KR20170076606A - Upf1 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제, UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법 및 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

UPF1 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition for immunotherapy comprising an UPF1 inhibitor as an active ingredient}
본 발명은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제, UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법 및 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
모든 세포는 필요한 유전정보를 적당한 시기에 적당한 양을 적당한 위치에 발현하기 위해 많은 유전자 발현조절 기전을 가지고 있다. 유전자의 발현조절 기전은 사람 세포에 있어서 전사, 스플라이싱 (splicing), 번역 과정 동안 필수적으로 수반되는 작용기전으로서, 정확한 유전정보를 세포 내에 발현하는 기능을 담당하고 있다.
많은 종류의 유전자 발현조절 기전 중, 특히 mRNA의 양질조절(quality control)에 관여하는 대표적인 기전으로 넌센스-매개 mRNA 깨짐(Nonsense-mediated mRNA Decay, NMD)이 잘 알려져 있다. 상기 NMD 기전은 mRNA 상에서 비정상인 단백질 종결코돈 (Premature termination codon, 이하, 'PTC'라고 함)이 생성되었을 경우, 이 mRNA를 인식하여 최종적으로 세포 내에서 제거하는 기전이다.
NMD는 PTC-함유 mRNA들을 분해하여 변이 단백질의 생성을 방지하는 가장 잘 연구된 번역 후 기작이다. 비록 PTC-함유 mRNA들을 효과적으로 제거하지만, 최근의 연구에 따르면, 일부 PTC-함유 mRNA들이 NMD을 회피하고, 다른 것들은 NMD에 내성적이라는 증거가 있다. 이러한 변이 mRNA들이 번역된다면 신생 펩타이드를 가진 절단된 변이 단백질들이 생겨나게 된다. 변이 단백질들의 생성은 암을 위시한 질병의 발생과 직접적으로 연계되고, 및 변이 단백질들은 질병에 대한 치료법을 개발하는 데 이용되어 왔다. 따라서, PTC-함유 mRNA들이 변이 단백질의 생성 원으로서 사용될 수 있는지 및 변이 단백질의 생성을 조절하는 인자를 특정화하여 이러한 과정을 조작할 수 있는 지를 이해하는 것이 점점 더 중요해지고 있다.
1. Brogna, S. & Wen, J. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) mechanisms. Nat Struct Mol Biol 16, 107-13 (2009). 2. Le Hir, H., Moore, M.J. & Maquat, L.E. Pre-mRNA splicing alters mRNP composition: evidence for stable association of proteins at exon-exon junctions. Genes Dev 14, 1098-108 (2000). 3. Maquat, L.E. When cells stop making sense: effects of nonsense codons on RNA metabolism in vertebrate cells. RNA 1, 453-65 (1995). 4. Le Hir, H., Izaurralde, E., Maquat, L.E. & Moore, M.J. The spliceosome deposits multiple proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions. EMBO J 19, 6860-9 (2000). 5. Metze, S., Herzog, V.A., Ruepp, M.D. & Muhlemann, O. Comparison of EJC-enhanced and EJC-independent NMD in human cells reveals two partially redundant degradation pathways. RNA 19, 1432-48 (2013). 6. Kashima, I. et al. Binding of a novel SMG-1-Upf1-eRF1-eRF3 complex (SURF) to the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev 20, 355-67 (2006). 7. Holbrook, J.A., Neu-Yilik, G., Hentze, M.W. & Kulozik, A.E. Nonsense-mediated decay approaches the clinic. Nat Genet 36, 801-8 (2004). 8. Kim, W.K. et al. Identification and selective degradation of neopeptide-containing truncated mutant proteins in the tumors with high microsatellite instability. Clin Cancer Res 19, 3369-82 (2013). 9. Trcek, T., Sato, H., Singer, R.H. & Maquat, L.E. Temporal and spatial characterization of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev 27, 541-51 (2013). 10. Maquat, L.E., Tarn, W.Y. & Isken, O. The pioneer round of translation: features and functions. Cell 142, 368-74 (2010). 11. Cheng, J. & Maquat, L.E. Nonsense codons can reduce the abundance of nuclear mRNA without affecting the abundance of pre-mRNA or the half-life of cytoplasmic mRNA. Mol Cell Biol 13, 1892-902 (1993). 12. Belgrader, P., Cheng, J. & Maquat, L.E. Evidence to implicate translation by ribosomes in the mechanism by which nonsense codons reduce the nuclear level of human triosephosphate isomerase mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 482-6 (1993). 13. Lejeune, F., Li, X. & Maquat, L.E. Nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells involves decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Mol Cell 12, 675-87 (2003). 14. Barbier, J. et al. Regulation of H-ras splice variant expression by cross talk between the p53 and nonsense-mediated mRNA decay pathways. Mol Cell Biol 27, 7315-33 (2007). 15. Rio Frio, T. et al. Premature termination codons in PRPF31 cause retinitis pigmentosa via haploinsufficiency due to nonsense-mediated mRNA decay. J Clin Invest 118, 1519-31 (2008). 16. Van Allen, E.M. et al. Genomic correlates of response to CTLA-4 blockade in metastatic melanoma. Science 350, 207-11 (2015). 17. Le, D.T. et al. PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med 372, 2509-20 (2015).
본 발명자들은 여러 종양에서 돌연변이 mRNA가 돌연변이 단백질로 만들어지는 과정은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1)에 의해 대부분 막혀있는데, 이러한 UPF1을 억제해주면 여러 암에서 돌연변이 단백질 생성을 촉진할 수 있고, 이는 곧 종양항원으로 작용하여 면역치료에 응용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 종양항원을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
미성숙 종결 코돈(PTC)들을 함유한 변이 mRNA들은 넌센스-매개 전사체 붕괴(nonsense-mediated mRNA decay)를 통해 빠르게 분해되어, 절단된 변이 단백질이 생성되는 것을 막는다. 그러나 일부 PTC-함유 mRNA들은 NMD에서 살아남아서 암과 같은 다양한 질병에 관여하는 절단된 단백질을 발생시키는 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 PTC-함유 인간 게놈성 β-글로빈 DNA 벡터를 사용하여 NMD-수용성(competent) PTC-함유 벡터로부터 발현된 PTC-함유 mRNA들의 약 30%는 정상상태에 안정적으로 머물러 있고, PTC가 없는(free) 대응체와 동등하게 안정하다는 것을 밝혔다.
이들의 안정한 발현에도 불구하고, 이러한 mRNA들은 폴리좀과의 연합이 약하며, 변이 단백질의 발현에 거의 영향을 끼치지 못하는 것으로 나타난다. 또한, 본 발명자들은 NMD-수용성 PTC-함유 벡터 출처의 미량의 변이 단백질이 일차적으로 번역의 개시 회차(pioneer round)에서 유래한다는 증거를, 안정적으로 발현된 PTC-함유 mRNA들의 eIF4E-의존적 번역 또는 축적을 저해함으로써 변이 단백질의 발현이 조절되지 않는다는 것을 밝힘으로써 제공하였다.
또한, 변이 단백질의 생성이 NMD 및 후속적 eIF4E-의존성 번역으로부터 남겨진 PTC-함유 mRNA들의 폴리좀과의 연합을 유도하는 UPF1 또는 SMG1 저해에 의해 유의하게 촉진될 수 있다는 증거를 제공한다. 수없이 많은 전사체들이 NMD 경로에 대한 기질인 것을 고려하여, PTC-함유 mRNA들은 변이 단백질 생성에 대한 기본적이고 조절 가능한 원천이고 이는 질병 치료에 적용될 수 있다.
