JP2020500518A - ダイナミン2関連疾患のためのアレル特異的サイレンシング療法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ダイナミン2のヘテロ接合型突然変異及び/又は過剰発現によって引き起こされる疾患を処置するための、ヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNAに関する。
ダイナミン2は、ラージGTPaseのスーパーファミリーに属する、遍在的に発現するタンパク質である。ダイナミン2(DNM2)は、生体膜を変形させる機械化学的足場分子として作用し、その結果、新生小胞が放出される。原形質膜において、DNM2は、クラスリン依存性及びクラスリン非依存性のエンドサイトーシスに関与している。このタンパク質は、エンドソームからの小胞の形成及びトランスゴルジネットワークにも関与している。幾つかの研究によって、アクチン及び微小管の細胞骨格の制御因子としてのダイナミン2の役割が明らかになっている。
一態様では、本発明は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA(AS-siRNA)を提供する。具体的な実施態様では、本発明のAS-siRNAは、19〜23、好ましくは19塩基対長である。
発明の詳細な説明
本開示は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現を効率的にサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA(AS-siRNA)であって、DNM2関連疾患を処置するために使用されるAS-siRNAの予想外の発見に基づく。
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子
本発明の一実施態様では、DNM2遺伝子は、疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である。したがって、DNM2遺伝子は、2つのアレルに対応する2つの異なる形態で存在する:一方のDNM2アレルは「野生型アレル」であるのに対して、他方は「突然変異体アレル」である。この実施態様では、本発明のAS-siRNAは、野生型アレルを標的とすることなく、該疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを特異的に標的とし、そして、サイレンシングする。したがって、AS-siRNAは、野生型アレルに由来するmRNA及びタンパク質の発現に影響を与えることなく、突然変異体アレルに由来するダイナミン2mRNA及びダイナミン2タンパク質の発現をサイレンシングすることができる。
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の突然変異体アレルに由来する遺伝子転写物(メッセンジャーRNA又はmRNA)に特異的にハイブリダイズすることによって、DNM2遺伝子の該突然変異体アレルをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該突然変異体アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約100%に等しい。
非病理学的多型を含むDNM2遺伝子
本発明の別の態様は、細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるAs-siRNAに関し、該DNM2遺伝子は、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である。
本発明のAS-siRNAは、DNM2遺伝子の該アレルに由来する遺伝子転写物(メッセンジャーRNA又はmRNA)に特異的にハイブリダイズすることによって、ヘテロ接合型の非病理学的多型を含むDNM2遺伝子の一方のアレルのみをサイレンシングすることができる。したがって、本発明のAS-siRNAは、DNM2の該アレルに由来するmRNAに対して相補的であり、そして、塩基対合によって該mRNAに結合する。用語「相補的」とは、別のポリヌクレオチド分子と塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指す。塩基対は、典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。好ましくは、本発明に係るAS-siRNAと標的mRNAとの間の相補性の程度は、約100%に等しい。
本発明は、本発明のAS-siRNAを標的mRNAに到達させる様々な方法を企図する。AS-siRNAは、直接、又はトランスフェクション試薬、例えば、脂質誘導体、リポソーム、リン酸カルシウム、ナノ粒子、マイクロインジェクション、若しくはエレクトロポレーションを用いて、単離オリゴヌクレオチドとして細胞に投与され得る。
疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子のアレルを標的とするAS-siRNA
材料及び方法
細胞培養
