間で1回、室温、2時間で1回インキュベートした。スライドを、10mMのトリス-HCl pH7.2、70%ホルムアミド、0.1%BSA中で2回、及び0.1Mトリス-HCl pH7.2、0.15MのNaCl、0.08%Tween-20中で3回、それぞれ室温で10分間洗浄した。間期核での天然FISH実験のために、カバーガラス上で成長させた細胞を、CSK緩衝液(100mMのNaCl、300mMのスクロース、3mMのMgCl2、10mMのPIPES pH6.8、0.5%Triton-X)中、氷上で7分間インキュベートした。次いで細胞を、1×PBS中の4%ホルムアルデヒドで10分間固定し、CSK緩衝液で、室温で5分間透過化した。
RNアーゼH処置を、1×RNアーゼH緩衝液中の30UのRNアーゼH(Takara)と、又は緩衝液のみと、37℃で2時間スライドをインキュベートすることによって実行した。ハイブリダイゼーション及び洗浄を、上記の通り、ただしTYE563結合GリッチテロメアLNAプローブ(TelG-TYE563;5'-TYE563-T*TAGGGT*TAGGGT*TAGGG-3'、星印はLNAヌクレオチドを示す;Exiqon社)を使用して実行した。DNAを、1×PBS中の100ng/mlのDAPI(Sigma-Aldrich社)を用いて対比染色し、スライドをVectashield(Vectorlabs社)にマウントした。浜松のORCA-ERカメラ及び60X/1.42NA油浸PlanApo N対物を備えたオリンパス株式会社のIX 81顕微鏡で、又は冷却したアクシオカム506mカメラ及び63X/1.4NA油浸DIC M27 PlanApo N対物を備えたZeiss社のCell Observerで、画像を獲得した。画像分析を、ImageJ及びPhotoshopソフトウェアを使用して実行した。
FISH及びEdU取り込み/検出の組合せ
siRNAトランスフェクションの24時間後に、細胞を、10μMのRO-3306(Selleckchem社)中でインキュベートした。21.5時間後、10μMのEdU(Thermo Fisher Scientific社)を培養培地に添加し、続いて2.5時間インキュベートした。細胞をまずDNA FISHと同様にTelC-Cy3プローブを使用して染色し、次いで1×PBSで2回洗浄し、続いてClick-iT EdU Alexa Fluor 488画像化キット(Thermo Fisher Scientific社)を製造元の説明書に従って使用して、EdUを検出した。DNAを、1×PBS中の100ng/mlのDAPIを用いて対比染色し、カバーガラスをVectashield中のスライド上にマウントした。画像獲得及び分析を、DNA FISHと同様にして行った。
間接免疫蛍光法(IF)
細胞をカバーガラス上で成長させ、CSK緩衝液中で氷上で7分間インキュベートした。それに続く全ての処置を室温で実行した。細胞を、1×PBS中の4%ホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)で10分間固定し、CSK緩衝液で5分間透過化し、ブロッキング溶液(1×PBS中の0.5%BSA、0.1%Tween-20)中で1時間インキュベートした。カバーガラスを、一次抗体を含有するブロッキング溶液中で1時間インキュベートし、1×PBS中の0.1%Tween-20で3回、それぞれ10分間洗浄し、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体と共に50分間インキュベートした。DNAを、1×PBS中の100ng/mlのDAPIで1対比染色した。IFとDNA FISHの組合せのために、細胞を再び1×PBS中の4%ホルムアルデヒドで10分間固定し、1×PBSで3回洗浄し、10mMのトリス-HCl pH7.2中で5分間インキュベートし、次いで変性させ、上述したようにTelC-Cy3プローブとハイブリダイズさせた。DNAを、0.1Mのトリス-HCl pH7.2、0.15MのNaCl、0.08%Tween-20中の100ng/mlのDAPIで対比染色し、カバーガラスをVectashield中のスライド上にマウントした。以下の一次抗体を使用した:ウサギポリクローナル抗pRPA32 pSer33(Bethyl Laboratories社、A300～246A、1:1000希釈);ウサギポリクローナル抗53BPl(Abcam社、ab21083、1:1000希釈);マウスモノクローナル抗TRF2(Millipore社、05～521、1:500希釈);ウサギポリクローナル抗BLM(Bethyl社、A300～110A、1:5000希釈);ウサギポリクローナル抗PML(M. Carmo-Fonseca氏、iMM、Lisbon、Portugalからの親切な贈与、1:500希釈);マウスモノクローナル抗RAD51(Abcam社、ab213、1:100希釈);マウスモノクローナル抗POLD3(Novus Biologicals社、H00010714-M01、1:100希釈);ウサギポリクローナル抗RAP1(Bethyl社、A300～306A、1:500希釈)。二次抗体は、Alexa Fluor 568結合ロバ抗ウサギIgG(Thermo Fisher Scientific社、A10042)及びAlexa Fluor 488結合ロバ抗マウスIgG(Thermo Fisher Scientific社、A21202)であった。画像獲得及び分析を、DNA FISHと同様に行った。
ゲノムDNA分析
ゲノムDNAを、フェノール:クロロホルム抽出及び40μg/mlのRNアーゼAでの処置、それに続くエタノール沈殿によって単離した。再構築されたDNAをHinfI及びRsaI(New England Biolabs社)で消化し、フェノール:クロロホルム抽出によって再び精製した。TRF分析のために、2μgの消化したDNAを0.6%アガロースゲル上で分離し、これを50℃で50分間、真空乾燥させた。ゲルを、5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs社)及び[α-32P]ATPで標識したテロメアのオリゴヌクレオチドプローブ(5'-(TTAGGG)5-3'又は5'-(CCCTAA)5-3')と、50℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、2×SSC、0.2%SDSで20分間を2回、及び0.5×SSC、0.2%SDS、50℃で30分間を1回であった。
放射性シグナルの獲得後、ゲルを変性溶液(1.5MのNaCl、0.5MのNaOH)中で室温で20分間インキュベートし、次いで二本鎖テロメアプローブ(Telo2プローブ)と55℃で一晩ハイブリダイズさせ、クレノー断片(New England Biolabs社)及び[α-32P]dCTPを使用して放射標識した。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、2×SSC、0.2%のSDS中で20分間を2回、及び0.2×SSC、0.2%SDSで、55℃で30分間を1回であった。ドットブロットハイブリダイゼーションのために、1μgのゲノムDNAを上記の通り消化し、98℃で5分間変性させるか、又は未処置のままにし、ナイロン膜上にドットブロットした。膜をまず、上記の通りテロメアのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。放射性シグナルの獲得後、ゲルを上記の通り変性溶液中でインキュベートし、次いで放射標識したAlu反復オリゴヌクレオチド(5'-GTGATCCGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTG-3'[配列番号48])に50℃で一晩、再びハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、2×SSC、0.2%のSDS中で20分を2回、及び0.5×SSC、0.2%のSDS中で、50℃で30分間を1回であった。Cサークルアッセイのために、150～500ngの消化したDNAを、7.5Uのphi29DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社)と共に、dATP、dTTP及びdGTP(それぞれ1mM)の存在下で、30℃で8時間インキュベートし、続いて65℃で20分間、熱不活性化した。増幅産物を、ナイロン膜(GE Healthcare社)上にドットブロットし、上記の通り放射標識したTelo2プローブにハイブリダイズさせた。2次元ゲル電気泳動のために、10μgの消化したDNAを0.6%アガロースゲル(パルスフィールド認定済みアガロース;Biorad社)上で30Vで7時間かけて分離し、続いてレーンを切り出し、DNAを、第二の方向で、1.1%アガロースゲル(UltraPureアガロース;Life Technologies社)上で100Vで3時間かけて分離した。次いでDNAをナイロン膜上に移し、変性させ、上記の通り放射標識したTelo2プローブにハイブリダイズさせた。放射性シグナルを、Typhoon FLA9000イメージャー(GE Healthcare社)を使用して検出し、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