넌센스-매개 전사체 붕괴(nonsense-mediated mRNA decay; 이하 NMD)는 넌센스/프레임천이 변이, 유전자 재배열, 또는 스플라이싱에 의해 생성된 미성숙 종결 코돈(PTC)-함유 mRNA들을 분해하는, 번역 수준에서의 품질관리 기작이다. 번역된다면, PTC-함유 mRNA들은 기능 획득(gain-of-function) 또는 우성적 네거티브 활성을 통해 세포 기능을 혼란시킬 수 있는 유해한 절단된 단백질을 생성할 잠재력을 가질 수 있다.
EJC들(exon-junction complexes) 및 UPF 복합체와 같은 다양한 인자들은 NMD 경로의 중심에 서서 주요한 역할을 한다. NMD의 궁극적 목적은 PTC-함유 mRNA들을 분해함으로써 절단된 변이 단백질의 생성을 방지하는 것이다. 변이 mRNA들이 최종 엑손이 PTC를 포함하고 있으면, 이들은 NMD에 효과적으로 인지되지 않고(NMD-무관련성), 절단된 변이 단백질들은 인간 세포에서 이러한 mRNA들로부터 생성된다고 예상된다.
본 발명자들은, 마지막 엑손에서 프레임 천이에 의해 생성된 NMD-무관련성 PTC-함유 mRNA들이 무흠적이며, 높은 현미부수체 불안정성(microsatellite instability, MSI-H)을 가진 대장암에서 신생 펩타이드(신생항원 neoantigen)를 가진 절단된 변이 단백질로 번역되는 것을 이전에 보고하였다. 이러한 절단된 변이 단백질들은 프로테아좀-매개 분해로 인해 인간 세포에서는 재빠르게 제거되었고, 강력한 종양 항원으로서 사용되는 것으로 예상되었다. 마지막 엑손에서 PTC를 함유하는 변이 mRNA들을 제외하고, PTC를 함유하는 다른 변이 mRNA들은 NMD에 의해 분해되는 것으로 예측된다.
그러나 연구에 의하면, NMD-수용성 PTC-함유 mRNA의 약 10% 내지 30%는 NMD를 회피하고, 인간 세포에서 안정적으로 존재하며, 및/또는 특이한 생리적 조건하에서 NMD 감시에서 벗어날 수 있다는 증거가 점차 증가하고 있다.
NMD에서 생존하거나 회피한 이러한 PTC-함유 mRNA들로부터 변이 단백질이 생성하는 것인지를 결정하는 것은 중요한데, 왜냐하면 변이 단백질의 생성은 질병, 특히 암과 직접적으로 연결되기 때문이다. 더욱이, 최근 연구에 따르면 흑색종 또는 MSI-H 대장암 환자에 면역요법들을 적용할 때, 변이성 부하 및 신생항원 부하는 유의하게 임상적 효용과 연계된다는 것을 밝혀졌다. 이러한 발견은 변이 단백질 생성 근저에 있는 기작을 더 깊이 이해할 수 있는 데 방점을 둔다.
본 발명자들은 인간 게놈성 β-글로빈 DNA를 함유하는 발현 벡터를 사용하여, NMD-수용성 PTC-함유 벡터로부터 얻은 PTC-함유 mRNA 일부는 정상 상태에서 안정적으로 발현되지만, 이러한 mRNA들은 NMD-수용성 PTC-함유 벡터로부터 발현된 변이 단백질 발현에 거의 영향을 못 끼친다는 것을 보였다.
본 발명자들은 NMD-수용성 PTC-함유 벡터로부터 발현된 미량의 변이 단백질을 검출할 수 있었고, 이러한 변이 단백질들은 PTC-함유 mRNA의 번역 개시 회차 동안 일차적으로 생성된다는 것이 발견되었다.
또한, 본 발명자들은 UPF1 또는 SMG1 하향조절에 의해 NMD를 저해하면, NMD로부터 비켜난 PTC-함유 mRNA들의 eIF4E-의존성 번역을 통해 다량의 변이 단백질을 생성할 수 있다는 증거를 또한 제공한다.
전체적으로, 미량의 절단된 변이 단백질이 PTC-함유 mRNA의 번역 개시 회차에 일정하게 생성되며, 및 변이 단백질의 생성은 UPF1 또는 SMG1을 저해함으로써 구출된PTC-함유 mRNA들의 eIF4E-의존성 번역을 통해 유의하게 유도될 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제에 관한 것이다.
상기 뉴클레오타이드는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 특정 영역과 혼성화 가능한 RNA, RNA 앱타머, 안티센스 RNA, 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오타이드는 유전자 발현에 대해 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 siNA, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA와 같은 핵산분자일 수 있으며, 예를 들어, 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 10 내지 40개, 10 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 1개 이상의 서열과 결합할 수 있으며, 예를 들어 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 연속하는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 또는 약 20 개의 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법에 관한 것이다.
상기 UPF1 단백질의 발현의 억제는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드에 의해 억제되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 뉴클레오타이드는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 특정 영역과 혼성화 가능한 RNA, RNA 앱타머, 안티센스 RNA, 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오타이드는 유전자 발현에 대해 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 siNA, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA와 같은 핵산분자일 수 있으며, 예를 들어, 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 10 내지 40개, 10 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 1개 이상의 서열과 결합할 수 있으며, 예를 들어 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 연속하는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 또는 약 20 개의 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 억제제는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합하는 뉴클레오타이드인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 뉴클레오타이드는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 특정 영역과 혼성화 가능한 RNA, RNA 앱타머, 안티센스 RNA, 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오타이드는 유전자 발현에 대해 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 siNA, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA와 같은 핵산분자일 수 있으며, 예를 들어, 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 10 내지 40개, 10 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 1개 이상의 서열과 결합할 수 있으며, 예를 들어 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 연속하는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 또는 약 20 개의 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화한 약제학적 제제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다
본 발명에 따른 약제학적 제제를 비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
보다 상세하게, 상기 약제학적 제제는 상기 조성물에 추가하여 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 부형제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제를 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 제제는 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약제학적 제제는 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분(i.e., SCOTIN 단백질, 이의 코딩 유전자 또는 이들의 혼합물) 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 10000 ㎎/kg, 0.01 내지 10000 ㎎/kg, 0.1 내지 10000 ㎎/kg, 0.5 내지 10000 ㎎/kg, 0.001 내지 1000 ㎎/kg, 0.01 내지 1000 ㎎/kg, 0.1 내지 1000 ㎎/kg, 0.5 내지 1000 ㎎/kg, 0.001 내지 500 ㎎/kg, 0.01 내지 500 ㎎/kg, 0.1 내지 500 ㎎/kg, 0.5 내지 500 ㎎/kg, 0.001 내지 300 ㎎/kg, 0.01 내지 300 ㎎/kg, 0.1 내지 300 ㎎/kg, 또는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 일 예는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 종양항원을 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 UPF1 단백질의 발현의 억제는 UPF1 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드에 의해 억제되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 뉴클레오타이드는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 특정 영역과 혼성화 가능한 RNA, RNA 앱타머, 안티센스 RNA, 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 뉴클레오타이드는 유전자 발현에 대해 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 siNA, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA와 같은 핵산분자일 수 있으며, 예를 들어, 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 10 내지 40개, 10 내지 30개, 15 내지 25개, 또는 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열일 수 있다.
또한, 상기 뉴클레오타이드는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 1개 이상의 서열과 결합할 수 있으며, 예를 들어 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA의 연속하는 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 또는 약 20 개의 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있다.
상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
여러 종양에서 돌연변이 mRNA가 돌연변이 단백질로 만들어지는 과정은 UPF1에 의해 대부분 막혀있는데, 이러한 UPF1을 억제해주면 여러 암에서 돌연변이 단백질 생성을 촉진할 수 있고, 이는 곧 종양항원으로 작용하여 면역치료에 응용이 가능하다.
