KR102378381B1 - 넌센스-매개 mRNA 분해를 억제하기 위한 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 넌센스-매개 mRNA 분해(nonsense-mediated mRNA decay, 이하 "NMD"라 함)를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명은 NMD를 억제하는 화합물을 통해 NMD 관련 질병을 예방 또는 치료하고자 한다.

Description

넌센스-매개 mRNA 분해를 억제하기 위한 화합물{A COMPOUND FOR INHIBITION OF NONSENSE-MEDIATED MRNA DECAY}

본 발명은 넌센스-매개 mRNA 분해(nonsense-mediated mRNA decay, 이하 "NMD"라 함)를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명은 NMD를 억제하는 화합물을 통해 NMD 관련 질병을 치료 또는 예방하고자 한다.

인간의 모든 유전자는 적당한 시간과 위치 그리고 적당한 양을 발현함으로써 최종적인 고유의 기능을 수행하게 되며, 만약 유전자의 적당한 발현 조절 과정에서 문제가 생겼을 경우, 비정상적으로 발현된 유전자는 정상적인 세포의 기능을 방해하고 그 결과 수많은 암 및 유전병을 일으키게 된다.

지금까지 알려진 유전병의 약 30%가 비정상적인 과정에 의해 생성된 잘못된 mRNA, 즉 넌센스 돌연변이(nonsense mutation)에 기인하는 것으로 알려져 있다. 넌센스 돌연변이 생성의 주요인은, DNA 재조합 및 복제 과정에서의 실수와 같은 DNA 염기서열 상에서 생성되는 돌연변이뿐만 아니라, 잘못된 전사과정 (aberrant transcription), 비효율적인 스플라이싱(splicing), 프레임시프트 돌연변이 (frameshift mutation) 등 비정상 또는 비효율적인 세포내 기전에 기인한다.

넌센스 돌연변이를 갖는 mRNA는 정상길이보다 짧은 단백질을 발현하고 이로 인해 세포의 정상 기능을 저해할 수 있다. 그러나 운 좋게도 대부분의 잘못된 mRNA는 세포내에 존재하는 품질검사 기전인 NMD 기전에 의해 인식되고, 정상 mRNA보다 훨씬 빠른 속도로 세포내에서 제거된다. 즉, 세포는 NMD 기전을 이용하여 자신에게 해를 줄 수 있는 잘못된 mRNA를 선택적으로 인식/제거할 수 있다.

다양한 이유로 잘못 생성된 mRNA가 NMD에 의해 없어지지 않으면 세포의 기능을 저해할 수 있는 짧은 단백질이 생성되고, 그 결과 세포의 암화 및 다양한 유전병을 초래한다. 이와는 반대로 조금만 잘못되더라도 NMD에 의해 빨리 제거되기 때문에 세포의 정상적인 기능을 저해할 수 있으며, 이 역시 다양한 유전병의 발병과 직접적으로 관련이 있다.

현재 NMD 관련 질환의 치료를 위해 많은 치료법이 개발되고 있다. 예를 들어, 1,2,4-oxidiazole 화합물인 PTC 124(일반명: ataluren)는 듀센형 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy, 이하 DMD)과 같은 유전 질환의 돌연변이-특이적 치료를 위해 개발이 진행중이다. PTC 124는 표현형 스크리닝(phenotypic screening)으로 발견되어 최적화된 약물로서 수년간의 기전 연구에도 불구하고 약물의 정확한 기전은 아직 파악되지 않은 것으로 알려져 있고, NMD 저해를 기전으로 하고 있지 않은 것으로 판단된다. 이러한 이유로 임상 3상에서 효력이 예상치에 미치지 못하고 용량 의존성(dose-dependency)이 보이지 않아 미국 식품의약국(FDA)의 허가가 지연되고 있다.

이에 NMD를 억제하여 NMD 관련 유전 질환을 효과적으로 치료하기 위한 효과적인 치료제의 개발은 여전히 요구되고 있다.

한국특허등록공보 제10-1021402호

본 발명의 목적은 NMD를 효과적으로 억제하는 화합물(이하, "NMD 억제 화합물"로도 지칭함)을 제공함으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 NMD 관련 유전 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NMD 관련 유전 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 NMD 억제 화합물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NMD 억제 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 NMD 관련 유전 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD) 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물; 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 용도; 또는 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이를 포함하는 돌연변이 유전자와 관련된 것일 수 있으며, 또는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 유전 질병일 수 있다.