ノーザンブロッティング
全RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen社)を使用して単離し、DNアーゼI(New England Biolabs社)で3回処置した。15μgのRNAを、0.7%ホルムアルデヒドを含有する1.2%アガロースゲル上で分離した。次いでRNAをナイロン膜上に移し、上記の通り放射標識したTelo2プローブにハイブリダイズさせた。エチジウムブロマイド(Sigma-Aldrich社)で染色されたtRNAを使用して、ローディングを制御した。放射性シグナルを、Typhoon FLA9000イメージャー(GE Healthcare社)を使用して検出し、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
クロマチン免疫沈降(ChIP)
106個の細胞をスクレーピングによって回収し、1mlの1%ホルムアルデヒドに室温で15分間再懸濁した。125mMのグリシンでクエンチした後、細胞を、800gで5分間、遠心分離することによって1×PBS中で3回洗浄した。細胞ペレットを、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)が補足された500μlの溶解緩衝液(1%のSDS、50mMのトリス-HCl pH8、10mMのEDTA pH8)中に再懸濁し、Bioruptor装置(Diagenode社)を使用して4℃で2回音波処理した(設定:30秒「オン」/30秒「オフ」;出力:「高」;時間:15分)。
細胞死細胞片を1600gで、4℃で10分間、遠心分離によってペレット化し、100μlの上清を、1.1mlのIP緩衝液(1%のTriton X-100、20mMのトリス-HCl pH8、2mMのEDTA pH8、150mMのNaCl)と混合した。希釈した抽出物を、せん断した大腸菌のゲノムDNA及びBSAでブロックした50μlのプロテインA/G-セファロースビーズ(GE Healthcare社)と共に、回転させたホイールで4℃で30分間インキュベートし、続いて800gで、4℃で5分間、遠心分離することによって事前に清澄化した。清澄化した抽出物を、1μgの抗FANCMマウスモノクローナル抗体(CE56.172)と共に、回転させたホイールで4℃で4時間インキュベートした。免疫複合体を、ブロックしたプロテインA/Gビーズと共に、回転させたホイールで4℃で一晩インキュベートすることによって単離した。ビーズを、洗浄緩衝液1(0.1%のSDS、1%のTriton X-100、2mMのEDTA pH8、150mMのNaCl、20mMのトリス-HCl pH8)で4回、及び洗浄緩衝液2(0.1%のSDS、1%のTriton X-100、2mMのEDTA pH8、500mMのNaCl、20mMのトリス-HCl pH8)で1回、800gで4℃で5分間、遠心分離することによって洗浄した。次いでビーズを、40μg/mlのRNアーゼAを含有する100μlの溶出緩衝液(1%のTriton X-100、20mMのトリス-HCl pH8、2mMのEDTA pH8、150mMのNaCl)中で37℃で1時間インキュベートし、続いて65℃で一晩インキュベートして架橋を元に戻した。DNAを、Wizard SVゲル及びPCRクリーンアップキット(Promega社)を使用して精製し、ナイロン膜上にドットブロットし、TRF分析の場合と同様に放射標識したTelo2プローブに一晩ハイブリダイズさせた。シグナル検出後、膜をはがし、上記の通り放射標識したAlu反復オリゴヌクレオチドに一晩、再びハイブリダイズさせた。放射性シグナルを、Typhoon FLA9000イメージャー(GE Healthcare社)を使用して検出し、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
DNA:RNA免疫沈降(DRIP)
細胞を、スクレーピングによって回収し、1%v/vのβ-メルカプトエタノール及び100mMのNaClを含有する1mlのRA1緩衝液(Macherey-Nagel社)中に溶解させた。核酸を、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(10mMのトリス-Cl pH7.0、1mMのEDTAで飽和させた25:24:1)で抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、続いて15000gで、4℃で10分間、遠心分離した。ペレットを、70%のエタノール中で洗浄し、200μlのトリス-EDTA、100mMのNaClに再懸濁し、Bioruptor装置(Diagenode社)を4℃で使用して音波処理した(設定:30秒「オン」/30秒「オフ」;出力:「高」;時間:5分)。5μgの核酸を、IP緩衝液(0.1%のSDS、1%のTriton X-100、10mMのHEPES pH7.2、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、275mMのNaCl)中の1μgのS9.6抗体(B. Luke氏、IMB、Mainz、Germanyからの親切な贈与)と共に、回転させたホイールで4℃で5時間インキュベートした。RNアーゼH対照実験のために、核酸を、1×RNアーゼH緩衝液中の60UのRNアーゼHと共に、又は緩衝液のみと共に37℃で3時間インキュベートし、その後、S9.6抗体と共にインキュベートした。免疫複合体を、せん断した大腸菌のDNA及びBSAでブロックしたプロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare社)とのインキュベーションによって単離した。ビーズを、IP緩衝液中で、800gで遠心分離することによって4回洗浄し、10μg/mlのプロテイナーゼK(Sigma-Aldrich社)及び40μg/mlのRNアーゼAを含有する溶出緩衝液(50mMのトリス-Cl pH8、10mMのEDTA、0.5%のSDS)中で50℃で30分間インキュベートした。ビーズを上記の通り遠心分離し、上清を回収した。イソプロパノール沈殿したDNAをナイロン膜上にドットブロットし、TRF分析の場合と同様に放射標識した5'-(TTAGGG)5-3'オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。シグナル検出後、膜をはがし、ChIP分析の場合と同様に放射標識したAlu反復オリゴヌクレオチドに再びハイブリダイズさせた。放射性シグナルを、Typhoon FLA9000イメージャー(GE Healthcare社)を使用して検出し、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
インビトロでのRループ分解アッセイ
Flag-FANCM-8HIS:FAAP24複合体を、Sf9細胞でバキュロウイルス発現系を使用して精製した。細胞を500×gでペレット化し、0.5MのNaCl、0.02Mのトリエタノールアミン pH7.5、1mMのDTT、10%のグリセロールに加えて、哺乳類プロテアーゼ阻害剤(Sigma-Aldrich社)中で、氷上で溶解させ、氷上で5×10秒のバーストで音波処理した。透明化した溶解産物を、平衡化したFlag M2樹脂(Sigma-Aldrich社)と共に、4℃で1時間インキュベートした。Flag樹脂を、5回のバッチ洗浄に供し、100μg/mlのFlagペプチドで溶出させた。プールしたFANCM-FAAP24を含有する溶出液を、100mMのNaCl、20mMのTEA pH7.5、10%のグリセロール、1mMのDTT(緩衝液B)の最終濃度に希釈し、400μlのssDNA親和性樹脂(Sigma-Aldrich社)に結合させた。樹脂を、10CVの緩衝液Bで洗浄した。FANCM-FAAP24複合体を、0.5MのNaClを含有する緩衝液Bで溶出させた。T7プロモーターの下流にクローニングしたヒトテロメア反復配列の約1kb断片を含有する2μgのpcDNA6-Telo又はpcDNA6-TeloRプラスミドを、インビトロにおいて、T7ポリメラーゼ(New England Biolabs社)を使用して、CTP、GTP、ATP(それぞれ2.25mM)、825nMの[α32P]UTP(3000Ci/mmol;Perkin Elmer)の存在下で転写させた。65℃に20分間加熱し、続いて330mMのNaCl中のRNアーゼA(Epicentre社)で処置することによって、反応を止めた。Rループを含有するプラスミドを、2回のフェノール:クロロホルム抽出によって精製した。取り込まれなかったヌクレオチドを、核酸を2回S-400カラム(GE Healthcare社)に通過させることによって除去した。Rループの巻き戻し反応物(10μlの最終容量)は、Rループ緩衝液(6.6mMのトリス pH7.5、3%のグリセロール、0.1mMのEDTA、1mMのDTT、0.5mMのMgCl2)中に1nMのRループプラスミド、1mMのATP、2.5nMのFANCM-FAAP24を含有していた。反応を37℃で10分間実行し、次いで2μlの停止緩衝液(10mg/mlのプロテイナーゼK(New England Biolabs社)、1%のSDS)を添加することによって止め、37℃で15分間インキュベートした。サンプルを、TAE緩衝液(40mMのトリス、20mMの酢酸、1mMのEDTA)中の0.8%アガロースTAEゲルで、100Vで、60～90分間泳動させ、続いてゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。