본 발명에서 용어 "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질, 또는 기능성 RNA를 암호화할 수 있다. 이때, 조절단백질은 전사인자, 열 충격단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 표적 유전자는 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질"은 펩타이드 결합(들)에 의해 함께 연결된 아미노산의 중합체를 포함하는 분자를 의미한다. 단백질은 2 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 일 수 있다.
본 발명의 용어 "코딩"은 DNA 분자로부터 이의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 RNA 분자를 암호화 하는 것을 포함하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 상기 벡터는 목적 유전자 발현을 위한 요소 (elements)를 포함하는 것으로, 복제원점 (replication origin), 프로모터, 작동 유전자 (operator), 전사 종결 서열 (terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site; RBS), IRES (Internal Ribosome Entry Site) 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터로서 상기한 융합 폴리뉴클레오타이드 (융합 프로모터)를 갖도록 통상적인 유전공학적 방법으로 조작된 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 이외의 전사 조절 서열 (예컨대 인핸서 등)을 추가로 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈 (Invitrogen), pCI (Promega), Mammalian expression vector (Sigma), pCMV-Tag epitope taggging mammalian vector(Stratagene), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있다.
본 발명은 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제, UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법 및 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 여러 종양에서 돌연변이 mRNA가 돌연변이 단백질로 만들어지는 과정은 UPF1에 의해 대부분 막혀있는데, 이러한 UPF1을 억제해주면 여러 암에서 돌연변이 단백질 생성을 촉진할 수 있고, 이는 곧 종양항원으로 작용하여 면역치료에 응용이 가능하다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 야생형 인간 게놈성 β-글로빈 DNA(gBglo-WT)을 함유하는 발현 벡터 및 미성숙 종결 코돈(PTC)들을 지정된 위치들에 도입하는 돌연변이 발생법에 의해 gBglo-WT로부터 유도된 플라스미드들의 개략도이다.
도 1b은 본 발명의 일 실시예에 따른 RT-PCR 앰프리콘 위치의 개략도(좌상), EGFP을 내부 대조군으로 사용하면서 전구체 β-글로빈 RNA를 RT-PCR 분석결과(좌하) 및 도 1a의 벡터로 형질감염된 HeLa 세포로부터 분리한 mRNA의 qPCR 분석결과이다(우).
도 1c은 본 발명의 일 실시예에 따라 gBglo-WT, gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 얻은 β-글로빈 mRNA들의 세포 내 위치를 보여주는 사진이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 악티노마이신 D(Act.D) 처리 후 지정된 시간에서 발현벡터 gBglo-WT, gBglo-P39, gBglo-P66, gBglo-P101 및 gBglo-P127로부터 발현된 mRNA의 HeLa 세포 내에서의 qPCR 분석결과를 나타낸 그래프이다. (GAPDH 및 c-Myc는 각각 안정한 및 매우 불안정한 대조군으로 사용)
도 2c 및 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 악티노마이신 D(Act.D) 처리 후 지정된 시간에서 발현벡터 gBglo-WT, gBglo-P39, gBglo-P66, gBglo-P101 및 gBglo-P127로부터 발현된 mRNA의 HEK293 세포에서의 qPCR 분석결과를 나타낸 그래프이다. (GAPDH 및 c-Myc는 각각 안정한 및 매우 불안정한 대조군으로 사용)
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 Act.D 처리 후 조기 시점에서 gBglo-WT, gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 발현된 mRNA의 qPCR 분석를 보여주는 그래프이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따라 프로테아좀 저해체 MG132의 존재 또는 부재 하에서 항-FLAG 항체에 짧게(상) 및 길게(하) 노출하여 HeLa 세포에서 지정된 게놈성 β-글로빈 벡터로부터의 나온 야생형 및 변이 단백질 발현의 웨스턴 분석결과를 보여주는 그림이다. (화살표: 변이 단백질들의 예상된 위치, 숫자: 야생형에 상대적인 밴드 밀도)
도 2g는 본 발명의 일 실시예에 따라 MG132 존재 또는 부존재 하에서 HeLa 세포 내 지정된 게놈성 β-글로빈 벡터로부터 발현된 mRNA의 qPCR 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 gBglo-P66로부터 나온 미량의 변이 단백질은 eIF4E 의존성 번역으로부터 유래되지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 gBglo-P66로부터 나온 미량의 변이 단백질은 eIF4E 의존성 번역으로부터 유래되지 않음을 보여주는 사진이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 지정된 일정량의 gBglo-WT 또는 gBglo-P66 및 encoding eIF4E-의존성 번역 저해체 4E-BP1 를 암호화하는 발현벡터를 증가하는 양으로 공형질감염한 HeLa 세포에서의 단백질 발현의 웨스턴 분석결과를 보여주는 사진이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 지정된 일정량의 gBglo-WT 또는 gBglo-P66 및 encoding eIF4E-의존성 번역 저해체 4E-BP1 를 암호화하는 발현벡터를 증가하는 양으로 지정된 시간 동안 4EGi-1로 처리한 세포에서의 단백질 발현의 웨스턴 분석결과를 보여주는 사진이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 Act.D으로 선처리하거나 하지 않은 채 gBglo-P66로 형질감염된 HeLa 세포에서의 단백질 발현의 웨스턴 블랏 결과(좌) 및 상대적인 mRNA 발현의 qPCR 분석결과(우)를 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 도4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1를 타겟팅하는 siRNA의 부재(A-D) 또는 존재(E)하에서, 지정된 벡터로 형질 감염된 HeLa 세포의 폴리좀을 함유하는 수크로스 구배 분획물들의 254nm에서의 흡광도(상) 및 상대적인 mRNA 수준의 RT-PCR 분석(하)결과를 나타낸 사진이다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1 녹다운의 존재 및 부재 하에서 지정된 벡터로 형질 감염된 도 4c 내지 도 4e에 나타난 세포에서의 PTC-함유 mRNA들의 분배 패턴의 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1를 타겟팅하는 siRNA 또는 대조군 siRNA(NC) 및 지정된 야생형 또는 변이 β-글로빈 벡터로 HeLa 세포를 형질 감염한 3일 후에 UPF1 발현의 웨스턴 분석(상) 및 β-글로빈 mRNA 수준의 qPCR 분석(하)결과를 보여주는 사진이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1를 타겟팅하는 siRNA의 존재 또는 부재 시, 및 MG132의 존재 또는 부재 시, 지정된 벡터로 형질감염된 세포에서의 야생형 및 변이 β-글로빈 발현의 웨스턴 분석 결과를 보여주는 사진이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1를 타겟팅하는 siRNA의 존재 또는 부재 시, 및 MG132의 존재 또는 부재 시, 지정된 벡터로 형질감염된 세포에서의 야생형 및 변이 β-글로빈 발현의 mRNA 수준의 qPCR 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1을 타겟팅하는 siRNA1(siUPF1) 또는 대조군 siRNA(siNC) 존재 또는 부재 하에서, 및 MG132 및 4EGi-1의 존재 및 부재 하에서, HA-4E-BP1을 함유하는 벡터로 공형질감염되거나 되지 않은 HeLa 세포에서 항-FLAG 항체를 사용시 NMD-회피된 PTC-함유 gBglo-P66 mRNA로부터 번역된 β-글로빈 및 항-HA 항체를 사용시 HA-4E-BP1의 웨스턴 분석(좌) 및 블랏 내 β-글로빈 밴드들의 상대적 밀도(우)를 보여주는 도면이다.
도 5e는 본 발명의 일 실시에에 따라 도 5d에서 분석된 세포 내 mRNA 발현의 qPCR 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 5f는 본 발명의 일 실시예에 따라 UPF1가 결핍되거나 그러지 않았을 때, gBglo-WT 또는 gBglo-P66를 포함하는 HA-eIF4E 벡터로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하여 RNA 면역침전 검정 분석 결과를 보여주는 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포에서 각 타겟 유전자에 대한 siRNA가 코어 NMD 및 EJC 인자들인 UPF1, Y14, EIF4A3, SMG1, UPF2 및 MAGOH의 단백질 발현을 하향 조절하는 것을 보여주는 웨스턴 분석 결과이다 (내부 대조군: GAPDH).