상기 NMD 관련 유전 질병은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증(예컨대, 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 백커형 근위측증(Becker muscular dystrophy), 울리히병(Ullrich's disease), 선천성 근위축증 근이영양증, 또는 지대형 근육 근이영양증 등), 상염색체 우성 다낭성 신장질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADOKD), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia telangiectasia), 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 인자 VII 결핍증(factor VII deficiency), 가족성 심방 세동, 혈우병 B, 간의 카르니틴 팔미토일 전달 효소 1A 결핍증(hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency; CPT1A), 유전성 폐 동맥 고혈압(heritable pulmonary arterial hypertension; HPAH), 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; LNCL), 백혈구 부착 결핍1(leukocyte adhesion deficiency 1; LAD1), 메틸말론산증(methylmalonic academia; MMA), 헐러 증후군(Hurler syndrome), 신세포성 시스틴증(nephropatic cystinosis), 비만, 퍼옥시좀 형성 장애(peroxisome biogenesis disorder; PBD), 신세뇨관 산증 (RTA), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa; RP), 레트 증후군(Rett syndrome; RTT), 척수 근위축증(spinal muscular atrophy; SMA), 스티뷰-와이드만 증후군(Stuve-Wiedemann syndrome; SMS), X-연관 신성요붕증(X-linked nephrogenic diabetes insipidus; XNDI) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome; USH1)일 수 있다.

추가적으로, 본 발명의 NMD 관련 질병은, 위 언급된 NMD 관련 유전 질병 이외에, 미성숙 종결 코돈의 존재에 의해 발병되는 다양한 암(예컨대, 유전적 확산성 위암(hereditary diffuse gastric cancer; HDGC), P53 유전자 돌연변이와 관련된 암, 또는 APC 유전자 돌연변이와 관련된 암)일 수 있다.

본 발명의 NMD 억제 화합물은 NMD 효율을 저하시킴으로, NMD에 의해서 유발되는 다양한 질병, 특히 유전 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 화합물은 모두 DMD 환자 유래 세포주에서 NMD를 저해하여 디스트로핀 mRNA 양을 증가시킬 수 있으므로 DMD 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 NMD 저해제의 대용량 탐색(high-throughput screening, HTS)을 위해 NMD 표적 mRNA를 항상 발현(constitutive expression)하는 세포주를 도시화한 모식도이다.
도 2는 도 1의 세포주에 비특이적 NMD 저해제인 카페인을 처리한 결과를 나타낸다.
도 3은 도 1의 세포주에 비특이적 NMD 억제제인 Wortmannin를 처리한 결과를 나타낸다.
도 4는 도 1의 세포주에 화합물 1 내지 3을 처리한 후 루시퍼라제(renilla luciferase; RLuc) 발현 효율을 mRNA 및 단백질 수준에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 화합물 1 내지 3의 처리가 UPF1(upstream frameshift 1)의 인산화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 화합물 1 내지 3의 처리가 UPF1과 UPF2의 결합에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 NMD의 각 단계에 작용하는 단백질 (Upf1, Upf2, Upf3X)을 리포터 mRNA의 3' UTR에 인위적으로 연결시킴으로써(tethering), 리포터 mRNA 양을 인위적으로 줄이는 방법에 대한 모식도이다. 이 방법을 통해 특정 화합물이 NMD에 미치는 정확한 단계를 결정할 수 있다.
도 8은 도 7의 방법을 이용하여 세포주에 화합물 1 또는 3을 각각 처리한 후, 리포터 mRNA인 β-6bs mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 도 7의 방법을 이용하여 세포주에 화합물 1 또는 2를 각각 처리한 후, 리포터 mRNA인 β-6bs mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 듀센형 근이영양증 환자 유래의 세포에 화합물 1 내지 3을 각각 처리한 후 NMD 표적 유전자인 디스트로핀 유전자의 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 듀센형 근이영양증 환자 유래의 세포에 화합물 1을 처리한 후 디스트로핀 단백질의 수준을 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 NMD를 억제하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

일 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 1의 화합물은 간단히 "화합물 1"로도 지칭된다.