13.5日齢胚からマウス胎仔線維芽細胞(MEF)を調製した。ペニシリン、ストレプトマイシン、L−グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した10% ウシ胎仔血清(FCS)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中において、細胞を37℃(5% CO2)で培養した。初代培養物、すなわち、胚解剖後2〜3回継代したMEFに対して実験を実施した。健常対照被験体(C1及びC2)に由来する、及びp.R465W突然変異を有するDNM2に連鎖しているCNM患者1人に由来するヒト皮膚線維芽細胞を、同じ培地を用いて培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、70%コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル(Polyplus Transfection, France)に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA(Eurogentec, Belgium)を対照として用いた。RNA及びタンパク質の抽出並びに免疫組織化学のために、48時間後に細胞を収集した。
製造業者のプロトコルに従って、それぞれ細胞及び筋肉についてRNA easy又はRNA easy Fibrous tissue mini kits(Qiagen, France)を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞又は組織切片を22Gシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit(Life Technologies)を用いて、全RNA(1μg)を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた:96℃で5分間;96℃で30秒間、適切な温度(58〜62℃)で30秒間、72℃で30秒間〜1分間のサイクル;及び72℃で7分間の最終工程。Gapdhを増幅させるために23サイクル、Dnm2の半定量的分析については28サイクル、ヒト及びマウスのDnm2アンプリコンの制限酵素切断については30サイクル、そして、遺伝子型判定及び他のPCRについては30サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す:
1% プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich, France)を添加した50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1% NP40を含有する溶解バッファ中で、細胞ペレット及び凍結前脛骨筋(TA)をホモジナイズした。更に、Fastprep Lysing Matrix D及びFastprep apparatus(MP Biomedical, France)を用いて、前脛骨筋を溶解バッファ中で機械的にホモジナイズした。遠心分離(14,000g、4℃、15分間)後、BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific Pierce, France)を用いて上清中のタンパク質濃度を決定した。タンパク質 20μgをローディングバッファ(50mM Tris-HCl、2% SDS、10% グリセロール、1% β−メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー)と混合し、そして、90℃で5分間変性した。タンパク質サンプルを10% SDS-PAGEで分離し、そして、100mA、4℃で一晩、PVDFメンブレン(孔径0.45μm、Life Technologies)に転写した。5% 脱脂粉乳及び0.1% Tween20を含有するPBS中において、室温で1時間メンブレンをブロッキングし、次いで、4℃で一晩、0.1% PBS-Tween20、1% ミルク中の以下の一次抗体:ウサギポリクローナル抗ダイナミン2(Abcam ab3457, United Kingdom)及びウサギポリクローナル抗GAPDH(Santa Cruz, France)に曝露した。0.1% PBS-Tween20でメンブレンをすすぎ、そして、0.1% PBS-Tween20中二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗体(Jackson ImmunoResearch, United Kingdom製の抗ウサギ)と共に1時間インキュベートした。G-Box(Ozyme, France)内でECL detection Kit(Merck-Millipore, Germany)を用いて化学発光を検出し、そして、ImageJソフトウェアを用いて関連するシグナルの定量を実施した。