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 gBglo-WT 또는 gBglo-P66, 및 각 인자에 대한 siRNA로 형질 감염된 HeLa 세포에서의 β-글로빈 mRNA의 qPCR 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 도 6b에서 분석된 세포에서 NMD-회피된 PTC-함유 gBglo-P66 mRNA로부터 유도된 β-글로빈의 웨스턴 분석(좌) 및 상대적인 밴드 밀도(우)를 보여주는 사진이다.
도 6d는 본 발명의 일 실시예에 따라 MG132 존재 및 부존재 하에서 gBglo-P66로 형질감염된 HeLa 세포에서의 UPF1과 UPF2, Y14, EIF4A3 또는 MAGOH에 의한 동시 저해를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 PTC-함유 mRNA들로부터 변이 단백질을 생성하는 개략한 모델을 나태는 것으로, 모델은 PTC-함유 mRNA들의 구별되는 운명을 나타낸다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 게놈 인간 β- 글로빈 발현 벡터를 HeLa 세포에 형질 감염시킨 후, 웨스턴 블랏과 qRT-PCR을 수행하여 단백질과 mRNA의 발현을 평가한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 절단 된 돌연변이 β-글로빈 단백질의 객관적인 안정성을 평가하기 위해 제작된 cDNA 형태의 인간 β-글로빈 발현 벡터를 나타내는 그림이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따라 cDNA 형태의 β-글로빈 구조물을 HeLa 세포로 형질 전환시킨 후, 단백질 및 mRNA 발현 수준 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 증가하는 양의 gBglo-WT 및 gBglo-P66 플라스미드를 HeLa 세포로 형질 감염시키고, 2일 후에 qRT-PCR을 수행하여 각각의 구조물로부터 mRNA 발현 수준을 측정하였으며, 동일한 양의 각각의 플라스미드가 형질 감염되었을 때 gBglo-WT 및 gBglo-P66의 mRNA 발현 수준 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 증가하는 양의 gBglo-WT 및 gBglo-P66 플라스미드를 HeLa 세포로 형질 감염시키고, 2일 후에 qRT-PCR을 수행하여 각각의 구조물로부터 mRNA 발현 수준을 측정하였으며, 일정량의 gBglo-WT 플라스미드를 형질 감염 시켰을 때 증가하는 gBglo-P66의 mRNA 발현 변화 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 증가하는 양의 gBglo-WT 플라스미드를HeLa 세포로 형질 감염시키고, 2일 후에 qRT-PCR과 western blotting을 수행하여 gBglo-WT로부터 생성된 mRNA의 양이 증가함에 따라 단백질 역시 증가한다는 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 4E-BP1 플라스미드와 EGFP 플라스미드를 HeLa 세포로 형질 감염시키고, 2일 후에 western blotting을 수행하여 4E-BP1의 발현이 EGPF mRNA의 eIF4E 의존 번역을 효율적으로 저해하는 것을 보여주는 결과 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 NMD 무관 벡터인 gBglo-P101과 gBglo-P127의 모식도를 보여주는 그림이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따라 gBglo-P101 및 gBglo-P127 (NMD-무관련성) 구조물을 UPF1의 하향 조절 하에 또는 하지 않고 HeLa 세포로 형질 감염시킨 후, mRNA와 단백질 발현을 측정한 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
세포주와 시약
HeLa 및 HEK293 세포들은 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 수득하였다. 10% 우태아혈청(FBS, Life Technologies)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 ATCC 지침에 따라 세포들을 유지하였다. 프로테아좀 저해체 MG132(25 uM) 및 번역 개시 인자들인 eIF4E 및 eIF4G의 상호작용을 저해하는20 uM 4EGi-1로 세포를 처리하여 eIF4E-의존성 번역을 특이적으로 차단하였다. β-글로빈 벡터로부터 발현된 mRNA들의 안정성을 확인하기 위해, 세포를 악티노마이신 D로 처리하여 전사를 저해하였다.
RT-PCR 및 qPCR
β-글로빈 및 EGFP 암호화하는 발현 벡터로 형질감염된 세포로부터 illustra RNAspin Mini Kits(GE Healthcare)를 사용하여 총 RNA를 분리하였고, 2 ug의 RNA를 사용하여 RT를 수행하였다. ABI PRISM 7500 Sequence Detector(Applied Biosystems) 및 SYBR Premix Ex TaqII(TaKaRa)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 qPCR를 수행하였다. β-글로빈 mRNA 수준을 EGFP의 것에 표준화하였다. mRNA 수준들은 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.
플라스미드 작제 및 형질 감염
두 개 인간 β-글로빈 발현 벡터를 제조한바, 하나는 인트론들을 포함하는 게놈성 DNA를 함유하는 것이고, 다른 하나는 cDNA를 함유하는 것이었다. 게놈성 DNA 발현벡터(gBglo-WT)를 생성하기 위해, β-글로빈 유전자의 세 개 엑손 및 그 사이에 개제되는 인트론들을 3xFLAG 태그 함유 벡터 PCMV10로 클론하였다. 점 돌연변이(point mutagenesis)을 수행하여 변이 벡터 gBglo-P39와 gBglo-P66(PTC는 엑손 2에 위치) 및 gBglo-P101과 gBglo-P127(PTC는 마지막 엑손인 엑손 3에 위치)를 생성하였다. cDNA 발현벡터(cBglo-WT)를 만들기 위해, gBglo-WT로 형질감염된 세포로부터 분리한 RNA에서 얻은 cDNA로부터 PCR로 β-글로빈 유전자의 코딩 부위들은 증폭하고 이를 3xFLAG 태그를 포함하는 벡터 PCMV10으로 클론하였다. cBglo-WT을 사용하여, 변이 벡터 cBglo-P39, cBglo-P66, cBlgo-P101 및 cBglo-127을 점 돌연변이로 생성하였다. eIF4E-의존성 번역을 저해하기 위해, 4E-BP1 발현벡터를 만들었다. HeLa 세포로부터 만든 cDNA들을 사용하여, 4E-BP1 유전자의 코딩 부위를 헤마글루티닌(HA) 태그를 포함하는 PCMV10으로 클론시켰다. 세포들을 내부 대조용으로서 벡터 CMV10-EGFP로 공형질감염시켰다. Lipofectamine 3000(Life Technologies)을 제조사의 지침에 따라 사용하여, β-글로빈 발현 벡터 단독, 및 EIF4Alll, Y14, UPF1 또는 SMG1(Bioneer)를 타겟하는 간섭 RNA들(siRNAs)과 함께 세포에 형질감염시키고, 3일 수에 수집하였다. 클로닝에 사용된 프라이머들과 siRNAs에 의해 타겟된 뉴클레오타이드 및 siRNA는 하기 표 1에 기재되어 있다.