<화학식 1>

화학식 1의 화합물은 GSK2126458의 코드 번호 또는 오미팔리십(Omipalisib)의 일반명으로 명명되며, 이의 화합물명은 2,4-Difluoro-N-{2-(methyloxy)-5-[4-(4-pyridazinyl)-6-quinolinyl]-3-pyridinyl}benzenesulfonamide이다. 화학식 1의 화합물은 PI3K/mTOR 신호전달 경로에서 PI3K에 결합하여 PI3K를 억제함으로써 항암 효과를 나타낸다고 알려져 있다 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Omipalisib). 화합물 1의 제조 및 그의 용도 등에 대해서는 WO 2008/144463, 특히 실시예 345 등에 개시되어 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 2의 화합물은 간단히 "화합물 2"로도 지칭된다.

<화학식 2>

화학식 2의 화합물은 BEZ235의 코드 번호 또는 닥토리십(Dactolisib)의 일반명으로 명명되며, 이의 화합물명은 2-Methyl-2-{4-[3-methyl-2-oxo-8-(quinolin-3-yl)-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]phenyl}propanenitrile 이다.

화학식 2의 화합물은 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로에서 PI3K kinase 및 mTOR kinase에 결합하여 종양세포 사멸과 PI3K/mTOR 과발현 종양 세포 성장 억제 활성을 나타낸다고 알려져 있다(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11977753). 화학식 2의 제조 및 그의 용도 등에 대해서는 WO 2006/122806, 특히 실시예 7 등에 개시되어 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 NMD를 억제하기 위한 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시된다. 본원에서 하기 화학식 3의 화합물은 간단히 "화합물 3"으로도 지칭된다.

<화학식 3>

화학식 3의 화합물은 CP-466722의 코드 번호로 명명되며, 이의 화합물명은 1-(6,7-Dimethoxy-4-quinazolinyl)-3-(2-pyridinyl)-1H-1,2,4-Triazol-5-amine이다.

본원에서 화학식 1 내지 3의 화합물 각각을 총칭하여 "본 발명의 화합물"로 기재하기도 한다.

본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 염의 형태로 존재할 수 있다.

"제약상 허용되는 염" 또는 "염"은 본원에서 환자의 치료에 적합한 또는 상용성이 있는 산부가염 또는 염기부가염을 지칭하는데 사용된다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기산으로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산뿐만 아니라 금속 염, 예컨대 오르토인산 일수소 나트륨 및 황산수소칼륨을 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기산으로는 모노-, 디- 및 트리카르복실산, 예컨대 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 벤조산, 페닐아세트산, 신남산 및 살리실산뿐만 아니라 술폰산, 예컨대 p-톨루엔 술폰산 및 메탄술폰산을 들 수 있다. 일산 또는 이산 염이 형성될 수 있으며, 이러한 염은 수화, 용매화 또는 실질적으로 무수 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 산부가염은 이의 유리 염기 형태와 비교하여 물 및 다양한 친수성 유기 용매에 더욱 가용성이고, 일반적으로 더 높은 융점을 나타낸다. 적절한 염의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 다른 비-제약상 허용되는 염, 예를 들어 옥살레이트는 예를 들어, 실험실용으로 또는 제약상 허용되는 산부가염으로의 후속 전환용으로 본 발명의 화합물의 단리에서 사용될 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 무기 염기로는 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 또는 바륨 히드록시드를 들 수 있다. 적합한 염을 형성하는 예시적 유기 염기로는 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린 또는 암모니아를 들 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 알킬, 디알킬, 트리알킬 또는 테트라-알킬 암모늄 염을 들 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 고려되는 염으로는 L-아르기닌, 베넨타민, 벤자틴, 베타인, 수산화칼슘, 콜린, 데아놀, 디에탄올아민, 디에틸아민, 2-(디에틸아미노)에탄올, 에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 히드라바민, 1H-이미다졸, 리튬, L-리신, 마그네슘, 4-(2-히드록시에틸)모르폴린, 피페라진, 칼륨, 1-(2-히드록시에틸)피롤리딘, 나트륨, 트리에탄올아민, 트로메타민, 및 아연 염을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

적절한 염의 선택은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 화학식 2의 화합물은 토실산염(tosylate)의 형태로 존재할 수 있다.

또한 본 발명의 화합물은 이의 제약상 허용되는 염뿐만 아니라 모든 가능한 광학 이성질체를 제한 없이 포함한다. 본 발명의 화합물의 입체이성질체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 결정질 형태 또는 비결정질 형태로 제조될 수 있다. 화합물이 결정질 형태로 제조되면, 임의로 수화 또는 용매화 될 수 있다.

본 발명의 화합물은 임의의 치료용 약학 조성물로서 제제화하거나, 또는 본원에 개시된 임의의 방법, 예컨대 예방 또는 치료 방법에서 사용하기에 적합한 형태로 제제화될 수 있다.