pSMD2-Dnm2-PTMプラスミド、AAV生成に必須のアデノウイルス配列をコードしているpXX6プラスミド、及びAAV1カプシドをコードしているpRepCApプラスミドを用いて、293細胞にトランスフェクトすることによって、AAV2/1偽型ベクターを調製した。イオジキサノール勾配においてベクター粒子を精製し、そして、Amicon Ultra-15 100Kカラム(Merck-Millipore)で濃縮した。定量PCRによって粒子価(ウイルスゲノム(vg)数/mL)を決定した。イソフルラン麻酔下で1月齢の野生型及びヘテロ接合型のKI-Dnm2R465Wマウスに注射した。1011vg/筋肉で29Gニードルを用いて2つのTAにおいて、AAV-sh9、AAV-sh10、又はAAV-nosh(ウイルスゲノム中にshRNA配列を有しない陰性対照)の筋肉内注射を2回行った(30μL/TA、24時間間隔)。動物実験は、実験動物の使用に関する仏国の法律及び規制に従い、そして、外部の倫理委員会によって承認された(French Ministry of Higher Education and Scientific Researchによる承認番号00351.02)。
60mg/kg ペントバルビタールで麻酔したマウスにおいてTA筋の等尺性収縮特性をインサイツで試験した。TA筋の遠位腱をサーボモータシステム(305B Dual-Mode Lever, Aurora Scientific)のレバーアームに取り付けた。持続時間0.1msの最大上(10V)方形波パルスを用いて、双極銀電極によって坐骨神経を刺激した。電気刺激に応答した等尺性収縮中に絶対最大等尺性力(P0)を測定した(周波数25〜150Hz;連発刺激500ms)。P0が得られた最適筋長(L0)において全ての等尺性収縮測定を行った。TA筋を計量し、そして、P0を筋肉重量で除することによって特定力(sP0)を計算した。
イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼によってマウスを屠殺した。TA筋を液体窒素で冷却したイソペンタンで冷凍した。TA筋の横断切片(厚さ8μm)をヘマトキシリン及びエオシン(HE)で染色し、そして、標準的な方法によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−テトラゾリウムレダクターゼ(NADH-TR)で還元した。正立顕微鏡(DMR, Leica)を用いて光学顕微鏡観察を実施し、そして、白黒カメラ(DS-Ri1, Nikon)及びNIS-Elements BRソフトウェア(Nikon, France)を用いて画像取込した。全ての撮像について、比較したサンプル間の曝露設定は同一であり、そして、室温で観察した。ImageJソフトウェアを用いてフェレット径を測定することによって、ラミニンで免疫細胞化学的に標識されたTA筋切片における線維サイズ分布を求めた。
細胞及びTA凍結切片(厚さ8μm)を4% パラホルムアルデヒドで固定した(室温で15分間)。PBSで洗浄した後、細胞及び凍結切片を室温で10分間PBS中0.5% Triton X-100で透過処理し、そして、30分間0.1% PBS-Triton X-100、5% BSA、及び5% ロバ血清でブロッキングした。サンプルを、0.1% Triton X-100及び1% BSAを含むPBS中において4℃で一晩、一次抗体:ウサギ抗C末端ダイナミン2(Abcam ab3457)又はウサギ抗ラミニン(Abcam ab11575)と共にインキュベートした。0.1% PBS-Triton X-100で洗浄した後、サンプルを、室温で60分間、ロバ抗ウサギAlexa 488二次抗体(Life Technologies, France)と共にインキュベートした。VECTASHIELD封入剤(Vector Laboratories, United Kingdom)を用いてスライドグラスを封入した。axiophot顕微鏡(Zeiss)又は共焦点顕微鏡(Olympus FV-1000)のいずれかを用いて画像を取得した。
siRNAをトランスフェクトした48時間後の健常対照細胞株2つ(C1及びC2)及びp.R465W突然変異を発現している患者由来の細胞株1つを用いた。37℃で45分間、FCSを含まないDMEM中で細胞を培養した。Transferrin-AlexaFluor488(Life Technologies, France)を40μg/mLで添加し、そして、細胞を37℃で15分間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、そして、室温で15分間4% パラホルムアルデヒドで固定した。共焦点Leica SP2顕微鏡を用いて細胞画像のスタック(0.5μm間隔)を得た。ImageJソフトウェアを用いてスタック投影において蛍光陽性表面を定量し、そして、全細胞表面に対して正規化した。
ヘテロ接合型細胞におけるアレル特異的siRNAの同定