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
1 PCMV10 3XFLAG-β-globin_F
(gDNA form)		 AGCAACCTCAAACAGACACC
2 PCMV10 3XFLAG-β-globin_R
(gDNA form)		 GACCTCCCACATTCCCTT
3 PCMV10 3XFLAG-β-globin_F
(gDNA form)		 TGCAACCTCAAACAGACACCA
4 PCMV10 3XFLAG-β-globin_R
(gDNA form)		 GCAAGAAAGCGAGCTTAGTGA
5 PCMV-HA-4E-BP1_F GTGCAGCGCACAGGAGAC
6 PCMV-HA-4E-BP1_R CTCCACACGATGGCTGGT
7 siUPF1 (siRNA) GAUGCAGUUCCGCUCCAUU
8 siEIF4A3 (siRNA) GAGGAAUCAAGCAGAUCAU
9 siY14 (siRNA) CGCUCUGUUGAAGGCUGGA
10 siSMG1 (siRNA) GTGTATGTGCGCCAAAGTA
웨스턴 블랏팅
패시브 용혈 완충액(Promega)를 사용하여 형질감염된 세포로부터 총 단백질을 얻고, 30 ug의 각 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막에 전이하였다. 5% 탈지유 함유 Tween 20을 포함하는 트리스-완충 식염수(TBST)로 차단한 후, 블랏들을 GAPDH(Trevigen), HA(Santacruz), UPF1(Cell Signaling Technology), SMG-1(Cell Signaling Technology), Y14(Santa Cruz Biotechnology), EIF4Alll(Proteintech), FLAG(Sigma), GFP(BD Biosciences), 및 HIF1-α(Cell Signaling Technology)에 대한 일차 항체로 실온에서 1시간 처리하였다. 겨자무 산화효소(HRP)-접합 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
폴리좀 분획화
발현벡터들의 형질 감염 48시간 후, HeLa 세포들을 100 ug/mL 사이클로헥시마이드로 실온에서 5분간 처리하고 빙냉 PBS로 세 번 세척하였다. 세포들을 PBS에 긁어 넣어서 수집한 후 용혈 완충액 [15 mM Tris-Cl, pH 7.4, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 100 ug/mL 사이클로헥시마이드, 1 mg/mL 헤파린, 및 200 U RNasin(Intron)]에서 처리하였다. 12,000g에서 2분간 원심분리하여 핵과 부스러기들을 제거하였다. 각 샘플의 1밀리리터를 11-mL 10%-50% 수크로스 구배액에 층을 지어 놓고, 2시간 동안 4℃에서 SW41 로터를 39,000 rpm으로 사용하여 원심분리하였다. 분획액 수집 시스템을 사용하여 12개 분획액을 각 구배액의 정부로부터 얻고, 동시에 254nm에서 흡광도를 측정하였다. TRIZOL 시약(Life Technologies)을 사용하여 각 분획액으로부터 RNA를 추출하고 RT-PCR로 분석하였다.
결과
벡터 gBglo -P39 및 gBglo -P66로부터 발현된 일부 PTC-함유 mRNA들은 분해되지 않는다.
PTC-함유 mRNA들로부터 변이 단백질의 생성을 연구하기 위해, 본 발명자들은 인간 야생형 β-글로빈 게놈성 DNA의 스플라이스되지 않은 형태를 사용하여 벡터를 생성하였다(gBglo-WT). 그 다음, PTC를 아미노산 위치 39 또는 66에 도입하여 gBglo-WT을 변이시키고, 각각 벡터 gBglo-P39 및 gBglo-P66을 얻었다(NMD-수용성 벡터). 벡터 gBglo-P101 및 gBglo-P127을 PTC을 아미노산 위치 101 또는 127에 도입하여 gBglo-WT을 돌연 변이하여 생성한바, 이는 β-글로빈 유전자의 마지막 엑손(엑손 3)에서 일어난 것이다. 따라서, 이러한 벡터로부터 나오는 PTC-함유 mRNA들은 NMD에 의해 인식될 것으로 예상되지 않는다(NMD-무관련성 벡터)(도 1a).
HeLa 세포들을 β-글로빈 벡터로 형질감염 시키고 48시간 후에 수집하였다. 역전사(RT)-PCR을 수행하여 전구체 β-글로빈 mRNA들의 발현 수준을 비교하고, 및 정량적인 qPCR을 수행하여 성숙 β-글로빈 mRNA들의 발현 수준을 비교하였다. PTC 위치에 관계없이, 모든 β-글로빈 벡터로부터 나오는 전구체 β-글로빈 mRNA들의 발현 수준은 유사하였다. gBglo-WT, gBglo-P101 및 gBglo-P127로부터 발현된 성숙 β-글로빈 mRNA들의 수준 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았고, 이는 NMD-무관련성 PTC-함유 gBglo-P101 및 gBglo-P127 mRNA들이 NMD 기질로서 인식되지 않았다는 것을 나타낸다. 반면에, 항상 상태에 있는 gBglo-P39 및 gBglo-P66 mRNA들의 잔류 수준은 gBglo-WT mRNA의 약 30%이고, 이들 mRNA들은 유사한 세포질 위치 패턴을 나타내었다(도 1b 및 도 1c).
항상 상태에서의 잔류 PTC-함유 gBglo -P39 및 gBglo -P66 mRNA들은 이들의 PTC가 없는 대응물과 동일하게 안정적이나, 무시할 만한 양의 변이 단백질을 생성한다.
변이 단백질들의 생성은 크게는 이들 원천 mRNA들의 안정성에 의존한다. 따라서, 본 발명자들은 항상 상태에 있는 잔류 PTC-함유 gBglo-P39 및 gBglo-P66 mRNA들의 안정성을 조사했다. HeLa 및 HEK293 세포들을 상기 게놈성 β-글로빈 벡터로 형질감염시키고, 악티노마이신 D로 40시간 후에 처리하여 전사를 저해한 후 qPCR로 분석하였다.
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 양쪽 세포 유형에서 상기 5개 β-글로빈 벡터로부터의 mRNA 발현이 시간-의존적으로 감소하는 것이, PTC 위치에 관계없이 유사하다는 것을 발견하였다. 항상 상태로 잔류하는 상기 PTC-함유 gBglo-P39 및 gBglo-P66 mRNA들은 야생형 β-글로빈 mRNA들과 동일하게 안정적이었고, 본 발명자들은 이들 mRNA들을 변이 단백질 생성의 잠재적 및 안정한 원천으로 간주하였다.
gBglo-WT, gBglo-P39, 및 gBglo-P66을 HeLa 세포에 형질감염시킴으로써, gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 출처된 PTC-함유 mRNA들의 안정성을 초기 시점에서 측정하였다. 세포들을 사이클로헥시마이드로 15 분간 미리 처리하여 빠르게 분해되는 PTC-함유 mRNA들이 축적되도록 유도하였다. 다음, 사이클로헥시마이드를 세척하고 악티노마이신 D를 처리하였다. gBglo-WT로부터 출처되는 야생형 mRNA들과는 달리, gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 나온 PTC-함유 mRNA들은 초기에 이중적 붕괴 패턴을 나타냈고, 이는 이전 보고와 일치하는 것으로 두 개의 PTC-함유 mRNA 집단(불안정한 및 매우 안정한 집단)이 있음을 가르킨다(도 2B).
그 다음, gBglo-P39 및 gBglo-P66 벡터로부터의 변이 단백질 발현을 HeLa 세포에서 분석하였다. 웨스턴 분석에 따르면, gBglo-P101 및 gBglo-P127으로부터 발현된, 절단된 변이 β-글로빈의 수준은 각각, gBglo-WT으로부터 발현된 야생형 β-글로빈의 약 71% 및 73% 임이 나타났다; 하지만, 변이 β-글로빈 단백질은 gBglo-P39 및 gBglo-P66로 형질감염된 세포에서는 검출될 수 없었다. 본 발명자들은 각 벡터로부터의 mRNA 발현을 qPCR로 확인하였다(도 8a).
gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 항상 상태에서 나오는 잔류 PTC-함유 mRNA들의 안정성을 고려하여, 본 발명자들은 gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 출처되는, 검출될 수 없는 수준의 단백질 발현은 변이 단백질들의 낮은 안정성에 기인할 수 있다는 의심을 하였다. 변이 β-글로빈들의 안정성을 측정하기 위해, 원래의 β-글로빈 발현 벡터들의 cDNA 형태들을 생성하였다(cBglo-WT, cBglo-P39, cBglo-P66, cBglo-P101, 및 cBglo-P127). 이러한 벡터들은 EJC 조합체가 없기 때문에 NMD-무관련성 PTC-함유 mRNA들을 발현하였다(도 8b).