統計的分析
2つのグループの直接比較のために、本発明者らは、Microsoft Excelを使用した対応のある両側スチューデントのt検定、又はGraphPad Prismを使用したノンパラメトリックな両側マン-ホイットニーU検定を採用した。各グループにつき2つ以上の要因及びそれらの相互作用の比較のために、本発明者らは、二元分散分析(ANOVA)、続いてペアワイズ比較のためのテューキーのHSDを使用した。Rバージョン3.3.2のaov及びテューキーHSD機能を使用して分析を行った。有意レベルは、テューキーのHSDによって調整されたP値からのものである。P値は、*P<0.05、**P<0.005、***P<0.001、****P<0.0001として示される。
結果
FANCMはALT細胞の生存能を裏付ける
本発明者らは、FANCMコード領域からの2つの配列(siFa及びsiFb)に対する短鎖干渉RNA(siRNA)を使用して、数種のALT(U20S、Hu09、Saos2及びWI-38VA13)及びテロメラーゼ陽性(Tel+;HeLa、HOS、HT1080及びSKNAS)細胞においてFANCMを枯渇させた。対照として標的化されないsiRNAを使用した(siCt)。トランスフェクションの2日後、Fa及びFbでトランスフェクトされた細胞におけるウェスタンブロットによって、ほぼ完全なFANCMタンパク質の枯渇を検出したが、タンパク質の約10%が残ったsiFbでトランスフェクトされたSKNAS細胞を除く(図15A)。エタノール固定したヨウ化プロピジウム(PI)染色細胞の蛍光活性化セルソーティング(FACS)から、FANCMを枯渇させたALT細胞は、Tel+を除いて、G2/M期で蓄積したことが解明された(図15B及び図15C)。ALT細胞のクローン産生能は、FANCM siRNAのトランスフェクションで大部分が壊滅したが、Tel+細胞の1つは本質的に影響を受けないままであった(図15D及び図15E)。コロニー形成実験のために、細胞をsiRNAで1回のみトランスフェクトし、その後、植え付けし、少なくとも8日後にコロニーを計数した。したがって、ALT細胞でのFANCM枯渇によって発揮された抗増殖効果は、迅速であり不可逆的である。長期的なsiRNA処置での細胞成長分析は、FANCMを枯渇させたU20S細胞は集団から迅速に除外されたが、HeLa細胞は、より低い速度ではあるが成長し続けたことを示した(図15F)。最終的に、HeLa細胞ではなくFANCMを枯渇させたU20S細胞は、すでにsiRNA処置の3日後にはPIに対して透過性になり始めた。これは細胞死を意味する。同じ細胞でPARP1切断における大きな変化は検出されなかった。したがって、FANCM枯渇は、G2/M期におけるALT細胞の異常な蓄積、続いてPARPl非依存性細胞死を引き起こす。
本発明者らのデータは、ALT細胞において、FANCMは細胞周期進行及び生存能に必須であることを示す。これは、これまで観察されたものと異なる17。Panと共同研究社により得られたそれほど効率的ではないタンパク質枯渇又は重要なFANCMスプライスバリアントの保持された発現(場合によっては公開データベースで報告されていない細胞型特異的なものを含む)は、細胞増殖を維持するのに十分なFANCMタンパク質の残量を残したことが考えられる。より低い感受性の細胞の生存能アッセイも、以前の研究において、FANCM枯渇の作用を過小評価した可能性がある。
テロメアの複製ストレスがALT細胞をFANCM枯渇に対して感受性にする
ALT細胞の数々の特色、すなわち、テロメラーゼ活性の非存在、非常に長いテロメア、ATRX不活性化、及び持続的なテロメアの複製ストレスが、そのFANCM枯渇への感受性を説明することができる。本発明者らは、U20S及びHeLa細胞においてテロメラーゼの触媒性(hTERT)及びRNA(hTR)サブユニットを異所的に発現させて、スーパーテロメラーゼ細胞を生成した37。hTERT及びhTRの過剰発現が定量RT-PCRによって確認された。予想通りに、HeLaスーパーテロメラーゼ細胞は、HeLa対照細胞より一層長いテロメアを有しており、U20Sスーパーテロメラーゼ細胞は、低減したTFE頻度を有していたが、複製が不十分な脆いテロメア(TF)の発生率は不変のままであった11、37。FANCM枯渇は、U20Sスーパーテロメラーゼ細胞では、細胞増殖を阻害し、G2/M蓄積をもたらしたが、HeLaスーパーテロメラーゼ細胞ではそうではなかった(図15B～図15E)。更に、テロメラーゼ阻害剤BIBR153238で処置したHeLa細胞は、FANCMを枯渇させた場合、G2/Mで蓄積しなかった。本発明者らは次いで、HeLa細胞においてFANCMとATRXを同時枯渇させたところ、G2/M細胞の蓄積は観察されなかった。したがって、極めて長いテロメアの存在又は活性なテロメラーゼ若しくはATRX単独の非存在は、ALT細胞のFANCM枯渇への感受性の説明にならない。
次いで本発明者らは、U20S細胞において、レトロウイルス感染によってシェルタリン因子TRF1を過剰発現させたが、これは、この処置によってFTの発生率が半分になるためである39。TRF1を過剰発現する細胞におけるFANCM枯渇はそれでもなお、G2/M蓄積をもたらしたが、空のベクター(ev)レトロウイルスを感染させた細胞における蓄積より著しく少なかった(図15G及び図15H)。しかしながら、FANCMを同時枯渇させた場合、HeLa細胞は、これまでにテロメアの脆さを誘発することが示されたsiRNAを使用してTRF1を枯渇させ39、G2/Mでは蓄積しなかった。同様に、FANCMを枯渇させたHeLa細胞は、複製ストレス誘導物質であるヒドロキシ尿素(HU)、それに続くブロックの解放で処置した場合、変更された細胞周期分布を示さなかった。したがって、テロメアの複製ストレスは、FANCM枯渇へのALT細胞の感受性に寄与するが、それにもかかわらず、テロメア又は普遍化した複製ストレスは、単独では、非ALT細胞をFANCM枯渇に対して感受性にするには不十分である。
FANCMはALT細胞においてテロメアの複製ストレスを抑制する
テロメア安定性におけるFANCMの関与を試験するために、本発明者らは、TRF2に対する抗体と、セリン33でリン酸化されたRPA32(pS33)又はp53結合タンパク質1(53BP1)に対する抗体との組合せを使用して、間接免疫蛍光法(IF)を実行した。RPA32は、S期中に、複製フォーク失速のときにATRによってセリン33でリン酸化される40;53BP1は、ATR、若しくは他のDNA傷害シグナル伝達キナーゼ毛細血管拡張性運動失調症変異(ATM)のいずれか、又はその両方を活性化した機能不全性のテロメアにおいて病巣を形態する41、42。トランスフェクションの48時間以内に、pS33及び53BP1は、FANCMを枯渇させたALT細胞において、テロメアで蓄積し(図16A)、いわゆるテロメア機能不全によって誘発された病巣(TIF)を形成した41。FANCM枯渇は、Tel+細胞においてTIF形成を誘発しなかった(図16A)。テロメア以外でのpSer33及び53BP1の蓄積は、全てのFANCMを枯渇させた細胞株においてごくわずかであった(図16A)。クロマチン免疫沈降(ChIP)実験においてタンパク質はテロメアDNAと会合するため、テロメア不安定性のFANCMによって媒介される抑制は直接的である可能性が高い(図16B及び図16C)。FANCMはまた、豊富な、ゲノム全体に拡がったAlu反復DNAとも免疫沈降したことから(図16B及び図16C)、タンパク質が独占的にテロメアと会合しないことが示される。これは、報告されているFANCMの細胞クロマチン部分への局在化と一致する43。
ウェスタンブロット分析によって、FANCM枯渇がpS33蓄積を引き起こすことが確認され、HeLa細胞ではなくU20Sにおける他のATR標的チェックポイントキナーゼ1(CHK1)のリン酸化が解明された(図16D)。ATM標的KRABドメイン関連タンパク質1(KAP1)は、試験された細胞株のいずれにおいてもリン酸化されなかった(図16D)。更に、pS33蓄積は、TRF1を過剰発現するFANCMを枯渇させたU20S細胞において弱くなったが(図15G)、テロメラーゼ阻害、ATRX又はTRF1枯渇及びHU処置は、FANCMを枯渇させたHeLa細胞においてpS33蓄積を促進しなかった。実際には、pS33は、FANCMを枯渇させHUで処置したHeLa細胞において効率的に蓄積できなかったが、これは、正規のATR依存性S期内チェックポイントの活性化を支持することにおけるFANCMに関する役割と一致する32。本発明者らは、ALT細胞におけるFANCM欠乏は、特異的なATR依存性シグナル伝達カスケードを活性化するが、これは、普遍化した複製ストレスによって引き起こされるものとは完全に同一ではなく、少なくとも部分的に過剰なテロメアの複製ストレスに起因することを提唱する。このようなATR応答は、観察されたG2/Mの停止及び細胞死を引き起こす可能性がある。