본원에서 달리 언급되지 않는 한, 치료제의 유효 성분으로서 본 발명의 화합물은 이의 임의의 제약상 허용되는 염을 포함하고, 이들 모두가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 설명의 편의상, 이는 상기 화학식의 화합물 또는 본 발명의 화합물이라고 간단히 약칭될 수 있다.

본 발명의 화합물; 또는 이의 제약상 허용되는 염은 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD)를 억제할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 화합물 1 내지 3은 NMD 관련 질병을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다.

일 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염을 유효 성분으로서 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염은 유효량으로 포함될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 NMD 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NMD 관련 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 상기 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염은 치료적 유효량으로 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 본원에 기술된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"이란 용어는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들어 증상을 완화하거나, 병태를 경감시키거나, 질환의 진행을 늦추거나 지연시키거나, 질환을 예방하는 등의 본 발명의 화합물의 양을 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물에는 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 고양이, 말, 소, 닭, 개, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 및 돼지가 포함된다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병, 병태 또는 장애를 완화 또는 개선하는 것(즉, 병태 또는 이의 임상 증상들 중 적어도 하나의 발생을 지연 또는 저지하는 것); 또는 환자가 인식할 수 없는 것을 포함하여, 질병, 병태 또는 장애와 관련된 적어도 하나의 신체적 파라미터 또는 바이오마커를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 임의의 질병, 병태 또는 장애를 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는 질병, 병태 또는 장애의 예방적 처치; 또는 병태 또는 장애의 발병 또는 진행을 지연시키는 것을 지칭한다.

구체적 일 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 NMD 억제에 반응성인 질병일 수 있다.

또 다른 구체적 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이를 포함하는 돌연변이 유전자와 관련된 것일 수 있으며, 예를 들어, 넌센스 돌연변이에 의해 발병되는 유전 질병일 수 있다.

또 다른 구체적 실시태양에서, 상기 NMD 관련 질병은 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 유전 질병일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 NMD 관련 질병은 PTC를 보유하는 유전자의 염기서열을 기초로 선별된 것일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "넌센스-매개 RNA 분해(NMD)"는 미성숙 번역 종결 코돈을 포함하는 mRNA의 분해를 매개하는 메커니즘을 지칭한다. 구체적으로, NMD는 돌연변이, 번역 상 에러(transcriptional error), 및 비정상적 스플라이싱(aberrant splicing)에 의해 mRNA에 도입되곤 하는 미성숙 종결 코돈(PTC)을 포함하는 transcript를 특이적으로 인식하여 분해하는 세포 메커니즘이다. 번역시, 해당 mRNA는 짧은 형태의 암호화된 단백질을 생산하게 된다. NMD 감시 메커니즘은 이러한 결함 단백질 및 펩타이드의 형성을 감소시키거나 예방한다. 모든 유전 질환의 약 1/3과 몇몇 형태의 암은 PTC를 도입하는 넌센스 또는 프레임시프트 돌연변이에 의해 야기되는 것으로 알려져 있으며, NMD는 이러한 질병의 임상적 표현형을 조절할 수 있다. 이에 따라 NMD의 조절 (즉, NMD의 억제 또는 증가)는 잠재적인 치료적 이점을 제공할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "미성숙 번역 종결(premature translation termination)"은 아미노산에 해당하는 코돈을 정지 코돈으로 변화시키는 돌연변이의 결과를 의미하고, 용어 "미성숙 종결 코돈(premature termination codon; "PTC")" 또는 "미성숙 정지 코돈(premature stop codon)"은 아미노산에 해당하는 코돈이 정지 코돈으로 변화된 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "넌센스 돌연변이(nonsense mutation)"는 아미노산에 해당하는 코돈을 정지 코돈으로 변경하는 점 돌연변이이다.

본원에 사용된 용어 "프레임시프트 돌연변이(frameshift mutation)"는 서열이 판독되는 방향으로 이동하는 DNA 서열의 결실 또는 삽입에 의해 야기되는 유전적 돌연변이를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "NMD 억제"는, NMD 억제가 없는 세포와 비교하여, 임의의 측정 가능한 양만큼 세포에서 NMD의 활성 감소 및 결함있는 mRNA의 분해가 감소됨을 지칭한다. NMD 억제는 NMD 경로의 단백질 성분의 기능을 차단하거나, 번역을 억제하거나, 또는 번역 machine이 미성숙 종결 코돈을 우회하도록 허용("번역 우회 요법(translational bypass therapy; TBT)" 또는 "리드-쓰루(read-through)")하는 등 다양한 방법으로 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Bashyam, Recent Patents on DNA & Gene Sequences 2009, 3, 7-15] 참조).