p.R465W DNM2突然変異を用いてKI-Dnm2R465Wマウスモデルを構築した。マウスでは、このミスセンス突然変異は、エキソン11における単一点突然変異A>Tに対応している。ヘテロ接合型(HTZ)KI-Dnm2マウスから培養したマウス胎仔線維芽細胞(MEF)において、WTのDnm2アレルに影響を与えることなく突然変異型Dnm2アレルをサイレンシングするアレル特異的siRNAのスクリーニングを実施した。アンプリコンの制限酵素切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は19の可能性があるsiRNAの中で12のsiRNAのアレル特異性について評価した(図1A)。図1AにsiRNAセンス鎖を表す。標的突然変異体mRNAに対して相補性によって結合するのは他のsiRNA鎖(アンチセンス鎖)である。低濃度(20nM)では、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型の両方のアレルの発現が同様であることと一致して、1に等しい突然変異体/WT比を示す(図1B)。12の評価したsiRNAの中でも、6つのsiRNA(si9、si10、si11、si12、si15、si16)は、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた対照細胞と比べて有意に低下した突然変異体/WT比によって証明される通り、アレル特異的サイレンシング特性を示す(図1B)。これら6つのsiRNA内において、ミスマッチの位置は、それぞれ、AS-siRNAのセンス鎖の5’末端からN9、N10、N11、N12、N15、又はN16位に位置する。
HTZ KI-Dnm2マウス由来のTA筋における筋肉の表現型は、2月齢で完全に確立され、そして、収縮特性の欠陥、線維サイズの減少による筋萎縮、及び酸化的染色における形態学的異常を含む。インビボ評価のために、si9及びsi10に対応するshRNAを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、並びにshRNA配列を有しない対照AAV(AAV-nosh)を構築した。1月齢のHTZ KI-Dnm2マウスのTA筋にAAVを筋肉内注射し、そして、3ヶ月後に筋肉の表現型を調べた。WT TAと比べて、noshを注射したHTZ筋肉では、質量が約30%、絶対力が40%、そして、特定力が15%の有意な減少が存在する(図4)。sh9の発現によって、絶対力及び特定力がWT値まで完全に回復した。また、sh9注射マウスでは、筋肉量はnoSh筋肉と比べて大きく増加する(+30%)が、WT筋肉の質量よりもわずかに低くとどまっている(−10%)。また、絶対力及び特定力、並びに筋肉量が増大することにより、sh10の発現によって有意な回復が達成される。(図4)。
si9及びsi10のDnm2標的配列は、マウス配列とヒト配列との間で79%の同一性を示す(19bpのうちの15)。p.R465W突然変異を発現している患者由来の線維芽細胞株1つにおいてインビボ評価するためにヒト特異的si9及びsi10を生成した。50nMで48時間si9をトランスフェクトした細胞においてDnm2のmRNA含量は約50%減少する(図6A)。アンプリコンのシークエンシングによって、WT及び突然変異型のDNM2のミックスを依然として発現しているスクランブル−及びsi10がトランスフェクトされた細胞と比べて、si9がトランスフェクトされた線維芽細胞において突然変異型mRNAが消失したことが確認される(図6B)。本発明者等はアンプリコンのPfoI切断後にWT及び突然変異型のアレルを識別するために開発された半定量的RT-PCRアッセイを用いた。このアッセイを使用したところ、非トランスフェクト細胞及びスクランブルがトランスフェクトされた細胞については突然変異体/WT比が1に等しく、そして、si10では0.8に、そして、si9では0.2に有意に減少する(図6C)。48時間にわたってsi9及びsi10の両方をトランスフェクトした結果、ウエスタンブロットによって証明された通り、DNM2タンパク質含量が減少した(図6D)。si9がヒト細胞においてアレル特異的siRNAの予測される特性を全て示したことに鑑みて、その結果、より高用量(100nM)でsi9について更に調べた。この用量では、DNM2転写物の発現は依然として約50%減少し(図7A)、そして、明らかな細胞毒性なく(図7C)、突然変異型DNM2 mRNAに対するアレル特異性は維持される(図7B)。si9(センス鎖及びアンチセンス鎖)についての潜在的オフターゲットを同定するために使用したBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)は、13の連続ヌクレオチドにおける完全同一性に対応する68%の同一性を有する最も近縁な配列としてSLC9A8を示した。本発明者等は100mM siRNAをトランスフェクトした48時間後にRT-PCRによって、SLC9A8のmRNAのサイレンシングがsi9によって誘導される可能性について調べた。スクランブルsiRNAと比べて、si9はSLC9A8転写物の発現に影響を与えない(データ不図示)。
RNAiによるアレル特異的サイレンシングは、単一ヌクレオチドのみが異なる場合であっても2つの配列を識別することができる、siRNAによって媒介されるRNA干渉プロセスの顕著な特異性から益を得る。この特性によって、AD-CNMに罹患している患者で同定された24のDNM2突然変異の大部分を表す単一ヌクレオチド置換をもたらす優性突然変異、特にそのうち最も高頻度のもの(患者の30%)、すなわち、p.R465W突然変異をアレル特異的RNAiが標的とすることができるようになった。上記結果は、救済動物モデルを通して、そして、患者由来の細胞において、DNM2に関連するCNMの治療ストラテジーとしてのp.R465W突然変異に対するアレル特異的RNAiの効率を証明した。