FANCMはALTの特色を抑制する
本発明者らのIF画像において、FANCMを枯渇させたALT細胞におけるTRF2病巣は、対照細胞の場合と比べて、より大きい病巣とより明るい病巣の両方である。これは単にテロメアにおいて増加したTRF2に起因するのではないことを確認するために、本発明者らは、siRNAでトランスフェクトされたU20S間期細胞を、テロメアプローブを使用したDNA蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)に供し、テロメア病巣の数及び面積を測定した。本発明者らは、siCtでトランスフェクトされた細胞を、サイクリン依存性キナーゼ1(CDK1)阻害剤であるRO-3306でG2/Mの境界で停止させることによって、細胞周期段階に関する起こり得る副次的な作用を制御した44(図17A及び図17B)。テロメア病巣の全体的な数は、FANCMが枯渇されると減少したが(図17C及び図17D)、それらの面積分布はより広くなり、非常に小さい病巣の頻度はわずかに増加し(図17C及び図17EにおけるS)、非常に大きい病巣の頻度は実質的に増加した(図17C及び図17EにおけるL)。またRO-3306で処置した細胞が有するテロメア病巣の数も対照細胞より少なかったが(図17D)、これは、G2におけるALTテロメアのクラスター化による可能性がある19、45。しかしながら、非常に小さい及び非常に大きい病巣における増加は、RO-3306処置よりFANCM枯渇においてより顕著であった(図17C及び図17E)。FANCMを枯渇させた細胞のおよそ60%が、少なくとも5個の大きい病巣を有していたが、それに対して、未処置又はRO-3306処置したsiCtでトランスフェクトされた細胞のそれぞれは、およそ10%及び15%であった(図17F)。
次いで本発明者らは、テロメアにおけるPML、RAD51及びPOLD3の局在化を、PML及びRAD51のIFをテロメアFISHと組み合わせることによって、POLD3及びRAP1の場合、二重のIFによって分析した。本発明者らは、FANCMを枯渇させたU20S細胞において、全ての3つの因子のテロメア局在化の増加を観察したが、PML、POLD3及びRAD51総タンパク質レベルにおける明白な増加は見られなかった(図17A;図18)。RO-3306処置は、テロメアのPML及びRAD51病巣の数に実質的に影響を与えなかったが、テロメアのPOLD3病巣のうち1つを増加させ、しかしながらFANCM枯渇ほど重要ではなかった(図18)。更に、本発明者らは、チミジンアナログの5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)で上記の通り処置した細胞を2.5時間インキュベートし、EdU検出と組み合わせたテロメアFISHを実行して、新たに合成されたテロメアDNAを可視化した。S期細胞を排除するために、本発明者らは、斑点状の(punctuate)EdU染色を示す細胞と、25個以下のEdU病巣を有する細胞のみをスコア付けした。FANCM枯渇は、RO-3306処置の場合と同様にテロメアのEdU病巣の発生率を増加させたが、それより低い程度であった(図18)。
本発明者らは、FANCM枯渇は、PML、RAD51及びPOLD3を含有する大きいAPB内でのロバストなテロメアのクラスター化、及びS期以外でのテロメアDNA合成の増加により示されたように、ALT活性を悪化させると結論付けている。FANCM枯渇はまた、場合によってはECTRを表す短いテロメア種も生成する(以下を参照)。G2/Mの停止単独では、FANCMを枯渇させた細胞で観察された異常に上昇したALTの特色を説明することはできない。
FANCMはALT細胞においてテロメアのssDNA及びECTRを抑制する
本発明者らは、siRNAトランスフェクションの48時間後に回収されたALT(U20S及びWI-38VA13)及びTel+(HOS及びHeLa)細胞からのゲノムDNAのゲル中のテロメア制限断片(TRF)分析を実行した。ブロットを、5'-TTAGGG-3'又は5'-CCCTAA-3'反復のいずれかのテロメアのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを天然(非変性)条件下で実行した場合、本発明者らは、FANCMを枯渇させたALT細胞において非常に多様な長さのCリッチなテロメアのssDNAの増加を観察した(図19A、上のパネル)。逆に言えば、GリッチなssDNAの減少がテロメアの大部分の対応物で観察された。これは、G-オーバーハングの短縮化に起因する可能性がある(図19A、下のパネル)。両方のプローブにつき、シグナルの画分はゲルウェル中にあり、場合によっては重要な二次構造を有する分子由来の露出したssDNAに対応する(図19A)。本発明者らは、Tel+細胞においてテロメアのssDNAの変更を観察しなかった(図19A)。長いテロメアプローブ(Telo2プローブ)を使用した変性条件での同じゲルのハイブリダイゼーションから、FANCMを枯渇させた細胞においてテロメアの長さの明らかな変更がなかったことが解明された(図19A)。
本発明者らは次いで、上記した細胞からのゲノムDNAをドットブロットし、それを天然条件下でテロメアのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、続いて変性させ、ローディングした総DNAのための対照としてAlu反復とハイブリダイズさせた。この実験は、FANCMを枯渇させたALT細胞は、siCtでトランスフェクトされた細胞より多くのテロメアCリッチssDNAを含有することを確認した(図19B)。これまで報告されたように11、U20S細胞におけるRNアーゼH1の枯渇も、FANCM枯渇より低いレベルではあるが、テロメアCリッチssDNAを増加させた(図19B)。U20S、HOS及びHeLa細胞に関する変性したDNAのドットブロットハイブリダイゼーションを使用したところ、総テロメアDNAにおいて大きな差は検出されなかった(図19B)。総CリッチテロメアDNAにおける増加は、FANCMを枯渇させたWI-38VA13細胞で観察された(図19B)。
本発明者らは次いで、ALT及びTel+細胞からのDNAを使用したphi-29によって媒介されるCサークルアッセイ46を実行し、FANCMを枯渇させたALT細胞におけるCサークルの驚くべき増加を見出した(図19C)。ECTRの蓄積は、部分的に、ただし非独占的にCサークルに一致する可能性が高く、2次元ゲル電気泳動を使用してFANCMを枯渇させたU20S細胞でも検出された(図19D)。FANCMを枯渇させたU20S細胞の分裂中期染色体FISHは、恐らくECTRに対応する豊富な染色体外のテロメアシグナルを示し、単一の染色体の末端から伸長する、又は2つの独立した染色体の末端を架橋するDNAスレッドを示した。CリッチなssDNA含有ECTR及びDNAスレッドは、本発明者らのTRF分析で観察されたよく保持されたDNA分子、及び本発明者らのドットブロット分析で観察された増加したテロメアssDNAを説明することが可能である(図19A及び図19B)。本発明者らは、FANCMを枯渇させたU20S細胞におけるTFEの発生率における増加を観察しなかった。
FANCMはALT細胞においてBLMを調節する
FANCM及びBLMは、ALTテロメアを維持することにおいて協働することが報告されている17。本発明者らは、U20S及びHeLa細胞においてFANCMを枯渇させ、抗BLM及び抗TRF2抗体を使用した間接IFを実行した。FANCMは、失速した複製により誘発された傷害部位へのBLM補充に必要であるため34、本発明者らは、トポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシン(CPT)で処置した細胞を含めた。CPTは、siCtでトランスフェクトされたU20S及びHeLa細胞において核の(非テロメアの)BLM病巣のロバストな形成を誘発したが、siFaでトランスフェクトされた細胞では誘発しなかった。一方で、siCtでトランスフェクトされたU20Sでは、BLM TIFはすでに豊富であり、siCtでトランスフェクトされたHeLa細胞では、極めてまれにしか観察されず、U20S細胞では、FANCM枯渇はBLM TIFの数を増加させた。全てのサンプルにおいて、CPT処置はTIF頻度にわずかに影響を与えた。BLM核の再局在化は、総タンパク質レベルにおいて大きな変化なく起こった。したがって、本発明者らは、FANCM枯渇がALTテロメアにおけるBLM蓄積を引き起こすが17、ALT及びTel+細胞の両方において傷害の非テロメア部位でそれを防ぐことを確認する34。FANCM枯渇のときのBLMのテロメアの蓄積は、報告されたTRF1及びTRF2との相互作用を含む場合がある47。