상기 5개 cDNA β-글로빈 벡터들을 HeLa 세포로 형질감염시키고, 동시에 세포를 프로테아좀 저해체 MG132로 처리하여 불안정한 변이 단백질의 잠재적 프로테아좀성 분해를 방지하였다. 단백질과 mRNA 수준을 각각 웨스턴 및 qPCR로 분석하였다. cBglo-P101 및 cBglo-P127로부터 발현된 변이 단백질을 프로테아좀성 저해 존재 및 부존재하에서 검출하였다. cBglo-P39으로부터 발현된 단백질은 MG132 처리 후에만, 낮은 수준에서 검출되었고, 및 특히, cBglo-P66로부터 발현된 상당한 수준의 변이 단백질이 MG132 처리로 검출되었다. 모든 cDNA β-글로빈 벡터로부터 나온 mRNA들의 발현 수준은 거의 유사하였다(도 8c). 이러한 발견은 gBglo-P66 벡터가 항상 상태에 있는 잔류 PTC-함유 mRNA로부터 변이 단백질들을 생성하는 것을 조사하는 데 적절한 모델이라는 것을 알려준다.
그 다음, 게놈성 β-글로빈 발현 벡터들로 형질감염된 HeLa 세포에서 단백질과 mRNA 발현을 분석하였다. gBglo-P66로부터 발현된 변이 단백질은 거의 검출되지 않았지만, MG132 처리하면, gBglo-WT로부터의 야생형 β-글로빈 발현 수준의 4%까지 끌어올려 졌다(도 2c). HIF1α 발현을 측정하여 MG132에 의한 프로테아좀성 분해 저해를 확인하였다. 또한, 각 벡터가 MG132 처리에 최소한으로 영향을 받는다는 것을 확인하였다(도 2d).
eIF4E 의존성 번역은 gBglo -P66으로부터의 변이 단백질 생성에 관여하지 않는다.
gBglo-P66에서 나온 변이 단백질들은 MG132 처리 후에 검출되었기 때문에, 본 발명자들은 정상 상태에서는 더 많은 PTC-함유 mRNA들이 더 많은 변이 단백질을 결과할 수 있을 것이라는 의심을 하였다. 세포가 gBglo-WT보다 3배 더 많은 양의 gBglo-P66로 형질감염될 때, gBglo-P66 mRNA의 수준은 정상 상태에서 gBglo-WT mRNA의 85%까지 축적되었다(도 9a). 또한, 세포가 동일한 양의 각 벡터로 형질감염될 때, gBglo-WT mRNA 대 gBglo-P66의 비율은 10:3에서 일정하게 남겨지는 것을 확인하였다(도 9b).
상기 결과에 기초하여, 일정량의 gBglo-WT 또는 증가하는 양의 gBglo-P66로 형질감염되고, 및 MG132 존재 또는 부존재하에서 배양된 HeLa 세포에서의 mRNA 및 단백질 수준을 각각 qPCR 및 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
분석 결과 형질감염된 gBglo-P66의 양이 증가할수록, 잔류 PTC-함유 gBglo-P66 mRNA의 발현이 점진적으로 증가하였다(도 3a). 그러나 변이 단백질의 수준은 변이 mRNA이 축적됨에 따라 증가하지 않았다(도 3b). 야생형 벡터를 사용하여 동일한 실험을 수행할 때, mRNA 및 단백질 수준이 동시에 증가하는 것이 관찰 되었다(도 10). 이러한 발견으로 인해, 미량의 변이 gBglo-P66 단백질이 어디에서 나오는 지를 조사하였다.
mRNA들이 eIF4E-의존성 번역될 때, 많은 양의 세포성 단백질이 생성되며, 세포성 단백질은 번역의 개시 회차 동안 생성된다는 것이 또한 알려져 있다. 번역 과정의 어떠한 단계에서, 미량의 변이 gBglo-P66 단백질이 생성되는 것인지를 결정하기 위해, 4E-BP1를 eIF4E-의존성 번역의 특이적 저해체로 사용하였고, 및 4E-BP1이 EGFP의 번역을 효과적으로 차단한다는 것을 증명하였다(보충 도면 S4).
그 다음, HeLa 세포를 4E-BP1 벡터 및 gBglo-WT 또는 gBglo-P66로 공동 형질감염시켰다. 4E-BP1 발현이 증가함에 따라, gBglo-WT로부터의 야생형 β-글로빈 발현이 점차적으로 감소하였다; 그러나, gBglo-P66으로부터의 변이 β-글로빈 발현은 4E-BP1 발현 수준에 영향을 받지 않았다(도 3c).
형질감염된 세포들을 eIF4E-특이성 번역 저해체 4EGi-1로 처리한 동시 실험에서, gBglo-P66부터의 변이 β-글로빈 발현은 eIF4E-의존성 번역을 저해해도 영향을 받지 않았다는 것을 확인하였다(도 3D). 한편, MG132의 시간 과정적 처리는 변이 단백질 발현 수준을 점진적으로 증가시키는 결과를 낳았고, 이는 gBglo-P66로 형질감염된 HeLa 세포들을 악티노마이신 D으로 4시간 선 처리할 때 관찰되지 않았던 것으로(도 3e), PTC-함유 mRNA들의 연속적 유입이 gBglo-P66으로부터의 미량의 변이 β-글로빈 생성에 필요한 것임을 나타내고 있다.
gBglo -P66로부터 발현된 PTC-함유 mRNA의 폴리좀 연합은 NMD의 저해에 의해 유도된다
gBglo-P66로부터 발현된, 정상 상태의 잔류 PTC-함유 mRNA의 번역적 상태를 측정하기 위해, 벡터 gBglo-P66 및 gBglo-WT로 형질감염된 HeLa 세포를 용혈시키고, 수크로스 구배 밀도 원심분리로 분획화하였다. 분획액의 254 nm 흡광도를 측정하여 폴리좀을 함유하는 분획액을 동정한 후, RT-PCR 분석하였다. cBglo-P66 및 cBglo-WT으로 형질감염된 세포로부터 제조한 샘플을 NMD-무관련성 대조군으로 사용하였다. 본 실험에서, NMD이 siRNA-매개 UPF1 녹다운에 의해 저해될 때, gBglo-P66로부터 발현된 PTC-함유 mRNA와 폴리좀의 회합을 분석하였다.
상기 폴리좀 분석에 따르면, gBglo-WT 및 cBglo-WT mRNA들은 전통적인 수용성(competent) 대조군 mRNA인, GAPDH mRNA가 그런 것 같이, 폴리좀-연합 분획물로서 일차적으로 검출되었다(오른쪽 천이)는 것이 나타났다(도 4a 및 도 4b).
변이 β-글로빈 gBglo-P66 mRNA의 분배 패턴은 cBglo-P66 mRNA의 것에 비해 왼쪽으로 천이되었고, 이는 gBglo-P66으로부터 발현된, 항상 상태의 PTC-함유 mRNA들은 약한 폴리좀 연합을 나타내는 것을 가르킨다(도 4C 및 D).
한편, 폴리좀-연합된 gBglo-P66 mRNA(우측 천이)는 UPF1 녹다운에 의해 저해될 때, 관찰되었다. gBglo-P66 로부터 나온, 이러한 폴리좀-연합 mRNA들은 UPF1 녹다운 후에 나타나기 때문에, 이러한 mRNA들은 NMD에서 회피된 PTC-함유 mRNA들로 구성되는 것으로 보인다(도 4e 및 도 4f).