일 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 NMD의 각 단계에 작용하는 단백질(UPF1, UPF2, UPF3X, eIF4AIII, PNRC2 등) 중 임의의 단백질 또는 이들이 관여하는 임의의 단계에 작용하는 것일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물은 NMD에 중요한 인자인 UPF1을 표적으로 하여 NMD의 효율을 억제할 수 있다.

구체적 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 특히 화합물 1은 NMD의 주요 단백질인 UPF1과 UPF2의 결합을 저해함으로서 NMD 억제 효과를 나타낸다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 특히 화합물 2는 NMD의 주요 단계인 UPF1 인산화를 저해함으로써 NMD 억제 효과를 나타낸다.

또 다른 실시태양에서, 화합물 3은 UPF1 이전 단계를 타겟함으로써 NMD 억제 효과를 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "NMD 관련 질병"은 NMD 억제에 반응성인 질병으로서, NMD 억제에 의해 질병 표현형(disease phenotype)이 감소되는 질병을 나타낸다. 이러한 질병 표현형을 가진 환자는 예를 들어, 통상적인 방법으로 PTC를 생성하는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 같은 돌연변이 보유 여부를 판단함으로써 진단될 수 있다. 다르게는, 상기 환자는 PTC 보유 유전자 수준을 측정함으로써 선별될 수 있다.

이에 따라 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 적용되는 환자 또는 대상체는 PCT를 생성하는 넌센스 돌연변이를 보유하고 있는 환자 또는 대상체일 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의 NMD 관련 질병은 PTC를 생성하는 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 같은 돌연변이가 있는 질병일 수 있다. 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 여러 유전 질환의 예는 표 1에 나타낸 바와 같다.

보다 구체적 실시태양에서, 상기 PTC의 존재에 의해 발병하는 NMD 관련 유전 질환은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증, 상염색체 우성 다낭성 신장질환(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADOKD), 모세혈관확장성운동실조증(ataxia telangiectasia), 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 인자 VII 결핍증(factor VII deficiency), 가족성 심방 세동, 혈우병 B, 간의 카르니틴 팔미토일 전달 효소 1A 결핍증(hepatic carnitine palmitoyltransferase 1A deficiency; CPT1A), 유전성 폐 동맥 고혈압(heritable pulmonary arterial hypertension; HPAH), 후기 영아 신경원성 세로이드 리포푸신증(late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis; LNCL), 백혈구 부착 결핍1(　leukocyte adhesion deficiency 1; LAD1), 메틸말론산증(methylmalonic academia; MMA), 헐러 증후군(Hurler syndrome), 신세포성 시스틴증(nephropatic cystinosis), 비만, 퍼옥시좀 형성 장애(peroxisome biogenesis disorder; PBD), 신세뇨관 산증 (RTA), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa; RP), 레트 증후군(Rett syndrome; RTT), 척수 근위축증(spinal muscular atrophy; SMA), 스티뷰-와이드만 증후군(Stuve-Wiedemann syndrome; SMS), X-연관 신성요붕증(X-linked nephrogenic diabetes insipidus; XNDI) 또는 어셔 증후군(Usher syndrome; USH1)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, PTC 생성 돌연변이 유전자를 보유하는 것으로 당업계에 알려진 질병이라면 본 발명의 NMD 관련 질병의 범위에 포함된다. 다르게는, NMD 억제 기전을 통해 질병의 개선 또는 치료 효과가 있는 것으로 당업계에 공지된 질병 역시 모두 본 발명의 NMD 관련 질병의 범위에 포함된다.

특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 NMD 관련 질병은 근이영양증일 수 있으며, 구체적으로, 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 백커형 근위측증(Becker muscular dystrophy), 울리히병(Ullrich's disease), 선천성 근위축증 근이영양증, 또는 지대형 근육 근이영양증일 수 있다.

보다 구체적 실시태양에서, 본 발명의 화합물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 NMD 관련 질병은 듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy) 또는 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia)일 수 있다.