本発明者らは次いで、U20S細胞においてFANCM及びBLMを同時に枯渇させた(図20A)。BLM枯渇は単独で細胞周期分布及び形成されたコロニーの数を変更しなかったが、増殖率を減少させ、極めて最小限であるがPI透過性細胞の割合を増大させた(図20B～図20D)。意外なことに、FANCM及びBLM同時枯渇は、FANCMを枯渇させることに起因する異常な細胞周期分布並びに細胞の増殖及び生存能の部分的なレスキューをもたらした(図20B～図20D)。更に、BLM枯渇は、FANCMを枯渇させた細胞におけるpS33 TIFの発生率を半分にした(図20E)。これらの結果は、BLM枯渇が、ALT細胞においてFANCM欠乏によって発揮される有害作用を軽減することを確立する。
FANCMはALT細胞においてTERRA及びtelRループを抑制する
FANCMが、TERRA及び/又はtelRループを調節することによってALT細胞においてテロメア複製ストレスを抑制するかどうかを試験するために、本発明者らはまず、TERRAノーザンブロットを実行したところ、このIncRNAのレベルが、siCtでトランスフェクトされたものより、siFa及びsiFbでトランスフェクトされた細胞においてそれぞれ3.5及び2.5倍高かったことを見出した。最大約2kbの長さのTERRA種が最も影響された(図21A)。本発明者らは次いで、およそ1kbのテロメアの経路のT7転写によって生成したtelRループを含有するプラスミドを使用したインビトロにおけるRループ分解アッセイを実行した11。本発明者らは、TERRA様のGリッチなRNA反復、又は相補的なCリッチな転写物を含有する転写物を生産するためのものとインサート方向が異なる2種のプラスミドを使用した(図21B)。予想通りに11、Gリッチな転写物は、Cリッチなものより低い効率で生産された(図21B)。telRループプラスミドを、ATP含有又は非含有で、その安定化パートナーFAAP24とのヘテロ二量体の組換えFANCMと共にインキュベートし、次いでアガロースゲルで分解した。FANCMは、RNA分解なしで、更に、ATP依存性の方式で、Rループ-プラスミドからのGリッチ及びCリッチな転写物の両方の完全放出を促進した(図21B)。したがって、FANCMは、インビトロにおいてtelRループのRNA部分を効率的に巻き戻す。FANCMを枯渇させたU20S細胞におけるtelRループを検査するために、本発明者らは、モノクローナル抗体S9.6を使用したDNA:RNA免疫沈降(DRIP)を実行した48。ドットブロットハイブリダイゼーションは、全てのサンプルからの免疫沈降した材料においてテロメアDNAを検出し、siFa及びsiFbサンプルでは約3倍の増加であった(図21C)。抗体インキュベーションの前における組換えRNアーゼHでの核酸の処置は、ハイブリダイゼーションシグナルの大部分を壊滅させたことから、それらがDNA:RNAハイブリッドから発出されたことが確認される(図21C)。本発明者らはまた、RNアーゼHで処置した又はそれで処置されていない間期核にGリッチなテロメアプローブを使用した天然DNA FISHも実行した11。CリッチなテロメアDNAに対応する斑点状の染色は、未処置のsiCtでトランスフェクトされた細胞においてすでに目で見ることができ、その強度は、RNアーゼH処置した細胞においてより高かった。これは、telRループ内でのTERRA転写物の分解、及び結果としてそのプローブへの増加した結合部位に起因する可能性がある(図21D及び図21E)。未処置のsiFaでトランスフェクトされた細胞において、CリッチなssDNAのシグナルは、対照細胞における場合より顕著であり、RNアーゼH処置によって更に増大された(図21D及び図21E)。細胞当たりの病巣の総数は、FANCMを枯渇させた細胞における総数より高かったが、RNアーゼH処置によって影響を受けなかった(図21D及び図21E)。本発明者らは、FANCMが、ALT細胞においてTERRA及びTERRAを含有するtelRループを抑制すると結論付けている。インビトロでtelRループを分解するFANCMの能力(図21B)及びテロメアへのFANCMの局在化(図16C及び図16D)を考慮して、本発明者らは、FANCMがテロメアクロマチン上で直接的にtelRループを分解することを提唱する。すでにRNアーゼHで処置されていないFANCMを枯渇させた細胞に存在するより顕著なCリッチなssDNAシグナル(図21D及び図21E)は、DNA複製におけるギャップ又はtelRループのRNA部分の細胞による分解に起因する可能性がある。本発明者らは、telRループとしてのFANCM枯渇のときに生じるテロメアのRNA:DNAハイブリッド構造についても言及していたが、本発明者らの実験は、従来のRループ、RNA:DNAハイブリッドと置き換えられたssDNAを含む3本鎖の核酸、及び置き換えループが欠失したds RNA:DNAハイブリッドを区別しない。
FANCMはtelRループによって誘発されたテロメアの複製ストレスを回避する
本発明者らは、FANCMが、telRループを分解することによってテロメアの複製ストレスを抑制するという仮説を立てた。本発明者らは、siRNA耐性、V5エピトープタグを有するFANCMバリアント(V5-FANCM WT)、又はRループを分解することができないATPアーゼ/トランスロカーゼ不活性なカウンターパート(V5-FANCM K117R36)を発現するレトロウイルスに感染させたU20S細胞においてFANCMを枯渇させた。両方のバリアントが、内因性FANCMより高いレベルで発現された(図22A)。本発明者らのsiRNAの特異性を確認したところ、siFaでトランスフェクトされた細胞において、V5-FANCM WTの大部分がG2/Mの停止並びにps33 TIF及びAPBの蓄積を回避した(図22B及び図22C)。それとは逆に、細胞周期分布及びpS33 TIF及びAPBの発生率は、V5-FANCM K117RとsiFaでトランスフェクトした対照細胞とで類似していた(図22B及び図22C)。本発明者らは次いで、細胞においてtelRループを抑制する過剰発現されたRNアーゼH1の能力を活用した11、39、49。本発明者らは、MYCエピトープタグを有するRNアーゼH1の過剰発現を駆動するレトロウイルス(MYC-RH1 WT)、若しくは触媒的に不活性なカウンターパート(MYC-RH1 D145A)で感染させた、又はev対照レトロウイルスで感染させたU20S細胞において、FANCM単独を、又はBLMと組み合わせて枯渇させた(図22D)。MYC-RH1 WTは更に、FANCMとBLMを同時枯渇させた細胞においてG2/Mの停止の欠陥のレスキューを強化した(図22E)。ev感染細胞と比較して、MYC-RH1 WTを発現する細胞においてFANCM枯渇によって誘発されたpS33 TIFの頻度の減少を測定した(図22F)。FANCMとBLMを同時枯渇させた、MYC-RH1 WTを過剰発現する細胞において、pS33 TIFはev対照細胞に類似したレベルに回復した(図22F)。全ての実験において、MYC-RH1 D145Aは、その触媒活性カウンターパートとして機能できなかった(図22E及び図22F)。これらの結果は、FANCM枯渇のとき生じるテロメアの複製ストレスが、FANCM酵素活性によって抑制され、分解されなかったtelRループ及び制御不能なBLMに起因することを示す。
本発明者らは本明細書において、FANCMの非存在で、ALT細胞は重度のテロメアの複製ストレスを経験し、ATRによって媒介されるDNA傷害シグナル伝達を活性化し、これが観察されたG2/Mの停止及び細胞死のきっかけである可能性があることを実証する50。TRF1の過剰発現が、ALT細胞のFANCM枯渇に対する感受性をより低くするという事実と(図15G及び図15H)、FANCMを枯渇させたALT細胞において非テロメアpSer33及び53BP1病巣の蓄積の欠如(図16A)は、G2/Mの停止を促進することにおいて傷害を受けたテロメアから放出されるシグナルの中心性を立証する。しかしながら、それとAlu反復DNAとの物理的な相互作用によって示唆されるように、FANCMは、テロメアの外側でもALT細胞において必須の機能を果たす可能性がある。
また本発明者らは、Tel+細胞の増殖及び生存能はFANCM枯渇によってそれほど影響を受けないため、FANCMは全ての細胞において必須ではないことも確認している。一貫して、二対立遺伝子機能喪失型FANCM突然変異を有する成人ヒトが報告されている51、52。更に、FANCMがノックアウトされたTel+ヒト結腸直腸癌細胞、マウス胚線維芽細胞及びトリリンパ芽球は、DNA傷害による攻撃を受けない限りうまく発生し、正常に増殖した53～55。そのようなものとして、FANCMは、ALTがん療法における魅力的な標的の一つである。FANCM欠乏は、乳がん及び肝臓がんのより高いリスクに関連することは確かであるが51、55、ALT細胞におけるFANCM枯渇によって迅速に生じた不可逆的な病変は、FANCMの短期間の阻害が、副次的な作用を起こさずにALT腫瘍を効率的に根絶できることを示す。別の観点から言えば、これまでに提唱されているFANCMとBLMの共阻害に基づく療法は、避けるべきである17。