이러한 결과들은 NMD가 저해될 때 gBglo-P66으로부터 회피된 PTC-함유 mRNA들이 일단의 변이 단백질의 원천이 될 수 있음을 제시한다.
NMD가 저해될 때, 일단의 변이 단백질이 gBglo -P66로부터 생성된다.
폴리좀 분석 결과에 근거하여, 본 발명자들은 NMD가 저해될 때 gBglo-P66로부터 일단의 변이 단백질들이 생성되는 지를 결정하였다. 따라서, gBglo-WT 및 gBglo-P66로부터의 단백질 및 mRNA 발현 수준을 NMD 저해 하 또는 부재 하에서 측정하였다. 번역시 억제 효과를 배제하기 위해, 사이클로헥시마이드 및 에메틴과 같은 화학적 NMD 저해체들을 본 연구에서 사용하지 않았다. qPCR 분석에 따르면, gBglo-P66 mRNA 발현 수준은 NMD가 UPF1 녹다운에 의해 저해될 때 거의 두 배가 되었으나, gBglo-WT mRNA 발현은 근본적으로 변하지 않는다는 것을 확인하였다(도 5a).
이러한 결과에 근거하여, 증가된 발현 수준의 gBglo-P66 mRNA을 NMD-회피된 PTC-함유 mRNA로서 정의하였다. 동시에 실시한 단백질 수준의 웨스턴 분석은 어떠한 gBglo-WT 단백질의 유의미한 증가도 UPF1 하향 조절과 연계되지 않는다는 것을 나타냈다. 또한, gBglo-P101 및 gBglo-P127(NMD-무관련성) mRNA 및 단백질 수준들은 NMD 저해에 영향을 받지 않았다(도 12a 및 도 12b).
한편, UPF1 녹다운은, gBglo-P66 mRNA 발현 수준이 두 배가 될 때, MG132 존재 시, 변이 gBglo-P66 단백질 수준을 4 배 이상 증가시키도록 유도하였다(도 5b 및 5c). UPF1 녹다운에 의한 변이 단백질 증가에 eIF4E-의존성 번역이 관여하는 것을 증명하기 위해, UPF1 녹다운 하에서 또는 부재시 4E-BP1 또는 4EGi-1에 의한 eIF4E-의존성 번역 저해 후 변이 gBglo-P66 단백질 수준을 측정하였다. 웨스턴 분석에 따르면, MG132 존재 시 UPF1 하향조절로 관찰되는 변이 gBglo-P66 단백질의 증가된 수준은 4E-BP1 과발현 또는 4EGi-1 처리에 의해 억제된 것이 나타났다(도 5d). gBglo-P66 mRNA의 수준은 4E-BP1 또는 4EGi-1 처리의 공형질감염에 의해 영향을 받지 않았다(도 5e).
RNA 면역침전 검정을 위해서, gBglo-WT 또는 gBglo-P66를 포함한 HA-eIF4E 벡터를 UPF1 녹다운 하 또는 부재하에서 HeLa 세포로 형질감염시켰다. HA 항체를 사용하여 면역침전을 수행한 후, gBglo-WT 및 gBglo-P66로부터 얻은 eIF4E 결합 β-글로빈 mRNA들을 추가 분석을 위해 추출하였다. RT-PCR 및 qPCR 분석 둘 다는 gBglo-P66로부터 출처된 eIF4E 결합 PTC-함유 mRNA들은 유의하게 증가되었고(~3-배), 반면 gBglo-WT로부터 나온 eIF4E 결합 야생형 mRNA들은 거의 변하지 않은 것을 나타냈다(도 5F). 이러한 발견은 NMD로부터 회피된 PTC-함유 mRNA의 eIF4E-의존성 번역이 NMD 저해에 의한 변이 단백질의 향상된 생성에 관여하는 증거를 제공한다.
UPF1 또는 SMG1의 하향 조절은 일단의 변이 단백질들을 생성하는 데 필요로 한다.
UPF1를 타겟하는 siRNA를 사용하여 NMD를 저해하고, 변이 단백질의 수준을 유의하게 증가시킨다는 것을 발견하였다. 그러나 NMD에 관여하는 임의의 인자를 하향조절함으로써 NMD를 저해하는 것이 일단의 변이 단백질을 생성하는 것에 충분한 것인지는 불분명하였다. NMD 인자들 또는 EJC 성분들을 하향조절하면 일단의 gBglo-P66 단백질이 생성되는지를 결정하기 위해, 코어 NMD 인자들(UPF1, UPF2 및 SMG1) 및 코어 EJC 성분들(Y14, EIF4A3 및 MAGOH)을 녹다운 시키고(도 6a), gBglo-P66 mRNA 및 단백질의 수준을 gBglo-P66 및 각 인자에 대한 siRNA로 형질전환된 HeLa 세포에서 평가하였다.
gBglo-P66 mRNA 수준에서의 증가(~2배)가 UPF1, Y14, siEIF4A3, 및 SMG1가 하향조절 될 때 유사하게 관찰되었다. 어떠한 gBglo-P66 mRNA 수준의 유의적인 증가도 UPF2 및 MAGOH의 하향조절 후에는 관찰되지 않았다(도 6b). gBglo-P66으로부터 나온 변이 단백질의 수준은 UPF1 또는 SMG1의 녹다운시 유의하게 증가되었지만, 다른 인자에서는 관찰되지 않았다(도 6c). 더구나, UPF1과, UPF2, Y14, EIF4A3 또는 MAGOH을 동시에 하향조절하면 UPF1을 단일 녹다운 하는 것에 비해, 변이 단백질 수준에서 시너지성 증가로 이어지지 않았다(도 6d).
이러한 결과는 NMD 또는 EJC 인자들의 하향조절이 NMD를 공통적으로 저해하지만, UPF1 또는 SMG1의 하향조절은 NMD-회피된 PTC-함유 mRNA로부터 일단의 변이 단백질이 생성되는 것에 필요하다는 것을 암시한다.
논의
NMD-무관련성 PTC-함유 mRNA들이 신생 펩타이드를 함유하는 절단된 변이 단백질의 강력한 원천이라는 것은 이미 알려져 있으나, NMD-무관련성 PTC들을 가진 mRNA들은 모든 PTC-함유 mRNAs들의 작은 부분만을 대표할 뿐이다.
또한, NMD는 저산소증, 혈청 기아, 열충격, 및 NMD 인자들의 조절과 같은 다양한 외부 또는 내부 조건에 의해 동적으로 조절되며, 이는 NMD 기질에 속하는 PTC-함유 mRNA들이 분해되지 않고 NMD를 회피한다는 것을 암시하고 있다.
여기서, 본 발명자들은 변이 단백질들이 NMD 상태에 의존하여, PTC-함유 mRNA들로부터 생성되는 것인지에 대하여 및 변이 단백질들의 생성이 질적 및 양적으로 어떻게 조절되는 지에 대하여 설명하였다.
β-글로빈 발현 벡터들을 사용하여, gBglo-P39 및 gBglo-P66로부터 발현된 잔류 PTC-함유 mRNA들이 항상 상태에서 야생형 gBglo-WT mRNA들과 동일하게 안정하다는 것을 확인하였고, 형질감염된 gBglo-P66 플라스미드의 양이 증가할수록 잔류 PTC-함유 gBglo-P66 mRNA가 점진적으로 축적된다는 것을 확인하였다.
이러한 결과에 근거하여, 본 발명자들은 NMD는 특정 조건하에서 PTC-함유 mRNA를 제거하는 데 제한된 능력만을 가지며, NMD에 민감하지 않은 PTC-함유 mRNA들은 이전에 제시된 NMD-내성적 PTC-함유 mRNA로서 검출된다는 것을 확인하였다.