또다른 특정 실시태양에서, 상기 PTC의 존재에 의해 발병하는 NMD 관련 질병은 암일 수 있으며, 특히 유전적 확산성 위암(hereditary diffuse gastric cancer; HDGC), P53 유전자 돌연변이와 관련된 암(예를 들어, Li-Fraumeni 증후군, 인간 유방암) 또는 APC 유전자의 돌연변이와 관련된 암(예를 들어, 대장암 및 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis))일 수 있다.

듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)은 디스트로핀(dystrophin) 유전자에 PTC가 생성되어 NMD에 의해 빨리 제거됨으로 인해 발병되는 희귀난치성 근육병이다. DMD 돌연변이의 98% 이상이 11kb 길이에 걸쳐 다양한 지점에서 디스트로핀 개방 판독 프레임의 조기 종결을 야기시킨다.

베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia)은 헤모글로빈 생성을 감소시키는 혈액 질환이다. β⁰39-지중해성 빈혈에서, 정지 코돈 돌연변이는 미성숙 번역 종료를 초래하고 넌센스 매개 분해를 통해 mRNA의 불안정화를 야기시킨다. 문헌 [Salvatori et al., Am. J. Hematol., 84 (11) : 720-8 (2009)] 등에서의 연구 등으로부터, NMD 억제를 통해 베타-지중해성 빈혈을 예방 또는 치료할 수 있음이 시사되었다.

그 외 위 언급된 질병들은 모두 NMD 억제를 통해 예방 또는 치료될 수 있음이 당업계에 공지되어 있거나 시사되어 있다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)에 관한 문헌 [Welch et al., Nature 447, 87-91 (2007)], Ulrich's disease에 대해서는 문헌 [Usuki et al., Molecular Therapy 14: 351-360 (2006)], 　HDGC에 대해서는 문헌 [Karam et al., Oncogene 27:4255-4260 (2008))] 등 참조. 그 외 NMD 관련 유전질환 및 암에 대해서는 많은 문헌에서 이미 보고되어 있는 상황이다(예를 들어, 문헌 [Miller & Pearce, Mutat Res Rev Mutat Res. 762:52-64 (2014)], [Holbrook et al., Nature Genetics 36:801-808 (2004)], [Supek et al., Trends Genet. 37:657-668 (2021)], [Khajavi et al., Eur J Hum Genet. 14:1074-1081 (2006)] 등 참조).

본원에 사용된 용어 "조성물" 또는 "약학 조성물"은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 본 발명의 화합물의 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물은 환자 또는 대상체에게 화합물의 투여를 용이하게 한다.

이에 따라 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 제약상 허용되는 담체는, 비유효 성분, 즉, 제약상 허용되는 부형제로서, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients] 등을 참고하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

적합한 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 예를 들면, 근육내, 정맥내, 또는 피하내 투여 등을 비제한적으로 포함한다. 경구 투여가 바람직하다.

실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것이 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. NMD 저해제 탐색용 세포주 구축

NMD 효율 측정을 위해서 일반적으로 세포에서 mRNA를 추출하여 mRNA의 양을 RT-PCR을 통해 확인하나, 이러한 방법은 대용량 탐색(High-throughput screening, HTS)을 수행하기에는 한계가 있기 때문에 정량화를 쉽게 할 수 있는 방법 개발이 필요하다.

이에 본 발명은 도 1과 같은 효율적인 NMD 저해제 탐색 방법을 고안하였다. 베타-지중해성빈혈 (beta-thalassemia)은 NMD 관련 유전병으로서 베타-글로빈(beta-globin) 유전자와 관련된 것으로 알려져 있다. 즉, 지중해성빈혈 (beta-thalassemia)을 가진 사람의 베타-글로빈(beta-globin) 유전자는, 정상인과 비교하여, PTC (premature termination codon) 유전자가 발현되어 있다.

본 실시예에서는 화학발광 유전자(Chemiluminescence gene)인 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase; RLuc)의 뒷부분에, 베타-글로빈(beta-globin) 정상 유전자 또는 유전병에서 발견되는 PTC (premature termination codon)를 포함한 유전자를 삽입시켰다. 정상 유전자를 삽입한 형태의 mRNA는 NMD의 표적이 되지 않는 반면, PTC를 가지는 유전자를 삽입했을 경우 NMD 표적이 되고, 그 결과 mRNA가 빨리 깨지고, RLuc의 발현양이 줄어들게 된다.