本発明者らはまた、FANCMが、PML、POLD3及びRAD51を含有するAPBにおけるテロメアのクラスター化、及びCサークルを含み、ただし場合によっては他の形態も含むECTRの生産等のALT関連の特色を抑制することも示す(図18A;図19C及び図19D)。本発明者らがTel+細胞においてFANCMを枯渇させたところ、同じ特色が明白ではなかったため、FANCM欠乏単独は、ALTを新たに開始させるには不十分である。更にFANCMがALTを制限することと一致して、その枯渇は、S期以外でテロメアDNAの合成を増加させ(図18A及び図18B)、分子間の組換え事象の中間体を表す可能性があるDNAスレッドの出現をもたらした。本発明者らは、FANCMが、G2及び場合によってはMiDASにおいてPOLD3依存性のテロメアBIRを抑制することを提唱する24～26。一貫して、サッカロマイセス・セレビジエFANCMオーソログである酵母ヘリカーゼMph1の欠失56が、HOエンドヌクレアーゼによって誘発されたDSBのBIRへの修復を指示する57。更に、Mph1過剰発現は、染色体内DSBにおいてBIRを阻害したが58、BIRを介してそのテロメアを維持するALT酵母であるテロメラーゼ欠乏II型の生き残りの反乱を防止しなかった58～62。最終的に、Mph1は、Rループ依存性の方式で短いテロメアに局在する63。FANCMタンパク質は、ALT及びキャップされていないテロメアにおいて、それが染色体内の傷害部位で発揮するものや、Rループによって媒介されるものと異なる特異的な役割を果たすようである。telRループは、ヒトALT細胞におけるテロメアでのFANCMの補充及び/又は安定化、順に活性化を直接的に促進し、したがってPOLD3依存性のテロメアBIRを調節することができる。FANCMが枯渇される場合のAPBにおけるRAD51蓄積の関連性は、不明瞭なままである(図18A)。RAD51は、FANCMを枯渇させた細胞又は姉妹テロメア交換等の本発明者らが調査しなかった他の分子の事象で観察されたテロメアのクラスター化を媒介することができる。
ALT活性を増加させたにもかかわらず、FANCM枯渇は、総(Gリッチに加えてCリッチ)テロメアDNAの大きな獲得を惹起しなかった(図19B)。本発明者らの実験において、新たに生産されたテロメアDNAの量が検出限界未満であった可能性がある。加えて、FANCMを枯渇させた細胞におけるテロメアDNAのデノボ合成は、S期におけるテロメアDNAの不完全な半保存的複製によって17、更に、細胞からのECTRの除外によって相殺される可能性がある。環状ECTRが生成される正確なメカニズムは未だ不明であるが、そのようなメカニズムは、複製ストレス、活性化されたATR、CリッチなテロメアのssDNA及びtelRループ等のFANCMを枯渇させたALT細胞において増加する特色と関連する11、64～66。本発明者らの研究の1つの観察は、FANCM枯渇はTFE頻度を変更しないということである。これは、観察されたECTRがテロメアの経路全体を切り出すことによって得られないことを示唆する。
FANCM枯渇のときにALTテロメアで生じる複製ストレスは、主として2つの源、すなわち脱調節されたBLM及びtelRループから起こる。FANCMが枯渇されたときのALTテロメアへのBLM補充の増加を考慮すると、FANCMは、テロメアからのBLMを直接置き換えることができる。代替として、FANCMは、抑止されたテロメアの複製フォーク又はR及びDループ中間体等のBLM補充を引き起こすきっかけを抑制することができる。BLM活性は、場合によりBLM-TOP3A-RMI(BTR)溶解酵素複合体の一部としてのBIRに関連する鎖侵入中に形成された組換え中間体を分解することによりテロメア組換え及びBIRベースのテロメアDNAの合成を支持することによってALTを促進する15、67、68。一貫して、FANCM枯渇は、S期以外でテロメア合成を増加させる(図18A)。更に、BLMはDNA末端の長距離の切除を媒介するため69、70、過剰に活性なBLMは、FANCMが枯渇される場合、テロメアssDNAの生産に直接寄与する可能性が高い。これは、FANCMとBLMを二重に枯渇させた細胞において検出された低いレベルのpS33 TIFと一致する(図22F)。FANCD2はまた、ALT細胞においてBLM毒性を抑制することも示されていることから68、これはFA経路に関する一般的な役割であり得るという仮説を立てることができる。それにもかかわらず、FANCMのATPアーゼ/トランスロカーゼ活性は、FANCD2のモノユビキチン化に関して重要ではなく31、クロマチンにFA複合体を補充することができないFANCMのバリアントのU20S細胞における過剰発現は、いずれのALT関連の特色も抑制しなかった(上記を参照)。それゆえに、FA複合体の全体が、ALTを維持するために機能する可能性はないようである。
FANCMを枯渇させた細胞におけるtelRループの性質の場合と同様に、本発明者らのデータは、それらはテロメアクロマチンでFANCMのATPアーゼ/トランスロカーゼ活性によって適切に分解されないため、それらが蓄積することを示唆する(図21B～図21E)。テロメアDNAはRNAポリメラーゼにとって難しい基質であるため、telRループは共転写によって生成することができる11、49。FANCMを枯渇させたALT細胞で観察された増加した短いTERRA種(図21A)は、実際には不適切なtelRループ分解に起因するテロメア転写の早期終結による可能性がある。またpS33の蓄積は、FANCMがS期中にtelRループを分解する可能性が最も高いことも示す。したがって、不適切なtelRループ分解は、FANCMを枯渇させた細胞におけるテロメアの経路を介した複製フォーク進行の効率の減少を少なくとも部分的に説明することができる17。更に、一部のFANCM枯渇に関連する複製ストレスの特色であるCリッチなテロメアのssDNA及びCサークルの蓄積(図19A、図19B及び図19E)は、他のALT細胞の場合よりU20S細胞において明白である。これは、TERRA及びtelRループがU20S細胞において特に豊富であるという事実によって説明され得る11。
FANCM不活性化に対するALT細胞の迅速で劇的な応答のために(図15B～図15F)、本発明者らの研究は、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子不活性化ではなくsiRNAを使用して実行しなければならなかったが、それが遺伝学的相互作用の分析を混乱させた。それにもかかわらず、FANCMを枯渇させた細胞において複製ストレスを抑制することにおけるBLM枯渇とRNアーゼH1過剰発現との相乗作用は、BLM活性及びtelRループが機能的に関連する可能性があることを示唆する。BLMがゲノム規模でRループを抑制するが71、BLMは、例えばCリッチなssDNAの生成、それに続くTERRAアニーリングによって、ALT細胞において特異的にtelRループ形成を促進することができる。逆に言えば、telRループは、テロメアの複製フォークを失速させることによって、又はDループを模擬する構造を形成することによって、BLMをテロメアに補充することができる。
将来的な研究は、FANCM及びBLMに関する条件付きのノックアウト細胞を利用する可能性があるが、この興味深い細胞シナリオを精密化し、ALTがんを治すための新規の達成手段への道を切り開くと予想される。
（参考文献）
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Figure 2022534138000004
Figure 2022534138000005
Figure 2022534138000006
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Claims (89)

  1. テロメア代替伸長(ALT)細胞の生存能及び/又はALT細胞の成長を阻害する方法であって、前記ALT細胞におけるファンコーニ貧血相補群M(FANCM)の発現又は活性を低減させる工程を含む、方法。
  2. FANCMの発現又は活性が、FANCMアンタゴニストを個体に投与することによって低減される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの1つ又は複数の活性を阻害する、請求項2に記載の方法。
  4. 前記FANCMアンタゴニストが、900Da以下の分子量を有する有機化合物である、請求項3に記載の方法。
  5. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMに特異的に結合する抗体分子又はアプタマーである、請求項3に記載の方法。
  6. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの発現を低減させる、請求項2に記載の方法。
  7. 前記FANCMアンタゴニストが、サプレッサー核酸である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記サプレッサー核酸が、siRNA又はshRNAである、請求項7に記載の方法。