이들의 안정한 발현에도 불구하고, gBglo-P66로부터 발현된 잔류 PTC-함유 mRNA들은 폴리좀과 연합하지 않고, 이들의 축적은 변이 단백질의 생성에 영향을 거의 끼치지 않으며, 이는 이들 mRNA들이 변이 단백질을 생성하는 데 연속적인 원천이 아니라는 것을 의미한다.
이러한 발견은 또한 NMD 타겟들이 모노좀과 우세하게 연합한다는 것을 나타내는 최근의 연구와 일치한다. 비록 상기 잔류 PTC-함유 mRNA들과 폴리좀과의 연합이 약하다 하더라도, 일부 PTC-함유 mRNA들과의 부분적 연합은 관찰되었다. 또한, 어떠한 단백질도 이러한 mRNA들로부터 변함없이 생성되지 않았다.
이러한 발견에 근거하여, 리보좀은 이러한 mRNA 상에서 정지되어 있다는 가정을 할 수 있다. 오직 미량의 변이 gBglo-P66 단백질만이 프로테아좀 저해 후에 검출되었고, 본 발명자들은 이러한 변이 단백질들이 번역의 개시 회차에서 일차적으로 발원되었다는 증거를 제시한다.
그러나, 이러한 mRNA들은 이들에 결합된 mRNP 조성을 동정하기 위해 더 특성화되어야 하며, 이는 이들이 어떻게 NMD를 회피하는 지를 이해하는 데 도움을 준다. UPF1 또는 SMG1의 녹다운에 의하지만 Y14 또는 EIF4A3에는 되지 않는 NMD의 저해가 PTC-함유 mRNA 및 절단된 변이 단백질 둘 다를 유의하게 증가시키는 결과를 나타내는 것을 증명한다. 일반적으로, UPF1는 eRF1, eRF3, 및 SMG1과 상호작용하여 SURF 복합체를 만들고, 이는 후속적으로 EJC 복합체, 및 SMG5, SMG6, 및 SMG7를 위시한 mRNA 붕괴 인자와 결합하여 mRNA를 분해한다고 알려져 있다.
UPF1의 통상적인 역할에 더하여, 이것이 번역 억제에 관여한다는 것을 또한 조사하였다. SMG1에 의해 인산화된 UPF1은 eIF3과 상호작용하고, 이는 40S/Met-tRNAi Met/mRNA이 eIF3-의존적으로 번역 수용성 80S/Met-tRNAi Met/mRNA 개시 복합체로 전환되는 것을 저해함으로써 연속된 번역 개시를 억제하여 PTC-함유 mRNA의 번역을 억제하는 것이 보고되었다.
이러한 보고에 기반하여, UPF1는 EJC 녹다운에 의해 매개된 NMD 저해 후에도, PTC-함유 mRNA의 번역에서 억제성 역할을 할 것으로 예상되며, UPF1의 하향 조절은 변이 단백질들의 일단의 생성에 요구된다. 그러나 항상 상태에서 안정적으로 잔류하는 PTC-함유 mRNA들이 UPF1이 저해될 때, 일단의 변이 단백질에 또한 기여할 것인가는 불분명하며, 및 더 조사되어야 한다.
과거 수십 년간, 대장, 유방, 뇌 및 췌장 종양과 같은 다양한 암에서의 변이에 대하여 많은 연구가 있었다. 평균 33 내지 66 개 유전자들이 다양한 암에서 체세포 변이를 나타내는 것으로 보고되었다. 암에서의 그러한 변이 중에서, 어떤 것들은 PTC-함유 mRNA들의 생성으로 이어지는 절단 변이(넌센스 또는 프레임 천이 변이)들이다.
상기 결과에 따르면, 미량의 변이 단백질이 PTC-함유 mRNA의 번역의 개시 회차에 항상 발생되고, 및 많은 양의 변이 단백질들이 NMD의 저해에 의해 발생될 수 있다. 다음, 상기 절단된 변이 단백질들은 궁극적으로 프로테아좀 시스템에 의해 분해된다(도 7).
이러한 발견들은 신생 항체를 가진 변이 단백질의 발생과 프로테오좀성 분해에 근거한 최근의 면역요법적 접근 방식에 대한 이론적 근거를 제공한다. 더구나, Pastor 등은 오발부민 펩타이드를 또한 암호화하는 β-글로빈 벡터로부터 나온 변이 단백질을 발현하는 종양은, NMD가 저해될 때, CD8+ T 세포에 의해 효과적으로 제거된다는 것을 밝혔다.
종양 치료를 위해 면역 체계를 자극하는 것은 새로운 개념이 아니다. 많은 연구에 의해, 종양 조직 주위에 밀집된 면역 침투가 있다는 것을 발견하였고, 이제, 활성화된 T 세포에 의해 특이적 타겟으로서 사용될 수 있는 재귀성 신생 항원을 동정하는 것이 중요하다.
따라서, 본 발명자들은, PTC-함유 mRNA들이 변이 단백질들의 신규한 원천이고, UPF1을 위시한 적절한 인자들을 조작함으로써 변이 단백질의 생성을 유도하는 것이 다양한 암의 진단과 치료에 도움이 될 것이라고 제시한다.
추가의 연구에서, 정상 상태에서 안정하게 잔류하는 PTC-함유 mRNA들의 번역상 불수용성의 근거에 있는 기작 및 일단의 변이 단백질의 생성에서의 UPF1의 역할에 대하여 심도 있게 설명할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for immunotherapy comprising an UPF1 inhibitor as an active ingredient <130> PN150629P <150> KR 10-2015-0185081 <151> 2015-12-23 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV10 3XFLAG-beta-globin_F <400> 1 agcaacctca aacagacacc 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV10 3XFLAG-beta-globin_R <400> 2 gacctcccac attccctt 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV10 3XFLAG-beta-globin_F <400> 3 tgcaacctca aacagacacc a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV10 3XFLAG-beta-globin_R <400> 4 gcaagaaagc gagcttagtg a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV-HA-4E-BP1_F <400> 5 gtgcagcgca caggagac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCMV-HA-4E-BP1_R <400> 6 ctccacacga tggctggt 18 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siUPF1 <400> 7 gaugcaguuc cgcuccauu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siEIF4A3 <400> 8 gaggaaucaa gcagaucau 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siY14 <400> 9 cgcucuguug aaggcugga 19 <210> 10 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSMG1 <400> 10 gacctcccac attccctt 18

Claims (11)

  1. UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드를 포함하는 NMD(Nonsense-mediated mRNA Decay) 저해제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)인 것인, NMD 저해제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, NMD 저해제.
  4. UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하여 NMD를 저해하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 UPF1 단백질의 발현의 억제는 UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현을 억제하는 뉴클레오타이드에 의해 억제되는 것인, NMD를 저해하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)인 것인, NMD를 저해하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, NMD를 저해하는 방법.
  8. UPF1(Regulator of nonsense transcripts 1) 단백질의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 억제제는 UPF1 단백질을 코딩하는 mRNA와 상보적으로 결합하는 뉴클레오타이드인 것인, 면역치료용 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 작은 간섭 이중-나선 RNA(small interfering double-stranded RNA, siRNA)인 것인, 면역치료용 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드는 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 것인, 면역치료용 약제학적 조성물.
KR1020160178366A 2015-12-23 2016-12-23 Upf1 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물 KR20170076606A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102378381B1 (ko) * 2021-08-23 2022-03-24 라이보텍(주) 넌센스-매개 mRNA 분해를 억제하기 위한 화합물
WO2022177267A1 (ko) * 2021-02-16 2022-08-25 라이보텍(주) 넌센스-매개 mrna 분해를 억제하기 위한 화합물
KR20230068278A (ko) 2021-11-08 2023-05-17 한양대학교 산학협력단 Upf1 단백질 또는 upf1 단백질 유래 폴리펩티드의 암의 예방 또는 치료 용도

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