材料及び方法
細胞培養
ペニシリン、ストレプトマイシン、L−グルタミン酸、及びピルビン酸ナトリウムを添加した10% ウシ胎仔血清(FCS)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中において、p.R465W突然変異を有する1人のDNM2連鎖性CNM患者由来のヒト皮膚線維芽細胞を37℃(5% CO2)で培養した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を発現するレンチウイルスを形質導入した後、不死化細胞集団に対して実験を実施した。トランスフェクションについては、70%コンフルエントになるまで細胞を成長させ、そして、製造業者のプロトコル(Polyplus Transfection, France)に従ってJetPrimeトランスフェクション試薬を用いてsiRNAをトランスフェクトした。各実験におけるsiRNAの濃度を図のレジェンドに示す。スクランブルsiRNA(Eurogentec, Belgium)を対照として用いた。RNA及び抽出及びRT-PCR分析のために、48時間後に細胞を収集した。
製造業者のプロトコルに従ってRNA easyキット(Qiagen, France)を用いて全RNAを単離した。溶解バッファ中で破壊するために、細胞を22Gシリンジに数回通した。六量体プライマーを用い、Superscript III reverse transcriptase kit(Life Technologies)を用いて、全RNA(1μg)を逆転写に供した。以下の条件下でPCRによってcDNAを増幅させた:96℃で5分間;96℃で30秒間、適切な温度(58〜62℃)で30秒間、72℃で30秒間〜1分間のサイクル;及び72℃で7分間の最終工程。HPRTを増幅させるために27サイクル、DNM2の半定量的分析については27サイクル、DNM2アンプリコンの制限酵素切断については30サイクルを実施した。使用した全てのプライマーの配列を以下の表に示す:
ヘテロ接合型非病理学的多型を標的とすることによるアレル特異的siRNAの同定
患者由来の細胞はp.R465W DNM2突然変異を有し、そして、DNM2タンパク質配列における713位のアミノ酸をコードしているコドンの1つの塩基に対応する単一ヌクレオチド多型(SNP)rs2229920(C及びT)についてヘテロ接合型である。DNM2 mRNAをシークエンシングすることによって、本発明者等は、その突然変異が多型のCバージョンとインフレームであることを示した。HTZ SNPの存在によって、SNPの2つの可能性のあるバージョン(C及びT)に対して効率的なAS-siRNAをスクリーニングすることができた。Cに対する2つのsiRNA(それぞれ16又は17位におけるミスマッチ、すなわち、si16-713C及びsi17-713Cを含む)及びTに対する1つのsiRNA(si17-713Tと呼ばれる17位におけるミスマッチを含む)を評価した。RT-PCR分析前に48時間、30nM siRNAを細胞にトランスフェクトした。3つの試験したsiRNAは、スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞又は非トランスフェクト細胞と比べたとき、DNM2転写物の発現を減少させるのに効率的である(図9A)。ハウスキーピング遺伝子として使用したHPRT mRNAに対するDNM2転写物の定量(図9B)は、17位におけるミスマッチが16位と比べてより効率的であることを示す。アンプリコンの制限酵素切断後にアレルC及びアレルTを識別するために開発されたRT-PCRアッセイを用いて、本発明者等は30nMにおけるこれら3つのsiRNAのアレル特異性を48時間にわたって評価した。スクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞及び非トランスフェクト細胞は、WT及び突然変異型のアレル両方の発現が同様であることと一致して、1に等しいC(突然変異体)/T(WT)比を示す(図10)。Cに対するsiRNAを使用したときは該比が減少するが、Tに対するsiRNAを使用したときは増加する(図10Bの左パネル)。HPRT発現に対してTヌクレオチドを有するmRNAレベルを定量することによって、これら3つのsiRNAのアレル特異性を確認したsi17-713Tを用いたときのみ減少を示す(図10Bの右パネル)。
siRNAの効率を増大させる目的で、5’又は3’にヌクレオチドを付加することによってsi17-713Cの長さを改変した(図11A)。50nMで48時間トランスフェクトしたとき、3つの改変されたsiRNA全てが、スクランブルsiRNAと比べてDNM2転写物の発現を減少させることができる(図11C)が、その中でもsi713C-17/21は効率が低いと思われる(それでも約30%は減少するので依然として関心対象である)。RT-PCR、その後BglI切断を用いてアレル特異性を評価した。非トランスフェクト細胞及びスクランブルsiRNAがトランスフェクトされた細胞において、計算されたアレルC/アレルT比は、両アレルの発現レベルが同様であることと一致して約1である。予想の通り、Cに対する改変AS-siRNAの全てを50nMで48時間トランスフェクトした結果、アレルC/アレルT比が減少する。