  9. 前記サプレッサー核酸が、配列番号32の15～40ヌクレオチドの連続する配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の方法。
  10. 前記サプレッサー核酸が、配列番号3又は配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項9に記載の方法。
  11. 前記サプレッサー核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項7に記載の方法。
  12. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの発現を低減させる標的化されたヌクレアーゼである、請求項6に記載の方法。
  13. 前記標的化されたヌクレアーゼが、FANCM遺伝子内の標的配列を認識するZFN、TALEN又はメガヌクレアーゼである、請求項12に記載の方法。
  14. 前記標的化されたヌクレアーゼが、CRISPR関連ヌクレアーゼであり、前記CRISPR関連ヌクレアーゼは、FANCM遺伝子内の標的配列を認識するガイドRNAと組み合わせて投与される、請求項12に記載の方法。
  15. 前記標的化されたヌクレアーゼが、FANCM遺伝子の標的配列でゲノムDNAを切断し、それによって、活性なFANCMポリペプチドの発現を低減又は防止する欠失又は挿入がもたらされる、請求項12又は13に記載の方法。
  16. BLM及び/又はBRCA1の活性又は発現が、前記ALT細胞において低減されない、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ALT細胞が、間葉系又は上皮がん細胞である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ALT細胞が、骨肉腫、脂肪肉腫、膠芽腫、星細胞腫、又は膀胱癌細胞である、請求項17に記載の方法。
  19. 前記方法が、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含む、請求項1に記載の方法。
  20. FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤を投与する工程を含み、FANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程が、FANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を投与する工程を含む、請求項19に記載の方法。
  21. MM2ドメインにおけるFANCMとRMIとの結合を崩壊させる工程を含む、請求項19又は20に記載の方法。
  22. 阻害剤が、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数である、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記遺伝学的阻害剤が、siRNAである、請求項22に記載の方法。
  24. 前記小分子が、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルである、請求項22に記載の方法。
  25. 前記ペプチドが、
    DLFSVTFDLGFC(配列番号49)、
    DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)、及び
    IFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)
    からなる群から選択されるペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項22に記載の方法。
  26. 前記タンパク質が、不活性化されたFANCMタンパク質である、請求項22に記載の方法。
  27. 前記不活性化されたFANCMタンパク質が、F1232A/F1236A二重置換を含む、請求項26に記載の方法。
  28. 前記タンパク質が、免疫グロブリン結合ドメインを含む、請求項22に記載の方法。
  29. 対象におけるALTがんを処置する方法である、請求項19に記載の方法。
  30. それを必要とする個体におけるテロメア代替伸長(ALT)がんを処置する方法であって、前記個体においてファンコーニ貧血相補群M(FANCM)の発現又は活性を低減させる工程を含む、方法。
  31. FANCMの発現又は活性が、FANCMアンタゴニストを前記個体に投与することによって低減される、請求項30に記載の方法。
  32. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの活性を阻害する、請求項31に記載の方法。
  33. 前記FANCMアンタゴニストが、900Da以下の分子量を有する有機化合物である、請求項32に記載の方法。
  34. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMに特異的に結合する抗体分子又はアプタマーである、請求項32に記載の方法。
  35. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの発現を低減させる、請求項31に記載の方法。
  36. 前記FANCMアンタゴニストが、サプレッサー核酸である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記サプレッサー核酸が、siRNA又はshRNAである、請求項36に記載の方法。
  38. 前記サプレッサー核酸が、配列番号32の15～40ヌクレオチドの連続する配列と少なくとも95%同一なヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載の方法。
  39. 前記サプレッサー核酸が、配列番号3又は配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項38に記載の方法。
  40. 前記サプレッサー核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項36に記載の方法。
  41. 前記FANCMアンタゴニストが、FANCMの発現を低減させる標的化されたヌクレアーゼである、請求項35に記載の方法。
  42. 前記標的化されたヌクレアーゼが、FANCM遺伝子内の標的配列を認識するZFN、TALEN又はメガヌクレアーゼである、請求項41に記載の方法。
  43. 前記標的化されたヌクレアーゼが、CRISPR関連ヌクレアーゼであり、前記CRISPR関連ヌクレアーゼは、FANCM遺伝子内の標的配列を認識するガイドRNAと組み合わせて投与される、請求項41に記載の方法。
  44. 前記標的化されたヌクレアーゼが、FANCM遺伝子の標的配列でゲノムDNAを切断し、それによって、活性なFANCMポリペプチドの発現を低減又は防止する欠失又は挿入がもたらされる、請求項41又は42に記載の方法。
  45. BLM及び/又はBRCA1の活性又は発現が、ALT細胞において低減されない、請求項30から44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ALTがんが、間葉系又は上皮がんである、請求項30から45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ALTがんが、骨肉腫、軟部組織肉腫(例えば、脂肪肉腫、未分化多形肉腫、又は平滑筋肉腫)、膠芽腫、星細胞腫、神経芽細胞腫、又は膀胱癌である、請求項46に記載の方法。
  48. 請求項30から47のいずれか一項に記載の処置の方法における使用のための、FANCMの発現又は活性を低減させる薬剤。
  49. 請求項30から47のいずれか一項に記載の処置の方法における使用のための医薬の製造における、FANCMアンタゴニストの使用。
  50. 前記方法が、FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程、及び/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する工程を含む、請求項30に記載の方法。
  51. FANCM-RMI相互作用を崩壊させる工程が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/若しくはFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を投与する工程、並びに/又はFANCMのATPアーゼ活性を阻害する薬剤を投与する工程を含む、請求項50に記載の方法。
  52. MM2ドメインにおけるFANCMとRMIとの結合を崩壊させる工程を含む、請求項50又は51に記載の方法。