이에 따라 NMD 표적 mRNA를 항상 발현하는 HeLa 세포주를 제조하였고, 동시에 이 세포주는 NMD의 표적이 되지 않는 firefly luciferase (FLuc) 유전자를 항상 발현할 수 있게 디자인을 하였으며, 동일한 구성을 갖는 총 3종의 세포주 (NMD20, NMD4, NMD5)를 확보하였다. 이렇게 제조된 HeLa 세포주가 NMD 효율 측정에 적합한지를 확인하기 위해 아래와 같은 2가지 실험을 수행하였다.

우선, 제조된 세포주 각각을 비특이적 NMD 저해물질로 알려진 카페인을 처리하여, FLuc activity에 대한 RLuc activity의 정도를 확인하였다. 시약을 12시간 처리한 이후, 세포로부터 전체 단백질을 분리하였다. 그 후, dual luciferase assay를 통해 RLuc과 FLuc 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이, 카페인 미처리 군과 비교하여, 카페인 처리군에서 RLuc의 발현량이 약 1,300배 ~ 약 2000배까지 증가함이 확인되었다. 이러한 결과는 상기 세포주들이 NMD의 효율을 잘 반영하는 것을 의미한다.

추가적으로 제조된 HeLa 세포주가 대용량 탐색(high-throughput screening, HTS)을 수행하기에 적합한지를 확인하고자 하였다. HTS에 적합하도록 384-웰 포맷에서 세포의 수, 사용된 시약 및 버퍼의 양 등의 조건을 최적화하여 실험을 수행하였고(도 3), 대조 물질로서 비특이적 NMD 저해제인 wortmannin을 사용하여 NMD 효율을 측정하였다. Wortmannin은 NMD pathway의 결정적 단계인 SMG1-mediated UPF1 phosphorylation을 억제함으로써 NMD를 억제한다고 알려져 있다(A Yamashita et al., 2001 Sep 1;15(17):2215-28). 그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, 미처리 군과 비교하여, Wortmannin 처리군에서 RLuc의 발현량이 약 10-40배 증가하였다(도 3에서 w/FF luc calibration은 FLuc 활성값에 대해 보정한 RLuc값임). 이에 따라 제조된 HeLa 세포주는 NMD의 효율을 잘 반영할 뿐만 아니라, HTS를 수행하기에 적합한 것으로 검증되었다.

실시예 2. 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 효과 확인

실시예 1에서 제조된 HeLa 세포주를 사용하여 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 효과를 확인하고자 하였다. 화합물 1 내지 3을 5 μM, 12시간 동안 세포에 각각 처리한 후, 세포로부터 전체 RNA와 단백질을 각각 정제하였다. 그 후, RNA와 단백질을 실시간 PCR 기법과 dual luciferase assay 방법을 통해 각각의 양을 정량하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

화합물 1은 RLuc의 단백질 번역을 증가시키는 반면, 화합물 2 및 3의 경우 mRNA의 양을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 이로부터 상기 3종의 화합물은 모두 NMD를 저해하는 효과를 나타내나, 화합물 1과 화합물 2 및 3은 서로 다른 단계에서 저해함을 알 수 있었다.

결론적으로 화합물 1 내지 3 각각이 작용하는 NMD 단계는 조금씩 차이는 있으나 모두 공통적으로 NMD를 억제하는 물질임을 알 수 있었다.

실시예 3. 화합물 1 내지 3의 NMD 저해 기전 분석

NMD는 여러 단계의 단백질 결합을 통해 이루어지는 현상으로서, 그 중 UPF1 및 UPF2 사이의 결합과, UPF1의 인산화 등에 의해 특히 영향을 받음이 알려져 있다(한국특허 제1021402호 등 참조).

본 실시예에서는 본 발명의 각 화합물이 구체적으로 NMD의 어떤 단계에 작용하는지를 확인하고자 하였다.

3.1 UPF1의 인산화에 미치는 영향 분석

UPF1의 인산화는 NMD에 있어서 가장 중요한 인자 중 하나로 알려져 있다. 본 실시예에서는 본 발명의 3종 화합물이 UPF1의 인산화에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 세포에 각 화합물을 5 μM, 12시간 동안 처리한 후, 전체 단백질을 정제하였다. 그 후 Upf1 또는 특정 위치에 인산화된 Upf1을 인식할 수 있는 각각의 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였다.

그 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 및 3은 UPF1의 인산화에 큰 영향을 미치지 않지만, 화합물 2는 UPF1의 인산화를 현저히 저해시키는 것을 확인하였다.