幾つかの原因突然変異が同定されている優性疾患の場合、RNAiストラテジーによる2つのアレル特異的サイレンシングを開発することができる。第1のストラテジーは、AD-CNMを引き起こすp.R465W DNM2突然変異について開発されたので、各同定された突然変異に対するAS-siRNAを開発することによって個別療法に対応する。第2のストラテジーは、該疾患に関連する非病理学的変異体に対するAS-siRNAを開発することである。ここで、本発明者等はDNM2転写物のコード領域に存在する一般的な非病理学的単一ヌクレオチド多型(SNP)を標的とすることによって、DNM2連鎖性CNMについてこの汎突然変異ストラテジーを開発できることを示す。このSNPが高頻度でヘテロ接合型状態(一方のアレルはC、そして他方はT)でみられることに鑑みて、SNPに対するAS-siRNAは、突然変異とインフレームのSNPのバージョンに対するAS-siRNAを用いることによって、突然変異型転写物全てをサイレンシングすることができる。
Claims (18)
- 細胞内のヘテロ接合型DNM2遺伝子の一方のアレルのみの発現をサイレンシングすることができるアレル特異的siRNA(AS-siRNA)。
- 19〜23、好ましくは19塩基対長である、請求項1記載のAS-siRNA。
- DNM2遺伝子が、非病理学的多型の存在についてヘテロ接合型である及び/又は疾患を引き起こす突然変異の存在についてヘテロ接合型である、請求項1又は2記載のAS-siRNA。
- 非病理学的多型を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする、請求項3記載のAS-siRNA。
- 非病理学的多型が、疾患を引き起こす突然変異と同じアレルに存在する、請求項4記載のAS-siRNA。
- 非病理学的多型が、rs2229920(C又はT)又はrs12461992(A又はT)、好ましくはrs2229920(C又はT)である、請求項3〜5のいずれか一項記載のAS-siRNA。
- 19塩基対長及びcであり、そして、ミスマッチの位置が、AS-siRNAのセンス鎖の5’末端からN16又はN17位、好ましくはN17位に位置する、請求項6記載のAS-siRNA。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4、好ましくは、配列番号1又は配列番号2からなる群から選択されるセンス鎖を含む、請求項6〜7のいずれか一項記載のAS-siRNA。
- 疾患を引き起こす突然変異を含むDNM2遺伝子転写物の領域を標的とする、請求項3記載のAS-siRNA。
- 疾患を引き起こす突然変異が、1393C>T;c.1105C>T、c.1106G>A、c.1856C>T、又はc.1948G>A、好ましくは1393C>Tである、請求項8記載のAS-siRNA。
- 19塩基対長であり、そして、ミスマッチの位置が、AS-siRNAのセンス鎖の5’末端からN9、N10、N11、N12、N15、又はN16位、好ましくはN9又はN10位、そして、より好ましくはN9位に位置する、請求項10記載のAS-siRNA。
- 配列番号5〜配列番号10、好ましくは、配列番号5又は配列番号6、そして、より好ましくは配列番号5からなる群から選択されるセンス鎖を含む、請求項9〜11のいずれか記載のAS-siRNA。
- DNM2 mRNA及び/又はDNM2タンパク質の発現を20〜60%、好ましくは約50%低減することができる、請求項1〜12のいずれか一項記載のAS-siRNA。
- 請求項1〜13のいずれか一項記載のAS-siRNAをコードしているベクターであって、好ましくは、プラスミド又はウイルスのベクター、例えば、AAVベクターであるベクター。
- 請求項14記載のベクターがトランスフェクト又は形質導入されている標的細胞。
- 標的細胞内のDNM2遺伝子の野生型アレルの発現をサイレンシングすることなく、前記DNM2遺伝子の突然変異型アレルの発現をサイレンシングするインビトロ法であって、前記標的細胞に請求項1〜13のいずれか一項記載のAS-siRNA又は請求項14記載のベクターを導入することを含む方法。
- ダイナミン2の過剰発現に関連する疾患を処置する、好ましくは、X連鎖性筋細管ミオパシー又は癌、例えば、前立腺癌及び膵臓癌を処置する方法において使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のAS-siRNA又は請求項14記載のベクター又は請求項15記載の細胞。