  53. 阻害剤が、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数である、請求項50から52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記遺伝学的阻害剤が、siRNAである、請求項53に記載の方法。
  55. 前記小分子が、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルである、請求項53に記載の方法。
  56. 前記ペプチドが、
    DLFSVTFDLGFC(配列番号49)、
    DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)、及び
    EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)
    からなる群から選択されるペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項53に記載の方法。
  57. 前記タンパク質が、不活性化されたFANCMタンパク質である、請求項53に記載の方法。
  58. 前記不活性化されたFANCMタンパク質が、F1232A/F1236A二重置換及び/又はK117R置換を含む、請求項57に記載の方法。
  59. 前記タンパク質が、免疫グロブリン結合ドメインを含む、請求項53に記載の方法。
  60. 化学療法剤の同時の、逐次的な、又は別々の投与を更に含む、請求項51又は52に記載の方法。
  61. 前記方法が、化学療法剤の同時の、逐次的な、又は別々の投与を含まない、請求項51又は52に記載の方法。
  62. テロメア代替伸長(ALT)がんを処置することにおける使用のための、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤を含む医薬組成物。
  63. テロメア代替伸長(ALT)がんの処置のための医薬の製造における、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤の使用。
  64. 前記医薬組成物が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/若しくはFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になる、請求項62に記載の医薬組成物;又は、医薬が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/若しくはFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤から本質的になる、請求項19に記載の使用。
  65. FANCM-RMI相互作用の阻害剤及び/又はFANCMのATPアーゼ活性の阻害剤が、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数である、請求項62若しくは64に記載の医薬組成物、又は請求項19若しくは20に記載の使用。
  66. 前記遺伝学的阻害剤が、siRNAである、請求項65に記載の医薬組成物又は使用。
  67. 前記小分子が、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルである、請求項65に記載の医薬組成物又は使用。
  68. 前記ペプチドが、
    DLFSVTFDLGFC(配列番号49)、
    DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)及び
    EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)
    からなる群から選択されるペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の医薬組成物又は使用。
  69. 前記タンパク質が、不活性化されたFANCMタンパク質である、請求項65に記載の医薬組成物又は使用。
  70. 前記不活性化されたFANCMタンパク質が、F1232A/F1236A二重置換及び/又はK117R置換を含む、請求項69に記載の医薬組成物又は使用。
  71. 前記タンパク質が、免疫グロブリン結合ドメインを含む、請求項65に記載の医薬組成物又は使用。
  72. FANCMアンタゴニストでの処置に対する個体におけるがんの応答性を決定する方法であって、前記個体由来のがん細胞のサンプル中における1つ又は複数のALTがん細胞の存在を決定する工程を含み、前記サンプル中における1つ又は複数のALTがん細胞の存在が、前記がんが前記FANCMアンタゴニストでの処置に応答することを示す、方法。
  73. ALTがん細胞の存在が、前記サンプル中における1つ又は複数のがん細胞におけるCサークル又はALT関連PML体の存在を評価することによって決定され、前記1つ又は複数のがん細胞におけるCサークル又はALT関連PML体の存在が、前記がん細胞がALTがん細胞であることを示す、請求項72に記載の方法。
  74. 前記個体における前記がんを、FANCMアンタゴニストに応答するとして同定する工程を含む、請求項72又は73に記載の方法。
  75. FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置について対象を選択する方法であって、前記方法が、前記対象がALTがんに罹っているかどうかを決定する工程を含み、前記対象がALTがんに罹っている場合、前記対象が、FANCM-RMI相互作用の前記阻害剤での処置について選択される、方法。
  76. がんに罹っている対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に好適であるかどうかを同定する方法であって、前記がんがALTがんであるかどうかを決定する工程を含み、前記対象がALTがんに罹っている場合、前記対象が、FANCM-RMI相互作用の前記阻害剤での処置に好適であると同定される、方法。
  77. 対象が、FANCM-RMI相互作用の阻害剤での処置に応答しているかどうかを決定する方法であって、
    対象から採取した細胞における1つ又は複数のテロメアにおけるゲノム不安定性の存在及び/若しくは程度を決定する工程;並びに/又は
    対象から採取した細胞におけるALT活性の存在及び/若しくはレベルを決定する工程
    を含む、方法。
  78. 前記細胞が、ALTがん細胞である、請求項77に記載の方法。
  79. 前記阻害剤が、遺伝学的阻害剤、小分子、ペプチド及びタンパク質のいずれか1つ又は複数である、請求項75から78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記遺伝学的阻害剤が、siRNAである、請求項79に記載の方法。
  81. 前記小分子が、4-[(1-ヒドロキシ-2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-ピリジン-2-イル-メチル]-ピペラジン-1-カルボン酸エチルエステルである、請求項79に記載の方法。
  82. 前記ペプチドが、
    DLFSVTFDLGFC(配列番号49)、
    DIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号50)、
    EDIFDCSRDLFSVTFDLGFCSPDSDDEILEHTSD(配列番号5)
    からなる群から選択されるペプチドと少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項79に記載の方法。
  83. 前記タンパク質が、不活性化されたFANCMタンパク質である、請求項79に記載の方法。
  84. 前記不活性化されたFANCMタンパク質が、F1232A/F1236A二重置換及び/又はK117R置換を含む、請求項83に記載の方法。
  85. 前記タンパク質が、免疫グロブリン結合ドメインを含む、請求項79に記載の方法。
  86. ALTがん細胞の死を誘発する化合物をスクリーニングする方法であって、
    試験化合物とFANCMとの結合を決定する工程
    を含み、
    FANCMとの結合は、前記化合物がALT細胞において細胞死を誘発することを示す、方法。
  87. ALTがん細胞の死を誘発する化合物をスクリーニングする方法であって、FANCMの発現又は活性に対する試験化合物の作用を決定する工程を含み、
    FANCMの発現又は活性における低減は、前記化合物が、ALT細胞において細胞死を誘発することを示す、方法。
  88. 前記試験化合物を、FANCMの発現又は活性を低減させる化合物として同定する工程を含む、請求項87又は88に記載の方法。
  89. 同定された化合物を単離又は精製する工程を含む、請求項88に記載の方法。
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