3.2 UPF1과 UPF2 간의 결합에 미치는 영향 분석

NMD는 여러 단계의 단백질 결합을 통해 이루어지는 현상으로 그 중 UPF1과 UPF2 간의 결합이 가장 중요한 단계로 알려져 있다. 본 실시예에서는 UPF1과 UPF2 간의 결합에 본 발명의 3종 화합물이 미치는 영향을 조사하고자 하였다.

세포주에 FLAG-UPF1을 발현하는 DNA를 일시적으로 과발현시켰다. 이 세포주에 각 화합물을 5 μM, 1시간 동안 처리한 후 cell extract를 얻었다. 확보한 cell extract를 FLAG 항체를 이용하여 immunoprecipitation을 수행하였다. Immunoprecipitation 전과 후의 단백질을 western blotting을 통해 분석하였다.

그 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 UPF1-UPF2 결합을 현저히 저해하는 반면, 화합물 2 및 3은 UPF1-UPF2 결합에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

3.3 NMD의 작용 단계 분석

NMD의 각 단계에 작용하는 단백질(Upf1, Upf2, Upf3X)을 리포터 mRNA의 3'UTR에 인위적으로 연결(Tethering)한 후, 리포터 mRNA 양을 인위적으로 줄일 수 있는 NMD 기반 검색시스템을 구축하였다(도 7). 이 방법을 이용하여 3종 화합물이 NMD의 어느 단계에 작동하는지를 검증하고자 하였다.

HeLa 세포주에 도 7과 같이 리포터 mRNA를 발현하는 플라스미드와 인위적으로 리포터 mRNA의 3' UTR에 결합할 수 있는 MS2 결합단백질(MS2-Upf1, MS2-Upf2, MS2-Upf3)을 발현시켰다. 이 세포주에 각 화합물 5 μM, 6시간 또는 12시간 동안 처리한 후 cell extract를 얻었다. 그 후, 리포터 mRNA의 상대적인 양을 실시간 PCR을 통해 측정하였다.

그 결과, 화합물 1은 UPF1-UPF2 단계를 타겟하는 반면, 화합물 2와 3은 UPF1-UPF2, UPF2-UPF3 단계를 타겟하지 않는 것을 확인하였다(도 8 및 9).

결론적으로 화합물 1 내지 3은 각 화합물이 작용하는 NMD 단계는 조금씩 차이는 있으나 모두 공통적으로 NMD를 억제하는 물질임을 확인하였다. 이에 따라, 화합물 1 내지 3은 모두 NMD에 의해 유발되는 유전병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음이 확인되었다.

실시예 4. DMD 치료 효과 확인

본 실시예에서는 NMD 억제제로서 확인된 화합물 1 내지 3이 NMD 관련 유전병에 효과적인지를 추가적으로 확인하기 위해서, DMD 환자 유래 세포주를 대상으로 실험을 진행하였다. DMD는 디스트로핀(dystrophin) 유전자에 PTC가 생성되어서 NMD에 의해 빨리 제거되기 때문에 발병하는 대표적인 NMD 관련 유전병이다.

서로 다른 DMD 환자에서 유래된 lymphocyte 2종에 화합물 3종을 5 μM, 12시간 동안 각각 처리한 후, dystrophin mRNA 양을 실시간 PCR을 통해 정량하였다.

그 결과, 서로 다른 DMD 환자 유래 세포주에서 3종 화합물 모두 디스트로핀 mRNA (DMD/GAPDH mRNA)의 양을 증가시키는 것을 확인하였다(도 10).

위와 동일한 실험 조건에서 화합물 1을 처리한 세포주에서 단백질을 얻어, 디스트로핀 단백질 양의 변화를 Western blotting으로 조사한 결과, 세포내에서 발현되는 디스트로핀 단백질의 양이 실제로 증가되는 것을 알 수 있었다(도 11).

따라서 위의 3종 화합물은 NMD를 저해하여, 디스트로핀의 양을 증가시키는 것으로 확인되었다.

Claims (13)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD) 관련 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서,
   상기 질병은 넌센스 돌연변이 또는 프레임시프트 돌연변이와 연관된 미성숙 종결 코돈(PTC)으로 인한 NMD에 의해 유발되는 유전 질병으로,
   듀센형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 또는 베타-지중해성 빈혈(beta-thalassemia)인, 약학 조성물:
   <화학식 1>
   

   

   .
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 넌센스-매개 mRNA 분해(NMD)를 억제하는 것인, 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 UPF1과 UPF2의 결합을 저해하는 것인, 약학 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.

Images