- DNM2遺伝子における疾患を引き起こす突然変異によって誘導される疾患を処置する、好ましくは、常染色体優性中心核ミオパシー、T細胞性急性リンパ芽球性白血病、シャルコー・マリー・ツース病、又は遺伝性痙性対麻痺を処置する、そして、より好ましくは、常染色体優性中心核ミオパシーを処置する方法において使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のAS-siRNA又は請求項14記載のベクター又は請求項15記載の細胞。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006288321A (ja) * | 2005-04-13 | 2006-10-26 | Japan Health Science Foundation | 変異対立遺伝子に対する特異的なRNAiの評価方法 |
JP2009509548A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ユニバーシティー オブ マサチューセッツ | 対立遺伝子特異的rna干渉 |
WO2012043633A1 (ja) * | 2010-09-30 | 2012-04-05 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター | 優性変異遺伝子発現抑制剤 |
WO2015055859A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Universite De Strasbourg | Dynamin 2 inhibitor for the treatment of centronuclear myopathies |
Family Cites Families (6)
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---|---|---|---|---|
US20050255086A1 (en) * | 2002-08-05 | 2005-11-17 | Davidson Beverly L | Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene |
US20040214198A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-10-28 | University Of Massachusetts | Allele-targeted RNA interference |
WO2004070062A2 (en) * | 2003-02-04 | 2004-08-19 | Wyeth | Compositions and methods for diagnosing and treating cancers |
US20090036395A1 (en) * | 2007-04-26 | 2009-02-05 | Davidson Beverly L | Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof |
EP3085785A1 (en) * | 2015-04-22 | 2016-10-26 | Université de Strasbourg | Dynamin 2 inhibitor for the treatment of duchenne's muscular dystrophy |
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Patent Citations (4)
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---|---|---|---|---|
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JP2009509548A (ja) * | 2005-09-30 | 2009-03-12 | ユニバーシティー オブ マサチューセッツ | 対立遺伝子特異的rna干渉 |
WO2012043633A1 (ja) * | 2010-09-30 | 2012-04-05 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター | 優性変異遺伝子発現抑制剤 |
WO2015055859A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | Universite De Strasbourg | Dynamin 2 inhibitor for the treatment of centronuclear myopathies |
Non-Patent Citations (2)
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BRAIN, 2012, VOL.135,PP.1395-1411, JPN6021037182, ISSN: 0004753442 * |
NATURE GENETICS, vol. VOL:37, NR:11, JPN5020001365, 16 October 2005 (2005-10-16), US, pages 1207 - 1209, ISSN: 0004753441 * |
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